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VINEO™ Brettanomytest PCR Kit - Bio-Rad

1. software version 3 3 and higher or the CFX Manager software Industrial Diagnostic Edition for an automated and quantitative interpretation A complete report may be printed cf software instructions 1 Controls Before a final interpretation of the results you have to check the results of the negative and positive controls For the test to be valid the results of the negative and positive controls must be as follows Detection of Brettanomyces Detection of the internal bruxellensis FAM control Channel HEX Negative control Ct N A 25 lt Ct lt 40 Positive Qs PCR control 27 lt Ct lt 37 Not significant N A means Not Applicable The software indicates N A for the Ct of a sample when the fluorescence curve does not cross the threshold If the results of the positive and negative PCR Qs controls are different from those described in the table below you have to begin the PCR again 2 Samples A sample is considered to be positive for Brettanomyces bruxellensis if the value of Ct gt 10 is obtained for the FAM fluorophore If no value is obtained for Ctray Ctram N A the interpretation of the result depends on the value of the internal control A sample is considered to be negative for Brettanomyces bruxellensis if no value of Ct is obtained for the FAM fluorophore Ctray N A and if the Ct of the internal control is greater than or equal to 28 Up gt 28 An N A value for the Ct
2. D tection de Brettanomyces D tection du contr le interne bruxellensis FAM Canal HEX Contr le n gatif Ct N A 25 lt Ct lt 40 Contr le positif Qs PCR 27 lt Ct lt 37 Non significatif N A signifie Non Applicable Le logiciel indique N A pour le Ct d un chantillon quand la courbe de fluorescence ne croise pas le seuil Si les r sultats des contr les positif Qs PCR et n gatif sont diff rents de ceux d crits dans le tableau ci dessus il est n cessaire de recommencer la PCR 2 Echantillons Un chantillon est consid r positif pour Brettanomyces bruxellensis si une valeur de Ct gt 10 est obtenue pour le fluorophore FAM Si aucune valeur n est obtenue pour le Ctray Ctram N A l interpr tation du r sultat d pend de la valeur du contr le interne Un chantillon est consid r n gatif pour Brettanomyces bruxellensis si aucune valeur de Ct n est obtenue pour le fluorophore FAM Ctram N A et si le Ct du contr le interne est sup rieur ou gal 28 Chez 28 Une valeur N A pour le Ctyex du contr le interne indique lorsque le Ctram de la cible est galement N A qu un ph nom ne d inhibition de la r action de PCR a probablement eu lieu Dans ce cas l chantillon d ADN doit tre dilu au 1 10 par exemple en eau distill e st rile puis soumis une nouvelle PCR Si le Ctyex du contr le interne est inf rieur 28 il n est pas possible d interpr ter le r sultat
3. ou CFX Manager Industrial Diagnostic Edition permettent par une analyse automatique et quantitative de mesurer le risque Brettanomyces bruxellensis dans l chantillon de vin analys Une interpr tation du niveau de risque est ainsi propos e l utilisateur Elle est li e au nombre d UFC mL 1 Unit Formant Colonie d tect dans le vin O 2010 Bio Rad 17 e N gatif e Population faible risque ma tris e Population critique surveiller 9 Population tr s lev e risque de production de Ph nols volatils Le VINEOTM Brettanomytest PCR Kit peut galement tre utilis sur un mode qualitatif pour la confirmation de colonies isol es partir d un milieu de culture 2 PRINCIPE DU VINEO Brettanomytest PCR Kit Ce test repose sur l amplification la d tection et la quantification de s quences d ADN par la technique de PCR en temps r el Il utilise des amorces et une sonde d ADN sp cifiques de Brettanomyces bruxellensis La d tection et l analyse des r sultats sont optimis es pour l utilisation avec un thermocycleur pour la PCR en temps r el Bio Rad tel que le MiniOpticon le Chromo4 ou le CFX96 Au cours de la r action de PCR les amorces vont s hybrider la r gion cible puis catalys es par la polym rase s allonger dans le sens 5 3 en utilisant les d soxynucl otides triphosphates dNTPs pr sents dans le m lange r actionnel cr ant ainsi une s quence compl mentaire d ADN appel
4. rence dans les 24 heures et pas plus de 48 heures apr s le pr levement Si les chantillons sont transport s et analys s dans les 24 heures le transport et le stockage ont lieu temp rature ambiante 18 C 30 C Si les chantillons sont transport s et analys s dans les 48 heures le transport et le stockage ont lieu entre 2 C et 8 C 8 EXTRACTION DE L ADN L extraction de l ADN doit tre r alis e en utilisant le kit d velopp par Bio Rad pour l extraction d ADN a partir d chantillons de vin VINEO Extract DNA Kit r f Bio Rad 854 8100 9 PCR EN TEMPS REEL 1 Mise en marche appareil PCR Allumer dans l ordre le thermocycleur l ordinateur puis ouvrir le logiciel Opticon Monitor Pour plus d informations et pour la d finition des param tres du logiciel consulter le manuel utilisateur du thermocycleur Bio Rad pour le kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 2 Pr paration des r actions PCR 2 1 Pr parer le m lange r actionnel VINEOTM Brettanomytest PCR Kit en m langeant 40 uL chantillon de la solution d amplification tube bouchon blanc et 5 uL chantillon des sondes fluorescentes tube bouchon rose R aliser le m lange r actionnel en fonction du nombre d chantillons et des contr les analyser au minimum 1 duplicat 2 du contr le positif Qs PCR et un contr le n gatif doivent tre utilis s par plaque Le tableau de pr paration du m lange r actionnel d amplification PCR pr
5. 3413 32 173 1382 80 432 3456 33 178 1426 81 437 3499 34 184 1469 82 443 3542 35 189 1512 83 448 3586 36 194 1555 84 454 3629 37 200 1598 85 459 3672 38 205 1642 86 464 3715 39 211 1685 87 470 3758 40 216 1728 88 475 3802 41 221 1771 89 481 3845 42 227 1814 90 486 3888 43 232 1858 91 491 3931 44 238 1901 92 497 39 4 45 243 1944 93 502 4018 46 248 1987 94 508 4061 47 254 2030 95 513 4104 48 259 2074 96 518 4147 40 O 2010 Bio Rad ANEXO B PLAN DE PLACA PARA LOS TERMOCICLADORES Chromo4 CFX96 Los 3 primeros pocillos de la columna 1 pueden usarse para analizar los 3 puntos de control Los dem s pocillos de la placa se usar n para colocar las muestras que se desee analizar 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Qs Qs NC Muestra Muestra I Q oO o wj gt CN Control negativo PCR QS Control positivo Qs PCR ANEXO C PLAN DE PLACA PARA EL TERMOCICLADOR MiniOpticonTM Los 3 primeros pocillos de la columna 1 pueden usarse para analizar los 3 puntos de control Los dem s pocillos de la placa se usar n para colocar las muestras que se desee analizar 1 2 3 4 5 6 Qs Qs NC Muestra Muestra I Q oj oO gt CN Control negativo PCR QS Control positivo Qs PCR 2010 Bio Rad 41 AVISO AL COMPRADOR LICENCIA LIMITADA Este producto est protegido por una o
6. Allegato A indica le quantit necessarie di ogni reagente da miscelare in funzione del numero di campioni da analizzare Non dimenticare di registrare i 3 punti di controlli Nota non mischiare i lotti di reagenti 2010 Bio Rad 49 2 2 Dopo la preparazione la miscela di reazione Soluzioni di amplificazione e di sonde va utilizzata immediatamente o pu essere conservata per 2 ore ad una temperatura da 2 C a 8 C 2 3 Ripartire 45 ul di questa miscela di reazione per pozzetto secondo il piano di piastra definito Gli Allegati B e C propongono piani di piastra da utilizzare rispettivamente sui termociclatori Chromo4 CFX96 e MiniOpticon Aggiungere 5 ul di campione o di controllo negativo o di controllo positivo Qs PCR e chiudere ermeticamente pozzetti della piastra o delle barrette E importante insistere sulla chiusura dei pozzetti della piastra o delle barrette per evitare qualunque fenomeno di evaporazione nel corso della reazione PCR E importante evitare il formarsi di bolle sul fondo dei pozzetti pipettando con cautela Per eliminare le bolle dopo aver sigillato la piastra o aver chiuso le barrette PCR possibile centrifugare brevemente la piastra o le barrette PCR La piastra pu essere conservata per 2 ore ad una temperatura da 2 C a 8 C 2 4 Posizionare la piastra o le barrette PCR nel termociclatore Accertarsi che siano orientate correttamente pozzetti A1 in alto a sinistra Chiudere il modulo di
7. Contr le positif Qs PCR 26 O 2010 Bio Rad AVIS CONCERNANT L ACHETEUR LICENCE LIMITEE L utilisation de ce produit est couverte par un ou plusieurs des brevets US suivants et les revendications de brevet correspondantes hors Etats Unis 5 079 352 5 789 224 5 618 711 6 127 155 5 677 152 revendications 1 23 seulement et 5 773 258 revendications 1 et 6 seulement et par les revendications hors Etats Unis correspondant au brevet US n 4 889 818 L achat de ce produit comprend une immunit de poursuite restreinte et non transf rable selon les revendications de brevet pr c dentes lorsque cette quantit de produit est uniquement utilis e des fins d analyse alimentaire d analyse environnementale et en microbiologie industrielle y compris la publication des r sultats des activit s de l acheteur moyennant paiement ou toute autre contrepartie commerciale et lorsqu elle est galement utilis e aux fins des propres recherches de l acheteur Aucun droit selon une quelconque revendication de brevet comme les revendications de la m thode 5 nucl ase dans les brevets US n 5 210 015 et 5 487 972 n est express ment c d que ce soit par implication ou par pr clusion De plus amples informations concernant l achat de licences peuvent tre obtenues en contactant le Directeur des Licences Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City Califomie 94404 Etats Unis 2010 Bio Rad 27 28 O 2010 Bio Rad VINEO Brettano
8. V rifier que le seuil a t correctement plac ou que la courbe brute montre un aspect caract ristique d amplification exponentielle Si la courbe observ e n est pas correcte il sera n cessaire de r p ter le test PCR pour cet chantillon 2010 Bio Rad 23 Interpr tation des r sultats obtenus sur les chantillons D tection de Brettanomyces bruxellensis FAM D tection du contr le interne Interpr tation Ct gt 10 Non significatif Positif Ct N A Cty 28 N gatif Ct N A Ct N A Inhibition En cas de valeur nulle pour un chantillon et son contr le interne Ct N A l analyse doit tre renouvel e avec l chantillon d ADN dilu au 1 5 ou au 1 10 par exemple Il peut arriver qu une valeur inf rieure 10 soit obtenue v rifier que la courbe en tant que donn e brute montre un aspect caract ristique d amplification exponentielle ligne de base plate puis augmentation r guli re de la fluorescence suivi par un plateau Si la courbe observ e est correcte on peut consid rer l chantillon positif pour la pr sence de Brettanomyces bruxellensis Dans le cas contraire l interpr tation du r sultat d pend de la valeur du contr le interne comme il est expliqu dans les paragraphes ci dessus 12 PROTOCOLE DE CONFIRMATION A PARTIR DE COLONIES ISOL ES Il est possible d utiliser le test VINEO Brettanomytest PCR Kit pour la confirmation de colonies isol e
