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détermination de l`impact du pentachlorophénol sur la diversité

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1. for yy 1 Longueur Miscall Miscall 10 Qualite yy 10 end Qmoy mean Qualite C6 i Debut Longueur GC Qmoy Int1 Int2 Int3 Int4 Int5 Int6 Int7 Int8 Int9 Int10 Int11 Int12 Int13 Int14 Int15 Int16 Int17 Int18 Int19 Int20 Miscall end end break 268 elseif sum Seq1 Ec7 gt NumMin if length Sequence Debut end gt 1 if length Sequence Debut end lt 250 Ech7 E7 1 Header Structure i Header Ech7 E7 1 Sequence Sequence Debut end Qual7 E7 1 Header Quality i Header Qual7 E7 1 Sequence num2str Qualite Debut end E7 E7 1 Sequence Sequence Debut end Qualite Qualite Debut end gt Il v 0 0 0 0 QQHD Il Il gt Calcul du GC for j 1 length Sequence if strempi Sequence j A 1 A A elseif strempi Sequence j T 1 T T 1 elseif strempi Sequence j G G G elseif strempi Sequence j C C C 1 end end GC G C A T G C Longueur length Sequence Intl 0 Int2 0 Int3 0 Int4 0 Int5 0 Int6 0 Int7 0 Int8 0 Int9 0 Int10 0 Int11 0 Int12 0 Int13 0 Int14 0 Int15 0 Int16 0 Int17 0 Int18 0 Int19 0 Int20 0 for xx 1 Longueur if Qualite xx lt 1 Intl Int1 1 elseif Qualite xx Int2 Int2 1 elseif Qualite xx Int3 Int3 1 elseif Qualite xx 4 Int4 Int4 1 elseif Qualite xx Int5 Int5 1 elseif Qualite
2. 19 Figure 1 5 Repr sentation sch matique des r gions conserv es et hypervariables V1 V9 du g ne 16S bact rien tir de http www alimetrics net en index php dna sequence analysis cssccccccesssccecesssseeeeeessseeeeesaeees 23 Figure 1 6 Principe g n ral de l amplification PCR La premi re tape la d naturation se r alise haute temp rature et permet de s parer l ADN double brin en 2 brins simples compl mentaires La deuxi me tape l hybridation permet aux amorces d aller se coller un endroit sp cifique sur les brins d ADN Finalement l tape d longation permet la Taq polym rase de prolonger les brins d ADN partir de la fin des amorces Le processus est r p t entre 30 et 40 fois chaque r p tition permettant th oriquement de multiplier par 2 le nombre de brins d ADN dans l chantillon tir de http users ugent be avierstr principles pcr html 25 Figure 1 7 Gauche Principe g n ral du DGGE tir de Temmerman et al 2004 Droite Gel DGGE exp rimental Figure 3 1 Profil DGGE et courbe d intensit lumineuse en niveaux de gris associ e Sur le graphique la courbe visible une intensit lumineuse de 4 10 correspond un profil DGGE o un chantillon PCR ne contenant pas d ADN a t inject Afin de faciliter l analyse les images de gels DGGE sont redimensionn es en utilisant un facteur de 10 10 240 pixels au lieu de 1024 Il a effec
3. Titre Contamination artificielle de sols au pentachloroph nol PCP Mots cl s sol pentachloroph nol contamination dichlorom thane agitation par culbutage OBJECTIF Ce protocole a pour objectif principal d laborer une proc dure de contamination artificielle adapt aux contaminants qui sont peu solubles dans l eau L objectif est que la contamination soit la plus 197 homog ne possible Dans le cadre de ce projet le PCP sera utilis Deux sols diff rents seront contamin s 198 MATERIEL Pentachloroph nol PCP Sigma 87 86 5 Ac tone Fisher A18 4 Hexane CAS no 110 54 3 Dichlorom thane Aldrich 27056 3 Eau d ionis e Sols Bouteilles ambr es munies de bouchons dont l int rieur est recouvert d une membrane de Teflon nombre et volume des bouteilles 4 d terminer selon les masses de sol requises Bouteilles s rologiques de 60 mL Bouchons 4 sertir en Teflon Balance PB3002 pour le sol pr cision 0 01 g Balance pr cision 0 0001 g Spatules m talliques Mortier en c ramique Hotte chimique Gants de latex ou de nitrile Seringue Hamilton de 5 mL Pipette en verre de 25 mL Agitateur m canique par culbutage METHODOLOGIE Pr paration du sol l D terminer la capacit de r tention d eau au champ de l chantillon selon le protocole PSO A23 199 Calcul de la CRC CR g eau EM T sol satur en eau Msol se
4. 174 3 3 2 Solutions d acrylamide 8 avec 80 d ur e d naturant 25 ml 1 A l aide d une pipette gradu e pr lever 5 ml d acrylamide bis 37 5 1 40 et transf rer dans un b cher de 100 ml 2 l aide d une pipette P1000 pr lever 500 ul de solution TAE 50X et transf rer dans le b cher 3 l aide d une pipette gradu e de 10 ml pr lever 8 ml de formamide d ionis d congeler s il en reste mais ne pas recongeler bon pour une semaine 4 C et transf rer dans le b cher 4 A la balance peser 8 4g d ur e dans une coupelle et transf rer dans le b cher 5 Ajouter un barreau magn tique dans le b cher 6 Ajouter environ 2 ml d eau d ionis e en prenant soin de laver la coupelle qui contenait l ur e dans le b cher 7 Agiter jusqu dissolution environ 30 minutes 8 Transf rer dans un ballon jaug de 25 ml et compl ter la jauge avec de l eau d ionis e 9 Avec une seringue de 30ml filtrer la solution avec un filtre millipore 0 45um dans un tube centrifuger de 50ml Si la solution est utilis e le jour m me pour la pr paration du gel 10 Placer le tube dans de la glace et y conserver la solution jusqu son utilisation Si la solution est pr par e en avance 11 D gazer dans une chambre ana robie placer le b cher dans la chambre agitateur magn tique dans la solution placer la chambre sur une plaque agitatrice fermer la chambre herm tiquement et mettre sous vide 12
5. Based on these objectives an analytical approach was developed on in silico DGGE profiles using the software Matlab Unlike commercial software programs that use a virtual rolling disk to subtract the DGGE profile background noise this framework uses a background profile manually adjusted by the analyst This background noise is used to define a new parameter the peak to signal ratio that was proved to be related to community richness Then the information about the relative abundance of the dominant species is extracted using a semi automated algorithm thus facilitating the analysis of complex DGGE profiles Using the information extracted from the profiles an empirical framework allowing the accurate estimation of the diversity of soil bacterial communities was developed The partial rank abundance distributions produced by the DGGE bands quantification step are first of all normalized using the peak to signal ratios extracted from the profiles Then using the power law abundance model an elongation model was parameterized using the complete rank abundance distributions used to synthesize the in silico DGGE profiles Because the model parameters depend on the peak to signal ratios the elongation process is therefore sample specific To further validate this elongation model the diversity of the bacterial communities of eight different soil samples were studied using both DGGE profiling and Ion Torrent sequencing a next generatio
6. Figure 3 3 R sultats produits par l algorithme de quantification des pics DGGE la gauche de la figure se trouve la portion de profil analyser L information par rapport la position des pics est d termin e directement partir du profil analys et est entr e dans une boite de dialogue droite de la figure L algorithme optimise alors les param tres des distributions correspondant chaque pic et pr sente les r sultats sur un graphique Les r sultats peuvent tre accept s ou rejet s 44 CHAPITRE 4 DEVELOPPEMENT D UNE M THODOLOGIE PERMETTANT DE QUANTIFIER LA DIVERSIT DES COMMUNAUT S BACT RIENNES DES SOLS PARTIR DU DGGE Cette section est centr e autour du premier manuscrit intitul new framework to accurately quantify soil bacterial community diversity from DGGE section 4 2 publi dans la revue Microbial Ecology soumis le 19 d cembre 2012 accept le 11 avril 2013 4 1 Pr sentation du premier manuscrit Plusieurs logiciels commerciaux sont disponibles afin d analyser les gels DGGE En communiquant avec les d veloppeurs de ces logiciels il est possible de r aliser que ces derniers n ont pas t d velopp s sp cifiquement afin d analyser des profils complexes L approche analytique pr sent e au chapitre 3 a t d velopp dans le but de contourner ces difficult s et permettre l analyse de profils DGGE complexes Afin de prouver son utilit ce manuscrit vise com
7. Peser 3 6525 g de NaCl dans une coupelle et transf rer dans le b cher de 25 ml Ajouter environ 20 ml H2O ajouter un barreau magn tique et agiter sur une plaque magn tique jusqu dissolution complete Transf rer quantitativement dans un ballon de 25 ml et compl ter jusqu au trait jauge avec de l eau distill e Solution tampon TE 50mM TRIS HCI 10mM EDTA pH8 l 2 Peser 0 6057 g de TRIS et le transf rer dans un b cher de 100 ml Ajouter environ 80 ml H2O ajouter un barreau magn tique et agiter sur une plaque magn tique Ajuster le pH 8 l aide du pH m tre avec une solution de HCl 10 M Voir le PSO E3 pour l utilisation du pH m tre Peser 0 3722 g d EDTA dans une coupelle et transf rer dans le b cher de 100 ml et agiter jusqu dissolution compl te des solides Transf rer quantitativement dans un ballon de 100 ml et compl ter jusqu au trait jauge avec de l eau distill e Solution Chloroform isoamyl alcohol 24 1 l 2 Travailler sous la hotte chimique pour la pr paration de cette solution l aide d une pipette jaug e 4 ml mettre 4 ml d alcool isoamyl dans un ballon de 100 ml l aide d un cylindre gradu 100 ml ajouter le chloroforme dans le ballon de 100 ml et compl ter jusqu au trait de jauge Bouchonner le ballon de 100 ml et l inverser treize reprises 150 Solution Phenol Chloroform isoamyl alcohol 25 24 1 pH6 8 l
8. l aide de cette approche furent significativement corr l s ceux produits par l Ion Torrent D s lors il est possible de conclure que les indicateurs cotoxiques pr sent s dans cette th se sont aussi repr sentatifs que l ont t les tapes d extraction et d amplification d ADN Cette distinction est n cessaire et s applique toutes les approches bas es sur l tude et l amplification de l ADN extrait du sol De plus l utilit d indicateurs bas s sur la diversit bact rienne des sols a t test e Ces indicateurs se sont av r s beaucoup plus sensibles au PCP que certains indicateurs fonctionnels De plus les courbes concentration r ponse trac es partir des indices de diversit se sont av r es tr s semblables la SSD repr sentative de la sensibilit des communaut s biotiques terrestres expos es au PCP Si les observations faites pour le PCP peuvent tre g n ralis es ces indicateurs pourraient jouer un r le central dans la g n ration de connaissances quant l impact des contaminants ou des m langes complexes sur les cosyst mes terrestres Les sections suivantes r sument les diff rentes contributions apport es par les travaux pr sent s dans cette th se et donnent quelques orientations afin de poursuivre ces travaux Contributions scientifiques La pr sente th se a permis e De montrer que l approche Rolling disk ou Rolling ball n est pas adapt e a l analyse de profi
9. Tableau A3 3 Numerical values of the diversity indices calculated from the DGGE peaks with or without cut off or from the elongated RADs and compared to the true diversity of the samples at the 98 similarity level Index Sample DGGE peaks DGGE peaks Elongated True diversity no cut off cut off 1 0 RADs at 98 similarity FUG100 107 29 7887 7899 BF100 105 30 9974 9273 SAF100 88 31 5618 5612 2 FUG97 101 28 4822 5407 BF97 94 27 6988 6090 Z SAF97 91 30 3064 3274 FUG95 93 28 3310 3096 BF95 81 30 3181 3238 SAF95 80 30 2321 1779 FUG100 3 93 3 06 7 53 7 50 BF100 3 97 3 22 7 92 7 87 2 SAF100 3 96 3 29 7 15 7 01 z FUG97 3 96 3 08 6 95 6 87 E BF97 3 88 3 05 7 36 7 14 SAF97 3 94 3 25 6 47 6 14 Le FUG95 3 86 3 06 6 57 6 35 BF95 3 81 3 23 6 52 6 32 SAF95 3 89 3 23 5 91 5 52 FUG100 24 6 13 3 247 0 230 4 BF100 35 9 21 2 518 4 491 2 a SAF100 38 6 23 8 279 7 259 3 P FUG97 28 4 15 0 169 6 168 5 S BF97 29 9 16 9 260 8 265 5 SAF97 35 9 22 3 149 3 139 8 72 FUG95 26 4 15 0 126 3 130 4 BF95 31 9 21 6 151 1 149 5 SAF95 32 3 21 9 92 6 84 7 280 ANNEXE 4 R SULTATS SUPPL MENTAIRES ASSOCI S AU SECOND MANUSCRIT CHAPITRE 5 Tableau A4 1 Sequences corresponding to the Ion Torrent adaptors and multiplex identifiers MID used in this study Oligo ID Sequence 5 3 Adaptor A CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC Adaptor trP1 CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT LMcln MID CTAAGGTAAC LM300 MID
10. patrons de dominance d termin s partir des profils DGGE la base le DGGE a t d velopp 29 en tant qu outil de d tection de mutations et peut th oriquement s parer deux s quences d ADN qui diff rent par une seule paire de bases Myers Maniatis and Lerman 1987 Sheffield et al 1989 Par contre en proc dant au s quen age de l ADN contenu dans des bandes DGGE il a t clairement d montr que pour des communaut s tr s diversifi es les bandes DGGE contiennent une multitude de s quences d ADN diff rentes Schmalenberger and Tebbe 2003 L influence quantitative de cette co migration sur les tudes de diversit bas es sur le DGGE n a jamais t valu e La capacit du processus d analyse des profils estimer correctement l abondance relative des esp ces les plus abondantes n a jamais t d termin e non plus Les diff rents logiciels d analyse des gels ont majoritairement t d velopp s afin d analyser des profils relativement simples Dans un premier temps le bruit de fond est soustrait souvent l aide d une bille virtuelle ayant un diam tre choisi par l utilisateur qui roule sous le profil et qui soustraie le signal situ sous la bille Par la suite les bandes sont d limit es l aide de bornes lin aires manuellement positionn es ou encore l aide de distributions Gaussiennes Si cette m thodologie peut donner de bons r sultats pour des profils simples il pourrait en tre tout
11. 1 def O options Resize on options WindowStyle normal Modifier inputdlg prompt dlg titlejnum lines def options if strempi Modifier 1 N 0 amp amp strempi Modifier 1 0 0 Modifier end end while strempi Modifier 1 O 1 Type while size Type 1 0 prompt Souhaitez vous d finir un couloir de migration croche pas la verticale c ou d caler un des couloir s vers la droite ou vers la gauche d dlg title Type de probl me r gler num_lines 1 A c def A options Resize on options WindowStyle normal Type inputdlg prompt dlg_title num_lines def options if strempi Type 1 c 0 amp amp strempi Type 1 d 0 amp amp strempi Type 1 b 0 Type end end 220 if strempi Type 1 c Type while size Type 1 0 prompt Num ro de l chantillon un seul couloir la fois Pixels X de debut vecteur Pixels Y de debut correspondants vecteur Pixels X de d but au point le plus large Pixels X de fin au point le plus large dlg title Type de probl me r gler num lines 1 A num2str 0 B num2str 0 C num2str 0 D num2str 0 E num 2str 0 def A B C D E options Resize on options WindowStyle normal Type inputdlg prompt dlg_title num_lines def options if size Type 1 0 NoEch str2num Type 1 DebutX
12. 2 Travailler sous la hotte chimique pour la pr paration de cette solution Pr lever 25 ml de la solution Phenol Chloroform isoamyl alcohol 25 24 1 et transf rer dans un b cher de 25 ml Ajuster le pH 6 8 l aide du pH m tre avec une solution de HCI 10 M Voir le PSO E3 pour l utilisation du pH m tre Solution de phosphate de potassium 20 mM pH7 4 l 2 Peser 1 3600 g de KH2POA et le transf rer dans un b cher de 500 ml Ajouter environ 80 ml H2O ajouter un barreau magn tique et agiter sur une plaque magn tique Transf rer quantitativement dans un ballon de 500 ml et compl ter jusqu au trait jauge avec de l eau distill e Peser 5 4400 g de K2HPO4 et le transf rer dans un b cher de 2 Ajouter environ 1600 ml H2O ajouter un barreau magn tique et agiter sur une plaque magn tique Transf rer quantitativement dans un ballon de 2 1 et compl ter jusqu au trait jauge avec de l eau distill e Transf rer dans un b cher de 2 environ 250 ml de solution KH2POA et ajuster le pH 7 4 voir PSO E3 avec la solution de K2HPO4 Pour 500 ml de KH2POA il faudra normalement un peu moins de 2 1 de K2HPOA afin d arriver un pH de 7 4 Lorsque ce pH est atteint verser la solution obtenue dans une bouteille en verre de 2 1 Reprendre jusqu ce que toute la solution de KH2POA ait t utilis e Solution d ac tate de sodium 3M pH5 2 l 2 Peser 40 8240 g d ac t
13. ANNEXE S Figure A1 2 Appareil lectrophor se et son support 170 Centre Interuniversitaire de R f rence sur 4 CIRAIG l Analyse l Interpr tation et la Gestion du cycle de vie des produits proc d s et services PROTOCOLE EXP RIMENTAL Protocole PE71C Nombres de pages 17 Version 2 Date 05 02 12 Auteur s Jonathan Lalande Lucie Jean Genevi ve Plouffe Approuv par Signatures Date Richard Villemur Dx Manon Leduc c xX Sabria Defnoun x Titre Migration DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis du produit PCR amplifi partir de l ADN extrait d un sol Mots cl s ADN gradient d ur e gel electrophorese DGGE 171 OBJECTIF L objectif de la m thode vise effectuer un gel lectrophor se DGGE afin d obtenir un patron de migration pour l amplification du g ne 16S des procaryotes Ce g ne se retrouve chez tous les procaryotes Cependant la s quence varie selon le type de bact ries Cette variation de la s quence nous permet d obtenir des migrations diff rentes dans le gel DGGE d o l int r t d amplifier ce gene afin de faire le suivi d une flore microbienne dans un sol l tude MAT RIEL e Tubes microcentrifuges eppendorf 1 5 ml Fisher Scientific e Fioles de 25 ml e Pipette gradu e de 10 ml e Barreau magn tique et plaque agitatrice e Ur e Bio Rad cat 161 0731 e Solutio
14. Boucher le tube et vortexer 10 secondes l aide de la pipette automatique P5000 pr lever 1 ml de la solution vortex e et la transf rer dans un nouveau tube centrifugeuse jetable de 15 ml l aide de la pipette automatique P5000 lui ajouter 4 ml de tampon TE Boucher le tube et vortexer de nouveau pendant 10 secondes l aide de la pipette P5000 pr lever 4 ml de la solution obtenue l tape 5 et la transf rer dans un nouveau tube centrifugeuse jetable de 50 ml l aide d une pipette gradu e de 25 ml lui ajouter 16 ml de tampon TE Boucher et recouvrir le tube de 50 ml contenant la solution Hoechst 0 8 ug ml d un papier aluminium car cette solution r agit la lumi re et perd sa fluorescence 152 Pr paration des colonnes de PVPP Solution de PVPP 1 2 6 Peser 20 00 g de PVPP et le transf rer dans un b cher de 500 ml Ajouter 100 ml de HCL 3M Filtrer cette solution l aide d un entonnoir Buchner avec papier filtre Whatman 1 Laver le PVPP avec 500 ml d eau d ionis e Laver de nouveau avec 500 ml de tampon KPO4 20 mM pH 7 4 Transf rer le PVPP dans une bouteille propre et laisser s cher Pr paration des colonnes de PVPP l Transf rer le PVPP dans un b cher de 100 ml et ajouter 50 ml de tampon KPO 20 mM pH 7 4 Introduire environ 1 mm de laine dans une seringue Hamilton de 1 ml Dans un tube centrifuge de 15 ml introduire
15. pentachlorophenol This thesis allowed developing a complete framework allowing the comparison of soil bacterial community diversity using DGGE a widespread technique that was unable to do so before Furthermore it was shown that diversity based indicators were more sensitive to pentachlorophenol than some integrative functional indicators and that the response of soil bacterial communities to pentachlorophenol was highly similar to the response of macroscopic terrestrial communities exposed to the same substance If this similarity can be established for other contaminants or classes of contaminants this methodology has the potential to help fill many gaps in terrestrial ecotoxicological databases and in the understanding of the effect of xenobiotics or complex mixtures on terrestrial ecosystems And if these similarities are fortuitous the framework can still provide relevant information about the toxicity of xenobiotics to organisms poorly represented in the ecotoxicological databases soil bacterial archeal and fungal communities xvii TABLE DES MATI RES D DICACE m r EE EESE I AAAA AEE Il REMERCIEMENTS ia ced sas ie Midi cen vas doi canvas ces vat ces vas cetevcevlesceusescevtesceusevcevieeceutevceeceetees IV RESUME seircascciveciscsidesucsiteuiscoikesnctivastecsitasucsitascsibasuciidaduesecivcsusivevecaateaigevecsatvaigervesuaiveseciveuscives VI ABSTRACT E XII TABLE DES MATIERES 62202 atu vitto
