IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DEL HONGO Colletotrichum spp
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1. COLE T COLE C CONWAY E 2005 Effectiveness of selected fungicides applied with or without surfactant in controlling anthracnose on three cultivars of Euonymus fortunei Journal of Applied Horticulture 7 16 19 CHUNG H CHUNG C PENG YANG R HUANG W 2010 Specific detection of benzamidazole resistance in Colletotrichum gloeosporioides from fruit crops by PCR RFLP Special Issue on Biocatalysis and Agriculture Biotechnology 3 17 24 DE LAPEYRE DE BELLAIRE L CHILLET M LASSOIS L HAISSAM M 2010 Crown rot of bananas Preharvest factors involved in postharvest disease development and integrated control methods Plant Disease 94 648 658 DE LAPEYRE DE BELLAIRE L DUBOIS C 1997 Distribution of thiabendazole resistant Colletotrichum musae isolates from Guadalupe banana plantations Plant Disease 81 1378 1383 DEMERUTISC QUIROS L MARTINUZA ALVARADO E WILLIAMS R ELLIS M 2008 Evaluation of an organic treatment for post harvest control of crown rot of banana Ecological Engineering 3 4 324 327 DU M SCHRDL C NUCKLES E VAILLANCOURT L 2005 Using mating type gene sequence for improved phylogenetic resolution of Colletotrichum species complexes Mycologia 97 641 658 SALAZAR et al Identificaci n molecular del hongo Colletotrichum spp aislado de banano 67 FREEMAN S KATAN T 1997 Identification of Colletotrichum species responsible for anthracnose and root necrosis of strawberry in Israel Phytopat2. 1074 LASSOIS L BASTIAANSE H CHILLET M JULLIEN A JIJAKLI M DE LAPEYRE DE BELLAIRE L 2010 Hand position on the bunch and source sink ratio influence the banana fruit susceptibility to crown rot disease Annals of Applied Biology 156 221 229 LIMA R OLIVEIRA S MENEZES M 2003 Caracteriza o enzim tica e patogenicidad cruzada de Colletotrichum spp associados a doen as de p s colheita Fitopatologia Brasileira 28 620 625 LIU B WASILVA L MORELOCK T O NEIL N CORREL J 2007 Comparison of Colletotrichum orbiculare and several allied Colletotrichum spp for mtDNA RFLPs intron RFLP and sequence variation vegetative compatibility and host specificity Phytopathology 97 1305 1314 MAQBOOL M ALI A RAMACHANDRAN S SMITH D ALDERSON P GI 2010 Control of postharvest anthracnose of banana using a new edible composite coating Crop Protection doi 10 1016 j cropro 2010 06 005 MEDEIROS 1 MACIEL D MEDIEROS V HOULLOU KIDO L OLIVEIRA N 2010 pelB gene in isolates of Colletotrichum gloeosporioides from several hosts Genetics and Molecular Research 9 661 673 MORIWAKI J TSUKIBOSHI T SATO T 2002 Grouping of Colletotrichum species in Japan based on rDNA sequences Journal Genetic Plant Pathology 68 307 320 NIROSHINI W KARUNARATNE A 2009 Interactions of Colletotrichum musae and Lasiodiplodia theobromae and their biocontrol by Pantoea agglomerans and Flavobacterium sp in expression of crow
3. Rica Turrialba Costa Rica xxix Centro de Investigaciones Agron micas Universidad de Costa Rica San Jos Costa Rica 54 AGRONOMIA COSTARRICENSE INTRODUCCION El cultivo del banano Musa spp es una fuente importante de trabajo e ingresos en los pa ses donde se produce En Costa Rica el banano se cultiva en forma comercial en zonas de alta precipitaci n y temperatura promedio de 30 C ubicadas hasta los 300 msnm Actualmente existe inter s en la producci n de banano en reas localizadas a mayores altitudes entre 440 y 1300 msnm banano de altura ya que la fruta tiene un sabor m s dulce A Tapia 2009 Comunicaci n personal Ram rez 2010 esto debido a que su ciclo de producci n es m s prolongado y se da una mayor acumulaci n de almidones que pos teriormente son desdoblados en az cares durante la maduraci n Adicionalmente puede haber una mayor acumulaci n de fructosa que es 5 veces m s dulce que la glucosa La fruta proveniente de estas reas podr a comercializarse en los mercados como un producto diferenciado even tualmente a un mayor precio Junto con la mejora en el sabor de la fruta tambi n se busca que sea producida bajo un esquema de reducci n o no uso de fungicidas dada la preferencia creciente de los consumidores por productos obtenidos sin el uso de agroqu micos Sin embargo la fruta producida bajo este esquema de no uso de agroqu micos puede presentar mayores da os por pat genos en posc
4. el valor de la CE dependi del fungicida Algunas zonas San Juan Sur por ejemplo present el valor m s alto de CE para un fungicida imazalil 2 28 mg y el m s bajo para otro miclobutanil 1 10 mg I Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 AGRONOMIA COSTARRICENSE 62 i 10 0 gt d 139s14 AST PPZI HN VINSIPLIS eqan Iq BUOZ 10d seprorsunj soy op OUN epro vied svIoUdIOJIP Se NOSNUTUL SVIA SLUOZ seJ op Lun epeo ered Jo aque svIOUDJOJIP sepnosn eu seo 86 E PS E 810 I 89 Pre T 6VE T 8e0 qd 081 6120 6900 900 eg zro ma 1E 9 91 971 qo ES 8LLT 168 0 ECO e gy trI LIFO 8v0 0 0 0 e qY soo OIO OUVIDO LT T YO T Soo 2V OorI 66E T 6807 TO q dv 877 sor 0 870 0 100 e av S00 ing uenf ues ZO 9 LS p vpS0 q3 LS 769 7 6ST T 950 2e av 681 S60 0 890 0 100 e qY soo Bso nfa or i sepuopoy 8Lv 9v t STO q94 89p 769 7 SLSO 880 BV Eli SOT 0 800 0 voo ev p00 seIpord E 15 C 7su C 1s oSue y AS9 SAD o uey Asoq 079 osuey Asoaq SAD pepreooT puemqoprn eze WI OZepuaquIL SeprorSuny O3uoy op eoor OJUATUNTDOIO op pepr iqisuas e op Imede epeurulojop Seprordunz op OSRIILD eq eIIINT op UQJULI JO Ud VINYL IP OUBURA DP SPIOJMMPOIA SRUOZ IP AUIUIAOIA SIPI0110dS020 8 WNYI141012110 9 os WO EMPU Lano UOIDRIJUIDUOS Lj Op Orpoword SaJO EA OIPeno Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 SALAZAR et al Identificaci n mo
