Simplexa™ Influenza A H1N1 (2009)
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1. Nombre Dentro de de la Concentraci n Media Media Ne de Entre la misma muestr esperada geom trica logar tmica resultados Entre Entre pruebas prueba de a copias ml copias ml copias ml medibles equipos d as de PCR PCR Total NTC 0 No detectado No detectado 0 No corresponde N C HPC 5 08 x 10 481x10 7 682 74 0 026 0 012 0 025 0 024 0 045 LPC 6 32 x 10 6 44 x 10 3 809 80 0 014 0 034 0 015 0 045 0 060 Qs 1 4 70 x 10 gt 1 x10 N A 0 N C QS 2 5 29 x 10 5 35 x 10 6 728 79 0 016 0 021 0 024 0 024 0 043 QS 3 2 74 x10 5 56 x 10 4 745 80 0 000 0 021 0 014 0 021 0 032 QS 4 5 83 x 10 5 89 x 10 3 770 80 0 005 0 025 0 017 0 047 0 056 QS 5 1 05 x 10 1 02 x 10 3 007 80 0 008 0 031 0 000 0 083 0 089 pri 1 00 x 10 9 11 x10 6 960 74 0 016 0 009 0 026 0 019 0 037 pe 5 00 x 10 4 71 x 10 3 673 80 0 022 0 050 0 025 0 048 0 076 I 2 00 x 10 1 44 x 10 3 158 80 0 063 0 050 0 000 0 098 0 126 Simplexa BKV p gina 10 Focus Reproducibilidad Simplexa para VBK Desviaci n est ndar Nombre Dentro de de la Concentraci n Media Media N de Entre la misma muestr esperada geom trica logar tmica resultados Entre Entre pruebas prueba de a copias ml copias ml copias ml medibles equipos d as de PCR PCR Total 0 No detectado No detectado 0 N C per 12. Vol menes de la mezcla de reacci n Mezcla de reacci n Mezcla de reacci n Reactivo Volumen 1 reacci n Volumen 10 reacciones Simplexa Master Mix 4 0 yl 40 pl Simplexa BKV Primer Mix 1 0 yl 10 yl Volumen total 5 0 ul 50 ul Mezcle suavemente la mezcla de reacci n mediante inversi n o pipeteando de 8 a 10 veces Centrifugue brevemente para bajar el contenido al fondo del tubo Contin e con la preparaci n de la PCR Use la mezcla de reacci n antes de que pase una hora de la preparaci n Guarde la mezcla de reacci n a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C si la PCR no se llevara a cabo inmediatamente despu s de preparar la mezcla de reacci n ZONA DE AMPLIFICACI N POR PCR EN TIEMPO REAL Realice la preparaci n del disco universal de 96 pocillos para la prueba Simplexa para VBK en un rea habilitada exclusivamente para ello Consulte el ejemplo de disposici n del disco de la secci n C mientras realiza lo siguiente Simplexa BKV p gina 6 A ada 5 0 ul de mezcla de reacci n a cada pocillo A ada 5 ul del control positivo extra do al pocillo del control positivo alto HPC y del control positivo bajo LPC A ada 5 0 ul de la muestra del paciente extra da al pocillo del S correspondiente A ada 5 0 ul de control negativo sin molde extra do al pocillo del NTC Cubra el disco con cinta de cubierta para Universal Discs Abra la tapa del equipo Integrated Cycler
3. Coloque el disco universal sellado sobre el plato Cierre la tapa suavemente Pulse sobre Run Proceso 0 Pulse sobre Start Iniciar SAO o E F AN LISIS DE DATOS 1 Cuando el proceso finalice pulse Analyze Analizar 2 Revise los colorantes uno por uno o seleccione todos los colorantes canales al marcar la casilla de selecci n de cada colorante 3 Presione el bot n de vista Print Preview Previa de la impresi n bot n derecho para examinar el resumen de los valores diagn stico Marque la casila de Include Graphs Incluir gr ficas para examinar las gr ficas de amplificaci n Para incluir de calibraci n asociado con el proceso de diagn stico seleccione la casilla de Include Calibration Result Incluir resultado de calibraci n Avance por las p ginas mediante los botones con flecha que se encuentran en la esquina superior izquierda de la ventana Print Preview Imprimir vista previa 4 Print Imprima o Save Guarde el informe 5 Exporte los valores diagn stico si es necesario CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos de control de calidad y la frecuencia de la pruebas de control de calidad bas ndose en las leyes y normas locales aplicables y las buenas pr cticas de laboratorio INFORME DE LOS RESULTADOS 1 Validez de la ronda Determine si el proceso es v lido al examinar los resultados del VBK y el control interno Cl para el control positivo bajo LPC control pos
4. 00 x 10 5 75 x 10 6 760 80 0 000 0 104 0 014 0 013 0 105 a 5 00 x 10 2 87 x 10 3 458 80 0 000 0 061 0 022 0 081 0 104 w 2 00 x 10 1 12x10 3 048 79 0 088 0 049 0 000 0 090 0 135 a 0 No detectado No detectado 0 N C N mero de resultados dentro del rango de linealidad del ensayo Simplexa para VBK LINEALIDAD La linealidad se determin mediante muestras dise adas a partir de un stock de una copia de VBK cuantificada que se agreg a matrices de orina y plasma cl nicamente negativas La bater a consist a en 10 mezclas de copias conocidas a lo largo del intervalo lineal esperado De las mezclas al menos 3 concentraciones estaban cerca del l mite inferior de cuantificaci n LLOQ 2 cerca del l mite superior de cuantificaci n ULOQ y las restantes distribuidas aproximadamente a partes iguales entre el LLOQ y el ULOQ Cada muestra se ensay aleatoriamente en al menos 3 r plicas El protocolo de linealidad se realiz para cada tipo de muestra en cada uno de los dos m todos de extracci n Los valores individuales del intervalo de notificaci n se muestran en la tabla siguiente Plasma MagNA Pure easyMag MagNA Pure easyMag 250 a 1 00 x 10 250 a 1 00 x 10 500 a 1 00 x 10 250 a 1 00 x 10 Focus Disgsostics Linealidad del ensayo Simplexa BKV para plasma MagNA Pure Conc Simplexa BKV Log I0 copias ml 5 0 Conc BKV esperada Log10 copias