16. 225 226 Nom du fichier AjustementBlanc m Description AjustementBlanc sert aller lire dans un fichier Excel de l information sur le bruit de fond et la position approximative de la racine des bandes d un profil DGGE En retour l algorithme produira un vecteur de bruit de fond ainsi qu un vecteur permettant de d limiter la r gion des pics Ces verteurs contiendront autant de points que le nombre de pixels en y du gel DGGE Auteur Jonathan Lalande clear all close all clc Fichier LectureImages xlsx Feuille Ph red tif Vecteur xlsread Fichier Feuille G1 G10240 A xlsread Fichier Feuille AG3 AH100 B xlsread Fichier Feuille AI3 AJ100 Longueur length Vecteur hold on figure 1 plot Vecteur plot A 1 AG 2 hold off option fitoptions Method PchipInterpolant Courbe feval fit A 1 A 2 pchipinterp option 1 Longueur option fitoptions Method PchipInterpolant Courbel feval fit B 1 B 2 pchipinterp option 1 Longueur Vecteurl Vecteur Courbel Paste Courbe Courbel figure 2 plot Vecteur1 AcceptationPic 227 while size AcceptationPic 1 0 while size AcceptationPic 1 0 prompt Charger ajouter des points O N dlg title Ajustement num_lines 1 def O options Resize on options WindowStyle normal AcceptationPic inputdlg prompt dlg title num lines
17. Biospec product no 110791012 147 Mini BeadBeater 8 Biospec Products mod le 693 Bartlesville Oklahoma Fluorom tre GENios TECAN coupl au logiciel Magellan TECAN Tubes microcentrifuges autoclavables 1 5 ml Fisher Brand no 05 669 30 et 2 ml Fisher Scientific no 05 407 25A Tubes en polypropyl ne avec bouchon vissable 2 ml pour Mini BeadBeater autoclavable Centrifugeuse IEC 21000R Needham Heights USA Micropipettes P1000 P200 P20 et P10ml Gilson Embouts a micropipettes st riles jaunes Fisher Brand no 21 197 8G et bleus Fisher Brand no21 197 8F Dispenseur huit canaux Nichiryo mod le 8800 Microplaque 96 puits Vortexeur Fisher Scientific vortex mod le g nie 2 no 12 812 N Y USA pH m tre Accumet mod le 25 pH ion meter lectrode Orion Research Inc Ross Sure flow Beverly U S A Spatules B chers 500 100 et 25 ml Ballons de 100 ml et 25 ml Cylindre gradu de 100 ml Pipette jaug e de 4 ml Pipette gradu e de 25 ml Erlenmeyer sous vide de 2 I Entonnoir Buchner et filtre whatman 1 Balance avec une pr cision de 0 0001 Mettler Toledo AB204 Switzerland Tubes a centrifuge st riles jetables de 15 ml Fisher Brand no 05 539 5 et 50 ml Fisher Brand no 05 539 6 Papier aluminium Bec br leur Pince Bain marie a 37 C 148 Glace Hotte chimique METHODOLOGIE Pr paration des solutions Solution tampon 0 2 he
18. Braman JC and Hogrefe HH 1996 PCR Fidelity of Pfu DNA Polymerase and Other Thermostable DNA Polymerases Nucleic Acids Research 24 18 3546 3551 doi 10 1093 nar 24 18 3546 Cole JR Chai B Farris RJ Wang Q Kulam SA McGarrell DM Tiedje JM 2005 The Ribosomal Database Project RDP II sequences and tools for high throughput rRNA analysis Nucleic Acids Research 33 suppl 1 D294 D296 doi 10 1093 nar gk1038 Cole JR Wang Q Cardenas E Fish J Chai B Farris RJ Tiedje JM 2009 The Ribosomal Database Project improved alignments and new tools for rRNA analysis Nucleic Acids Research 37 1 141 145 doi 10 1093 nar gkn879 Demanou J Sharma S Dorfler U Schroll R Pritsch K Njine T Schloter M 2006 Structural and functional diversity of soil microbial communities as a result of combined applications of copper and mefenoxam Soil Biology and Biochemistry 38 8 2381 2389 Demidenko E Williams BB Flood AB and Swartz HM 2012 Standard error of inverse prediction for dose response relationship approximate and exact statistical inference Statistics in Medicine Retrieved from http dx doi org 10 1002 sim 5668 doi 10 1002 sim 5668 Deng H 2012 A review of diversity stability relationship of soil microbial community What do we not know Journal of Environmental Sciences 24 6 1027 1035 doi http dx doi org 10 1016 S1001 0742 1 1 60846 2 Diez B Pedr s
19. DGGE peaks quantification and the extent of the bands clustering process were assessed To do so publicly available pyrosequencing datasets of soil bacterial communities Nacke et al 2011 were used to generate in silico DGGE profiles Knowing community composition made it possible to assess whether DGGE based diversity estimations can theoretically lead to similar conclusions than more robust methods based on DNA sequencing and clustering 48 4 2 3 Methods 4 2 3 1 In silico DGGE profiles construction In silico DGGE profiles were constructed using pyrosequencing datasets of soil bacterial communities downloaded from the NCBI Sequence Read Archive NCBI 2012 This methodology was selected to avoid the necessity of choosing a suitable theoretical model to derive the RADs used to create the profiles Datasets were generated using DNA extracted from six different soils and targeting the V2 V3 region of the bacterial 16S rRNA gene approximately 400 nt Nacke et al 2011 The sequences were processed by the authors to remove the primers and the regions presenting low quality scores and ranged in length between 200 and 300 nt Presenting different initial richness and dominance patterns three of these datasets were selected for further analysis FUG3 intensely fertilized grassland BF2 unmanaged beech forest and SAFI spruce forest Each dataset was aligned and clustered using three similarity levels 100 97 and 95 with the RDP py
20. E6 E61 Sequence Sequence Debut end Qualite Qualite Debut end A 0 T 0 266 C 0 G 0 Calcul du GC for j 1 length Sequence if strempi Sequence j A 1 A A elseif strempi Sequence j T 1 T T 1 elseif strempi Sequence j G 1 G G 1 elseif strempi Sequence j C 1 C C l end end GC G C A T G C Longueur length Sequence Intl 0 Int2 0 Int3 0 Int4 0 Int5 0 Int6 0 Int7 0 Int8 0 Int9 0 Int10 0 Int11 0 Int12 0 Int13 0 Int14 0 Int15 0 Int16 0 Int17 0 Int18 0 Int19 2 0 Int20 0 for xx 1 Longueur if Qualite xx lt 1 Intl Int1 1 elseif Qualite xx 2 Int2 Int2 1 elseif Qualite xx 3 Int3 Int3 1 elseif Qualite xx 4 267 Int4 Int4 1 elseif Qualite xx Int5 Int5 1 elseif Qualite xx Int6 Int6 1 elseif Qualite xx 7 Int7 Int7 1 elseif Qualite xx 8 Int8 Int8 1 elseif Qualite xx Int9 Int9 1 elseif Qualite xx Int10 Int10 1 elseif Qualite xx 11 Int1 1 Int117 1 elseif Qualite xx 12 Int12 Int12 1 elseif Qualite xx 12 Int13 Int13 1 elseif Qualite xx Int14 Int14 1 elseif Qualite xx Int15 Int15 1 elseif Qualite xx 16 Int16 Intl6 1 elseif Qualite xx 17 Int17 Int17 1 elseif Qualite xx Int18 coe elseif Qualite xx Int19 D else Int20 Int20 1 end end len len
21. Interestingly the LM and particularly S7 samples were not characterized by the same bright bands as the LMe and Sc samples This observation corresponds to a high PCP toxic effect not show by the DGGE profile The diversity increases observed for sample S and to a lesser extent LM when compared with Se and LM6 were associated with concentrations sufficiently high to affect the species generally able to degrade or tolerate PCP The diversity indices calculated for these samples were therefore excluded from the data fitting process 104 LMo LM4 LM LM LM4 LMs LMe LM So 4 Figure 6 1 DGGE migration profiles corresponding to the first replicate DNA samples extracted from soil LM and soil S were subjected to PCR for the amplification of 16S rRNA gene sequences the V3 variable region The amplicons were separated on 8 polyacrylamide DGGE with a 32 5 72 5 denaturant gradient The indices number in the sample names refer to the initial PCP concentrations in Tableau 6 2 The DGGE migration profiles were used to measure three bacterial diversity indices Simpson s 1 D Shannon exp and community richness The impact of PCP can be seen in the reduction of these indices Figure 6 2A B and C A reduction in the FDA hydrolytic activity was also noticed Figure 6 2D The four indices exhibited a typical sigmoidal response with increasing concentrations of PCP from which the ECso values the PCP concentrations causing a 5096 decre
22. Tir de Solomon et Takacs 2001 1 2 3 Particularit s des cosyst mes terrestres Les cosyst mes terrestres pr sentent plusieurs particularit s qui complexifient ou limitent grandement l application de l approche SSD Parmi ces l ments se trouve la question de la biodisponibilit des contaminants dans les sols La biodisponibilit est la mesure de la proportion d une contamination tant susceptible d tre ing r e absorb e ou en contact avec les organismes Elle module donc la toxicit d une substance dans un environnement donn Dans les sols il est reconnu que la forme biodisponible d un contaminant correspond la portion dissoute dans l eau interstitielle et non celle adsorb e sur les particules de sol Posthuma Suter II and Traas 2001 Les contaminants tr s hydrophobes ont tendance s adsorber sur certaines particules composant les sols et donc tre peu biodisponibles D s lors la composition d un sol notamment sa teneur en mati re organique est susceptible d influencer la toxicit de ces contaminants Par contre la 17 biodisponibilit exprim e via la portion dissoute d un contaminant n est pas syst matiquement apte pr dire la toxicit observ e des contaminants sur certains r cepteurs Lock De Schamphelaere and Janssen 2002 tant donn la variabilit des propri t s physico chimiques des sols autant localement qu plus grande chelle il est tr s probable
23. and Takacs P 2001 Probabilistic risk assessment using species sensitivity distributions In L Posthuma G W Suter II amp T P Traas Eds Species sensitivity distributions in ecotoxicology pp 285 313 Boca Raton Lewis Publisher Stackebrandt E and Goebel BM 1994 Taxonomic Note A Place for DNA DNA Reassociation and 16S rRNA Sequence Analysis in the Present Species Definition in Bacteriology International Journal of Systematic Bacteriology 44 4 846 849 doi 10 1099 00207713 44 4 846 Staley JT and Konopka A 1985 Measurement of in Situ Activities of Nonphotosynthetic Microorganisms in Aquatic and Terrestrial Habitats Annual Review of Microbiology 39 1 321 346 doi doi 10 1146 annurev mi 39 100185 001541 Stephan CE 2001 Use of species sensitivity distributions in the derivation of water quality criteria for aquatic life by the U S Environmental Protection Agency In L Posthuma G W Suter Il amp T P Traas Eds Species sensitivity distributions in ecotoxicology pp 211 220 Boca Raton Lewis Publisher Stres B and Tiedje J 2006 New Frontiers in Soil Microbiology How To Link Structure and Function of Microbial Communities In P Nannipieri amp K Smalla Eds Nucleic Acids and Proteins in Soil Vol 8 pp 1 22 Springer Berlin Heidelberg Sun B y Pan X r and Zhou F 2012 Species Sensitivity Distribution for Arsenic Toxicity on Plant Based on Soil Culture Data Implicati
24. dictions quant l volution de la biodiversit dans les cosyst mes naturels ne sont pas encourageantes Les facteurs ayant men aux changements actuellement observ s modification des habitats changements climatiques invasion par des esp ces trang res surexploitation et pollution sont soit stable dans le temps ne montrent aucun signe de ralentissement ou encore montrent des signes d augmentation Bien que tr s incertain le taux d extinction des esp ces pourrait dans un futur rapproch tre entre 10 et 100 fois sup rieur au taux actuellement observ Millenium Ecosystem Assessment 2005 Aux tats Unis environ le tiers des esp ces v g tales et animales est menac d extinction McCann 2000 et ces derni res pourraient disparaitre 1 1 2 Lien biodiversit fonction stabilit Le d clin de la biodiversit des cosyst mes est une certitude Butchart et al 2010 et les pr visions ne sont gu re plus encourageantes En quoi cela constitue t il un probl me Philosophiquement parlant savoir que l Humanit est directement responsable de la disparition d un nombre appr ciable d esp ces vivantes peut constituer un probl me thique Mais plus encore en adoptant une vision des plus anthropocentriste la recherche tend d montrer qu il existe un lien entre la biodiversit les fonctions assur es par les cosyst mes cycles biog ochimiques production biotique d toxification etc et la r si
25. es dans le Tableau A1 2 Tableau A1 2 D tail de l amplification pour les amorces 341f GCet 534r tape D tail D naturation initiale 94 C durant 90 secondes D naturation 94 C 10 secondes Appariement 67 5 C 62 5 C 0 5 C cycle 10 secondes longation 72 C 10 secondes Touchdown 10 cycles D naturation 94 C 10 secondes Amplification 20 30 cycles Appariement 62 5 C 10 secondes longation 72 C 10 secondes longation finale 72 C 5 minutes Hold 4 C ind finiment 166 V rification du produit PCR sur un gel d agarose 2 0 entre 1 5 et 2 l 10 11 12 13 A la balance peser dans une coupelle 0 8 g d agarose et transf rer dans un erlenmeyer de 250 ml l aide d un cylindre gradu de 50 ml mesurer un volume de 40 ml de la solution TAE 1X et l ajouter l erlenmeyer de 250 ml Faire chauffer la solution dans une micro onde d abord pendant environ 30 secondes Remuer l g rement l erlenmeyer Remettre dans la micro onde durant 20 secondes Remuer l g rement l erlenmeyer Remettre dans la micro onde durant 10 secondes Laisser refroidir l g rement la solution et y ajouter 0 75ul d une solution de bromure d thidium 10 mg ml Couler la solution chaude dans le support migration lectrophor se on doit mettre du ruban adh sif aux extr mit s du support pour maintenir la solution dans le support voir Figure A1 2 Fixer le peigne appropr
26. ine dans un ballon jaug de 10 mL 2 Ajuster jusqu au trait de jauge avec du tampon phosphate 60 mM pH 7 6 et bien agiter pour dissoudre la fluoresc ine M THODOLOGIE Les mesures sont effectu es en 4 tapes 1 Il faut pr parer le sol avec le substrat et l incuber 2 pr parer les dilutions de la solution standard de fluoresc ine afin de tracer une courbe standard 3 stopper la r action l aide d ac tone 4 pr parer le filtrat qui contient le produit de l hydrolyse du substrat FDA et 5 mesurer l absorbance des chantillons Pr paration du sol et incubation avec substrat 1 Dans des erlenmeyers de 125 mL pr alablement identifi s peser 1 g de sol et noter la masse exacte dans votre cahier de laboratoire 2 Ne pas oublier de pr parer les blancs de m thodes appropri s erlenmeyer sans sol mais avec substrat FDA et erlenmeyer avec sol mais sans substrat FDA 3 l aide d une dispensette pr alablement calibr e ajouter dans chaque erlenmeyer 50 mL de tampon phosphate 4 l aide d une pipette P1000 ajouter dans chaque erlenmeyer sauf le blanc dans lequel 0 5 mL de tampon phosphate est ajout 0 5 mL de solution de substrat FDA 5 Sceller les contenants avec des rubber stoppers et incuber pendant 2h 37 C 214 Pr paration de la courbe standard l Paide d une pipette appropri e injecter dans 6 ballons jaug s de 50 mL 0 0 5 1 0 1 5 2 5 et 5 mL de solution standard d
27. la vie de th sard je me dois de remercier certaines personnes ayant t impliqu es directement ou indirectement dans mon projet videmment je dois placer tout en haut de cette liste Louise D abord pour m avoir accept comme tudiant la maitrise puis au doctorat Puis pour m avoir donn l opportunit de m impliquer dans l enseignement de plusieurs cours Puis pour sa grande disponibilit chaque fois que le besoin s en faisait sentir Mais surtout pour m avoir permis d orienter mon projet dans la direction que je croyais tre la bonne pour avoir toujours plac mes int r ts en premier lorsque venait le temps de prendre des d cisions et pour m avoir toujours fait confiance malgr les r sultats qui tardaient arriver Qa t un plaisir de travailler avec toi Je ne pourrais passer sous silence la contribution de Richard qui m a toujours apport tr s rapidement l aide ou les conseils dont j avais besoin tout en me donnant toute la latitude et le temps dont j avais besoin afin de d velopper mes id es J ai beaucoup appr ci tout le travail que tu as fourni notamment en fin de projet afin d accroitre la qualit des publications que nous avons r ussi crire Merci aux partenaires du CIRAIG la Fondation de Polytechnique au Fonds qu b cois de la recherche sur la nature et les technologies et au Conseil de recherches en sciences naturelles et en g nie du Canada pour leur soutien financier tout au l
28. me une tr s grande proportion De plus les esp ces qui seront cibl es et celles qui ne le seront pas ne sont pas choisies par l exp rimentateur sur la base 116 de leur sensibilit 4 un certain contaminant ou de leur importance fonctionnelle Ce dernier choisit simplement des amorces offrant une bonne couverture pour le groupe taxonomique tudi En ciblant autant d esp ces choisies al atoirement l indicateur a tout de m me le potentiel d tre repr sentatif de la communaut tudi e Forbes and Calow 2002 Une question ayant des implications beaucoup plus importantes par rapport l utilisation d un indicateur bas sur la diversit bact rienne des sols concerne l origine de l ADN analys Effectivement les manuscrits 2 et 3 ont montr que la diversit des chantillons contamin s une concentration de 2000 mg kg tait plus lev e que celle mesur e pour des chantillons contenant 425 mg kg de PCP Afin d expliquer cette observation deux hypoth ses ont t formul es Premi rement la tr s forte contamination a pu avoir un effet toxique sur toutes les esp ces bact riennes faisant en sorte que le profil migratoire DGGE a peu chang S7 vs So Cette hypoth se est partiellement appuy e par le fait que la biomasse microbienne a t significativement r duite par le PCP 50 en consid rant l activit hydrolytique de la FDA Une autre hypoth se permettant d expliquer cette observation
29. qui lui permet de d terminer quelle et combien de bases ont t ajout es l intensit du signal mesur est proportionnel au nombre de bases ajout es De cette fa on un tr s grand nombre de s quences gt 10 peuvent tre lues pour chaque s rie d analyse de l appareil En ajoutant aux amorces PCR une s rie de nucl otides propre chaque chantillon il est possible d inclure plusieurs chantillons dans une m me s rie d analyse Par la suite les s quences obtenue sont align es et compar es base base l aide d un algorithme de groupement toutes les s quences similaires plus d un certain pourcentage fr quemment fix 97 sont regroup es en unit s taxonomiques op rationnelles Operational Taxonomic Units ou OTU Les outils bio informatiques n cessaires l analyse des s quences sont disponibles en ligne notamment sur le site du Ribosomal Database Project RDP Cole et al 2009 ou encore via des logiciels libres i e Mothur Schloss et al 2009 Le nombre et l abondance relative des OTUs peuvent servir quantifier la diversit des communaut s tudi es Il va sans dire que la puissance de ces approches d passe largement la capacit des techniques de profilage Les NGS ont connu une volution fulgurante Quelques revues qui ont r cemment t produites afin de comparer les diff rentes plateformes entre elles permettent de constater l volution de la capacit de ces appareils no
30. re doit tre optimis e pour chaque nouveau type de sol ou paire d amorces utilis e Certains additifs peuvent tre ajout s afin d optimiser l amplification voir le guide de d pannage fourni avec les tubes d enzymes Finnzymes ou diff rent guides disponibles en ligne Les recettes utilis es avec certaines paires d amorces sont donn es en annexes 164 Une seule amplification 1 Pr parer dans un epperdorf st rile de 200 ul la recette unitaire pr sent au Tableau A1 1 Ajouter les r actifs dans l ordre du tableau 2 Ajouter lul de solution d ADN 5 10 ng ul issue d une dilution de l extrait d ADN La concentration peut varier R aliser des dilutions de l extrait d ADN de fa on ce que l amplification PCR ne soit pas inhib e Lorsque les extractions sont r alis es l aide du protocole PE71B une dilution 1 2 est normalement suffisante Certains additifs peuvent galement aider pr venir l inhibition BSA MgClo Glycerol DMSO Tableau A1 1 Recette PCR pour les amorces 341f GC et 534r DGGE R actif Volume ul Phusion PCR master mix 25 Eau d ionis e st rile 18 BSA 3 MgCb 1 Amorce 341f GC 10 pmoles ul 1 Amorce 534r 10 pmoles ul l 3 Ins rer le tube dans l appareil Techne Genius et allumer l appareil 4 S assurer que le programme 1 a t s lectionn 5 Appuyer sur le bouton START 6 Fermer le couvercle et laisser le programme rouler Plusieurs amplifications
31. rer un barreau magn tique et agiter jusqu dissolution compl te du TRIS Transvider le contenu du b cher dans un ballon jaug de 500ml Compl ter 500 ml avec H20 d ionis e en prenant soin de rincer au moins trois fois le b cher ayant contenu la solution Sceller le ballon et l inverser au moins treize fois pour homog n iser la solution 10 R partir le contenu du ballon dans deux bouteilles en verre de 500ml avec bouchon en t flon 11 Autoclaver les bouteilles pendant 30minutes Pr paration de la solution d acrylamide 40 Travailler sous une hotte chimique pour la pr paration de cette solution TOXIQUE Le port des gants est obligatoire Peser 38g de poudre d acrylamide dans une coupelle 2 D poser dans un b cher de 250 ml et nettoyer la coupelle avec un peu d eau d ionis e pas trop d eau parce que l acrylamide prend beaucoup d expansion 3 Peser 2g de poudre de bis acrylamide dans une coupelle 4 D poser dans le m me b cher que l acrylamide en nettoyant la coupelle avec un peu d eau 5 Ajouter de l eau un peu plus bas que la ligne de 75 ml du b cher 173 Ajouter un barreau magn tique et agiter sur un agitateur magn tique jusqu a dissolution compl te au moins 30 minutes en prenant soin de rincer les rebords du b cher avec un peu d eau d ionis e de temps en temps Lorsque compl tement dissous transvider dans un ballon jaug de 100 ml et compl ter jusqu la ligne avec de l eau d i
