Caracterización morfológica, bioquímica y molecular de cultivares
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1. 10min con 40 ciclos entre los pasos 2 y 4 Despu s de la desnaturalizaci n se corrieron al cuotas de 2 pl en un gel de poliacrilamida al 4 Se obtuvieron bandas visibles por autorradio graf a Se emple el paquete de programa NTSYS pc para obtener la matriz distancias y el agru pamiento se realiz a trav s de un an lisis de conglomerados RESULTADOS Y DISCUSI N El an lisis de componentes principales realizado con las variables morfol gicas seleccionadas permiti constatar que las dos primeras componentes extrajeron el 86 44 de la variaci n total correspondiendo el 58 36 y el 28 08 para la primera y segunda componente respectivamen te Las variables que m s contribuyeron para la discriminaci n en la primera componente fueron el grosor y la flexibilidad de la c scara del fruto y la poca de cosecha y en la segunda el olor a an s en las hojas y el color de las lenticelas del v stago joven En el gr fico de los componentes principales Figura 1 puede notarse la formaci n de tres grupos El primero compuesto por los aguacateros del Grupo Guatemalteco y la mayor a de los h bridos de Guatemalteco x Antillano con excepci n del cultivar Monroe Estaci n que se agrup con los Antillanos Grupo ll El cultivar Jaru co No 1 clasificado como Antillano Lima et al 1988 qued incluido en el Grupo l Es posible que el mismo conjuntamente con el Hass y el Miguel Garc a sean h bridos donde uno de los parenta les pertene2. registr un 100 de bandas polim rficas Los an lisis de isoenzimas y del marcador de ADN utilizado brindaron patrones de bandas espe c ficos que permiten la identificaci n de los cultivares estudiados y el nivel de variabilidad gen ti ca de los mismos resultados que pueden o no coincidir con los an lisis que utilizan variables mor foagron micas de selecci n antr pica para el agrupamiento de los cultivares seg n su grupo eco l gico Palabras Clave Aguacatero caracteres morfol gicos isoenzimas marcadores de ADN Grupos Ecol gicos INTRODUCCI N En el aguacatero existen tres Grupos Ecol gicos o Razas Hort colas Mexicano Guatemalteco y Antillano Estos grupos se diferencian en su poca de floraci n poca de recolecci n contenido de aceite en la pulpa tipo de corteza y resistencia al fr o Los caracteres morfol gicos se han empleado con mayor o menor efectividad para la identificaci n de estos grupos Lima et al 1988 Rodr guez et al 2000 sin embargo cuando estamos en presencia de h bridos naturales entre Razas Hort colas diferentes resulta dif cil su ubicaci n Lima et al 1988 Los marcadores gen ticos son entidades heredables que est n asociados a caracteres de impor tancia econ mica que se han utilizado en la selecci n y evaluaci n de los bancos de germoplas ma para diferentes cultivos Staub et al 1982 Darvasi y Soller 1994 Los estudios del polimor fismo isoenzim tico y del ADN e
3. technique for genome analysis in the plant and animal kigdom J Genet amp Breed 50 249 261 SIGARROA A Y M T CORNIDE 1995 Paquete de Programas MAT GEN Manual del Usuario Facul tad de Biolog a 23 p STAUB J E L J KUHNS B MAY Y P GRUN 1982 Stability of potato tuber isozymes under dif ferent storage regimes J Amer Soc Hort Sci 107 405 408 V Congreso Mundial del Aguacate Tabla 1 Relaci n de cultivares de aguacatero Persea americana Mill estudiados y de sus grupos ecol gicos presumi bles N MERO DE ORDEN CULTIVAR GRUPO ECOL GICO PRESUMIBLE 1 Amado G mez No 1 A 2 California G 3 Casimiro A 4 Catalina A 5 Centro Am rica No 3 G 6 CH 1 No 3 A 7 Chavao No 3 A 8 Choquette GxA 9 Cueto A 10 Duke 7 M 11 Hass 12 Itzamna G 13 Jaruco No 1 A 14 Jos Antonio A 15 Los Moros A 16 Lula GxA 17 Miguel Garc a 18 Monroe Estaci n GxA 19 Sicilia No 6 A 20 Suard a G 21 Wilson Popenoe A A Antillanos G Guatemaltecos M Mexicanos G x A H bridos de Guatemalteco y Antillano Tabla 2 Medidas de la variabilidad gen tica en cultivares de aguacatero Persea americana Mill para los sistemas enzi m ticos estudiados Sistemas No Loci No Alelos No Alelos Media Loci ESE Propios Alelos Locus Polim rficos Alelos Loci Polim rficos PX 6 10 1 15 100 115 PPO 4 8 1 1 7 75 2 AO 3 7 1 2 100 2 TOTAL 13 25 3 1 7 90 2 1 7 PX Peroxidasas PPO Polifenoloxidasas AO Ascorbato
