Trousses HISTO TYPE SSP C0123
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1. Contenu contient HLA TYPING D stin au Typage HLA IFU Notice d utilisation IVD D stin une utilisation in vitro LOT N de Lot PCRBUF 10x Tampon PCR concentr 10 x PCRCAP Couvercles pour barrettes PCR PCRFOIL Films de scellage pour barettes PCR PCRPLATE Plaques pour PCR PCRSTRIP Barrettes pour PCR REACTIONMIX Mix initial REF Code produit WORKSHEET Feuille d interpr tation N B pour les Notices d utilisation en d autres langues veuillez utiliser ce lien http www bag healthcare com en Diagnostika Downloads 11 sur 112. cessaire d optimiser ces param tres d amplification du fait que les thermocycleurs de diff rents fabricants fonctionnent souvent diff remment voire un instrument du m me type peut aussi montrer des performances diff rentes Nous rappelons qu il est n cessaire de v rifier et le cas ch ant param trer tout autre appareil optimisation des param tres d amplification si n cessaire et que la validation du mat riel par l utilisateur est n cessaire avant toute utilisation Pour optimiser le protocole sur votre appareil utiliser les consignes suivantes a en cas de r sultats faussement positifs bandes non sp cifiques suppl mentaires augmenter la temp rature d hybridation par pas de 1 C b en cas de r sultats faussement n gatifs bandes manquantes r duire la temp rature d hybridation par pas de 1 C et ou augmenter les dur es d hybridation par pas de 5 secondes et ou augmenter les dur es de d naturation par pas de 5 secondes Il est recommand d utiliser des thermocycleurs r guli rement calibr s Pour contr ler la calibration de votre thermocycleur notre produit CYCLER CHECK R f 7104 est particuli rement adapt e N B nous r alisons r guli rement le contr le de tous les appareils utilis s par notre d partement Contr le de Qualit soit les syst mes PTC 200 PTC 100 MJ Research 9700 AB Mastercycler epGradient S Eppendorf et Tprofessional Biometra 7 sur 11 lectrophor
3. s faibles chelle ADN invisible Le fond du gel est trop clair Dur e de coloration trop longue Tremper le gel dans de l eau ou concentration en EtBr trop lev e du TBE r duire la concentration en EtBr Bande floue Tampon d lectrophor se trop chaud R duire la tension utiliser du ou puis mauvaise composition tampon TBE 0 5x du tampon d lectrophor se ou encore polym risation insuffisant du gel X Si l quipement et les mat riels utilis s sont ceux propos s dans cette notice l optimisation des param tres d amplification ne doit tre envisag e qu en dernier ressort Dans la plupart des cas il est possible d valuer le test sans tenir compte des bandes suppl mentaires de taille discordante 10 sur 11 7 Oo BB NN Bibliographie Bodmer J 1993 Immunogenetics 37 79 94 Olerup O Zetterquist H 1992 Tissue Antigens 39 225 235 Olerup O Zetterquist H 1993 Tissue Antigens 41 55 56 Lu Y H and N gre S 1993 Trends in Genetics 9 297 Maniatis et al 1989 Molecular Cloning A Laboratory Manual New York Cold Spring Harbour Laboratory Beutler E et al 1990 BioTechniques 9 166 Bunce M 1995 Tissue Antigens 46 355 367 Explication des symboles utilis s sur les emballages Temp rature de conservation Utiliser avant Consulter le mode d emploi Suffisant pour n tests JET