9. al metodo microbiologico tradizionale la biologia molecolare apporta soluzioni di rilevazione ad alti livelli di rapidit di sensibilit e di specificit La diagnosi della presenza di questo lievito deve permettere di determinare a che livello di rischio si trova il vino e come tale rischio evolve nel tempo Questo rischio varia a seconda del livello di contaminazione del vino Pertanto uno strumento di quantificazione adatto permette di determinare se i la popolazione in quantit bassa e quindi il rischio basso cio controllato ii in quantit intermedia o critica in questo caso il vino deve essere sorvegliato si impone un controllo regolare il vino pu essere trattato iii e infine se la popolazione molto importante e in questo caso lo anche il rischio di produzione dei fenoli volatili si impone un azione immediata e urgente sul vino In tutti i casi si consiglia un follow up regolare importante seguire l evoluzione dei Brettanomyces bruxellensis nel vino VINEOTM Brettanomytest PCR Kit un test quantitativo che permette la rilevazione specifica di Brettanomyces bruxellensis nei vini e nei mosti in fermentazione mediante la tecnica di polimerizzazione a catena in tempo reale RT PCR Una sequenza di DNA specifica di Brettanomyces bruxellensis viene amplificata e rilevata simultaneamente grazie ad una sonda fluorescente La realizzazione di questo test permette di ottenere un risultato quantitativo in meno
10. all utilizzatore un interpretazione relativa al rischio correlato alla presenza di Brettanomyces bruxellensis 46 2010 Bio Rad Questo test consente la rilevazione e la quantificazione di Brettanomyces bruxellensis nei DNA estratti a partire da bevande fermentate ottenute da uva e dai mosti in fermentazione AMPLIFICAZIONE SE ESTRAZIONE DNA DNA mediante PCRINI PRELIEVO DEL VINEO Extract TEMPO REALE Lia CAMPIONE gt DNA Kit vineom 1 OP S Rif 354 8100 Brettanomytest PCR ES Kit Rif 354 8101 CFX Manager IDE 3 COMPOSIZIONE DEL KIT Tappi Designazione Reagente Volume Rosa Fluorescent probes Sonde fluorescenti 1 provetta 0 55 ml Bianco Amplification mix Soluzione di amplificazione 2 provette 2 x 2 2 ml Verde Negative PCR control Controllo negativo PCR 1 proveta 0 5m Rosso Positive Qs PCR control Controllo positivo Qs PCR 1 provetta 0 5 ml Questo kit contiene la quantit di reagente necessaria per 96 reazioni 4 PERIODO DI VALIDIT E CONSERVAZIONE Dal momento della ricezione il Rit deve essere conservato ad una temperatura tra 2 C e 8 C Ogni reagente conservato tra 2 C e 8 C pu essere utilizzato fino alla data di scadenza indicata sulla provetta NB Non congelare i reagenti 5 ATTREZZATURA E MATERIALE NECESSARI NON FORNITI Attrezzature e Industrial Diagnostic CFX96 per la PCR in tempo reale blocco di reazi
11. bouteille dont l analyse n cessite un niveau de sensibilit analytique lev 24 2010 Bio Rad ANNEXE A TABLEAU DE PREPARATION DU MELANGE REACTIONNEL D AMPLIFICATION PCR Utiliser ce tableau pour d terminer les quanti solution d amp s n cessaires de sondes fluorescentes et ification pour pr parer le m lange r actionnel de PCR Le calcul du nombre d chantillons doit inclure les 2 contr les positifs Qs PCR et le contr le n gatif Sondes P Sondes r Nombre fluorescentes d Seed Nombre fluorescentes Solution amplification uL d amplification uL d chantillons UL Bouchon blanc d chantillons ul Bouchon blanc Bouchon rose Bouchon rose 1 5 40 49 265 2117 2 1 86 50 270 2160 3 16 130 51 275 2203 4 22 173 52 281 2246 5 27 216 53 286 2290 6 32 259 54 292 2333 Y 38 302 55 297 2376 8 43 346 56 302 2419 9 49 389 57 308 2462 10 54 432 58 313 2506 dl 59 475 59 319 2549 12 65 518 60 324 2592 13 70 562 61 329 2635 14 76 605 62 335 2678 15 81 648 63 340 2722 16 86 691 64 346 2765 17 92 734 65 351 2808 18 97 778 66 356 2851 19 103 821 67 362 2894 20 108 864 68 367 2938 21 113 907 69 373 2981 22 119 950 70 378 3024 23 124 994 71 383 3067 24 130 1037 72 389 3110 25 135 1080 73 394 3154 26 140 1123 74 400 3197 27 146 1166 75 405 3240 28 1
12. depends on the value of the internal control as is explained in the previous paragraphs 12 CONFIRMATION PROTOCOL FROM ISOLATED COLONIES You can use the VINEOTM Brettanomytest PCR Kit to confirm isolated colonies on agarose gel 1 Puncture an isolated colony whether it comes from a selective medium or not using a toothpick or a 1 ul piercing instrument or any other consumable adapted to this purpose a pipette cone for example 2 Resuspend the colony in 100 ul of R2 in an Eppendorf tube it is possible to resuspend the colony in steril physiological water PCR efficiency can then be affected Homogenise the suspension by means of a vortex 8 Put 5 ul of suspension in 45 ul of PCR reagent mixture cf part 9 2 Real time PCR and follow the rest of the VINEOTM Brettanomytest PCR Kit method to obtain and interpret results Note only a qualitative analysis is made from the PCR carried out on this suspension The signal obtained by PCR is often quite high because the quantity of cells sampled and analysed by PCR using this method is quite significant 13 TEST PERFORMANCE AND VALIDATIONS The VINEOTM Brettanomytest PCR Kit is specific for detecting Brettanomyces bruxellensis You can detect the yeast from e 500 CFU mL of wine using the DNA extraction protocol described in the VINEOTM Extract DNA Kit for 1 8 mL for fermenting grape must or a heavy wine during the wine making or maturing process and e 10 CFU mL of wine according to the
13. e amplicon Pendant la PCR des sondes oligonucl otidiques sp cifiques de la s quence cible vont s hybrider aux amplicons Ces sondes marqu es par des fluorophores mettent de la fluorescence uniquement quand l hybridation a lieu La sonde qui se lie la s quence cible de Brettanomyces bruxellensis est marqu e par un fluorophore sp cifique L intensit de fluorescence augmente proportionnellement a l augmentation de la quantit des produits d amplification dans le tube de PCR La fluorescence ainsi g n r e est mesur e directement par le module optique du thermocycleur Un ADN synth tique appel Contr le interne est ajout chaque r action Il est amplifi en m me temps que les s quences cibles de Brettanomyces bruxellensis mais d tect par une sonde marqu e avec un deuxi me fluorophore ll permet de mettre en vidence un ventuel ph nom ne d inhibition de la r action Le logiciel associ a l appareil calcule automatiquement la relation entre l intensit de la fluorescence et le cycle d amplification Cette relation indique la pr sence ou l absence de Brettanomyces bruxellensis dans l chantillon Les r sultats obtenus pour l amplification de ces ADN sont analys s par les logiciels Opticon Monitor ou CFX Manager IDE software programm s 18 O 2010 Bio Rad pour r aliser une analyse automatique et quantitative Une interpr tation concernant le risque li la pr sence de Brettanomyces b
14. el resultado Comprobar que se haya colocado el umbral correctamente o que la curva bruta muestre un aspecto caracter stico de amplificaci n exponencial Si la curva observada no es correcta ser necesario repetir la prueba de PCR para esa muestra Interpretaci n de los resultados obtenidos con las muestras Detecci n de Brettanomyces bruxellensis FAM de A Interpretaci n Detecci n del control interno Ct gt 10 No significativo Positivo Ct N A Ctuex gt 28 Negativo Ct N A Ct N A Inhibici n En caso de valor nulo en una muestra y su control interno Ct N A el an lisis debe repetirse con la muestra de ADN diluida por ejemplo en relaci n 1 4 o 1 9 Puede ocurrir que se obtenga un valor inferior a 10 En ese caso hay que comprobar que la curva de datos brutos muestre un aspecto caracter stico de amplificaci n exponencial l nea de base plana seguida de aumento regular de la fluorescencia hasta llegar a una meseta Si la curva observada es correcta puede considerarse que la muestra es positiva en Brettanomyces bruxellensis En caso contrario la interpretaci n del resultado depende del valor del control interno seg n lo explicado en los p rrafos anteriores 12 PROTOCOLO DE CONFIRMACI N A PARTIR DE COLONIAS AISLADAS Es posible utilizar la prueba VINEOTM Brettanomytest PCR Kit para confirmar colonias aisladas en agar 1 Pinchar la colonia aislada ya sea a p
15. esempio 2 Risospendere la colonia in 100 ul di R2 in una provetta Eppendorf possibile risospendere la colonia in soluzione di acqua fisiologica sterile l efficienza della PCR pu quindi essere influenzato Omogeneizzare bene la sospensione utilizzando il vortex 3 Porre 5 ul della sospensione in 45 pl della miscela di reazione PCR Cf parte 9 2 PCR in tempo reale e seguire il resto del metodo VINEOTM Brettanomytest PCR Kit per ottenere e interpretare i risultati Nota una sola analisi qualitativa viene realizzata a partire dalla PCR effettuata su questa sospensione Il segnale ottenuto in PCR spesso molto elevato poich la quantit di cellule prelevate e analizzate mediante PCR con questo metodo molto considerevole 13 PRESTAZIONI DEL TEST E VALIDAZIONI Il test VINEOTM Brettanomytest PCR Kit specifico per la rilevazione di Brettanomyces bruxellensis possibile rilevare il lievito a partire da e 200 UFC ml di vino con il protocollo di estrazione del DNA descritto nel VINEOTM Extract DNA Kit su 1 8 ml per un mosto in fermentazione o un vino carico in corso di vinificazione o di affinamento e e 10 UFC mI di vino secondo il protocollo che parte da 45 ml per un vino poco carico prossimo all imbottigliamento o gi imbottigliato la cui analisi richiede un livello di sensibilit analitica elevato 52 2010 Bio Rad ALLEGATO A TABELLA DI PREPARAZIONE DELLA MISCELA DI REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE PCR Utilizzare ques
16. m s de las siguientes patentes de EE UU y las reivindicaciones de patentes correspondientes fuera de Estados Unidos 5 079 352 5 789 224 5 618 711 6 127 155 5 677 152 s lo reivindicaciones de la 1 a la 23 y 5 773 258 s lo reivindicaciones de la 1 a la 6 y las reivindicaciones fuera de EE UU correspondientes a la patente n 4 889 818 de EE UU La adquisici n de este producto incluye inmunidad judicial restringida e intransferible seg n las anteriores reivindicaciones de patentes cuando esta cantidad de producto se use nicamente con fines de an lisis alimentario an lisis medioambiental y en microbiolog a industrial incluida la publicaci n de los resultados de las actividades del comprador por medio del pago o toda contrapartida comercial cuando se utilice para los fines de las propias investigaciones del comprador No se cede de forma expresa ning n derecho a cualquier reivindicaci n de patente como las reivindicaciones del m todo de la 5 nucleasa en las patentes n 5 210 015 y 5 487 972 de EE UU ya sea por implicaci n o por preclusi n Puede obtenerse m s informaci n respecto a la compra de licencias poni ndose en contacto con el Director de Licencias Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City Califomia 94404 EE UU 42 O 2010 Bio Rad VINEO Brettanomytest PCR Kit Rif 354 8101 Istruzioni per l uso Test per la rilevazione e la quantificazione mediante PCR in tempo reale di Brettanomyces br
