Manual de Usuario del programa Confocal Uniovi ImageJ
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1. Label Slides cada imagen del montaje ir se alada por un n mero que indica la posici n de dicha imagen en la serie El tama o de este n mero lo podemos modificas con al opci n Front size El siguiente ejemplo realiza un montaje de una serie de 30 secciones pticas tomando una de cada 2 secciones empezando en la secci n 2 y terminando en la 28 Make Montage Columns a Rows Scale Factor First Slice Last Slice Increment Border Width Font Size Y Label Slices Use Foreground Color OK Cancel Visor de imagenes 3D Realiza reconstrucciones en tres dimensiones de una serie de im genes sucesivas de un volumen de muestra y las visualiza en diferentes formatos Al pulsar en el icono se nos abre la ventana de visualizacion Previamente tenemos que tener abiertas la serie de imagenes que queremos visualizar Para cargar una serie de imagenes en la ventana de visualizacion iremos a File Add content Se abrira el siguiente menu 25 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 ma ej 3 File Edit Select Transformation View Help Tel ge D Vie ve Series005 Green v Name Series005 Gree Display as Volume Color Threshold 0 Resamplingfactor 2 Channels red WM green v blue OK Cancel Los par metros que debemos seleccionar son Image Seleccionaremos la serie de im genes que queremos visualizar podemos seleccionar cualquier serie de im2. el Y o el Z Slide spacing es la distancia entre secciones pticas Para im genes obtenidas con el microscopio confocal Leica TCS SP2 AOBS el equipo guarda esta informaci n en el fichero TXT Abriremos el fichero txt del experimento pulsando el icono leer TXT y buscaremos el valor de Voxel Depth um 16 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Initial angle indicaremos el ngulo donde queremos iniciar la animaci n Total rotation indicaremos los grados totales de la animaci n Rotation angle increment indicaremos el incremento en ngulos entre una posici n y la siguiente Los par metros de Lower transparency bound Upper transparency bound y Opacity est n relacionados con la intensidad de los pixels en la reconstrucci n 3D Se recomienda dejar los que aparecen por defecto Surface Depth Cueing y Interior Depth Cueing Dejar el dato que aparece por defecto s lo se aplica en series con un gran n mero de secciones pticas Interpolate Si marcamos esta casilla el programa genera la informaci n entre planos obteniendo una reconstrucci n 3D de mayor calidad Si la dejamos sin marcar los p xeles correspondientes a zonas entre planos aparecen en negro Es aconsejable utilizar esta opci n aunque el proceso de reconstrucci n sea m s lento a q Ei Secciones ortogonales Permite realizar secciones ortogonales de un v
3. 3DAnimMax 00 40008 ch00 tif F MA convallaria 3DAnimMax 00 A0003 ch01 tif PM convallaria 3DAnimMax 00 40008 ch01 tif F MA convallaria 3DAnimMax_00_A0003_ch02 tif PM convallaria 3DAnimMax_00_40008_chO02 tif A Nombre de archivo Archivos de tipo Todos los archivos En EN Abrir archivos simples Permite abrir cualquier imagen tiff tanto de confocal como de cualquier otra fuente Al pulsar el bot n se nos abrir el explorador de archivos y seleccionaremos el fichero de imagen t1ff que nos interesa WE Salvar TIFF Permite salvar como tiff la imagen seleccionada Al pulsar el bot n se nos abrir el explorador de archivos buscaremos la carpeta donde queremos guardar el fichero escribiremos el nombre del fichero y pulsaremos el bot n guardar Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Save as TIFF Guardar en P 2007 12 05 Convallaria s amp s 051207 E 051207_Senies04 1_2006_chO0 MN 051207_Series041_7013_ch00 5 051207 E 051207_Seres041_7006_ch01 19 051207_Series041_7013_ch01 8 051207 _Series041_2000_ch00 W 051207_Senes04 1_2007_ch00 MM 051207 _Series041_7014 cho 051207_ Series041_2000_ch01 M 051207_Series041_2007_ch01 M 051207_Series041_2014_cho1 051207 Series041_2001_ch00 051207 Series041_2008_ch00 19051207 _Series041_2015_ch00 E 051207_Series041_2001_chO1 BM 051207_Series041_7008_ch01 Bll 051207_Series041_7015_ch01 E 051207_Series04 1_2002_ch00 MN 051207_Series04 1_2009_ch00 MN 051207_Ser
4. contraste de fases incluyendo su nombre en el campo correspondiente a Imagen gris Seleccionando la opci n Keep Source Image las im genes originales de cada color no se eliminan de la pantalla Con esta funci n podemos mezclar im genes individuales o series Cargar LUT Permite aplicar una paleta de colores a una imagen serie proyecci n Al pulsar este icono se abre la siguiente ventana Seleccionando una de las paletas de colores nuestra imagen se visualizar con esa gama de colores 20 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Animar series Permite observar la serie en forma de animacion Al pulsar este icono se activa una barra que se adosa a la derecha de la imagen activada S1 pinchamos en otra imagen la barra se desplaza a la nueva imagen seleccionada a y 5 30 238 10x238 10 m 1024x1024 RGB 120MB gt E i g ES E lt BERVVAA En la barra de animar series encontramos los siguientes botones Start animation pulsar para empezar la animaci n Stop animation pulsar para parar la animaci n Animation options abre una nueva ventana en la que podemos definir las opciones de la animaci n 2l Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Animation Options Speed 0 1 1000 fps FirstFrame Last Frame Y Loop Back and Forth l Start Animation OK Cancel Podemos modificar
