RNA de interferencia: Origen y aplicación en el
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1. Sintetizar Clonar shRNA dentro del shRNAs 1 Dise ar shR NAs siRNA shR NA vector plasmido Ventajas F cil de sintetizar Estable expresi n del siR NA F cil de usar con mayor tiempo de duraci n del silenciamiento Desventajas Poco tiempo del silenciamiento Dif ciles de usar en c lulas Dif ciles de usar en c lulas dif ciles de transfectar como dif ciles de transfectar como cultivos primarios cultivos primarios B SIRNA Verificar grado de siRNAS silenciamiento Introducir Vector plasmido shR NA a la c lula blanco o transfecci n 4 Producci n de pseudo lenti vector retro vector 2 4 part culas virales 3 Mayor tiempo para obtener las c lulas de inter s e Medidas de bioseguridad nivel Il para la recolecci n de las pseudo part culas virales e infecci n de las c lulas blanco Verificar grado de silenciamiento Infecci n de la c lulas blanco 4 Verificar grado de silenciamiento Figura 3 Inducci n de RNAi en c lulas de mam feros A Ventajas y desventajas del uso de siRNAs sint ticos siRNA con estructura de hairpin shRNAs expresados en vectores pl smidos y shRNAs expresados en vectores virales B Diagrama de trabajo simplificado de cada m todo 1 El di se o debe incluir los sitios de restricci n del vector pl smido o lenti vector retro vector 2 Transformaci n de bacterias competentes con el vector pl s m2. 30 nucle tidos sintetizados qu micamente e introducidos artificialmente a las c lulas Estudios posteriores demostraron la existen cia de los componentes del RNAi en mam feros equivalentes a los encontrados en invertebrados plantas y hongos incluyendo Dicer 17 18 MicroRNAs mirtrones y siRNAs end geno hpR NAs RNA de doble hebra de origen end geno e MicroRNAs A pesar de que la maquinaria nece saria para desencadenar el RNAi est presente en mam feros no existen evidencias de la generaci n natural de siRNA a partir de dsRNA largos de origen ex geno en cd ulas som ticas de mam fe ros Sin embargo en poco tiempo se demostr la existencia de RNA peque os de doble hebra 22 nucle tidos de origen end geno microRNAs o miRNAs estructuralmente similares a los siR NAs A diferencia de los siRNAs de origen ex ge no estos miRNAs provienen del procesamiento de precursores dsRNA producidos en el n cleo de la propia c lula 1 21 proceso catalizado por el complejo Drosha formado por la enzima de la fa milia de las RN asa tipo 111 Drosha y la prote na de uni n a dsRNA DGCR8 2537 Los productos de este procesamiento son exportados al citoplasma por el complejo transportador nuclear exportin 5 RanGTP en donde son procesados por Dicer via del RNAi para producir los miRNA maduros Fi gura 2 Las evidencias demostraron r pidamen te que los miRNAs constituyen una nueva v a de regulaci n gen tica en todas las e
3. La in formaci n necesaria para desarrollar dichos siste mas se encuentra en cada manual del usuario User Manual de toda compa a El mango de vectores virales requiere el uso de me didas de bioseguridad nivel 2 www cdc gov od ohs biosfty bmbl 4 bmbl4s3 htm http ombl od nih gov contents htm Es necesario verificar los estatutos de bioseguridad aplicados al uso de lentivirus o re trovirus de la instituci n donde trabaje Por ultimo la eficiencia en la transfecci n o in fecci n del shRNA tambi n determina que el efec to en el silenciamiento del gen de inter s pueda ser detectado Pero a diferencia del uso de siR NAs los vectores de expresi n ofrecen la posibili dad de la introducci n de un marcador o reportero que permita verificar que el shARNA haya sido introducido a la c lula de inter s Asi mismo un marcador puede ser utilizado para purificar las c lulas transfectadas o infectadas Figura 5 Recomendaciones ShRNA vectores Se re comienda usar el GFP como marcador ya que permite verificar la eficiencia de la transfecci n infecci n y adem s permite la purificaci n de las c lulas transfectadas infectadas Figura 5 Este tipo de purificaci n requiere de menor tiempo que la purificaci n basada en la inserci n de un gen para la resistencia a un antibi tico Este ltimo requiere del cultivo de las c lulas transfectadas infectadas en presencia del antibi tico y del pase
4. lulas blanco Unicamente c lulas GFP por citometr a flujo el vector lentiviral shR NA es incorporado i a al DNA gen mico por transcripci n inver sa perdiendo la capacidad de replica ci n Las c lulas que contienen el vector lentiviral shR NA pueden ser selecciona das mediante marcadores como la pro te na verde fluorescente GFP codificada en el vector te na verde fluorescente o GFP o bien genes de resistencia a antibi ticos ejemplo neomici na que permitan la selecci n de las c lulas blanco que contengan el vector d Si presenta un promotor que requiera de la presencia de un antibi tico para inducir la ex presi n del snRNA sistema condicionado o in ducible Los vectores pl smidos son introducidos a las c lulas mediante reactivos basados en l pidos o polia minas o bien electroporaci n por lo que son dif ciles de introducir en c lulas dif ciles de transfectar Los requerimientos particulares del experimento dicta r n el mejor vector a usar Se recomienda verificar la caracter stica del vector principalmente inciso a d su accesibilidad si se requiere el uso forzoso de kits de la misma compa a para garantizar su funci n y si ste ha sido utilizado con xito en tra bajos publicados e Vectores de expresi n virales Los vectores de expresi n virales son veh culos efectivos para la expresi n estable y al largo plazo del shRNA al ser integrados al genoma de la
5. te laser induced model of chroidal neovascularization Retina 2004 24 132 8 Raoul C Abbas Terki T Bensadoun JC Guillot S Haase G Szulc J et al Lentiviral mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS Nat Med 2005 11 423 8 Xia H Mao Q Eliason SL Harper SQ Martins IH Orr HT et al RNAi suppresses polyglutamine induced neurodegeneration in a model of spinocerebellar ataxia Nat Med 2004 10 816 20 Landen CN Jr Chavez Reyes A Bucana C Schmandt R Dea vers MT Lopez Berestein G Sood AK Therapeutic EphA2 gene targeting in vivo using neutral liposomal small interfering RNA delivery Cancer Res 2005 65 6910 8 Hu Lieskovan S Heidel JD Bartlett DW Davis ME Triche TJ Sequence specific knockdown of EWS FLII by targeted non viral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing s sarcoma Cancer Res 2005 65 8984 92 Kumar P et al T Cell Specific siRNA Delivery suppresses HIV 1 Infection in Humanized Mice Cell 2009 134 577 86 Robbins M et al 2 O Methyl modified RNAs act as TLR7 anatgonist Mol Ther 2007 15 1663 9 Grim D et al Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA short hairpin RNA pathways Nature 2006 441 537 41 An DS et al Optimization and functional effects of stable short hairpin RNA expression in primary human lymphocytes via lentiviral vectors Mol Ther 200
6. Clin 2009 61 5 412 427 421 fecci n sea suficiente para observar el efecto de silenciamiento Un siRNA shRNA control positi vo presenta una secuencia complementaria al MRNA de un gen constitutivo en la c lula de in ter s e Monitoreo del grado de silenciamiento El grado de silenciamiento se determina midiendo la disminuci n de los niveles del MRNA blanco o bien la disminuci n de los niveles de la prote na blanco En general el silenciamiento se conside ra v lido cuando ocurre una disminuci n sustan cial de los niveles de expresi n del gen de inter s mientras que no existe disminuci n alguna en la expresi n de un gen control El PCR tiempo real es el m todo de elecci n para medir los niveles del mRNA Este m todo sensible y cuantitativo mide los niveles del MRNA blanco en las c lulas transfectadas infectadas con el siR NA shRNA de inter s y los compara con los nive les del mRNA blanco en las c lulas transfectadas infectadas con el siRNA control Adem s este m todo requiere de la determinaci n de los nive les de mRNA de un gen constitutivo tubulina actina etc el cual funciona como gen control cuya expresi n no debe ser afectada Compa as como Ambion y Applied Biosystem ofrecen las sondas pre dise adas o primers www ambion conyRN Ai y con garant a de fun cionamiento Por otro lado las sondas pueden di se arse o simplemente pueden obtenerse de los bancos de secuencias disponibles en