17. personas que hayan recibido una formaci n adecuada ela calidad de los resultados depende de que se cumplan escrupulosamente las buenas pr cticas de laboratorio en especial en lo referente a la PCR El material pipetas tubos etc no debe cambiarse de puesto de trabajo Es indispensable utilizar un control positivo y otro negativo para cada serie de reacciones de amplificaci n No utilizar los reactivos despu s de la fecha de caducidad Agitar con v rtex los reactivos del kit antes de utilizarlos para trabajar con soluciones homog neas Comprobar la exactitud y la precisi n de las pipetas as como el correcto funcionamiento del instrumental Cambiarse los guantes de forma regular y en cuanto se sospeche que puedan estar contaminados Limpiar regularmente las superficies de trabajo con lej a diluida al 5 y otro agente limpiador como DNA AWAY o RNase AWAY Usar guantes sin polvo para no dejar huellas de dedos en la l mina ptica empleada para sellar las microplacas No escribir en los tapones de los tubos para PCR En ambos casos puede dificultar el registro de datos por parte del aparato 34 O 2010 Bio Rad Recomendamos encarecidamente leer el protocolo completo antes de comenzar el ensayo Cumpla escrupulosamente el protocolo propuesto 7 EXTRACCI N Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS Las muestras de vino se recogen en condiciones as pticas en recipientes est riles de vidrio polietileno o de otro mater
18. positive control and seal the wells on the plate or the strips hermetically It is important to insist on sealing the vvells and the strips to avoid any evaporation phenomenon during the PCR reaction It is important to avoid the presence of bubbles at the bottom of the wells by pipetting cautiously To eliminate bubbles after sealing the plate or closing the PCR strips you may centrifuge the plate of PCR strips briefly The plate can be store at 2 C to 8 C for 2 hours 2 4 Put the plate or the PCR strips into the thermocycler Make sure that they are correctly oriented well A1 at the top left Close the reaction module 3 Starting the amplification reaction To restart the PCR refer to the user guide for the Bio Rad thermocycler for the VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 10 ANALYSIS OF THE DATA Data analysis can be carried out directly at the end of the amplification reaction or later by re opening the data file To open the data files and analyse the results of the PCR refer to the user guide for the Bio Rad hermocycler for the VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 11 INTERPRETATION OF THE RESULTS To obtain the analysis results you only have to read the values of Ct Cycle hreshold value of the amplification cycle from which fluorescence increases significantly above background noise Manual analysis will only be used for a qualitative analysis presence or absence 8 O 2010 Bio Rad You must use the the Opticon Monitor
19. protocol starting from 45 mL for slightly heavy wine close to bottling or already bottled the analysis of which requires a high level of analytic sensitivity 10 O 2010 Bio Rad APPENDIX A PCR AMPLIFICATION REAGENT MIXTURE PREPARATION TABLE Use this table to determine the required quantities of fluorescent probes and amplification solution to prepare the PCR reagent mixture Calculation of the number of samples must include the 2 positive Qs PCR controls and the negative control Fluorescent Amplification Fluorescent Amplification E pali probes uL solution uL di y ll probes uL solution uL Pink stopper White stopper Pink stopper White stopper 1 5 40 49 265 2117 2 11 86 50 270 2160 3 16 130 51 275 2203 4 22 173 52 281 2246 5 27 216 53 286 2290 6 32 259 54 292 2333 7 38 302 55 297 2376 8 43 346 56 302 2419 9 49 389 57 308 2462 10 54 432 58 313 2506 11 59 475 59 319 2549 12 65 518 60 324 2592 13 70 562 61 329 2635 14 76 605 62 335 2678 15 81 648 63 340 2722 16 86 691 64 346 2765 17 92 734 65 351 2808 18 97 778 66 356 2851 19 103 821 67 362 2894 20 108 864 68 367 2938 21 113 907 69 373 2981 22 119 950 70 378 3024 23 124 994 71 383 3067 24 130 1037 72 389 3110 25 135 1080 73 394 3154 26 140 1123 74 400 3197 27 146 1166 75 405 3240 28 151 1210 76 410 3283 29 157 1253 7
20. sent en Annexe A indique les quantit s n cessaires de chaque r actif m langer en fonction du nombre d chantillons analyser Ne pas oublier de comptabiliser les 3 points de contr les Note ne pas m langer les lots de r actifs O 2010 Bio Rad 21 2 2 Apr s pr paration le m lange r actionnel Solutions d amplification et de sondes doit tre utilis imm diatement ou il peut tre conserv pendant 2 heures de 2 C 8 C 2 8 R partir 45 ul de ce m lange r actionnel par puits selon le plan de plaque d fini Les Annexes B et C proposent des plans de plaque utiliser respectivement sur les thermocycleurs Chromo4 CFX96 et MiniOpticonTM Ajouter 5 ul d chantillon ou de contr le n gatif ou de contr le positif Qs PCR et sceller de fa on herm tique les puits de la plaque ou des barrettes Il est important d insister sur la fermeture des puits et des barrettes pour viter tout ph nom ne d vaporation au cours de la r action de PCR Il est important d viter la pr sence de bulles au fond des puits en pipetant pr cautionneusement Pour liminer des bulles apr s avoir scell la plaque ou avoir ferm les barrettes PCR il est possible de centrifuger bri vement la plaque ou les barrettes PCR La plaque peut tre conserv e pendant 2 heures de 2 C 8 C 2 4 Placer la plaque ou les barrettes PCR dans le thermocycleur S assurer de leur bonne orientation puits A1 en haut gauche
21. 100 9 REAL TIME PCR 1 Starting up the PCR apparatus Switch the thermocyler and the computer on in that order and start up the Opticon Monitor software For more information and for the definition of software parameters see the user guide for the Bio Rad thermocycler for the VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 2 Preparing PCR reactions 2 1 Prepare the VINEOTM Brettanomytest PCR Kit reagent mixture by mixing 40 uL sample the amplification solution tube with white stopper and 5 uL sample the fluorescent probes tube with pink stopper Carry out the reagent mixture on the basis of the number of samples and controls to be analysed at least 1 duplicate 2 of the positive Qs PCR control and a negative control must be used per plate The PCR amplification reagent mixture preparation table in Appendix A indicates the required quantities of each reagent to be mixed on the basis of the number of samples to be analysed Do not forget to include the 2 control points Note do not mix reagent batches O 2010 Bio Rad 7 2 2 After preparation the reagent mix amplification and probe solutions must be used immediately or can be stored for 2 hours between 2 C and 8 C 2 3 Distribute 45 pl of this reagent mixture per well according to the defined plate surface Appendices B and C propose plate surfaces to be used for the Chromo4 CFX96 and MiniOpticon thermocyclers respectively Add 5 ul of sample or negative control or Qs PCR
22. 100 The analysis software adapted to these tests Opticon Monitor or CFX Manager Industrial Diagnostic Edition make it possible to measure the Brettanomyces bruxellensis risk in the analysed wine sample by an automatic and quantitative analysis An interpretation of the risk level is proposed to the user in this way It is linked to the number of CFU ml 1 Colony forming unit detected in the wine O 2010 Bio Rad 3 e Negative e Low population controlled risk e Critical population to be monitored e Very high population risk of production of volatile Phenols The VINEO Brettanomytest PCR Kit can also be used in a qualitative mode to confirm isolated colonies from a culture medium 2 PRINCIPLE BEHIND THE VINEO Brettanomytest PCR Kit This test is based on amplification detection and quantification of DNA sequences using the real time PCR technique lt uses primers and a DNA probe that are specific to Brettanomyces bruxellensis Detection and analysis of the results are optimised for use with a thermocycler for Bio Rad real time PCR such as MiniOpticon Chromo4 or CFX96 During the PCR reaction the primers will be hybridised in the target region and will then catalysed by the polymerase lengthen in the 5 3 direction using the desoxynucleotide triphosphate dNTPs present in the reagent mixture thereby creating a complementary DNA sequence called an amplicon During PCR oligonucleotidic probes that are spe
23. 51 1210 76 410 3283 29 157 1253 77 416 3326 30 162 1296 78 421 3370 31 167 1339 79 427 3413 32 173 1382 80 432 3456 33 178 1426 81 437 3499 34 184 1469 82 443 3542 35 189 1512 83 448 3586 36 194 1555 84 454 3629 37 200 1598 85 459 3672 38 205 1642 86 464 3715 39 211 1685 87 470 3758 40 216 1728 88 475 3802 41 221 1771 89 481 3845 42 227 1814 90 486 3888 43 232 1858 91 491 3931 44 238 1901 92 497 3974 45 243 1944 93 502 4018 46 248 1987 94 508 4061 47 254 2030 95 513 4104 48 259 2074 96 518 4147 O 2010 Bio Rad 25 ANNEXE B PLAN DE PLAQUE A UTILISER SUR LES THERMOCYCLEURS Chromo4 CFX96 Les 3 premiers puits de la colonne 1 peuvent tre utilis s pour analyser les 3 points de contr les Les autres puits de la plaque seront utilis s pour d poser les chantillons a analyser 1 2 3 10 11 12 A Qs B Qs Cc NC D Echantilons E Echantilons F G H NC Contr le n gatif PCR QS Contr le positif Qs PCR ANNEXE C PLAN DE PLAQUE A UTILISER SUR LE THERMOCYCLEUR MiniOpticon Les 3 premiers puits de la colonne 1 peuvent tre utilis s pour analyser les 3 points de contr les Les autres puits de la plaque seront utilis s pour d poser les chantillons a analyser Qs Qs NC Echantillons A B D Echantilons E F G H NC Contr le n gatif PCR QS
24. 64 3715 39 211 1685 87 470 3758 40 216 1728 88 475 3802 41 221 1771 89 481 3845 42 227 1814 90 486 3888 43 232 1858 91 491 3931 44 238 1901 92 497 3974 45 243 1944 93 502 4018 46 248 1987 94 508 4061 47 254 2030 95 513 4104 48 259 2074 96 518 4147 O 2010 Bio Rad 53 ALLEGATO B PIANO DI PIASTRA DA UTILIZZARE SUI TERMOCICLATORI Chromo4 o CFX967M primi 3 pozzetti della colonna 1 possono essere utilizzati per analizzare i 3 punti di controlli Gli altri pozzetti della piastra saranno utilizzati per deporre i campioni da analizzare 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Qs Qs NC Campione Campione TO n m o o w gt NC Controllo negativo PCR QS Controllo positivo Qs PCR ALLEGATO C PIANO DI PIASTRA DA UTILIZZARE SUL TERMOCICLATORE MiniOpticon primi 3 pozzetti della colonna 1 possono essere utilizzati per analizzare i 3 punti di controlli Gli altri pozzetti della piastra saranno utilizzati per deporre i campioni da analizzare 1 2 3 4 5 6 A Qs B Qs Campione E F G H Campione NC Controllo negativo PCR QS Controllo positivo Qs PCR 54 O 2010 Bio Rad AVVISO PER L ACQUIRENTE LICENZA LIMITATA L utilizzazione di questo prodotto tutelata da uno o molti dei seguenti brevetti statunitensi e dalle rivendicazioni di brevetto corrispondenti fuori degli Stati U