32. resulting Euclidean distances This happened when two OTUs both dominant at 100 similarity were found to cluster when choosing a lower level DGGE bands corresponding to these OTUs did not cluster on the gel Considering the lack of resolving power of 16S rRNA gene sequences to identify bacteria at the species level Rossell Mora and Amann 2001 it is impossible to state unambiguously that these OTUs should be clustered Still the Euclidean distances relatively small values clearly indicate that most of the DGGE peaks were associated with a dominant OTU having a quantitatively comparable relative abundance It can therefore be concluded that the DGGE peaks and DNA sequences cluster in two different ways Peaks cluster on the basis of their melting properties more so than on the basis of base to 65 base sequences similarity Of course melting properties are linked to sequence composition but a high base to base similarity does not guarantee that two sequences will migrate at a similar position at least in in silico DGGE profiles While different in nature both processes consistently yielded comparable dominance profiles at 98 similarity level a value that could change slightly for experimental DGGE gels 4 2 5 2 Using PSRs to improve DGGE based diversity surveys Based on numerical simulations or pyrosequencing studies a typical soil bacterial community RAD can be confidently described as long Fierer et al 2007 Gans et al
33. sir e dans l chantillon de sol Noter la masse exacte ajout e 4 l aide d une pipette en verre de 25 mL pr lever 20 mL de dichlorom thane et verser ce dernier dans la bouteille s rologique Bien m langer afin de dissoudre compl tement le contaminant Prot ger de la lumi re si la solution n est pas utilis e imm diatement N B Pour une des concentrations un chantillon sera envoy dans un laboratoire externe pour analyses chimiques Pour cette concentration 1l faudra pr parer un volume de 25 mL de la solution de dichlorom thane 200 5 l aide d une seringue Hamilton pr lever 5 mL de la solution de dichlorom thane et injecter dans une bouteille ambr e pr alablement lav e et identifi e Type de sol contaminant test concentration d sir e et num ro du r plica A Fl 0 1 6 Puisque les sols sont contamin s en triplicatas reproduire l tape pr c dente 3 fois pour chaque niveau de concentration N B Ne pas oublier de pr parer une quatri me bouteille pour l chantillon envoyer dans un laboratoire externe 7 Tout en laissant le solvant dichlorom thane s vaporer faire rouler les bouteilles de fa on ce que le contaminant cristallise sur la surface totale des parois plut t que dans le fond de la bouteille 8 Une fois le solvant dichlorom thane vapor introduire la quantit de sol requise pour les essais dans chacune des bouteilles ambr es Note
34. total organic carbon content and pH are presented in Table l For each soil twenty one soil microcosms were derived representing seven different levels of PCP contamination all prepared in independent triplicates Three other microcosms served as control and were not spiked with PCP Based on the DGGE profiles published by Marti et al 2011 contamination was performed by dissolving 0 0 6 1 3 2 6 6 3 12 3 25 9 and 89 mg of PCP Sigma Aldrich purity gt 97 in 5 mL of dichloromethane HPLC grade in empty 250 mL amber bottles The bottles were gently shaken during dichloromethane volatilization in order to recover the PCP on the bottle walls After dichloromethane volatilization the soils 30 g dry wt were added to the bottles and mixed in a tumble action agitator for 24 hours in order to recover PCP from the bottle walls Samples were humidified with distilled water to 60 w w of the soil water holding capacity and manually mixed Soils were kept at room temperature and protected from light for 28 days prior to DNA extraction and FDA hydrolytic activity assessment Tableau 6 1 Physico chemical properties of soils Soil sand loam clay Total organic carbon pH LM 58 24 18 2 8 0 4 7 39 0 03 S 98 2 0 2 2 ULT 6 68 0 03 The PCP concentrations at the beginning of the incubation period were determined Table 2 as previously described Pu and Cutright 2006 Since ecotoxicological data are usually determi
35. 14 1 1 5 Weinstock GM 2012 Genomic approaches to studying the human microbiota Nature 489 7415 250 256 doi 10 1038 nature1 1553 142 Wheeler JR Grist EPM Leung KMY Morritt D and Crane M 2002 Species sensitivity distributions data and model choice Marine Pollution Bulletin 45 1 12 192 202 doi http dx doi org 10 1016 S0025 326X 01 00327 7 Wheeler JR Leung KMY Morritt D Sorokin N and Rogers H 2002 Freshwater to saltwater toxicity extrapolation using species sensitivity distributions Environmental Toxicology and Chemistry 21 11 2459 5267 Whittaker RH 1972 Evolution and Measurement of Species Diversity Taxon 21 2 213 251 Will C Th rmer A Wollherr A Nacke H Herold N Schrumpf M Daniel R 2010 Horizon Specific Bacterial Community Composition of German Grassland Soils as Revealed by Pyrosequencing Based Analysis of 16S rRNA Genes Applied and Environmental Microbiology 76 20 6751 6759 doi 10 1128 aem 01063 10 Winding A Hund Rinke K and Rutgers M 2005 The use of microorgasnisms in ecological soil classification and assessment concepts Ecotoxicology and Environmental Safety 62 2 230 248 Wittebolle L Marzorati M Clement L Balloi A Daffonchio D Heylen K Boon N 2009 Initial community evenness favours functionality under selective stress Nature 458 7238 623 626 doi 10 1038 nature07840 Xie K Xu P Yang S Tang
36. 2 10 9 10 4 9 5 10 2 9 2 3 6 3 6 14 7 13 8 12 8
37. 20 pg ml 1 l aide d une seringue de 250ul pr lever 200p de la solution d ADN de 100p g ml et le transf rer dans un tube microcentrifuge st rile de 1 5 ml 2 l aide d une seringue de 1ml y ajouter 800p de tampon TE Pr parer le standard de 15 ug ml 1 l aide d une seringue de 250ul pr lever 150p de la solution d ADN 100ug ml et le transf rer dans un tube microcentrifuge st rile de 1 5 ml 2 l aide d une seringue de 10001 y ajouter 85011 de tampon TE Pr parer le standard de 10 pg ml 1 l aide d une seringue de 100ul pr lever 100p de la solution d ADN 100ug ml et le transf rer dans un tube microcentrifuge st rile de 1 5 ml 2 l aide d une seringue de 1ml y ajouter 900u1 de tampon TE Pr parer le standard de 5 ug ml 1 l aide d une seringue de 50 ul pr lever 501 de la solution d ADN 100 ug ml et le transf rer dans un tube microcentrifuge st rile de 1 5 ml 2 l aide d une seringue de 1ml y ajouter 950 ul de tampon TE Pr parer le standard de 2 5 ug ml 1 l aide d une seringue de 25 ul pr lever 25 ul de la solution d ADN 100 ug ml et le transf rer dans un tube microcentrifuge st rile de 1 5 ml 2 l aide d une seringue de 1ml y ajouter 975 ul de tampon TE Vortexer les solutions standards et les d poser sur de la glace jusqu leur utilisation Conserver les standards au cong lateur 20 C apr s leur utilisation 157 Qua
38. 2011 UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection Bioinformatics 27 16 2194 2200 doi 10 1093 bioinformatics btr38 1 Ereshefsky M 2010 Microbiology and the species problem Biology and Philosophy 25 4 553 568 doi 10 1007 s10539 010 9211 9 Feinstein LM Sul WJ and Blackwood CB 2009 Assessment of Bias Associated with Incomplete Extraction of Microbial DNA from Soil Applied and Environmental Microbiology 75 16 5428 5433 doi 10 1128 aem 00120 09 Fierer N Breitbart M Nulton J Salamon P Lozupone C Jones R Jackson RB 2007 Metagenomic and small subunit rRNA analyses reveal the genetic diversity of bacteria archaea fungi and viruses in soil Applied and Environmental Microbiology 73 21 7059 7066 127 Filip Z 2002 International approach to assessing soil quality by ecologically related biological parameters Agriculture Ecosystems amp Environment 88 2 169 174 doi http dx doi org 10 1016 S0167 8809 01 00254 7 Forbes VE and Calow P 2002 Species sensitivity distributions revisited A critical appraisal Human and Ecological Risk Assessment 8 3 473 492 Frampton GK Jansch S Scott Fordsmand JJ R mbke J and van den Brink PJ 2006 Effects of pesticides on soil invertebrates in laboratory studies A review and analysis using species sensitivity distributions Environmental Toxicology and Chemistry 25 9 2480 Fuglem M Parr G and Jorda
39. 400 and 200 ng well profiles the brightest band of the initial S3ooo profile is not visible in the 200 ng well gel see Figure 5 1 For the subsequent analysis the diversity indices corresponding to S3ooo 200 ng well were therefore estimated from the 400 ng well indices Generally speaking loading lower amounts of PCR product led to 1 D values closer to the Ion Torrent estimates More influenced by rare species than abundant ones exp and OTU richness 81 estimates were found to be less affected by the amount of DNA loaded into the wells than 1 D 52 4 3 Biases in Ion Torrent sequencing results Tableau 5 2 presents the number of reads that match both primers contained within the sequencing datasets before and after processing The achieved depth was different for all the samples and particularly low for soil S The proportion of sequences matching with both primers but having a mean quality score under 20 was also different for all the samples This proportion was higher for the clean and 300 mg PCP kg samples when compared with the most contaminated ones Tableau 5 2 For all the samples number of reads matching both primers before and after processing The deletion percentage corresponding to the eight samples are also presented Sample After processing Before processing Deletion EM 13 333 37 835 65 LM300 14 069 35 852 61 LM ooo 15 081 27 589 45 LM3000 11 144 26 894 59 Scin 7 254 22 400 68 S300 7 494 22 329 66 590
40. 48 4 24 ResUlt sin nn ERO IEEE T i T Ee OP RE HR HWREAEEFIE Peer 55 4 2 5 DISCUSSION PEE 62 4 2 6 Acknowledgements ee en in ea eerte herbe ae te nre a ere Ye E eL p erbe ene Eo ERE TR name dae EYE e Deo 67 CHAPITRE 5 VALIDATION DE LA M THODOLOGIE D LONGATION DES RAD DGGE SUR DES CHANTILLONS DE SOL CONTAMIN S AU PENTACHLOROPHENDOL eeee eene nnn 68 5 1 Lien entre le premier et le second manuscrit eeeeeeee esee cesses eese eese eene een nnne nnne 68 5 2 Can DGGE and lon Torrent sequencing yield similar quantitative conclusions when comparing the diversity of soil bacterial communities ssccccsssssccecsssscecessseccensssscesessesceaeens 69 5 2 1 Abstract entendent te ene E ere ru cene ne coe aee ona e Enea voran 69 5 22 Introductionc mee RR ROI EE RET UO eren Le ERE EET E TU EID 69 5 2 3 Methods E 71 5 2 4 RESUS RE ee bI M aie md e t midi Ma 77 5 2 5 DISCUSSION RE REOR RR OR tere eR 88 5 2 6 Acknowledgements fine tee ve cons Eee does e datei qe eo E Fuels Tu pde ees testate s EEA 93 xix CHAPITRE 6 DETERMINATION DE L EFFET COTOXIQUE DU PENTACHLOROPH NOL SUR LA DIVERSIT DES COMMUNAUT S BACT RIENNES DES SOLS errore eene nennen nee ses sna 94 6 1 Lien entre le deuxi me et le troisi me manuscrit csccscceccsscscccscnccececscceccececesesesceseecs 94 6 2 Assessing the impact of pentachlorophenol on soil bacterial communities using ecolo
41. 6 2 5 2 Using the diversity of soil bacterial communities to derive EQCs Most importantly the results produced using the SSD modeling process must be put into perspective The data that were used corresponded to many different endpoints growth reproduction survival etc As presented by Roman et al 2007 the sensitivity of a species to xenobiotics is highly dependent on the endpoint that is considered Furthermore considering that the required information was not often reported soil pH and organic matter content the ecotoxicological dataset was not normalized for PCP bioavailability As presented by Puglisi et al 2009 PCP adsoprtion has the potential to significantly change its ecotoxicological impact Consequently the standard deviations of the ECs available for certain species included in Tableau 6 4 were high Also since the toxicity of xenobiotics varies from one taxonomic group to another Forbes and Calow 2002 it is important that the dataset used for SSD modeling be representative of the modeled ecosystem In the present case worms and plants dominated the dataset even though these groups may not naturally dominate terrestrial ecosystems Therefore the geometric mean of the ECso for the taxonomic groups was used instead of the ECso of the single species This modeling choice moved the SSD slightly to the left of the x axis even though the correspondence between the SSD and 14 ECso is still very good Figure 6 3 A questi
42. 8 3 0 SAF 100 10 98 0 8 2 2 3 FUGo7 5 100 28230 E BF97 5 96 2 0 3 0 3 e SAFo7 5 97 2 8 3 0 FUGos None BFos 10 98 1 0 3 0 SAFo5 10 97 1 0 3 0 58 Tableau 4 1 For the Matlab based framework TotalLab Quant GelCompar II and BIO 1D optimal parameters obtained for all the samples Ball size and similarity level values were selected as those simultaneously generating APSR AH and A1 D values lower than 10 over the widest range of cut off values continued Software Optimal Closest Cut off Sample program ball size similarity level range FUG 100 4 96 0 6 1 8 BF100 72 96 1 0 3 0 SAF 100 72 97 0 4 1 6 FUGo7 20 96 0 6 3 0 3 BFo7 20 96 0 6 0 8 E SAF97 12 96 1 0 3 0 FUGos 20 96 0 2 3 0 BFo5 20 100 0 4 3 0 SAFos 20 98 0 6 3 0 FUGi00 None BFi00 5 99 0 4 3 0 SAF 100 10 100 0 8 3 0 FUGo7 None BFo7 41 97 0 0 3 0 a SAFo7 41 99 0 8 3 0 FUGos 20 97 0 0 0 2 BFo5 None SAFoso 4 10096 0 6 3 0 59 Tableau 4 2 also presents the parameters that were deemed optimal for each software program However since DGGE profile analysis traditionally involves the use of a single ball size for all the samples loaded on a given gel the parameters presented in Tableau 4 2 were selected considering all nine samples simultaneously The optimal cut off percentage was also limited to a single value Figure 4 3 pr
43. 98 similarity level using Mothur Schloss et al 2009 ssss 79 Figure 5 3 Intensity of the DGGE band produced by loading different amounts of a PCR product amplified from the genomic DNA of Escherichia coli All PCR products came from the same aliquot Resulting intensities calculated as the area under the peaks are reported as a fraction of the intensity corresponding to a loading of 400 ng Figure 5 4 The elongated DGGE RADs each containing 35 000 reads were randomly sampled without replacement at various depths ranging from 100 to 30 000 reads The impact of sampling was quantitatively assessed by dividing the diversity indices calculated at a certain depth by the values calculated at a depth of 35 000 Since DGGE gels were run in triplicate results were averaged for every sample 82 XXIV Figure 5 5 Proportion of the sequences deleted when applying an average quality filter q gt 20 over the lon Torrent dataset Upper Deletion percentages for the different trimmed lengths Lower Observing that the sequences with lengths ranging between 133 138 and 157 163 bases contained more than half of all the sequences and were of particularly good quality these sequences were extracted and ordered by increasing GC content individually for each length Results reported individually for the two clusters 133 138 and 157 163 correspond to the average deletion percentage for the different lengths in each cluste
44. Cette pratique n est pas courante Le Tableau 1 4 pr sente la r partition des donn es cotoxiques contenues dans ECOTOX U S Environmental Protection Agency 2013 une des principales sources de donn es en libre acc s Les donn es ont t trait es de fa on retirer les doublons Chaque donn e r pertori e concerne donc un triplet contaminant esp ce test e indicateur cotoxique unique 18 Tableau 1 4 Nombre de contaminants et types d indicateurs couverts par la base de donn es ECOTOX U S Environmental Protection Agency 2013 pour les cosyst mes aquatiques et terrestres Si la base de donn es contenait plus d une entr e pour une m me combinaison contaminant organisme type d indicateur i e une NOEC pour la reproduction et une NOEC pour la mortalit cette combinaison a t comptabilis e une seule fois Nombre de donn es disponibles pins Type Nombre de y d organismes contaminants NOEC LOEC Bos ECx x 50 Aquatique Tous 5799 13253 9507 28389 22256 Mammiferes et oiseaux 1897 3451 2982 2352 1669 Terrestre Contact direct plantes 2322 15038 12917 4863 6026 vers insectes etc Les donn es du Tableau 1 4 permettent de constater qu il existe une diff rence assez marqu e entre la disponibilit des donn es aquatiques et terrestres Les donn es aquatiques sont non seulement plus nombreuses et couvrent pr s de trois fois plus de contaminants mais elles corresponden
45. DNA quantitation assay Life Technologies Carlsbad CA USA The amplification products from the different samples were pooled in an equimolar ratio Bacterial 16S rRNA gene amplicons were sequenced at the National Research Council of Canada in Montr al Qu bec As described by Yergeau et al 2012 the emulsion PCR and sequencing was done using an Ion OneTouch 200 template kit Life Technologies Carlsbad CA USA OneTouch and OneTouch ES instruments Life Technologies Carlsbad CA USA and an Ion Torrent personal genome machine PGM Even though it is newer and therefore less frequently used than other sequencing platforms Ion Torrent sequencing produced community structure and composition that were almost interchangeable with those produced by 454 pyrosequencing Yergeau et al 2012 The sequences were deposited in the NCBI sequence read archive NCBI 2012 under the accession number SRR833619 Sequencing dataset processing was done in such a way that only the sequences containing both primers were retained Initial processing was carried out using Matlab Since the general quality of the sequences dropped at a length of 100 bases very few sequences produced hits with the reverse primer To overcome this limitation the reverse primer was trimmed to allow 7 mismatches over 17 nt For the barcodes and the forward primer only one mismatch was tolerated The remainder of the dataset processing was done using Mothur Schloss et al 2009
46. DNA was recovered by ethanol precipitation Sambrook et al 1989 Purified DNA was quality checked using a 1 w v agarose gel and quantified with a TECAN GENios fluorometer Tecan Group Ltd M nnedorf Switzerland Samples were stored at 20 C PCR amplifications V3 region of the bacterial 16S rRNA gene were done using primers 341f 5 CCTACGGGAGGCAGCAG 3 and 534r 5 ATTACCGCGGCTGCTGG 3 Muyzer et al 1993 Both primers were HPLC purified The forward primer also contained at its 5 end a 40 nt GC clamp 5 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG 3 Muyzer et al 1993 Amplifications were conducted in 50 uL volumes using the 2X Phusion High Fidelity PCR Master Mix Fisher Scientific Inc PCR mixtures contained 200 uM of each dNTP 2 5 mM of MgCl2 0 6 ug uL of bovine serum albumin 0 1 uM of each primer and 5 ng of extracted DNA Amplification was carried out with a Techne Genius Thermocycler Bibby Scientific Ltd Staffordshire UK After an initial two minute denaturation step at 94 C a total of 35 amplification cycles were carried out consisting of 10 second denaturation at 94 C 10 second annealing and 10 second elongation at 72 C The amplification process was concluded by a final elongation step of 5 minutes at 72 C To increase the specificity and yield of the amplification process Korbie and Mattick 2008 the annealing temperature was decreased from 67 5 to 62 5 C during the first 10 cycles and t
47. ETETE 226 Code 3 QuantificatronPicsS Meses i nes e po El Se E AO Ea 229 Code 4 Normale DEUxPICSd0y oos ere nr ce SUAE a S REN EUIUE Pappe Gen rr 241 Codes sBlonpauopn ADIT as ou ese vero RISE a a sat duran AS dae 245 Code 6 Constr ctioiHiag e Tos voces do erede E ES FREE RARRRE CEEX SERE natale een 248 Code 7 3 Pasta LEIILEL on cen ooo y ERE ere LS NU TU NOE URP ana e GERI AR 252 Code 8 IntiuenceNDSeQ Bros sara ere d evbe nada ennemie been etes dan bte tss 274 217 Nom du fichier Lecturelmage m Description Cet algorithme permet d aller lire une image en format TIFF peu importe sa r solution et de d finir des couloirs DGGE droits ou croches A partir des couloirs d finis l algorithme ira enregistrer dans un fichier Excel les profils DGGE en une dimension qui seront analys s par le code QuantificationPics m Auteur Jonathan Lalande clear all close all clc Nom while size Nom 1 prompt Nom de l image lire dlg title Entrez les informations demand es num lines 1 A AS2 red tif def A options Resize on options WindowStyle normal Nom inputdlg prompt dlg titlejnum lines def options end im imread Nom 1 figure 1 imshow im NbColonnes size 1m 2 NbLignes size im 1 InfoCouloirs while size InfoCouloirs 1 0 218 prompt D but des couloirs de migration coordonn e X s parez chaque valeur par un es