5. 3 fungicidas poscosecha Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 58 AGRONOMIA COSTARRICENSE La sensibilidad de cada aislamiento a los fungicidas se evalu con base en la CE Con centraci n Efectiva Media la concentraci n del fungicida que reduce el di metro de la colonia en un 50 en el medio de cultivo enmendado con fungicida en relaci n con el crecimiento en el medio de cultivo sin fungicida El porcentaje de inhibici n del crecimiento micelial fue determi nado mediante la f rmula propuesta por Cole et al 2005 inhibici n di metro promedio en PDA sin fungicida di metro promedio en PDA con fungicida x 100 di metro promedio en PDA sin fungicida Para obtener los valores de CE corres pondiente a la concentraci n de cada fungicida los valores promedio de inhibici n de crecimien to micelial se graficaron contra el logaritmo de las concentraciones del fungicida y se determin la regresi n lineal El logaritmo de la CE se calcul basadao en la intercepci n con el eje x que corresponde al valor del 50 de inhibici n en la regresi n lineal Los valores de la CE se calcularon como el antilogaritmo del resultado obtenido del logaritmo Es decir se reemplaz el valor 50 en las ecuaciones resultantes que relacionan la variable respuesta el porcentaje de inhibici n y con el logaritmo de la concentra ci n del fungicida y se calcul el antilogaritmo Se emple u
6. Agronomia Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 www mag go cr rev_agr index html Www cia ucr ac cr IDENTIFICACION MOLECULAR DEL HONGO Colletotrichum spp AISLADO DE BANANO Musa spp DE ALTURA EN LA ZONA DE TURRIALBA Y DETERMINACION DE SU SENSIBILIDAD A FUNGICIDAS POSCOSECHA Eduardo Salazar Ramses Hern ndez Ana Tapia Luis G mez Alp zar Palabras clave Antracnosis PCR poscosecha tiabendazole imazalil miclobutanil Keywords Anthracnose PCR postharvest thiabendazole imazalil miclobutanil Recibido 12 10 11 RESUMEN La antracnosis causada por el hongo Colletotrichum spp es una de las principales enfermedades poscosecha que afectan el fruto del banano En el presente experimento 25 ais lamientos de Colletotrichum spp obtenidos de frutos de banano provenientes de 5 zonas del cant n de Turrialba Costa Rica fueron utiliza dos para caracterizar molecularmente al hongo y evaluar su sensibilidad in vitro a 3 fungicidas poscosecha tiabendazol imazalil y miclobutanil La identificaci n molecular de cada uno de los aislamientos se realiz mediante la t cnica PCR con los imprimadores especie espec ficos de la regi n IT S CgInt ITS5 y de una regi n del gen de la 8 tubulina TBCG TBS Para las pruebas de sensibilidad in vitro a los 3 fungicidas se uti lizaron las siguientes concentraciones 0 1 1 0 10 0 y 100 0 ug ml El an lisis de la regi n ITS y de la regi n del gen de la f tubu
7. Cg corresponde a C gloeosporioides Ca corresponde a C acutatum control negativo sin ADN con los imprimadores Calnt2 ITS4 de imprimadores TBCG y TBS en tanto que no se obtuvo amplificaci n para el aislamiento con trol de C acutatum Ca La Figura 4 muestra un ejemplo de los productos de PCR obtenidos con los imprimadores TBCG y TBS Para el aislamiento control de C acutatum Ca un producto de PCR de aproximadamente 350 pb se produjo con la combinaci n de imprimadores TBCA y TBS en tanto que para ninguno de los aislamientos de banano de altura o el control de C gloeosporioides Cg se observ producto de PCR Figura 5 En ambos casos el tama o de los productos de PCR corresponden al esperado con estos imprimadores especie espec ficos 350 pb C gloeosporioides y 350 pb C acutatum Valero et al 2010 Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 60 AGRONOMIA COSTARRICENSE Fig 4 Electroforesis en gel de agarosa de productos PCR obtenidos del ADN de los aislamientos de Colletotrichum pro veniente de frutos de bananos infectados 1 a 5 y controles Ca corresponde a C acutatum Cg corresponde a C gloesporioides control negativo sin ADN con los imprimadores generados apartir de B tubulina TB5 TBCG para C gloeosporioides Fig n Electroforesis en gel de agarosa de productos PCR obtenidos del ADN de los aislamientos de Colletotrichum pro veniente de frutos de bananos infec
8. Concentraci n efectiva media promedio CE del tiabendazol imazalil y miclobutanil determinada a partir de la sensibilidad del crecimiento micelial del hongo Colletotrichum gloesporioides proveniente de 5 zonas productoras de banano de altura en el cant n de Turrialba Cartago Fungicida CESO ug ml Desviaci n Rango vg ml FR Tiabendazol 0 072 A 0 049 0 008 0 129 16 12 Imazalil 1708 B 0 626 0 575 2 70 4 69 Miclobutanil 3 987 C 1 684 1 072 6 30 5 88 FR Mayor CE Menor CEs Prueba estad stica utilizada LSD Fisher p lt 0 01 no B c 2 E 7 44 a 36 TIABENDAZOL 8 3 E IMAZALIL e S MYCLOBUTANIL 3 FL e a se j a AS 49 Concentraci n efectiva media CEs pl ml 1 Fig 6 Distribuci n de la frecuencia de la sensibilidad al tiabendazol imazalil y miclobutanil en 25 aislamientos de Collectotrichum sp proveniente de 5 zonas del cant n de Turrialba Cartago mientras que para el imazalil el 80 de los aislamientos mostr valores entre 1 0 y 3 0 ng mI y para el miclobutanil el 80 entre 3 0 y 7 0 ug ml En relaci n con las 5 zonas muestreadas se observaron diferencias significativas p lt 0 01 para la CE promedio entre zonas para cada fun gicida y entre fungicidas para cada zona Cuadro 3 Piedras Redondas present los valores m s bajos de CE para los fungicidas tiabendazol e imazalil 0 04 y 1 13 mg I respectivamente mientras que para las otras zonas
9. Du et al 2005 En adici n Freeman y Katan 1997 se alan que la diferenciaci n de especies dentro del g nero Colletotrichum con base en el hospedante no es un criterio confiable Por otra parte C gloeos porioides ha sido definida como una especie compuesta por aislamientos que difieren fisio l gicamente con algunos m s virulentos hacia ciertos hospedantes que otros Suzuki et al 2010 Recientemente Medeiros et al 2010 demostra ron la variabilidad intraespec fica presente en C gloeosporioides con la t cnica ISSR Secuencia entre Repeticiones Simples que consiste en la amplificaci n mediante PCR del fragmento ubi cado entre los microsat lites Aislamientos de C gloeosporioides provenientes de diferentes hos pedantes cebolla mango mara n se agruparon de acuerdo al hospedante lo que indica diferencia entre los aislamientos y especificidad por hospe dante dentro de la misma especie La evidencia recolectada a la fecha indica que C musae es un linaje dentro de C gloeospo rioides con especificidad hacia frutos de banano Hernandez 2009 Por antigiiedad en descripci n y nomenclatura C gloeosporioides debe consi derarse como la especie causante de la antracno sis en banano Sin embargo desde un punto de Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 64 AGRONOMIA COSTARRICENSE vista pr ctico atin se mantiene a C musae como el agente causal de la antracnosis del banano Niroshini