25. 7 416 3326 30 162 1296 8 421 3370 31 167 1339 79 427 3413 32 173 1382 80 432 3456 33 178 1426 81 437 3499 34 184 1469 82 443 3542 35 189 1512 83 448 3586 36 194 1555 84 454 3629 37 200 1598 85 459 3672 38 205 1642 86 464 3715 39 211 1685 87 470 3758 40 216 1728 88 475 3802 41 221 1771 89 481 3845 42 227 1814 90 486 3888 43 232 1858 91 491 3931 44 238 1901 92 497 3974 45 243 1944 93 502 4018 46 248 1987 94 508 4061 47 254 2030 95 513 4104 48 259 2074 96 518 4147 O 2010 Bio Rad 11 APPENDIX B PLATE SETUP FOR THE Chromo4 CFX96 THERMOCYCLERS The first 3 wells in column 1 may be used to analyse the 3 control points The other wells in the plate will be used for the samples to be analysed 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 Qs Qs NC Sample Sample I n m OO w gt NC Negative PCR control QS Positive Qs PCR control APPENDIX C PLATE SETUP FOR THE MiniOpticon THERMOCYCLER The first 3 wells in column 1 may be used to analyse the 3 control points The other wells in the plate will be used for the samples to be analysed 1 2 3 4 5 6 Qs Qs NC Sample Sample I n m o o w gt NC Negative PCR control QS Positive Qs PCR control 12 2010 Bio Rad NOTICE OF CONCERN TO THE PURCHASER LIMITED LICENSE Use of this product is covered by one or more of t
26. ERIAL NECESARIOS NO SUMINISTRADOS Equipo e Industrial Diagnostic CFX96 para la PCR en tiempo real bloque reactivo de 96 pocillos ref Bio Rad 359 3990 e CFX Manager Software Industrial Diagnostic Edition ref Bio Rad 359 3893 e Sistema MiniOpticon para la PCR en tiempo real bloque reactivo de 48 pocillos ref Bio Rad 359 3995 e V rtex e Opcional centr fuga con rotor para placa o tira de tubos m x 2000 x 9 e Micropipetas de 20 ul 200 pl y 1000 pi e Dispensador m ltiple como pipetas Combitip Observaci n Recomendamos utilizar un ondulador el ctrico con el termociclador O 2010 Bio Rad 33 Consumibles e Para las placas tubos PCR y tapones Placas blancas de 96 pocillos de perfil bajo ref Bio Rad MLL 9651 Placas blancas de 48 pocillos de perfil bajo ref Bio Rad MLL 4851 Tiras de 8 tubos de 200ul de perfil bajo ref Bio Rad TLS 0851 Tiras de 8 tapones pticos planos para tubos o placas de pocillos de 0 2 mL 120 tiras ref Bio Rad TCS 0803 e Conos para Combitip o dispensador m ltiple est riles y envasados de forma individual e Conos con filtro est riles adaptables a micropipetas de 10 ul 20 ul 100 ul 200 ul y 1000 ul e Tubos est riles de 2 mL y de 5 mL e Guantes de l tex o nitrilo sin polvo e Agua destilada est ril e Lej a diluida al 5 e Agente descontaminante como DNA AWAY o RNAse AWAY 6 PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES e El ensayo debe ser realizado por
27. Fermer le module r actionnel 3 Lancement de la r action d amplification Pour le lancement de la PCR consulter le manuel utilisateur du thermocycleur Bio Rad pour le kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 10 ANALYSE DES DONNEES L analyse des donn es peut tre r alis e directement la fin de la r action d amplification ou ult rieurement en r ouvrant le fichier de donn es Pour ouvrir des fichiers de donn es et analyser les r sultats de la PCR consulter le manuel utilisateur du thermocycleur Bio Rad pour le kit VINEO TM Brettanomytest PCR Kit 11 INTERPRETATION DES RESULTATS Pour obtenir les r sultats de l analyse il suffit de lire les valeurs de Ct Cycle treshold valeur du cycle d amplification partir duquel la fluorescence s leve significativement au dessus du bruit de fond L analyse manuelle permettra uniquement une analyse qualitative pr sence ou absence 22 O 2010 Bio Rad Il est n cessaire d utiliser les logiciels Opticon Monitor version 3 3 et plus ou CFX Manager Industrial Diagnostic Edition pour une interpr tation automatis e et quantitative Un rapport complet pourra tre imprim Cf notice d utilisation des logiciels 1 Contr les Avant l interpr tation finale des r sultats il est n cessaire de v rifier les r sultats des contr les n gatif et positif Pour que le test soit valide les r sultats des contr les n gatif et positif doivent tre les suivants
28. IDITE ET CONSERVATION 5 EQUIPEMENT ET MATERIEL NECESSAIRES NON FOURNIS 6 PRECAUTIONS ET RECOMMANDATIONS 7 PRELEVEMENT ET TRANSPORT DES ECHANTILLONS 8 EXTRACTION DE L ADN 9 POR EN TEMPS REEL 10 ANALYSE DES DONNEES 11 INTERPRETATION DES RESULTATS 12 PROTOCOLE DE CONFIRMATION A PARTIR DE COLONIES ISOLEES 13 PERFORMANCES DU TEST ET VALIDATIONS ANNEXE A TABLEAU DE PREPARATION DU MELANGE REACTIONNEL D AMPLIFICATION PCR ANNEXE B PLAN DE PLAQUE A UTILISER SUR LES THERMOCYCLEURS Chromo4 OU CFX96 TM ANNEXE C PLAN DE PLAQUE A UTILISER SUR LE THERMOCYCLEUR MiniOpticon 16 2010 Bio Rad 1 INTRODUCTION Brettanomyces bruxellensis est une levure responsable de la pr sence des 4 ethyl Ph nol et 4 ethyl Guaiacol dans les boissons de type vins jus de fruits et bi res impliquant des pertes conomiques importantes Dans les vins sa pr sence est difficile d tecter par les m thodes de culture classiques qui sont longues et non sp cifiques La d tection rapide sp cifique et pr coce de cette levure dans le processus d laboration des vins permettrait cependant l oenologue et au producteur de prendre des mesures de pr vention et de l liminer avant l apparition du caract re ph nol caract ristique de l alt ration par cette levure Face la m thode microbiologique traditionnelle la biologie mol culaire apporte des solutions de d tection de hauts niveaux de rapidit de
29. O 2010 Bio Rad 39 ANEXO A TABLA DE PREPARACI N DE LA MEZCLA REACTIVA DE AMPLIFICACI N POR PCR Utilizar esta tab n mero de muestras deben incluirse los 2 controles positi la para determinar las cantidades de sondas amplificaci n necesarias para preparar la mezcla reactiva de uorescentes y soluci n de la PCR En el c lculo del ivos Qs PCR y el control negativo Sondas Si Sondas 2 N mero de fluorescentes Solucion N mero de fluorescentes Soluci n de muestras 4 amplificaci n UL muestras uL amplificaci n uL Tap n rosa Tap n blanco Tap n rosa Tap n blanco 1 5 40 49 265 2117 2 11 86 50 270 2160 3 16 130 51 275 2203 4 22 173 52 281 2246 5 27 216 53 286 2290 6 32 259 54 292 2333 7 38 302 55 297 2376 8 43 346 56 302 2419 9 49 389 57 308 2462 10 54 432 58 313 2506 11 59 475 59 319 2549 12 65 518 60 324 2592 13 70 562 61 329 2635 14 76 605 62 335 2678 15 81 648 63 340 2722 16 86 691 64 346 2765 17 92 734 65 351 2808 18 97 778 66 356 2851 19 103 821 67 362 2894 20 108 864 68 367 2938 21 113 907 69 373 2981 22 119 950 70 378 3024 23 124 994 71 383 3067 24 130 1037 72 389 3110 25 135 1080 73 394 3154 26 140 1123 74 400 3197 27 146 1166 75 405 3240 28 151 1210 76 410 3283 29 157 1253 TT 416 3326 30 162 1296 78 421 3370 31 167 1339 79 427
30. VINEO Brettanomytest PCR Kit Ref 354 8101 Instructions Test to detect and quantify Brettanomyces bruxellensis using real time PCR TABLE OF CONTENTS 1 INTRODUCTION 2 PRINCIPLE BEHIND THE VINEO Brettanomytest PCR Kit 3 KIT COMPOSITION 4 VALIDITY AND PRESERVATION 5 REQUIRED EQUIPMENT THAT IS NOT PROVIDED 6 PRECAUTIONS AND RECOMMENDATIONS 7 SAMPLING AND TRANSPORT OF SAMPLES 8 DNA EXTRACTION 9 REAL TIME PCR 10 ANALYSIS OF THE DATA 11 INTERPRETATION OF THE RESULTS 12 CONFIRMATION PROTOCOL FROM ISOLATED COLONIES 13 TEST PERFORMANCE AND VALIDATIONS APPENDIX A PCR AMPLIFICATION REAGENT MIXTURE PREPARATION TABLE APPENDIX 8 PLATE SETUP FOR THE Chromo4 OR THE CFX96 THERMOCYCLERS APPENDIX C PLATE SETUP FOR THE MiniOpticon THERMOCYCLER 2 O 2010 Bio Rad 1 INTRODUCTION Brettanomyces bruxellensis is a type of yeast that is responsible for the presence of 4 ethyl Phenol and 4 ethylguaiacol in wine type drinks fruit juices and beers that involves significant economic losses In wines its presence is difficult to detect using classic culture methods which take a long time and are non specific Rapid specific and early detection of this yeast in the wine production would however allow the oenologist and the producer to take preventive measurements and to eliminate it before the appearance of the phenolated Character that is characteristic of changes induced by t
31. ale HEX Controllo negativo Ct N A 25 lt Ct lt 40 Controllo positivo Qs PCR 27 lt Ct lt 37 Non significativo N A significa Non Applicabile Il software indica N A per il Ct di un campione quando la curva di fluorescenza non interseca la soglia Se i risultati dei controlli positivo Qs PCR e negativo differiscono da quelli descritti nella tabella qui sopra necessario ripetere la PCR 2 Campioni Un campione considerato positivo per Brettanomyces bruxellensis se viene ottenuto un valore di Ct gt 10 per il fluoroforo FAM Se non viene ottenuto alcun valore per il CtFAM Cteay N A l interpretazione del risultato dipende dal valore del controllo interno Un campione considerato negativo per Brettanomyces bruxellensis se non viene ottenuto alcun valore di Ct per il fluoroforo FAM Ctpay N A e se il Ct del controllo interno superiore o uguale a 28 Ctiygx gt 28 Un valore N A per 1 Ctyex del controllo interno indica quando il Ctpam del bersaglio ugualmente N A che probabilmente ha avuto luogo un fenomeno di inibizione della reazione di PCR In tal caso il campione di DNA deve essere diluito a 1 10 per esempio in acqua distillata sterile poi sottoposto nuovamente a PCR Se il Ctyex del controllo interno inferiore a 28 non possibile interpretare il risultato Verificare che la soglia sia stata posta correttamente o che la curva grezza abbia un aspetto caratteristico di amplifi
32. amente una secuencia de ADN espec fica de la Brettanomyces bruxellensis gracias a una sonda fluorescente La aplicaci n de esta prueba permite obtener un resultado cuantitativo en menos de 3 h tras la extracci n de ADN VINEOTM Extract DNA Kit 354 8100 Los softwares dise ados para este an lisis Opticon Monitor o CFX Manager Industrial Diagnostic Edition permiten la monitorizaci n del riesgo derivado de la presencia de Brettanomyces bruxellensis en la muestra de vino analizada Adem s se ofrece al usuario una interpretaci n del nivel de riesgo en relaci n con el numero de UFC mL 1 unidades formadoras de colonias detectado en el vino O 2010 Bio Rad 31 e Negativo e Poblaci n peque a riesgo controlado e Poblaci n cr tica que debe vigilarse e Poblaci n muy elevada riesgo de producci n de fenoles vol tiles El kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit puede usarse asimismo de modo cualitativo para confirmar colonias aisladas a partir de un medio de cultivo 2 PRINCIPIO DEL Kit VINEO Brettanomytest PCR Kit Esta prueba se basa en la amplificaci n detecci n y cuantificaci n de secuencias de ADN mediante la t cnica de PCR en tiempo real Utiliza cebadores y una sonda de ADN espec ficos de la Brettanomyces bruxellensis La detecci n y el an lisis de los resultados se optimizan para el uso con un termociclador para PCR en tiempo real de Bio Rad como el MiniOpticon el Chromo4 o el CFX967M Durante la reacci