48. First trimmed amplicons with unresolved bases N s homopolymers longer than 7 or an average quality score under 20 were discarded Datasets were aligned and amplicons outside the general alignment space or the expected length range were disregarded Aligned datasets were then screened for chimeras using 75 UCHIME Edgar Haas Clemente Quince and Knight 2011 For all the samples amplicons identified as chimeras represented less than 2 5 of all the sequences Since no denoising program seems to have been adapted to the Ion Torrent PGM sequencing errors were reduced using the Mothur implementation of a pseudo single linkage clustering algorithm Huse et al 2010 As recommended sequences with less than 2 dissimilarity 3 bases were clustered to more abundant OTUs Finally clustering was done using an average neighbour algorithm This methodology pseudo single linkage followed by average linkage clustering proved to accurately predict expected OTUs for communities of known taxonomic composition Huse et al 2010 Contrary to what is generally done final clustering was carried out at 98 similarity as on in silico profiles this level consistently matched the DGGE banding patterns Lalande Villemur et al 2013 5 2 3 5 Diversity quantification Diversity estimations produced by the elongation framework and sequencing dataset clustering at the 98 similarity level were compared through three diversity indices Community str
49. Int16 0 Int17 0 Int18 0 Int19 0 Int20 0 for xx 1 Longueur if Qualite xx lt 1 Intl Int1 1 elseif Qualite xx 2 Int2 Int2 1 elseif Qualite xx 3 Int3 Int3 1 elseif Qualite xx 4 Int4 Int4 1 elseif Qualite xx 5 Int5 Int5 1 elseif Qualite xx 6 Int6 Int6 1 elseif Qualite xx 7 Int7 Int7 1 elseif Qualite xx 8 Int8 Int8 1 elseif Qualite xx 9 Int9 Int9 1 elseif Qualite xx 10 Int10 Int10 1 265 elseif Qualite xx Int1 1 Int11 1 elseif Qualite xx Int12 Int12 1 elseif Qualite xx 12 Int13 Int13 1 elseif Qualite xx 14 Int14 Int14 1 elseif Qualite xx Int15 Int15 1 elseif Qualite xx Int16 Intl6 1 elseif Qualite xx 17 Int17 Int17 1 elseif Qualite xx 18 Int18 pu elseif Qualite xx Int19 Eod else Int20 Int20 1 end end Los D for yy 1 Longueur Miscall Miscall 10 Qualite yy 10 end Qmoy mean Qualite C5 i Debut Longueur GC Qmoy Int1 Int2 Int3 Int4 Int5 Int6 Int7 Int8 Int9 Int10 Int11 Int12 Int13 Int14 Int15 Int16 Int17 Int18 Int19 Int20 Miscall end end break elseif sum Seq1 Ec6 gt NumMin if length Sequence Debut end gt 1 if length Sequence Debut end lt 250 Ech6 E6 1 Header Structure i Header Ech6 E6 1 Sequence Sequence Debut end Qual6 E6 1 Header Quality i Header Qual6 E6 1 Sequence num2str Qualite Debut end
50. Odum EP 1985 Trends Expected in Stressed Ecosystems BioScience 35 7 419 422 OECD 1992 OECD Guidelines for Testing of Chemicals Fish Acute Toxicity Test pp 9 OCDE Office qu b cois de la langue frangaise 2012 Le grand dictionnaire terminologique Retrieved 26 mars 2013 from http gdt oqlf gouv qc ca index aspx Oros Sichler M Costa R Heuer H and Smalla K 2007 Molecular fingerprinting techniques to analyze soil microbial communities In J D van Elsas J K Jansson amp J T Trevors Eds Modern Soil Microbiology second edition pp 355 386 Boca Raton CRC Press 135 Pan Y Bodrossy L Frenzel P Hestnes A G Krause S Luke C Bodelier PLE 2010 Impacts of inter and intralaboratory variations on the reproducibility of microbial community analyses Applied and Environmental Microbiology 76 22 7451 7458 doi 10 1128 aem 01595 10 Paul EA 2007 Soil microbiology ecology and biochemistry third edition Elsevier Academic Press Pennanen T Caul S Daniell TJ Griffiths BS Ritz K and Wheatley RE 2004 Community level responses of metabolically active soil microorganisms to the quantity and quality of substrate inputs Soil Biology and Biochemistry 36 5 841 848 Pinard R de Winter A Sarkis G Gerstein M Tartaro K Plant R Leamon J 2006 Assessment of whole genome amplification induced bias through high throughput massively parall
51. R f rence sur l Analyse l Interpr tation et la Gestion du cycle de vie des produits proc d s et services Universit th FEE Eve ifi EH de Montr al wontreat NLE PROTOCOLE EXP RIMENTAL Protocole PE71B Nombres de pages 10 Version 2 Date 01 04 12 Auteur s Jonathan Lalande Approuv par Lucie Jean Signatures Date D Titre Amplification de l ADN par la m thode PCR Mots cl s ADN sol PCR bact ries champignons lectrophor se OBJECTIF 160 L objectif de la m thode PCR vise amplifier une r gion sp cifique de l ADN de divers organismes La r gion de l ADN et les organismes cibl s d pendent des amorces utilis es afin de proc der l amplification qui peuvent tre tr s sp cifiques ou quasi universelles pour un type d organisme ex bact ries L amplification PCR doit permettre d obtenir une quantit suffisante d ADN afin d analyser le produit par s quengage ou sur un gel lectrophor se Pour certaines applications s quen age le produit amplifi devra tre purifi avant de proc der l analyse Bien qu un protocole g n ral soit pr sent ici la concentration des diff rents r actifs ainsi que les 161 conditions de l amplification dilution des extraits d ADN nombre de cycles temp ratures temps d pend de la puret des extraits d ADN du type de sol tudi des amorces utili
52. S Zhang F Huang X Zhang H 2011 The influence of paddy soil bacterial diversity affected by heavy metals contamination of Dabaoshan mine JEEE Xplore 3 1705 1709 doi 10 1109 iswrep 2011 5893576 Yankson KK and Steck TR 2009 Strategy for Extracting DNA from Clay Soil and Detecting a Specific Target Sequence via Selective Enrichment and Real Time Quantitative PCR Amplification Applied and Environmental Microbiology 75 18 6017 6021 doi 10 1128 aem 00211 09 Yergeau E Lawrence JR Sanschagrin S Waiser MJ Korber DR and Greer CW 2012 Next generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in 143 relation to oil sands mining activities Applied and Environmental Microbiology doi 10 1128 aem 02036 12 Zielezny Y Groeneweg J Vereecken H and Tappe W 2006 Impact of sulfadiazine and chlorotetracycline on soil bacterial community structure and respiratory activity Soil Biology and Biochemistry 38 8 2372 2380 144 ANNEXE 1 PROTOCOLES EXPERIMENTAUX Protocole PE71A Extraction de l ADN total d un chantillon de sol selon la m thode CTAB Protocole PE71B Amplification de l ADN par la m thode PCR 160 Protocole PE71C Migration DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis du produit PCR amplifi partir de l ADN extrait d un SO vic nn errant n Ing awh es 170 Protocole PE71D Utilisation de l
53. The PAF potentially affected fraction of species corresponds to the cumulative proportion of species affected above their ECso at a given PCP concentration See the Material and methods section for the cal ulatioris 2 ie eee eei eee intesa ae ee 107 xxii LISTE DES FIGURES Figure 1 1 Exemple de RAD pour deux communaut s diff rentes Dans cet exemple la richesse de la communaut 1 7105 esp ces est plus faible que celle de la communaut 2 120 esp ces Aussi comme l abondance relative des esp ces les plus abondantes est plus lev e pour la communaut 1 la dominance de cette communaut est sup rieure celle de la communaut 2 6 Figure 1 2 Comparaison de quatre distributions de probabilit s couramment utilis es afin de construire les courbes concentration r ponse Les diff rents mod les sont tr s semblables pour les r ponses situ es entre 20 et 8096 mais diff rent passablement pour les percentiles plus faibles et plus lev s eseeeeeesees 11 Figure 1 3 R ponse th orique d un cosyst me contamin comparativement aux pr dictions de la SSD Tir de Solomon et Takacs 2001 tnde ato te ett t dese den e eere ie ein eden ius tu M Re dee dee 16 Figure 1 4 Nombre de donn es cotoxiques disponibles pour chaque contaminants r pertori es au Tableau 1 4 Les r sultats sont pr sent s sous forme de pourcentage du nombre total de contaminants
54. activit hydrolytique de la FDA des sols 2 3 M thodologie g n rale Afin d atteindre les objectifs il est propos de ill D velopper une approche analytique ainsi que les outils logiciels associ s permettant d extraire des profils DGGE de l information pertinente et quantitative sur les communaut s bact riennes tudi es chapitre 3 A partir de profils DGGE in silico valuer la performance de divers logiciels d analyse produire un portrait r aliste des communaut s bact riennes tudi es chapitre 4 A partir des m mes profils in silico d velopper et param trer une approche empirique permettant de quantifier la diversit bact rienne des sols a partir de la technique du DGGE chapitre 4 Valider cette approche sur des chantillons r els en comparant la diversit bact rienne estim e l aide du DGGE celle g n r e par une plateforme NGS chapitre 5 R aliser des essais de toxicit sur le PCP en ciblant les communaut s microbiennes dans les sols Pour ce faire valuer l effet du PCP sur la diversit des communaut s bact riennes ainsi que sur le potentiel d activit hydrolytique de la FDA des sols chapitre 6 36 vi Rassembler un maximum de donn es cotoxiques sur le PCP qui couvriront la plus large gamme possible d esp ces terrestres plantes vers insectes etc chapitre 6 vii R aliser une mod lisation concentration r ponse sur les r sultats des
55. al 2005 Il s agit donc de mesures tr s g n rales qui englobent dans un m me indicateur l activit des bact ries des arch es des champignons et de tout autre organisme se trouvant ou s tant trouv dans le sol Bien que ces indicateurs soient tr s pertinents pour l tude de la sant d un sol Killham and Staddon 2002 leur utilisation en tant qu indicateur de toxicit pr sente certaines limitations Par exemple dans une tude r alis e sur l effet du plomb sur la respiration de 6 sols diff rents aucune diff rence significative entre les contr les et les chantillons contamin s 5 niveaux de contamination diff rents ne fut observ e Lazzaro Schulin Widmer and Frey 2006 Dans une autre il fut observ que ce m me indicateur pouvait tre multipli par quatre suite l ajout de PCP Scelza Rao and Gianfreda 2008 Puisque ces indicateurs sont tr s globaux leur sensibilit aux diff rents contaminants peut tre tr s variable Ainsi la biomasse microbienne s est av r e assez sensible au PCP Megharaj Singleton and McClure 1998 mais pas au plomb Liao Chen Zeng and Huang 2007 Parfois ces indicateurs vont carr ment mener des conclusions erron es Effectivement si le contaminant est biod gradable les quelques esp ces de d gradeurs auront facilement acc s une source de carbone abondante et ces derniers augmenteront significativement en nombre et en masse Cette augmentation s ta
56. algorithme permet de lire un fichier fasta contenant des s quences d ADN de calculer la temp rature de d naturation de chaque s quence mod le de Khandelwal et Bhyravabhotla et de recr er un gel DGGE in silico partir de ces s quences Auteur Jonathan Lalande R f rences Khandelwal G Bhyravabhotla J 2010 A Phenomenological Model for Predicting Melting Temperatures of DNA Sequences PLoS ONE 5 8 e12433 doi 10 1371 journal pone 0012433 Lalande J Villemur R amp Deschenes L In press A new framework to accurately quantify soil bacterial communities diversity from DGGE Microbial Ecology clear all close all clc ETmoy 25 NbPixels 10240 Uree 7 Formamide 40 BasGradient 0 40 HautGradient 0 75 Position 1 10240 Vecteurs zeros 10240 8 TempMin 60 2 25 Uree 0 6 Formamide BasGradient TempMax 60 2 25 Uree 0 6 Formamide HautGradient Tmin 100 Tmax 0 Nombre zeros 8 1 for k 1 8 k Fichier strcat Ech num2str k 20 fasta Structure fastaread Fichier Nombre k size Structure 1 for 1 1 Nombre k if 1 10000 round i 10000 i Nombre end Sequence Structure i Sequence E 0 Calcul du E for j 1 length Sequence 1 if strempi Sequence j j 1 GC E E 13 elseif strempi Sequence j j 1 CC E E 11 elseif strempi Sequence j j 1 GG 1 E E 11 elseif strem
57. alimentation en marche appuyer sur RUN et laisser migrer pendant 45 minutes 20 D brancher l appareil lectrophor se retirer le couvercle et le support 2 Analyser le gel sous une lampe UV et prendre une photo voir PE71D pour le fonctionnement de l appareil Quantum ST4 Excision d une bande et purification du produit amplifi si n cessaire l A la balance peser dans une coupelle 1 2g d agarose et transf rer dans un erlenmeyer de 250 ml l aide d un cylindre gradu de 100 ml mesurer un volume de 60 ml de la solution TAE 1X et l ajouter l erlenmeyer de 250 ml Faire chauffer la solution dans une micro onde d abord pendant environ 30 secondes Remuer l g rement l erlenmeyer Remettre dans la micro onde durant 20 secondes Remuer l g rement l erlenmeyer Remettre dans la micro onde durant 10 secondes Laisser refroidir l g rement la solution et y ajouter 0 5ul d une solution de bromure d thidium 10 mg ml Couler la solution chaude dans le support migration lectrophor se on doit mettre du ruban adh sif aux extr mit s du support pour maintenir la solution dans le support voir Figure A1 2 Fixer le peigne appropri sur le support puits larges Couvrir pour prot ger de la lumi re et laisser g lifier pendant 30 min la temp rature 10 11 12 13 14 15 16 I 18 19 20 21 168 ambiante Ajouter aux tubes eppendorf contenant l
58. analyser l aide d une pipette automatique de 20 ul 10 Injecter la totalit du contenu des eppendorf dans les puits form s dans le gel l aide d une pipette automatique de 20 ul attention il faut r aliser ces manipulations tr s d licatement 11 Brancher l alimentation du bain a migration et r gler la diff rence de potentiel 100 V 12 Laisser migrer l ADN dans le bain durant environ 45 60 minutes 13 Couper le courant de l appareil et d brancher le fil d alimentation du bain migration 14 D poser le gel dans un bain de bromure d thydium coloration environ 10 minutes et d coloration dans de l eau d ionis e durant 15 minutes ou de SYBR green coloration environ 30 minutes pas de d coloration 15 Visualiser le gel l aide de l appareil Quantum STA voir PE71D SANT ET SECURIT Le port des gants est exig pendant toutes les manipulations pour l extraction d ADN La manipulation des solvants s effectue en tout temps sous la ventilation d une hotte chimique Consulter les fiches signal tiques du ph nol chloroforme et de l alcool isoamyl avant leur utilisation 159 RECOMMANDATION S Le type de sol est un param tre important lors de l extraction de l ADN La quantit de sol analyser doit tre valu e exp rimentalement pour chaque type de sol utilis On peut faire varier la quantit de sol de 100 500 mg seulement D 29 Centre Interuniversitaire de
59. and corrected values were produced with the DGGE RADs sampling framework The numbers 2 3 and 4 refer to the dissimilarity level number of bases used for the initial pseudo single linkage algorithm Huse et al 2010 Except for the three lines in bold characters all linear correlations were significant p lt 0 05 Index Ion Torrent DGGE ng well Slope r Uncorrected 3 400 1 92 0 92 A Uncorrected 3 200 1 43 0 94 Normalized 3 200 1 51 0 94 Corrected 4 200 1 93 0 96 s Corrected 3 200 1 37 0 95 Corrected 2 200 0 86 0 91 Uncorrected 3 400 1 03 0 81 m Uncorrected 3 200 0 93 0 80 G Normalized 3 200 1 42 0 88 z Corrected 4 200 0 81 0 96 S Corrected 3 200 0 64 0 94 Corrected 2 200 0 51 0 93 Uncorrected 3 400 1 27 a Uncorrected 3 200 1 22 E Normalized 3 200 2 45 0 67 5 Corrected 4 200 0 68 0 91 P Corrected 3 200 0 62 0 90 Corrected 2 200 0 59 0 90 88 If both techniques could produce accurate diversity estimates the slope and the coefficient of correlation of the linear regression analysis would both be close to one Considering that two very different techniques were compared and that biases were identified for both techniques the slopes of the regression lines are rarely close to one Tableau 5 4 However the coefficients of correlation were still very high indicating that a significant linear relation links the Ion Torrent and DGGE diversity indices In order to find significant correlations for OTU ric
60. approximatif avoisinant les 10 millions Il importe de mentionner que la notion d esp ce en biologie et en microbiologie est diff rente Ereshefsky 2010 4 Tableau 1 1 Nombre d esp ces d crit et estim pour les trois domaines biologiques Tir de Groombridge et Jenkins 2002 Domaine Esp ces d crites Nombre total estim Arch es 175 10 000 000 Bact ries 10 000 Eucaryotes 1 750 000 14 000 000 Tir de Tamames et Rossell M ra 2012 Comprend les eucaryotes unicellulaires et multicellulaires Il va sans dire que cette diversit est une richesse pr server l aube du nouveau mill naire sous l gide du Programme des Nations Unies pour l Environnement PNUE une vaste tude laquelle plus de 1350 experts ont particip a t lanc e l valuation des cosyst mes pour le Mill naire Cette tude visait faire le point sur les changements survenus dans les cosyst mes ainsi que de proposer des pistes de solution afin de r agir ces changements Les conclusions de ce groupe de travail sont sans quivoque induits par l activit humaine les changements de biodiversit des cosyst mes a t plus rapide dans les 50 derni res ann es qu n importe quelle p riode de l histoire humaine Effectivement le taux d extinction des esp ces actuellement observ dans les cosyst mes est plus de 100 fois sup rieur aux taux pass s Millenium Ecosystem Assessment 2005 Les pr
61. autrement pour les profils complexes tels que ceux produits par les communaut s bact riennes dans les sols Effectivement mesure que la diversit de la communaut augmente le bruit de fond est de plus en plus complexe et important et les bandes DGGE sont de plus en plus superpos es les unes sur les autres Les d veloppeurs de logiciels admettent que ces profils peuvent tre probl matiques communications personnelles mais aucune tude n a valu la distorsion introduite par la m thode d analyse dans les tudes de diversit 1 4 2 4 Analyse du produit amplifi l aide des nouvelles technologies de s quencage d ADN Depuis quelques ann es les nouvelles technologies de s quengage d ADN Next Generation Sequencing ou NGS ont fait leur apparition sur le march Au lieu de s parer les brins d ADN sur la base de leur composition ces appareils sont en mesure de lire les s quences La plupart des plateformes NGS fonctionnent sur un principe g n ral similaire Sur une microplaque contenant des centaines de milliers de pores microscopiques les brins d ADN pr alablement amplifi s par PCR sont r amplifi s L appareil introduit successivement dans les micropores chacune des bases qui constituent l ADN A T G et C Lorsque la bonne base est ajout e la polym rase l incorpore 30 la chaine en extension Le s quenceur est alors en mesure de mesurer un signal mission lumineuse d ions d nergie etc
62. bacterial communities using ecological diversity indices a t soumis la revue The ISME Journal 38 CHAPITRE3 DEVELOPPEMENT D UNE APPROCHE ANALYTIQUE PERMETTANT L EXTRACTION D INFORMATIONS QUANTITATIVES D UN PROFIL DGGE Les logiciels permettant d analyser les profils DGGE pr sentent plusieurs limitations quand vient le temps de travailler avec les communaut s bact riennes des sols Etant tr s diversifi es les profils correspondant ces communaut s sont caract ris es par un important bruit de fond ainsi que d un grand nombre et d une forte superposition des bandes D s lors des outils informatiques mieux adapt s ces profils complexes furent d velopp s l aide du logiciel Matlab Les outils pr sent s dans cette section serviront extraire des profils DGGE l information la plus juste possible quant l abondance relative des esp ces dominantes des communaut s bact riennes tudi es De plus la m thode de soustraction du bruit de fond pr sent e ci bas cherchera permettre l extraction de ratios pics sur signal aussi repr sentatifs que possible L approche globale pr sent e dans ce chapitre sera compar e dans le premier manuscrit chapitre 4 diff rents logiciels commerciaux d analyse de gels DGGE Les r sultats produits par cette approche seront par la suite utilis s par le mod le d longation pr sent galement dans le premier manuscrit chapitre 4 et valid dans le second manuscri