5. de extracci n utilizado para realizar la determinaci n inicial en la muestra debe ser utilizado en todas las determinaciones posteriores 4 Todos los resultados de esta prueba o de cualquier otra prueba deben correlacionarse con los antecedentes cl nicos los datos epidemiol gicos y otros datos disponibles para el m dico a cargo de la evaluaci n del paciente 5 La prevalencia de la infecci n influir en el valor diagn stico de la prueba 6 Como ocurre con otras pruebas los resultados negativos no descartan una infecci n por VBK 7 Pueden producirse resultados falsos negativos cuando el organismo causante de la infecci n tiene mutaciones gen micas inserciones deleciones o reorganizaciones o cuando las pruebas se realizan en una fase muy temprana de la enfermedad 8 Pueden aparecer resultados falsos negativos si en la muestra hay un n mero inadecuado de microorganismos debido a una recogida un transporte o una manipulaci n incorrectos 9 Al igual que con cualquier otra prueba pueden producirse resultados falso positivos En algunas circunstancias podr a estar indicada la repetici n de la prueba o la realizaci n de una prueba con un dispositivo diferente 10 Esta prueba no permite descartar enfermedades causadas por otros agentes pat genos bacterianos o virales 11 No se ha determinado el rendimiento de esta prueba en programas de diagn stico precoz de orina o plasma para la detecci n de VBK 12 Esta prueba no est in
6. ml y las muestras inferiores a 510 se describir n como lt 510 CONTAMINACI N POR TRANSFERENCIA Se evalu la amplificaci n por arrastre para el equipo y el Disco Universal utilizando otros ensayos Los estudios se centraron en la b squeda de contaminaci n en muestras altamente negativas El estudio se dise colocando de manera alterna muestras con resultado positivo alto y resultado negativo alto en cada disco El efecto de arrastre se evalu comparando la tasa de Focus Simplexa BKV p gina 13 negativos observados en las muestras con resultado negativo alto con la tasa esperada en condiciones de reproducibilidad normales No se observ contaminaci n por efecto de arrastre en pruebas anteriores REFERENCIAS 1 10 11 12 Padgett B L and Walker D L 1973 Prevalence of antibodies in human sera against JC virus an isolate from a case of progressive multifocal leukoencephalopathy J Infect Dis 127 4 467 470 Shah KV Daniel RW Warszawski RM High prevalence of antibodies to BK virus an SV40 related papovavirus in residents of Maryland J Infect Dis 1973 128 784 Gardner SD Prevalence in England of antibody to human polyomavirus B K BMJ 1973 1 77 Mantyjarvi RA Meurman OH Vihma L Berglund B A human papovavirus BK biological properties and seroepidemiology Ann Clin Res 1973 5 283 Flaegstad T Ronne K Filipe AR Traavik T Prevalence of anti BK virus antibody in Portugal and Norway Sc
7. y o de repetici n de una precisi n comprendida en el rango de 1 10 yl 10 100 ul y 100 1000 ul 11 Congelador eliminaci n de escarcha manual de 10 a 30 C para guardar congelados los componentes del kit 12 Congelador eliminaci n de escarcha manual de 10 a 30 C para guardar congeladas las muestras 13 Frigor fico de 2 C a 8 C para las muestras y los componentes del kit que han sido descongelados 14 Cabina de bioseguridad campana de flujo laminar para las extracciones 15 Microcentr fuga 16 Mezclador v rtex 17 Puntas de micropipetas est riles desechables exentas de ARNasas ADNasas con protecci n contra aerosoles 18 Tubos para microcentr fuga de polipropileno de 1 5 ml y gradillas se recomienda usar tubos exentos de ARNasas ADNasas pero no es obligatorio 19 Guantes sin polvo desechables 20 Agua libre de nucleasas que se utiliza durante la extracci n y como el control sin molde No Template Control NTC 21 Gradillas fr as para los tubos de microcentr fuga de 1 5 ml Para uso con el m todo de extracci n Roche MagNA Pure LC Para uso con el m todo de extracci n del bioM rieux easyMAG 2929001 E Nn PER ODO DE VALIDEZ Y MANIPULACI N Conserve los reactivos a una temperatura entre 10 C y 30 C no use un congelador de tipo no frost Deje que los reactivos se descongelen a temperatura ambiente antes de usarlos aproximadamente entre 18 y 25 C No use los kits ni los react