4. amplification n est obtenue que si les amorces correspondent en totalit la s quence cible Elle est ensuite visualis e par lectrophor se sur gel d agarose omne ou m Appariement parfait amplification Mismatch gt pas d amplification all le sp cifique all le non sp cifique Figure 1 principe de la PCR SSP La composition des m langes individuels d amorces permet une identification claire des types HLA indiqu s sur les diagrammes d valuation respectifs Chaque typage utilise un certain nombre 24 ou 96 de m langes r actionnels pr aliquot s et s ch s d un volume final de 10 uL et comprenant un contr le interne d amplification 2 Mat riel 2 1 Contenu des trousses HISTO TYPE SSP 20 plaques HISTO TYPE permettant 20 typages HLA Les m langes r actionnels pr aliquot s et s ch s sont compos s des amorces sp cifiques de l all le des amorces du contr le interne sp cifique du g ne humain G3PDH et de nucl otides Le premier m lange r actionnel n 1 est marqu consulter page 7 pour le sch ma des m langes Dans certaines trousses HISTO TYPE le contr le de contamination se situe sur le dernier emplacement de la plaque consulter la table de sp cificit et la table d interpr tation sp cifiques du lot Le num ro du lot est imprim sur chaque plaque barrette 2 sur 11 3 barrettes 8x de contr les de contamination contenant les amorces du contr le intern
5. I en vigueur doivent tre respect es de mani re r duire le risque de typages 4 sur 11 erron s et tout particuli rement dans le cas o des r sultats discordants entre la s rologie et la m thode de g n tique mol culaire sont observ s Des conditions particuli res de s curit doivent tre respect es pour viter la contamination et donc les fausses r actions Porter des gants pour manipuler sans poudre si possible Utiliser de nouveaux embouts pour chaque tape de pipetage avec un filtre int gr Utiliser des zones de travail s par es pour les t ches avant l amplification isolement de l ADN et pr paration des r actions et apr s l amplification lectrophor se sur gel documentation De pr f rence utiliser deux pi ces diff rentes Utiliser les dispositifs et autres mat riels uniquement leur place respective et ne pas les changer 4 2 Isolement de l ADN Le typage HLA SSP d un patient n cessite 5 10 ug d ADN correspondant environ 0 5 mL de sang La trousse BAG EXTRA GENE est particuli rement adapt e pour l isolement puisque un ADN pur peut tre obtenu rapidement partir du sang total sans utiliser de produits chimiques ni de solvants toxiques D autres m thodes commerciales bas es sur des techniques mettant en uvre des colonnes ou des billes magn tiques ou des techniques d crites dans la litt rature 5 comme la m thode au CTAB bromure de c tyl tri m
6. O BAG eam care Notice utilisateur Trousses HISTO TYPE SSP CE nz Trousses de test pour le typage tissulaire des all les HLA Classe HLA A B C et Classe II HLA DR DQ par technique de biologie mol culaire IVD 20 typages pr ts l emploi pr aliquot s R F 70721 HISTO TYPE A low rouge R F 70731 HISTO TYPE B low blanc R F 70741 HISTO TYPE C low jaune R F 70751 HISTO TYPE DR low violet R F 70891 HISTO TYPE DQB low blanc R F 7098 HISTO TYPE A B DR blanc R F 7102 HISTO TYPE A B C bleu R F 7103 HISTO TYPE DR DQ blanc R F 709010 HISTO TYPE DQB high bleu R F 70903 HISTO TYPE DQB1 03 violet Table des mati res 1 Description du POIL nn deniers ete 2 PE EC EEE 2 2 1 Contenu des trousses HISTO TYPE SSP irrnnnretenslnen petis sense 2 2 2 Mat riel suppl mentaire n cessaire ssssnennsnnrnneesseererrrrnressrrrrnnrtsstrrrnrrnnnrsseresernnr nnne 3 2 3 CONSOMAlION LSIADINI nie ne nee doneiteners tiennateneese 4 3 Donn es de performance sise 4 4 Protocole ce a 4 4 1 Conditions de s curit et remarques sp cifiques 4 4 2 Isolement de ADN 2 5 4 30 AMPICAUON PPS E ee 5 Electrophor se Cross AN NS Nes 8 4 4 Documentation et int rpr talion ssssusssasssensnsansenmentanenmmenensennaimenerninants 8 5 Avertissements et traitement des d chets sssneseesseseenerrnrtesstrtrtrrnrrtnsrrttnrrnnnrsserrnnrnnnerenet 9 6 D pannage e