5. genes que tengamos abierta Name El nombre de este contenido en el visor Puede haber m s de un contenido visualiz ndose simult neamente Display as M todo de visualizaci n del volumen Tenemos tres opciones o Volume La imagen se visualiza como un volumen con la informaci n de todos los p xeles en el espacio tridimensional o OrthoSlice Se visualizan tres secciones ortogonales x y z o Surface Se visualiza un volumen renderizado Color Permite seleccionar el color en el que queremos visualizar el objeto Threshold En caso de que elijamos la opci n surface indica la porci n de volumen que se visualiza en funci n de su intensidad Las zonas del volumen que tienen una intensidad por debajo del valor de Threshold no se visualizan Resampling factor Es el factor por el que la serie de im genes es remuestreada para realizar la renderizaci n Un factor de 1 utilizar todas las secciones para renderizar un factor de 3 utilizar 1 de cada 3 secciones en la renderizaci n Cuanto menor es este factor m s exacta es la renderizaci n y m s tarda en realizarla Channels Si estamos visualizando una imagen en color marcaremos los canales que queremos visualizar En caso de im genes monocromas podemos dejar marcados los tres 26 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 A continuaci n pueden verse tres tipos de visualizaci n 3D de la misma serie de ha 7 Im genes e Image 3D Viewer O w E j dei
6. la velocidad de la animacion Speed imagenes por segundo y tambi n indicar cu l ser la primera imagen First Frame y la ultima Last Frame Si activamos la opci n Loop Back and Forth la animacion ira del inicio al final y del final al inicio efecto ping pong Si se alamos la opci n Start animation la animaci n se activar inmediatamente al pulsar la casilla OK ka Go to first slice abre la primera imagen de la animaci n Previous slice abre la imagen anterior de la animaci n Next slice abre la imagen siguiente de la animaci n gt l Last slice abre la ltima imagen de la animaci n pres da Delete slice elimina la imagen de la ventana Add slide a ade una imagen en negro Duplicate slide duplica la imagen de la ventana Cierra el men de animar series 22 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 El Zoom Permite ampliar o reducir el tama o de la imagen activada Al pulsar este icono se activa una barra con funciones de zoom que se adosa a la derecha de la imagen activada S1 pinchamos en otra imagen la barra de zoom se desplaza a la nueva imagen seleccionada MAX SeriesD41 Red 507 Dentro de la barra de zoom encontramos los siguientes botones 3 1 Zoom out Pulsando este bot n se disminuye el zoom de la imagen hasta Reset zoom Elimina el zoom y deja la imagen a
7. n de la configuraci n del microscopio y las caracter sticas de adquisici n de las im genes del fichero objetivos ganancia apertura del pinhole tama o de la imagen etc Al pulsar el bot n se nos abrir el explorador de archivos buscaremos el subdirectorio del experimento que nos interesa y seleccionaremos el fichero de texto txt Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 d Leica List Opener Buscar en de convallaria convallaria avi MA convallaria 3DAnimMax_ 00 A0004_ch00 tif F _ convallaria lei MA convallaria 3DAnimMax 00 A0004 ch01 tif F A convallaria 3DAnimMax_00_A0004_ch02 tif F aria SDAnimMax 00 40000 ch00 tif YM convallaria 3DAnimMax 00 A0005_ch00 tif F convallaria 3DAnimMax 00_A0000_ch0L tif M convallaria 3DAnimMax_00_40005_ch01 tif A A convallaria 3DAnimMax_00_A0000_ch02 tif M convallaria 3DAnimMax_00_40005_ch02 tif A A convallaria 3DAnimMax 00_A0001_ch00 tif PM convallaria 3DAnimMax_00_A0006_ch00 tif convallaria 3DA4nimMax 00 A0001 ch01 tif PM convallaria 3DAnimMax 00 40006 chO1 tif MA convallaria 3DAnimMax 00 A0001_ch02 tif PM convallaria 3DAnimMax 00 40006 ch02 tif M MA convallaria 3DAnimMax 00_A0002 ch00 tif PM convallaria 3DAnimMax_00_A40007 ch00 tif M MA convallaria 3D AnimMax 60 A0002_ ch01 tif PM convallaria 3DAnimMax_00_A0007 chO1 tif M MA convallaria 3DAnimMax 00 40002 ch02 tif M convallaria 3DAnimMax 00_A0007_ch02 tif F MA convallaria 3DAnimMax 00 A0003 ch00 tif M convallaria
8. o no queremos interpolaci n none S1 la casilla Craete new window est activada la nueva imagen aparecer en una nueva ventana Si se desactiva esta opci n la imagen original se elimina y s lo aparecer la imagen escalada X Scale Y Scale width pixels Height pixels 512 Interpolation Bilinear Fill with Background Color lv Create new window MAX_Series041 R OK Cancel Title Calibrar imagen Con esta funci n podremos realizar una calibraci n de la imagen de manera que las medidas que hagamos se obtengan en unidades reales micras mm cm etc Para calibrar una imagen podemos proceder de dos maneras 1 Si tenemos marcada en la imagen una distancia conocida En este caso con la herramienta linea lt del men de ImageJ marcaremos la distancia conocida 11 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 A continuaci n pulsaremos en el icono calibrar la imagen y se nos abrir el siguiente men Distance in Pixels Known Distance Pixel Aspect Ratio 10 Unit of Length micras Click to Remove Scale M Global Scale 0 238 pixels micras El primer valor Distance in pixels corresponde a la longitud en pixeles de la linea marcada y no debemos tocarlo El siguiente valor Know Distance corresponde a la distancia en unidades reales de la linea marcada en este caso 400 micras El siguiente valor pixel ratio se refiere a l