8. 44 nm 670 nm gen A thaliana Simplexa Master Mix MM Mezcla maestra ADN polimerasa tamp n y dNTPs Simplexa Extraction amp ii Amplification Control DNA IC Un fragmento de ADN de 577 pares de bases derivado del gen que codifica la unidad N metiltransferasa Control de extracci n y grande de la ribulosa 1 5 bifosfato carboxilasa oxigenasa de la planta Arabidopsis thaliana amplificaci n de ADN IC Simplexa BKV Low Positive Control LPC Control positivo bajo Amplic n de VBK en una base de matriz extracelular humana Simplexa BKV High Positive Control HPC Control positivo alto Amplic n de VBK en una base de matriz extracelular humana Simplexa BKV Barcode Card Tarjeta de c digo de barras Par metros espec ficos de la prueba MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS Simplexa BKV Quantitation Standard Set REF MOL2310 Equipo Integrated Cycler 3M con software Integrated Cycler Studio versi n 3 0 o superior Universal Discs para el equipo Integrated Cycler Cinta de cubierta para Universal Discs Sistema MagNA Pure LC de Roche y elementos fungibles asociados Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit N de cat de Roche 3038505001 P Equipo NucliSENSO easyMAG de bioM rieux y consumibles y reactivos asociados Pipeta multicanal Biohit bioM rieux Placa de tiras ELISA 0 Micropipeta s de canal nico multicanal
9. Simplexa BKV MOL2300 Rev E Un ensayo de PCR en tiempo real para la cuantificaci n in OC U S vitro del virus BK VBK Diagnostics Para uso diagn stico in vitro INDICACIONES DE USO El ensayo Simplexa BKV de Focus Diagnostics est dise ado para la cuantificaci n in vitro de los cidos nucleicos del virus BK VBK en muestras de orina y o plasma utilizando el 3M Integrated Cycler Este ensayo est dise ado para ser utilizado en el tratamiento cl nico de los pacientes infectados con el VBK junto con la presentaci n cl nica y otros marcadores de laboratorio que eval an el progreso de la enfermedad Este ensayo no est dise ado como un reactivo de selecci n de donantes El ensayo es para uso profesional solamente RESUMEN Y EXPLICACI N El virus BK VBK de tipo poliomavirus humano es un virus sin envuelta con un genoma de ADN de doble cadena circular de 5 300 pb Al principio el VBK fue reconocido como un miembro de la familia de los poliomavirus en 1971 despu s de de aislarlo de la orina de un receptor de trasplante renal La tasa de seroprevalencia a nivel mundial es del 70 al 90 en adultos La seroconversi n normalmente se produce durante la infancia a los 4 a os 7 La viremia en una primoinfecci n infecta el ri n en el que el virus se establece como una infecci n cl nicamente latente Normalmente el virus permanece durmiente pero puede producirse una reactivaci n intermitente en determinada
10. V Log10 copias m 5 6 Conc LDT BKV Log10 copias ml o Conc Simplexa BKV Log10 copias ml Correspondencia P B Ref linea de identidad Prueba Matriz de muestra Orina M todo de extracci n MagNA Pure Correspondencia de regresi n Passing Bablock con l mite de confianza P B Linea de reg 0 82 1 05 X IC 95 para intersecci n 1 0538 0 6348 IC 95 para pendiente 1 0104 1 0852 n 55 Coeficiente de correlaci n R 0 99 Conc Simplexa BKV Log IM copias m 6 7 Conc LDT BKV Log10 copias ml Conc Simplexa BKV Log10 copias ml Correspondencia P B Ref l nea de identidad Prueba Las muestras cl nicas con los resultados de rango lineal del ensayo Simplexa para VBK tambi n se analizaron con extracci n easyMAG Las muestras se comportaron de modo equivalente a las muestras extra das con una extracci n MagNA Pure pendiente de 0 98 y una intersecci n de 0 03 para plasma y una pendiente de 1 06 y una intersecci n de 0 4 para orina SENSIBILIDAD ANAL TICA L MITE DE DETECCI N El l mite de detecci n LoD Limit of Detection se calcul creando muestras dise adas partir de un stock de una cepa de VBK cuantificada que se agreg a matrices de plasma y orina cl nicamente negativas La bater a incluy matrices de orina y plasma negativas sin agregados y muestras de concentraciones variables diluidas en serie aproximadamente al LoD obtenido en una fase de la prueba anterior Par
11. a cada combinaci n de sistema de extracci n easyMAG MagNA Pure y tipo de muestra plasma orina se analizaron veinticuatro 24 r plicas procedentes de tres 3 extracciones diferentes y fases de PCR a cada nivel con el Probit Analysis para determinar la concentraci n m s baja que pudiera ser detectada con una probabilidad del 95 El protocolo LoD se realiz para cada uno de los dos m todos de extracci n y tipos de muestras Los valores LoD individuales se muestran en la tabla siguiente Se determin que el LoD era de 510 copias ml basado en el LoD mayor observado en todos los m todos de extracci n y tipos de muestras Simplexa BKV p gina 9 Focus Disg Plasma MagNA Pure easyMag MagNA Pure easyMag REACTIVIDAD ANAL TICA REACTIVIDAD CRUZADA Los estudios han indicado que los cebadores son espec ficos para VBK y que no poseen reacci n cruzada con otros microorganismos como VIH 1 VIH 2 VHS 1 VHS 2 VHH 6 VJA VVZ VEB VCM Staphylococcus saprophyticus Enterococcus Candida Enterobacter Citrobacter E coli Klebsiella y Proteus mirabilis Adicionalmente las bases de datos de las secuencias de cidos nucleicos indicaron que los cebadores eran espec ficos para VBK y que no pose an homolog a significativa con otros pat genos o con ADN humano INTERFERENCIAS El rendimiento de este ensayo no ha sido evaluado con sustancias que puedan interferir potencialmente Los procesos de extracci n de cidos nucleic