10. alnt2 e ITS4 Sreeniva saprasad et al 1996 respectivamente La porci n del gen de la f Tubulina 2 se amplific con los imprimadores espec ficos TBCG C gloeospo rioides CGGAAGCCTGGGTAGGAGCG 3 y TBCA C acutatum 5 CGGAGGCCTGGTT GGGTGAG 3 combinados con el imprimador TBS 5 GGTAACCAGATTGGTGCTGCCTT3 Valero et al 2010 Cada par de imprimadores se emple de manera independiente Cada reacci n de PCR se llev a cabo en un volumen total de 25 yl la mezcla consisti en 2 5 ul de Dreamtaq buffer 10X 1 6 uM de cada imprimador 1 7 mM de MgCl 0 16 mM de dNTPs 0 4 mg ml BSA 1 5 U Taq Polimerasa Fermentas aproximadamente 30 ng de ADN molde y agua nanopura est ril La amplificaci n se realiz en un termociclador Veriti 96 Well Thermal Cycler con el siguiente programa t r mico ITS f Tubulina desnaturalizaci n inicial a 94 C por 3 5 min 25 30 ciclos de desnatu ralizaci n a 94 C por 30 45 s alineamiento a 57 C 62 C por 60 30 s extensi n inicial a 72 C por 45 120 s y una extensi n final de 72 C por 5 7 min En todos los casos se incluy controles positivos para C gloeosporioides y C acutatum as como un control negativo sin ADN El pro ducto de PCR se analiz por electroforesis en geles de agarosa al 1 en 0 5X TBE buffer Tris 10mM Borato 20 mM EDTA 1mM con GelRed 2 ul 5SO0m Las condiciones de la electroforesis fueron 80 voltios por 90 min Para visualizar el producto
11. cloranfenicol 0 5 g l para evitar el crecimiento bacterial Una espora por caja Petri Las cajas Petri se colocaron en una incubadora con una temperatura entre 24 y 26 C por 8 d as Identificaci n molecular Extracci n de ADN del hongo La extracci n de ADN se hizo a partir del micelio de cada uno de los 25 cultivos monos p ricos monoconidiales obtenidos La extrac ci n del ADN se realiz mediante el protocolo SALAZAR et al Identificaci n molecular del hongo Colletotrichum spp aislado de banano 57 descrito por Rogers y Bendich 1988 con algunas modificaciones Identificaci n de especies mediante imprimadores espec ficos Para la identificaci n de las especies de Colletotrichum asociadas a la antracnosis de banano de altura se utiliz la t cnica de la reacci n en cadena de la polimerasa PCR para la ampli ficaci n con imprimadores o iniciadores espec ficos de 2 regiones gen micas 1 la regi n de los espaciadores internos transcritos ITS Internal Transcribed Spacers ITS1 5 8S ITS2 por sus siglas en ingl s del ADN ribosomal ADNr y 2 una porci n del gen de la f3 Tubulina 2 Para la amplificaci n de la regi n ITS se usaron los imprimadores CgInt 5 GGCCTCC CGCCTCCGGGCGG3 para C gloeosporioi des y Calnt2 5 GGGGAAGCCTCTCGCGG3 para C acutatum combinados con el imprima dor universal ITS4 S TCCTCCGCTTATTGA TATGC3 Las combinaciones de imprimadores fueron CgInt e ITS4 y C
12. cular del metabolismo del pat geno El uso de fungicidas de este tipo enfrenta el problema de la selecci n SALAZAR et al Identificaci n molecular del hongo Colletotrichum spp aislado de banano 55 de individuos resistentes en la poblaci n del pat geno blanco Hern ndez 2009 que resulta en una disminuci n en la eficacia de los productos y una p rdida de esta estrategia de combate El cant n de Turrialba provincia de Car tago posee las condiciones agroclim ticas as como disponibilidad de mano de obra v as de comunicaci n cercan a a un puerto entre otras que le confieren el potencial para la producci n de banano de altura En la zona existen algunas plantaciones de banano con las variedades Gros Mitchel y Congo El objetivo de esta investigaci n fue determinar la s especie s de Colletotrichum asociada s con la antracnosis en frutos de banano Musa spp de altura en el cant n de Turrialba y su sensibilidad a los fungicidas tiabendazol ima zalil y miclobutanil MATERIALES Y M TODOS Material vegetal En la presente investigaci n se recolecta ron racimos de banano de las variedades Gros Michel y Congo en 5 zonas del cant n de Turrial ba Cartago ubicadas entre los 440 y los 1160 msnm por lo que se considera banano de altura Cuadro 1 Los racimos recolectados ten an un cali bre entre 38 y 40 32avos de pulgada en el dedo central de la segunda mano de arriba hacia abajo Una vez seleccionado
13. de PCR luego de la electroforesis los geles se colocaron en un transiluminador Kodak EDAS 290 Evaluaci n de la sensibilidad in vitro a 3 fungicidas Para cada fungicida Mertec 50 SC ia tiabendazol Magnate 75 SG ia imazalil y Rally 40 WP ia miclobutanil se prepar una soluci n madre a 2000 yg ml a partir de la cual se obtuvo las concentraciones a evaluar El medio de cultivo papa dextrosa agar PDA Difco Le Pont de Claix Francia fue enmendado con una al cuota de la soluci n madre de manera que se obtuviera las siguientes concentraciones 0 0 0 1 1 0 10 0 100 0 ug mi De cada aislamiento 25 en total se toma ron discos de 8 mm de di metro del borde de una colonia de 7 d as de establecida en medio PDA como se describi anteriormente Los dis cos se colocaron en el centro de las placas Petri en forma invertida de manera que el micelio quedara en contacto directo con el medio PDA enmendado con cada uno de los fungicidas Para cada aislamiento y concentraci n de fungicida se prepararon 4 placas Petri Las placas Petri se incubaron a una temperatura entre 22 C y 24 C durante 8 d as posteriormente se midi el di me tro de la colonia del hongo en forma horizontal y vertical di metro m s largo y m s corto y se calcul el promedio para cada aislamiento en cada tratamiento An lisis de los datos Evaluaci n in vitro de la sensibilidad del crecimiento micelial del hongo Colletotrichum sp a