9. 0006 _ch02 tif AA convallaria 3DAnimMax 00 _A0002 chO0 tif M convallaria 3DAnimMax_00_40007_ch00 tif A convallaria 3DAnimMax 0 A0002 ch01 tif M convallaria 3DAnimMax_00_40007_ch01 tif PA convallaria 3DA4nimMax 00 40002 ch02 tif M convallaria 3DAnimMax_ 00_A0007 ch02 tif F PA convallaria 3DA4nimMax 00 A0003 ch00 tif M convallaria 3DAnimMax 00 40008 ch00 tif F PA convallaria 3DA4nimMax 00 A0003 ch01 tif PM convallaria 3DAnimMax 00 40008 ch01 tif F MA convallaria 3DAnimMax_00_A0003_ch02 tif PM convallaria 3DAnimMax_00_40008_ch02 tif A 4 1 Nombre de archivo Archivos de tipo Nos aparecer la siguiente ventana que nos permite escoger que imagen o conjunto de im genes en caso de que se trate de una serie queremos abrir y en caso de tener m s de un canal si queremos verlas como im genes separadas o intercaladas en una serie d Select Images to Open W Split channels convallaria ft contains image aries MW SeriesO05 FT 3DAnimMax 00 OK Cancel Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Es aconsejable seleccionar la opci n de Split Channels para ver los canales como imagenes separadas S1 la imagen tiene m s de una secci n podemos desplazarnos por todo el conjunto moviendo la barra de la parte inferior SernesD05 Red b 23 50 118 82x118 82 m 512x512 8 bit 13MB i JUN A Es r Leer TXT Permite abrir el fichero de texto del archivo Leica para conocer la informaci
10. 0x1024 pixels RGB 4 1MB 29 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Pegar im genes Esta funci n permite pegar im genes consecutivas para formar una nica imagen mosaico de im genes Las im genes deben de tener una parte com n para que el programa realice la uni n de forma correcta Al pulsar en el icono nos aparece un mensaje pidi ndonos el n mero de im genes a pegar N de im genes 3 OK Cancel Abre imagen 1 del mosaico Pulsaremos OK y seleccionaremos la primera imagen a continuaci n nos pedir abrir la imagen siguiente que compone el mosaico Esta imagen debe de tener una parte en com n con la primera 30 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Una vez abierta la segunda imagen el programa iniciar la funci n de pegado Deberemos esperar hasta que nos aparezca la imagen resultante dependiendo del tama o de las im genes y de la potencia del ordenador este proceso puede llevar su tiempo imagesum 50 oo E 3 1701x1025 pixels RGB 6 7MB eer eS Una vez mostrada la imagen resultante si tenemos mas imagenes para pegar el programa pedira que abramos la siguiente y la pegara al mosaico de las dos anteriores Este proceso se repetira hasta que haya pegado todas las imagenes 31 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Cuando se trata de realizar mosaicos compuestos de varias filas de im genes es a
11. Image 30 Viewer ait Y Image 3D Viewer Fie Edit Select Transformation View Help ls de Edt Select Transiorma on Fie Edit Select Transformation View Help Volume Orthoslice Surface Para variar la vista del objeto utilizaremos las siguientes combinaciones de herramientas de ImageJ y botones del rat n Herramienta de Image Rota Mover el rat n pulsando el bot n izd Desplazar am Pulsar la tecla shift y mover el raton pulsando el bot n izd Como es posible tener m s de un contenido visualiz ndose simult neamente podemos rotar simult neamente todos los contenidos o uno de ellos Para rotar un contenido pulsaremos sobre l para seleccionarlo y nos aparecer un recuadro marcando el contenido Si realizamos la operaci n de rotar nicamente girar ese contenido Para rotar todos los contenidos hay que pulsar con el rat n en una zona en que no haya nada para deseleccionar todos los contenidos Una vez deseleccionados si realizamos la rotaci n nos rotar todo Es posible cambiar el color o el modo de visualizaci n de un contenido para ello primero debemos seleccionar dicho contenido nos parecer el recuadro rojo y a continuaci n pulsando en edit seleccionaremos display as para cambiar el modo de visualizaci n o attributes para cambiar los atributos de la imagen color transparencia threshold etc La opci n fill selection del men edit ofrece la posibilidad de elimin
