tensioactivos pulmonares peptidicos sinteticos con antioxidantes
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1. Mezcla n PCs PCio Restauraci n ACPT A CPT SEQ ID N 2 3 52 2 75 2 83 5 HBB Aoc Glu Trp Glu Lys N Ha SEQ ID N 3 2 33 2 59 2 43 6 Trl Aoc Glu Trp Aib Lys NH gt SEQ ID N 5 3 55 4 77 2 81 7 HBB Aoc Glu Trp Ala Lys NH Lista de secuencias 1 INFORMACION GENERAL i SOLICITANTE McLean Larry R Edwards Judson V ii TITULO DE LA INVENCION Tensioactivos pulmonares pept dicos sint ticos con antioxidantes covalentemente unidos iii NUMERO DE SECUENCIAS 5 iv DIRECCION PARA CORRESPONDENCIA A DESTINATARIO Marion Merrell Dow Inc B CALLE 2110 East Galbraith Rd D ESTADO Ohio C CIUDAD Cincinnati P O Box 156300 E PAIS EEUU E ZIP 45215 6300 v FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR A TIPO DE MEDIO Disco flexible B ORDENADOR IBM PC Compatible C SISTEMA OPERATIVO PC DOS MS DOS D PAQUETE DE APLICACIONES PatentIn Release 1 0 versi n 41 25 vi DATOS DE LA SOLICITUD EN CURSO A NUMERO DE SOLICITUD US B FECHA DE PRESENTACION 16 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 C CLASIFICACION vii DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA A NUMERO DE SOLICITUD US 07 923 092 B FECHA DE PRESENTACION 31 JUL 1992 viii INFORMACION SOBRE EL PROCURADOR AGENTE A NOMBRE Collier Kenneth J B NUMERO DE REGISTRO 34 982 C NUMERO DE REFEREN2. D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa lisin 1 amida 40 xi DESCRIPCION DE LA SECUENCIA SEQ ID N 2 Xaa Trp Glu Xaa 1 45 2 INFORMACION PARA SEQ ID N 3 i CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA A LONGITUD 4 amino cidos Ni B TIPO amino cido D TOPOLOGIA lineal 55 ii TIPO DE MOLECULA p ptido ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado 60 B LOCALIZACION 1 18 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa N alfa N cido 6 hidroxi 2 5 7 8 tetrametilcroman 2 car box lico aminooctanoil ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado B LOCALIZACION 1 D INFORMACION ADICIONAL nota lo anterior acabado en cido glut mico Trl Aoc Glu ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado B LOCALIZACION 4 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa cido 2 aminoisobut rico Aib ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado B LOCALIZACION 5 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa lisin 1 amida xi DESCRIPCION DE LA SECUENCIA SEQ ID N 3 Xaa Glu Trp Xaa Xaa 1 5 2 INFORMACION PARA SEQ ID N 4 i CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA A LONGITUD 4 amino cidos B TIPO amino cido D TOPOLOGIA lineal ii TIPO DE MOLECULA p ptido ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modifica
3. cido 3 5 di t butil 4 hidroxicin mico 4 HBA cido 2 3 5 di t butil 4 hidroxifenil ac tico 5 di HBA cido 2 2 di 3 5 di t butil 4 hidroxifenil ac tico 6 Trl cido 6 hidroxi 2 5 7 8 tetrametilcroman 2 carbox lico conocido tambi n como Trolox Preferiblemente se utilizan HBB HBP HBC HBA di HBA y Trl cuando el grupo funcional es un grupo alcoh lico o un grupo amino Dentro del grupo de tensioactivos unidos por un terminal se puede elegir un agrupamiento preferido para formar un agrupamiento m s preferido tal como HBB y Trl Los compuestos antioxidantes anteriores son asequibles en el mercado o su s ntesis es conocida en la t cnica v g el cido 3 5 di t butil 4 hidroxifenilac tico est descrito en Izv Akad Nauk SSSR Ser Khim 358 1965 y el 3 5 di t butil 4 hidroxibenzaldeh do est descrito en J Org Chem 22 1333 1957 En general en la presente invenci n se puede utilizar cualquier compuesto antioxidante que 1 se pueda unir al polip ptido de la presente invenci n 2 presente actividad antioxidante mientras est unido al polip ptido y 3 permita que el polip ptido act e como se describe aqu Trl Glu representa una mol cula que tiene un enlace pept dico formado entre trolox y un resto glutamilo donde el trolox est unido al grupo a amino de un resto de cido glut mico como se muestra a continuaci n 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
4. 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 DESCRIPCION Esta invenci n se refiere a la s ntesis de una serie de polip ptidos de 3 a 4 amino cidos que tienen antioxidantes covalentemente unidos al p ptido ya sea directamente o a trav s de una regi n terminal de uni n Estos p ptidos modificados son tiles como tensioactivos pulmonares sint ticos que tienen antio xidantes tiles formando parte estructural del p ptido Tambi n se describe la preparaci n de mezclas de estos polip ptidos con l pidos el m todo para su producci n y composiciones farmac uticas que son eficaces en el tratamiento del s ndrome de disnea respiratoria de los mam feros Antecedentes de la invenci n Los pulmones est n en un equilibrio delicado entre los oxidantes t xicos y las actividades protectoras de los sistemas de defensa antioxidantes Un desequilibrio en este sistema ya sea por un incremento de los agentes oxidantes o una disfunci n de los sistemas de defensa antioxidantes protectores puede conducir a episodios patofisiol gicos en los pulmones causando disfunci n pulmonar Un tipo de disfunci n pulmonar a la que puede contribuir un incremento de los agentes oxidantes es el s ndrome de disnea respiratoria SDR El s ndrome de disnea respiratoria infantil es causa de muerte en los primeros 28 d as de vida El SDR infantil afecta a 1 de cada 100 lactantes en todo el mundo y aproximadamente el 10 por ciento muere El s ndrome raramente
5. PC5 suficiente 3 PC5 ensayo x 100 PC5 suficiente PCs deficiente y se hace por an lisis mono modal de varianza utilizando el procedimiento de los modelos lineales generales con contrastes espec ficos de los valores medios SAS Institute Inc Cary NC La irrigaci n y el tratamiento con mezclas de ensayo no produjeron cambios en la CPT absoluta mayores que 6 Resultados Los preparados administrados a la rata ten an una apariencia transl cida El limbo de desinflado de la curva de presi n volumen P V en pulmones de rata adulta se analiz calculando el porcentaje de capacidad pulmonar total CPT a una presi n de 5 cm de H20 PC5 y la CPT a 10 cm de H20 PC10 La restauraci n basada en los valores de PC se utiliz para comparar las mezclas de ensayo DPPC solo no tuvo ning n efecto significativo sobre las curvas de presi n volumen P V de pulm n irrigado Las actividades de las mezclas de p ptido DPPC se indican en la Tabla 2 TABLA 2 Eficacia de tensioactivos sint ticos en el modelo pulmonar irrigado de rata adulta Mezcla n PCs PCio Restauraci n ACPT A CPT suficiente 50 68 1 87 1 100 deficiente 50 17 1 45 1 0 DPPC 4 13 1 31 2 11 8 SEQ ID N 1 2 48 5 733 65 5 HBB Aoc Glu Trp Aib Lys NH gt 15 10 15 20 ES 2 107 048 T3 TABLA 2 Continuaci n Eficacia de tensioactivos sint ticos en el modelo pulmonar irrigado de rata adulta
6. ES 2 107 048 T3 O HO li a o E CH2 2 COOH Como se indica por el ejemplo Trl Glu el resto antioxidante en este caso donde X Db y B un enlace junto con un grupo carbonilo C O puede unirse al extremo a amino del polip ptido para formar Db C O A A gt 9 Az Ay Y Los polip ptidos de esta invenci n se pueden preparar por diversos procedimientos f cilmente cono cidos por los expertos en la t cnica tales como qu mica en fase de soluci n Un m todo preferido es el procedimiento secuencial en fase s lida que puede utilizar m todos autom ticos tales como el sintetizador de p ptidos ABI En el procedimiento secuencial en fase s lida ocurren las siguientes etapas 1 un primer amino cido que tiene un grupo a amino protegido se une a una resina soporte 2 el grupo carbox lico de un segundo amino cido que tiene un grupo a amino protegido se activa 3 el primer amino cido se desprotege con un reactivo que permita que el primer amino cido permanezca unido a la resina y 4 ocurre la copulaci n entre el grupo a amino del primer amino cido y el grupo carbox lico activado del segundo amino cido Estas etapas se repiten con nuevos restos de amino cido lo que permite la formaci n del p ptido Cuando se ha formado la longitud deseada de p ptido el p ptido de puede modificar con un resto antioxidante apropiadamente copulado antes de ser separado de la resina despro tegido y aislado Alternativamente el p pti