4. trav s de la matriz de correlaciones el an lisis de componentes principales realizado con las variables color de las len ticelas del v stago joven olor a an s en las hojas longitud del ped nculo superficie grosor y flexibilidad de la c scara del fruto y poca de cosecha permiti el agrupamiento de cultivares en los grupos ecol gicos presumibles Los considerados como h bridos de Guatemalteco x Anti llano quedaron incluidos dentro de los Guatemaltecos El an lisis gen tico con los tres sistemas enzim ticos se bas en las variables n mero total de loc total de bandas o alelos total de ale los raros valor medio de alelos por locus porcentaje de loci polim rficos y valor medio de ale los por loci polim rficos Se determin la matriz de similitud a trav s del ndice de Zcekanowski El an lisis de conglomerados determin la formaci n de cinco grupos con una gran similitud en la mayor a de los cultivares de origen Antillano y mayor variabilidad para los de origen Guatemal V Congreso Mundial del Aguacate teco y algunos h bridos Se determin la alta eficiencia de la t cnica de ISTR para la detecci n del polimorfismo dentro de los genotipos seleccionados Aunque el an lisis de conglomerados no per miti el agrupamiento adecuado de los cultivares en sus grupos ecol gicos posiblemente a que se utiliz una sola combinaci n de primer Fz B2B se
5. KAUFMAN E LAHAV J HILLEL C DEGANI AND U LAVI 1997 Genetic relationships within avocado Persea americana Mill cultivars and between Persea spe cies Theor Appl Genet 94 279 286 PASTEUR N G PASTEUR F BONHOMME Y J CATAL N 1987 Interpretation genetique des zymogrammes Mannuel Technique de Genetique par electrofhorese des proteines Technique et Documentation Lavoisier PLIEGO ALFARO F Y B O BERGH 1992 Biotecnology of perennial fruit crops Chapter 13 Avo cado Ed Hammers Chlag F A y R E Litz CAB International 323 334 RAM REZ I M J L FUENTES N N RODR GUEZ J R CUETO AND W ROHDE 2002 DNA poly morphic in Cuban varieties of avocado Persea americana Mill as detected by Inverse Sequence Tagged Repeat ISTR analysis Cultivos Tropicales 23 3 88 85 RODR GUEZ N N G GONZ LEZ A SIM N H LIMA C GONZ LEZ R JIM NEZ O MAS Y M MORENZA 2000 Recursos gen ticos del aguacatero Persea americana Mill en Cuba Il Agru paci n de cultivares en sus grupos ecol gicos a trav s de marcadores morfol gicos y bioqu mi cos Citrifrut 18 1 2 y 3 23 32 ROHDE W A KULLAYA J RODR GUEZ AND E RITTER 1995 Genetic analysis of Cocos nuc fe ra L by PCR amplification of spacer sequences separating a subset of copia like Eco RI repetitive elements J Genet amp Breed 49 179 186 ROHDE W 1996 Inverse sequence tagged repeat ISTR analysis a novel and universal PCR based
6. Proceedings V World Avocado Congress Actas V Congreso Mundial del Aguacate 2003 pp 47 53 CARACTERIZACI N MORFOL GICA BIOQU MICA Y MOLECULAR DE CULTIVARES DE AGUACATERO PERSEA AMERICANA MILL EN CUBA N N Rodr guez Medina W Rohde C Gonz lez Arencibia3 I M Ram irez P rez J L Fuentes Lorenzo M A Rom n Gutierrez3 X Xiqu s Mart n D Becker y J B Vel zquez Palenzuela linstituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical Ave 7 a NO 3005 e 30 y 32 Miramar Playa Ciudad de La Habana Cuba e mail iicif ceniai inf cu 2Max Planck Institut f r Ziichtngsforschung Carl von Linn Weg 10 D 50829 K ln Germany e mail rohdeSmpiz koeln mpg de 3Facultad de Biolog a Universidad de La Habana Calle 25 e I y J Vedado Ciudad de La Habana Cuba e mail cglezOfbio uh cu Centro de Estudios Aplicados al Desarrollo Nuclear Calle 30 No 502 e 5t y 7ma Mira mar Playa Ciudad de La Habana Cuba e mail fuentesOceaden edu cu RESUMEN Se realiz la caracterizaci n morfoagron mica isoenzim tica y molecular en aguacateros Persea americana Mill de la colecci n del Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical de Cuba Para ello se emplearon los descriptores establecidos por el Instituto Internacional de Recursos Fitogen ticos tres sistemas enzim ticos peroxidasas polifenol oxidasa y ascorbato oxidasa y la t cnica de ISTR Inverse Sequense Tagged Repeat respectivamente A