12. Men Inicio ConfocalUniovi ImageJ Tareas Adicionales Iconos adicionales Crear un icono en el escritorio Una vez finalizado el proceso de instalaci n nos aparece la siguiente ventana indicandonos que se complet con xito la instalaci n he Completando la instalaci n de ConfocalUniovi El programa complet la instalaci n de ConfocalUniovi en su sistema Puede ejecutar la aplicaci n haciendo clic sobre el icono instalado Haga clic en Finalizar para salir del programa de instalaci n S1 durante la instalaci n hemos seleccionado la opci n correspondiente al finalizar la instalaci n en el escritorio nos aparecer un icono para acceder directamente al programa Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Funcionamiento Al arrancar el programa nos aparecen dos men s el general de ImageJ y el que contiene las funciones de ConfocalUniovi ImageJ Fie Edit Image Process Analyze Plugins Window Help ab AJAO zkunt fam gt 0 olclo lt 4 Wand tracing tool A continuaci n se describen cada una de las funciones incluidas en el men Confocal Uniovi Para conocer el funcionamiento del menu principal de ImagJ ir a la documentaci n on line de la p gina Web http rsb info nih gov ij docs Leer imagen del Confocal Leica Permite abrir im genes almacenadas en el formato del Microscopio Confocal Leica TC
13. S SP2 AOBS Este equipo almacena las im genes por experimentos Cada experimento se almacena en un subdirectorio que contiene un fichero lei para la apertura del experimento en el microscopio confocal un fichero de texto txt con la informaci n de la configuraci n del microscopio objetivos ganancia apertura del pinhole tama o de la imagen etc y un conjunto de im genes que a su vez pueden estar formadas por series de im genes de uno o varios canales Cada una de las im genes es un fichero t1f Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Al pulsar en el bot n se nos abrir el explorador de archivos buscaremos el subdirectorio del experimento que nos interesa y seleccionaremos el fichero de texto txt d Leica List Opener Buscar en m convallaria convallaria avi MA convallaria 3DAnimMax_ 00 _A0004_ch00 tif M _ convallaria lei MA convallaria 3DAnimMax_00 A0004 ch01 tif F A convallaria 3DAnimMax_00_40004_ch02 tif F lara 3D AnirmMax 00_A0000_ch00 tif PM convallaria 3DAnimMax_00_40005_ch00 tif P a convallaria 3DAnimMax_00_A0000_ch01 tif M convallaria 3DAnimMax_00_40005_ch01 tif F A convallaria 3DAnimMax_00_A0000_ch02 tif M convallaria 3DAnimMax_00_A0005_ch02 tif F convallaria 3DAnimMax_ 00 40001 _ch00 tif PM convallaria 3DAnimMax_ 00_A0006_ch00 tif PA convallaria 3DAnimMax 00 A0001 ch01 tif PM convallaria 3DAnimMax 00 40006 chO1 tif PA convallaria 3DAnimMax 00 A0001 ch02 tif PM convallaria 3DAnimMax 00 4
14. a relacion longitud anchura del pixel Siempre que trabajemos con pixeles cuadrados su valor sera 1 0 En el campo Unit of Length teclearemos las unidades de medida micras en este caso Finalmente marcaremos el campo global si queremos que este factor de calibraci n se aplique 12 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 a todas las im genes que abramos En caso de que deseemos que se aplique s lo a esta imagen lo dejaremos sin marcar 2 si conocemos el valor de calibraci n del p xel de la imagen En el caso de las im genes obtenidas con el microscopio confocal Leica TCS SP2 AOBS el equipo guarda la calibraci n del p xel en el fichero TXT Abriremos el fichero txt del experimento buscaremos el valor de la calibraci n del p xel suele venir como voxel with y voxel height y teclearemos su valor en el campo Know Distance En el campo Distance in Pixels pondremos el valor 1 y el resto de los valores haremos como en el caso anterior EL E Distance in Pixels 1 Known Distance 0 23 Pixel Aspect Ratio 1 0 Unit of Length micras Clickto Remove Scale i Global Scale no scale OK Cancel Finalmente pulsaremos OK para aplicar esta calibraci n En este momento aparece en la parte superior de la imagen la informaci n de sus dimensiones reales con las dimensiones en p xeles entre par ntesis Pintar barra de escala Con est funci n podemos inc
15. ar zonas de nuestro volumen Esta opci n s lo funciona en el modo de visualizaci n de volumen Para trabajar con esta opci n primero seleccionaremos el volumen del que queremos eliminar una zona a continuaci n en el men de ImageJ seleccionaremos la herramienta de dibujo a mano alzada a continuaci n marcaremos con el rat n la zona a 2 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 eliminar y seleccionaremos edit f11l selection La zona de volumen seleccionada se nos borrar de la imagen Con esta opci n podemos cortar un volumen para ver lo que hay detr s File Edit Image Process Analyze Plugins Window Help OJO la lala Alz elemzo Esta funci n utiliza el pluging 3D Viewer desarrollado por Benjamin Schmid Albert Cardona Mark Longair Johannes Schindelin 2 uu Par estereosc pico Permite crear un par estereosc pico a partir de una serie de im genes Al pulsar el icono se abre una ventana en la que se alaremos la opci n Red Green Anapelyph 28 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Stereo Pairs E Angle of rotation a Try angles between 5 10 Red Cyan Anaglyph V Red Green Anaglyph Stereo Pair Rotation movie OK Cancel El programa comienza a generar las dos proyecciones y finalmente muestra la imagen Red Green que deberemos ver utilizando las gafas estereosc picas LD Red Green 50 E JE 104