7. Paciente representa un mam fero por ejemplo un ser humano pero sin limitarse a este Los siguientes ejemplos muestran algunos m todos de preparaci n del polip ptido complejo de po lip ptido l pido y materiales de partida de la presente invenci n La presente invenci n no se limita a los ejemplos siguientes ni a estos m todos de preparaci n Las abreviaturas utilizadas en los ejemplos no definidas previamente son las siguientes TBDMS Tetrabutildimetilsililo SEt Etiltio Suc Succinilo TFA Acido trifluoroac tico Bzl Bencilo Ot Bu t butil ter que acompa an a la qu mica convencional de Boc y a la qu mica convencional de Fmoc que es la qu mica utilizada con el sintetizador de p ptidos ABI para los ciclos Boc y los ciclos Fmoc respectivamente 10 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 Procedimientos qu micos experimentales Ejemplo 1 S ntesis de p ptidos y otros productos qu micos Los p ptidos se sintetizaron en una escala de 0 5 milimoles por m todos de fase s lida en un sintetizador de p ptidos modelo 430 A de Applied Biosystems Inc Foster City CA Se utiliz resina de p Metilbenzoxihidrilamina pMBHA para dar amidas C terminales al desanclar el p ptido Los Na t Boc t butiloxicarbonil amino cidos con protecci n en las cadenas laterales Cis etiltio Glu bencilo y Lys 2 clorobenciloxicarbonilo de Peptides International se copularon doblem
8. tal como etanol o trifluoroetano o un agente desnaturalizante tal como hidrocloruro de guanidinio o urea lo que mejora la solubilidad del p ptido en la suspensi n acuosa La asociaci n de p ptido y l pido puede ser promovida a un pH particular as que el pH de la soluci n acuosa puede variar de 2 a 10 El m todo preferido para mezclar p ptido y l pido es a adir p ptido seco al l pido en agua a 45 50 C y mezclar en un ba o ultras nico a 45 50 C durante 30 90 minutos despu s liofilizar y conservar la mezcla a 20 C Opcionalmente los l pidos se pueden mezclar con un detergente adecuado tal como octilgluc sido o desoxicolato de sodio a una relaci n en peso de 1 a 20 partes de detergente por parte de DPPC en agua un tamp n acuoso o soluci n salina a concentraciones de 1 a 100 mg de DPPC ml Despu s se a ade un p ptido como un polvo seco o suspendido en soluci n acuosa con o sin un disolvente org nico agente 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6 o ES 2 107 048 T3 desnaturalizante o detergente Despu s la mezcla se dializa filtra centrifuga o cromatograf a para sepa rar el detergente Preferiblemente los l pidos y p ptidos se mezclan en un disolvente org nico vol til con o sin una peque a cantidad de agua El disolvente vol til se evapora bajo una corriente de nitr geno o argon en una estufa a vac o O por evaporaci n rotatoria ya sea antes o despu s de la adici n de un d
9. 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 Se prepar Aoc Glu OBzl Trp Glu OBzl Lys N 2C1Z pMBHA utilizando una resina Lys N 2CIZ pMBHA colocada en el sintetizador de p ptidos ABI430A y se sintetiz utilizando qu mica t Boc convencional Para sintetizar el p ptido 2A se mezclaron cido N hidroxi di t butilbenzoico HBB 501 mg dimetilformamida 4 ml y cloruro de metileno 4 ml y se a adi una soluci n de diciclohexilcar bodiimida 8 ml de una soluci n 0 5 M en cloruro de metileno y la mezcla se agit durante 5 minutos para dar el anh drido sim trico de HBB que despu s se copul a Aoc Glu OBzl Trp Glu OBzl Lys N 2C1Z pMBHA en un exceso de 4 veces para cada una de dos copulaciones El p ptido protegido HBB Aoc Glu OBzl Trp Glu OBzl Lys N 2C1Z pMBHA se desancl de la resina y los grupos protectores de las cadenas laterales se separaron tratando HBB p ptido resina en HF anhidro que conten a anisol al 5 y sulfuro de dimetilo al 5 a 5 C durante 1 hora Despu s se extrajo el p ptido de la resina con acetonitrilo al 50 en cido trifluoroac tico al 0 1 se congel y se liofiliz Despu s el p ptido se purific por CLAE en fase reversa para dar el compuesto del t tulo 2 B Preparaci n del complejo de DPPC con el polip ptido descrito en el ejemplo 2 A El p ptido 2 A se mezcl con DPPC esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 1 Ejemplo 3 3 A Preparaci n del polip
10. 60 ES 2 107 048 T3 vac o para dar 2 propil 3 t butil 5 isopropil benzoquinona Se disuelven 2 propil 3 t butil 5 isopropilbenzoquinona 10 mmoles 1 1 3 3 tetrametildisiloxano 1 79 ml 10 mmoles y yodo 0 05 g en cloruro de metileno 30 ml La soluci n se agita a reflujo durante 30 minutos y se extrae con hidr xido de sodio 1N 30 ml La fase acuosa se acidula con cido clorh drico concentrado y se extrae en acetato de etilo 4 x 10 ml se seca Na2SO4 y se evapora el disolvente a vac o para dar 2 propil 3 t butil 4 hidroxi 5 isopropilfenol Se disuelven 2 propil 3 t butil 4 hidroxi 5 isopropilfenol 2 0 moles y ortoformiato de trimetilo 0 3 ml en metanol 1 2 ml y se desgasifica La mezcla se pone en atm sfera de nitr geno y se enfr a a 3 C y se a ade cido sulf rico concentrado 5 ml Se a ade gota a gota metilvinilcetona 340 ml 4 0 moles y se agita sin enfriar durante 44 horas La mezcla se vierte en hidr geno carbonato de sodio acuoso y se extrae con ter et lico El extracto se seca MgSO4 y el disolvente se evapora a vac o para dar 2 metoxi 2 metil 7 t butil 5 isopropil 8 propilcroman 6 ol Se disuelve 2 metoxi 2 metil 7 t butil 5 isopropil 8 propileroman 6 ol 2 moles en piridina 600 ml y se a ade anh drido ac tico 900 ml La mezcla se desgasifica y agita en atm sfera de nitr geno durante 18 horas Se vierte en hielo agua y se agita durante 3 horas Se extrae en ter et lico se seca MgSO4
11. R4 NOH Ri R2 2 R5 OH Da Db donde Bl es B C O B C O C O NH B C O y B es un enlace alquileno C1 16 o alquenileno C2 16 y donde R1 Ra Rg Ra Rs Re y R7 en cada caso son independientemente alquilo C1 6 e Y es un sustituyente del carboxilo de Ay elegido entre grupos hidroxi amino alquilamino y alcoxi Adem s los p ptidos de esta invenci n se pueden asociar con un l pido que comprende uno o m s del tipo asociado con tensioactivo pulmonar natural Estos complejos de polip ptido l pido y sus composiciones farmac uticas son tiles en el tratamiento de s ndrome de disnea respiratoria de los mam feros Breve descripci n de los dibujos La Figura 1 es una representaci n en rueda helicoidal de un tensioactivo pept dico de diez restos utilizado para desarrollar un modelo para p ptidos cortos La vista es desde abajo del cuerpo de la h lice y las cadenas laterales de los restos est n indicadas en sus posiciones respecto del eje de la h lice La cara hidrof bica incluye los restos a la derecha en el dibujo que son Trp Leu Leu Leu Leu y Leu La cara hidrof lica incluye los restos cargados Lyst Glu Glu y Lys La Figura 2 es un ejemplo de un antioxidante tetrapept dico dise ado sobre la base de una sola vuelta de la proyecci n de la rueda helicoidal del p ptido de diez restos mostrado en la Figura 1 La cara hi drof bica del p ptido de la Figura 1 ha sido reemplazada por Trp Ala
12. a a 0 5 C Se a ade gota a gota una soluci n de cloruro de isobutirilo 0 533 mmoles en ter diet lico anhidro 1 5 ml La mezcla se agita a 0 5 C durante 1 5 horas se vierte en una mezcla de hielo y cido clorh drico concentrado 0 15 ml y se separa la fase org nica Se lava con acetato de etilo carbonato de sodio acuoso al 5 y salmuera Se seca MgSO4 y se evapora el disolvente a vac o para dar 2 2 6 trimetil 4 heptanona Se disuelve cloruro de vinilmagnesio 0 7 mmoles en ter diet lico anhidro 1 ml se pone en atm sfera de argon y se enfr a a 1 5 C Se a ade gota a gota una soluci n de cloruro de butirilo 0 533 mmoles en ter diet lico anhidro 1 5 ml Se agita a 0 5 C durante 1 5 horas se vierte en una mezcla de hielo y cido clorh drico concentrado 0 15 ml y se separa la fase org nica Se lava con agua carbonato de sodio acuoso al 5 y salmuera Se seca MgSO4 y se evapora el disolvente a vac o para dar propil vinil cetona Se disuelve 2 2 6 trimetil 4 heptanona 0 4 moles en metanol 10 ml y se a ade t but xido de potasio 12 g 0 1 moles Se a ade gota a gota una soluci n de propilvinilcetona 0 2 moles en metanol 10 ml Se agita durante 10 minutos y la mezcla de reacci n se distribuye entre ter et lico y salmuera Se separa la fase org nica y se lava con salmuera hasta neutralidad Se seca NasS04 y se evapora el disolvente a 13 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
13. caso son independientemente alquilo C1 6 e Y es un sustituyente del carboxilo de A elegido entre grupos hidroxi amino alquilamino y alcoxi 3 un polip ptido de f rmula X A A2 Az Ay Y o uno de sus is meros pticamente activos o una de sus sales farmac uticamente aceptables en donde Al es un enlace o Glu Ao es Trp o Glu As es Aib Glu Gln Leu Ala u Orn y As es Lys X tiene la f rmula Da o Db R3 H3C Bi o R4 NOH Ri R2 a R5 OH Da Db donde Bl es B C O B C O C O NH B C O y B es un enlace alquileno C1 16 o alquenileno C2 16 y donde R1 Ra Rg Ra Rs Re y R7 en cada caso son independientemente alquilo C1 6 e Y es un sustituyente de 1 carboxilo de A4 elegido entre grupos hidroxi amino alquilamino y alcoxi 4 Un polip ptido seg n una de las reivindicaciones 1 3 en que Al es Glu 5 Un polip ptido seg n una de las reivindicaciones 1 3 en que Az es Trp 6 Un polip ptido seg n una de las reivindicaciones 1 3 en que Ag es Aib 7 Un polip ptido seg n una de las reivindicaciones 1 3 en que As es Ala 22 ES 2 107 048 T3 8 Un polip ptido seg n una de las reivindicaciones 1 2 en que As es Lys 9 Un polip ptido seg n una de las reivindicaciones 1 3 en que X es Da 5 10 Un polip ptido seg n la reivindicaci n 9 en que cada uno de R y Ra es t butilo 11 Un polip ptido de una de las reivindicaciones 1 10 en que Y es amino 12 Un polip ptido seg n una de las reivindic