7. cultura 5 227 231 DAVARSI A Y M SOLLER 1994 Optimum spacing of genetic markers for determinig linkage bet ween marker loci and quantitative trait loci Theor Appl Genet 89 351 357 DOYLE J J AND DOYLE J L 1990 Isolation of plants DNA from fresh tissue Focus12 13 15 Gonz lez C M I Roman X Xiques J Due as R Jimenez y N Rodr guez 2002 Caracterizaci n genetico bioquimica de 20 cultivares de aguacate Persea americana Mill en Cuba Rev Biolog a 6 1 49 55 GONZ LEZ C Y J A GONZ LEZ 1981 Estudio de patrones para lima Persa IIl Caracterizaci n isoenzim tica Ciencia y T cnica en la Agricultura C trico y otros Frutales 4 2 101 108 GUEDES A AND C J RODR GUEZ 1974 Disc electrophoretic pattern of phenoloxidase from lea ves of coffe cultivars Sep De Portugalial Acta Biol gica Serie A Vol XIII p 169 177 IGLESIAS L H LIMA AND J P SIM N 1974 Isozime identification of cigotic and nucellar seed lings in Citrus J Hered 65 81 84 LIMA H T RIVERA A M CABRERA Y O L RODR GUEZ 1988 Clasificaci n de cultivares de agua catero Persea americana en grupos ecol gicos Ciencia y T cnica en la Agricultura Citricos y otros Frutales 11 47 53 MARTINS CORDER M A E S MORI P Y KAGEYAMA Y C R LOPES 1996 Estudo da variabilidade isoenzimatica em Eucalyptus urophylla das ihas flores Scientia Forestalis 50 43 49 Recursos gen ticos MHAMEED S D SHARON D
8. n el aguacatero se han aplicado para garantizar el conocimiento y mantenimiento de la diversidad gen tica presente en las colecciones y en la caracterizaci n de loci potencialmente marcadores que pueden ser utilizados dentro de los programas de mejora miento gen tico Clegg et al 1999 Gonz lez et al 2002 Ram rez et al 2002 MATERIALES Y M TODOS Material vegetal Los cultivares de aguacatero considerados Tabla 1 pertenecen a las colecciones de la Unidad Cient fico Tecnol gica de Base del Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical en el muni cipio de Alqu zar provincia de La Habana Cuba Caracterizaci n morfoagron mica Se determinaron 92 caracteres morfoagron micos y se seleccionaron siete de ellos color de las lenticelas del v stago joven olor a an s en las hojas longitud del ped nculo superficie gro sor y flexibilidad de la c scara del fruto y poca de cosecha Con el empleo del paquete de pro grama NTSYS pc se realiz un an lisis de componentes principales a partir de la matriz de corre laciones Caracterizaci n bioqu mica Se tomaron muestras foliares de 20 cultivares de aguacatero de los referidos en la Tabla 1 para la caracterizaci n isoenzim tica Se emple un sistema de corrida vertical y buffer discontinuos Gonz lez y Gonz lez 1981 El gel de separaci n fue de 8 5 de poliacrilamida PAGE y buffer Recursos gen ticos de cor
9. oxidasas Recursos gen ticos 141 0 57 027 1 10 194 Figura 1 Agrupamiento de cultivares de aguacatero a trav s del an lisis de componentes principales utilizando caracte res morfol gicos M todo vecino m s cercano distancia cuadrado euclidiano Coeficiente de Dice 11 1 0 0 2 0 6 0 4 0 2 19 Grupos A 14 5 13 A 2 20 I E 22 1 6 19 3 15 16 14 7 20 17 11 12 In 10 15 S 4 21 13 m 6 2 5 1 M 12 g 16 13 j Ad 0 0 1 0 2 0 3 0 4 Figura 2 Dendrograma que ilustra la agrupaci n de los Figura 3 Dendrograma que ilustra la agrupaci n de los cultivares de aguacatero a trav s de caracteres bio cultivares de aguacatero a trav s del marcador ISTR qu micos AK Lla