33. artir de un medio selectivo o no con ayuda de un palillo un asa de siembra de 1 uL u otro consumible adecuado p ej un cono de pipeta 2 Volver a suspender la colonia en 100 ul de R2 en un tubo Eppendorf es posible para volver a suspender la colonia en agua fisiol gica est ril la eficiencia de PCR pueden ser afectadas Homogeneizar bien la suspensi n en un v rtex 3 Poner 5 uL de la suspensi n en 45 uL de la mezcla reactiva de la PCR v ase apartado 9 2 PCR en tiempo real y seguir el resto del m todo del kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit para obtener e interpretar los resultados Nota S lo se realiza un an lisis cualitativo a partir de la PCR efectuada con esta suspensi n A menudo la se al obtenida con la PCR es muy elevada debido a que la cantidad de c lulas extra das y analizadas mediante PCR con este m todo es muy grande 38 O 2010 Bio Rad 13 RENDIMIENTOS DE LA PRUEBA Y VALIDACIONES La prueba VINEOTM Brettanomytest PCR Kit es espec fica para la detecci n de la Brettanomyces bruxellensis La levadura puede detectarse a partir de e 500 UFC mL de vino con el protocolo de extracci n de ADN descrito en el kit VINEOTM Extract DNA Kit 1 8 mL para un mosto en fermentaci n o un vino pesado durante la vinificaci n o la crianza e 10 UFC mL de vino seg n el protocolo 45 mL para un vino poco pesado pr ximo al embotellado o ya embotellado cuyo an lisis precise de un nivel elevado de sensibilidad anal tica
34. ati re de PCR Le mat riel pipettes tubes etc ne doit pas circuler d un poste de travail a l autre Il est indispensable d utiliser un contr le positif et un contr le n gatif pour chaque s rie de r actions d amplification Ne pas utiliser les r actifs au del de leur date de p remption Vortexer les r actifs du kit avant leur utilisation pour travailler avec des solutions homog nes V rifier l exactitude et la pr cision des pipettes ainsi que le bon fonctionnement des instruments Changer de gants r guli rement et d s que vous soup onnez qu ils peuvent tre contamin s Nettoyer les surfaces de travail r guli rement avec de l eau de javel 5 et autre agent tel que DNA AWAY ou RNase AWAY Porter des gants non poudr s pour ne pas laisser des traces de O 2010 Bio Rad doigts sur le film optique utilis pour sceller les microplaques Ne pas crire sur les bouchons des tubes PCR Dans les deux cas l enregistrement des donn es par l appareil peut tre perturb Nous vous recommandons vivement de lire l ensemble du protocole avant de commencer l essai Respecter scrupuleusement le protocole propos 7 PRELEVEMENT ET TRANSPORT DES ECHANTILLONS Les chantillons de vins sont collect s en conditions aseptiques dans des r cipients st riles en verre en poly thyl ne ou en mat riel similaire Les chantillons doivent tre remis au laboratoire le plus rapidement possible de pr f
35. cazione esponenziale Se la curva osservata non corretta sar necessario ripetere il test di PCR per questo campione 2010 Bio Rad 51 Interpretazione dei risultati ottenuti sui campioni Rilevazione di Brettanomyces Rilevazione del controllo Interpretazione bruxellensis FAM interno ct 10 Non significativo Positivo Ct N A Du gt 28 Negativo Ct N A Ct N A Inibizione In caso di valore nullo per un campione e il suo controllo interno Ct N A l analisi deve essere ripetuta con il campione di DNA diluito a 1 5 o a 1 10 per esempio Pu capitare di ottenere un valore inferiore a 10 verificare che la curva come dato grezzo abbia un aspetto caratteristico di amplificazione esponenziale linea di base piatta poi aumento regolare della fluorescenza seguito da un plateau Se la curva osservata corretta il campione pu essere considerato positivo per la presenza di Brettanomyces bruxellensis in caso contrario l interpretazione del risultato dipende dal valore del controllo interno come spiegato nei paragrafi precedenti 12 PROTOCOLLO DI CONFERMA A PARTIRE DA COLONIE ISOLATE possibile utilizzare il test VINEO Brettanomytest PCR Kit per la conferma di colonie isolate su agar agar 1 Pungere una colonia isolata a partire da un mezzo selettivo o non con uno stuzzicadenti o un ansa da 1 ul o qualsiasi altro materiale corrente di laboratorio adatto cono di pipettaggio per
36. cific to the target sequence will be hybridised with the amplicons These probes which are marked by fluorophores only emit fluorescence when hybridisation takes place The probe that is linked to the target sequence of Brettanomyces bruxellensis is marked by a specific fluorophore Intensity of fluorescence increases proportionally to the increase in quantity of amplification products in the PCR tube The fluorescence that is generated in this way is directly measured by the optical module of the thermocycler A synthetic DNA called the Internal control is added to each reaction lt is amplified at the same time as the target sequences of Brettanomyces bruxellensis but detected by a probe marked with a second fluorophore lt is used to bring out any reaction inhibiting phenomenon The software associated with the device calculates the relation between he intensity of the fluorescence and the amplification cycle automatically This relation shows the presence or absence of Brettanomyces bruxellensis in the sample The results obtained by amplification of this DNA are analysed by the Opticon Monitor or CFX Manager IDE software that have been programmed to carry out an automatic and quantitative analysis An interpretation of the risk linked to the presence of Brettanomyces bruxellensis is then proposed to the user 4 O 2010 Bio Rad This test is used to detect and quantify Brettanomyces bruxellensis in the DNA extracted fro
37. di 3 ore dopo l estrazione di DNA VINEO Extract DNA Kit 354 8100 Il software di analisi adatto a questo test Opticon MonitorTM oppure CFX Manager Industrial Diagnostic Edition consente attraverso un analisi automatica e quantitativa di misurare il rischio Brettanomyces bruxellensis nel campione di vino analizzato All utilizzatore viene proposta anche un interpretazione del livello di rischio Quest ultima correlata al numero di UFC ml 1 Unit Formanti Colonia rilevate nel vino 2010 Bio Rad 45 e Negativo e Popolazione bassa rischio controllato e Popolazione critica da tenere sotto controllo e Popolazione molto elevata rischio di produzione di Fenoli volatili VINEOTM Brettanomytest PCR Kit pu essere utilizzato anche in modalit qualitativa per la conferma di colonie isolate a partire dal mezzo di coltura 2 PRINCIPIO DEL VINEO Brettanomytest PCR Kit Questo test si basa sull amplificazione la rilevazione e la quantificazione di sequenze di DNA mediante la tecnica di PCR in tempo reale Utilizza dei primer e una sonda da DNA specifici per Brettanomyces bruxellensis La rilevazione e l analisi dei risultati sono ottimizzate per l utilizzazione con un termociclatore per la PCR in tempo reale Bio Rad quale il MiniOpticon il Chromo4 o il CFX96 Durante la reazione di PCR i primer si ibrideranno alla regione bersaglio poi catalizzati mediante polimerasi si allungheranno nelle direzioni 5 3 utilizza
38. di Bio Rad Bio Rad 8 bd Raymond Poincar 92430 Marnes la Coquette France Tel 33 1 47 95 60 00 Fax 33 1 47 41 91 33 Rev D 12 2010
39. evenci n y eliminarla antes de la aparici n del car cter fenolado caracter stico de la alteraci n provocada por esta levadura Frente al m todo microbiol gico tradicional la biolog a molecular ofrece soluciones de detecci n con elevados niveles de rapidez sensibilidad y especificidad El diagn stico de la presencia de esta levadura debe permitir determinar el nivel de riesgo en que se encuentra el vino y c mo evoluciona dicho riesgo con el tiempo El riesgo var a seg n el nivel de contaminaci n del vino As pues una herramienta de cuantificaci n adaptada permite determinar si a existe una peque a poblaci n y por tanto el riesgo es bajo o est controlado b existe una poblaci n intermedia o cr tica en cuyo caso el vino debe ser vigilado es necesario hacer un seguimiento de forma regular y puede tratarse el vino o c la poblaci n es considerable en cuyo caso tambi n lo es el riesgo de producci n de fenoles vol tiles y se requiere actuar de forma inmediata y urgente sobre el vino En todos los casos se recomienda realizar un seguimiento regular Es importante seguir la evoluci n de las Brettanomyces bruxellensis en el vino El kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit es una prueba cuantitativa que permite detectar de forma espec fica la Brettanomyces bruxellensis en los vinos y mostos en fermentaci n mediante la t cnica de reacci n en cadena de la polimerasa en tiempo real RT PCR Se amplifica y detecta simult ne
40. he following US patents and the corresponding patent claims outside the United States 5 079 352 5 789 224 5 618 711 6 127 155 5 677 152 claims 1 to 23 only and 5 773 258 claims 1 and 6 only and by the claims outside the United States that correspond to US patent n 4 889 818 The purchase of this product includes limited immunity from legal proceedings that may not be transferred according to the claims of previous patents when this quantity of product is solely used for alimentary analysis environmental and industrial microbiology purposes including publication of the results of the purchaser s activities in return for payment or other commercial counterpart and when it is also used for the purchaser s own research purposes No right according to any patent claim such as the claims of method 5 nuclease in US patents n 5 210 015 and 5 487 972 is not expressly transferred whether by implication or preclusion Further information on the purchase of licenses may be obtained by contacting the Director of Licenses Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City California 94404 United States O 2010 Bio Rad 13 14 O 2010 Bio Rad VINEO Brettanomytest PCR Kit R f 354 8101 Notice d utilisation Test pour la d tection et quantification par PCR en temps r el de Brettanomyces bruxellensis O 2010 Bio Rad 15 SOMMAIRE 1 INTRODUCTION 2 PRINCIPE DU VINEO Brettanomytest PCR Kit 3 COMPOSITION DU KIT 4 VAL
41. his yeast Compared with the traditional microbiological method molecular biology provides high speea high sensitivity and high specificity detection solutions Diagnosis of the presence of this yeast must make it possible to determine at what risk level the wine is and how this risk develops over time This risk is variable according to the contamination level of the wine Therefore an adapted quantification tool is used to determine whether i the population is low and therefore that risk is low or even controlled ii regular monitoring is required and the wine can be processed in intermediate or critical quantities in the event that the wine must be supervised ii and finally whether the population is very high and in the event that the risk of producing volatile phenols is also high an immediate and urgent action is required for the wine In all cases regular monitoring is recommended It is important to monitor he development Brettanomyces bruxellensis of in the wine VINEOTM Brettanomytest PCR Kit is a quantitative test used for specific detection of Brettanomyces bruxellensis in wines and grape musts in ermentation using the real time polymerase chain technique RT PCR A specific sequence of Brettanomyces bruxellensis is amplified and detected simultaneously by means of a fluorescent probe Implementation of this est is used to obtain a quantitative result less than 3 hours after extracting he DNA VINEO M Extract DNA Kit 354 8