7. cule de type 667 Choisir le temps d exposition et l ouverture pour que les bandes soient bien nettes et se d tachent du fond sombre donn es approximatives ouverture 11 temps d exposition 1 seconde Pour l interpr tation utiliser le tableau de sp cificit et le diagramme d valuation voir feuille suppl mentaire Seules les bandes ayant la taille correcte par rapport l chelle ADN doivent tre consid r es positives Les tailles correctes sont indiqu es dans le tableau et le diagramme Dans toutes les pistes sans amplification sp cifique d all le le contr le interne de 1 070 pb doit tre clairement visible Dans la plupart des pistes avec une amplification sp cifique d all le le contr le interne est plus faible ou dispara t compl tement En cas de r sultats incorrects consulter le guide de d pannage paragraphe 6 Aucune bande ne doit tre visible sur le contr le de contamination En cas de contamination avec de l ADN g nomique une bande est visible 282 pb Des bandes suppl mentaires peuvent tre pr sentes 78 pb 104 pb 176 pb et autour de 580 pb En cas de contamination avec les amplicons des bandes sont visibles 78 pb et ou 104 pb et ou 282 pb L interpr tation peut se faire l aide de l application HISTO MATCH BAG Healthcare ou en utilisant le logiciel SCORE largement distribu travers le monde 8 sur 11 5 Avertissements et traitement des d chets Le bromure d thidium
8. de capot ferm troitement il est galement possible d utiliser des tapis de silicone r utilisables Agiter l g rement la plaque vers le bas pour dissoudre le r sidu bleu situ au fond de la cupule Toute la solution PCR doit se d poser au fond de la cupule 6 sur 11 4 Placer les tubes r actionnels dans le thermocycleur et bien serrer le couvercle pour que les cupules r actionnelles ne se d forment pas la chaleur Lancer le programme PCR Il n est pas n cessaire de recouvrir les m langes r actionnels avec de l huile min rale en pr sence d un couvercle chauffant et ajust Param tres d amplification tape de programme Te Dur e Nb de cycles Thermocycleurs valid s Premi re d naturation 96 __ 5mn 1 cyoe PTC 100 200 C1000 MJR h BioR a Resear BBRA Hybridation 68 ME Lu mn GeneAmp PCR System 9600 amp 9700 SHARE N B veuillez utiliser la vitesse de as fo cycles mont e en temp rature du pan ju mod le classique 9600 Hybridation 64 C s S ABI Life Technologies zz s Mastercycler epGradient S N B veuillez utiliser la fonction pman fee ss Extension 72 ze 45s S Extension finale 72 C 5 mn 1 cycle Tprofessional Biometra simulate Mastercycler gradient Eppendorf pus iso lors de l usage de thermocycleurs vitesse tr s rapide de mont e et descente en ne LUie il est recommand de r duire ces vitesses Il peut tre n
9. e ee 10 Ie BIDIO PAPIER a a a 11 8 Explication des symboles utilis s sur les emballages 0nnnnnnnnneeneeeeeeee eneee nnn nenene 11 Version 9 2013 Distribu en Belgique en France au Luxembourg et en Suisse par m diane diagnostics Z A de la Cha ne 78370 PLAISIR 33 1 30 07 50 60 info mediane diag fr AG Health Care GmbH Auftragsannahme Ordering Customer Service AmtsgerichtsstraRe 1 5 Tel 49 0 6404 925 0 www bag healthcare com Tel 49 0 6404 925 450 Tel 49 0 6404 925 125 35423 Lich Germany Fax 49 0 6404 925 250 info bag healthcare com Fax 49 0 6404 925 460 Fax 49 0 6404 925 421 verkauf bag healthcare com service bag healthcare com 1 Description du produit Le typage HLA a fait beaucoup de progr s r cemment gr ce l utilisation de la PCR Polymerase Chain Reaction Le s quen age des all les HLA 1 facilite le typage sans ambigu t au niveau de l ADN avec une haute r solution et pr sente de nombreux avantages par rapport aux m thodes s rologiques traditionnellement utilis es L ADN purifi constitue le mat riau de base du typage avec les trousses HISTO TYPE SSP Le test est r alis par PCR SSP PCR par amorces sp cifiques de s quence ou Sequence Specific Primers voir figure 1 2 3 Cette m thode est bas e sur le fait que l extension de l amorce et donc la r ussite de la PCR repose sur l appariement exact de l extr mit 3 des deux amorces Donc l