14. e test sp SHIVAS R TAN Y 2009 A taxonomic re assessment of Colletotrichum acutatum introducing C fioriniae Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 68 AGRONOMIA COSTARRICENSE comb et stat nov and C simmondsii sp nov Fungal Diversity 39 111 122 SOMBARDIER A DUFOUR M BLANCARD D CORIO COSTET M 2010 Sensitivity of Podosphaera aphanis isolates to DMI fungicides distribution and reduced cross sensitivity Pest Manag Sci 66 35 43 SREENIVASAPRASAD S SHARADA K BROWN A MILLS P 1996 PCR based detection of Colletotrichum acutatum on strawberry Plant Pathology 45 650 655 SREENIVASAPRASAD S TALHINHAS P 2005 Genotypic and phenotypic diversity in Colletotrichum acutatum a cosmopolitan pathogen causing anthracnose on a wide range of hosts Molecular Plant Pathology 6 361 378 SUSUKI T TANAKA C EBIHARA Y ITU Y VEMATSU S 2010 Genetic polymorphism and virulence of Colletotrichum gloeosporioides isolated from strawberry Fragaria x ananassa Duchesne Journal of General Plant Pathology 76 247 253 Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 URE A A MACKENZIE S BOWEN B LEGARD D 2002 Etiology and population genetics of Colletotrichum spp causing crown and fruit rot of strawberry Phytopathology 92 1245 1252 VALERO M GARC A S GINER M ARANZAZU A RUIZ J 2010 Benomyl sensitivity assays and species specific PCR reactions highlight association o
15. ec ficos para C acutatum Con estos ltimos se obtuvo amplificaci n nicamente para el ais lamiento control de C acutatum El tama o de producto de PCR fue de 450 pb para CgInt ITS4 y 350 pb para TBCG TBS correspondiente al tama o esperado para la amplificaci n con estos imprimadores de ADN perteneciente a C gloeos porioides Sreenivasaprasad et al 1996 Valero et al 2010 Ambos pares de imprimadores se han utilizado ampliamente para la confirmaci n de C gloeosporioides como el agente causal de la antracnosis en diferentes hospedantes incluidos frutos tropicales como mango mara n y papaya Sreenivasaprasad y Talhinhas 2005 Medeiros et al 2010 Estos resultados coinciden con los obte nidos por Hern ndez 2009 para aislamientos costarricenses provenientes de fincas de banano para exportaci n ubicadas en las zonas Huetar Norte y Huetar Atl ntica y con los de Peres et al 2002 en Brasil y Chung et al 2010 en Taiw n quienes determinaron que C gloeosporioides es el agente causal de la antracnosis en banano Colletotrichum musae ha sido considerada la especie causante de la antracnosis en banano con base en su especificidad por el hospedante Peres et al 2002 Lima et al 2003 Hern ndez 2009 Jeger et al 1995 Sin embargo an lisis filogen ticos recientes indican que C musae y C gloeosporioides son co espec ficas es decir no se diferencian como especie una de la otra Moriwaki et al 2002 y
16. erdi ndose una estrategia de manejo de la enfermedad Los aislamientos asociados a banano de altura en el cant n de Turrialba presentaron una CE pro medio para el tiabendazol de 0 07 ug mI con un rango de 0 008 0 129 ug ml Hern ndez 2009 determin para aislamientos provenientes de un 50 de las fincas bananeras que analiz una CE promedio superior a 3 wg mI Una de las fincas ubicadas en el Valle la Estrella Finca R o La Estrella tuvo una CE de 55 yg m Una proporci n importante de aislamien tos mostr una reducida sensibilidad al imazalil 80 y al miclobutanil 100 Este resulta do concuerda con lo observado por Hern ndez 2009 para aislamientos de Colletotrichum sp recolectados de banano proveniente de zonas silvestres sin aplicaci n de fungicidas y plan taciones comerciales con aplicaci n de fungici das Ambos fungicidas pertenecen al grupo de inhibidores de la desmetilaci n del esterol o en ingl s sterol demethylation inhibitors DMIs por sus siglas en ingl s Una correlaci n positiva entre la sensibilidad o p rdida de sensibilidad a fungicidas dentro de este grupo ha sido observada para diferentes pat genos incluidos aislamientos del g nero Colletotrichum Wong et al 2007 Sombardier et al 2010 SALAZAR et al Identificaci n molecular del hongo Colletotrichum spp aislado de banano 65 La baja eficacia del imazalil sobre ais lamientos de Colletotrichum de banano no es sor
17. f two Colletotrichum gloeosporioides types and C acutatum with rumple disease on Primofiori lemons European Journal of Plant Pathology 3 399 405 VILLALTA R SAMPLE M SHIELDS D GUZMAN M 2006 Evaluaci n de fungicidas y mezclas de fungicidas para el combate de enfermedades poscosecha del banano Musa AAA CORBANA 32 59 17 33 WONG F MIDLAND S DE LA CERDA K 2007 Occurrence and distribution of Qol resistant isolates of Colletotrichum cereale from annual bluegrass in California Plant Disease 91 1531 1546
18. hology 87 516 521 GUERBER J LIU B CORRELL J JOHNSTON P 2003 Characterization of diversity in Colletotrichum acutatum sensu lato by sequence analysis of two gene introns mtDNA and intron RFLPs and mating compatibility Mycologia 95 872 895 GUZMAN M VILLALTA R 2008 Eficacia de mezclas de azoxistrobina com tiabendazole para El combate de enfermedades poscosecha del banano Musa AAA CORBANA 34 61 1 10 HERN NDEZR 2009 Sensibilidad a fungicidas poscosecha e identificaci n molecular del hongo Colletotrichum spp agente causal de la antracnosis en frutos de banano en Costa Rica Tesis de maestr a San Jos Costa Rica 96 p HYDE K CAI L CANNON F CROUCH A CROUS W DAMM U GOODWIN H CHEN H JOHNSTON R JONES G LIU Y MCKENZIE C MORIWAKI J NOIREUNG P PENNYCOOK R PFENNING H PRIHASTUTI H SATO T SHIVAS G TAN P TAYLOR J WEIR S YANG L ZHANG Z 2009 Colletotrichum names in current use Fungal Diversity 39 147 182 HYDE K CAI L MCKENZIE E YANG Y ZHANG J PRIHASTUTI H 2009 Colletotrichum a catalogue of confusion Fungal Diversity 39 1 17 INFOSTAT 2008 Software estad stico Manual de usuario C rdoba Argentina JEGER M EDEN GREEN S JOHANSON A WALLER J BROWN A 1995 Banana diseases In Banana and Plantains Edited by Gowen Chapman and Hall London UK KOLLER W SCHEINPFLUG H 1987 Fungal resistance to sterol biosynthesis inhibitors Plant Disease 71 1066