63. ces ont t compar s En travaillant sur des profils DGGE in silico il a t montr que la repr sentativit des r sultats g n r s par les approches analytiques g n ralement employ es pour analyser les gels DGGE et impl ment es dans trois logiciels commerciaux variait d un chantillon l autre Au contraire X l approche analytique d velopp e dans le cadre de ce projet a permis d extraire des profils DGGE des ratios pics sur signal pr cis et de produire des patrons de dominance repr sentatifs des communaut s tudi es Il a t montr que ces patrons de dominance taient tr s semblables ceux g n r s par le groupement des s quences utilis es pour construire les profils DGGE si un pourcentage de similitude de 98 tait utilis Le mod le d longation calibr partir des distributions rang abondance produites en groupant les s quences d ADN avec un pourcentage de similitude de 98 a montr un tr s fort potentiel afin de permettre l estimation de la diversit bact rienne partir du DGGE Ainsi il a t possible d estimer la diversit r elle des communaut s tudi es avec une pr cision g n ralement sup rieure 5 Une corr lation tr s significative existait entre les indices de diversit r els et ceux estim s partir du DGGE R gt 0 99 En utilisant deux approches diff rentes afin d tudier les m mes communaut s bact riennes il a t possible d identifier de
64. composition des s quences d ADN d un chantillon donn D s lors ce profil peut pr senter de brusques variations certaines positions sur le gel L ajustement du profil doit se faire de fa on ce que l importance relative de chaque bande visible soit logique Par exemple sur la Figure 3 2 les pics identifi s l aide du chiffre 1 correspondent des bandes p les floues et mal d finies Au contraire le pic identifi par le chiffre 2 sans tre tr s brillant est tr s bien d fini Le profil de d limitation des pics doit donc tre ajust afin que l importance des pics situ s en 1 influenc s la hausse par la pr sence d un pic dominant soit inf rieure l importance du pic situ en 2 De la m me fa on la position 3 se trouvent une s rie de quatre pics parmi lesquels uniquement deux sont brillants Si le profil de d limitation des pics tait situ trop bas l importance des pics tr s pales serait disproportionn e par rapport celle des pics abondants Le profil de d limitation est donc ajust de facon ce que l importance d un pic ne soit pas influenc e la hausse ou la baisse par sa position sur le gel 3 2 Quantification des pics L algorithme de quantification des pics DGGE est bas sur l observation que les pics DGGE correspondant des esp ces uniques taient tr s bien repr sent s par des distributions de densit de probabilit s Gaussiennes Eq 1 x xg A 2 07 I x e 2
65. concentration r ponse repr sentatives de l effet du pentachloroph nol sur la diversit des communaut s bact riennes des sols Cet indicateur s est av r tre sensible ce contaminant et a fait preuve d un potentiel norme en produisant des indicateurs quantitativement similaires aux crit res de qualit environnementale en vigueur dans plusieurs pays pour cette substance Les 121 recommandations qui suivent noncent quelques perspectives de d veloppement et de validation de cet outil e Influence de la longueur des s quences amplifi es sur les indices de diversit estim s a partir du DGGE Dans cette th se il a t montr que la migration et la superposition des bandes d ADN sur les gels DGGE taient similaires un groupement des s quences d ADN une similitude de 98 Puisqu il a t montr que la longueur des s quences amplifi es influen ait les estim s de diversit calcul s partir des r sultats des plateformes NGS il se pourrait que ce param tre influence galement le processus de formation des profils DGGE Ainsi il est possible que la similitude observ e entre bandes DGGE et groupement des s quences a 98 ne soit pas valide pour des s quences plus longues ou plus courtes Le param trage du mod le d longation des RAD DGGE pourrait donc tre revoir e Influence du processus d analyse et de groupement des s quences sur les tudes comparatives de diversit La m
66. conditions environnementales normales Aussi la disponibilit des donn es est souvent tr s probl matique Les s ries de donn es contiennent donc trop peu d indicateurs qui concernent souvent diverses fonctions suivies Aussi il arrive fr quemment que les esp ces cibl es par les essais de toxicit ne soient pas repr sentatives de l cosyst me mod lis i e utiliser des donn es sur des plantes potag res afin de mod liser l effet d un contaminant sur un cosyst me forestier Forbes and Calow 2002 De plus tous les groupes taxonomiques ne sont pas repr sent s dans les bases de donn es cotoxiques Finalement la SSD simplifie norm ment l cosyst me et ne tient pas compte des interactions entre les esp ces Ces interactions peuvent moduler la hausse ou la baisse la r ponse d un cosyst me expos un agent stressant particuli rement de faibles et fortes concentrations voir Figure 1 3 Solomon and Takacs 2001 16 Contrairement l approche SSD les indices de diversit tiennent implicitement compte des interactions entre les esp ces Observed ecological effect m Deviation P resulting from c interactions SS pec E cological a bet va S effect Deviation resulting from community resiliency and 2 ies redundanc i species redu y Concentration Figure 1 3 R ponse th orique d un cosyst me contamin comparativement aux pr dictions de la SSD
67. cran Ajuster au besoin le zoom et le focus de l appareil photo afin d obtenir l image la plus claire possible Si l appareil est la limite de la saturation pour certaines bandes sur le gel utiliser ces bandes afin de peaufiner les ajustements Lorsque tous les ajustements sont r alis s diminuer l g rement le temps d exposition ou r duire l ouverture de l objectif afin d tre la limite de la saturation Appuyer nouveau sur Start exposure afin de prendre la photo finale Si l image est trop brillante reprendre la proc dure pr c dente en r duisant le temps d exposition ou l ouverture de l objectif jusqu ce que la photo soit acceptable Au besoin prendre plusieurs photos Lorsque la photo est prise il faut s assurer de la sauvegarder afin de conserver cette derni re 188 16 Lorsque la photo est prise jeter le gel dans la chaudi re pr vue cet effet situ e juste en dessous du comptoir o se trouve l ordinateur 17 Bien nettoyer le transilluminateur avec de l eau d ionis e et des kimwipes Analyse de l image avec le logiciel Bio 1D quantification du produit PCR ou analyse des gels DGGE D tection D finition des pistes En cliquant sur l onglet Image analysis partir du logiciel Quantum Capt il sera possible d envoyer l image directement au logiciel Bio 1D Alternativement double cliquer sur l ic ne correspondant Bio 1D et s lectionner la photo an
68. d int r ts agro cosyst me forestier etc afin de faire le lien entre une concentration en contaminant dans le sol et la dose ing r e par certains mammif res et oiseaux Ainsi il sera possible d int grer les donn es cotoxiques repr sentatives des mammif res et des oiseaux aux donn es repr sentatives des organismes contact direct 123 BIBLIOGRAPHIE Adam G and Duncan H 2001 Development of a sensitive and rapid method for the measurement of total microbial activity using fluorescein diacetate FDA in a range of soils Soil Biology and Biochemistry 33 7 8 943 951 doi http dx doi org 10 1016 S0038 0717 00 00244 3 Aldenberg T and Jaworska JS 2000 Uncertainty of the Hazardous Concentration and Fraction Affected for Normal Species Sensitivity Distributions Ecotoxicology and Environmental Safety 46 1 18 Arcand Y Hawari J and Guiot SR 1995 Solubility of pentachlorophenol in aqueous solutions The pH effect Water Research 29 1 131 136 doi http dx doi org 10 1016 0043 1354 94 E0104 E ASTM International 2006 ASTM D1140 00 Standard Test Methods for Amount of Material in Soils Finer than No 200 75 um Sieve West Conshohocken PA ASTM International 2007a ASTM D422 63 Standard Test Method for Particle Size Analysis of Soils West Conshohocken PA ASTM International 2007b ASTM D2974 07a Standard Test Methods for Moisture Ash and Organic Matter of Peat and Othe
69. d un courant lectrique les brins d ADN migreront dans le gel et seront expos s des conditions d naturantes de plus en plus lev es Petit petit les liaisons A T et G C se briseront et les brins d ADN auront tendance s ouvrir une certaine position sur le gel le brin est totalement ouvert sauf la pince GC et se retrouve immobilis La position d un brin donn d pend de sa composition et comme chaque esp ce poss de une s quence d ADN qui lui est propre il est possible de s parer les s quences provenant de diff rentes esp ces L analyse des gels DGGE consid re implicitement tort que chaque bande visible a t g n r e par une esp ce unique et que l intensit d une bande est proportionnelle l abondance de l esp ce l ayant produit En permettant l analyse d environ 50 bandes le DGGE ne g n re de l information que sur les esp ces les plus abondantes de la communaut 28 Bz6C lamp E Li d E B s n 2 Increasing conc of denaturants Direction of electrophoresis m 1 R Reference pattern A Organism 1 B Organism 2 Organism 3 M Mix of organisms 1 2 and 3 S unknown sample Figure 1 7 Gauche Principe g n ral du DGGE tir de Temmerman et al 2004 Droite Gel DGGE exp rimental Le DGGE a t maintes fois utilis avec succ s afin de diff rentier des communaut s expos es ou non diff rents contaminants Cette approche s est montr e effi
70. de vie Effectivement afin de produire des r sultats minimalement fiables la mod lisation SSD requiert la r alisation d essais de toxicit sur un minimum de 10 esp ces diff rentes Au contraire l application du mod le d longation ne requiert que quelques grammes de sol par niveau de concentration et est bas sur une technique tr s r pandue Et si une similitude entre les courbes concentration r ponse bas es sur les indices 118 de diversit et les SSD ne peut pas tre tablie les donn es cotoxiques produites partir de cette approche constituent tout de m me une source d information tr s pertinente afin de mieux comprendre l effet des contaminants sur des groupes taxonomiques tr s importants dans les cosyst mes terrestres Dans ce projet seules les communaut s bact riennes des sols ont t cibl es Par contre l approche propos e peut galement s appliquer aux communaut s fongiques et arch ennes des sols si diff rentes amorces PCR sont choisies L tude simultan e de ces trois groupes permettrait d avoir une vision plus globale de l effet des contaminants sur les communaut s microbiennes des sols Par contre avant d utiliser le mod le d longation pr sent dans cette th se afin d tudier ces communaut s il faudra revoir le param trage du mod le afin d adapter le mod le aux communaut s fongiques et arch ennes Finalement il importe de mettre de l avant que l approche
71. def options if strempi AcceptationPic 1 N 0 amp amp strempi AcceptationPic 1 0 0 AcceptationPic end end AcceptationPic strempi AcceptationPic 1 0 if AcceptationPic 1 InfoPic while size InfoPic 1 prompt Position Valeur dlg title Modification Ajout num_lines 1 C 0 B 0 def C B options Resize on options WindowStyle normal InfoPic inputdlg prompt dlg_title ynum_lines def options if size InfoPic 1 0 Centre str2num InfoPic 1 Valeur str2num InfoPic 2 end end for i 1 length Centre Ind find A 1 Centre 1 if size Ind 1 228 A Ind 2 Valeur i else A A Centre 1 Valeur i A sortrows A l end end close figure 1 close figure 2 hold on figure 1 plot Vecteur plot A 1 A 2 1 hold off option fitoptions Method PchipInterpolant Courbe feval fit A 1 A 2 pchipinterp option 1 Longueur Vecteurl Vecteur Courbe figure 2 plot Vecteur1 AcceptationPic else AcceptationPic 1 end end 229 Nom du fichier QuantificationPics m Description QuantificationPics sert d terminer l abondance relative de chaque pic DGGE sur un profil L algorithme interagit avec l utilisateur ce dernier entre dans une fen tre la position centrale des pics devant tre quantifi s moins de 10 pics la fois L algorithme optimisera alors
72. dent cette capacit mais demeurent pour le moment peu disponibles pour plusieurs chercheurs et ou laboratoires Au contraire la technique du DGGE est tr s r pandue et permet d analyser rapidement un grand nombre d chantillons Par contre aucune approche analytique ne permet actuellement d utiliser le DGGE des fins quantitatives Afin de d velopper une telle approche le PCP semble tre une substance id ale En effet ce contaminant se retrouve fr quemment dans les cosyst mes naturels canadiens poss de des propri t s physico chimiques susceptibles de faire varier sa toxicit en fonction de la composition du sol utilis et a t test sur plusieurs esp ces terrestres diff rentes De plus son effet sur les microorganismes du sol a fait l objet de quelques publications Il sera int ressant de comparer la r ponse et la sensibilit d un indicateur bas sur la diversit bact rienne des sols des mesures biochimiques cette fin la mesure du potentiel d activit hydrolytique de la FDA un essai simple produisant des r sultats corr l s aux mesures de biomasse microbienne semble tre id ale Effectivement la biomasse microbienne s est av r e tre un indicateur sensible au PCP dans plusieurs tudes diff rentes 2 2 Hypoth se de recherche et objectifs L hypoth se de recherche qui sous tend les travaux pr sent s dans cette th se est la suivante La technique de l lectrophor se sur gel en grad
73. employ e dans ce projet n est pas le seul moyen d accro tre la disponibilit des donn es cotoxiques terrestres Effectivement une certaine quantit d indicateurs cotoxiques concernant des esp ces de mammif res et d oiseaux sont galement disponibles Par contre ces indicateurs ne sont pas utilisables avec les donn es concernant les esp ces contact direct Il serait possible de d velopper une approche permettant d utiliser simultan ment les deux types de donn es non seulement pour augmenter la disponibilit des donn es mais aussi pour accro tre la repr sentativit des s ries de donn es cotoxiques terrestres utilis es afin d ajuster des courbes SSD 119 CONCLUSION Les travaux pr sent s dans cette th se portaient sur l tude de l effet du pentachloroph nol sur la diversit des communaut s bact riennes des sols partir de la technique de l lectrophor se sur gel en gradient d naturant Le projet s appuyait sur l hypoth se de recherche suivante La technique de l lectrophor se sur gel en gradient d naturant peut permettre la production d un indicateur cotoxique quantitativement repr sentatif de l effet du pentachloroph nol sur la diversit taxonomique des bact ries du sol La m thode d longation des RAD DGGE a permis de produire des estim s de diversit pr cis lorsque des profils de migration in silico ont t tudi s De plus les estim s de diversit produits
74. en quatre sous chantillons Pour chaque sol trois de ces chantillons sont contamin s diff rentes concentrations en PCP 100 900 et 3000 mg kg En analysant les m mes chantillons partir de deux approches diff rentes ce manuscrit vise galement identifier les sources de distorsion inh rentes aux deux techniques et proposer des moyens permettant de r duire leur importance Puisque la diversit des communaut s bact riennes des sols tudi s n est pas connue il ne sera pas possible de conclure quant la sup riorit de l une ou l autre des approches utilis es Par contre l existence d une relation lin aire significative entre la diversit estim e partir du DGGE et de l Ion torrent permettra de conclure que l une et l autre de ces approches ont la capacit de produire des r sultats similaires lorsqu utilis es des fins comparatives 69 5 2 Can DGGE and Ion Torrent sequencing yield similar quantitative conclusions when comparing the diversity of soil bacterial communities 5 2 1 Abstract Denaturing gradient gel electrophoresis DGGE is a technique that has been used extensively to study soil bacterial communities Considering only the most abundant phylotypes this technique is known to produce diversity estimates uncorrelated to true community diversity Recently a framework to accurately quantify the diversity of these communities using DGGE was published This paper aims
75. es Potentially affected fraction of species PCP Pentachloroph nol PCR R action en chaine par polym rase Polymerase Chain Reaction PNUE Programme des Nations Unies pour l Environnement RAD Distribution de rang abondance Rank abundance distribution RSSI Index de stabilit relative des sols Relative Soil Stability Index SIR Respiration induite par l ajout de substrat Substrate Induced Respiration SSD Distribution de sensibilit des esp ces Species Sensitivity Distribution Taq polym rase Polym rase enzyme thermostable initialement isol e de la bact rie Thermus aquaticus INTRODUCTION L importance de la diversit biologique sur la r sistance et la r silience des cosyst mes face des perturbations naturelles ou anthropiques n est plus d montrer Cleland 2012 R alisant que la contamination des milieux naturels avait une influence n gative sur la biodiversit des cosyst mes plusieurs outils de gestion environnementale tels que l analyse de risque environnemental ARE et l analyse du cycle de vie ACV ont vu le jour Afin d tre utilis s ces outils n cessitent l estimation de l effet des contaminants sur la biodiversit des cosyst mes qui repose majoritairement sur des essais de toxicit r alis s en laboratoire Consid rant que la capacit estimer l effet d un contaminant sur un cosyst me donn d pend notamment du nombre d esp ces ayant test es Wheeler Grist
76. es en termes d esp ces test es Les donn es disponibles sont fortement polaris es sur quelques esp ces de plantes terrestres appartenant au phylum Magnoliophyta laitue mais soya etc ainsi que sur certains vers et arthropodes Tel que rapport par d autres auteurs les microorganismes sont fortement sous repr sent s dans les bases de donn es terrestres Suter II et al 2001 Pour ces organismes les quelques donn es qui existent ont g n ralement t d riv es de mesures tr s g n rales d activit enzymatique ou microbienne de biomasse ou l aide de d comptes sur boites de P tri La faible disponibilit des donn es cotoxiques est donc une limitation importante l application de l approche SDD pour les cosyst mes terrestres 1 3 Importance structure et diversit des communaut s microbiennes des sols La production d indicateurs cotoxiques repr sentatifs des communaut s microbiennes dans les sols permettrait la g n ration d information hautement pertinente sur un groupe syst matiquement sous repr sent dans les bases de donn es En effet ces communaut s sont essentielles au bon fonctionnement des cosyst mes terrestres pour un bon aper u voir Paul 2007 et van Elsas et 20 al 2007 et sont immens ment diversifi es Torsvik and Ovreas 2007 En r alit ces communaut s sont parmi les plus diversifi es sur Terre chaque gramme de sol peut contenir plus de 1000 esp ces de champig
77. est d ailleurs un sujet de recherche effervescent Dans une tude il a t exp rimentalement montr que la diversit bact rienne avait un effet b n fique la fois sur la stabilit de la communaut et sur la capacit des fonctions du sol r cup rer des perturbations Girvan et al 2005 Allant encore plus loin Wittebolle et al 2009 ont trouv un lien entre l quit initiale des communaut s bact riennes et la stabilit du processus de d nitrification dans le sol Encore ici le lien entre diversit et stabilit n est pas direct 1 4 Evaluation de l effet des contaminants sur la communaut microbienne d un sol La multitude d indicateurs permettant d tudier l effet des contaminants sur les communaut s microbiennes des sols ont fait l objet de plusieurs revues Imfeld and Vuilleumier 2012 Kirk et al 2004 Winding Hund Rinke and Rutgers 2005 De fa on g n rale ces techniques peuvent tre divis es en deux grandes classes les approches fonctionnelles et mol culaires 21 1 4 1 Approches fonctionnelles Les indicateurs de type fonctionnels sont principalement associ s l tude des processus r actions biochimiques rendus possibles par l action des microorganismes Cette classe de tests regroupe les mesures de respiration du sol de d composition de la mati re organique de biomasse microbienne de potentiel d activit enzymatique ou d activit microbienne Winding et