7. conocidas Una vez dise adas la s ntesis qu mica de la hebra sentido y anti sentido puede ser ordenada a varias compa as como s ntesis de oligonucle tidos I DT www idtdna com Dharmacon www dharmacon com Ambion www ambion com RNAi Generalmente se or dena la s ntesis de oligonucledtidos de salinizados des alted purified oligonucleotides a una concentraci n de 50 100 nM La purificaci n por cromatograf a l quida de alta eficiencia HPLC por sus siglas en ingl s de di chos oligonucle tidos no es necesaria Una vez recibi dos se requiere unir ambos oligonucle tidos para formar el RNA de doble hebra d plex mediante un procedimiento conocido como alineaci n annealing por su descripci n en ingl s siguiendo las instruccio nes del fabricante Una vez unidas pueden ser usadas para introducirlas a la c lula de inter s Varias compa as ofrecen el dise o y la s ntesis de siRNAs listos para ser transfectados 3 4 siRNAs duplex diferentes e incluso la garant a de 50 70 de silenciamiento con al menos uno de ellos Dharma con SMART pool reagent www dharmacon com si genome Ambion Silencer pre designed siRNAs Validated siRNAs www ambion com RN Ai El cos to final de este servicio no resulta barato pero la garantia del funcionamiento y el ahorro de tiempo trabajo justifican completamente el gasto Esta al ternativa es ampliamente recomendada por el autor Finalmente los
8. consecutivo a medio de cultivo nuevo adicionado con el antibi tico hasta que s lo las c lulas resis tentes sobrevivan Por otro lado si el gen de inter s es esencial para la sobrevivencia de la c lula o simplemente se de see controlar la expresi n del shRNA se reco mienda el uso de los sistemas inducibles 1 72 Compa as como Clontech ofrecen vectores de ex presi n inducibles con las instrucciones necesa rias para su USO Controles Un control negativo siIRNA shRNA control negativo no presenta una secuencia com plementaria a ning n mRNA existente en el orga nismo de inter s ste debe ser utilizado para descartar efectos no espec ficos en la expresi n del gen blanco causado por el procedimiento de introducci n siRNA shRNA El control negativo debe ser utilizado en cada experimento realizado y debe usarse para comparar los niveles de silen ciamiento del gen blanco ver monitoreo del grado de silenciamiento abajo Varias compa as ofrecen siRN As shRN As controles negativos Qiagen wwwl giagen com GeneGlobe siRna ControlView Ambion www ambion com RN Ai Se recomienda el uso de un control positivo para verificar las condiciones ptimas de la transfec ci n o infecci n ste resulta muy importante en el caso de los siRNAs ya que podria ser la nica manera de verificar que la eficiencia de la trans Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest
9. lula o tejido blanco por lo que se requiere del uso de siR NAs particularmente resistentes o estables En se gundo lugar evitar la activaci n de la respuesta inmune mediada por interferones o por TLRs es par ticularmente importante al administrar los siRNAs a un mam fero En este caso la introducci n de modifi caciones qu micas al dise o del siRNA ver modifica ciones qu micas abajo se suma a la eliminaci n de las secuencias motivo que activan dicha respuesta in mune En tercer lugar la administraci n segura de los sIRNA ShRNAs debe ser verificada rigurosamente lo cual incluye el uso de veh culos de liberaci n de siRNAs no t xicos ver m todos liberaci n abajo En el caso particular de los shRNAs la saturaci n de los mecanismos end genos de silenciamiento debe ser evitada ver secci n abajo Por ultimo la aplicaci n del RNAi en la terap utica requiere forzosamente que los siRNA shRNAs administrados puedan llegar a la c lula o tejido blanco para lo cual fueron dise ados Precisamente el desarrollo de m todos efectivos para la liberaci n local o sist mica de siRNA shRNAs en organismos vivos se considera el principal problema a resolver en el uso factible del RNAi en la terap utica Por todo lo anterior el uso del RNAi como trata miento presenta implicaciones particulares con res pecto a su uso en la investigaci n b sica A continuaci n se describen los requerimientos parti culares del uso del RNA
10. n el siRNA d plex Los programas disponibles constan de algoritmos basados en las caracter sticas co munes de los siRNA funcionales estudiados Algu nos programas incluyen algoritmos que consideran la estructura secundaria y accesibilidad del mRNA blanco Dichos programas predicen varias secuen cias probables de siRNA o candidatos y cada uno debe examinarse para eliminar aqu llos con secuencias hom logas a genes no deseados para lo cual se sugiere el uso de programa BLAST www ncbi nlm nih gov BLAST La mayor a de los programas para dise ar siRNAs incluyen un progra ma Capaz de realizar tal an lisis por lo que se reco mienda verificar las caracter sticas y capacidades del programa para escoger el m s conveniente Cuadro 1 5657 Efectividad potencia estabilidad y especifici dad del siRNA es lo que se persigue en su dise o Lo anterior incluye evitar la activaci n de la respuesta inmune innata mediada por receptores tipo Toll TLRs la activaci n de la respuesta mediada por interferones y la afectaci n de mRNAs de genes no relacionados Off targets Entre las caracter sti cas comunes que comparten los siRNA efectivos y estables se encuentran tama o del siRNA duplex secuencia asim trica de siRNA d plex localizaci n preferencial de nucle tidos y estabilidad termodin mica Cuadro 2 5 64 Adicionalmente modificacio Cuadro 2 Criterios para el dise o de siRNAs 58 64 Criterio Tama o y s
11. por RNAi se desarrollaron vectores de expresi n con teniendo promotores de RNA polimerasa para la tras cripci n de siRNA dentro de propia c lula Los vectores de expresi n son derivados plasm dicos o de virus que son introducidos a las c lulas de manera es table y son transmitidos a trav s de varias generacio nes Se ha observado que el uso de shRNAs que imitan la estructura de los miRNAs y que son expre sados en dichos vectores es una estrategia eficiente para la inducci n del RNAi Los sARNAs son sinteti zados a partir de una sola hebra que codifica para la secuencia sentido 19 nt seguido de 5 10 nt que for man la estructura de rizo y la secuencia anti senti do complementaria de 19 29 nt Figura 4 La hebra es insertada clonada dentro del vector de expresi n el vector es introducido a la c lula y el shRNA es transcrito mediante un promotor eucari tico de poli merasa como los ampliamente usados promotores de polimerasa II Pol 111 H1 y U6 Los shRNAs son entonces procesados por Dicer para producir los siR NAs Los promotores de Pol II inducen la trascrip ci n en el residuo 1 del transcrito y la termina en el segundo residuo continuo a una secuencia de 4 5 ti midinas T produciendo una secuencia terminal de uridinas U Los promotores Pol II son activos en todo tipo de c lula eucari ticas permitiendo la expre si n constitutiva de los shARNAs e Vectores de expresi n pl smidos Varios pl s
12. por la producci n de interfer n IFN la cual produce la inhibici n general de la traducci n y la apoptosis celular La producci n de IFN activa la expresi n de varios genes incluyendo la expresi n de la prote na cinasa dependiente de RNA PKR PKR reconoce dsRNAs y a continuaci n fosforila e inactiva al factor de iniciaci n 2 el F2 a inhibiendo as la traducci n del mRNA de forma generaliza da 24 Aparentemente el mecanismo anti viral del RNAi hab a sido sustituido por una respuesta m s evolucionada en los vertebrados Sin embargo la maquinaria necesaria para desencadenar el RNAi se encuentra todav a presente en mam feros como se demostr en los trabajos publicados por Elbashir et al y Caplen et al en el 2001 1516 En dichos tra bajos los dsRNA largos fueron sustituidos por RNAs de doble hebra de 21 25 nucle tidos sint ticos imitando la estructura de los siRNAs producidos por el RNAi en los invertebrados Figura 2 La intro ducci n de estos siRNA en c lulas som ticas de ma m feros indujo el fen meno de silenciamiento espec fico de genes sin inducir la respuesta mediada por IFN En este caso los siRNAs entran a la ma quinaria del RNAi al incorporarse directamente al complejo RISC sin requerir la acci n de Dicer Figu ra 4 Este hallazgo es la base del desarrollo del RNAi como herramienta de experimentaci n para el silenciamiento espec fico de genes en mam feros utilizando siRNA lt