19. lecular del hongo Colletotrichum spp aislado de banano 63 DISCUSI N Al igual que los bananos producidos co mercialmente en las zonas costeras el banano producido en el cant n de Turrialba banano de altura y cultivados bajo un sistema de no apli caci n de fungicidas tambi n es afectado por la antracnosis lo que podr a limitar su comerciali zaci n como producto fresco de exportaci n En Filipinas peque os productores cultivan banano cerca de sus casas sin la aplicaci n de fungicidas en pre o poscosecha los cuales son exportados a Jap n donde los consumidores prefieren este tipo de producto sin embargo la calidad de los frutos al llegar al mercado final es muy pobre debido a las enfermedades poscosecha entre ellas la antracnosis con una incidencia del 83 Alvindia y Natsuaki 2008 Identificaci n molecular La amplificaci n del ADN mediante PCR con imprimadores espec ficos para C gloeos porioides y C acutatum tanto de la regi n ITS como para una porci n del gen de la B tubulina indic que los 25 aislamientos de Colletotrichum spp Obtenidos de banano de altura en el can t n de Turrialba corresponden a la especie C gloeosporioides Para ambas regiones se obtuvo un producto de PCR con los imprimadores espe c ficos para C gloeosporioides para los aisla mientos provenientes de banano y el aislamiento control de C gloeosporioides proveniente de papaya pero no cuando se utiliz imprimadores esp
20. lina indic que los aislamientos analizados corresponden a la especie Colletotrichum gloeosporioides En cuanto a las pruebas de sensibilidad in vitro todos los aislamientos fueron sensibles al tiaben dazol mientras que existe una marcada insensi bilidad al imazalil y al miclobutanil 1 Autor para correspondencia Correo electr nico esalazar biotek agriculture cr Biotek Agriculture Latinoam rica San Jos Costa Rica PR Plant Pathology and Postharvest Tropical Fruit Aceptado 12 04 12 ABSTRACT Molecular identification of the fungus Colletotrichum spp isolated from banana Musa spp in high lands from Turrialba and determination of their sensitivity to postharvest fungicides Anthracnose is one of the most serious banana post harvest diseases A total of 25 Colletotrichum isolates were obtained from banana fruits grown in 5 areas in Turrialba County Costa Rica 5 isolates per area Isolates were characterized on the basis of polymerase chain reaction PCR using species specific primers of the ITS region and f tubulin gene and their in vitro sensitivities to the fungicides thiabendazole imazalil and myclobutanil at 0 1 1 0 10 0 y 100 0 pg ml All isolates were identified as Colletotrichum gloeosporioides and were sensitive to thiabendazole whereas most isolates showed a marked reduction in sensitivity to imazalil and myclobutanil EE Laboratorio de Fitopatolog a Sede del Atl ntico Universidad de Costa
21. n dise o irrestricto al azar con un arreglo factorial 5x3x5 correspondiente a 5 zonas muestreadas 3 fungicidas Mertec 50 SC Magnate 75 SG Rally 40 WP y 5 concentracio nes de cada uno de los fungicidas 0 0 0 1 1 0 10 0 100 0 ppm con 4 repeticiones Cada unidad experimental consisti de una caja Petri Se com par el valor medio de la CE entre fungicidas para los 25 aislamientos y entre zonas muestrea das para cada fungicida con el programa Infostat Software Estad stico Versi n 2008 RESULTADOS Caracterizaci n molecular La amplificaci n del ADN mediante PCR con los imprimadores especie espec ficos para C Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 gloeosporioides CgInt en combinaci n con el imprimador universal ITS4 produjo un producto de PCR de aproximadamente 450 pb para los 25 aislamientos recolectados en las 5 zonas produc toras de banano de altura del cant n de Turrialba as como para el aislamiento control de C gloeos porioides Cg proveniente de frutos de papaya Un ejemplo de los productos de PCR obtenidos se muestra en la Figura 2 No se obtuvo producto de amplificaci n con el aislamiento control de C acutatum Ca Un producto de PCR de aproxi madamente 500 pb se obtuvo para el aislamiento control C acutatum Ca cuando se emple el par de imprimadores Calnt2 espec fico para C acutatum e ITS4 mientras que no hubo producto de amplificaci n para los aislamien
22. n est ril se rasparon las lesiones sobre la c scara de los frutos de banano que presentaban una cantidad visible de ac rvulos y se coloc el raspado en un erlenmeyer con 25 ml de agua destilada est ril Posteriormente se tom una al cuota de 10 yl y se coloc en una caja Petri con medio de cultivo Agar Agua Bacto Agar Difco Le Pont de Claix Francia enmendado con 0 5 gI de clo ranfenicol para evitar el crecimiento de bacterias La suspensi n de esporas se distribuy sobre la superficie de la caja Petri con ayuda de un asa con el fin de que las esporas quedaran suficientemente separadas Posteriormente las cajas Petri se colocaron en una incubadora por 14 h aproximadamente a una temperatura de 24 C Transcurrido este tiempo y con ayuda de Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 Costa Rica reas bajo estudio en Turrialba 2010 Bryan Alem n M Fuente Atlas 2008 ITCR Proyecci n Transversal de Mercator para Costa Rica CRTMOS Fecha Agosto 2010 Rangos altitudin 1 300 700 MIA 701 1100 HM 1101 1400 HE 1401 1900 Mapa de algunas de las zonas productoras de banano de altura en el cant n de Turrialba Cartago Ramirez 2010 un estereoscopio se identificaron las esporas lige ramente germinadas y se procedi a transferir las esporas individuales a nuevas cajas Petri con el medio de cultivo PDA papa dextrosa agar PDA Difco Le Pont de Claix Francia enmendado con