14. el disolvente se evapora a vac o y el residuo se purifica por cromatograf a para dar acetato de 2 metoxi 2 metil 7 t butil 5 isopropil 8 propileroman 6 ilo Se disuelve acetato de acetato de 2 metoxi 2 metil 7 t butil 5 isopropil 8 propilcroman 6 ilo 2 mo les en acetona 2 5 litros y se a ade agua 2 litros seguida de cido clorh drico concentrado 16 6 ml Se destila el disolvente de la mezcla agitada hasta que la temperatura alcanza 90 C La suspensi n se enfr a se diluye con ter et lico y se lava con hidr geno carbonato de sodio acuoso Se seca MgSO4 el disolvente se evapora a vac o y el residuo se purifica por cromatograf a para dar acetato de 2 hidroxi 2 metil 7 t butil 5 isopropil 8 propileroman 6 ilo Se suspende hidruro de sodio 47 2 g de suspensi n al 56 en aceite mineral 1 10 moles en tetra hidrofurano anhidro 1 litro Se pone en atm sfera de nitr geno y se a ade gota a gota una soluci n de acetato de 2 hidroxi 2 metil 7 t butil 5 isopropil 8 propilcroman 6 ilo 0 5 moles en tetrahidrofurano 1 litro La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 18 horas y despu s se calienta a reflujo durante 4 horas Despu s se enfr a se evapora el disolvente a vac o y el residuo se purifica para dar el compuesto del t tulo Ejemplos biol gicos Los m todos para ensayar la eficacia de los preparados tensioactivos sint ticos son bien conocidos en la t cnica Por ejemplo los preparados tensioactivos s
15. inorg nico Acidos inorg nicos ilustrativos que pueden formar sales adecuadas incluyen cido clorh drico bromh drico sulf rico y fosf rico y sales met licas cidas tales como mono hidr geno ortofosfato de sodio e hidr geno sulfato de potasio Acidos org nicos ilustrativos que forman sales adecuadas incluyen cidos mono di y tricarbox licos Como ejemplos de estos cidos se pueden citar cido ac tico glic lico l ctico pir vico mal nico succ nico glut rico fum rico m lico tart rico c trico asc rbico maleico hidroximaleico benzoico hidroxibenzoico fenilac tico cin mico salic lico 2 fenoxibenzoico y cidos sulf nicos tales como cido metanosulf nico y cido 2 hidroxietanosulf nico Entre las sales del resto de amino cido carboxi terminal se incluyen las sales de cido carbox lico no t xicas formadas con cualquier base org nica o inorg nica adecuada Ilustrativamente estas sales inclu yen las de metales alcalinos como por ejemplo sodio y potasio metales alcalinot rreos tales como calcio y magnesio metales ligeros del Grupo IIIA incluyendo aluminio y aminas org nicas primarias secun darias y terciarias como por ejemplo trialquilaminas incluyendo trietilamina proca na dibencilamina 1 etenamina N N dibenciletilendiamina dihidroabietilamina N alquil inferior piperidina y cualquier otra amina adecuada Los fosfol pidos de los complejos de prote na fosfol pido de esta inve
16. n 17 o 18 en que el polip ptido es HBB Aoc Glu Trp Glu Lys NH2 SEQ ID N 1 3 23 Un complejo seg n la reivindicaci n 17 o 18 en que el polip ptido es HBB Aoc Glu Trp Glu Lys NH2 SEQ ID N 2 24 Un complejo seg n la reivindicaci n 17 o 18 en que el polip ptido es Trl Aoc Glu Trp Aib Lys m NH SEQ ID N 3 25 Un complejo seg n la reivindicaci n 17 o 18 en que el polip ptido es HBB Glu Trp Aib Lys NH2 SEQ ID N 4 26 Un complejo seg n la reivindicaci n 17 o 18 en que el polip ptido es HBB Aoc Glu Trp Ala Lys 55 NH SEQ ID N 5 27 Uso de un complejo de acuerdo con la reivindicaci n 17 para la preparaci n de un medicamento para el tratamiento del s ndrome de disnea respiratoria en un sujeto que lo necesita 60 28 Uso de un complejo de acuerdo con la reivindicaci n 18 para la preparaci n de un medicamento para el tratamiento del s ndrome de disnea respiratoria en un sujeto que lo necesita 24 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 29 Uso de un complejo de acuerdo con la reivindicaci n 27 28 donde DPPC constituye el compo nente principal del l pido 30 Uso de un complejo de acuerdo con la reivindicaci n 27 28 donde dicho l pido es una mezcla de DPPC y PG 31 Uso de un complejo de acuerdo con la reivindicaci n 27 28 donde dicho l pido comprende aproximadamente 85 100 de DPPC y aproximadamente 0 15 de PG 32
17. o mezcla de l pidos 50 elegidos del grupo formado por DPPC PC CL PG PS FA y TG 18 Un complejo de un polip ptido de f rmula 23 ES 2 107 048 T3 X A A gt Az Ay Y o uno de sus is meros pticamente activos o una de sus sales farmac uticamente aceptables en donde Al es un enlace o un amino cido cargado negativamente elegido entre Glu o Asp 5 Aos es un amino cido hidrof bico elegido entre Trp Tyr Phe His Val Leu o Ile As es Aib Glu Gln Leu Ala Orn o un enlace y 10 Ay es un amino cido cargado positivamente elegido entre Lys Arg o His X tiene la f rmula Da o Db 15 R3 8 H3C 1 O Ra 20 NOH O Ry R2 Rs OH 25 Da Db donde Bl es B C O B C O C O NH B C O y B es un enlace alquileno C1 16 o alquenileno a C2 16 y donde R1 Ra R3 Ra Rs Re y R7 en cada caso son independientemente alquilo C1 6 Y es un sustituyente del carboxilo de A4 elegido entre grupos hidroxi amino alquilamino y alcoxi y un l pido o mezcla de l pidos elegidos del grupo formado por DPPC PC CL PG PS FA y TG 19 Un complejo seg n la reivindicaci n 17 o 18 en que DPPC constituye el componente principal 35 del l pido 20 Un complejo seg n la reivindicaci n 17 o 18 en que el l pido es una mezcla de DPPC y PG 21 Un complejo seg n la reivindicaci n 17 o 18 en que el l pido comprende aproximadamente 85 40 100 de DPPC y aproximadamente 0 15 de PG 22 Un complejo seg n la reivindicaci
18. ocurre en reci n nacidos a t rmino pero generalmente est relacionada con inmadurez y bajo peso al nacer menos de 2 kg El SDR del adulto presenta un cuadro cl nico y patofisiolog a similares a los de la enfermedad infantil y generalmente se trata en unidades de cuidados intensivos La enfermedad adulta tiene diversas etiolog as muchas de ellas resultantes de ataques pulmo nares tales como infecciones difusas aspiraci n del contenido g strico inhalaci n de sustancias irritantes y toxinas y edema pulmonar debido a focos tales como sobredosis de narc ticos El SDR est correlacionado con una ausencia o disfunci n del tensioactivo pulmonar que reviste los alv olos pulmonares donde ocurre el intercambio de gases y ha sido asociado con los radicales libres con centrados en el ox geno de los pulmones o cavidades pulmonares conocidos como oxidantes tales como los radicales super xido radicales hidroxilo per xido de hidr geno que puede generar radicales hidroxilo y per xidos de l pidos que han estado implicados en lesiones celulares Heffner y col Am Rev Respir Dis 104 531 554 1989 Halliwell FASEB J 1 358 364 1987 En la solicitud de patente estadounidense n de serie 07 789 918 presentada el 4 de noviembre de 1991 que se incorpora aqu como referencia se han descrito tensioactivos pulmonares sint ticos de po lip ptidos m s grandes que tienen restos antioxidantes Sin embargo la presente invenci n proporc
19. s f cil de fabricar Los polip ptidos de la presente invenci n se pueden utilizar por separado en mezclas con l pido o combinados en mezclas de l pido en donde el polip ptido constituye un componente minoritario de la mezcla de tensioactivo La composici n de la presente invenci n se puede preparar con alta pureza y de modo normalizado ya que es una mezcla definida de componentes sint ticos Adem s los componentes no se derivan de fuentes animales lo que minimiza el riesgo de contaminaci n por virus y bacterias Para desarrollar un modelo para los p ptidos de tres y cuatro restos se utiliza una representaci n de rueda helicoidal de un p ptido ambip tico en h lice a de diez restos para la descripci n del p ptido en h lice a ambip tico v ase McLean L R y col Biochem 1991 30 31 Cuando se mira desde abajo 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 el cuerpo de la h lice a las cadenas laterales de los restos indican una cara hidrof bica y una cara hi drof lica sobre la h lice Un p ptido de cuatro restos representa una sola vuelta de esta h lice a con la cara hidrof bica y la cara hidrof lica requeridas presentes Un p ptido de tres restos representa una vuelta apretada de la h lice con las caras hidrof bica e hidrof lica todav a presentes Compendio de la invenci n La presente invenci n comprende tensioactivos pulmonares sint ticos que comprenden un complejo