13. rate selection of siRNAs for high throughput functional assays Bioinformatics 2005 21 1376 82 Reynolds A et al Rational siRNA design for RNA interferen ce Nat Biotechnol 2004 22 326 30 Huesken D et al Design of a genome wide siRNA library using an artificial neural network Nat Biotechnol 2005 23 995 1001 Shabalina SA Spiridonov AN Ogurtsov AY Computational models with thermodynamic and composition features improve siRNA design BMC Bioinformatics 2006 7 65 81 Takasaki S Kotani S Konagaya A An effective method for selecting siRNA target sequences in mammalian cells Cell Cycle 2004 3 790 5 Amarzguioui M Prydz H An algorithm for selection of func tional siRNA sequences Biochem Biophys Res Commun 2004 316 1050 8 Judge AD et al Sequence dependent stimulation of the mam malian innate immune response by synthetic siRNA Nat Biote chnol 2005 23 457 62 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 Hornung V et al Sequence specific potent induction of inter feron alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7 Nat Med 2005 11 263 70 Czauderna F et al Structural variations and stabilizing modifi cations of synthetic siRNAs in mammalian cells Nucleic Acids Res 2003 31 2705 16 Morrissey DV et al Potent and persistent in vivo anti HBV ac tivity of chemically mod
14. siRNAs pueden ser introducidos directamente a las c lulas transfecci n usando reactivos basados en l pidos cati nicos o poliaminas RNAiF ect de Qiagen Oligofectamine de Invitrogen siPORT NeoF X deAmbion Este m todo es eficiente en el caso de c lulas inmortalizadas adherentes pero no para c lulas en suspensi n y reci n purificadas cultivos primarios El m todo de elecci n en este ltimo caso es la electroporaci n electroporation en ingl s la cual consiste en la apertura de poros en la membrana celular mediante la aplicaci n de pulsos el ctricos Este procedimiento puede compro meter severamente la viabilidad celular y se reco mienda optimizar las condiciones del procedimiento para evitar un alto grado de muerte celular Por lo general esto se logra siguiendo las recomendaciones de las compa as que ofrecen los aparatos y o amor tiguadores para electroporaci n Es importante se alar que la eficiencia en la transfecci n determina que el silenciamiento del gen de inter s sea detectado Una eficiencia de transfec ci n de 50 s lo permitir la detecci n de silencia miento aun cuando el siRNA sea altamente eficiente Por lo anterior el uso de controles positi vos se recomienda ver secci n controles El uso de shRNAs insertados en vectores de expresi n pue de ser una alternativa para verificar la eficiencia de la transfecci n shRNA Para incrementar la duraci n del silenciamiento
15. viral evolutivamente conservado RNAi plantas hongos y animales invertebrados Los estudios para determinar los mecanismos in volucrados en el RNAi se realizaron principalmente en el nem todo Caenorhabditis degans y en la mos ca de la fruta Drosophila introduciendo dsRNA de 500 nucle tidos dsRNA largos Como primer paso el dsRNA largo penetra la c lula y es reco nocido por la RNasa de tipo 111 llamada Dicer Figu ras 1 y 5 A continuaci n Dicer escinde el dsRNA en RNA peque os de doble hebra siRNA por sus si glas en ingl s de 22 25 nucle tidos de largo con 2 3 nucle tidos no pareados en el extremo 3 de cada he bra un grupo fosfato en el extremo 5 y un grupo hi droxilo en el extremo 3 52 Estos siRNAs son reclutados por el complejo proteico de silenciamien to inducido por RNA RISC por sus siglas en in gl s 2 RISC separa las hebras del siRNA y utiliza la hebra anti sentido como gu a para reclutar la mol cula del MRNA que presenta la secuencia comple mentaria MRNA blanco 1 11 A continuaci n RISC escinde el mRNA el cual es r pidamente degradado Infecci n viral AHA dete Robie large di ANA C LULA Via del RNAi Secuencias complementarias Transftecci n SARA sint ticos OH PO i CITOPLASMA DCER Anasatipo Ili RISC Complejo Ge apa iee aA Figura L Mecanismo de RNAi me silence complex diado por siR NAs ex genos RNA de do ble
16. 6 14 494 505 Bitko V et al Inhibition of respiratory viruses by nasally ad ministered siRNA Nature Med 2005 11 50 5 426 Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 86 87 88 89 90 91 Soutschek J et al Therapeutic silencing o fan endogenous 92 Brummelkamp TR Bernards R Agami R Stable suppression gene by systemic administration of modified siRNAs Nature of tumorigenicity by virus mediated RNA interference Cancer 2004 432 173 8 Cell 2002 2 243 7 Zimmermann TS et al RNAi mediated gene silencing in non 93 Huang B Schiefer J Sass C Landwehrmeyer GB Kosinski human primates Nature 2006 441 111 14 Hu Lieskovan S Heidel JD Bartlett DW Davis ME Triche TJ Sequence specific knockdown of EWS FLI1 by targeted non viral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastactic Ewing s sarcoma Cancer Res 2005 65 8984 92 Song E et al Antibody mediated in vivo delivery of siR NA via cell surface receptors Nature Biotechnol 2005 23 709 17 McNamara JO et al Cell type specific delivery of siRNA with aptamer siRNA chimeras Nature Biotechnol 2006 24 1005 15 Hu Lieskovan S Heidel JD Bartlett DW Davis ME Triche TJ Sequence specific knockdown of EWS FLI1 by targeted non viral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metas
17. Bernstein E Caudy AA Hammond SM Hannon GJ Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interferen ce Nature 2001 409 363 6 7 Zamore PD Tuschl T Sharp PA Bartel DP RNAi double stranded RNA directs the ATP dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals Cell 2000 101 25 33 8 Elbashir SM Lendeckel W Tuschl T RNA interference is me diated by 21 and 22 nucleotide RNAs Genes Dev 2001 15 188 200 9 Hammond SM Bernstein E Beach D Hannon GJ An RNA di rected nuclease mediates post transcriptional gene silencing in Drosophila cells Nature 2000 404 293 6 10 Nykanen A Haley B Zamore PD ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway Cell 2001 107 309 21 11 Schwarz DS Hutvagner G Haley B Zamore PD Evidence that RNAs function as guides not primers in the Drosophila and human RNAi pathway Mol Cell 2002 10 537 48 12 Williams BR Role of the double stranded RNA activated pro tein kinase PKR in cell regulation Biochem Soc Trans 1997 25 509 13 13 Gil J Alcami J Esteban M Induction of apoptosis by double stranded RNA dependent protein kinase PKR involves the al pha subunit of eukaryotic translation initiation factor 2 and NF kappaB Mol Cell Biol 1999 19 4653 63 14 Gil J Esteban M Induction of apoptosis by the dsRNA depen dent protein kinase PKR mechanism of action Apoptosis 2000 5 107 14 15 Elbashir SM Ha
18. E RIC ART CULO DE REVISI N RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Blanca Ortiz Quintero Investigador en Ciencias M dicas Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias RNA interference from origins to a novel tool for gene silencing ABSTRACT RNA interference RNAi is a conserved biological mechanism triggered by double stranded RNA from exogenous small in terfering RNA siRNA or endogenous origin microRNAs miRNA that inhibits gene expression at transcriptional level First discovered as an ancient anti viral response RNAi is now recognized as a natural regulatory mechanism for silen cing gene expression in eukaryotes and as a powerful tool for investigating gene function Over the last seven years RNAi has become a valuable and standardized tool to silence gene expression in almost every scientific research fidd This re view describes the RNAi as a biological response and as a research tool for silencing gene expression focusing on pri mary information required when the RNAi is applying for first time at a laboratory It provides a basic guide to promote RNAi advantages and a list of available web tools for RNAi application in research field at a laboratory Information about R NAi based therapeutics development is included Key words RNA interference RNAi Knocking down Re search tool Small interference RNA siRNA microRNA miRNA RNAi based therapeutic
19. INTRODUCCION El RNAi fue caracterizado por primera vez en 1998 cuando Fire y Mello demostraron que la in troducci n de RNA de doble hebra dsRNA por sus siglas en ingl s en el nem todo Caenorhabditis de RESUMEN El RNA de interferencia RNAi es un mecanismo biol gico conservado que inhibe espec ficamente la expresi n de genes a nivel post transcripcional en respuesta a la presencia de RNA de doble hebra que proviene de la propia c lula microRNA o miRNA o del exterior de la misma RNA peque os de interfe rencia o siRNA Identificado por primera vez como un meca nismo anti viral conservado evolutivamente el RNAi surge como un proceso natural de regulaci n de la expresi n de ge nes en eucariotes y como una potente herramienta para el si lenciamiento artificial de genes en investigaci n As en los ltimos 10 a os el RNAi se ha convertido en una invaluable y estandarizada herramienta de experimentaci n para la carac terizaci n funcional de genes en todo laboratorio y en pr cti camente toda rea de la investigaci n cient fica La siguiente revisi n describe el RNAi como proceso biol gico y su aplica ci n como herramienta en investigaci n experimental bas n dose particularmente en las dudas que surgen al montar las t cnicas por primera vez en un laboratorio La informaci n contenida es simple y pretende difundir las ventajas del RNAi e incluye las fuentes de informaci n t cnica especializada para