12. and J Infect Dis 1989 21 2 145 7 Rziha HJ Bornkamm GW zur Hausen H BK virus Seroepidemiologic studies and serologic response to viral infection Med Microbiol Immunol Berl 1978 Jul 4 165 2 73 81 AU Dei R Marmo F Corte D Sampietro MG Franceschini E Urbano P Age related changes in the prevalence of precipitating antibodies to BK virus in infants and children J Med Microbiol 1982 Aug 15 3 285 91 Arthur RR Shah KV Occurrence and significance of papovaviruses BK and JC in the urine Prog Med Virol 1989 36 42 Shah KV Polyomaviruses IN Virlogy ga Ed Fields BN Knope DM Howley PM Eds Lipincott Raven Publishers Philadelphia 1996 p 2027 Gillespie SM Chang Y Lemkp G et al Progressive multifocal leukoencephalopathy in persons infected with human immunodeficiency virus San Francisco 1981 1989 Ann Neurol 1991 30 597 NCCLS H18 A2 Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens Approved Guideline 2nd Ed CDC NIH Manual 1999 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 4th ed And National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS Protection of Laboratory Workers from Instruments Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood Body Fluids and Tissue NCCLS M29 A El uso de sondas Scorpions para diagn sticos in vitro en seres humanos est cubierto por una licencia de Focus Diagnostics Inc de DxS Ltd Los colorantes Black Hole Quencher CAL Fluor y Q
13. de 18 a 25 C Cuando mezcle los reactivos mantenga fr as las enzimas mediante un bloque refrigerador No reutilice los Universal Discs que ya han estado expuestos a muestras de pacientes o reactivos Deseche el disco usado sin separar ni retirar la cinta de cubierta Si se preparan en el mismo disco diferentes kits o lotes Simplexa en la prueba se deber n usar los controles positivos y negativos correspondientes a cada kit La mezcla maestra contiene m s de un 1 de glicerol lo que puede causar irritaci n si se inhala o entra en contacto con la piel En caso de inhalaci n o contacto deben tomarse medidas de primeros auxilios No se recomienda almacenar las muestras extra das a temperaturas entre 2 C a 8 C de forma prolongada puesto que el rendimiento no se ha establecido Si el envase del kit o su contenido tienen aspecto de estar rotos o deteriorados no los use y p ngase en contacto con Focus Diagnostics La informaci n de contacto aparece en la ltima p gina de este documento INSTRUCCIONES DE USO A RECOGIDA DE MUESTRAS Los tipos de muestras aceptables son orina y plasma Para plasma no utilice tubos recolectores de muestra que contengan heparina como anticoagulante La heparina inhibe la PCR Focus Simplexa M BKV p gina 4 B REA DE EXTRACCI N DE MUESTRAS Realice la extracci n de muestras y controles en un rea exclusiva para ello La preparaci n de muestras para la extracci n debe realizarse e
14. de que la s lice magn tica vuelva a caer en la muestra Guarde el ADN extra do a una temperatura de entre 2 C y 8 C antes de usarlo No se recomienda el almacenamiento prolongado a esta temperatura de las muestras extra das Mantenga el ADN extra do en un bloque refrigerador mientras carga el disco CONFIGURACI N DEL EQUIPO DE PCR EN TIEMPO REAL 1 Consulte el manual del operador del equipo Integrated Cycler para configurar el software Integrated Cycler Studio para a adir una definici n de ensayo configurar los procesos y analizarlos en el equipo Integrated Cycler Nota Debe establecerse una curva est ndar v lida proceso de calibraci n antes de llevar a cabo un proceso de diagn stico ZONA DE PREPARACI N DE REACTIVOS Area espec fica para la preparaci n de la mezcla de reacci n de la prueba Simplexa para VBK 1 9701 B 0 Descongele la mezcla de cebadores y la mezcla maestra a temperatura ambiente aproximadamente a una temperatura entre 18 C y 25 C Cada vial del componente del kit contiene reactivos suficientes para 50 reacciones Antes de cada uso mezcle suavemente la mezcla de cebadores y la mezcla maestra invirti ndolas de 6 a 8 veces y centrifug ndolas brevemente para bajar el contenido al fondo del tubo Prepare el volumen requerido de la mezcla de reacci n en un tubo para microcentr fuga de polipropileno del tama o adecuado pipeteando el volumen de cada componente como se indica en la tabla siguiente
15. del genoma del VBK es la diana para identificar el ADN viral en la muestra Por ltimo a fin de monitorizar el proceso de extracci n y detectar la inhibici n de la PCR se emplea un control interno La se al de amplificaci n que se obtiene por cada muestra se compara con una curva de calibraci n y se cuantifica MATERIALES SUMINISTRADOS El kit de Focus Diagnostics Simplexa para VBK contiene una cantidad suficiente de reactivos para un total de 100 reacciones Descripci n del Kit Nombre del compuesto SIMBOLO CE Nombre Color dell N mero Reacciones Volumen EN ETIQUETA Abreviado tap n de viales por vial kit por vial Simplexa BKV Primer Mix MOL2301 REAG A PM Mar n 2 50 100 50 pl Simplexa Master Mix MOL2000 REAG B MM Verde 2 50 100 200 ul Simplexa Extraction amp Amplification Control DNA MOL9001 CONTROL 50 150 250 yl Simplexa BKV Low Positive Control MOL2302 CONTROL LPC Blanco 6 1 6 200ul Simplexa BKV High Positive Control MOL2303 CONTROL HPC Rojo 6 1 6 200ul G Simplexa BKV p gina 2 FOCUS Descripci n del componente Componente del kit Descripci n Cebadores espec ficos marcados con colorante fluorescente para la detecci n y cuantificaci n de VBK y para el control interno Sonda Diana Fluor foro Excitaci n Emisi n Gen diana Simplexa BKV Primer Mix PM colorante Mezcla de cebadores BKV FAM 495 nm 520 nm Gen VP2 Sonoma Q670 6