20. CIA EXPTE M01582 US ix INFORMACION PARA TELECOMINICACION A TELEFONO 513 948 7834 B TELEFAX 513 948 7961 C TELEX 214320 2 INFORMACION PARA SEQ ID N 1 i CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA A LONGITUD 4 amino cidos B TIPO amino cido D TOPOLOGIA lineal ii TIPO DE MOLECULA p ptido ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado B LOCALIZACION 1 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa cido N alfa N 8 hidroxi di t butilbenzoil aminooctanoil glut mico HBB Aoc Glu ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado B LOCALIZACION 3 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa cido 2 aminoisobut rico Aib ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado B LOCALIZACION 4 17 ES 2 107 048 T3 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa lisin 1 amida xi DESCRIPCION DE LA SECUENCIA SEQ ID N 1 Xaa Trp Xaa Xaa 1 2 INFORMACION PARA SEQ ID N 2 i CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA A LONGITUD 4 amino cidos 15 B TIPO amino cido D TOPOLOGIA lineal ii TIPO DE MOLECULA p ptido ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado 25 B LOCALIZACION 1 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa cido N alfa N 8 hidroxi di t butilbenzoil aminooctanoil glut mico HBB Aoc Glu ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado se B LOCALIZACION 4
21. ES 2 107 048 T3 ac 1 N mero de publicaci n 2 107 048 6D Int CL CO7K 5 10 ESPA A CO7K 5 08 CO7K 5 06 A61K 38 07 A61K 38 06 A61K 38 05 D TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 N mero de solicitud europea 93916889 4 Fecha de presentaci n 30 06 93 87 N mero de publicaci n de la solicitud O 652 894 87 Fecha de publicaci n de la solicitud 17 05 95 T tulo Tensioactivos pulmonares pept dicos sint ticos con antioxidantes covalentemente unidos Prioridad 31 07 92 US 923092 13 Titular es Merrell Pharmaceuticals Inc 21 06 93 US 77802 2110 East Galbraith Road P O Box 156300 Cincinnati Ohio 45215 6300 US Fecha de la publicaci n de la menci n BOPI 12 Inventor es McLean Larry R y 16 11 97 Edwards J Vincent G Fecha ds la publicaci n del folleto de patente 9 Agente Ungr a L pez Javier Aviso En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci n en el Bolet n europeo de patentes de la menci n de concesi n de la patente europea cualquier persona podr oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida La oposici n deber formularse por escrito y estar motivada s lo se considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici n art 99 1 del Convenio sobre concesi n de Patentes Europeas Venta de fasc culos Oficina Espa ola de Patentes y Marcas C Panam 1 28036 Madrid 10 15 20 25 30 35
22. HBB Aoc que constituyen una cara hidrof bica suficiente para anclar el p ptido al l pido La cara cargada hidrof lica ha sido reempla zada por Glu y Lys Breve descripci n de las tablas La Tabla 1 presenta los resultados del an lisis de amino cidos de los p ptidos sintetizados La Tabla 2 presenta los resultados de los experimentos de presi n volumen que muestran la eficacia de los compuestos en el modelo pulmonar de rata adulta Descripci n detallada de la invenci n En toda esta memoria se utilizan las siguientes abreviaturas vulgares de los amino cidos naturales Ala o A alanina Val o V valina Leu o L leucina Ile o I isoleucina Phe o F fenilalanina Trp o W tript fano 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 Met o M metionina Ser o S serina Tyr o Y tirosina Asp o D cido asp rtico Glu o E cido glut mico Gln o Q glutamina Thr o T treonina Gly o G glicina Lys o K lisina Arg o R arginina Asn o N asparagina Nle norleucina Orn ornitina hArg homoarginina Nva norvalina Aib cido aminoisobut rico Los amino cidos naturales salvo la glicina contienen un tomo de carbono quiral Salvo indicaci n especifica en contrario los amino cidos pticamente activos referidos aqu son los de configuraci n L Una vez que el resto antioxidante de la presente invenci n es a adido al p ptido se pueden formar estereo
23. Uso de un complejo de acuerdo con la reivindicaci n 27 28 donde dicho polip ptido es HBB Aoc Glu Trp Glu Lys NH2 SEQ ID N 1 33 Uso de un complejo de acuerdo con la reivindicaci n 27 28 donde dicho polip ptido es HBB Aoc Glu Trp Glu Lys NH2 SEQ ID N 2 34 Uso de un complejo de acuerdo con la reivindicaci n 27 28 donde dicho polip ptido es Trl Aoc Glu Trp Aib Lys NHz SEQ ID N 3 35 Uso de un complejo de acuerdo con la reivindicaci n 27 28 donde dicho polip ptido es HBB Glu Trp Aib Lys NHz SEQ ID N 4 36 Uso de un complejo de acuerdo con la reivindicaci n 27 28 en que el polip ptido es HBB Aoc Glu Trp Ala Lys NH2 SEQ ID N 5 37 Un procedimiento de preparaci n de un polip ptido de la reivindicaci n 1 que comprende las etapas de 1 Sintetizar un polip ptido adecuadamente protegido de la f rmula A A2 A3 Ay Y y despu s 2 Hacer reaccionar el extremo alfa amino adecuadamente preparado de Aj As As A4 Y por acilaci n por reacci n con un grupo carbonilo activo de B de f rmula X para formar un polip ptido de la forma X A A2 A3 As Y 38 Un procedimiento seg n la reivindicaci n 37 donde dicho polip ptido es el de las reivindicaciones 12 16 NOTA INFORMATIVA Conforme a la reserva del art 167 2 del Convenio de Patentes Europeas CPE y a la Disposici n Transitoria del RD 2424 1986 de 10 de octubre relativo a la aplicaci n del Convenio de Patente E
24. aciones 1 3 que es HBB Aoc Glu Trp Glu Lys NHa2 10 SEQ ID N 13 Un polip ptido seg n una de las reivindicaciones 1 3 que es HBB Aoc Glu Trp Glu Lys NHa2 SEQ ID N 2 15 14 Un polip ptido seg n una de las reivindicaciones 1 3 que es Trl Aoc Glu Trp Aib Lys NH SEQ ID N 3 15 Un polip ptido seg n una de las reivindicaciones 1 3 que es HBB Glu Trp Aib Lys NH SEQ ID N 4 20 16 Un polip ptido seg n una de las reivindicaciones 1 3 que es HBB Aoc Glu Trp Ala Lys NHa2 SEQ ID N 5 17 Un complejo de un polip ptido de f rmula 25 X A A2 Az Ay Y o uno de sus is meros pticamente activos o una de sus sales farmac uticamente aceptables en donde 30 A es un enlace o un amino cido cargado negativamente elegido entre Glu o Asp Aos es un amino cido hidrof bico elegido entre Trp Tyr Phe His Val Leu o Ile As es Aib Glu Gln Leu Ala Orn o un enlace y Ay es un amino cido cargado positivamente elegido entre Lys Arg o His X tiene la f rmula Da o Db 40 R3 B H3C 1 O Ra a B e 1 45 NOH O Ry R2 Rs OH 50 Da Db z donde B es B C O B C O C O NH B C O y B es un enlace alquileno C 16 o alquenileno C2 16 y donde R1 Ro Rs Ra Rs Re y R7 en cada caso son independientemente alquilo C1 6 Y es un sustituyente del carboxilo de Az elegido entre grupos hidroxi amino alquilamino y alcoxi y donde cuando Az es un enlace Aj y Az se pueden intercambiar y un l pido
25. ativamente elegido entre Glu o Asp 10 Aos es un amino cido hidrof bico elegido entre Trp Tyr Phe His Val Leu o Ile As es Aib Glu Gln Leu Ala Orn o un enlace y 15 Ay es un amino cido cargado positivamente elegido entre Lys Arg o His X tiene la f rmula Da o Db 20 R3 8 H3C 1 O Ra 25 NOH O Ry R2 Rs OH 30 Da Db donde Bl es B C O B C O C O NH B C O y B es un enlace alquileno C 16 o alquenileno 35 C2 16 y donde R1 Ro Ra Ra Rs Re y R7 en cada caso son independientemente alquilo Cy 6 Y es un sustituyente del carboxilo de Az elegido entre grupos hidroxi amino alquilamino y alcoxi y donde cuando Az es un enlace Al y Ao se pueden intercambiar 3 2 Un polip ptido de f rmula X A A2 Az Ay Y 45 9 uno de sus is meros pticamente activos o una de sus sales farmac uticamente aceptables en donde Al es un enlace o un amino cido cargado negativamente elegido entre Glu o Asp Aos es un amino cido hidrof bico elegido entre Trp Tyr Phe His Val Leu o Ile 29 As es Aib Glu Gln Leu Ala Orn o un enlace y Ay es un amino cido cargado positivamente elegido entre Lys Arg o His sa X tiene la f rmula Da o Db 60 21 10 20 25 30 35 40 45 55 60 ES 2 107 048 T3 R3 H3C Bi o R4 NOH Ri R2 E Rs OH Da Db donde Bl es B C O B C O C O NH B C O y B es un enlace alquileno C1 16 o alquenileno C2 16 y donde R1 Ra Rg Ra Rs Re y R7 en cada
26. b Ejemplo 4 4 A Preparaci n del polip pido HBB Glu Trp Aib Lys NH2 SEQ ID N 4 HBB N hidroxi di t butilbenzoil El p ptido 4 A se prepara de manera esencialmente an loga a la preparaci n del p ptido 1 A 4 B Preparaci n del complejo de DPPC con el polip ptido descrito en el ejemplo 4 A El p ptido 4 A se mezcla con DPPC esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 Ejemplo 5 5 A Preparaci n del polip ptido HBB Aoc Glu Trp Ala Lys NH2 SEQ ID N 5 HBB Aoc N hidroxi di t butilenzoilaminooctanoil El p ptido 5 A se prepara de manera esencialmente an loga a la preparaci n del p ptido 1 A 5 B Preparaci n del complejo de DPPC con el polip ptido descrito en el ejemplo 5 A El p ptido 5 A se mezcla con DPPC esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 12 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 TABLA 1 Propiedades anal ticas de los p ptidos sintetizados an lisis por espectrometr a de masas BAR de los p ptidos 1 5 SEQ P ptido EM BAR AAA ID N 1 HBB Aoc Glu Trp Aib Lys NHz M H 920 6 085 2 HBB Aoc Glu Trp Glu Lys NH2 M H 963 6 062 3 Trl Aoc Glu Trp Aib Lys NH gt M H 920 6 089 4 HBB Glu Trp Aib Lys NH M H 778 97 078 5 HBB Aoc Glu Trp Ala Lys NHz M H 904 076 Preparaci n de restos antioridantes Los siguientes materiales de partida an