20. NA gen mico de la c lula blanco Las pseudo part culas virales son generadas en c lulas pro ductoras por co transfecci n transitoria del shRNA vector lentiviral pl smido de empaqueta miento y pl smido de envoltura Figura 5 El se gundo contiene la informaci n para la transcripci n y empaquetamiento de un RNA co pia del shRNA vector lentiviral dentro de la pseu do part cula viral El tercero contiene la informaci n para la s ntesis de la envoltura mem branal la cual es esencial para la capacidad de infecci n Las pseudo part culas virales son se cretadas al medio de cultivo recolectadas y pos teriormente usadas para infectar las c lulas blanco Dentro de la c lula blanco ocurre la transcripci n inversa de la informaci n contenida en el shRNA vector lentiviral y la integraci n al DNA gen mico Posterior a la integraci n gen mica ocurre la expresi n del shRNA y del mar cador en su caso y la capacidad de replicaci n viral se pierde debido a que genes estructurales est n ausentes y los LTR virales est n dise ados para auto desactivaci n Los LTRs long termi nal repeats son los promotores virales que con tienen toda informaci n para la expresi n gen tica de los retrovirus Existen varias compa as que ofrecen sistemas re tro y lentivirales Clontech www clontech com Invitrogen www invitrogen com System Biosciences SBI www systembio com Tronolab www tronolab epfl ch www lentiweb com
21. RISC en humanos incluyen las prote nas de uni n a dsRNA Argonauta 1 y 2 AGO El miR NA se une al extremo 3 del mRNA blan co reconociendo secuencias parcialmente complementarias e inhibe la traducci n del mismo El mecanismo de inhibici n de la traducci n no se conoce con exactitud Evidencias recientes indican que el miR NA inhibe el inicio de la traducci n del mRNA al bloquear el reclutamiento de la subunidad 605 del ribosoma durante el proceso de traducci n VNanu Sp 614 AA 5 de 22 nucle tidos el cual es reclutado por el complejo RISC Una vez incorporado al complejo RISC el miRNA se une al extremo 3 del MRNA blanco reconociendo secuencias parcial mente com plementarias o imperfectas reconocimiento par cial donde no todas las secuencias son complementarias e inhibe la traducci n del mis mo 22 23 40 En vertebrados dicho reconocimiento requiere nicamente de una perfecta complemen tariedad entre el MRNA y la regi n 5 del miRNA conocida como seed por su descripci n en in gl s la cual abarca 2 7 nucledtidos 4143 El mecanismo por el cual los miRNAs inhiben la traducci n no se conoce con exactitud En 2008 Novina et al 48 reportaron que el miRNA inhibe el inicio de la traducci n del mRNA al bloquear el reclutamiento de la subunidad 605 del ribosoma durante el proceso de traducci n Algunas eviden cias indican que el miRNA podr a tambi n degra dar directamente al mRNA
22. RNA in volucra la inyecci n intravenosa de siRNAs modi ficados qu micamente m s estables conjugados a colesterol o encapsulados en bicapas lip dicas co nocidas como part culas lip dicas cido nucleico estables SNALPs los cuales facilitan la libera ci n a trav s de endocitosis Estos dos m todos han sido usados con xito para liberar los siRNA en h gado e intestino delgado pero no son apropiados para otro tipo de rganos o tejidos La alternativa son los m todos de liberaci n sist mica espec fica dirigida a un rgano o tejido parti cular los cuales involucran el uso de siRNAs encapsulados en nanopart culas cati nicas conju gadas a ligandos o receptores espec ficos 9 siRNAs unidos al complejo anticuerpos protaminaf y siR NAs fusionados a RNA aptameros Como ejem plo siRNA dirigido contra el producto del gen EWS FLI1 en un modelo murino de sarcoma metas t tico fue protegido con nanopart culas compuestas por ciclodextrina un oligos carido c clico conte niendo policationes y cubiertas con transferrina cuyo receptor es expresado en grandes cantidades en las c lulas cancerosas El tratamiento inhibi considerablemente el crecimiento tumoral 24 e shRNA vectores virales Vectores lentivirales han sido usados exitosamente para la liberaci n deshRNAs en mam feros shRNA vector lentiviral contra la forma activada del oncogene Ras fue usado en ratones para disminuir el crecimiento de c lulas tu
23. a neonatal han sido finalizadas usando ALN RSVO1 el cual es un siRNA dirigido contra un gen que codifica para la nucleoc pside viral Alnylam Pharmaceuticals co municado de prensa Calando Pharmaceuticals Pasadena California inici pruebas cl nicas de fase para el tratamiento de tumores s lidos usando un siRNA espec fico para la subunidad de la ribonucle tido reductasa RRM2 enzima requerida para la s ntesis de DNA Este estudio es el primero en usar un m todo de li beraci n mediante receptores donde el siRNA es en capsulado en ciclodextrina un oligos carido c clico conjugada a lactoferrina cuyo receptor es altamente expresado en c lulas cancerosas Pruebas cl nicas en fase han iniciado para el tratamiento de linfoma en pacientes con VIH usando shRNA vector viral contra los exones tat y rev del VIH En este estudio c lulas pluripotenciales infec tadas con el shRNA vector lentiviral han sido trans plantadas en cuatro pacientes The City of Hope Nacional Medical Center Duarte California en cola boraci n con Benitec Melbourne Australia La rapidez de este avance puede deberse a que las compa as farmac uticas han decidido unir esfuer zos para el desarrollo de terapias basadas en el RNAi y actualmente la colaboraci n parece ser la pr ctica com n en este campo CONCLUSIONES Actualmente el RNAi es un m todo confiable estandarizado relativamente r pido y con menor costo que los m todos altern
24. ativos como la genera ci n de ratones knock out La inhibici n de la expresi n de un gen dado o genes proporciona al investigador un modelo contundente para elucidar su posible funci n Las ventajas y aplicaci n de esta herramienta deben ser difundidas para que un n mero mayor de investigadores visualice la posibilidad de implementar el RNAi en su labora torio Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 Aunado a lo anterior la aplicaci n del RNAi como agente terap utico ofrece un campo promete dor y novedoso para aquellos dedicados al area m di co clinica REFERENCIAS 1 Fire A Xu S Montgomery MK Kostas SA Driver SE Mello CC Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature 1998 391 806 11 2 Ratcliff F Harrison BD Baulcombe DC A similarity between viral defense and gene silencing in plants Science 1997 276 1558 60 3 Ruiz MT Voinnet O Baulcombe DC Initiation and maintenan ce of virus induced gene silencing Plant Cell 1998 10 937 46 4 Angell SM Baulcombe DC Consistent gene silencing in trans genic plants expressing a replicating potato virus X RNA EMBO J 1997 16 3675 84 5 Romano N Macino G Quelling transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homo logous sequences Mol Microbiol 1992 22 3343 53 6
25. blanco dentro de los compartimentos citoplasm ticos conocidos como compartimentos de procesamiento o comparti mentos P P bodies por su descripci n en in gl s 49 Una revisi n detallada de la biog nesis y mecanismos de silenciamiento de siRNAs y miR NAs se encuentra en la referencia 50 Mirtrones y hpRNAs Recientemente se consi deraba que los miRNAs eran derivados de trans critos end genos plantas invertebrados y mam feros que requieren forzosamente de la ac ci n del complejo Drosha y de Dicer v a de miR NAs mientras que los siRNAs eran derivados exclusivos de dsRNA largos ex genos procesados por Dicer via del RNAi en plantas e invertebra dos Sin embargo los ltimos hallazgos revela ron no s lo la existencia de una v a alterna en la Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 415 A Uso de siRNAs sint ticos siRNA con estructura de hairpin shR NAs shRNA vector lentiviral o retroviral Estable expresi n del siR NA con mayor tiempo de duraci n del silenciamiento Son introducidos a pr cticamente cualquier tipo de c lula mediante infecci n Dise as Sintetizar Introducir siRNAs a SIRNAS siRNAS la c lula blanco e shRNA vector plasmido Dise ar Sintetizar Clonar shRNA dentro shRNAS shRNAs 1 vector pl smido 2 shRNA vector lentiviral o retroviral