10. e et les amorces sp cifiques de l amplicon ne sont pas jointes aux trousses o le contr le de contamination est int gr au dernier emplacement de la plaque PCR Tampon PCR 10x en quantit suffisante pour 20 typages Bouchons de barrette ou opercules PCR en quantit suffisante pour 20 typages Notice d utilisation table de sp cificit table d interpr tation et fiche de travail Mat riel suppl mentaire n cessaire Enzyme Taq Polym rase 5 U uL par exemple HISTO TAQ R f 70975 N B n utiliser en aucun cas une Taq Polym rase de qualit hot starf Trousse d extraction d ADN par exemple BAG EXTRA GENE R f 7059 pour une extraction manuelle d ADN partir de sang lymphocytes leucocytes ou autre mat riel ou d autres m thodes d extraction d ADN valid es Pipettes piston 0 5 250 uL Embouts st riles avec filtre int gr Thermocycleur par_ exemple PTC 200 MJ Research BioRad quip d un couvercle chauffant et ajustable N B veuillez consulter la liste des thermocycleurs valid s par nos soins page 7 Dispositifs et mat riel pour l lectrophor se sur gel Agarose qualit biologie mol culaire Tampon TBE 0 5x Tris 45 mM acide borique 45 mM EDTA 0 5 mM Bromure d thidium EtBr Appareil d lectrophor se gel immerg au moins 25 puits G n rateur lectrique 200 300 V 200 mA chelle de P M p ex R f 7097 Dispositifs pour l interpr tatio
11. est un agent mutag ne puissant Porter des gants pour manipuler les gels ou les solutions contenant de lEtBr Noter les instructions d utilisation et les avertissements et pr cautions du fabricant Le transilluminateur met une lumi re UV longueur d onde tr s courte qui peut provoquer des br lures de la peau et de la r tine Utiliser un masque facial anti UV Tous les produits biologiques utilis s pour l extraction d ADN par exemple le sang ou un tissu humain doivent tre manipul s comme des substances potentiellement infectieuses Il est recommand de respecter les pr cautions de s curit adapt es pour manipuler les produits biologiques ne pas pipeter la bouche utiliser des gants jetables pour manipuler les produits biologiques et r aliser le test se d sinfecter les mains une fois le test termin Les produits biologiques doivent tre inactiv s avant leur limination ex dans un autoclave Les produits jetables doivent tre autoclav s ou incin r s apr s usage Un renversement de produits potentiellement infectieux doit tre ramass imm diatement avec du papier absorbant et les zones contamin es doivent tre nettoy es avec un d sinfectant standard adapt ou avec de l alcool 70 Les mat riels utilis s pour nettoyer les renversements y compris les gants doivent tre inactiv s avant leur limination ex dans un autoclave 9 sur 11 6 D pannage Probl me Raison possible Pas d amplificat
12. ion chelle ADN contamin par des inhibiteurs de R isoler l ADN essayer d autres ADN visible PCR m thodes Concentration en ADN trop lev e ou trop faible r isoler l ADN Enzyme absente ou en concentration trop faible concentration de l enzyme recueilli sur EDTA ou citrate Param tres d amplification incorrects Optimiser les param tres d amplification voir 4 3 chec r p t sur certaines Fuite dans les tubes r actionnels Bien fermer les tubes avec les pistes pas sur le contr le perte d eau et modification de la bouchons utiliser d autres tubes concentration au cours de la PCR r actionnels Amplification non sp cifique Contamination par les produits Refaire le typage en suivant le bandes suppl mentaires les d amplification protocole exact bandes suppl mentaires ADN contamin