42. ial parecido Las muestras deben enviarse al laboratorio lo m s r pidamente posible preferentemente antes de 24 horas y no m s de 48 horas tras su extracci n Si las muestras se transportan y analizan en un plazo de 24 horas el transporte y almacenamiento se realizan a temperatura ambiente entre 18 C y 30 3 Si las muestras se transportan y analizan en un plazo de 48 horas el transporte y almacenamiento se realizan a una temperatura de entre 2 C y 8 C 8 EXTRACCI N DEL ADN La extracci n del ADN debe realizarse con el kit VINEOTM Extract DNA Kit ref Bio Rad 354 8100 desarrollado por Bio Rad para la extracci n de ADN a partir de muestras de vino 9 PCR EN TIEMPO REAL 1 Puesta en marcha de la m quina de PCR Encender por este orden el termociclador y el ordenador y a continuaci n abrir el software Opticon Monitor Encontrar m s informaci n y la definici n de los par metros del software en el manual del usuario del termociclador Bio Rad para el kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 2 Preparaci n de las reacciones de PCR 2 1 Preparar la mezcla reactiva del kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit con 40 uL muestra de la soluci n de amplificaci n tubo con tap n blanco y 5 uL muestra de sondas fluorescentes tubo con tap n rosa Hacer mezcla reactiva en funci n del n mero de muestras y de controles que se desee analizar teniendo en cuenta que por cada placa deben usarse como m nimo 1 duplicado 2 del contro
43. ilmente entro le 24 ore e non oltre le 48 ore successive al prelievo Se i campioni sono trasportati e analizzati entro 24 ore il trasporto e la conservazione hanno luogo a temperatura ambiente da 18 C a 30 C Se i campioni vengono trasportati e analizzati entro le 48 ore il trasporto e la conservazione hanno luogo ad una temperatura tra 2 C e 8 C 8 ESTRAZIONE DEL DNA L estrazione del DNA va effettuata utilizzando il kit messo a punto da Bio Rad per l estrazione del DNA a partire da campioni di vino VINEOTM Extract DNA kit rif Bio Rad 354 8100 9 PCR IN TEMPO REALE 1 Accensione dell apparecchio PCR Accendere nell ordine il termociclatore il computer poi aprire il software Opticon Monitor Per maggiori informazioni e per la definizione dei parametri del software consultare il manuale d uso del termociclatore Bio Rad per il kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 2 Preparazione delle reazioni PCR 2 1 Preparare la miscela di reazione VINEOTM Brettanomytest PCR Kit mescolando 40 ul campione della soluzione di amplificazione provetta con il tappo bianco e 5 ul campione delle sonde fluorescenti provetta con il tappo rosa Realizzare la miscela di reazione in funzione del numero di campioni e dei controlli da analizzare devono essere utilizzati minimo 1 duplicato 2 del controllo positivo Qs PCR e un controllo negativo per piastra La tabella di preparazione della miscela di reazione di amplificazione PCR presente nell
44. itivo y negativo deber n ser los siguientes Detecci n de Brettanomyces Detecci n del control interno bruxellensis FAM Canal HEX Control negativo Ct N A 25 lt Ct lt 40 Control positivo Qs PCR 27 lt Ct lt 37 No significativo N A significa no aplicable el software indica N A para el Ct de una muestra cuando la curva de fluorescencia no supera el umbral Si los resultados de los controles positivos Qs PCR y negativo son distintos de los descritos en la tabla anterior es necesario repetir la PCR desde el principio 2 Muestras Una muestra se considera positiva en Brettanomyces bruxellensis si se obtiene un valor Ct gt 10 para el fluor foro FAM Si no se obtiene ningun valor para el Ctram Ctram N A la interpretaci n del resultado depende del valor del control interno Una muestra se considera negativa en Brettanomyces bruxellensis si no se ha obtenido ning n valor de Ct para el fluor foro FAM Cteay N A y el Ct del control interno es igual o superior a 28 Uh gt 28 Un valor N A para el Ctyex del control interno indica cuando el Ctray del objetivo tambi n es N A que probablemente se ha producido un fen meno de inhibici n de la PCR En este caso la muestra de ADN debe ser diluida por ejemplo en relaci n 1 9 en agua destilada est ril y para luego someterla a una nueva PCR O 2010 Bio Rad 37 Si el Oh del control interno es inferior a 28 no es posible interpretar
45. l positivo Qs PCR y un control negativo La tabla de preparaci n de la mezcla reactiva de amplificaci n por PCR incluida en el Anexo A indica las cantidades de cada reactivo que deben mezclarse en funci n del n mero de muestras que se desee analizar No olvide contar los 3 puntos de control Nota No mezclar lotes de reactivos O 2010 Bio Rad 35 2 2 Una vez preparada la mezcla reactiva soluciones de amplificaci n y sondas debe utilizarse inmediatamente o bien puede conservarse durante 2 horas entre 2 C y 8 C 2 3 Repartir 45 uL de esta mezcla reactiva por pocillos seg n el plan de placa definido En los Anexos B y C se proponen planes de placa para los termocicladores Chromo4 CFX96 y MiniOpticon respectivamente A adir 5 uL de muestra de control negativo o de control positivo Qs PCR y sellar herm ticamente los pocillos de la placa o de las tiras Es importante insistir en el cierre de los pocillos y de las tiras de pocillos para evitar toda posible evaporaci n durante la PCR Es importante asimismo evitar la presencia de burbujas en el fondo de los pocillos para ello deber pipetearse con cuidado Para eliminar las burbujas una vez sellada la placa o cerradas las tiras de pocillos para PCR stas pueden centrifugarse brevemente La placa puede conservarse durante 2 horas entre 2 C y 8 C 2 4 Colocar la placa o las tiras para PCR en el termociclador Asegurarse de que est n orientadas correctamente
46. m fermented drinks produced from grape and fermenting grape musts TAKING THE SAMPLE DNA EXTRACTION VINEO Extract DNA Kit Ref 354 8100 DNA AMPLIFICATION by PCR IN REAL TIME Brettanomytest PCR Kit Ref 354 8101 VINEO ANALYSIS amp INTERPRETATION Opticon Monitor or CFX Manager IDE 3 KIT CONTENTS Stoppers Designation Reagent Volume Pink Fluorescent probes Fluorescent probes 1 tube 0 55 mL White Amplification mix Amplification mix 2 tubes 2 x 2 2 mL Green Negative PCR control Negative PCR control 1 tube 0 5 mL Red Positive Qs PCR control Positive Qs PCR control 1 tube 0 5 mL This kit contains the quantity of reagent required for 96 reactions 4 VALIDITY AND PRESERVATION On reception the kit must be stored at temperatures between 2 C and 8 C Each reagent stored between 2 C and 8 C can be used until the expiry date indicated on the tube NB Do not freeze the reagents 5 REQUIRED EQUIPMENT THAT IS NOT PROVIDED Equipment e Industrial Diagnostic CFX96 real time PCR detection system 96 wells ref Bio Rad 359 3990 e CFX Manager Software Industrial Diagnostic Edition ref Bio Rad 359 3893 e MiniOpticonTM system for real time PCR reaction block of 48 wells ref Bio Rad 359 3995 e Vortex e Optionally centrifuge with rotor for plates or strips max 2000 x G e 20 ul 200 ul and 1000
47. m to work with homogeneous solutions Check the exactness and the precision of the pipettes as well as the proper functioning of the instruments Change gloves regularly and as soon as you suspect that they may have been contaminated Clean work surfaces regularly with a 5 solution of chlorine bleach and another agent such as DNA AWAY or RNase AWAY Wear non powdered gloves so as not to leave fingerprints on the optical film used to seal the micro plates Do not write on the PCR tube stoppers In both cases recording the data by the device can be disturbed 6 O 2010 Bio Rad We strongly recommend that you read the complete protocol before beginning the trial Follow the suggested protocol scrupulously 7 SAMPLING AND TRANSPORT OF SAMPLES Wine samples are collected under aseptic conditions in sterile glass or polyethylene recipients or recipients made out of similar material The samples must be submitted to the laboratory as quickly as possible preferably within 24 and not more than 48 after taking the sample If the samples are transported and analysed within 24 h transport and storage take place at ambient temperature 18 C to 80 C If the samples are transported and analysed within 48 h transport and storage take place at between 2 C to 8 C 8 DNA EXTRACTION DNA extraction must be carried out using the kit developed by Bio Rad to extract DNA from wine sample VINEO Extract DNA Kit ref Bio Rad 354 8
48. mytest PCR Kit Ref 354 8101 Instrucciones de uso Prueba para la detecci n y cuantificaci n mediante PCR en tiempo real de Brettanomyces bruxellensis O 2010 Bio Rad 29 NDICE 1 INTRODUCCI N 2 PRINCIPIO DEL Kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 3 COMPOSICI N DEL KIT 4 CADUCIDAD Y CONSERVACI N 5 EQUIPO Y MATERIAL NECESARIOS NO SUMINISTRADOS 6 PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES 7 EXTRACCI N Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS 8 EXTRACCI N DEL ADN 9 PCR EN TIEMPO REAL 10 AN LISIS DE DATOS 11 INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS 12 PROTOCOLO DE CONFIRMACI N A PARTIR DE COLONIAS AISLADAS 13 RENDIMIENTOS DE LA PRUEBA Y VALIDACIONES ANEXO A TABLA DE PREPARACI N DE LA MEZCLA REACTIVA DE AMPLIFICACI N POR PCR ANEXO B PLAN DE PLACA PARA LOS TERMOCICLADORES Chromo4 O CFX96 ANEXO C PLAN DE PLACA PARA EL TERMOCICLADOR MiniOpticon 30 2010 Bio Rad 1 INTRODUCCI N La Brettanomyces bruxellensis es una levadura responsable de la presencia de 4 etil fenol y 4 etil guayacol en bebidas como los vinos los zumos de frutas y las cervezas que causan p rdidas econ micas importantes Resulta dif cil detectar su presencia en los vinos mediante los m todos de cultivo cl sicos que son largos y no espec ficos Sin embargo la detecci n r pida espec fica y precoz de esta levadura en el proceso de elaboraci n de los vinos permitir a al en logo y al productor tomar medidas de pr