26. c lula blanco 68 Cuando estos vectores son empaquetados dentro de pseudo part culas virales es posible introducir los pr cticamente a cualquier tipo de c lula me diante infecci n Dos tipos de vectores han sido desarrollados Los vectores derivados de oncore trovirus o retrovirales desarrollados a partir del virus Moloney de la leucemia murina Moloney murine leucemia virus MMLV o bien a partir del virus de c lulas madre murino murine stem cell virus MSCV y los vectores lentivirales de sarrollados a partir del virus dela inmunodeficien Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 cia humana 1 human immunodeficiency virus 1 HIV 1 que tambi n pertenecen a la familia de los retrovirus Una diferencia importante entre ellos radica en que los vectores retrovirales u on coretrovirus s lo infectan c lulas dividi ndose ac tivamente por mitosis a diferencia de los vectores lentivirales que son capaces de infectar c lulas con y sin actividad mit tica 69 70 Los vectores virales presentan los elementos de un vector plasm dicos mencionados en los incisos a d adem s de las caracter sticas mostradas a continuaci n Vectores lentivirales El shRNA es insertado en el vector lentiviral ShRNA vector lentiviral el cual contienen los elementos gen ticos para la transducci n integraci n y expresi n dentro del D
27. ecuencia asim trica 19 nt complementarios y 2 nt no pareados enel extremo 3 de cada hebra Estabilidad Contenido de G C bajo a medio 30 52 Posici n preferente para un nucle tido UoA en posici n 1 C o G en posici n 19 U en posici n 17 A en posici n 19 A en posici n 3 U en posici n 10 Especificidad Verificar homolog as en la secuencia del siRNA con blancos no deseados Off targets usando los programas Blast o Smith Waterman durante el proceso de selecci n Evitar las secuencias motivo conocidas que puedan activar la respuesta inmune innata a trav s de los receptores tipo Toll TLR s 52 63 Estabilidad en la s ntesis qu mica Se evitan las secuencias con pares alternados GC m s de 7 Reynolds et al 52 Huesken Shabalina Takasaki Amarzguioui J ud ge 3 Hornung 418 Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 nes qu micas artificiales son frecuentemente inclui das en el dise o del siRNA con la finalidad de incre mentar su estabilidad sin afectar su efectividad Se recomienda dise ar y probar el grado de silen ciamiento de al menos cuatro tipos diferentes siRNAs cuatro hebras sentido distintas con sus respectivas cuatro hebras anti sentido ya que no existe 100 de garant a en el dise o de siRNAs eficientes y espe c ficos aun cuando cumplan con las caracter sticas de dise o
28. facilitar la aplicaci n del RNAi en cualquier laboratorio El es crito incluye informaci n acerca del desarrollo de estrategias para la aplicaci n del RNAi en organismos vivos y su aplica ci n en la terap utica as como las pruebas en fase cl nica que se llevan a cabo actualmente por compa as farmac uticas Palabras clave RNA de interferencia RNAi Herramienta en investigaci n Silenciamiento de genes knocking down RNA peque os de interferencia siRNA microRNA miR NA Mirtrones mirtrons RNAi en terap utica gans indujo la degradaci n del RNA mensajero mRNA que presentaba una secuencia complemen taria a una u otra hebra del dsRNA resultando en el silenciamiento del gen correspondiente Esta de gradaci n del mRNA espec ficamente dependiente de la secuencia del mismo fue llamada RNA de interfe Revista de Investigaci n Cl nica Vol 61 N m 5 Septiembre Octubre 2009 pp 412 427 rencia RNAi Este fen meno de silenciamiento de genes en respuesta a dsRNA hab a sido observado previamente en plantas y hongos siendo el RNA vi ral la fuente del dsRNA 3 Estudios posteriores de mostraron que todos los organismos eucariotes estudiados incluyendo plantas hongos y animales invertebrados presentaban de manera conservada el RNAi en respuesta a dsRNA Debido a que la fuente natural de RNA de doble hebra son las infecciones virales se determin que el RNAi es un mecanismo anti
29. hebra largos dsRNA largos penetran la c lula y son procesados por la R Nasa tipo Ill llamada Dicer Dicer es cinde el dsRNA largo en RNA peque os de doble hebra siRNA de 21 23 phh nucle tidos nt con 2 nt no pareados en pare cada extremo 3 y un grupo fosfato en cada extremo 5 Los siRNAs son enton ces reclutados por el complejo de silen ciamiento inducido por RNA RISC por sus siglas en ingl s el cual separa las hebras del siRNA RISC utiliza la hebra anti sentido como gu a para incorporar al mRNA con la secuencia complementaria a dicha hebra y a continuaci n el mRNA es escindido inhibiendo as la expresi n del gen correspondiente Por otro lado AGG Amonauta MRNA RHA mensajero MRNA blanco es posible introducir artificialmente a la c lula siRNA sint ticos y desencadenar el mecanismo del RNAi cuando dichos siRNAs sint ticos son incorporados a RISC directamente Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 413 La hebra guia del siRNA y el mRNA blanco debe pre sentar una perfecta complementariedad cerca del si tio de rompimiento ruptura el cual se situa a 10 11 nucle tidos del extremo 5 del siRNA RNAi en mam feros A diferencia de los invertebrados la introducci n de dsRNA largos en c lulas som ticas de mamife ros indujo la activaci n de la respuesta anti viral mediada
30. i en la terap utica Modificaciones qu micas adicionales del siRNA El dise o de siRNAs efectivos y estables se basa en las caracter sticas comunes de los siRNAs funcio nales estudiados como ya fue mencionado en la sec ci n siRNAs sint ticos Adicionalmente algunas modificaciones qu micas de los siRNAs han sido uti lizadas para incrementar la resistencia del siRNA a la degradaci n in vivo La adici n de 2 O metil puri nas o 2 O fluoropirimidinas en la posici n 2 de la ribosa incrementa la resistencia a la acci n de ribo nucleasas en suero Los siRNAs modificados con 2 O metilpurinas son m s efectivos que sus an lo gos no modificados en la protecci n contra el virus de la hepatitis B in vivo La adici n de 2 O metil purinas en la hebra sentido de un siRNA d plex eli mina la activaci n de los TLRs y previene la activaci n del interfer n Evitar la saturaci n de los mecanismos end genos de silenciamiento cuesti n de vida o muerte Estudios recientes han demostrado que altos ni veles de shARN As inducidos por el uso de promotores potentes en los vectores de expresi n pueden ser le tales in vivo Un estudio publicado en 200683 repor t que la producci n de altos niveles de shRNAs en ratones produjo la muerte de 23 de los 49 ratones de experimentaci n debido a un da o hep tico asociado a la disminuci n de los niveles de miRNAs en el h gado indicando una interferencia compet
31. iRNA es transportado al citoplasma por el complejo trans portador nuclear exportin 5 RanGTP En el cito plasma Dicer escinde el pre miRNA cerca del rizo para producir finalmente el miRNA maduro 414 Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 N cleo Pa sh ypt CITOPLASMA A a Pre miRHA 70 nt hairpin Prodi bo peor Cicas TT mira PO 2 mi asia Febra we RISC Via del RNA Minpocnsador las Pro miRHA we TOMOS miRNA gen Prisha Ey Complejo oe mRNA banco Bloqueo de la traducci n Sees parciad merda Cor Sg har e Figura 2 Mecanismo de RNAi mediado por miRNAs En el nucleo celular el gen que codifican para el microRNA miRNA es transcrito por una RNA polimerasa II para producir el precursor miRNA primario o pri miRNA 60 100 nucle tidos con una i estructura de hairpin El pri RNA es pro cesado por el complejo Drosha DGCR8 en humanos para formar el precursor j miRNA o pre miRNA 70 nucle tidos i con estructura de hairspin un grupo fos fato en el extremo 5 y dos nucle tidos no pareados en el extremo 3 El pre miR NA es transportado al citoplasma a trav s de la exportin 5 RanGTP En el citoplasma Dicer escinde el pre miR NA para producir el miRNA maduro de 22 nucle tidos el cual es reclutado por el complejo RISC Los componentes conocidos de
32. ido shRNA o lenti vector shRNA retrovector shRNA para la producci n de cantidades suficientes del vector usado posteriormente para la transfecci n o producci n de part culas virales respectivamente 3 Incluye la co transfecci n del lenti vector shR NA con pl smidos para el empaquetamiento y envoltu ra de la pseudo part cula viral usando c lulas productoras y la posterior recolecci n del sobrenadante del cultivo conteniendo las pseudo part culas virales Uso de campana de bioseguridad nivel Il como m nimo 4 Incluye la selecci n de las c lulas transfectadas o infectadas mediante la detecci n de marca dores como la mol cula verde fluorescente GFP o mediante la resistencia a un antibi tico como neomicina biog nesis de miRNAs precursores Mirtro nes 51 52 sino la existencia de una nueva v a de bios ntesis de siRNAs provenientes de dsRNA largos de origen end geno hpRNAs 53 Los mirtrones Mirtrons en ingl s son precur sores dSRNA con estructura de hairspin seme jante al precursor pre miRNA que provienen de secuencias cortas de intrones que sufren un pro ceso de empalme y corte o splicing en in gl s Los mirtrones no requieren de la acci n del complejo Drosha y son exportados directamente al citoplasma por el complejo transportador nu clear exportina 5 donde son incorporados a la v a del miRNA 2 Su existencia ha sido confirma da en Drosophila Caenorhabditis elegans y c l