16. consejable realizar los mosaicos de cada fila individualmente y posteriormente juntarlos Esta funci n utiliza el pluging Stitching desarrollado por S Preibisch S Saalfeld P Tomancak 3 Es Seleccionar ROI Permite seleccionar una regi n de inter s ROI del ingl s region of interest en nuestra imagen o serie Al pulsar este icono aparece un mensaje en la pantalla para duplicar la imagen con el fin de que al extraer la regi n de inter s no perdamos la imagen original Tite Series005 Red 1 OK Cancel Una vez duplicada la imagen aparece el siguiente mensaje Selecciona una herramienta marca la regi n de Inter s y pulsa OK ok Desde el men principal de ImageJ ver icono deberemos seleccionar la herramienta necesaria para dibujar la ROI Podemos seleccionar un rect ngulo 1 un c rculo 2 un pol gono 3 o un dibujo a mano alzada 4 32 M anual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 File Edit Image Process Analyze Plugins Window Help ocio a NALS OIE 2 Kem gt Tras dibujar la ROI en nuestra imagen serie pulsaremos la casilla OK en el mensaje y la imagen se ajustar s lo a la ROI dibujada Si queremos dibujar varias ROIs en la imagen debemos mantener pulsada la tecla may sculas Shift ha lt Ajustar Nivel Gris Permite realizar un ajuste del brillo y contraste de la imagen o serie Al pulsar el icono
17. ecimales Median cada pixel de la proyecci n corrresponde al valor de la mediana de los p xeles de esa columna El tipo de proyecci n m s utilizado habitualmente es el Max intensity 15 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Si deseamos hacer una proyecci n de un n mero determinado de secciones dentro de la serie podemos escribir el n mero de la imagen de inicio y de final de la proyecci n en los apartados Start slide y Stop slide respectivamente Ja Proyecci n 3D Permite realizar en forma de animaci n una proyecci n en Z desde distintos ngulos para tener una vision completa de la estructura tridimensional de la muestra Para utilizar est funci n debemos trabajar con una serie de im genes Al pulsar el icono de reconstrucci n 3D aparece la siguiente ventana 3D Projection Projection Method Axis of Rotation Slice Spacing m Initial Angle 0 359 degrees Total Rotation 0 359 degrees Rotation Angle Increment Lower Transparency Bound Upper Transparency Bound Opacity 0 100 Surface Depth Cueing 0 100 Interior Depth Cueing 0 100 Interpolate OK Cancel Projection method Nos permite elegir entre 3 m todos Nearest point Brightest Point y Mean value El m s utilizado es el Brightest Point Axis of rotation Podemos elegir entre rotar la reconstrucci n tridimensional en el eje X
18. eren al menos 107 4 MB de espacio libre en el disco Introduciremos el nombre de la Carpeta del Men de Inicio y volveremos a pulsar siguiente Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Instalar ConfocalUniovi Seleccione la Carpeta del Men Inicio D nde deben colocarse los accesos directos del programa iT El programa de instalaci n crear los accesos directos del programa en la 4 siguiente carpeta del Men Inicio Para continuar haga clic en Siguiente Si desea seleccionar una carpeta distinta haga clic en Examinar Confocal Uniovwi ImageJ S1 deseamos crear un icono de acceso directo en el escritorio marcaremos la opci n correspondiente Seleccione las Tareas Adicionales Qu tareas adicionales deben realizarse Seleccione las tareas adicionales que desea que se realicen durante la instalaci n de ConfocalUniovi y haga clic en Siguiente Iconos adicionales Crear un icono en el escritorio Finalmente se nos presentar n las opciones elegidas y si estamos de acuerdo pulsaremos el bot n de Instalar Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 ip Instalar Confocaluniovi Listo para Instalar Ahora el programa est listo para iniciar la instalaci n de ConfocalUniovi en su sistema Haga clic en Instalar para continuar con el proceso o haga clic en Atr s si desea revisar o cambiar alguna configuraci n Carpeta de Destino ccNmaged Carpeta del
19. ero de Excel Al pulsar el recuadro Copy copiamos los valores de intensidad del histograma y podemos pegarlos en un documento de texto Word o en un fichero de datos Excel Si estamos trabajando con una serie podemos ir viendo el histograma de cada imagen de la serie S1 queremos conocer el histograma de una regi n concreta de la imagen serie dibujaremos con el rat n un rect ngulo sobre la imagen y el histograma se aplicar a la regi n dibujada lJ Pulsando este icono desaparece el menu general de ImageJ y solo queda en pantalla el men que contiene las funciones de ConfocalUniovi ImageJ S1 queremos volver a activar el men general de ImageJ pulsaremos de nuevo en el icono 36 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Referencias 1 W S Rasband ImageJ U S National Institute of Health MD 1997 2010 http rsb info nih gov 1 2 Benjamin Schmid Johannes Schindelin Albert Cardona Mark Longair and Martin Heisenberg A high level 3D visualization API for Java and ImageJ BMC Bioinformatics 2010 11 274 3 S Preibisch S Saalfeld P Tomancak 2009 Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions Bioinformatics 25 11 1463 1465 37