27. de un polip ptido y l pidos donde el polip ptido tiene la f rmula 1 siguiente X A A2 Az Ay Y 1 o uno de sus is meros pticamente activos o una de sus sales farmac uticamente aceptables en donde Al es un enlace o un amino cido cargado negativamente elegido entre Glu o Asp Aos es un amino cido hidrof bico elegido entre Trp Tyr Phe His Val Leu o Ile As es Aib Glu Gln Leu Ala Orn o un enlace y Ay es un amino cido cargado positivamente elegido entre Lys Arg o His X tiene la f rmula Da o Db R3 H3C Bi o R4 NOH Ri R2 Rs OH Da Db donde B es B C O B C O C O NH B C O y B es un enlace alquileno C 16 o alquenileno C2 16 y donde R1 Ro R3 Ra Rs Re y R7 en cada caso son independientemente alquilo C1 6 Y es un sustituyente del carboxilo de A4 elegido entre grupos hidroxi amino alquilamino y alcoxi y donde cuando Az es un enlace Al y Ao se pueden intercambiar Adem s la presente invenci n se refiere a tensioactivos pulmonares sint ticos que comprenden un complejo de un polip ptido y l pidos donde el polip ptido tiene la f rmula 2 siguiente X A A2 Az Ay Y 2 o uno de sus is meros pticamente activos o una de sus sales farmac uticamente aceptables en donde Al es un enlace o Glu Ao es Trp o Glu As es Aib Glu Gln Leu Ala u Orn y A4 es Lys X tiene la f rmula Da o Db 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 R3 H3C Bi o
28. do B LOCALIZACION 1 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa cido N alfa N 8 hidroxi di t butilbenzoil aminooctanoil glut mico HBB G ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado 19 ES 2 107 048 T3 B LOCALIZACION 3 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa cido 2 aminoisobut rico Aib ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado 10 B LOCALIZACION 4 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa lisin 1 amida 15 xi DESCRIPCION DE LA SECUENCIA SEQ ID N 4 Xaa Trp Xaa Xaa 1 20 2 INFORMACION PARA SEQ ID N 5 i CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA A LONGITUD 4 amino cidos de B TIPO amino cido D TOPOLOGIA lineal 30 ii TIPO DE MOLECULA p ptido ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado a B LOCALIZACION 1 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa cido N alfa N 8 hidroxi di t butilbenzoil aminooctanoil glut mico 40 HBB Aoc Glu ix RASGO CARACTERISTICO A NOMBRE CLAVE Sitio modificado Ei B LOCALIZACION 4 D INFORMACION ADICIONAL nota Xaa lisin 1 amida 5 xi DESCRIPCION DE LA SECUENCIA SEQ ID N 5 aa Trp Ala Xaa 55 60 20 ES 2 107 048 T3 RETVINDICACIONES 1 Un polip ptido de f rmula 5 X A A2 Az Ay Y o uno de sus is meros pticamente activos o una de sus sales farmac uticamente aceptables en donde A es un enlace o un amino cido cargado neg
29. do protegido se puede separar selectivamente de la resina y el resto antioxidante se copula al p ptido antes de separar los grupos protectores y aislarlo La resina soporte empleada puede ser cualquier resina adecuada empleada convencionalmente en la t cnica para la preparaci n en fase s lida de polip ptidos tales como un poliestireno que ha sido reticulado con 0 5 a aproximadamente 3 por ciento de divinilbenceno que ha sido clorometilado o hidroximetilado para proporcionar sitios para la formaci n de ster con el amino cido a amino protegido introducido ini cialmente Otras resinas soporte adecuadas son pMHBA Peptide International Lousiville Ky RINK Calbiochem LaJolla Ca y Sasrin Biochem Philadelphia Pa La resina Sasrin requiere un ciclo ABI especial para cargar el primer amino cido que se describe en el manual del usuario del sintetizador de p ptidos ABI El primer amino cido que tiene un grupo a amino protegido se une a la resina como se describe en el manual del usuario del sintetizador de p ptidos modelo 430A de Applied Biosystems incorporado aqu completamente Los m todos preferidos para activar cada amino cido a adido a la cadena pept dica unida incluyen la formaci n de un anh drido sim trico o ster activo de cada a amino cido a adido que ha sido pro tegido apropiadamente Por ejemplo un amino cido a amino protegido se puede someter a reacci n con diciclohexilcarbodiimida DCC en presencia de diclo
30. e l quidos de alta eficacia CLAE anal tico electroforesis de zona capilar espectrometr a de masas por bombardeo de tomos r pidos EM BAR en un instrumento VG Analytical ZAB2 SE que dio iones moleculares aislados concordantes con las secuencias correctas y an lisis de amino cidos que estaban dentro del 10 de los valores predichos para cada resto La L a dipalmitoilfosfatidilcolina DPPC gt 99 de pureza era de Avanti Polar Lipids Birmigngham AL Utilizando estos procedimientos se sintetizaron los p ptidos siguientes sus propiedades anal ticas se en cuentran en la Tabla 1 1 A Preparaci n del polip ptido HBB Aoc Glu Trp Aib Lys NH2 SEQ ID N 1 HBB Aoc N hidroxi di t butilbenzoilaminooctanoil Inicialmente se prepar Aoc Glu OBzl Trp Aib Lys N 2C1Z pMBHA utilizando una re sina Lys N 2C1Z pMBHA colocada en el sintetizador de p ptidos ABI430A y se sintetiz utilizando qu mica t Boc convencional Para sintetizar el p ptido 1A se mezclaron cido N hidroxi di t butilbenzoico HBB 501 mg dimetilformamida 4 ml y cloruro de metileno 4 ml y se a adi una soluci n de diciclohexilcarbodiimida 8 ml de una soluci n 0 5 M en cloruro de metileno y la mezcla se agit durante 5 minutos para dar el anh drido sim trico de HBB que despu s se copul a Aoc Glu OBzl Trp Aib Lys N 2C1Z pMBHA en un exceso de 10 veces para cada una de dos copulaciones El p ptido pro
31. ente v a sus anh dridos sim tricos preformados El grupo antioxidante se copul por activaci n del cido del antioxidante para formar el anh drido sim trico Antioxidantes tales como HBB cido 3 5 di t butil 4 hidroxibenzoico se pusieron en el extremo amino del p ptido por preactivaci n del cido HBB para formar el anh drido sim trico correspondiente En general el antioxidante se copula dos o tres veces para asegurar la reacci n completa Por ejemplo HBB requer a tres copulaciones para conseguir la incorporaci n completa Se efectuaron copulaciones adicionales como se determin en base a ensayos de ninhidrina Los grupos Na t Boc se eliminaron con cido trifluoroac tico TFA al 50 en cloruro de metileno y se neutralizaron con diisopropiletilamina DEA al 10 en dimetilformamida Los p ptidos se desanclaron de la resina y se desprotegieron en HF anhidro que conten a anisol al 5 y sulfuro de dimetilo al 5 a 5 C durante 45 min HF se separ a vac o y el p ptido se extrajo de la resina con acetonitrilo acuoso al 50 Los extractos combinados se congelaron y liofilizaron y se purificaron por CLAE preparativa en fase reversa en una columna C1g 21 4 x 250 mm de Rainin Dynamax a 40 ml min con un gradiente de acetonitrilo en TFA acuoso al 0 1 pH 2 monitorizada a 214 nm El pico principal se recogi y liofiliz La pureza gt 97 y la identidad de los p ptidos sint ticos se confirma ron por un solo pico en el cromatograma d
32. ficados Los cidos grasos pueden ser saturados o insaturados Acidos grasos representativos son cido l urico mir stico palm tico y oleico Los preparados farmac uticos del polip ptido o de los complejos de prote na fosfol pidos de esta in venci n se pueden hacer como una mezcla seca O en suspensi n acuosa conteniendo en algunos casos peque as cantidades de disolventes org nicos tales como por ejemplo etanol o trifluoroetanol deter gentes tales como por ejemplo dodecilsulfato de sodio o desoxicolato de sodio sales tales como cloruro de calcio o cloruro de sodio hidratos de carbono tales como glucosa dextrosa o manitol y amino cidos tales como glicina y alanina Cuando la composici n farmac utica se prepara en forma l quida se pueden a adir estabilizantes agentes de conservaci n reguladores de la presi n osm tica agentes tamponantes y agentes de suspensi n del l quido Si se desea tambi n se pueden a adir germicidas El pH de la sus pensi n acuosa puede variar entre 2 y 10 y se puede ajustar con cidos y bases tales como por ejemplo cido clorh drico fosfato de sodio o hidr xido de sodio La mezcla seca se puede reconstituir en una soluci n acuosa que contiene sales farmac uticamente aceptables disolventes org nicos y detergentes La preparaci n acuosa se puede dializar filtrar o cromatografiar para intercambiar el medio de suspensi n por un medio farmac uticamente aceptable antes de su uso El prepa