par des sels R isoler l ADN essayer d autres d une taille non significative m thodes doivent tre n glig es Concentration en ADN trop lev e Utiliser moins d ADN Concentration en enzyme trop lev e Utiliser moins d enzyme Param tres d amplification incorrects Optimiser les param tres d amplification voir 4 3 Le r sultat donne plus de Contamination crois e produits V rifier les m langes de typage 2 sp cificit s d amplification nouvel all le pas d ADN ajout appliquer le protocole exact Pas de bandes visibles ou Coloration l EtBr trop faible Refaire la coloration bandes tr
13. n et la documentation Table UV transilluminante 220 310 nm Syst me d acquisition d image par exemple appareil photo Polaro d avec films 667 ou un syst me vid o avec imprimante par exemple le mod le KP65HM CE Si possible un logiciel d aide l interpr tation install sur son PC par exemple application HISTO MATCH de BAG Healthcare ou le logiciel SCORE largement distribu travers le monde 3 sur 11 2 3 Conservation et stabilit La trousse est livr e dans un emballage ne contenant pas de r frig rant non congel e Apr s r ception conserver tous les r actifs entre 20 et 80 l obscurit La date de p remption est indiqu e sur l tiquette de chaque r actif Elle est elle reste galement valable une fois les r actifs ouverts La date de p remption indiqu e sur l tiquette externe correspond au r actif ayant la validit la plus courte dans la trousse D congeler le tampon PCR 10x peu de temps avant utilisation 3 Donn es de performance La composition de tous les m langes d amorces a t faite pour garantir une identification fiable des g notypes HLA ce choix repose sur les donn es de s quence le plus r cents list s sur les fiches d interpr tation fournis Les mises jour sont effectu es de fa on r guli re L exactitude et la reproductibilit concernant la sp cificit de chaque m lange d amorces ont t v rifi es pour chaque lot mis sur le march s
14. pule du contr le contenant du colorant rouge Ensuite ajouter la solution d ADN et distribuer le m lange initial dans les cupules r actionnelles pr aliquot es Tableau 1 Composition du m lange initial en fonction du nombre de m langes r actionnels Nb de Eau distill e Tampon PCR Solution ADN Taq Polymerase Volume total cupules 10x 25 40 ng uL 5 U L 1 7 1 2 0 08 10 uL 4 55 8 16 0 6 80 uL 8 69 10 20 0 8 100 uL 24 194 28 56 2 2 280 uL 30 235 34 68 2 7 340 uL 32 249 36 72 2 9 360 uL 48 360 52 104 4 2 520 uL 54 401 58 116 4 6 580 uL 56 415 60 120 4 8 600 uL 72 540 78 156 6 2 780 uL 80 595 86 172 6 9 860 uL 96 706 102 204 8 2 1020 uL gt Chaque m lange r actionnel doit contenir 50 80 ng d ADN Selon la concentration en ADN les quantit s d ADN et d eau doivent tre modifi es par exemple pour 24 m langes 28 0 uL de solution d ADN 50 ng pL et 222 uL d eau distill e 3 Homog n iser au Vortex et distribuer imm diatement 10 uL de ce m lange dans les cupules r actionnelles pr aliquot es et s ch es Marque D O Changer d embout apr s CR CR i chaque tape de distribution Bien fermer les tubes avec les bouchons respectifs S assurer de ne pas toucher la paroi interne des bouchons ni les bords sup rieurs des tubes avec les doigts pour viter les contaminations En cas d utilisation de thermocycleurs quip s