20. h ASTURIAS b JAR UNIVERSIDAD DE OVIEDO gt CAMPUS DE EXCELENCIA A Mi Vicerrectorado de Investigacion y INTERNACIONAL 10003215060 Campus de Excelencia Internacional AD FUTURUM Manual de Usuario del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 ngel Mart nez Nistal Marta Alonso Guerv s SERVICIOS CIENT FICO T CNICOS Servicio de Microscop a Fot nica y Proceso de Im genes Edificio Severo Ochoa Campus de El Cristo c Fernando Bonguera s n 33006 OVIEDO Tel 985103659 Correo electr nico procesoimagenes uniovi es http www10 uniovi es spi UE ASTURIAS y UNIVERSIDAD DE OVIEDO CAMPUS DE EXCELENCIA ry Vicerrectorado de Investigacion y INTERNACIONAL DU AAA Campus de Excelencia Internacional AD FUTURUM INDICE Contenido A E E E AA E E E E O A l A E ae eer ener ee l Funcionamiento cocococcccaoanaonaannnnonon nono ono nono non non nono non nono nn nono teresen ren iensen aieas nesnosne seste 5 Leer imagen del Confocal ea 5 Jaen 1 a E E EEE E OE E E AEA 10 Calbrar imac A E suateiaeaneanaaes 11 Pintar Barra de Escalada dades 13 Proy CCN Lars 15 OA o O E 16 o A A 17 Separar bandas COLOT cccccnnnnnnonoooononoconnnnnonnnnnnnnnnnnnnnnnnno nono no nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnns 19 Mezclar oandas CONOR tna 19 Carsar LUT eee ee E eee eee eee ene ee ee ene 20 a o eee eee te eee err eree ere 21 ZOO rn o A 23 LO E o E O 24 VISO dema ies caes 25 EA A acct a pees eet csc E eee 30 Sekeocio
21. ies041_2016 _choo 9 051207_ Series041_2002_ch01 M 051207_Series041_2009_chO1 M 051207_Series041_2016 cho1 051207 _Series041_2003_ch00 M 051207 Series041_2010_ch00 MN 051207 Series041 2017 cho0 E 051207_Series041_7003_ch01 051207_Seres041_7010_ch01 M 051207_Series041_2017_ch01 9 051207_Series04 1_2004_ch00 M 051207_Series041_2011_ch00 M 051207_Serjes041_7018_ch00 E 051207_Series041_2004_ch01 9 051207_Series041_7011_ch01 19 051207_Serjes041_7018_ch01 9 051207_SeriesO41_2005_ch00 MN 051207 Series041_2012 ch00 MM 051207 Series041_2019 h00 1051207 Series041_2005_ch01 M 051207_Series041_2012 ch01 M8 051207_Series041_2019 _cho1 Si ail Nombre de archivo C OO Archivos de tipo Todos los archivos S1 el fichero es una serie de im genes se salvar toda le serie en un nico fichero de imagen x Cerrar imagenes Al pulsar sobre est icono se cierran todas las im genes abiertas j PAEA Duplicar imagen Permite duplicar el fichero seleccionado ya sea una serie o una nica imagen EA PA S1 tenemos seleccionada la ventana de una imagen al pulsar el bot n se abrir la siguiente ventana Duplicate Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Escribiremos un nombre para denominar la nueva imagen o dejaremos el que nos asigna el programa por defecto pulsaremos OK y se crear una copia de la imagen EA EA S1 tenemos seleccionada la ventana de una serie al pulsar el bot n se abri
22. la lo podemos poner en negrita marcando la casilla Bold Text cambiar entre dos tipos de letra marcando la casilla Serif Font o cambiar el tama o de letra escribiendo en Font Size Si marcamos la casilla Hide text el texto desaparece y s lo veremos la barra de escala E E Proyecci n Z Permite realizar una proyecci n en Z a partir de una serie de im genes Al pulsar el icono de proyecci n Z aparece la siguiente ventana _ ZProjection Start slice 1 Stop slice 30 Projection Type C Max Intensity OK Cancel ES En la opci n Projection Type podemos seleccionar entre varios tipos de proyecciones Average Intensity cada pixel de la proyecci n corresponde con el valor medio de cada columna Max Intensity cada pixel de la proyecci n corresponde con el p xel de valor m ximo de cada columna Min Intensity cada pixel de la proyecci n corresponde con el p xel de valor m nimo de cada columna Sum Slides cada pixel de la proyecci n corresponde con la suma de los valores de los p xeles de esa columna La imagen resultante es una imagen de 32 bits por p xel para que los valores de la imagen resultante puedan ser superiores a 255 Standard Deviation cada pixel de la proyecci n corrresponde a la desviaci n standard de los p xeles de esa columna La imagen resultante es una imagen de 32 bits por p xel para que puedan tener p xeles con valores d
23. luir una barra de escala en una imagen serie proyeccion Primero debemos haber calibrado la imagen de trabajo siguiendo las instrucciones explicadas en el apartado anterior Calibrar imagen Al pulsar el icono se abrir la siguiente ventana 13 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 ScaleBar Plus Width in m Height in pixels Font Size Color White v Background None v Location Lower Right vV Bold Text Hide Text Serif Font Label all Slices OK Cancel Escribiremos en with in m la longitud de barra de escala que deseamos a adir a nuestra imagen serie proyecci n y en Hight in pixels el grosor de la barra de escala En Location podemos escoger la posici n donde colocar la barra de escala upper 29 66 right lower right lower left upper left La opci n at selection no funciona El color de la escala ser el de la paleta de colores LUT que tenga la imagen seleccionada por tanto las opciones Color y Background de la escala no tienen utilidad y es preferible dejarlas como aparecen por defecto Color White y Background None 14 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 S1 tenemos una serie abierta y activamos la opci n Label all Slices la barra de escala aparecer en todas las im genes de la serie El texto que sale debajo de la barra de esca