33. ina en un dep sito envuelto en una camisa a 37 C y la c nula traqueal se conecta a un man metro de agua y a una jeringa de vidrio mediante un tubo en T La jeringa de vidrio se pone en una bomba de infusi n extracci n Los pulmones se inflan r pidamente con aire a una presi n de H20 14 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 de 30 cm a un ritmo de 10 ml min para minimizar la entrada de aire y se mantienen a esta presi n durante 10 min por adici n intermitente de aire a los pulmones El volumen total de aire infundido se registra como la capacidad pulmonar total CPT que generalmente es 14 15 ml Despu s se desinflan los pulmones a un ritmo de 2 5 ml min hasta que se consigue presi n cero Durante el desinflado se lee la presi n en el man metro de agua a intervalos de 1 cm y se registra Estos datos se utilizan para construir una curva de presi n volumen P V o cuasi deformaci n despu s de la correcci n para la curva P V del aparato Despu s de desgasificar y equilibrar los pulmones se hacen deficientes en tensioactivo por irrigaci n repetida con 5 ml g de tamp n de irrigaci n NaCl al 0 9 HEPES 10 mM pH 7 4 Los procedimientos de desgasificaci n equilibraci n e irrigaci n se repiten 15 20 veces hasta que la curva de presi n volumen ha adquirido forma claramente sigmoidal y el volumen de aire que permanece en los pulmones a una presi n de H20 de 5 cm es menor o igual que 3
34. int ticos de la presente invenci n se pueden ensayar de cualquier manera apropiada tal como el modelo pulmonar de rata adulta Ikegami y col 1979 Pediatr Res 13 777 780 Las caracter sticas de presi n volumen de los pulmones de rata que carecen de tensioactivo son simi lares a las de los pulmones de lactantes con enfermedad de la membrana hialina y la recuperaci n de la relaci n presi n volumen de los pulmones a la normalidad est relacionada con la cantidad de tensioac tivo instilado de una manera dependiente de la dosis Bermel M S y col Pulmones de rata extirpados irrigados como modelo de deficiencia de tensioactivo Lung 162 99 113 1984 Ejemplo 8 Modelo de pulm n irrigado aislado de rata Los procedimientos experimentales para preparaci n de los animales registro de la curva de presi n volumen e irrigaci n de los pulmones se adaptan a partir de los descritos por Ikegami y col Pediatr Res 11 178 182 1977 y Pediatr Res 13 777 780 1979 y Bermel y col Lung 162 99 113 1984 Ratas Sprague Dawley machos 200 250 g se anestesian con pentobarbital s dico y se desangran Se canula la tr quea y los rganos tor cicos se extirpan en bloque Despu s de separar el tejido adventicio la tr quea y los pulmones 2 g se suspenden en soluci n salina 0 9 se ponen en una c mara de vac o y se desgasifican siguiendo el procedimiento de Stengel y col Los pulmones desgasificados se suspenden en soluci n sal
35. iona un tensioactivo pulmonar sint tico eficaz que tiene propiedades antioxidantes y basado en p ptidos m s cortos de 3 4 amino cidos que tienen el poder de inhibir la oxidaci n de compuestos susceptibles para dar oxidantes Los tensioactivos pulmonares acortados proporcionan un medio m s eficaz y m s rentable para producir agentes terap uticos La presente novedad de la invenci n radica en el poder de reducir eficazmente el p ptido a 3 4 amino cidos con retenci n de las propiedades tensioactivas y liberar eficaz mente el p ptido unido a un antioxidante covalentemente unido Algunos preparados de tensioactivos pulmonares sint ticos tienen a adidos agentes terap uticos tales como Vitamina E al preparado tensioactivo como un componente separado patente estadounidense n 4 765 987 publicaci n de PCT n WO 90 11768 publicaci n de PCT n WO 90 07469 Sin embargo en la presente invenci n los antioxidantes no son un componente separado sino que se incorporan real mente en un polip ptido Una ventaja de incorporar el antioxidante en el polip ptido es que en lugar de tener una mezcla de tres componentes l pido polip ptido y antioxidante es asequible una mezcla de dos componentes Esto puede ser una ventaja significativa en los ensayos de eficacia de un producto farmac utico comercializable en que deben ser ensayadas una gama de dosificaciones y formulaciones para cada componente Adem s una formulaci n de dos componentes es m
36. is meros La presente invenci n comprende mezclas de estos estereois meros as como el este reois mero aislado Como es habitual la estructura de los p ptidos aqu escrita es tal que el extremo amino terminal est al lado izquierdo de la cadena y el extremo carboxi terminal est al lado derecho de la cadena Cuando dos amino cidos se combinan para formar un p ptido a trav s de un enlace amido t pico se desprende una mol cula de agua y lo que queda de cada amino cido se denomina resto El enlace amido tambi n puede ocurrir cuando X se une a un amino cido subsiguiente o a un is stero de enlace amido Por lo tanto un resto es un amino cido que carece de un tomo de hidr geno del grupo amino terminal y que carece del grupo hidroxilo del grupo carboxilo terminal Utilizando la terminolog a aceptada un trazo que indica p rdida de una mol cula de agua en frente de un c digo de tres letras para un amino cido o derivado de amino cido indica el enlace amido de un resto Alquilo en el sentido aqu utilizado representa un radical hidrocarbonado de cadena lineal o ramifi cada tal como metilo etilo propilo butilo isopropilo t butilo sec butilo isopentilo 1 metilbutilo etc dependiendo del n mero de tomos de carbono especificados Acilo como se utiliza aqu representa un radical formado a partir de un cido org nico por eliminaci n de un grupo hidroxi la f rmula general es RCO donde R puede ser u
37. isolvente acuoso La mezcla de l pido y p ptido preparada por uno de los m todos descritos anteriormente se incuba durante hasta 2 horas preferiblemente a 35 50 C con irradiaci n s nica Despu s la mezcla se puede diali zar filtrar o cromatografiar para reemplazar el medio acuoso por un medio farmac uticamente aceptable aunque esto no es necesario En algunos casos se mejora la eficacia separando por ultracentrifugaci n el l pido o p ptido que no ha reaccionado del l pido y p ptido asociados Despu s la mezcla se puede liofilizar o convertir en aerosol Cuando se utilizan los complejos de polip ptido fosfol pido de esta invenci n en el tratamiento de s ndrome de disnea respiratoria neonatal una situaci n fisiol gica que se debe a la incapacidad de los pulmones de reci n nacidos prematuros para producir tensioactivo pulmonar los complejos act an como antioxidante y tensioactivos pulmonares sint ticos y pueden reemplazar al tensioactivo natural que no existe o la deficiencia de tensioactivo natural El tratamiento se contin a hasta que los pulmones del reci n nacido producen una cantidad suficiente de tensioactivo pulmonar natural que hace innecesario m s tratamiento Preferiblemente los preparados son aquellos que resultan adecuados para administraci n endotra queal es decir como una suspensi n l quida un polvo seco o un aerosol Para una suspensi n l quida la mezcla seca o la mezcla en suspensi n acuosa se me
38. ml En este instante se considera que los pulmones son deficientes en tensioactivo Para el ensayo se a aden 2 ml de NaCl al 0 9 10 ml de tamp n HEPES 10 mm pH 7 4 a los tensioactivos pulmonares secos 25 mg de fosfol pido 100 125 mg kg y la mezcla se somete a v rtice se lava con nitr geno y se incuba durante 1 h a 45 C Despu s la mezcla se somete nuevamente a v rtice se desgasifica si ha hecho espuma y se introducen 2 ml de la mezcla de ensayo y se sacan de los pulmones cuatro veces con una jeringa Cuando la mezcla de ensayo se reintroduce en los pulmones por quinta vez se deja que permanezca en los pulmones Se adopta este procedimiento para favorecer la distribuci n uniforme del material en los pulmones Los pulmones se desgasifican se dejan equilibrar a 37 C durante 5 min y se hace una medici n de P V Los pulmones se estudian mientras est n en soluci n salina a 37 C para contrastar con la temperatura ambiente ya que las caracter sticas f sicas de los tensioactivos pueden ser dependientes de la temperatura Se administra tensioactivo pulmonar canino de manera similar excepto que el tensioactivo se calienta s lo durante 5 min Los datos se dan en t rminos de CPT Los limbos de desinflado de las curvas de presi n volumen P V en pulmones de rata adulta se analizan calculando las capacidades pulmonares totales CPT a presio nes de 5 y 10 cm de H20 PC y PCi0 Las comparaciones se basan en el porcentaje de restauraci n