23. n rot of Embul banana Biocontrol NLD 54 587 596 PERES N KURUMAE E DIAS M DE SOUZA N 2002 Identification and characterization of Colletotrichum spp affecting fruit after harvest in Brazil Journal Phytopathology 150 128 134 P REZ L S ENZ M MAURI F 2001 Control de la pudrici n de la corona de los bananos en Cuba I Eficacia de benzimidazoles imidazoles y triazoles Fitosanidad 5 31 38 PHOULIVONG S CAI L CHEN H MCKENZIE E ABDELSALAM K CHUKEATIROTE E HYDE K D 2010 Colletotrichum gloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits Fungal Diversity 44 33 43 RAMIREZ C 2010 Ubicaci n Geogr fica y Evaluaci n de la Calidad de Fruta de Banano de Altura que se produce en el Cant n de Turrialba Costa Rica Tesis para licenciatura Universidad de Costa Rica Turrialba Costa Rica 69 p RAUT S RANADE S 2004 Diseases of banana and their management Disease of Fruits and Vegetables 2 37 57 ROGERS S BENDICH A 1988 In Plant Molecular Biology Manual S B Gelvin y R A Schilperoort eds Kluwer Academic Publishers echt The Netherlands pp A6 1 11 Modificado por S NCHEZ CHIANG N 2009 Laboratorio de T cnicas Moleculares para la Fitoprotecci n Centro de Investigaciones en Protecci n de Cultivos Universidad de Costa Rica SCHILDER A GILLET J SYSAK R 2001 Evaluation of Fungicides for Control of Anthracnose Fruit rot of blueberries fungicide and infanticid
24. nano en el cant n de Turrialba la baja sensibilidad de los aislamientos al imazalil y al miclobutanil podr a estar asociada al uso de fungicidas del grupo DMIs en otros cultivos en la zona a la inmigra ci n de aislamientos con reducida sensibilidad desde otras reas o a ambos La baja eficacia de los fungicidas imazalil y miclobutanil sobre la especie de Colletotrichum asociada a banano llama a una revisi n de su uso en el control de la antracnosis Recientemente fungicidas del grupo de las estrobirulinas han sido aprobados para su aplicaci n en banano en poscosecha con resultados promisorios Schilder et al 2001 Villalta et al 2006 Es recomendable establecer la l nea base de sensibilidad a los fungicidas antes de su empleo a gran escala Esta informaci n puede ser utilizada posteriormente para evaluar cambios en sensibilidad de la poblaci n del pat geno blanco en los a os siguientes En el presente estudio todos los aislamientos de C gloeosporioides C musae provenientes de banano de altura en el cant n de Turrilaba fueron sensibles al fungicida tiabendazol No obstante la poblaci n mostr un amplio rango de variaci n de CE FR 16 12 lo que indica la posible existencia de aislamien tos con sensibilidad reducida al fungicida De Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 66 AGRONOMIA COSTARRICENSE implementarse el uso de este fungicida en la zona para el combate poscosecha de la ant
25. opiado y genera confusi n Peres et al 2002 Lima et al 2003 Hern ndez 2009 Jeger et al 1995 Phou livong et al 2010 Una variabilidad morfol gica y patog nica entre aislamientos de C musae ha sido observada y se ha demostrado la existencia de razas fisiol gicas o biotipos Moriwaki et al 2002 Peres et al 2002 Ure a et al 2002 Guerber et al 2003 Liu et al 2007 An lisis filogen ticos recientes indican que C musae y C gloeosporoides son conspec ficas es decir una misma especie Du et al 2005 Hern ndez 2009 Phoulivong et al 2010 determinaron que aunque C gloeosporoides y C acutatum han sido consideradas las especies responsables de la antracnosis en frutos tropicales ninguna de estas especies fue identificada como el agente causal de la enfermedad en Laos y Tailandia Su estudio incluy 25 aislamientos provenientes de guayaba mango papaya y banano entre otros Actualmente el combate de la antracnosis en banano se basa en la aplicaci n de fungicidas poscosecha espec ficamente el tiabendazol e imazalil Villalta et al 2006 Guzm n y Villalta 2008 as como la implementaci n de pr cticas culturales en campo y en la planta empacadora para la reducci n del in culo Otros 2 fungicidas registrados para uso poscosecha en banano son el miclobutanil y la azoxistrobina Villalta et al 2006 Guzm n y Villalta 2008 Estos fungicidas son considerados de sitio espec fico e inhiben un proceso parti
26. osecha favorecidos por la edad de cosecha y por el tiempo transcurrido desde su cosecha hasta alcanzar el mercado final de destino Alvindia y Natsuaki 2008 En Costa Rica la informaci n disponible para banano de altura sobre los da os poscosecha y los pat genos asociados es limitada La antracnosis es una de las principales enfermedades poscosecha del banano e influye significativamente en la calidad de la fruta mer cadeable Los s ntomas se presentan como lesio nes ovaladas oscuras y hundidas con presencia de ac rvulos masas de esporas La infecci n del fruto ocurre normalmente en campo durante su desarrollo pero permanece latente hasta que el fruto madura Raut y Ranade 2004 por lo que los s ntomas se manifiestan mayormente durante el almacenamiento y muchas veces en los supermercados La antracnosis es m s severa si el Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 fruto sufre heridas o lesiones como resultado de un mal manejo de la fruta Colletotrichum musae Berk and Curtis Arx ha sido considerada la especie causante de la antracnosis en banano con base en descripciones morfol gicas y el alto grado de especificidad por el hospedante Sin embargo existe evidencia que aislamientos de Colletotrichum provenientes de un mismo hospedante pueden pertenecer a dife rentes especies por lo que el criterio de especi ficidad por hospedante para la identificaci n del agente causal de la enfermedad es inapr