78. et 5 jusqu a ce que tous les standards aient t filtr s Si Vactivit des chantillons est lue plusieurs fois r plicas le m me filtre peut servir pour tous les r plicas Entre chaque chantillon ou blanc bien rincer la seringue avec de l eau d ionis e 7 Pr lever du surnageant dans un erlenmeyer en prenant bien soin de pr lever le moins de particules solides possible 8 Fixer un filtre au bout de la seringue 9 Filtrer dans une cuvette pour spectrophotom tre 10 Reprendre les tapes 7 9 jusqu ce que tous les chantillons aient t filtr s 11 Mesurer l extinction 490 nm avec un spectrophotom tre contre la solution standard ne contenant pas de fluoresc ine CALCULS L activit hydrolytique de la FDA est exprim e comme la quantit de fluoresc ine produite par g de mati re s che et le temps d incubation smee E e 1 HUM MS Activit Activit hydrolytique umol fluoresc ine 2h g sol sec E valeur moyenne des chantillons umol fluoresc ine C valeur des contr les umol fluoresc ine MS Masse de sol ajout s dans l erlenmeyer g humide HUM Teneur en eau du sol sur une base s che g H20 g sol sec 216 ANNEXE 2 CODES MATLAB CR S AFIN D ANALYSER LES PROFILS DGGE ET DE QUANTIFIER LA DIVERSIT BACT RIENNE PARTIR DU DGGE Code 13 Lecture ASS Me Ur eia ete ped bae dee ed s na a PEE QUERI rene ton 217 Code 2 Xj stementb ane Mison E E Y EORR dike coal
79. et les mati res liquides organiques Les chantillons de mati res liquides aqueuses sont extraits avec de l hexane l aide d un agitateur m canique Les chantillons de mati res solides sont d abord d shydrat s avec du sulfate de magn sium anhydre puis extraits avec de l hexane l aide d un bain ultrasons Quant aux mati res liquides organiques elles sont dilu es dans l hexane Par la suite du gel de silice est ajout 203 a l extrait pour adsorber les substances polaires puis l hexane surnageant est analys par chromatographie en phase gazeuse coupl e a un d tecteur a ionisation de flamme CG DIF MAT RIEL Appareillage Balance analytique dont la sensibilit est de 0 01 g Balance analytique dont la sensibilit est de 0 0001 g Agitateur rotatif environ 25 rotations la minute Agitateur culbutage environ 100 rotations la minute Bain a ultrasons dont la puissance est d environ 200 watts Syst me d vaporation sous jet d azote avec aiguilles de type N Evap Chromatographe en phase gazeuse muni d un injecteur automatique on column coupl un d tecteur a ionisation de flamme GC FID Colonne chromatographique capillaire de type DB 1 ou l quivalent dont les dimensions sont de 15 m x 0 53 mm Di x 0 15 um Logiciel d acquisition et de traitement des donn es Bouteille d extraction de 30 ml en verre de borosilicate avec septum de silicone TF
80. if length Sequence Debut end gt 1 if length Sequence Debut end lt 250 Ech4 E4 1 Header Structure i Header Ech4 E4 1 Sequence Sequence Debut end Qual4 E4 1 Header Quality 1 Header Qual4 E4 1 Sequence num2str Qualite Debut end EA E441 Sequence Sequence Debut end Qualite Qualite Debut end gt Il v 0 0 0 0 QaAAInS Il Il Calcul du GC for j 1 length Sequence if strempi Sequence j A 1 A A elseif strempi Sequence j T 1 T T elseif strempi Sequence j G 1 G G 1 elseif strempi Sequence j C 1 C C l end end GC G C A T G C Longueur length Sequence Intl 0 Int2 0 Int3 0 Int4 0 Int5 0 Int6 0 Int7 0 Int8 0 Int9 0 Int10 0 Int11 0 Int12 0 Int13 0 Int14 0 Int15 0 Int16 0 Int17 0 Int18 0 Int19 2 0 Int20 0 for xx 1 Longueur if Qualite xx lt 1 Intl Int1 1 elseif Qualite xx Int2 Int2 1 elseif Qualite xx 3 Int3 Int3 1 elseif Qualite xx 4 Int4 Int4 1 elseif Qualite xx Int5 Int5 1 elseif Qualite xx Int6 Int6 1 elseif Qualite xx 7 Int7 Int7 1 elseif Qualite xx 8 Int8 Int8 1 elseif Qualite xx Int9 Int9 1 elseif Qualite xx Int10 Int10 1 elseif Qualite xx 11 Int1 17 Int117 1 elseif Qualite xx 12 Int12 Int12 1 elseif Qualite xx 12 Int13 Int13 1 elseif Qu
81. indicateur s tant montr sensible au PCP Ce manuscrit a donc cherch comparer la sensibilit des mesures bas es sur la diversit des communaut s bact riennes celle du potentiel d activit hydrolytique de la FDA Aussi vu la tr s grande diversit g n tique des communaut s bact riennes des sols une courbe concentration r ponse trac e partir d une mesure de diversit bact rienne peut s apparenter aux courbes SSD trac es afin d estimer la sensibilit des cosyst mes face aux contaminants Le manuscrit vise donc galement comparer la sensibilit des communaut s biotiques terrestres l chelle microscopique et macroscopique 95 6 2 Assessing the impact of pentachlorophenol on soil bacterial communities using ecological diversity indices 6 2 1 Abstract Species sensitivity distribution SSD is a central concept in assessing the impact of xenobiotics on natural ecosystems and deriving environmental quality criteria Data scarcity is a major limitation to SSD modeling especially for terrestrial ecosystems Until now the impact of pentachlorophenol PCP on soil bacterial communities was mostly evaluated using functional indicators yielding highly variable results The aim of this paper was to assess the usefulness of ecological diversity indices to model the impact of pentachlorophenol on soil bacterial communities Two different soils were contaminated with PCP at seven different concentrations The e
82. invert br s U S Environmental Protection Agency 2007 Sur la base des donn es toxiques et cotoxiques disponibles l EQC du PCP dans les sols canadiens a t fix 7 6 mg kg Canadian Council of Ministers of the Environment 1999 Une valeur semblable de 12 mg kg est en vigueur aux Pays Bas Ministry of Housing Spatial Planning and the Environment 2009 L effet du PCP sur les microorganismes dans des sols a galement fait l objet de quelques tudes Dans une tude il a t montr que des concentrations de PCP entre 10 et 50 mg kg avaient un effet n gatif significatif sur la croissance de Phanerochaete chrysosporium un champignon largement tudi pour ses capacit s d grader les x nobiotiques LeStan LeStan Chapelle and Lamar 1996 Ces auteurs ont galement tabli qu il existait une forte corr lation entre la biomasse microbienne de P chrysosporium et une mesure simple d activit enzymatique la mesure du potentiel d activit hydrolytique de la fluoresc ine diac tate FDA Scelza et al 2008 ont compar plusieurs param tres biochimiques de sols agricoles propres et artificiellement contamin s au PCP 50 mg kg Parmi ces param tres l activit de plusieurs enzymes 32 d hydrog nase arylsulfatase phosphatase et ur ase ainsi que les mesures de biomasse microbienne ont t significativement affect es par la pr sence du PCP L activit de la glucosidase une enzyme impliqu e dans le c
83. is hard to tell which of LMcin or Sen is the most diversified in terms of dominance when comparing the DGGE profiles of both samples the Ion Torrent 1 D value calculated for sample LMcin is more than 30 higher than the value corresponding to Scin Tableau A4 2 In contrast DGGE ranked these samples as almost equally diversified The same was observed for LM3000 and LM300 the sequencing based 1 D corresponding to LM300 was almost two times lower than the value corresponding to LM3000 In conclusion contrary to what the discussion may seem to suggest next generation sequencing technologies are undoubtedly much more powerful than DGGE Indeed this paper only sought to carry out a comparative assessment of the diversity of soil bacterial communities If phylogenetic information is also required DGGE is completely outcompeted by sequencing technologies Results have shown that the Ion Torrent platform and maybe other platforms too must still account for potential distortions and other quality considerations Of course the magnitude of the DGGE based diversity estimates can also be seen as uncertain However these values were found to be highly repeatable Overall both approaches would have led to the same conclusions if the impact of PCP contamination was quantified This is significant considering that the DGGE RADs elongation framework was developed from in silico profiles drawn using GS FLX datasets while 93 this paper analyzed some
84. le transilluminateur du syst me Quantum ST4 Mettre des lunettes de protection contre les rayons UV allumer l appareil enfoncer les boutons Power UV ainsi que le bouton marqu D un triangle contenant un point d exclamation ce bouton fait en sorte que le rayonnement UV continue lorsque la porte de l appareil est ouverte les bandes d ADN devraient apparaitre en rouge sur le gel 169 22 A l aide d une spatule m tallique ou d un scalpel couper le gel afin d extraire uniquement la bande d ADN correspondant au produit d sir produit de la bonne longueur R aliser cette op ration pour chaque chantillon en prenant soin de st riliser la spatule ou le scalpel l aide d thanol 10096 et d un br leur 23 Dissoudre les bandes excis es en suivant le protocole fourni avec le kit d extraction GenElute M R F RENCE S Villemur Richard Protocoles de l institut Armand Frappier RECOMMANDATION S Les r actifs et la pr paration de la r action doivent tre effectu s dans des endroits diff rents afin d viter la contamination crois e Il faut travailler sous une hotte biologique lorsqu on pr pare une r action PCR Tout objet que l on introduit l int rieur de la hotte biologique doit tre nettoy avec une solution d thanol 7096 Ceci aura pour effet d liminer une contamination due aux manipulations Le port des gants est obligatoire lorsqu on manipule la solution de bromure d thidium
85. les param tres position central cart type et amplitude d une distribution Gaussienne pour chaque pic de fa on a repr senter le plus fid lement possible le profil DGGE dont le bruit de fond a t pr alablement soustrait Auteur Jonathan Lalande clear all close all cle InfoDonnees Le fichier AppelQuantificationVecteur ne contient qu un vecteur colonne correspondant au volume sous le couloir de migration de l echantillon a analyser while size InfoDonnees 1 prompt Nom du fichier pour la lecture des donnees Nom de la feuille Cellules contenant les donnees dlg title Nom du fichier pour la lecture des vecteurs a analyser num lines 1 A Phenol xlsx B Phl C E2 E10241 def A B C options Resize on options WindowStyle normal InfoDonnees inputdlg prompt dlg title num lines def options end Vecteur xlsread InfoDonnees 1 InfoDonnees 2 InfoDonnees 3 Longueur length Vecteur for i 1 Longueur if Vecteur i lt 0 Vecteur i 0 230 end end Rang 1 Longueur Longueur length Vecteur Vecteurl Vecteur Vect_PositionMax 0 Avant 0 Apres 0 InfoResultats EcritureQuantificationPics est un fichier csv permettant de stocker les informations sur les pics deja quantifies Si j 1 debut de l analyse Le fichier EcritureQuantificationPics doit etre sauvegarde en format csv Colonne
86. lorsque le gel sera polym ris 1 Pr parer 71 de tampon TAE IX 178 a l aide d une cylindre gradu de 250ml pr lever 140 ml de solution TAE 50X et l ajouter dans le r cipient pour l lectrophor se b Compl ter avec de l eau d ionis e jusqu la jauge c est dire jusqu la ligne FILL 2 Placer le module contr leur d lectrophor se temp rature par dessus la cuve et s assurer que la tige rotative est plac e dans son enceinte dans la premi re fente dans la cuve 3 Mettre l appareil en fonction Le bouton de la temp rature doit tre ouvert 4 Ajuster la temp rature 60 C 5 Laisser le tampon atteindre cette temp rature environ 1h30 PE chauffage pompe alimentation g n rale Couvercle Z Module pour injecter les contr le chantillons lm Pompe _de Contr leur de recirculation du temp rature tampon Sonde 4 To Jauge tampon M s Figure A1 6 Appareil DGGE de Bio Rad Coulage du gel Pr parer une solution de persulfate d ammonium APS 1096 0 05g de persulfate d ammonium dans 500ul d H20 milli Q et placer sur de la glace 2 Mettre le TEMED sur de la glace Note lorsque les solutions sont froides la polym risation s effectue plus lentement et les risques d obstruction lors du coulage du gel sont moins lev s 3 S assurer que le mat riel pour couler le gel est totalement ass ch 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2
87. minimale ou maximale ou 4 non born s param tres peuvent tre favoris s 11 Weibull type 1 Weibull type 2 Log logistique Lognormale R ponse 0 10 100 1000 Concentration mg kg dw Figure 1 2 Comparaison de quatre distributions de probabilit s couramment utilis es afin de construire les courbes concentration r ponse Les diff rents mod les sont tr s semblables pour les r ponses situ es entre 20 et 80 mais diff rent passablement pour les percentiles plus faibles et plus lev s Plusieurs indicateurs toxicologiques peuvent tre extraits directement des s ries de donn es ou des courbes concentration r ponse Les indicateurs les plus souvent utilis s sont les concentrations sans effets observables No Observed Effect Concentration ou NOEC les concentrations avec un faible effet observable Lowest Observed Effect Concentration ou LOEC et les concentrations avec effet sur un certain percentile x de la population test e Effect Concentration ou ECx 12 La NOEC est la plus grande concentration test e ne pr sentant pas de diff rence statistique avec le contr le tandis que la LOEC est la plus faible concentration test e qui pr sente une diff rence statistique avec le contr le Larsen and Hauschild 2007 Ces deux indicateurs correspondent n cessairement une concentration test e au laboratoire Au contraire les EC sont extraits de la courbe concentration r ponse et ne correspondent
88. of the studied community that is not accounted for when only visible peaks are considered Unfortunately the relationship between the SBP and richness is not straightforward and was shown to depend on the abundance model to generate the simulated bacterial communities Used in conjunction with theoretical abundance models the SBP could make it possible to infer whole community RADs from DGGE banding patterns The most commonly used models to describe soil bacterial communities are the lognormal Blackwood et al 2007 Doroghazi and Buckley 2008 Dunbar Barns Ticknor and Kuske 2002 Loisel et al 2006 Narang and Dunbar 2004 the power law Gans Wolinsky and Dunbar 2005 nceo lu Al Soud Salles Semenov and van Elsas 2011 and the geometric Loisel et al 2006 Narang and Dunbar 2004 distributions and these abundance models could be used to elongate the partial DGGE based RADs to add the OTUs that are not abundant enough to produce a visible band on the gel The SBP would provide a stopping criterion for the elongation process indicating the length at which the distribution is complete If such a methodology could be developed it would allow for the accurate characterization of soil bacterial community diversity from DGGE fingerprints The main objective of this paper was to develop such a framework In the process of developing this framework the influence of certain analytical parameters background noise subtraction and
89. presented as the average minimum and maximum of all nine samples as well as the slope and coefficient of determination generated by linear regression analysis Diversity Analytical Relative deviation from true index Linear regression index methodology Average Min Max Slope R Peaks 99 3 99 7 98 3 4 5E 05 0 006 quantification Richness Elongation 4 5 10 8 30 5 0 93 0 969 framework Peaks 52 6 59 2 41 5 3 7E 02 0 075 quantification Shannon Elongation 2 9 0 4 7 1 1 16 0 992 framework Peaks 88 6 95 7 74 2 3 1E 03 0 009 quantification Simpson s 1 D Elongation 3 7 3 2 9 3 0 94 0 996 framework 4 2 5 Discussion 4 2 5 1 Representativeness of DGGE based dominance profiles In light of the complete results produced for this paper TableauA3 1 xlsx it can be concluded that analytical parameters highly influence DGGE based diversity surveys of complex bacterial communities The algorithm used to implement the rolling ball background subtraction method the chosen ball radius and the way peaks are delimited and quantified all influence the results to a 63 certain extent The most influential step is undoubtedly background noise subtraction Indeed by sharing the same rolling ball algorithm TotalLab Quant and GelCompar II behaved similarly while BIO 1D was completely different Furthermore indicator values were highly dynamic to ball size modifications for all the software programs It
90. preserved However since the beginning of the industrial era soil air and water contamination leads to a constant decrease in natural ecosystems diversity In order to protect ecosystems from diversity losses caused by xenobiotics ecotoxicological information about many different species is required This information on single species will be compiled and used to draw a species sensitivity distribution that allows estimating the effect of a contaminant on a whole ecosystem For terrestrial ecosystems data scarcity is a major limitation to the application of this framework Although necessary to the long term functioning of terrestrial ecosystems soil microbial communities are virtually absent from terrestrial ecotoxicological databases A major reason for that is linked with the technical difficulties in studying such small organisms Most of the publications that focused on the effect of xenobiotics to microbial communities measured functional parameters directly or indirectly linked to soil microorganisms such as microbial biomass or activity and enzymes activity Although highly informative of soil health these indicators showed important limitations when used as toxicity indicators Being very integrative those measures often showed increases after soil contamination especially if the tested contaminant is biodegradable Fractionating microbial communities into smaller distinct parts the species ecological diversity indices that consid
91. r e par le blanc PCR Figure 3 1 le profil de bruit de fond des chantillons a t d limit en reliant l intensit du signal observ aux deux extr mit s des profils Ce bruit de fond g n r par l interaction du gel avec la mol cule utilis e afin de colorer ce dernier ou par le passage dans le gel du produit amplifi par PCR qui peut contenir des nucl otides ainsi qu une certaine quantit de courts fragments d ADN ou de dim res d amorces etc ne sera pas consid r dans les analyses subs quentes Une fois que le bruit de fond est soustrait il faut d limiter la portion de signal attribuable aux esp ces abondantes pics visibles de celle g n r e par la multitude d esp ces n tant pas suffisamment abondantes pour produire une bande visible sur le gel Contrairement aux approches g n ralement employ es afin d analyser les profils DGGE l approche pr sent e dans ce chapitre 40 ne consid re pas le signal situ sous les pics visibles comme du bruit de fond Cette portion de signal est plut t associ e toutes les esp ces cibl es par les amorces DGGE mais trop peu abondantes pour produire une bande visible sur le gel Il a t montr que le ratio intensit sous les pics intensit sous le profil en entier appel ci apr s peak to signal ratio PSR tait reli la richesse des communaut s tudi es Loisel et al 2006 Afin de produire des r sultats quantitatifs il est donc p
92. results SSD modeling requires that a sufficient number of species be tested for a given contaminant Dowse Tang Palmer and Kefford 2013 The minimum size of the datasets was set at 10 data points Wheeler Grist et al 2002 and 96 should ideally cover as many taxonomic groups as possible von der Ohe and Liess 2004 Due to data scarcity the number of available data is generally much lower than 10 when focusing on terrestrial ecosystems and most of the data pertains to standard test species Frampton et al 2006 The derivation of relevant EQCs requires the production of more data on terrestrial taxonomic groups not included in the databases Soil microbial communities are among the most diverse and abundant on Earth Gans et al 2005 and play key roles in terrestrial ecosystems van der Heijden et al 2008 Though numerous papers have studied the impact of xenobiotics on these communities they are hardly represented in ecotoxicological databases Suter II et al 2001 This lack of data can probably be linked to technical difficulties in studying such complex communities and small organisms Earlier papers focused on functional parameters in order to evaluate the adverse effects of xenobiotics Filip 2002 However these indicators present several limitations when used as toxicity indicators Indeed some indicators increased following contaminants addition to soils Macur et al 2007 Scelza et al 2008 Other parameters