39. n radical hidrocarbonado alif tico alic clico o arom tico o hidr geno grupo formilo El grupo R puede ser sustituido Un ejemplo de un grupo acilo es succ nilo En el sentido aqu utilizado la expresi n amino cido hidrof bico representa un resto no polar con una cadena lateral hidrocarbonada alif tica tal como Val Leu o lle o un resto no polar con un grupo arom tico tal como Phe Tyr Trp o His En el sentido aqu utilizado la expresi n amino cido cargado negativamente representa un resto polar con una cadena lateral hidrof lica cida tal como Glu o Asp 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 En el sentido aqu utilizado la expresi n amino cido cargado positivamente representa un resto polar con una cadena lateral hidrof lica b sica tal como Lys Arg o His Los p ptidos donde X no ha sido modificado funcionalmente por el antioxidante designado se pueden sintetizar por cualquier m todo adecuado tal como un procedimiento secuencial en fase s lida como se describe m s adelante Se obtienen grupos Markush preferidos cuando R1 Ra Re y R7 son cada uno t butilo y cada uno de Rs R4 y Rs son metilo Se prefiere Da sobre Db y B es preferiblemente C O NH B C O donde B es un alcano Cg X se denomina aqu resto antioxidante ya que se cree que X es aquella porci n que confiere pro piedades antioxidantes al polip ptido Sin embargo se entender q
40. nar sint tico y son asequibles a partir de fuentes industriales comunes de alta pureza Los componentes polipept dicos se preparan por s ntesis de p ptidos en fase s lida por m todos familiares para los expertos en la t cnica Se ha demostrado que las mezclas de los l pidos de la invenci n con prote nas aisladas de lavado pulmonar de mam feros son eficaces para tratar SDR neonatal Sin embargo s lo recientemente se han dado a conocer mezclas de estos l pidos con p ptidos sint ticos en preparados de tensioactivo pulmonar McLean y col Los l pidos se suspenden como liposomas por m todos conocidos por los expertos en la t cnica es decir m todos que comprenden mezclar inicialmente l pidos en un disolvente org nico vol til o mezclas de disolventes tales como mezclas de cloroformo y metanol o trifluoroetanol El disolvente org nico se separa por evaporaci n en nitr geno argon o a vac o A la mezcla seca de l pidos se a ade una soluci n acuosa que puede contener cidos bases y sales org nicos e inorg nicos y sac ridos tales como dextrosa para conseguir una concentraci n final de 0 1 a 100 mg de DPPC por ml En general es preferible pero no necesario calentar la mezcla a 35 50 C mezclar en rgicamente e incubar durante hasta 2 horas a 25 50 C Despu s se a ade el p ptido o una mezcla de p ptidos como un polvo seco o suspendido en una soluci n acuosa que en algunos casos contiene un disolvente org nico adecuado
41. nci n pueden ser cualquier fos fol pido y este t rmino en el sentido aqu utilizado incluye los fosfoglic ridos y los esfingol pidos Los fosfoglic ridos son aquellos di steres de cido graso de glicerol en los que el grupo hidroxi restante un grupo hidroxi terminal del resto de glicerol forma un ster con cido fosf rico Corrientemente el resto de cido fosf rico de los fosfoglic ridos forma un segundo ster con un alcohol tal como etanolamina serina colina o glicerol Los esfingol pidos son aquellos mono steres de cido graso de esfingosina o dihidroesfin gosina en los que el grupo hidroxi de la posici n 1 forma un ster de colina de cido fosf rico Los l pidos preferidos de los complejos prote na fosfol pido de esta invenci n comprenden dipalmitoilfosfatidilcolina DPPC mol culas de fosfatidilcolina que contienen cadenas aciladas de otras longitudes y grados de saturaci n PC cardiolipina CL fosfatidilgliceroles PG fosfatidilserinas PS cidos grasos FA y 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 triacilgliceroles TG DPPC constituye el componente principal de la mezcla de tensioactivo pulmonar mientras que PC CL PG PS FA y TG constituyen componentes minoritarios Acidos grasos adecua dos para uso en los fosfol pidos de esta invenci n son cidos carbox licos de cadena larga que tienen generalmente ocho o m s tomos de carbono t picamente no rami
42. p bifenil 1 metiletoxicarbonilo a a dimetil 3 5 dimetoxibenciloxicarbonilo y benzhidriloxicarbonilo 3 grupos protectores de tipo uretano alif tico tales como t butiloxicarbonil Boc diisopropilmetoxicarbonilo isopropiloxicarbonilo etoxicarbonilo y aliloxicarbonilo 4 grupos pro tectores de tipo cicloalquiluretano tales como ciclopentiloxicarbonilo o 9 fluorenilmetoxicarbonilo Fmoc 6 grupos protectores de tipo alquilo tales como trifenilmetilo tritilo y bencilo 7 grupos trialquilsi lano tales como trimetilsilano Sin embargo la elecci n del grupo protector de a amino depender de la resina utilizada el grupo funcional del sitio diana los dem s grupos funcionales presentes en el polip ptido y de si el derivado de amino cido X puede resistir el desanclaje de la resina con un reactivo de corte Por ejemplo para preparar HBB Aoc Glu Trp Aib Lys NH SEQ ID N 1 se utiliza una resina pMBHA que produce un grupo amino C terminal y el p ptido se construye aplicando la qu mica t Boc convencional a un sintetizador de p ptidos ABI430A El resto HBB se puede introducir como un ster activo de HOBT con el fin de unir HBB al grupo N a amino diana de cido glut mico Se puede utilizar cido fluorh drico anhidro HF para desanclar el p ptido de la resina y al mismo tiempo eliminar los grupos protectores restantes La elecci n de la combinaci n apropiada de grupos protectores y reactivos para eliminar selectiva mente gru
43. pos protectores es bien conocida en la t cnica Por ejemplo v ase M Bodanszky PEPTIDE CHEMISTRY A PRACTICAL TEXTBOOK Springer Verlag 1988 J Stewart y col SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS 22 edici n Pierce Chemical Co 1984 Cada amino cido protegido o secuencia de amino cidos protegida se introduce en el reactor de fase s lida en un exceso de aproximadamente cuatro veces y la copulaci n se lleva a cabo en presencia de un agente copulante tal como en un medio de dimetilformamida cloruro de metileno 1 1 o en dimetilforma mida sola o cloruro de metileno solo En casos en los que ocurre copulaci n incompleta el procedimiento de copulaci n se repite antes de la separaci n del grupo protector de a amino previamente a la copulaci n del siguiente amino cido en el reactor de fase s lida El xito de la reacci n de copulaci n en cada etapa de la s ntesis se verifica por la reacci n de ninhidrina como describe E Kaiser y col Analyt Biochem 34 595 1970 Una vez obtenida la secuencia deseada de amino cidos el p ptido se separa de la resina utilizando cualquier reactivo apropiado que no afecte adversamente al polip ptido Por ejemplo se puede utilizar HF anhidro que contiene 5 de anisol y 5 de acetonitrilo en cido trifluoroac tico al 0 1 para desan clar el polip ptido de una resina PMBHA Los polip ptidos de F rmula 1 pueden formar sales farmac uticamente aceptables con cualquier cido no t xico org nico o
44. ptido Trl Aoc Glu Trp Aib Lys NH2 Trl Aoc 6 hidroxi 2 5 7 8 tetrametilcroman 2 carboxilaminooctanoil SEQ ID N 3 Se prepar Aoc Glu OBzl Trp Aib Lys N 2CIZ pMBHA utilizando una resina Lys N 2CIZ pMBHA colocada en el sintetizador de p ptidos ABI430A utilizando qu mica t Boc convencional Para sintetizar el p ptido 3A se mezclaron cido 6 hidroxi 2 5 7 8 tetrametileroman 2 carbox lico Trolox 501 mg dimetilformamida 4 ml y cloruro de metileno 2 5 ml y se a adi una soluci n de diciclohexilcarbodiimida 8 ml de una soluci n 0 5 M en cloruro de metileno y la mezcla se agit durante 5 minutos para dar el anh drido sim trico de HBB que despu s se copul a Aoc Glu OBzl Trp Aib Lys N 2C1Z pMBHA en un exceso de 10 veces para cada una de dos copulaciones Para desanclar Trl Aoc Glu OBzl Trp Aib Lys N 2C1Z pMBHA de la resina y eliminar los grupos protectores de las cadenas laterales el p ptido se trat en HF anhidro anisol al 5 y sulfuro de dimetilo al 5 a 5 C durante 1 hora Despu s se extrajo el Trl p ptido de la resina con acetonitrilo al 50 en cido trifluoroac tico al 0 1 se congel y se liofiliz Despu s el Trl p ptido se purific por CLAE en fase reversa para dar el compuesto del t tulo 3 B Preparaci n del complejo de DPPC con el polip pido descrito en el ejemplo 3 A El p ptido 3 A se mezcl con DPPC esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 1