27. presiva a pesar de su uso actual en el com bate de enfermedades poscosecha del banano antracnosis y pudrici n de corona Aked et al 2001 Villalta et al 2006 Demerutis et al 2008 En 1997 De Lapeyre de Bellaire y Dubois en Guadalupe indicaron que el imazalil a pesar de ser otro de los fungicidas aprobados para el com bate de enfermedades poscosecha no pod a ser considerado como un reemplazo del tiabendazol por su baja eficacia en el control de C musae Los resultados del presente trabajo y los de Her n ndez 2009 apoyan esta afirmaci n para las poblaciones costarricenses del agente causal de la antracnosis del banano El uso actual del imazalil a pesar de la presencia de un alto porcentaje de aislamientos con sensibilidad reducida puede estar asociado al hecho de que las dosis aplicadas para el combate de la enfermedad entre 250 y 500 wg mI Villal ta et al 2006 son lo suficientemente altas para proveer un adecuado combate tanto de los aisla mientos sensibles como de aquellos con reducida sensibilidad Una estrategia de combate con base en el uso de dosis de fungicidas del grupo DMIs relativamente altas ha sido propuesta por Koller y Scheinpflug 1987 Sin embargo dosis muy altas pueden ser impr cticas y de costo elevado Por otra parte la alta proporci n de aislamientos con sensibilidad reducida al imazalil indica que fallas en el combate de la enfermedad son previsibles en corto tiempo y que se est ante una
28. racnosis en banano deben emplearse estrategias para limitar la selecci n de cepas insensibles En adici n los datos presentados pueden ser utilizados para monitorear los cambios en sensibilidad de la poblaci n de esta zona en los pr ximos a os Adem s como poblaci n referencia no expuesta al fungicida en estudios de comparaci n de sensi bilidad con poblaciones en contacto frecuente con el fungicida o fungicidas del mismo grupo Por ejemplo poblaciones del pat geno provenientes de plantaciones comerciales para exportaci n como las ubicadas en la zona Atl ntica de Costa Rica A la fecha el m todo de combate m s eficaz contra la antracnosis del banano es el qu mico basado en la aplicaci n de fungicidas principalmente tiabendazol Sin embargo el com bate qu mico enfrenta una serie de problemas y limitaciones como la selecci n de cepas insensi bles al fungicida en diferentes partes del mundo incluida Costa Rica la eficiencia del fungicida que var a en funci n de la poca y la zona de producci n preocupaciones en relaci n con la contaminaci n del medio ambiente y finalmente los consumidores son muy selectivos y prefieren productos que no hayan sido expuestos a agroqu micos particularmente en poscosecha Lassois et al 2010 Este panorama plantea la necesidad de establecer nuevas estrategias no qu micas de combate como medidas preventivas en el campo y en las empacadoras t cnicas de almacena mien
29. s los racimos se desmana ron y empacaron en bolsas pl sticas con papel h medo en su interior y luego se colocaron en cajas pl sticas para su transporte Cada caja se identific con la zona de procedencia y la fecha de muestreo Las cajas pl sticas se colocaron en una c mara de almacenamiento con una tempera tura de 25 C y una humedad relativa del 95 con la finalidad de promover la maduraci n natural de los frutos y la aparici n de los s ntomas de la enfermedad Las cajas se revisaron cada 2 d as para verificar la presencia de signos ac rvulos del pat geno Los aislamientos se realizaron en el Laboratorio de Fitopatolog a de la Universidad de Costa Rica Sede del Atl ntico Turrialba Se escogieron 5 aislamientos para cada una de las 5 zonas del cant n de Turrialba provincia de Car tago Figura 1 Cuadro 1 Zonas productoras de banano de altura en el cant n de Turrialba Cartago donde se obtuvieron los frutos para la investigaci n Zonas Productor Altura msnm Grano Oro Alfredo Arias Jim nez 1160 Piedra Redonda Julio G mez S nchez 920 Celulosa V ctor Morales 440 San Juan Sur Alonso Obando 900 Atirro Feima Sede del Atl ntico 546 Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 56 AGRONOMIA COSTARRICENSE Lugares bajo estudio Principales rios Rios Principales rutas de acceso Fig 1 Obtenci n de aislamientos monosp ricos Con ayuda de una aguja de disecci
30. situaci n cr tica cuya siguiente etapa es la resistencia pr ctica o de campo si no se toman medidas anti resis tencia P rez et al 2001 determinaron una CE promedio de 0 89 ug ml para aislamientos de C musae Esta poblaci n fue sensible al imazalil l nea base Los aislamientos provenientes de banano de altura presentaron una CE promedio de 1 71 ugml aproximadamente el doble con un 20 de aislamientos con una CE promedio 3 veces mayor Para el miclobutanil tanto la CEso pro medio 3 987 yg ml como el factor de rango FR 5 88 de los aislamientos de Colletotrichum asociados a banano de altura fueron casi id n ticos a la CE promedio 3 8 pgmt y al FR 5 4 determinados por Wong et al 2007 para aislamientos de C cereale provenientes de zonas expuestas a fungicidas y con p rdida de sensibili dad Aislamientos recolectados de reas sin histo rial de uso del fungicida l nea base presentaron una CE promedio de 0 72 y g mI en un rango de 0 19 a 1 30 yg mt El FR para esta poblaci n fue de 7 2 En el presente trabajo solo los aislamientos de San Juan Sur mostraron una CE promedio y un rango similar aunque ligeramente m s alto 1 10 1 04 1 17 yg mT El miclobutanil fue uno de los fungicidas DMIs con menor actividad contra C cereale por lo que no se recomienda su uso en el combate de este pat geno Wong et al 2007 Si se considera que no existe un registro o historial de uso de fungicidas en ba
31. tados 1 a 5 y controles Ca corresponde a C acutatum Cg corresponde a C gloesporioides control negativo sin ADN con los imprimadores generados apartir de tubulina TB5 TBCA para C acutatum Sensibilidad del crecimiento micelial del hongo Colletotrichum sp a los fungicidas tiabendazol imazalil y miclobutanil La CE promedio para los 25 aisla mientos vari significativamente p lt 0 01 entre los 3 fungicidas evaluados Cuadro 2 El fungicida tiabendazol present la CE promedio m s baja 0 072 y g ml un rango de 0 008 a 0 129 wg mI seguido por el imazalil 1 70 ng mi dentro de un rango de 0 06 a 5 10 ng mI y el miclobutanil 3 98 qg ml en un rango de 1 07 a 6 30 pg ml El mayor rango Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 en sensibilidad lo present el tiabendazol con 16 12 veces de diferencia entre la CE m s alta y la m s baja FR Imazalil y miclobutanil presentaron un FR similar 4 69 y 5 88 veces respectivamente La frecuencia de aislamientos seg n su CE se presenta en la Figura 6 Para los fun gicidas tiabendazol e imazalil los valores de CE presentaron una distribuci n unimodal mientras que para el miclobutanil se observ una distribuci n bimodal Para el tiabendazol todos los aislamientos presentaron valores promedio de CE menores a 0 55 ngmi SALAZAR et al Identificaci n molecular del hongo Colletotrichum spp aislado de banano 61 Cuadro 2