24. n conjunto de botones que facilitan su utilizaci n por los usuarios Instalaci n ConfocalUniovi Image J incluye la versi n para Windows de ImageJ Para su instalaci n se necesita un ordenador con Windows 2000 XP Vista o 7 con 512 Mb de RAM Se puede descargar de la p gina web del Servicio de Proceso de Im genes de la Universidad de Oviedo http www sct uniovi es index php option com_content amp task view amp 1d 224 amp Itemid 145 Una vez descargado el fichero setup Confocal Uniovi ImageJ exe lo ejecutaremos y comenzar su instalaci n Nos aparece la pantalla siguiente Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 15 Instalar ConfocalUniovi_ Bienvenido al asistente de instalaci n de ConfocalUniovi Este programa instalar ConfocalUniovi ImageJ 1 0 en su sistema Se recomienda que cierre todas las dem s aplicaciones antes de continuar Haga clic en Siguiente para continuar o en Cancelar para salir de la instalaci n Pulsaremos siguiente y nos preguntar por el directorio de instalaci n dejaremos el que nos aparece por defecto que ser c imageJ y pulsaremos siguiente ig it Conoco aa Seleccione la Carpeta de Destino D nde debe instalarse ConfocalUniovi El programa instalar Confocal Lniovi en la siguiente carpeta Para continuar haga clic en Siguiente Si desea seleccionar una carpeta diferente haga clic en Examinar am Se requi
25. nir RO a ne ne ee ne ee 2 AN kG E a E EA E ANA E 33 SE O A I E A E E E 34 FAAS OO Ann eh Ta EO ae E E E i 35 A PP EE EE een atene meee 36 e E Aa 37 Edificio Severo Ochoa Campus de El Cristo c Fernando Bonguera s n 33006 OVIEDO Tel 985103659 Correo electr nico procesoimagenes uniovi es http www10 uniovi es spi Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Introducci n ConfocalUniovi Image J es una colecci n de funciones y plugins del programa ImageJ dirigidas a visualizar y procesar im genes obtenidas con el Microscopio Confocal Leica TCS SP2 AOBS Image J es un programa de proceso y an lisis de imagenes de dominio p blico open source realizado en lenguaje Java Su author Wayne Rasband 1 trabaja en el Research Services Branch National Institute of Mental Health Bethesda Maryland USA Existen versiones del programa para Windows Mac y Linux Con el paso de los a os el programa se ha visto complementado por un creciente n mero de plugins y macros desarrolladas por un gran n mero de colaboradores Estos plugins se pueden a adir a conveniencia al programa original Toda la informaci n sobre ImageJ se puede encontrar en http rsb info nih gov 1 En ConfocalUniovi ImageJ se han agrupado junto al programa ImageJ una serie de plugins de gran utilidad para el proceso de im genes de confocal Todas las funciones del programa se agrupan en una interface gr fica con u
26. olumen de una serie de forma interactiva desplaz ndose en cualquier eje sobre la serie y pudiendo capturar im genes Para utilizar est funci n debemos trabajar con una serie de im genes Al pulsar el icono aparece la ventana del visor interactivo de volumen de ImageJ 17 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 FA Volume Viewer 1 24 ell Slice Trilinear G aspect 6 12699 v Axes W markers En el centro aparece la imagen del visor interactivo c rculo azul En la zona inferior de la ventana tenemos las opciones para l cambiar la escala de la imagen que aparece en el visor interactivo Scale 2 activar o desactivar los ejes axes y las marcas Markers del visor interactivo 3 cambiar el ngulo de visi n del volumen pulsando en las casilla xy yz xz 4 definir en angle of rotation el ngulo x y z con el que nosotros queremos estudiar nuestro volumen Para desplazarnos interactivamente sobre el volumen de nuestra serie pulsaremos la barra indicada con una flecha roja en la ventana del visor interactivo de volumen de ImageJ y desplazaremos el rat n La imagen del visor interactivo ir cambiando seg n nos desplacemos en los ejes seleccionados En el margen izquierdo de la ventana se representa la informaci n de los tres ejes xy xz y yz y se se ala en cada eje con una l nea la posici n a la que corresponde la imagen que aparece en el visor inte
27. os cambios realizados sobre la imagen serie Una vez ajustados los valores de segmentaci n pulsaremos el bot n Apply y se abrir una nueva ventana Convert to Mask Convert all images in stack to binary Calculate Threshold for Each Image OK Cancel Deberemos activar la opci n Dark background y pulsar OK El resultado final de segmentaci n ser una imagen binaria en la que el fondo tiene un valor de 0 y la se al de inter s tiene un valor de 255 we Histograma interactivo Permite conocer el histograma de intensidad de se al de nuestra imagen Podemos aplicarlo a toda la imagen o a una regi n concreta de la imagen Al pulsar el icono aparece la siguiente ventana 35 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Live histogram of MAX_Serjes041 328x240 pixels RGB 308K 0 Count 1048576 Min 3 Mean 54 289086342 Max 255 StdDev 53 815310722Mode 4 107189 Value 148 List Copy Linear vw Copy fount 1129 Min Plot 0 Max Plot We Auto Manual Min Bin 0 Max Bin 255 S1 seleccionamos el modo manual podemos cambiar las escalas del histograma Los valores Min Plot y Max Plot son para el eje Y y los valores Min Bin y Max Bin son para el eje X Al pulsar el recuadro List se abre una nueva ventana con los valores de niveles de intensidad del histograma Este listado lo podemos guardar como una tabla de datos fich