45. rado se puede administrar como un polvo seco una suspensi n acuosa o como un aerosol directamente a los pulmones del enfermo de disnea La composici n farmac utica de la presente invenci n se puede cargar en envases cerrados herm ticamente tales como viales y ampollas y conservar en condiciones est riles La composici n se puede guardar en un vial o una ampolla distinto de un vial o una ampolla que contiene el tamp n de suspensi n y la composici n seca O hidratada se puede mezclar con el tamp n de suspensi n antes de su uso El l pido constituye de 50 a 99 9 del preparado de tensioactivo pulmonar Entre los l pidos adecua dos se incluyen DPPC PC CL PG PS FA y TG DPPC comprende la especie lip dica mayoritaria y est presente en concentraciones de 60 a 100 del peso total de l pidos Los l pidos restantes est n presentes en concentraciones minoritarias PC CL PG y PS pueden constituir hasta el 30 de los l pidos y FA y TG pueden constituir hasta el 10 del peso de l pidos Las cadenas de acilo graso de los componentes lip dicos minoritarios pueden ser saturadas o insaturadas y de cualquier longitud de cadena Se prefieren longitudes de cadena de 12 a 16 tomos de carbono y hasta 2 enlaces insaturados La composici n preferida de l pidos es 85 100 de DPPC m s 0 15 de PG Lo m s preferido es DPPC puro Los componentes lip dicos del tensioactivo pulmonar sint tico se encuentran corrientemente en el ten sioactivo pulmo
46. rometano DCM para formar el anh drido sim trico Alternativamente se puede formar un ster activo de HOBt disolviendo Boc amino cido t butiloxicarbonil amino cido y HOBT en DCC y enfriando a adiendo DCC adicional y calentando la soluci n a temperatura ambiente Despu s se a ade esta soluci n a la resina con el amino cido unido Este m todo de activaci n para formar agentes acilantes tambi n se puede utilizar para los compuestos antioxidantes Si hay otros grupos funcionales presentes adem s del grupo a amino generalmente esos grupos tendr n que ser protegidos Por lo general el grupo a amino y cada uno de los grupos funcionales de las cadenas laterales se pueden proteger con diferentes grupos protectores de manera que un grupo protector puede ser eliminado sin eliminar los dem s grupos protectores Entre las clases de grupos protectores de a amino contemplados para uso con la presente invenci n est n 1 grupos protectores de tipo acilo tales como formilo trifluoroacetilo ftalilo toluenosul fonilo tosilo bencenosulfonilo nitrofenilsulfenilo tritilsulfenilo o nitrofenoxiacetilo y y clorobutirilo 2 grupos protectores de tipo uretano arom tico tales como benciloxicarbonilo y benciloxicarbonilo sustituido tales como p clorobenciloxicarbonilo p nitrobenciloxicarbonilo p bromobenciloxicarbonilo p 7 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ES 2 107 048 T3 metoxibenciloxicarbonilo 1
47. tegido HBB Aoc Glu OBzl Trp Aib Lys N 2C1Z pMBHA se desancl de la resina y los grupos protectores de las cadenas laterales se separaron tratando HBB p ptido resina en HF anhidro que conten a anisol al 5 y sulfuro de dimetilo al 5 a 5 C durante 1 hora Despu s se extrajo el p ptido de la resina con acetonitrilo al 50 en cido trifluoroac tico al 0 1 se congel y se liofiliz Despu s el p ptido se purific por CLAE en fase reversa para dar el compuesto del t tulo 1 B Preparaci n del complejo de DPPC con el polip ptido descrito en el ejemplo 1 A Se prepara p ptido 1 A como se ha descrito anteriormente Se seca DPPC 25 mg en 1 ml de cloroformo bajo una corriente de nitr geno y se seca a vac o para eliminar trazas de disolvente org nico A la mezcla de l pidos seca se a aden 3 ml de agua El preparado se incuba durante 1 hora a 45 C Despu s se a aden 0 5 mg de p ptido seco 1 A al preparado acuoso El preparado se sonica en un ba o ultras nico a 45 C durante 2 horas La mezcla de l pido p ptido resultante se liofiliza y guarda a 4 C durante un mes a lo sumo Antes del ensayo se a aden 9 ml de NaCl al 0 9 tamp n HEPES 20 mM pH 7 40 El preparado se incuba durante 1 hora a 45 C con mezcla peri dica Ejemplo 2 2 A Preparaci n del polip pido HBB Aoc Glu Trp Glu Lys NH gt SEQ ID N 2 HBB Aoc N hidroxi di t butilbenzoilaminooctanoil 11 10 15 20 25
48. tioxidantes se pueden utilizar como se ha descrito en los ejem plos precedentes Ejemplo 6 Preparaci n de material de partida antioxidante Acido 3 t butil 5 metil 4 hidroxibenzoico Un recipiente de reacci n se carga con una suspensi n de hidruro de sodio 4 74 g 0 198 moles en dimetil ter de etilenglicol anhidro 150 ml Se a ade gota a gota una soluci n de 2 t butil 6 metilfenol 0 1 moles en dimetil ter de etilenglicol 150 ml La mezcla se calienta a 50 60 C durante 1 5 horas y despu s se introduce di xido de carbono a trav s de un tubo de entrada de gas por debajo de la superficie de la mezcla de reacci n durante 20 horas Se enfr a a 5 C y el exceso de hidruro de sodio se destruye cuidadosamente con alcohol met lico 30 ml Cuando cesa el desprendimiento de hidr geno el pH de la mezcla de reacci n se ajusta a 2 con cido clorh drico 1N La mezcla se diluye con agua 1 6 litros y el compuesto del titulo se recoge por filtraci n Ejemplo 7 Preparaci n de material de partida antioxidante Acido 6 hidroxi 7 t butil 5 isopropil 8 propileroman 2 il ac tico Se mezclan limaduras de magnesio 45 mg 1 85 mmoles y 1 cloro 2 2 dimetilpropano 75 6 mg 0 7 mmoles en ter anhidro 9 ml Se calienta y se agita en rgicamente despu s se a ade gota a gota 1 2 dibromoetano 156 mg 0 839 mmoles en ter anhidro 1 5 ml La mezcla se calienta a reflujo du rante 12 horas se pone en atm sfera de nitr geno y se enfr
49. ue X puede tener terminales de uni n al polip ptido de modo que cuando se describen los restos antioxidantes unidos al polip ptido tambi n incluyen los terminales de uni n apropiados v g B C O B C O C O NH B C O etc Hay muchas maneras de formar X Por ejemplo los derivados de amino cido se pueden acilar con un agente acilante formado a partir de compuestos antioxidantes Para ser un agente acilante los com puestos antioxidantes pueden formar por ejemplo un anh drido sim trico o un ster activo v g ster de N hidroxibenzotriazol ster de HOBT Despu s el agente acilante se expone al nucle filo funcional desprotegido para que tenga lugar la reacci n Esto se hace preferiblemente por s ntesis de p ptidos en fase s lida mientras el amino cido que recibe el resto antioxidante es parte del p ptido unido a la resina Los amino cidos individuales tambi n pueden ser modificados antes de su incorporaci n en el p ptido por ejemplo por esterificaci n alquilaci n reductiva etc Otras modificaciones de amino cidos y de de rivados de amino cidos que contienen grupos funcionales son bien conocidas en la t cnica Ejemplos preferidos de compuestos antioxidantes que resultan ser tiles en la reacci n con amino cidos o derivados de amino cidos en la presente invenci n son los siguientes 1 HBB cido 3 5 di t butil 4 hidroxibenzoico 2 HBP cido 3 3 5 di t butil 4 hidroxifenil propi nico 3 HBC
50. uropea las patentes europeas que designen a Espa a y solicitadas antes del 7 10 1992 no producir n ning n efecto en Espa a en la medida en que confieran protecci n a productos qu micos y farmac uticos como tales Esta informaci n no prejuzga que la patente est o no inclu da en la mencionada reserva 25 ES 2 107 048 T3 Figura 1 la Trp8 da y id Lys4 Leu po Leu Leu Glu3 Lys 0 NHo succinyl Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Trp Leu Lys NH2 Figura 2 Trp Ala3 Glul HBB Aoc Lyst amida HBB Aoc Glu Trp Ala Lys NH gt
51. zcla con agentes adecuados tales como agua soluciones salinas dextrosa y glicerol para producir una composici n farmac uticamente eficaz Las sus pensiones l quidas preferidas contendr n de 0 8 a 1 0 por ciento en peso de cloruro de sodio y tendr una concentraci n 1 20 mM preferiblemente en un medio de iones calcio Despu s el preparado se esteriliza por filtraci n En general el preparado comprende de 1 a 100 mg de DPPC por ml y se administra a una dosis de 0 2 a 5 ml kg Para preparar una mezcla seca la suspensi n acuosa se liofiliza El aerosol se prepara a partir de un polvo seco finamente dividido suspendido en un propelente tal como alcanos inferiores y alcanos fluorados tales como Freon El aerosol se almacena en un recipiente presurizado Por ejemplo el tensioactivo complejo de polip ptido de la presente invenci n y l pido se administra como es apropiado para la forma de dosificaci n por incubaci n endotraqueal por administraci n de ae rosol o por nebulizaci n de la suspensi n o mezcla seca en el gas inspirado El tensioactivo se administra en una o m ltiples dosis de 10 a 200 mg kg El m todo preferido de administraci n es como una sus pensi n de p ptido y l pido en soluci n salina fisiol gica a una concentraci n de 5 10 mg de tensioactivo por ml a trav s de un tubo endotraqueal consiguiendo una dosis de 50 100 mg kg El polip ptido de la presente invenci n se administra para tratar a un paciente
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