32. to m todos f sicos y biol gicos de combate Carr et al 2006 Niroshini y Karunaratne 2009 Lassois et al 2010 Maqbool et al 2010 algunas de las cuales ya se implementan o eva l an en plantaciones de banano para exportaci n en Costa Rica Demerutis et al 2008 Para la producci n de banano de altura en el cant n de Turrialba urge investigar la implementaci n de estas medidas de combate si se desea obtener un producto de calidad tanto para exportaci n como para mercado local Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 LITERATURA CITADA AKED S KHAN H MAGAN N 2001 Control of the anthracnose pathogen of banana Colletotrichum musae using antioxidants alone and in combination with thiabendazole or imazalil Plant Pathology 50 601 608 ALVINDIA D NATSUAKI K 2008 Evaluation of fungal epiphytes isolated from banana fruit surfaces for biocontrol of banana crown rot disease Crop Protection 27 81200 1207 CAI L HYDE K TAYLOR P WEIR B WALLER J ABANG M ZHANG J YANG Y PHOULIVONG S LIU Z PRIHASTUTI H SHIVAS G MCKENZIE E JOHNSTON P 2009 A polyphasic approach for studying Fungal Diversity 39 183 204 CARRE V STANGARLIN J BECKER A ZANELLA A GONCALVES JUNIOR A SCHWAN K FRANZENER G CRUZ M 2006 Postharvest control of Colletotrichum musae in banana Musa sp with camphor Artemisia camphorata and chitosan Journal Scientia Agraria Paranaensis Brasil 5 57 66
33. tos prove nientes de banano de altura Figura 3 ni para el control de C gloeosporioides En ambos casos el tamafio de los productos de PCR correspon den al esperado con los imprimadores especie especificos 450 pb C gloeosporioides y 500 pb C acutatum respectivamente Sreenivasaprasad et al 1996 La amplificaci n del ADN de los 25 aislamientos provenientes de banano de altura con los imprimadores especie especificos TBCG C gloeosporioides yYTBCA C acutatum en combinaci n con el imprimador TB5 corres pondientes a una regi n del gen de la f tubulina coincidi con los resultados anteriores Un pro ducto de PCR de aproximadamente 350 pb se observ para todos los aislamientos provenientes de banano y para el aislamiento control de C gloeosporioides Cg cuando se emple el par SALAZAR et al Identificaci n molecular del hongo Colletotrichum spp aislado de banano 59 PP TEN Fig 2 9 10 Ca Cg Electroforesis en gel de agarosa de productos PCR obtenidos del ADN ribosomal de los aislamientos de Colletotrichum proveniente de frutos de bananos infectados 1 a 10 y controles Cg corresponde a C gloeospo rioides Ca corresponde a C acutatum control negativo sin ADN con los imprimadores CgInt ITS4 Fig 3 Electroforesis en gel de agarosa de productos PCR obtenidos del ADN ribosomal de los aislamientos de Colletotrichum proveniente de frutos de bananos infectados 1 a 10 y controles
34. ultado contrasta con lo observado para aislamientos provenientes de zonas bananeras de producci n intensiva para exportaci n tanto en Costa Rica Hern ndez 2009 como en otros pa ses De Lapeyre de Bellaire y Dubois 1997 donde se ha encontra do aislamientos insensibles al tiabendazol Para Costa Rica Hern ndez 2009 determin que el porcentaje de aislamientos insensibles al tiaben dazol vari de un 25 a un 66 seg n la finca La p rdida de sensibilidad al tiabendazol ha sido asociada al uso de fungicidas del mismo Agronom a Costarricense 36 1 53 68 ISSN 0377 9424 2012 grupo benzimidazoles para el combate de enfer medades en campo pre cosecha particular mente benlate para el combate de la Sigatoka Amarilla Mycosphaerella musae De Lapeyre de Bellaire y Dubois 1997 Los aislamientos analizados provienen de una zona sin historial de aplicaci n de fungicidas en banano a excepci n de Atirro FEIMA lo que explicar a la ausencia de aislamientos con p rdida de sensibilidad al tiabendazol Aislamientos provenientes de areas regu larmente expuestas a los fungicidas muestran por lo general una CE mayor que la de aislamientos de zonas sin uso frecuente de fungicidas debido a la presi n de selecci n que ejerce el agroqu mico Wong et al 2007 En algunos casos la pobla ci n puede volverse insensible al fungicida lo que se refleja en el campo como falta de combate del pat geno resistencia de campo p
35. y Karunaratne 2009 De Lapeyre de Bellaire et al 2010 posiblemente hasta determi nar si otras regiones del genoma permiten separar ambas especies y validar la taxonom a molecular dentro del g nero Colletotrichum Hyde et al 2009 Shivas y Tan 2009 Phoulivong et al 2010 Por otra parte se ha demostrado que Colletotrichum gloeosporioides es una especie compleja que contiene varias especies gen ti ca y biol gicamente separadas por ejemplo Colletotrichum asianum Colletotrichum fraga riae Colletotrichum fructicola Colletotrichum gloeosporioides sensu stricto B Weir y PR Johnst Colletotrichum kahawae J M Waller y Bridge and Colletotrichum siamense y se ha denominado complejo gloeosporioides Phouli vong et al 2010 C gloeosporioides sensu stricto incluir a a los aislamientos reconocidos como C gloeosporioides De manera que cabe la posibili dad que los 2 pares de imprimadores utilizados en el presente estudio no sean espec ficos para C gloeosporioides sensu stricto sino que identi fican a miembros del complejo gloeosporioides An lisis filogen ticos basados en diferentes loci permitir n dilucidar esta situaci n Sensibilidad a fungicidas Todos los aislamientos evaluados fueron sensibles al tiabendazol Ning n aislamiento pre sent una CE igual o superior a 1 0 ug mi a partir de la cual los aislamientos se consideran insensibles al fungicida De Lapeyre de Bellaire y Dubois 1997 Este res
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