33. ified siRNAs Nature Biotechnol 2005 23 1002 7 Barton GM Medzhitov R Retroviral delivery of small interfe ring RNA into primary cells Proc Natl Acad Sci USA 2002 99 14943 5 Devroe E Silver PA Retrovirus delivered siRNA BMC Biote chnol 2002 2 15 Naldini L Bl mer U Gallay P Ory D Mulligan R Gage FH et al In vivo gene delivery and stable transduction of nondivi ding cells by a lentiviral vector Science 1996 272 263 7 Miller DG Adam MA Miller AD Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection Mol Cell Biol 1990 10 4239 42 Kappel S Mattess Y Kaufman M Strebhardt K Silencing of mammalian genes by tetracycline inducible shRNA expression Nature Protocols 2007 2 3257 60 Wiznerowicz M Szulc J Trono D Tuning silence conditional systems for RNA interference Nat Methods 2006 3 682 8 Bitko V Musiyenko A Shulyayeva O Barik S Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA Nat Med 2005 11 50 5 Palliser D Chowdhury D Wang QY Lee SJ Bronson RT Knipe DM Lieberman J An siRNA based microbicide protects mice from lethal herpes simplex virus 2 infection Nature 2006 439 89 94 Shen J et al Suppression of ocular neovascularization with siRNA targeting VEGF receptor Gene Ther 2006 13 225 34 Tolentino MJ et al Intravitreal injection of VEGF small inter fering RNA inhibits growth and leakage in a nonhuman prima
34. inhiben la traducci n de mRNA que presentan una secuencia parcialmente comple mentaria a los miRNAs Hairpin Estructura que presenta el RNA cuando una hebra con secuencias de nucle tidos repetidas e invertidas se dobla sobre s misma y forma una estructura de doble hebra con las secuencias invertidas ahora complementarias y un doblez en forma de rizo en un extremo Fi gura 5 Esta estructura se conoce como hairpin por su descripci n en ingl s shRNA siR NA con estructura de hairpin short hairpin RNA Por lo general son expresados en pl smidos o vectores provenientes de vi rus Knocking down Descripci n en ingl s que indica una disminuci n en la expresi n de un gen mediante RNAi o silenciamiento Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 427
35. itiva de la v a del miRNA Los datos indicaron una saturaci n del transportador nuclear exportina 5 y la subse cuente inhibici n de la exportaci n de los precurso res premiRNAs v a del miRNA y Figura 2 La soluci n es el uso de promotores menos potentes que induzcan la producci n de niveles de shRNA no t xi cos y con efectos terap uticos aceptables 33 84 En el caso de los siRNAs se recomienda usar la menor concentraci n posible de siRNAs que produz ca un efecto terap utico aceptable para disminuir el riesgo de la saturaci n de los mecanismos end ge nos de silenciamiento Sistemas de liberaci n del siRNA ShRNA in vivo e siRNA Los m todos de liberaci n desarrollados in vivo incluyen la inoculaci n directa del siRNA en rganos como el ojo pulm n y sistema nervio so central o bien la liberaci n sist mica de siR NA conjugados a l pidos pol meros anticuerpos y recientemente nanopart culas La liberaci n directa de siRNA en veh culos como soluci n salina o dextrosa 5 es relativa mente f cil y requiere de bajas concentraciones por lo que resulta muy atractiva como tratamien Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 423 to local pero no es util para un tratamiento sis t mico Este m todo ha sido utilizado con xito para liberar siRNA en ojo 3 76 y pulm n 35 La liberaci n sist mica no espec fica de si
36. la red http pga mgh harvard edu primerbank y solicitar su s ntesis a la compa a de elecci n Sigma es bue na opci n www sigma aldrich com lo cual dis minuye mucho los costos El grado de silenciamiento puede ser medido a ni vel proteico para lo cual existen varios m todos como el Western blot inmunofluorescencia y ci tometr a de flujo Todos son m todos perfecta mente estandarizados y de uso com n en el laboratorio APLICACIONES DE HERRAMIENTA EN LA INVESTIGACI N B SICA AL DESARROLLO DE UN AGENTE TERAP UTICO Existe una relaci n estrecha entre la investiga ci n b sica y el rea cl nica La investigaci n b sica permite el descubrimiento de los mecanismos o factores responsables de alguna enfermedad proporcionando no s lo los posibles blancos para una terap utica sino tambi n las herramientas para el desarrollo de la misma El rea cl nica proporciona la experiencia y conocimientos para el diagn stico de enfermedades y la capacidad para aplicar tratamientos a seres humanos En teor a el RNAi podr a ser aplicado como tra tamiento de enfermedades asociadas a la expre si n o sobre expresi n de un gen conocido El efecto esperado es detener o disminuir el mecanis mo generador de la enfermedad produciendo efectos secundarios tolerables o bien ninguno As pues la investigaci n b sica ha se alado como posibles blancos para terapia a productos de genes involucrados en ciclo celular a
37. m 2003 278 44312 9 Zeng Y Yi R Cullen BR MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms Proc Natl Acad Sci USA 2003 100 9779 84 Pasquinelli AE Reinhart BJ Slack F Martindale MQ Kuroda MI Maller B et al Conservation of the sequence and tempo ral expression of let 7 heterochronic regulatory RNA Nature 2000 408 86 9 Reinhart BJ Slack FJ Basson M Pasquinelli AE Bettinger JC Rougvie AE et al The 21 nucleotide let 7 RNA regulates de velopmental timing in Caenorhabditis elegans Nature 2000 403 901 06 Brennecke J Hipfner DR Stark A Russell RB Cohen SM Bantamencodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hidin Drosophila Cell 2003 113 25 36 Xu P Vernooy SY Guo M Hay BA The Drosophila microR NA mir 14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism Curr Biol 2003 13 790 5 Chen CZ Li L Lodish HF Bartel DP MicroRNAs modulate he matopoietic lineage differentiation Science 2004 303 83 6 Hutv gner G McLachlan J Pasquinelli AE B lint E Tuschl T Zamore PD A cellular function for the RNA interference en zyme Dicer in the maturation of the let 7 small temporal RNA Science 2000 293 834 8 Doench JG Petersen CP Sharp PA siRNAs can function as miRNAs Genes Dev 2003 17 438 42 Ruby JG Stark A Johnston WK Kellis M Bartel DP Lai EC Evolution biogenesis expres
38. midos han sido desarrollados como vectores de expresi n Ambion Sigma Qiagen Clontech Los elementos importantes de un vector de expre si n son a El tipo de promotor b El sitio de inserci n del shRNA c La expresi n de marcadores ejemplo la pro Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 419 shRNA inserto GFP le e i Lentivectors d ka Co transfeccidn Propagaci n y medici n del silencia miento ae ut gt 1 Co transfecci n y producci n ls de pseudopart culas virales S M Figura 5 Inducci n de RNAI usando vectores de expresi n lentivirales Los pasos generales incluyen la clonaci n del shRNA dentro del vector lentiviral se 2 Colecci n de las pseudopart culas noe guido por la co transfecci n del vector virales en el sobrenadante Tevfaccitei lentiviral shRNA y los plasmidos para el alas dls o a L empaquetamiento y la envoltura viral en see 3 c lulas productoras Las c lulas produc toras 293F 293FT son generalmente 3 Infecci n de c lulas blanco ba derivadas de la l nea celular 293T c lula A A A de ri n embri nico humano Las c lu C lulas blanco las productoras secretan las pseudo par 4 ticulas virales en el medio de cultivo las ra ay cuales son recolectadas y usadas para 4 Purificaci n de c lulas infectadas 9 i infectar a las c