16. dicada para su uso en programas de diagn stico precoz o diagn stico en orina o plasma para la detecci n de VBK 13 No se ha determinado el rendimiento de esta prueba con sustancias end genas o ex genas que puedan interferir CARACTER STICAS DE RENDIMIENTO COMPARACI N DE M TODOS En el estudio de acuerdo cl nico particip un centro de pruebas interno Los resultados utilizados como referencias se obtuvieron utilizando una prueba desarrollada en el laboratorio LDT Laboratory Developed Test de alto rendimiento En el estudio se analizaron 150 muestras de plasma y 125 muestras de orina para la detecci n o cuantificaci n del VBK La extracci n de las muestras se llevo a cabo utilizando el m todo de extracci n MagNA Pure Las muestras incluidas en el an lisis 75 de plasma y 55 de orina se encontraban dentro del intervalo de combinaci n notificable del LDT de referencia y del ensayo Simplexa para VBK El m todo de regresi n Passing Bablok arroj una pendiente de 1 05 y una intersecci n de 0 83 para plasma y una pendiente de 1 05 y una intersecci n de 0 82 para orina Simplexa BKV p gina 8 Matriz de muestra Plasma M todo de extracci n MagNA Pure Correspondencia de regresi n Passing Bablock con l mite de confianza P B L nea de reg 0 83 1 05 X IC 95 para intersecci n 0 9554 0 7204 IC 95 para pendiente 1 0276 1 0778 n 75 Coeficiente de correlaci n R 1 Conc Simplexa BK
17. do NucliSENSO easyMAG de bioM rieux 1 2 Consulte el manual de usuario del equipo NucliSENSO easyMAG para ver el funcionamiento del equipo y del software Elija la plantilla Generic Gen rica en el software NucliSENSO easyMAG con los siguientes par metros Default Request Solicitud por defecto Generic 2 0 1 o equivalente Run Name Prefix Prefijo del nombre del proceso seg n corresponda Sample ID prefix Prefijo de ID de muestra seg n corresponda Sample Type Tipo de muestra Primary Primaria Workflow Defaults Flujo de trabajo predeterminado On board lysis Incubation incubaci n de lisis en placa On board Silica Incubation incubaci n de s lice en placa Sample Addition Guidance Off Gu a de adici n de muestras apagada Reagent Tracking Seguimiento de reactivos Seguimiento de reactivos de lisis s lice y control interno desactivado Introduzca la informaci n individual de cada muestra en la pantalla Extraction Request Solicitud de extracci n tal y como se indica a continuaci n Sample ID Identificaci n de las muestras introduzca el nombre de la muestra Request Solicitud Generic 2 0 1 o equivalente Volume ml Volumen en ml 0 200 Eluate ul Eluato en pl 50 Type Tipo Primary Primaria Priority Prioridad Normal Matrix Matriz Other Otra Inicie un proceso de extracci n en el software NucliSENSO easyMAG siguiendo el manual de usuario Mezcle cada muest
18. gn tica y pulse otra vez Start Iniciar para dispensar la primera administraci n en el tubo de mezcla de s lice Pulse Start Iniciar para dispensar 125 ul de la mezcla de s lice magn tica en 8 pocillos individuales de la tira ELISA Repita la operaci n seg n el n mero de tiras ELISA adicionales 13 Despu s del periodo de incubaci n de lisis de 10 minutos use 8 puntas por cada tira ELISA y utilizando el modo P3 de la pipeta Biohit transfiera100 ul de la mezcla de s lice magn tica a cada muestra del recipiente para muestras Coloque las puntas en los pocillos de la tira ELISA y pulse Start Iniciar para mezclar y aspirar la mezcla de s lice magn tica 14 Transfiera la mezcla de s lice magn tica al recipiente para muestras apropiado y coloque las puntas de la pipeta en las muestras por debajo del nivel del l quido Pulse Start Iniciar para aspirar dispensar y mezclar x3 la s lice magn tica y las muestras Aseg rese de que las puntas est n bajo el nivel del l quido para garantizar una mezcla adecuada 15 Repita los pasos 13 y 14 para el resto de recipientes para muestras adicionales 16 Despu s de a adir la mezcla de s lice magn tica a todos los recipientes para muestras inicie el proceso de extracci n 17 Cuando el proceso haya terminado retire los recipientes para muestras del equipo Si las muestras no se van a utilizar inmediatamente transfiera el contenido a tubos individuales para minimizar la probabilidad
19. itivo alto HPC y el control sin molde NTC Los tres controles deben reunir los criterios de aceptaci n para que un proceso sea v lido Si uno de los proceso resulta inv lido todas las muestras de los pacientes deben ser examinadas nuevamente Criterios de aceptabilidad Control VBK Control de extracci n y amplificaci n de ADN CI No Template Control NTC No detectado Detectado Low Positive Control LPC Dentro del valor de tolerancia de la etiqueta High Positive Control HPC Dentro del valor de tolerancia de la etiqueta No corresponde de lote espec fico e El control sin molde NTC re ne los criterios de aceptaci n si el VBK no es detectable y el CI es detectable La detecci n del VBK en el control sin molde indica que las muestras pudieron contaminarse durante el proceso e El control positivo bajo LPC re ne los criterios de aceptaci n si el VBK es detectable en el LPC dentro de los l mites de tolerancia tal como se indica en la etiqueta de lote espec fico y el control interno CI deber a detectarse pero no requiere ser detectado e El control positivo alto HPC re ne los criterios de aceptaci n si el VEB es detectable en el HPC dentro de los l mites de tolerancia tal como se indica en la etiqueta de lote espec fico y el control interno Cl deber a detectarse pero no requiere ser detectado 2 Interpretaci n de los resultados Simplexa M BKV p gina 7 Interpretaci n de los resultados Valo