10. rida Tris glicina 0 04 M pH 8 3 Los m todos de tinciones fueron isoenzimas peroxida sas Iglesias y col 1974 isoenzimas polifenoloxidasas Guedes y Rodr guez 1974 e isoenzimas ascorbato oxidasas Pasteur y col 1987 El an lisis gen tico se bas en las variables n mero total de loci total de bandas o alelos total de alelos raros valor medio de alelos por locus por centaje de loci polim rficos y valor medio de alelos por loci polim rficos Se emple el paquete de programa MAT GEN para obtener la matriz de similitud por el ndice de Zcekanowski Sigarroa y Cornide 1995 Para el agrupamiento se utiliz el an lisis de conglomerados Caracterizaci n molecular Se colectaron hojas j venes de 18 cultivares referidos en la Tabla 1 para el aislamiento del ADN gen mico siguiendo el procedimiento sugerido por Doyle and Doyle 1990 modificado por Rohde et al 1995 Para la amplificaci n PCR se emple la pareja de primer Fa B B Rohde et al 1996 marcados con g 33 P ATP Amersham Pharmacia Biotech Se realiz la reacci n de ampli ficaci n con el protocolo sugerido por Rohde et al 1995 en un volumen final de 25 pl con 25 ng de DNA gen mico 200 uM dNTPs 2 5 mM MgCl 1x PCR buffer Gibco BRL 2 5 pmoles de cada primer y 1 unidad de Taq DNA polimerasa Gibco BRL El programa de amplificaci n consisti en los siguientes pasos 1 95 C 3min 2 95 C 30seg 3 45 C 30seg 4 72 C 2min 5 72 C
11. ridos ya que nueve de los once cultivares de origen Antillano est n incluidos en el primer Grupo A partir del an lisis de ISTR se pudo detectar un total de 157 bandas todas ellas polim rficas Con el empleo de la combinaci n de primer se alada pudo distinguirse el 100 de los genotipos cada uno caracterizado por un patr n de bandas espec fico En el an lisis de conglomerados sin embargo los grupos ecol gicos presumibles no quedaron bien representados Figura 3 Estos resultados coinciden con los obtenidos por Mhameed et al 1997 pero contrastan con los de Clegg et al 1999 Este hecho puede deberse a diferentes razones Primero la clasificaci n de las razas est basada sobre caracteres morfol gicos seleccionados de rboles y frutos segun do el ISTR explora polimorfismos en regiones no codificadoras del ADN Ram rez et al 2002 y tercero el empleo de una sola pareja de primer Los resultados demuestran que con un nico par de primer fue suficiente para distinguir todos los genotipos lo que indica que este marcador gen tico puede resultar de utilidad para la certifica ci n de variedades para la detecci n de duplicados en las colecciones y para asistir programas de mejoramiento en el aguacatero Ram rez et al 2002 BIBLIOGRAF A CLEGG M T M KOBAYASHI AND J ZHONG LIN 1999 The use of molecular markers in the managment and improvement of avocado Persea americana Mill Revista Chapingo Serie Horti
12. zcan al Grupo Guatemalteco resultados que confirman los obtenidos por Clegg et al 1999 para el caso espec fico del cultivar Hass El Grupo lll qued constituido por el nico repre sentante de la raza Mexicana Los resultados obtenidos coinciden con los de Rodr guez et al 2000 y demuestran la efectividad de las variables seleccionadas para el agrupamiento de los aguacateros seg n su grupo ecol gi co La Tabla 2 muestra las medidas de la variabilidad gen tica para los sistemas enzim ticos estu diados Se obtuvo un total de 13 loci con 25 alelos y la presencia de alelos propios en cada sis tema los cuales pueden haberse originado por la ocurrencia de mutaciones Martins Corder et al 1996 Los resultados est n en correspondencia con el sistema de reproducci n dicog mico de esta especie que provoca diferentes niveles de heterocigosidad en las poblaciones de agua catero Pliego Alfaro y Bergh 1992 V Congreso Mundial del Aguacate En el an lisis de agrupamiento dendrograma se aprecia la formaci n de cinco grupos de acuer do a las afinidades gen ticas entre los cultivares Fig 2 Las mayores similitudes se presentan para los de origen Antillano el h brido Monroe Estaci n y el cultivar Duque 7 de origen Mexicano que constituyen de esta forma el Grupo I Estos resultados ponen de manifiesto que la mayor varia bilidad gen tica est contenida en los cultivares de origen Guatemalteco y algunos de los h b
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