28. r la siguiente ventana Duplicate Eq Title ETE l Duplicate Stack Range 1 30 OK Cancel Si marcamos la casilla duplicate stack y pulsamos OK se crear una copia de la serie S1 queremos duplicar s lo una imagen de la serie desactivaremos la casilla duplicate stack y escribiremos en la casilla range el n mero de posicionamiento de dicha imagen en el ejemplo se selecciona la secci n n mero 4 de las 30 secciones totales de la serie Duplicate bq Title Series041 Red 1 l Duplicate Stack Range Q D OK Cancel S1 queremos duplicar un rango de im genes de una serie en la casilla range escribiremos el rango que deseamos por ejemplo 1 10 y nos duplicar las 10 primeras imagenes de la serie tH Escalar imagen Permite modificar el numero de pixeles de una imagen 10 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Al pulsar el icono se abre una ventana en la que podemos escribir el n mero de pixeles de la nueva imagen o bien el factor de aumento o reducci n que le queremos aplicar Cuando se trata de im genes cuadradas el valor de X scale o Yscale ser n iguales lo mismo sucede con los valores de ancho width y altura height En caso de que estemos aumentando el n mero de p xeles de la imagen debemos indicar si queremos que los p xeles se creen como interpolaci n de los existentes con sus vecinos m s pr ximos bilinear o c bica
29. ractivo Si queremos salvar la imagen que aparece en el visor interactivo pulsaremos la casilla save view en la zona superior derecha de la ventana 18 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 o Separar bandas color Permite separar una imagen RGB en tres im genes independientes rojo verde y azul m Mezclar bandas color Genera una imagen mezcla a partir de im genes de tres bandas de colores distintos Esta funci n permite mezclar im genes de dos o tres fluorocromos distintos en una nica imagen Por ejemplo si tenemos las tres im genes siguientes FluomecertC ell pg y d FlvorescentCellsjpg blue Oaeh e A a prwame JRE Wavelets EN BRA y el A y 15121517 phais Sdit 245k ETAST pixels B bIl 246K Al pulsar en este icono se abre la ventana p Merge b Xal Red FluorescentCells jpg red Green FluorescentCells pg green Blue FluorescentCells jpo blue Gray None Create Composite W Keep Source Images OK Cancel 19 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Se seleccionar para cada color el nombre de la imagen correspondiente En nuestro ejemplo queremos mezclar una imagen roja una verde y una azul y no tenemos imagen gris La imagen resultante es la siguiente di RGB G 60 x512 pixels RGB 1MB A esta imagen de tres bandas de fluorescencia se le podr a a adir una imagen de transmisi n o de
30. se abre la siguiente ventana Bac EER Minimum Maximum Brightness Contrast Moviendo las barras buscaremos el mejor ajuste de brillo y contraste para nuestra imagen 33 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Los botones inferiores en la ventana nos permiten Auto Image J aplica autom ticamente el ajuste de niveles de gris que el programa cree adecuado para la imagen Reset elimina los cambios realizados Set permite escribir el valor m nimo y el valor m ximo de intensidad para la imagen serle Apply aplica los cambios realizados sobre la imagen serie 7 gt Segmentaci n Permite trasformar nuestra imagen o serie en una imagen binaria Threshold Y Dark background Auto Apply Reset Set Moviendo las barras buscaremos los mejores valores de segmentaci n para nuestra imagen El recuadro se alado en rojo nos permite escoger entre diferentes m todos de segmentaci n En el recuadro se alado en azul seleccionaremos la opci n B amp W y la opci n Dark background debe estar activada Los botones inferiores en la ventana permiten Auto Se aplica autom ticamente el m todo de segmentaci n elegido en la ventana anterior 34 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Reset elimina los cambios realizados Set permite escribir el valor m nimo y el valor m ximo de segmentaci n para la imagen serte Apply aplica l
31. tama o real 100 Zoom in Aumenta el zoom hasta 3200 Cierra el men de zoom 23 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 Montaje Permite realizar una galer a de fotos a partir de una serie de im genes Al pulsar este icono se abre una ventana con las opciones para realizar el montaje A Columns Rows Scale Factor First Slice Last Slice Increment Border Width Font Size Label Slices Use Foreground Color OK Cancel En este menu podemos seleccionar el numero de columnas y filas que queremos en el montaje Colums y Rows respectivamente Con la opci n Scale Factor el programa reajusta el tama o de cada imagen en funci n del n mero de columnas y filas definidas Las opciones First slice y Last slice permiten seleccionar cu l queremos que sea la imagen inicial y la imagen final de la serie para el montaje Con la opci n Increment podemos seleccionamos todas las im genes de la serie increment 1 o una imagen s y otra no increment 2 etc Con Border With podemos dejar una imagen al lado de la siguiente sin separaci n Border With 0 o separar cada imagen en el montaje con una l nea Border With 1 S1 incrementamos el valor de Border With el grosor de la l nea aumenta 24 Manual del programa Confocal Uniovi ImageJ Versi n 1 2 S1 se alamos la opci n
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