20. ivos despu s de la fecha de caducidad Tras a adir la mezcla de Master use la mezcla de reacci n antes de que pase una hora Guarde la mezcla de reacci n a una temperatura comprendida entre 2 y 8 C hasta que est listo para proceder con la PCR 5 Una vez descongelados guarde la mezcla de cebadores la mezcla maestra y el control de extracci n y amplificaci n de ADN a una temperatura de 2 C a 8 C durante no m s de 30 d as RO D Focus 6 7 Simplexa BKV p gina 3 No vuelva a congelar la mezcla de cebadores la mezcla maestra el ADN para control de extracci n y amplificaci n ni el control positivo No combine los reactivos de distintos lotes ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1 2 p D 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Para utilizaci n en el diagn stico in vitro Todo el material utilizado que sea de origen humano debe ser tratado como potencialmente infeccioso La materia prima utilizada para la fabricaci n de los componentes incluyendo los controles ha sido analizada con m todos aprobados por el FDA con resultados negativos a la presencia de ant genos de superficie de hepatitis B anticuerpos de hepatitis C y de VIH 1 2 SIDA Sin embargo como ning n m todo de ensayo conocido puede ofrecer 100 de garant a de que los productos derivados de la sangre humana no transmitir n estos u otros agentes infecciosos todos los controles muestras de suero y equipos que entre
21. ml Ecuaci n de regresi n Log Simplexa BKV 0 085935 0 987908 Log esperado BKV Linealidad del ensayo Simplexa BKV para orina MagNA Pure Conc Simplexa BKV Log l0 copias ml 40 5 0 60 Conc BKV esperada Log10 copias ml Ecuaci n de regresi n Log_Simplexa_BKV 0 086666 1 084331 Log_esperado_BKV Simplexa BKV p gina 11 Focus Simplexa BKV p gina 12 Linealidad del ensayo Simplexa BKV para plasma easy MAG Conc Simplexa BKV Log10 copias ml 4 0 5 0 60 Conc BKV esperada Log10 copias ml Ecuaci n de regresi n Log _Simplexa BKV 0 213131 0 986263 Log esperado _BKV Linealidad del ensayo Simplexa BKV para orina eas5y MAG Conc Simplexa BKV Log10 copias ml T raraga EEE JJ IU TS IL E 3 SN IL DN E TIE TUS O CL CO TO O IS ET SS 0 0 10 20 3 0 4 0 5 0 50 Conc BKV esperada Log10 copias ml Ecuaci n de regresi n Log _Simplexa BKV 0 213131 0 986263 Log_esperado_BKV RANGO DE INFORME Todos los m todos de extraccci n y los tipos de muestras fueron lineales hasta 1 x 10 copias ml El intervalo de notificaci n del ensayo se bas en el LoD ya que era mayor que la linealidad Esto se determin como gt 510 copias ml a lt 1 x 10 copias ml Las muestras mayores que el rango lineal se describir n como gt 1 x 108 copias
22. n en contacto con estas muestras deben considerarse potencialmente infecciosos y descontaminarse o eliminarse con las precauciones adecuadas de riesgo biol gico El CDC y los institutos nacionales de la salud recomiendan que los agentes potencialmente infecciosos est n manejados en el nivel 2 de Biosafety Cuando manipule los reactivos del kit use equipos de protecci n personal como guantes y batas de laboratorio entre otros L vese las manos minuciosamente cuando termine de realizar la prueba No pipetee con la boca No fume beba coma manipule lentes de contacto ni se aplique maquillaje en las zonas en las que se usan los reactivos del kit o muestras de origen humano Elimine los reactivos del kit que no se hayan usado y las muestras humanas seg n las normas locales estatales y federales El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder en una sola direcci n comenzando en las zonas de preamplificaci n y prosiguiendo en la zona de amplificaci n detecci n a continuaci n se muestra la secuencia de acontecimientos desde la extracci n de la muestra hasta la amplificaci n de PCR en tiempo real e Empiece por la extracci n de la muestra contin e con la configuraci n del equipo de PCR en tiempo real la preparaci n del reactivo y finalice con la amplificaci n mediante PCR en tiempo real e No use materiales fungibles ni equipos en las reas destinadas a la extracci n y preparaci n de muestras No se recomienda ning n