93. str2num Type 2 DebutY str2num Type 3 ValXDeb str2num Type 4 ValXFin str2num Type 5 end if numel NoEch 1 numel DebutX numel DebutY numel ValXDeb 1 numel ValXFin 1 Type Revoir le nombre d l ments par vecteur ok lt NOPTS gt end if NoEch 0 Type Indiquer un numero d echantillon ok lt NOPTS gt end end if DebutX 1 0 for i 1 length DebutX if i length DebutX 221 for j DebutY i NbLignes PositionDebut j NoEch DebutX i end else Pente DebutX i 1 DebutX i DebutY i 1 DebutY i for j Debut Y 1 Debut Y i 1 PositionDebut j NoEch round Pente j DebutY 1 DebutX 1 end end end end Largeur ValXFin ValXDeb PositionFin NoEch PositionDebut NoEch Largeur elseif strempi Type 1 d Type while size Type 1 0 prompt Numero des chantillons a corriger s parer les l ments par des espaces D calage d but requis gauche n gatif D calage fin requis dlg title Type de probl me r gler num_lines 1 A num2str 0 B num2str 0 C num2str 0 def A B C options Resize on options WindowStyle normal Type inputdlg prompt dlg_title num_lines def options if size Type 1 0 NoEch str2num Type 1 Debut str2num Type 2 Fin str2num Type 3 222 end if numel NoEch numel Debut numel NoEch numel Fin Ty
94. such as enzyme activity were directly inhibited by certain substances making it difficult to differentiate between toxicity and inhibition Vig Megharaj Sethunathan and Naidu 2003 The advent of molecular microbiology opened the way through many different fingerprinting techniques Imfeld and Vuilleumier 2012 Kirk et al 2004 to the study of soil bacterial community diversity Focusing solely on the most abundant phylotypes the methods do not produce estimates correlated to the actual diversity of the communities Blackwood et al 2007 Lalande Villemur et al 2013 Even though next generation sequencing technologies make it possible to study microbial communities with unprecedented depth Weinstock 2012 the costs sequencer availability and potential biases in sequencing datasets Jaenicke et al 2011 Nacke et al 2011 Pinto and Raskin 2012 can still be problematic To overcome these limitations a new framework to accurately quantify soil bacterial community diversity using a PCR denaturing gradient gel electrophoresis DGGE methodology a widespread low cost and high throughput fingerprinting technique was recently published The methodology was developed on in silico DGGE migration profiles synthesized using pyrosequencing datasets Lalande Villemur et al 2013 and then further validated on real samples Lalande Yergeau Greer Villemur and Deschenes 2013 The framework yielded diversity estimates highly repres
95. thodologie utilis e afin d analyser les r sultats des NGS algorithme de groupement pourcentage de similitude algorithmes de d tection et suppression des erreurs et des chim res a une grande influence sur les estim s de diversit produits l aide de ces technologies Dans le but d accroitre l applicabilit et l acceptabilit de la m thode d longation des RAD DGGE pour les tudes comparatives de diversit il serait int ressant de comprendre l influence quantitative de la m thodologie d analyse des donn es de s quengage non pas sur les estim s de diversit eux m mes mais bien sur la comparaison de ces derniers e D termination de la provenance de l ADN analys a partir des approches mol culaires Dans cette th se il a t observ que la diversit bact rienne des sols diminuait mesure que la concentration en pentachloroph nol augmentait mais qu partir d une certaine concentration la diversit semblait augmenter Pour un des deux sols utilis s le profil DGGE correspondant l chantillon le plus contamin ressemblait trangement au profil DGGE de l chantillon propre Dans le but de proposer l utilisation de tests de toxicit de routine bas s sur la diversit des communaut s bact riennes dans les sols il serait tr s important de d terminer la cause de ces augmentations de diversit fortes concentrations L ADN 122 provenant d organismes morts a le potentiel de g n rer des distors
96. those produced by other authors Marti et al 2011 These authors obtained ECso ranging between 263 and 588 mg kg for cumulative soil respiration and between 52 and 690 mg kg for substrate induced respiration From their DGGE migration profiles they visually determined that the community structure began to change at concentrations between 10 and 100 mg kg The diversity based ECso presented here are lower than these functional ECso Tableau 6 3 except for the value of 52 mg kg The ECs of 52 mg kg produced by Mart et al 2011 corresponded to a soil with a pH of 8 0 and an organic carbon content of 1 7 w w The aqueous solubility of PCP is strongly affected by pH Arcand et al 1995 and organic carbon plays an important role in PCP adsorption in soils Cea et al 2007 Considering that PCP bioavailability in the soil used by Marti et al was probably particularly high it is not surprising that the ECso produced for this soil was low Another element to consider in order to recommend the use of diversity based indicators for toxicity modeling is the robustness of the indices The structure based indices like exp and especially 1 D are much more robust than community richness Haegeman et al 2013 and can be seen as suitable for C R modeling With its low dependence towards richness high robustness and high sensitivity to changes in community structure 1 D was deemed to be the most satisfactory index A point that must be addressed is th
97. to the tested environments Furthermore unlike traditional SSD modeling the assessment of the diversity of soil bacterial communities implicitly considers the intra and inter species interactions Of course the results produced here for PCP cannot be generalized to other contaminants If similarities in the sensitivity of bacterial and higher species communities can be established for other contaminants or classes of contaminants this 112 methodology has the potential to help fill many gaps in terrestrial ecotoxicological databases and the understanding of the impact of xenobiotics or complex mixtures on terrestrial ecosystems If the similarities observed here for PCP are fortuitous the framework still has the potential to provide relevant information on the toxicity of xenobiotics to organisms virtually absent from the ecotoxicological databases the soil bacterial archeal and fungal communities 6 2 6 Acknowledgements The authors would like to sincerely thank Lucie Jean for her precious help with the laboratory work carried out to produce this paper The authors also acknowledge the financial support of the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada The CIRAIG would also like to thank its industrial partners for their financial support ArcelorMittal Bombardier Bell Canada Cascades Eco Entreprises Qu bec RECYC QUEBEC Groupe EDF Gaz de France Hydro Qu bec Johnson amp Johnson LVMH Michelin Mouvement des
98. to verify if this framework and next generation sequencing platforms can yield similar diversity estimates when working on real samples To do so the impact of pentachlorophenol on bacterial diversity was quantified using both DGGE profiling and Ion Torrent sequencing Using two different techniques to study the same communities made it possible to find biases for both methodologies For DGGE localized gel saturation was identified as the most important bias For the Ion Torrent datasets many previously described biases sampling depth sequencing errors and GC content considerations proved to influence the diversity estimates in a sample specific way Reducing the extent of the different sources of bias allowed finding significant correlations between the diversity estimates produced by DGGE and Ion Torrent The results are promising since two very different techniques were able to yield similar conclusions when comparing the diversity of soil bacterial communities 5 2 2 Introduction As global diversity decreases and the pressure on natural ecosystems increases Butchart et al 2010 environmental microbiologists now require tools to routinely assess compare and follow soil bacterial community diversity trends These tools must be fast reproducible accessible and most of all produce environmentally relevant diversity estimates Even if these highly diverse and complex communities Roesch et al 2007 can be studied in great depth using nex
99. tr s grande influence sur la quantification des bandes sur les gels DGGE et PCR Trois options sont disponibles dans Bio 1D Rolling ball Vall e vall e et lin aire La soustraction du bruit de fond de profils de communaut s bact riennes de sols n est pas vidente Normalement ces profils sont caract ris s par un bruit de fond important surtout au centre du profil Voici une description des diff rentes approches ainsi que des conseils Rolling ball Une balle de taille choisie par l utilisateur roule virtuellement sous les profils et soustraie le signal se trouvant en dessous du centre de la bille L utilisateur n a qu choisir un diam tre de bille commun pour tous les profils et cliquer sur le bouton Rolling Ball Cette m thode de soustraction est tr s populaire mais le choix de la taille de la bille pose probl me Une trop grosse bille laissera beaucoup trop de signal sous les profils Une bille trop petite cr era une forte distorsion du profil la bille entrera profond ment dans les pics et soustraira presque tout le signal Le Rolling Ball est donc attrayant par sa simplicit mais la fiabilit des r sultats produits est douteuse 193 Vall e vall e La soustraction vall e vall e correspond en fait une soustraction r alis e par une courbe d finie par l utilisateur propre chaque profil Figure A1 12 Cette m thode est subjective mais si les profils sont attentivement observ s il e
100. une profondeur de s quen age plus ou moins lev s nombre de s quences de bonne qualit par chantillon Ainsi l estimation de la richesse d une communaut requiert la lecture de beaucoup plus de s quences que d autres indices i e Shannon et Simpson Pinto and Raskin 2012 1 5 Le pentachloroph nol comme cadre d tude Le PCP constitue un cadre d tude tr s int ressant et d actualit Ayant t tr s utilis afin de traiter le bois et blanchir le papier ce dernier se retrouve fr quemment dans les cosyst mes naturels canadiens Canadian Council of Ministers of the Environment 1999 Le PCP est un contaminant hydrophobe ayant tendance s adsorber sur la mati re organique Puglisi et al 2009 De plus ce compos est ionisable pKa 4 7 Boyle 2006 ce qui implique que sa solubilit aqueuse augmente avec le pH Arcand Hawari and Guiot 1995 D s lors la biodisponibilit et la toxicit du PCP peut varier en fonction des propri t s physico chimiques des sols En plus d avoir des propri t s int ressantes le PCP est un contaminant dont la toxicit envers divers organismes terrestres a t test e Cette substance semble tre particuli rement toxique envers les plantes terrestres Effectivement la valeur seuil concentration au del de laquelle un effet peut commencer tre ressenti du PCP a t d termin e 5 mg kg pour les plantes terrestres alors qu elle est de 31 mg kg pour les
101. very challenging experimental DGGE profiles and compared the results with diversity estimates drawn from a dataset produced by an Ion Torrent PGM The results are promising for researchers using DGGE and those using next generation sequencing technologies Even though the two methodologies are quite different they lead to similar portraits of soil bacterial communities 5 2 6 Acknowledgements The authors would like to sincerely thank Sylvie Sanschagrin and Christine Maynard for their support in producing the sequencing datasets The authors acknowledge the financial support of the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada The CIRAIG would also like to thank its industrial partners for their financial support ArcelorMittal Bombardier Bell Canada Cascades Eco Entreprises Qu bec RECYC QUEBEC Groupe EDF Gaz de France Hydro Qu bec Johnson amp Johnson LVMH Michelin Mouvement des caisses Desjardins Nestl Rio Tinto Alcan RONA SAQ Solvay Total Umicore and Veolia Environment 94 CHAPITRE6 D TERMINATION DE L EFFET COTOXIQUE DU PENTACHLOROPHENOL SUR LA DIVERSITE DES COMMUNAUTES BACTERIENNES DES SOLS Cette section est centr e autour du troisi me manuscrit intitul Assessing the impact of pentachlorophenol on soil bacterial communities using ecological diversity indices section 6 2 soumis a la revue The ISME Journal soumis le 8 mai 2013 6 1 Lien entre le deuxi me et le troisi me manu
102. 0 179 S assurer de fermer les deux valves de la chambre gradient Tracer une marque sur la petite vitre du montage sandwich indiquant la position du bas des puits Fixer le tube de caoutchouc la sortir de la chambre gradient et fixer l aide d un ruban adh sif le bout de l aiguille au centre des deux vitres du montage sandwich Avec une micropipette de 200ul ajouter 150u1 de persulfate d ammonium chacune des solutions Avec une micropipette de 20ul ajouter 15 ul de TEMED chacune des solutions M langer en remuant d licatement les b chers Verser la solution ayant la plus forte concentration d ur e formamide dans la chambre avant de la chambre gradient Afin d enlever la bulle d air entre les deux chambres ouvrir l g rement la valve reliant les chambres de fa on ce que l espace se remplisse de solution et fermer la valve Si de la solution se retrouve dans la chambre arri re pr lever cette solution l aide d une pipette et la remettre dans la chambre avant Verser la solution basse concentration dans la chambre arri re Ajouter un petit barreau magn tique dans chaque chambre et commencer l agitation vitesse moyenne Positionner la chambre gradient sur la plaque agitatrice de fa on ce que les barreaux magn tiques perturbent le moins possible l coulement des solutions attention le tube de caoutchouc pourrait se d crocher de la chambre gradient s il n est p
103. 0 Comptl 1 Hit 0 for i 1 Nombre Hit2 0 Hit3 0 Debut 1 if 1 50000 round i 50000 i Nombre end Sequence Structure i Sequence Qualite str2num Quality i Sequence Longueur length Structure 1 Sequence if Longueur gt 75 oldentification de la position juste apres le primer forward for k 1 min 100 length Sequence length Primerf Segl Sequence k k length Primerf 1 if sum Seq1 Primerf gt length Primerf 2 Debut k length Primerf Hit3 1 break end end Trim de la s quence avant le primer reverse si le primer f a t Yotrouve if Hit3 for k length Sequence length Primerr 1 1 Debut 100 Segl Sequence k k length Primerr 1 if sum Seq1 Primerr gt length Primerr 7 Sequence Sequence 1 k 1 Qualite Qualite 1 k 1 Longueur length Sequence Hit Hit 1 Hit2 1 break 253 254 end end end if Hit2 1 Miscall 0 if mean Qualite Debut end gt 0 5 for j 1 Debut 10 Seql Sequence j j 9 if sum Segl Ecl gt NumMin if length Sequence Debut end gt 1 if length Sequence Debut end lt 250 Ech1 E1 1 Header Structure 1 Header Ech1 E1 1 Sequence Sequence Debut end Qual1 E1 1 Header Quality i Header Qual1 E1 1 Sequence num2str Qualite Debut end El El Sequence Sequence Debut end Qualite Qualite Debut end Il gt Il 0 0 0 0 Oodd Il 2 Calcul du GC f
104. 0 7 2171 17 566 59 S3000 5 126 13 327 62 Figure 5 4 presents the evolution of 1 D exp and OTU richness when sampling depth is increased Considering these curves it is obvious that the Ion Torrent diversity indices underestimate the diversity of the studied soil bacterial communities Indeed even at 35 000 reads exp and especially OTU richness did not reach their plateau values On the contrary 1 D values stabilized between 10 000 and 15 000 reads a value that was not reached for all samples It is important to note that the bias linked with sampling depth is sample dependent The samples showing high diversity and low community dominance required more reads than less diversified ones to reach a given index accuracy These results show the importance of normalizing the sequencing datasets to the same size prior to comparing diversity indices especially for OTU richness and exp The diversity indices that were produced by two normalizing frameworks normalized at 5 000 or at 35 000 reads using the DGGE R ADS are presented as supplementary material Tableau A4 2 82 Simpson s 1 D 1 0 ao 3 2 S_cin x 08 ao g S_300 co 2 Hh 06 f eL S 900 o m c L 3000 S 3000 04 4 T T T T T T T 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 Number of reads Shannon exp H ao 3 o gt x aD T ao 2 S Q r4 0 0 T T T T T T 1 0 5000 10000 150
105. 0 fois chaque r p tition permettant th oriquement de multiplier par 2 le nombre de brins d ADN dans l chantillon tir de http users ugent be avierstr principles pcr html La distorsion introduite dans les tudes de diversit par la technique du PCR a t tudi e extensivement Il a t rapport que l amplification PCR pourrait tre plus ou moins efficace pour certaines s quences et donc esp ces que pour d autres causant ainsi certaines distorsions dans 26 l abondance relative des diff rentes esp ces composant la communaut Kurata et al 2004 Polz and Cavanaugh 1998 De plus les polym rases utilis es afin de r aliser l amplification poss dent un taux d erreur intrins que Cline Braman and Hogrefe 1996 Ces erreurs qui se produisent lorsque la polym rase substitue une base pour une autre lors de l tape d extension seront amplifi es lors des cycles subs quents et cr eront des s quences d ADN qui n existaient pr alablement pas dans l chantillon de base augmentation de la diversit apparente Une autre distorsion potentiellement importante peut se produire lors de l amplification de l ADN d une communaut enti re grand nombre d esp ces diff rentes Effectivement le milieu de r action contient un grand nombre de s quences d ADN diff rentes qui peuvent par hasard tre compl mentaires sur une certaine r gion et s apparier entre elles Cela m ne la format
106. 00 NbSeql 100 250 500 1000 2500 5000 10000 15000 20000 25000 30000 NbSeql xlsread AppelCalculIndices art2 xlsx Vecteurs DGGE reprise A1 H1 Distl isnan Dist1 0 MoyRichesse zeros size Dist1 2 2 MoyShannon zeros size Dist1 2 2 MoySimpson zeros size Dist1 2 2 ICRichesse zeros size Dist1 2 1 ICShannon zeros size Dist1 2 1 ICSimpson zeros size Dist1 2 1 for 1 1 size Dist1 2 l Dist Dist1 1 X find Dist 1 last Dist Dist 1 X D Dist sum Dist Richesse length D Shannon exp sum D log D Simpson l sum D 2 for m 1 1 NbSeq NbSeq1 1 NbSeq 5000 275 Dist2 for i 1 length Dist Ajout i ones Dist i 1 Dist2 Dist2 Ajout end forj 1 50 Especes randsample length Dist2 NbSeq Dist3 zeros length Especes 1 for k 1 length Especes Dist3 k Dist2 Especes k end Table tabulate Dist3 P Table 2 P sort P descend X find P l last P P 1 X P P sum P Resultats 1 j exp sum P log P Resultats 2 1 sum P 2 Resultats 3 j length P end MoyRichesse l mean Resultats 3 Richesse MoyShannon l mean Resultats 1 Shannon MoySimpson l mean Resultats 2 Simpson ICRichesse l 1 96 std Resultats 3 sqrt 50 ICShannon l 1 96 std Resultats 1 sqrt 50 ICSimpson l 1 96 std Resultats 2 sqrt 50 end en
107. 00 20000 25000 30000 35000 Number of reads OTU richness 10 ao 308 gt S 06 g 04 S 02 0 0 T T T T T T 1 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 Number of reads Figure 5 4 The elongated DGGE RADS each containing 35 000 reads were randomly sampled without replacement at various depths ranging from 100 to 30 000 reads The impact of sampling was quantitatively assessed by dividing the diversity indices calculated at a certain depth by the values calculated at a depth of 35 000 Since DGGE gels were run in triplicate results were averaged for every sample Besides sampling depth sequencing errors also have the potential to influence diversity estimates Tableau 5 3 presents the results obtained when applying the pseudo single linkage clustering 83 algorithm Huse et al 2010 with a dissimilarity of 2 or 4 bases instead of 3 Interestingly this process influenced community dominance through 1 D a lot more than richness Especially for 1 D the impact of increasing or reducing the dissimilarity level is not linear and sample dependent Changing the dissimilarity level impacted the 1 D values of soil LM samples more than soil S samples These differences could be explained by the sampling depth achieved for soil S samples Tableau 5 2 since fewer sequences also mean fewer errors in absolute values These observations could indicate that by processes different from undersampling sampling depth may have more influ
108. 003 can influence the outcome of DGGE based diversity studies However biases linked to PCR amplification can be reduced by optimizing the PCR conditions and even if co migration was observed to occur on in silico DGGE profiles it was still possible to find very strong correlations between DGGE and sequencing based diversity estimates R gt 0 99 An element that could influence the outcome of DGGE based diversity studies that to the authors knowledge has never been described is the local saturation of DGGE gels Figure 5 3 made it clear 89 that gel saturation has the potential to hinder the brightest DGGE bands from reaching their full intensity As a dominance index 1 D proved to be affected by gel saturation Even though this process was visible when loading as little as 75 ng of E coli 16S rRNA gene PCR product saturation could occur in certain DGGE profiles for much smaller peaks if they are located in high background noise intensity regions Trying to determine whether gel saturation can be expected to be a widespread problem in previously published papers a review was conducted to find out how much DNA researchers usually load in their DGGE wells Surprisingly this parameter is rarely reported and the few authors who did mentioned it loaded between 300 Li et al 2008 and 800 ng well D ez Pedr s Ali Marsh and Massana 2001 The fact that saturation occurred for some samples when loading 400 ng well leads to the h