49. n de la PCR los cebadores se hibridan en la regi n objetivo y despu s catalizados por la polimerasa se extienden en sentido 5 3 utilizando los desoxinucle tidos trifosfatos ANTP presentes en la mezcla reactiva creando de este modo una secuencia complementaria de ADN llamada amplic n Durante la PCR se hibridan con los amplicones sondas oligonucleot dicas espec ficas de la secuencia objetivo Dichas sondas marcadas mediante fluor foros s lo emiten fluorescencia cuando se produce la hibridaci n La sonda que se une a la secuencia objetivo de Brettanomyces bruxellensis se marca con un fluor foro espec fico La intensidad de la fluorescencia aumenta en proporci n a la cantidad de productos de amplificaci n en el tubo de PCR El m dulo ptico del termociclador mide directamente la fluorescencia generada de este modo A cada reacci n se a ade un ADN sint tico llamado control interno que se amplifica a la vez que las secuencias objetivo de Brettanomyces bruxellensis pero es detectado por una sonda marcada con un segundo fluor foro Este control intemo permite evidenciar un posible fen meno de inhibici n de la reacci n El software asociado al aparato calcula autom ticamente la relaci n entre la intensidad de la fluorescencia y el ciclo de amplificaci n Esta relaci n indica la presencia o ausencia de Brettanomyces bruxellensis en la muestra Los resultados obtenidos mediante amplificaci n de este DNA son analizado
50. ndo i desossinucleotidi trifosfati ANTP presenti nella miscela di reazione creando in questo modo una sequenza complementare di DNA detta amplicon Durante la PCR sonde oligonucleotidiche specifiche della sequenza bersaglio si ibrideranno agli amplicon Queste sonde marcate con fluorofori emettono fluorescenza solo quando ha luogo l ibridazione La sonda che si lega alla sequenza bersaglio di Brettanomyces bruxellensis marcata con un fluoroforo specifico L intensit di fluorescenza aumenta proporzionalmente all aumento della quantit dei prodotti di amplificazione nella provetta di PCR La fluorescenza cosi generata viene misurata direttamente attraverso il modulo ottico del termociclatore Ad ogni reazione viene aggiunto un DNA sintetico chiamato Controllo interno Viene amplificato simultaneamente alle sequenze bersaglio di Brettanomyces bruxellensis ma rilevato mediante una sonda marcata con un secondo fluoroforo Consente di evidenziare un eventuale fenomeno di inibizione della reazione Il software associato all apparecchio calcola automaticamente la relazione tra l intensit della fluorescenza e il ciclo di amplificazione Questa relazione indica la presenza o l assenza di Brettanomyces bruxellensis nel campione risultati ottenuti per l amplificazione di questi DNA sono analizzati dal software Opticon Monitor oppure CFX Manager programmati per eseguire un analisi automatica e quantitativa Viene allora proposta
51. niti 5 079 352 5 789 224 5 618 711 6 127 155 5 677 152 unicamente rivendicazioni da 1 a 23 e 5 773 258 unicamente rivendicazioni da 1 a 6 e dalle rivendicazioni fuori degli Stati Uniti corrispondenti al brevetto USA n 4 889 818 L acquisto di questo prodotto comprende un immunit da azioni giudiziarie limitata e non trasferibile conformemente alle rivendicazioni di brevetti precedenti quando questa quantit di prodotto viene utilizzata unicamente a scopi di analisi alimentare di analisi ambientale e in microbiologia industriale compresa la pubblicazione dei risultati delle attivit dell acquirente mediante pagamento o qualsiasi altra contropartita commerciale e quando viene egualmente utilizzata per le ricerche proprie dell acquirente Non viene espressamente ceduto alcun diritto sulla base di una qualunque rivendicazione di brevetto quali le rivendicazioni del metodo 5 nucleasi nei brevetti USA n 5 210 015 e 5 487 972 che sia per implicazione o per preclusione Informazioni pi complete riguardanti l acquisto di licenze possono essere ottenute contattando il Direttore delle licenze Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City Califomia 94404 Stati Uniti 2010 Bio Rad 55 Purchaser s information VINEO is a trademark of Bio Rad Information a l acheteur VINEO is a trademark of Bio Rad Informaci n al comprador VINEO es una marca registrada de Bio Rad Informazione per l acquirente VINEO un marchio registrato
52. nostic Edition r f Bio Rad 359 3893 e Syst me MiniOpticon pour la PCR en temps r el bloc r actionnel de 48 puits r f Bio Rad 359 3995 e Vortex e En option centrifugeuse avec rotor pour plaque ou barrette max 2000 x G O 2010 Bio Rad 19 20 e 20 ul 200 ul and 1000 ul micropipettes e Multi distributeur tel que combitip pipettes Remarque Nous recommandons l utilisation d un onduleur lectrique avec le thermocycleur Consommables e Pour les plaques tubes PCR et capuchons Plaques blanches de 96 puits Low profile r f Bio Rad MLL 9651 Plaques blanches de 48 puits Low profile r f Bio Rad MLL 4851 Barrettes de 8 tubes de 200 ul Low profile r f Bio Rad TLS 0851 Barrettes de 8 capuchons optiques plats pour tubes ou plaques de puits de 0 2 mL 120 barrettes R f Bio Rad TCS 0803 e C nes pour Combitip ou multi distributeur st riles emballage individuel e C nes filtre st riles adaptables sur les micropipettes de 10 ul 20 ul 100 ul 200 ul et 1000 ul e Tubes st riles de 2 mL et de 5 mL e Gants non poudr s latex ou nitrile Eau distill e st rile e Eau de javel 5 e Agent d contaminant tel que DNA AWAY ou RNAse AWAY PRECAUTIONS ET RECOMMANDATIONS Cet essai doit tre r alis par des personnes ayant recu une formation ad quate La qualit des r sultats d pend du respect scrupuleux des Bonnes Pratiques de Laboratoire en particulier en m
53. one da 96 pozzetti rif Bio Rad 359 3990 e CFX Manager Software Industrial Diagnostic Edition rif Bio Rad 359 3893 e Sistema MiniOpticon per la PCR in tempo reale blocco di reazione da 48 pozzetti rif Bio Rad 359 3995 e Vortex e Opzionale centrifuga con rotore per piastra o barretta max 2000 x G e Micropipette da 20 ul 200 ul e 1000 ul e Multidispensatore quale pipette combitip Nota Consigliamo di utilizzare un ondulatore elettrico con il termociclatore O 2010 Bio Rad 47 Materiali monouso e Per le piastre provette per PCR e cappucci Piastre bianche da 96 pozzetti Low profile rif Bio Rad MLL 9651 Piastre bianche da 48 pozzetti Low profile rif Bio Rad MLL 4851 Barrette da 8 provette da 200 ul Low profile rif Bio Rad TLS 0851 Barrette da 8 cappucci ottici piatti per provette o piastre per pozzetti da 0 2 ml 120 barrette Rif Bio Rad TCS 0803 e Coni per Combitip o multidispensatore sterili confezionati individualmente e Coni con filtro sterili adattabili a micropipette da 10 ul 20 ul 100 ul 200 ul e 1000 ul e Provette sterili da 2 ml e da 5 ml e Guanti non talcati in latice o nitrile e Acqua distillata sterile e Candeggina al 5 e Agente decontaminante quale DNA AWAY o RNAse AWAY 6 PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI 48 e Questo test deve essere realizzato da persone che hanno ricevuto una formazione adeguata e La qualit dei risultati dipende dal rispe
54. pocillos A1 en la parte superior izquierda Cerrar el m dulo reactivo 3 Inicio de la reacci n de amplificaci n Para iniciar la PCR consulte el manual del usuario del termociclador Bio Rad para el kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 10 AN LISIS DE DATOS El an lisis de los datos puede realizarse directamente al final de la reacci n de amplificaci n o posteriormente reabriendo el fichero de datos Para abrir los ficheros de datos y analizar los resultados de la PCR consulte el manual del usuario del termociclador Bio Rad para el kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 11 INTERPRETACI N DE LOS RESULTADOS Para obtener los resultados del an lisis basta con leer los valores Ct del ingl s cycle threshold ciclo umbral valor del ciclo de amplificaci n a partir del cual la fluorescencia se eleva significativamente por encima del ruido de fondo 36 O 2010 Bio Rad El an lisis manual permitir nicamente un an lisis cualitativo presencia o ausencia Para una interpretaci n autom tica es necesario utilizar el software Opticon Monitor versi n 3 3 y posteriores o el software CFX Manager Industrial Diagnostic Edition Ser posible imprimir un informe completo ver instrucciones de software 1 Controles Antes de la interpretaci n final de los resultados es necesario verificar los resultados de los controles positivo y negativo Para que la prueba sea v lida los resultados de los controles pos
55. reazione 3 Avvio della reazione di amplificazione Per awiare la PCR consultare il manuale d uso del termociclatore Bio Rad per il kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 10 ANALISI DEI DATI L analisi dei dati pu essere effettuata direttamente al termine della reazione di amplificazione o in seguito riaprendo il file dati Per aprire dei file dati e analizzare i risultati della PCR consultare il manuale d uso del termociclatore Bio Rad per il kit VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 11 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Per ottenere i risultati dell analisi sufficiente leggere i valori di Ct Cycle treshold valore del ciclo di amplificazione a partire dal quale la fluorescenza si innalza significativamente al di sopra del rumore di fondo L analisi manuale consentir solo un analisi qualitativa presenza o assenza 50 2010 Bio Rad E necessario utilizzare il software Opticon MonitorTM versione 3 3 o superiore oppure il CFX Manager software Industrial Diagnostic Edition per un interpretazione automatizzata e quantitativa Sar possibile stampare una relazione completa Cfr istruzioni del software 1 Controlli Prima dell interpretazione finale dei risultati necessario verificare i risultati dei controlli negativo e positivo Perch il test sia valido i risultati dei controlli negativo e positivo devono essere i seguenti Rilevazione di Brettanomyces Rilevazione del controllo bruxellensis FAM interno Can
56. ruxellensis est alors propos e l utilisateur Ce test permet la d tection et bruxellensis dans les ADN extraits partir de boissons ferment es issues de raisin et des mo ts en fermentat ion a quantification de Brettanomyces PR L VEMENT D L CHANTILLON EXTRACTION ADN E VINEO Extract DNA Kit R f 354 8100 AMPLIFICATION ADN par PCR EN TEMPS REEL VINEO Brettanomytest PCR Kit R f 354 8101 gt ANALYSE 8 INTERPRETATION Opticon Monitor ou CFX Manager IDE 3 COMPOSITION DU KIT Bouchons D signation R actif Volume Rose Fluorescent probes Sondes fluorescentes 1 tube 0 55 mL Blanc Amplification mix Solution d amplification 2 tubes 2 x 2 2 mL Vert Negative PCR control Contr le n gatif PCR 1 tube 0 5 mL Rouge Positive Qs PCR control Contr le positif Qs PCR 1 tube 0 5 mL Ce kit contient la quantit de r actif n cessaire pour 96 r actions 4 VALIDITE ET CONSERVATION Des r ception le kit doit tre conserv entre 2 C et 8 C Chaque r actif conserv entre 2 C et 8 C peut tre utilis jusqu la date de p remption indiqu e sur le tube NB Ne pas congeler les r actifs 5 EQUIPEMENT ET MATERIEL NECESSAIRES NON FOURNIS Equipements e Industrial Diagnostic CFX96 pour la PCR en temps r el bloc r actionnel de 96 puits r f Bio Rad 359 3990 e CFX Manager Software Industrial Diag