23. n una cabina de bioseguridad Extracci n mediante el m todo Roche MagNA Pure LC 1 N DUDAS 10 11 12 13 14 Los cidos nucleicos se extraen de las muestras de los pacientes y de los controles de la prueba mediante el kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid y el equipo Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor Consulte las instrucciones de uso del fabricante para extraer cidos nucleicos con este kit En el men desplegable Protocol Protocolo del equipo MagNA Pure LC seleccione Total NA cido nucleico total y luego Total NA Variable_elution_volume blk Se cargar n los ajustes apropiados para el proceso El Sample Protocol Protocolo de la muestra debe ser Total NA Variable_elution_volume El volumen de la muestra debe ajustarse en 200 ul y el volumen de eluci n en 50 pl El volumen de diluci n debe ajustarse a cero para todas las muestras Aseg rese de que el protocolo tras la eluci n se sit a en None Ninguno Aseg rese de que las muestras y los controles est n en la posici n correcta en el cartucho de muestras Mezcle cada muestra control positivo bajo LPC y control negativo alto HPC en el mezclador v rtex durante 2 a 4 segundos y centrifugue brevemente para que el contenido baje al fondo del tubo Pipetee 200 ul de cada muestra del control sin molde NTC control positivo bajo LPC y del control positivo alto HPC en la posici n correspondiente del cartucho de m
24. os automatizados usando el sistema MagNA Pure o el NucliSENS easyMAG eliminan eficazmente las impurezas de la muestra ya que a slan y lavan los cidos nucleicos durante el proceso de extracci n Los controles internos alertan al usuario final de una potencial inhibici n de la PCR si ni la diana ni los controles internos se detectan el ensayo es inv lido REPRODUCIBILIDAD El estudio de reproducibilidad se llev a cabo por dos operadores en dos termocicladores integrados un operador por termociclador que realizaron dos an lisis de PCR al d a durante cinco d as La bater a de reproducibilidad conten a los controles NTC HPC y LPC los patrones de cuantificaci n QS 1 a QS 5 mezclas negativas matrices de orina y plasma sin agregados y mezclas positivas con virus VBK en matrices de orina y plasma a tres concentraciones diferentes una mezcla baja a la que se le agreg una concentraci n aproximadamente de 2 a 4 veces el l mite de detecci n LoD una mezcla media aproximadamente de 8 a 10 veces el LoD y una mezcla alta intervalo superior del ensayo Se analizaron cuatro r plicas de cada muestra de la bater a para un total de 80 determinaciones para cada miembro de la bater a del estudio En la tabla siguiente se muestran los resultados de reproducibilidad de cada muestra de la bater a Reproducibilidad Simplexa para VBK Desviaci n est ndar
25. r de VBK Valor de Cl Interpretaci n No detectado Detectado VBK No detectado VBK detectado por debajo del LLOQ Lower Limit of Quantitation X copias m N C VBK detectado a una concentraci n espec fica gt 1x 10 copias ml N C VBK detectado sobre el ULoQ Upper Limit of Quantitation No detectado No detectado Inv lido vuelva a extraer y repita lt 510 copias ml N C 3 Validez del resultado de la muestra Una muestra es v lida si 1 El VBK no es detectado y el Cl es detectado 2 El VBK es detectado El Cl no requiere ser detectado para resultados positivos de VBK 3 Se deben examinar las curvas de amplificaci n para cada resultado en especial cuando se notifica un mensaje de Data Quality Calidad de datos Una curva de amplificaci n v lida presenta un aumento exponencial progresivo Consulte el manual del usuario para obtener m s recomendaciones LIMITACIONES 1 Los analistas deben tener una buena formaci n y estar familiarizados con los procedimientos de las pruebas y la interpretaci n de los resultados antes de realizar la prueba 2 El 3M Integrated Cycler Studio conserva el ltimo archivo de calibraci n v lido para cuantificar muestras de pacientes desconocidas Las normas de cuantificaci n y las muestras de los pacientes deben extraerse utilizando la misma metodolog a de extracci n o usted recibir resultados err neos 3 Cuando se realiza el seguimiento de un paciente el m todo
26. ra control positivo bajo LPC y control negativo alto HPC en el mezclador v rtex durante 2 a 4 segundos y centrifugue brevemente para que el contenido baje al fondo del tubo G Simplexa BKV p gina 5 FOCUS 6 Pipetee 200 ul de la muestra control negativo control positivo y control sin molde NTC en los recipientes para muestras 7 Dele dos 2 pulsos en el agitador v rtex al control interno CI y centrifugue brevemente para bajar el contenido al fondo del tubo 8 Pipetee 5uL del Cl en cada muestra y en todos los pocillos de control Cambie las puntas entre pocillos 9 Cargue los recipientes de las muestras los nuevos desechables del aspirador y los reactivos en el extractor easyMAG M siguiendo el manual del usuario 10 Inicie la lisis en la placa e incube las muestras lisadas durante 10 minutos antes de a adir la mezcla de s lice magn tica 11 Durante el periodo de incubaci n de lisis prepare la mezcla de s lice magn tica Mezcle la s lice y dil yala en agua sin nucleasas a adiendo 1 parte de s lice magn tica a 3 partes de agua sin nucleasas p ej 270 ul de s lice magn tica 810 ul de agua sin nucleasas Prepare un m nimo de 135 ul de mezcla de s lice magn tica por muestra 12 Para transferir la mezcla de s lice a los pocillos de las tiras ELISA mezcle la mezcla de s lice magn tica y use 1 punta h galo con el modo P2 de la pipeta Biohit Pulse Start Iniciar para aspirar 1050 ul de mezcla de s lice ma