39. morales Vectores adenovirales han sido usados para liberar shARNAs al sistema ner vioso central tomando ventaja de la atracci n na tural del adenovirus hacia las neuronas shRNA dirigido contra el gen huntingtin el gen mutado causante de la enfermedad de Huntington fue in sertado en un vector adenoviral y usado con xito en modelos murinos Es necesario advertir que a pesar de las ventajas que ofrece el uso de vectores virales existe el riesgo potencial de que algunos de ellos estimulen una respuesta inmunol gica por s mismos Por otro lado la naturaleza viral de estos vectores los hace susceptibles de sufrir mutacio nes lo cual podr a provocar potencial mente una expresi n gen tica alterada Pruebas cl nicas en humanos Pruebas cl nicas de fase 111 para el tratamiento de la degeneraci n macular relacionada con la edad de tipo h meda AMD se basan en la inyecci n in travitral de Cand5 Bevasiranib un siRNA dirigido contra todas las isoformas del factor de crecimiento vascular endotelial o VEGF Acuity Pharmaceuti cals comunicado de prensa Adicionalmente prue bas cl nicas de fase han sido finalizadas usando la inyecci n intravitral de Sirna 027 un siRNA dirigi do contra el receptor 1 del VEGF Merk Sirna The rapeutics San Francisco California comunicados de prensa Por otro lado pruebas cl nicas de fase contra el virus sincicial respiratorio RSV causan te de una infecci n seria respiratori
40. n estructura de hairpin shARNA o short hairpin RNA expre sados en vectores pl smidos introducidos a la c lula mediante transfecci n o electroporaci n El uso de shRNA expresados en vectores de ex presi n virales introducidos a la c lula mediante infecci n con pseudo part culas virales El m todo a escoger depende de dos factores la duraci n del efecto de silenciamiento que se requiera y el tipo de c lulas que se desea trabajar El uso de siRNA sint ticos induce un silenciamiento de tres a siete dias por lo que es el m todo adecuado para ensayos cortos Si se requiere de ensayos de larga duraci n el m todo m s adecuado ser a el uso de shRNA expresados en pl smidos vectores y si se re quiere trabajar con c lulas dif ciles de transfectar y un silenciamiento prolongado el m todo de opci n Sitios de restricci n sont p shRNA inserto Wector shRNA inserto fs Rizo Transeripeidn Hebra sentido NAA A A shRNA H bra anti sentido Dicer Habra santida siRNA 7 UUUUNA AANA AA A AAMAS E Hebra anti santido mplecllinaf kanamicina Tant sentido 18nt antiesentido g painiar gt NANANAANNAANAANANANANTTCA 4 AGANNANNANNANNANNANNANTTTT UUUUNNNNNNMNNNNNANNNNNNN i El 5 PAPAS Pal Pd Pad PSP Pa NNAM Wector Pl amido Lentiviral Retroviral Figura 4 Generaci n de shRNAs ex presados en vectores de expresi n Los vectores de expresi
41. n son derivados de pl smidos o de lentivirus retrovirus Es tos presentan generalmente a sitios de restricci n espec ficos donde se inserta el shRNA b un promotor eucari tico de polimerasa para la expresi n del shRNA c un marcador o resistencia a antibi ti cos para la selecci n de las c lulas que contenga el vector y d resistencia a ampicilina kanamicina para la selecci n de bacterias transformadas con el vec tor Los shRNA son sintetizados a partir de una sola hebra que codifica para la se cuencia sentido 19nt seguido de 5 10 nt que forman la estructura de rizo y la secuencia anti sentido complementaria de 19 29 nt La hebra es clonada inser tada dentro del vector de expresi n in troducida a la c lula y transcrita mediante el promotor eucaridtico de poli merasa Ill Pol 111 como el H1 y U6 Los shRNAs son entonces procesados por Dicer para producir los siRNAs y desen cadenar el mecanismo de RNAi GFP proteina verde fluorescente terminaci n ne uc Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 417 Cuadro 1 Sitios en la red para el dise o de si shRNAs Ambion Dharmacon Qiagen Invitrogen Integrated DNA Techonologies Sfold Algorithm Tuschl Lab White head Institute SDS siRNA Design Software BIOPREDsi www ambion com techlib misc siR NA_design htm www dharmacon com DesignC enter De
42. nes Rhoades MW Bartel DP Burge CB Prediction of mammalian microRNA targets Cell 2003 115 787 98 Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 425 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 ST 58 59 60 61 62 63 Doench JG Sharp PA Specificity of microRNA target selection in translational repression Genes Dev 2004 18 504 11 Lewis BP Burge CB Bartel DP Conserved seed pairing often flanked by adenosines indicates that thousands of human ge nes are microRNA targets Cell 2005 120 15 20 Wang B Love TM Call ME Doench JG Novina CD Recapi tulation on Short RNA Directed Translation Gene Silencing In Vitro Mol Cell 2006 22 553 60 Pillai RS Bhattacharyya SN Artus CG Zoller T Cougot N Basyuk E et al Inhibition of translational initiation by Let 7 MicroRNA in human cells Science 2005 309 1573 6 Humphreys DT Westman BJ Martin DI Preiss T MicroRNAs control translation initiation by inhibiting eukaryotic initiation factor 4E cap and poly A tail function Proc Natl Acad Sci USA 2005 102 16961 6 Bagga S Bracht J Hunter S Massirer K Holtz J Eachus R Pasquinelli AE Regulation by let 7 and lin 4 miRNAs results in target mRNA degradation Cell 2005 122 553 63 Petersen CP Bordeleau ME Pelletier J Sharp PA Short RNAs repress tra
43. nslation after initiation in mammalian cells Mol Cell 2006 21 533 42 Wang B Yanez A Novina CD MicroRNA repressed mRNAs contain 40S but not 60S components Proc Natl Acad Sci 2008 105 5343 8 Liu J et al MicroRNA dependent localization of targeted mR NAs to mammalian P bodies Nature Cell Biol 2005 7 719 23 Carthew RW Sontheimer EJ Origins and Mechanisms of miR NAs and siRNAs Cell 2009 136 642 55 Okamura K Hagen JW Duan H Tyler DM Lai EC The mir tron pathway generates microRNA class regulatory RNAs in Drosophila Cell 2007 130 1 89 100 Ruby JG Jan CH Bartel DP Intronic microRNA precursors that bypass Drosha processing Nature 2007 448 7149 83 6 Babiarz JE Ruby JG Wang Y Bartel DP Blelloch R Mouse ES cells express endogenous shRNAs siRNAs and other Mi croprocessor independent Dicer dependent small RNAs Ge nes Dev 2008 22 2773 85 Okamura K Chung WJ Ruby JG Guo H Bartel DP Lai EC The Drosophila hairpin RNA pathway generates endogenous short interfering RNAs Nature 2008 453 803 06 Watanabe T Totoki Y Toyoda A Kaneda M Kuramochi Mi yagawa S Obata Y et al Endogenous siRNAs from naturally formed dsRNAs regulate transcripts in mouse oocytes Nature 2008 453 539 43 Ding Y Chan CY Lawrence CE Sfold web server for statisti cal folding and rational design of nucleic acids Nucleic Acids Res 2004 32 W135 W141 Santoyo J Vaquerizas JM Dopazo J Highly specific and accu
44. poptosis motilidad celular transducci n de se ales estr s oxidativo desarrollo etc Lo anterior dio lugar a estudios pre cl nicos en modelos murinos y en primates no humanos que incluyen el tratamien to de infecciones virales 3 74 enfermedades ocula res 576 des rdenes neurodegenerativos 8 c ncer 280 e infecciones por VIH 8l M s a n los avances logrados en dichos estudios ya fueron trasladados al campo de las pruebas cl nicas en fasel Il y II en humanos ver secci n pruebas cl nicas El avance tan r pido del uso de RNAi en pruebas de fase cl nicas no tiene precedente y los resultados obtenidos son alentadores La siguiente secci n del manuscrito describe las estrategias desarrolladas en la aplicaci n del RNAi para el tratamiento de enfermedades en or ganismos vivos y los requerimientos especiales que tuvieron que ser resueltos para dicho fin Fi nal mente el manuscrito incluye las pruebas cl nicas que se llevan a cabo actualmente en el tratamiento de enfermedades humanas Estrategias para la aplicaci n del RNAi en la terap utica Dos estrategias principales han sido desarrolladas el uso de siRNA sintetizados qu micamente y el uso de shRNA insertados en vectores virales ShRNA vector viral Cada una presenta sus ventajas y desventajas Los siRNAs pueden ser modificados qui micamente para incrementar su estabilidad y su efica cia para el silenciamiento Aunado a lo anterior el tratamiento con
45. rborth J Lendeckel W Yalcin A Weber K Tuschl T Duplexes of 21 nucleotide RNAs mediate RNA inter ference in cultured mammalian cells Nature 2001 411 494 8 16 Caplen NJ Parrish S Imani F Fire A Morgan RA Specific in hibition of gene expression by small double stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems Proc Natl Acad Sci USA 2001 98 9742 7 17 Provost P Dishart D Doucet J Frendewey D Samuelsson B Radmark O Ribonuclease activity and RNA binding of recom binant human Dicer EMBO J 2002 21 5864 74 18 Rivas FV Tolia NH Song JJ Aragon JP Liu J Hannon GJ Jo shua Tor L Purified Argonaute2 and an siRNA form recombi nant human RISC Nat Struct Mol Biol 2005 12 340 9 19 Lau NC Lim LP Weinstein EG Bartel DP An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans Science 2001 294 858 62 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 3E 32 33 34 35 36 IT 38 39 40 Lagos Quintana M Rauhut R Lendeckel W Tuschl T Identifi cation of novel genes coding for small expressed RNAs Scien ce 2001 294 853 8 Lee RC Ambros V An extensive class of small RNAs in Cae norhabditis elegans Science 2001 294 862 4 Saxena S J nsson ZO Dutta A Small RNAs with imperfect match to endogenous mRNA repress translation Implications for off target activity of small inhibitory RNA in mammalian cells J Biol Che