57. s por los softwares Opticon Monitor o CFX Manager IDE que han sido programados para realizar an lisis cuantitativos y autom ticos Entonces se ofrece al usuario una interpretaci n del riesgo relacionado con la presencia de Brettanomyces bruxellensis 32 O 2010 Bio Rad Esta prueba permite detectar y cuantificar la Brettanomyces bruxellensis en los ADN extra dos a partir de bebidas fermentadas procedentes de la uva y de mostos en fermentaci n AMPLIFICACI N de AN LISIS e EXTRACCI N DE ADN PCRENTIEMPO INTERPRETACI N EXTRACCI N DE ADN VINEOTM REAL Opticon M riforma LA MUESTRA Extract DNA Kit VINEOTM 5 Ref 354 8100 Brettanomytest PCR ai Kit Ref 354 8101 CPX Manager IDE 3 COMPOSICI N DEL KIT Este kit contiene la cantidad de reactivos necesaria para 96 reacciones Tapones Denominaci n Reactivo Volumen Rosa Fluorescent probes Sondas fluorescentes 1 tubo 0 55 mL Blanco Amplification mix Soluci n de amplificaci n 2 tubos 2 x 2 2 mL Verde Negative PCR control Control negativo PCR 1 tubo 0 5 mL Rojo Positive Qs PCR control Control positivo Qs PCR 1 tubo 0 5 mL 4 CADUCIDAD Y CONSERVACI N Desde el momento de su recepci n el kit debe conservarse entre 2 C y 8 C Cada reactivo conservado entre 2 C y 8 C puede ser utilizado hasta la fecha de caducidad indicada en el tubo Nota No congelar los reactivos 5 EQUIPO Y MAT
58. s sur g lose 1 Piquer une colonie isol e partir d un milieu s lectif ou non l aide d un cure dent ou d une 0686 de 1 ul ou autre consommable adapt c ne pipette par exemple 2 Resuspendre la colonie dans 100 ul de R2 dans un tube de type Eppendorf il est possible de resuspendre la colonie dans de l eau physiologique st rile l efficacit PCR peut alors tre affect e Bien homog n iser la suspension l aide d un vortex 3 D poser 5 ul de la suspension dans 45 ul du m lange r actionnel PCR Cf partie 9 2 PCR en temps r el et suivre le reste de la m thode VINEOTM Brettanomytest PCR Kit pour l obtention et l interpr tation des r sultats Note seule une analyse qualitative est r alis e partir de la PCR effectu e sur cette suspension Le signal obtenu en PCR est souvent tr s lev car la quantit de cellules pr lev es et analys es par PCR avec cette m thode est tr s importante 13 PERFORMANCES DU TEST ET VALIDATIONS Le test VINEOTM Brettanomytest PCR Kit est sp cifique pour la d tection de Brettanomyces bruxellensis Il est possible de d tecter la levure partir de e 200 CFU mL de vin avec le protocole d extraction d ADN d crit dans le VINEOTM Extract DNA Kit sur 1 8 mL pour un mo t en fermentation ou un vin charg en cours de vinification ou d levage et e 10 CFU mL de vin selon le protocole partant de 45 mL pour un vin peu charg proche de l embouteillage ou d j mis en
59. sensibilit et de sp cificit Le diagnostic de la pr sence de cette levure doit permettre de d terminer quel niveau de risque se trouve le vin et comment volue ce risque dans le temps Ce risque est variable selon le niveau de contamination du vin Ainsi un outil de quantification adapt permet de d terminer si i la population est en faible quantit et donc que le risque est faible voire ma tris ii en quantit interm diaire ou critique dans ce cas le vin doit tre surveill un suivi r gulier s impose le vin peut tre trait ii et enfin si la population est tr s importante et dans ce cas le risque de production des ph nols volatils l est aussi une action imm diate et urgente s impose sur le vin Dans tous les cas un suivi r gulier est pr conis Il est important de suivre l volution des Brettanomyces bruxellensis au sein du vin VINEOTM Brettanomytest PCR Kit est un test quantitatif permettant la d tection sp cifique de Brettanomyces bruxellensis dans les vins et les mo ts en fermentation par la technique de polym risation en chaine en temps r el RT PCR Une s quence d ADN sp cifique de Brettanomyces bruxellensis est amplifi e et d tect e simultan ment gr ce a une sonde fluorescente La mise en uvre de ce test permet l obtention d un r sultat quantitatif moins de 3h apr s l extraction d ADN VINEOTM Extract DNA Kit 354 8100 Les logiciels d analyse adapt s ce test Opticon Monitor
60. ta tabella per determinare le quantit necessarie di sonde fluorescenti e soluzione di amplificazione per preparare la miscela di reazione di PCR Il calcolo del numero di campioni deve includere 2 controlli Qs PCR e il controllo negativo Numero Sonde i Soluzione di Numero Sonde Soluzione di di campioni fluorescenti ul amplificazione 04 di campioni fluorescenti pL amplificazione ul Tappo rosa Tappo bianco Tappo rosa Tappo bianco 1 5 40 49 265 2117 2 1 86 50 270 2160 3 16 130 51 275 2203 4 22 173 52 281 2246 5 27 216 53 286 2290 6 32 259 54 292 2333 Se 38 302 55 297 2376 8 43 346 56 302 2419 9 49 389 57 308 2462 10 54 432 58 313 2506 11 59 475 59 319 2549 12 65 518 60 324 2592 13 70 562 61 329 2635 14 76 605 62 335 2678 15 81 648 63 340 2722 16 86 691 64 346 2765 17 92 734 65 351 2808 18 97 778 66 356 2851 19 103 821 67 362 2894 20 108 864 68 367 2938 21 113 907 69 373 2981 22 119 950 70 378 3024 23 124 994 71 383 3067 24 130 1037 72 389 3110 25 135 1080 73 394 3154 26 140 1123 74 400 3197 27 146 1166 75 405 3240 28 151 1210 76 410 3283 29 157 1253 77 416 3326 30 162 1296 78 421 3370 31 167 1339 79 427 3413 32 173 1382 80 432 3456 33 178 1426 81 437 3499 34 184 1469 82 443 3542 35 189 1512 83 448 3586 36 194 1555 84 454 3629 37 200 1598 85 459 3672 38 205 1642 86 4
61. tto scrupoloso delle Buone Prassi di Laboratorio in particolare in materia di PCR Il materiale pipette provette ecc non deve circolare da una postazione di lavoro all altra indispensabile utilizzare un controllo positivo e un controllo negativo per ogni serie di reazioni di amplificazione Non utilizzare i reagenti oltre la data di scadenza Agitare con il vortex i reagenti del kit prima di utilizzarli n modo da lavorare con soluzioni omogenee Verificare l accuratezza e la precisione delle pipette e il corretto funzionamento degli strumenti Sostituire i guanti regolarmente e ogniqualvolta si ritiene che possano essere contaminati Pulire regolarmente le superfici di lavoro con candeggina al 5 e altri agenti quali DNA AWAY o RNase AWAY Indossare guanti non talcati per non lasciare impronte sulla pellicola ottica utilizzata per chiudere le micropiastre Non scrivere sui tappi delle provette PCR In entrambi i casi la registrazione dei dati da parte dell apparecchio pu risultare falsata 2010 Bio Rad Vi raccomandiamo vivamente di leggere l intero protocollo prima di iniziare il test Rispettare scrupolosamente il protocollo proposto 7 PRELIEVO E TRASPORTO DEI CAMPIONI campioni di vini vengono prelevati in condizioni di asepsi in recipienti sterili di vetro di polietilene o di materiale simile campioni devono essere consegnati al laboratorio il pi rapidamente possibile preferib
62. ugx of the internal control indicates that an inhibition phenomenon of the PCR reaction has probably occurred if the Cou of the target is also N A In this case the DNA sample must be diluted to 1 10 for example in sterile distilled water and then subjected to a new PCR If the Ctyex of the internal control is less than 28 it is impossible to interpret the result Check that the threshold was set correctly or that the raw curve shows an aspect characteristic of exponential amplification If the observed curve is not correct it will be necessary to repeat the PCR test for this sample O 2010 Bio Rad 9 Interpretation of results obtained for the samples Detection of Brettanomyces Detection of the internal Interpretation bruxellensis FAM control ct 10 Not significant Positive Ct N A CtHex gt 28 Negative Ct N A Ct N A Inhibition In the event of a null value for a sample and its internal control Ct N A the analysis must be done again with the diluted DNA sample diluted to 1 5 or to 1 10th for example A value less than 10 may be obtained check whether the curve as raw data shows an aspect that is characteristic of exponential amplification flat base line and regular increase in fluorescence followed by a plateau If the observed curve is correct the sample for the presence of Brettanomyces bruxellensis may be considered to be positive Otherwise the interpretation of the result
63. ul micropipettes e Multi distributor such as combitip pipettes Note We recommend using an uninterruptible power supply with the thermocycler O 2010 Bio Rad 5 Consumables e For the plates PCR tubes and stop caps White plates of 96 Low profile wells ref Bio Rad MLL 9651 White plates of 48 Low profile wells ref Bio Rad MLL 4851 Strips of 8 tubes of 200ul Low profile ref Bio Rad TLS 0851 Strips of 8 flat optical stop caps for tubes or plates of 0 2 mL wells 120 strips ref Bio Rad TCS 0803 Cones for Combitip or multi distributor sterile when packaged individually Cones with sterile filters that are adaptable to 10 uL 20 uL 100 uL 200 uL and 1000 uL micro pipettes 2mL and 5mL sterile tubes Non powdered latex or nitrile gloves Sterile distilled water 5 Chlorine Bleach Decontaminating agent such as DNA AWAY or RNAse AWAY 6 PRECAUTIONS AND RECOMMENDATIONS e This trial must be carried out by staff who have had adequate training e Result quality depends on scrupulous compliance with Laboratory Good Practice in particular in the area of PCR The equipment pipettes tubes etc must no go from one work station to another It is indispensable to use a positive and a negative control for each series of amplification reactions Do not use the reagents beyond their expiry date Subject the reagents in the kit to a vortex movement using the apparatus provided for this purpose before using the
64. uxellensis O 2010 Bio Rad 43 SOMMARIO 1 INTRODUZIONE 2 PRINCIPIO DEL VINEOTM Brettanomytest PCR Kit 3 COMPOSIZIONE DEL KIT 4 PERIODO DI VALIDIT E CONSERVAZIONE 5 ATTREZZATURA E MATERIALE NECESSARI NON FORNITI 6 PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI 7 PRELIEVO E TRASPORTO DEI CAMPIONI 8 ESTRAZIONE DEL DNA 9 PCR IN TEMPO REALE 10 ANALISI DEI DATI 11 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 12 PROTOCOLLO DI CONFERMA A PARTIRE DA COLONIE ISOLATE 13 PRESTAZIONI DEL TEST E VALIDAZIONI ALLEGATO A TABELLA DI PREPARAZIONE DELLA MISCELA DI REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE PCR ALLEGATO B PIANO DI PIASTRA DA UTILIZZARE SUI TERMOCICLATORI Chromo4 O CFX96 ALLEGATO C PIANO DI PIASTRA DA UTILIZZARE SUL TERMOCICLATORE MiniOpticonTM 44 2010 Bio Rad 1 INTRODUZIONE Brettanomyces bruxellensis un lievito responsabile della presenza di 4 etilfenolo e 4 etilguaiacolo nelle bevande quali vini succhi di frutta e birre che comporta importanti perdite a livello economico Nei vini la sua presenza difficile da rilevare attraverso i metodi di coltura classici che sono lunghi e non specifici La rilevazione rapida specifica e precoce di questo lievito nel procedimento di elaborazione dei vini consentirebbe tuttavia all enologo e al produttore di adottare delle misure preventive e di eliminarlo prima della comparsa del carattere fenolato caratteristico dell alterazione causata da questo lievito In confronto

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