27. s poblaciones como pacientes inmunodeprimidos o mujeres embarazadas La reactivaci n puede derivar en varias manifestaciones que van desde una viremia subcl nica o viruria hasta la nefropat a y estenosis uretral observada en pacientes trasplantados La enfermedad cl nicamente manifiesta de una infecci n por VBK no es com n pero se correlaciona con el grado de inmunodepresi n En la actualidad adem s de la PCR no existen otros m todos fiables de detecci n y cuantificaci n del VBK El cultivo viral pocas veces sirve de ayuda a la hora de proporcionar informaci n oportuna para el tratamiento del paciente debido a su baja tasa de crecimiento y a la necesidad de l neas celulares especializadas Las pruebas serol gicas son de uso m nimo porque la mayor a de la E es seropositiva a una enfermedad relacionada con el VBK como resultado de la reactivaci n de una infecci n latente PRINCIPIOS DEL PROTOCOLO El ensayo es un sistema de amplificaci n y detecci n de PCR en tiempo real que utiliza un cebador sonda fluorescente bifuncional para la detecci n del ADN del VBK en muestras de orina y plasma La prueba se compone de dos pasos principales 1 Extracci n del ADN de las muestras del paciente 2 Empleo de un cebador sonda fluorescente bifuncional junto con un cebador inverso para amplificar una diana espec fica para cada analito y control interno El ensayo proporciona un resultado una regi n altamente conservada del gen VP2
28. tipo de movimiento cruzado entre las diferentes reas e Los materiales fungibles y el equipo usado para la preparaci n de las muestras no debe usarse para la preparaci n de reactivos ni para procesar el ADN amplificado ni otras fuentes de cido nucleico diana e Los materiales fungibles de amplificaci n y los equipos deben estar siempre en el rea de equipos de PCR en tiempo real e El equipo de protecci n personal as como las batas de laboratorio o los guantes desechables deben ser espec ficos de cada rea La contaminaci n de las muestras de pacientes o de reactivos puede dar lugar a resultados err neos Utilice t cnicas as pticas Pipetee y manipule los reactivos con cuidado para evitar que se mezclen con muestras de pocillos adyacentes Utilice t cnicas de pipeteo adecuadas y mantenga las mismas condiciones de pipeteo durante todo el procedimiento para garantizar valores ptimos y reproducibles No sustituya los reactivos ni los mezcle con reactivos procedentes de diferentes lotes de kits o de otros fabricantes No intercambie las tapas de los tubos de reactivos Ello puede provocar su contaminaci n y alterar los resultados de la prueba Use nicamente el protocolo descrito en este prospecto Las desviaciones del protocolo o el uso de tiempos o temperaturas diferentes de las especificadas puede producir resultados err neos La preparaci n de la prueba debe realizarse a temperatura ambiente aproximadamente en el rango
29. uasar son marcas registradas de Biosearch Technologies Inc BTI La tecnolog a de los fluor foros Black Hole Quencher CAL Fluor y Quasar est autorizada seg n un acuerdo con BTI y estos productos se venden exclusivamente con fines cl nicos diagn sticos o de investigaci n y desarrollo REPRESENTANTE AUTORIZADO j mdi Europa GmbH Langenhagener Str 71 30855 Langenhagen Hannover Alemania PI MOL2300 O0US ES INFORMACION PARA Rev E PEDIDOS Fecha de redacci n 10 de noviembre de 2014 Tel fono 800 838 4548 EE UU solamente 562 240 6500 Internacional Fax 562 240 6510 ASISTENCIA T CNICA Tel fono 800 838 4548 EE UU solamente 562 240 6500 International focus Fax 562 240 6526 Diagnostics Visite nuestro sitio web en www focusdx com Cypress California 90630 EE UU
30. uestras Inspeccione visualmente el nivel de las muestras y los controles en el cartucho de muestras para asegurarse de que se haya agregado la muestra o las muestras Dele un pulso en el agitador v rtex al ADN para control de extracci n y amplificaci n Cl 2 veces y centrifugue brevemente para bajar el contenido al fondo del tubo Por cada conjunto de 16 muestras muestras 1 16 pipetee 100 ul del ADN del Cl en 6 ml del amortiguador de lisis en un tubo de fondo c nico Mezcle con el agitador v rtex brevemente A ada a la bandeja apropiada del sistema de extracci n MagNA Pure o Por ejemplo si se extraen m s de 16 muestras 17 32 muestras pipetee 200 ul del Cl en 12 ml del amortiguador de lisis en un tubo de fondo conuco Mezcle con el agitador v rtex brevemente A ada a la bandeja apropiada del sistema de extracci n MagNA Pure Transfiera el cartucho de muestras con las muestras al extractor MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid e inicie el proceso de extracci n Despu s de completar la extracci n de cido nucleico se puede retirar el cartucho que contiene los controles extra dos y las muestras de paciente del MagNA Pure y sellarse Guarde el ADN extra do a una temperatura de entre 2 C y 8 C antes de usarlo No se recomienda el almacenamiento prolongado a esta temperatura de las muestras extra das Mantenga las muestras de ADN extra do en un bloque refrigerador mientras carga el disco Extracci n mediante el m to
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