15. se sur gel La s paration des produits d amplification est r alis e par lectrophor se sur un gel horizontal d agarose Le tampon d lectrophor se recommand est le TBE 0 5x Tris 45 mM acide borique 45 mM EDTA 0 5 mM Le gel doit contenir une concentration de 2 0 2 5 d agarose Laisser le gel polym riser pendant au moins 30 minutes avant de d poser les chantillons Une fois l amplification termin e sortir les chantillons du thermocycleur et d poser soigneusement la totalit des m langes r actionnels sur chaque position du gel Ajouter en plus 10 uL de l chelle ADN pour la comparaison des tailles R aliser la s paration par lectrophor se 10 12 V cm avec une distance de 20 cm entre les lectrodes environ 200 240 V pendant 20 40 minutes Une fois l lectrophor se termin e le gel complet est color dans une solution de bromure d thidium EtBr environ 0 5 g mL d EtBr dans de l eau ou du tampon TBE pendant 30 40 minutes Il est galement possible d ajouter l EtBr 0 5 pg mL au tampon d lectrophor se ou au gel d agarose Au besoin l exc s d EtBr peut tre limin en immergeant le gel dans de l eau ou du tampon TBE 0 5x pendant 20 30 minutes 4 4 Documentation et interpr tation Pour la documentation visualiser l amplification PCR l aide d un transilluminateur UV 220 310 nm et photographier avec un appareil photo une pellicule et des filtres adapt s ex polaro d pelli
16. thylammonium ou encore une purification au ph nol chloroforme permettent d obtenir des ADN de puret s satisfaisantes La pr sence d h parine peut inhiber la PCR 6 De ce fait il est recommand d utiliser du sang recueilli sur EDTA ou sur citrate pour le typage Les ADN utilis s doivent disposer d un indice de puret rapport D O D O 280 qui est compris entre 1 5 et 2 0 4 3 Amplification Tous les m langes r actionnels pr aliquot s et s ch s contiennent d j les amorces sp cifiques d all le et de contr le ainsi que les nucl otides Ceux ci sont livr s s ch s dans la cupule r actionnelle Les param tres de l amplification sont optimis s pour travailler avec un volume final de 10 uL 1 Sortir le nombre n cessaire de plaques HISTO TYPE HLA SSP du cong lateur et d congeler le tampon PCR 10x temp rature ambiante 2 Pr parer le m lange initial compos de tampon PCR 10x de solution d ADN de Taq polym rase et d eau distill e et bien homog n iser vortex Les diff rentes trousses HISTO TYPE SSP utilisent toutes le m me m lange initial et peuvent de ce 5 sur 11 fait tre combin es La composition du m lange initial en fonction du nombre de m langes r actionnels est indiqu e dans le tableau 1 page 6 Dans le cas d une r alisation d un contr le de contamination r aliser tout d abord le m lange initial sans la solution d ADN et distribuer 10 uL de ce m lange dans la cu
17. ur un panel d ADN connus chantillons de r f rence dont le typage HLA est parfaitement connu Les all les qui n ont pas t list s car ils n ont pas t test s du fait de leur raret sont identifi s sur la fiche d interpr tation et la fiche des sp cificit s Une tude de performance a t r alis e sur toutes les trousses HISTO TYPE SSP mettant en uvre un minimum 50 chantillons d ADN Un autre aspect de cette tude concerne la comparaison des r sultats de typage aux typages r alis s avec des trousses SSP d autres fabricants aucune discordance nma t constat e lors de ces comparaisons Les tudes de performance et tout contr le de qualit des amorces contenus dans nos kits ont t effectu s avec des ADN qui ont t isol s soit l aide du kit EXTRA GENE ou encore par une technique de marque Quiagen Les Taq Polym rases utilis es sont soit la HISTO TAQ R f 70975 ou la Taq Polym rase R f de la soci t Quiagen Un typage fiable est garanti condition d utiliser une quantit d ADN qui est comprise entre 50 80 ng m lange r actionnel 4 Protocole 4 1 Conditions de s curit et remarques sp cifiques La PCR est une m thode particuli rement sensible qui doit tre r alis e par du personnel bien form ayant l exp rience des techniques de g n tique mol culaire et des tests d histocompatibilit Les directives concernant la transplantation ainsi que les normes EFI DG
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