46. siRNAs puede ser detenido en cualquier momento al suspender su administraci n Sin embargo el efecto del siRNA es transitorio y ade m s resulta dif cil dise ar un m todo efectivo de libe raci n del siRNA a la c lula o tejido blanco ver secci n Sistemas de liberaci n siRNA abajo Por otro lado el shRNA en un vector viral es sintetizado constantemente dentro del organismo infectado pro 422 Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 duciendo un silenciamiento prolongado mportante mente el shRNA puede ser liberado efectivamente en la c lula o tejido blanco al usar vectores provenientes de virus con receptores espec ficos para tales blancos Una desventaja es que el tratamiento no puede ser detenido ya que el shRNA vector viral permanecer dentro del organismo a lo largo de su vida El uso de siRNA shRNAs en organismos vivos como tratamiento para una enfermedad implica que stos puedan ser usados como drogas potentes es tables espec ficas y seguras El dise o de siRNAs shRNAs potentes estables y espec ficos sigue los principios ya mencionados en secciones anteriores Sin embargo la administraci n in vivo en organis mos vivos de dichos siRNA shRNAs presenta impli caciones particulares que deben ser resueltas En primer lugar los siRNAs pueden ser degradados por ribonucleasas end genas en su camino a la c
47. signC enterP age aspx www1 giagen com P roducts G eneSilencing C ustomS iR na S iR naDesigner rnaidesigner invitrogen com maiexpress www idtdna com S citools Applications R NAi RNAi aspx sfold wadsworth org sirna pl www rockefeller edu labheads tuschl sirna html jura wi mit edu siR NAext cs hku hk sirna software sirna php www biopredsi org star html siDE side bioinfo ochoa fib es ser a el uso de shRNA expresados en vectores vira les Una excelente gu a para escoger el m todo a usar se encuentra en el sitio www ambion com RNAi en su manual RNA interference Research Guide La figura 3 incluye un resumen de las ventajas y desventajas de cada m todo asi como un diagrama de trabajo simplificado de cada uno de ellos siRNA sint ticos siRNA son f cilmente sintetizados y f ciles de usar La desventaja es el corto tiempo de duraci n del silenciamiento y que no resulta f cil introducirlos en c lulas dif ciles de transfectar como los cultivos pri marios Pueden ser el m todo de elecci n ya que la mayor a de los experimentos son completados en tres a siete d as E ste periodo depende del grado de prolife raci n de la c lula blanco entre mayor sea el nivel de proliferaci n el silenciamiento durar menos El primer paso en la selecci n del siRNA comien za con la secuencia del MRNA del gen de inter s y la selecci n del programa para el dise o de la hebra sentido y antisentido del siRNA que formar
48. sion and target predictions of a substantially expanded set of Drosophila microRNAs Genome Res 2007 12 1850 64 Grad Y Aach J Hayes GD Reinhart BJ Church GM Ruvkun G Kim J Computational and experimental identification of C elegans microRNAs Mol Cell 2003 11 1253 63 Griffiths Jones S Saini HK van Dongen S Enright AJ miR Base tools for microRNA genomics Nucleic Acids Res 2008 36 Database issue D154 D158 Grun D Wang YL Langenberger D Gunsalus KC Rajewsky N mi croRNA target predictions across seven Drosophila species and com parison to mammalian targets PLoS Comput Biol 2005 1 e13 Han J Lee Y Yeom KH Nam JW Heo I Rhee JK et al Mo lecular basis for the recognition of primary microRNAs by the Drosha DGCR8 complex Cell 2006 125 887 901 Lee Y Ahn C Han J Choi H Kim J Yim J et al The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing Nature 2003 425 415 9 Han J Lee Y Yeom KH Nam JW Heo I Rhee JK et al Mo lecular basis for the recognition of primary microRNAs by the Drosha DGCR8 complex Cell 2006 125 887 901 Olsen PH Ambros V The lin 4 regulatory RNA controls develo pmental timing in C elegans by blocking LIN 14 protein synthe sis after the initiation of translation Dev Biol 1999 2 671 80 Bohnsack MT Czaplinski K Gorlich D Exportin 5 is a RanG TP dependent dsRNA binding protein that mediates nuclear export of pre miRNAs RNA 2004 10 185 91 Lewis BP Shih IH Jo
49. species estudia das en donde el miRNA reconoce secuencias par cialmente complementarias en el mRNA correspondiente lo cual resulta en la inhibici n de la traducci n de dicho mRNA 223 En noviem bre del 2007 se reportaron 5 922 secuencias de miRNAs expresados en 58 especies distintas in cluyendo plantas y animales vertebrados e inver tebrados indicando un proceso de regulaci n evolutivamente conservado 31 34 Los miRNAs han sido relacionados con la regulaci n de la expre si n de genes involucrados con el desarrollo pro liferaci n hematopoyesis y muerte celular 2 28 La figura 2 muestra la bios ntesis del miRNA una RNA polimerasa II transcribe el gen para el miR NA dando lugar al miRNA primario o pri miRNA 60 100 nucle tidos con estructura de hair pin en el n cleo celular 19 21 Hairpin por su descripci n en ingl s se refiere a la estructura que forma una hebra con secuencias de nucle ti dos repetidas e invertidas que al doblarse sobre s misma forma una doble hebra con las secuencias invertidas ahora complementarias y un doblez en forma de rizo en un extremo Figuras 2 y 3 Posteriormente el complejo Drosha Drosha DGCR8 en mam feros Drosha Pasha en Droso phila 37 escinde el pri miRNA y produce el miRNA precursor o pre miRNA 70 nucledtidos con estructura de hairpin un grupo fosfato en el extremo 5 y dos nucle tidos no pareados en el extremo 3 3537 A continuaci n el prem
50. tatic Ewing s sarcoma Cancer Res 2005 65 8984 92 GLOSARIO CM Kochanek S High capacity adenoviral vector mediated reduction of Huntington aggregate load in vitro and in vivo Hum Gene Ther 2007 18 303 11 Reimpresos Dra Blanca Ortiz Quintero Investigador en Ciencias M dicas Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Calzada de Tlalpan 4502 Col Secci n XVI 14080 M xico D F Tel 5487 1705 Correo electr nico boq iner gob mx Recibido el 24 de noviembre de 2008 Aceptado el 23 de marzo de 2009 RNAi RNA interference RNA de interferencia Mecanismo de inhibici n espec fica de la expresi n de genes a nivel post transcripcional inducido por la presencia de RNA de doble hebra dsRNA dsRNA double stranded RNA RNA de doble hebra e dsRNA largos long dsRNA dsRNA de 500 nucle tidos nt siRNA Small interfering RNA RNA peque os de interferencia RNA de doble hebra con un tama o de 22 25 nucle tidos 2 3 nucle ti dos no pareados en el extremo 3 de cada hebra un grupo fosfato en el extremo 5 y un grupo hidroxilo en el extremo 3 siRNAs son produc to del procesamiento de los dsRNA largos por la enzima Dicer o bien producto de s ntesis qu mica miRNA MicroRNA RNAs peque os no codificantes producidos por la propia c lula que se derivan del procesamiento de precursores RNAs 70 nucle tidos con estructura de hairpin que
51. u las pluripotenciales embrionarias de rat n 51 33 siRNA end genos pueden ser generados a partir detranscritos con secuencias repetidas invertidas que al doblarse forma un rizo o hairpin hpRNAs a semejanza de un miRNA pero son m s largos y no requieren del procesamiento por el complejo Drosha Su existencia ha sido confir mada en Drosophila oocitos de rat n y c lulas pluripotenciales embrionarias de rat n 53 55 A partir de esos hallazgos el adjetivo can nico ha sido utilizado para describir el componente cl sico de una v a previamente descrita por ejemplo miRNAs can nicos canonical miR 416 Ortiz Quintero B RNA de interferencia Origen y aplicaci n en el silenciamiento de genes Rev Invest Clin 2009 61 5 412 427 NAs en ingl s requieren del procesamiento por el complejo Drosha RNAi COMO HERRAMIENTA PARA EL SILENCIAMIENTO DE GENES La inhibici n artificial de la expresi n de genes mediante RNAi es conocido como silenciamiento o knocking down debido a que la inhibici n no es total a diferencia del knocking out donde el gen es eliminado completamente del genoma Usando la informaci n acerca del RNAi en mam feros se desarrollaron los siguientes m todos para el silenciamiento de genes El uso desiRN As sint ticos de 21 nt introducidos directamente a la c lula mediante transfecci n o electroporaci n El uso de RNAs peque os co
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