109. 02 1 Les pics DGGE sont donc compl tement repr sent s l aide de trois param tres la position centrale du pic sur le gel xo en pixels son amplitude A en niveaux de gris ainsi que sa largeur repr sent e par l cart type de la distribution c en pixels Un algorithme d optimisation a d abord t d velopp l aide du logiciel Matlab afin de d terminer automatiquement l amplitude et l cart type les plus repr sentatifs d un pic unique donn Cet algorithme n cessite comme param tres d entr un estim initial et des bornes minimales et maximales pour l amplitude et l cart type du pic ainsi qu un estim de la position centrale du pic d termin visuellement sur le gel L algorithme bas sur la fonction fmincon de Matlab optimisera ensuite ces param tres de facon repr senter le pic le plus fid lement possible 42 Lorsque les r sultats furent satisfaisants pour la quantification d un pic unique l algorithme fut g n ralis de fa on pouvoir optimiser plusieurs pics simultan ment L analyse des profils DGGE est interactive Figure 3 3 Dans une bo te de dialogue apparaissant l cran l utilisateur fournit un estim initial de la position centrale de tous les pics ainsi qu une d limitation des pixels devant servir au processus d optimisation d but et fin Afin d assurer la convergence de l algorithme moins de 10 pics peuvent tre quantifi s simultan ment L algorithm
110. 1 Positioncentrale du pic Colonne 2 Amplitude volume du pic Colonne 3 Ecart type du pic Colonne 4 Point avant Colonne 5 Point apres Colonne 6 Nombre permettant de grouper les pics optimises ensembles Colonne 7 Position max pic fantome Colonne 8 Avant fantome Colonne 9 Apres fantome Colonne 10 Facteur multiplicatif fantome while size InfoResultats 1 prompt Debut de l analyse 1 Oui 0 Non Nom du fichier pour l ecriture des resultats dig title Information sur l avancement de l analyse num lines 1 A num2str 1 B QuantificationPics_Ecriture csv def A B options Resize on options WindowStyle normal InfoResultats inputdlg prompt dlg titlejnum lines def options end j str2double InfoResultats 1 ifj 1 Matrice csvread InfoResultats 2 j size Matrice 1 PositionM Matrice 1 231 Ampl Matrice 2 ET Matrice 3 Pa zeros length Rang 1 for a 13 Pa Ampl a 2 pi ET a 2 1 2 exp Rang PositionM a 2 2 ET a 2 Vecteur Vecteur Pa end y Matrice end 6 1 j j l else Matrice y l j l end figure 1 plot Vecteur Global zeros Longueur 1 DernierPic 0 Quantifier while size Quantifier 1 prompt Souhaitez vous quantifier des pics O N dig title Verification du pic num_lines 1 def O options Resize on options Wind
111. 1 3 Diff rences entre type d indicateur et fonction suivie pour diff rents organismes expos s au cuivre Adapt de Roman et al 2007 Toutes les valeurs sont en mg de cuivre kg de sol Esp ce NOEC LOEC EC EC5o Tubifex tubifex 28 jours Survie 138 158 160 136 190 327 302 354 Croissance 78 3 102 43 25 74 126 107 150 Reproduction jeunes adultes 78 3 102 79 63 99 98 90 107 Reproduction cocons adultes 78 3 102 86 72 101 113 105 121 Hyalella azteca Survie 14 jours 100 180 135 103 168 Croissance 28 jours 53 2 95 4 75 43 135 Chironomus riparius Survie 14 jours lt 180 180 150 111 204 Croissance 28 jours 89 2 188 93 65 127 mergence 28 jours 59 5 89 2 33 16 68 Lumbriculus variegatus 28 jours Survie 114 140 126 113 141 Biomasse 80 5 103 70 60 80 Reproduction 80 5 103 97 91 103 Gammarus pulex 35 jours Survie 94 7 176 73 39 139 Croissance 94 7 176 102 60 169 316 281 355 194 153 248 320 279 366 150 125 169 59 44 80 211 194 229 126 119 133 105 102 108 151 115 198 148 132 186 14 1 2 2 Evaluation de la sensibilit des cosyst mes L valuation de la sensibilit des cosyst mes face aux contaminants se fait via l utilisation des indicateurs toxicologiques disponibles pour les diff rentes populations pouvant voluer dans l cosyst me consid r La fraction des esp ces potentiellement affect es
112. 2005 Roesch et al 2007 rather steep for the most abundant phylotypes and then slowly decreasing toward an asymptotic relative abundance value doubletons and singletons Doroghazi and Buckley 2008 Inceoglu et al 2011 Narang and Dunbar 2004 The elongation framework developed for this paper aimed to reproduce these characteristics As presented in Figure 4 4 the ability to accurately extract PSRs from the profiles is a strong prerequisite to estimate true community diversity from DGGE The elongation framework presented here was developed using nine samples originating from only three distinct pyrosequencing datasets The numerous clustering steps involved may have modified the shape of the resulting RADs By using more datasets covering many different environments and containing enough reads per sample to reach the plateau of the rarefaction curves it would be possible to develop a more robust framework adjustable to the many different soil types environments that researchers may study Though highly empirical this rather simple framework proved to be very effective in predicting true community diversity using both the Shannon and Simpson s 1 D indices As presented in Tableau 4 3 all diversity estimates were accurate at 10 and highly correlated with true indices at 98 similarity These values are tremendously better than those produced before RAD elongation even if these partial distributions were found to be highly representati
113. 2007 06 023 Rossell Mora R and Amann R 2001 The species concept for prokaryotes FEMS Microbiology Reviews 25 1 39 67 doi 10 1111 1 1574 6976 2001 tb00571 x Sambrook J Fritsch EF and Maniatis T 1989 Molecular cloning a laboratory manual Cold Spring Harbor N Y Cold Spring Harbor Laboratory Sanexen Services Environnementaux Inc 2002 TerraSys Version 1 0 Sanexen Services Environnementaux Inc Scelza R Rao M A and Gianfreda L 2008 Response of an agricultural soil to pentachlorophenol PCP contamination and the addition of compost or dissolved organic matter Soil Biology and Biochemistry 40 9 2162 2169 138 Schloss PD Westcott SL Ryabin T Hall JR Hartmann M Hollister EB Weber CF 2009 Introducing mothur Open Source Platform Independent Community Supported Software for Describing and Comparing Microbial Communities Applied and Environmental Microbiology 75 23 7537 7541 doi 10 1128 aem 01541 09 Schmalenberger A and Tebbe CC 2003 Bacterial diversity in maize rhizospheres conclusions on the use of genetic profiles based on PCR amplified partial small subunit rRNA genes in ecological studies Molecular Ecology 12 1 251 262 doi 10 1046 j 1365 294X 2003 01716 x Scott Fordsmand JJ and Jensen J 2001 Ecotoxicological soil quality criteria in Denmark In L Posthuma G W Suter II amp T P Traas Eds Species sensitivity distributions in ecotox
114. 244 f x Minimisation x NbPics Position Points options optimset UseParallel always Algorithm interior point MaxFunEvals 30000 length x0 MaxIter 30000 length x0 TolFun 10E 21 ToIX 10E 18 TolCon 10E 18 x fmincon f x0 lb ub options Sigma 1 x 1 NbPics Sigma 1 Amplitude 1 x NbPics 1 2 NbPics Vect PositionMax round x 2 NbPics 1 3 NbPics 245 Nom du fichier ElongationRAD m Description Cet algorithme ira lire dans un fichier Excel les distributions rang abondance partielles g n r es par l analyse des bandes DGGE ainsi que les param tres peak to signal ratio extraits des profils Il retournera des distributions rang abondances compl tes repr sentatives des commuanut s tudi es Auteur Jonathan Lalande R f rence Lalande J Villemur R amp Deschenes L In press A new framework to accurately quantify soil bacterial communities diversity from DGGE Microbial Ecology clear all close all clc Analyses xlsread LectureImages xlsx 121205 SYBR resume AS2 AS200 PR xlsread LectureImages xlsx 121205 SYBR resume W4 Analyses xlsread Phenol xlsx Sheet1 A2 E200 PR xlsread Phenol xlsx Sheet1 A1 E1 Analyses isnan Analyses 0 NbSeq 35000 NbColonnes size Analyses 2 Resultats alpha 0 875 alpha2 0 805 Vect zeros 25000 NbColon
115. 25 ml avec de l hexane Homog n iser 13 Si le r sultat du dosage est inf rieur la LOM calcul e avec cette proc dure l extrait doit tre concentr par 20 en utilisant un syst me d vaporation sous jet d azote temp rature ambiante Cette concentration permet alors d atteindre toutes les exigences r glementaires NOTE Le blanc est soumis la m me concentration que les chantillons 14 Effectuer le dosage tel que d crit la section 4 Mati res solides Pr paration de l quipement Soxtec Le syst me Soxtec poss de deux unit s de bains diff rentes l un est refroidissant pour la condensation du solvant l autre est une unit de r chauffement extraction et vaporation du solvant Il faudra mettre en marche ces bains en s assurant que les niveaux de liquide sont ad quats avant et apr s l atteinte des temp ratures d sir es 207 Niveau de liquide Bain refroidissant DC5 Max 2cm en dessous du couvercle Min 5 cm en dessous du couvercle Unit chauffante 1046 Max 3cm en dessous du couvercle 4 5 Min assez de liquide pour soulever l interrupteur flottant Mise en fonction Bain refroidissant DC5 Mettre l interrupteur du compresseur on Mettre l interrupteur du circulateur on Appuyer sur le bouton reset Appuyer sur le bouton de commande jusqu ce que S apparaisse R gler la temp rature 100C avec les fl ches 1 et appuyer sur enter La temp rature ch
116. 38 141 and 156 bp Many of the sequences outside these peaks can be hypothesized to contain insertions or 86 deletions indels thus generating variations in the sequence lengths The shape of the curves presented on the bottom part of Figure 5 5 also supports this affirmation Indeed both curves presented a minimum deletion percentage for a certain GC content at 48 for the 157 163 bp cluster and between 51 56 for 133 138 bp sequences and these percentages increased when moving to the left or to the right on the GC content axis These minimums probably corresponded to the OTUs expected GC content while the deletion increases can be explained by indels of AT or GC bases These deletion increases were a lot more important for the longer sequences indicating that length had a negative impact on the average quality of the sequences Interestingly although length negatively affected the average quality of the sequences the deletion percentage of the 48 GC bin 157 160 bp is still slightly lower than the percentages observed for the 51 56 GC bins 133 138 bp These differences are however not significant At GC contents above 58 the relation between GC content and quality is significant for both length clusters Also the deletion percentages corresponding to the 157 163 bp sequences were significantly higher than those corresponding to shorter sequences for GC contents higher than 58 confirming the premise that length decreas
117. 4 x Khandelwal G and Bhyravabhotla J 2010 A Phenomenological Model for Predicting Melting Temperatures of DNA Sequences PLoS ONE 5 8 e12433 doi 10 1371 journal pone 0012433 Killham K and Staddon WJ 2002 Bioindicators and Sensors of Soil Health and the Application of Geostatistics In R G Burns amp R P Dick Eds Enzymes in the Environment Activity Ecology and Applications pp 391 405 New York Marcel Dekker Inc Kirk JL Beaudette LA Hart M Moutoglis P Klironomos JN Lee H and Trevors JT 2004 Methods of studying soil microbial diversity Journal of Microbiological Methods 58 2 169 188 doi http dx doi org 10 1016 j mimet 2004 04 006 130 Klindworth A Pruesse E Schweer T Peplies J Quast C Horn M and Gl ckner FO 2013 Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next generation sequencing based diversity studies Nucleic Acids Research 41 1 el doi 10 1093 nar gks808 Kooijman SALM 1987 A safety factor for LC50 values allowing for differences in sensitivity among species Water Research 21 269 276 Korbie DJ and Mattick JS 2008 Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification Nature Protocols 3 9 1452 1456 doi 10 1038 nprot 2008 133 Kunin V Engelbrektson A Ochman H and Hugenholtz P 2010 Wrinkles in the rare biosphere pyrosequencing errors can lead to artificial inflation of divers
118. 6 2 0 3 0 0 8 2 3 6 9 23 9 SAFo7 5 97 2 8 3 0 0 499 3 1 10 3 19 8 FUG95 None BFo5 10 98 1 0 3 0 0 9 05 2 796 16 9 SAF95 10 97 1 0 3 0 09 0 296 0 1 12 9 278 Tableau A3 2 Optimal parameters obtained for all the sample software pairs Ball size and similarity level values were selected as those simultaneously generating APSR AH and AI D values lower than 10 over the widest range of cut off values Indicators were averaged over all the acceptable cut off values cut off increased in 0 2 increments continued DORE Spies koma CIO catol APSR AH AUD D co program ball size similarity level range FUG 100 4 96 0 6 1 8 25 1 3 1 3 13 1 E BF100 72 96 10 30 7 4 0 6 5 1 13 7 3 SAF 100 12 97 04 16 04 0 1 3 7 13 2 FUGo7 20 96 0 6 3 0 1 6 02 2 7 14 9 3 BFo7 20 96 0 6 0 8 7 6 2 0 8 5 10 8 SAFo7 T2 96 10 30 7 9 1 3 7 2 18 5 E FUGo5 20 96 02 30 1 9 08 5 5 14 9 BFo5 20 100 04 30 1 0 0 3 1 5 13 2 SAFo5 20 98 0 6 3 0 3 9 0 5 2 6 12 0 FUG 00 None z z E BF 100 5 99 0 4 3 0 5 3 0 5 3 8 28 3 z SAF 100 10 100 0 8 3 0 3 2 0 3 1 9 16 8 ao amp FUGo7 None 2 gt gt BFo7 41 97 0 0 3 0 1 4 0 2 2 5 16 6 E SAFo7 41 99 0 8 3 0 3 9 0 9 4 5 16 6 EX FUGoss 20 97 0 0 0 2 7 0 0 0 9 6 10 2 BFos None SAFo5 4 100 0 6 3 0 1 2 0 4 1 9 11 4 279
119. 6 294 doi 10 1007 bf01570036 Leung KMY Grist EPM Morley NJ Morritt D and Crane M 2007 Chronic toxicity of tributyltin to develpment and reproduction of the European freshwater snail Lymnaea stagnalis L Chemosphere 66 1358 1366 Li X Zhang H Wu M Zhang Y and Zhang C 2008 Effect of methamidophos on soil fungi community in microcosms by plate count DGGE and clone library analysis Journal of Environmental Sciences 20 5 619 625 Li Z Xu J Tang C Wu J Muhammad A and Wang H 2006 Application of 16S rDNA PCR amplification and DGGE fingerprinting for detection of shift in microbial community diversity in Cu Zn and Cd contaminated paddy soils Chemosphere 62 8 1374 1380 Liao M Chen C L Zeng L S and Huang C Y 2007 Influence of lead acetate on soil microbial biomass and community structure in two different soils with the growth of Chinese cabbage Brassica chinensis Chemosphere 66 7 1197 1205 doi 10 1016 j chemosphere 2006 07 046 Life Technologies 2012 June 5 2012 Relentless Improvements in Throughput Read length and Data Quality Fuel Rapid Market Adoption of Ion PGM Benchtop Sequencer Acquire Media Retrieved from http www lifetechnologies com ca en home about us news gallery press releases 2012 reletless improvemets i throughput html Life Technologies 2013 DNA Oligo FAQ Retrieved April 5 2013 from http www invitrogen com site us en home Products
120. 60 80 100 120 Rang Figure 1 1 Exemple de RAD pour deux communaut s diff rentes Dans cet exemple la richesse de la communaut 105 esp ces est plus faible que celle de la communaut 2 120 esp ces Aussi comme l abondance relative des esp ces les plus abondantes est plus lev e pour la communaut 1 la dominance de cette communaut est sup rieure a celle de la communaut 2 Tel que mentionn pr c demment la d finition de diversit biologique fait implicitement r f rence a deux l ments le nombre d esp ces richesse ainsi que l abondance relative des diff rentes esp ces dominance quit La majorit des indices utilis s afin de quantifier la diversit d une communaut Tableau 1 2 tiennent compte de ces deux aspects Bien que les quations permettant de calculer chaque indice de diversit soient passablement diff rentes la majorit des indices sont assez similaires Il s agit le plus souvent du temps d une sommation r alis e sur la totalit des esp ces r pertori es S tenant compte de l abondance relative ou absolue de chaque esp ce pi Les indices ne tenant pas compte de ces deux l ments risquent d tre fortement polaris s envers une facette particuli re de la diversit par exemple l indice de Berger Parker Tableau 1 2 La valeur num rique que prendront les diff rents indices d pendra principalement du poids accord aux esp ces rares et aux esp ces abond
121. ADs The Matlab based framework was found to yield very stable results over all the samples Indeed DGGE based and true RADs were very close when a similarity level of 98 was chosen the only exception being BFo7 for which the 97 level gave better results This framework allowed an accurate extraction of the sample PSRs from the profiles Among the indices tested H presented a very good match between DGGE based and true RADs However this index was found to be influenced by RAD lengths more than community dominance profiles Considering that for the sake of comparison distribution lengths were forced to be equal for both approaches it is not surprising that H exhibited very low variability for all the samples and software programs As a dominance index Simpson s 1 D was much more dynamic and is therefore a better indicator than H to compare software programs On average the Matlab based framework performed better than the other software programs with A1 D close to 5 for all samples except BFo7 11 All four software programs yielded a similar average Euclidean distance value around 10 12 4 2 4 2 Using PSRs to improve DGGE based diversity surveys Based on simulated communities it was shown that the subunit background percentage an indicator analogous to PSR was related to community richness Loisel et al 2006 Figure 4 4 shows the relationship between PSRs extracted from DGGE profiles using the Matlab based framewo
122. Ali C Marsh TL and Massana R 2001 Application of Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE To Study the Diversity of Marine Picoeukaryotic Assemblages and Comparison of DGGE with Other Molecular Techniques Applied and Environmental Microbiology 67 T 2942 2951 doi 10 1128 aem 67 7 2942 2951 2001 126 Dohm JC Lottaz C Borodina T and Himmelbauer H 2008 Substantial biases in ultra short read data sets from high throughput DNA sequencing Nucleic Acids Research 36 16 e105 doi 10 1093 nar gkn425 Doroghazi JR and Buckley DH 2008 Evidence from GC TRFLP that Bacterial Communities in Soil Are Lognormally Distributed PLoS ONE 3 8 e2910 doi 10 1371 journal pone 0002910 Dowd S Sun Y Secor P Rhoads D Wolcott B James G and Wolcott R 2008 Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing DGGE and full ribosome shotgun sequencing BMC Microbiology 8 1 43 Dowse R Tang D Palmer CG and Kefford BJ 2013 Risk assessment using the species sensitivity distribution method Data quality versus data quantity Environmental Toxicology and Chemistry 32 6 1360 1369 doi 10 1002 etc 2190 Dunbar J Barns SM Ticknor LO and Kuske CR 2002 Empirical and Theoretical Bacterial Diversity in Four Arizona Soils Applied and Environmental Microbiology 68 6 3035 3045 doi 10 1128 aem 68 6 3035 3045 2002 Edgar RC Haas BJ Clemente JC Quince C and Knight R
123. E Nilsson RH Uroz S and Martin F 2009 454 Pyrosequencing analyses of forest soils reveal an unexpectedly high fungal diversity New Phytologist 184 2 449 456 doi 10 1111 j 1469 8137 2009 03003 x B rgmann H Pesaro M Widmer F and Zeyer J 2001 A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil Journal of Microbiological Methods 45 1 7 20 doi 10 1016 s0167 7012 01 00213 5 Butchart SHM Walpole M Collen B van Strien A Scharlemann JPW Almond REA Watson R 2010 Global Biodiversity Indicators of Recent Declines Science 328 5982 1164 1168 doi 10 1126 science 1187512 Canadian Council of Ministers of the Environment 1999 Canadian Soil Quality Guidelines for the Protection of Environmental and Human Health Pentachlorophenol 1997 Winnipeg Retrieved from http ceqg rcqe ccme ca download en 276 Carrigg C Rice O Kavanagh S Collins G and O Flaherty V 2007 DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment Applied Microbiology and Biotechnology 77 4 955 964 125 Cea M Seaman JC Jara AA Fuentes B Mora ML and Diez MC 2007 Adsorption behavior of 2 4 dichlorophenol and pentachlorophenol in an allophanic soil Chemosphere 67 7 1354 1360 doi http dx doi org 10 1016 j chemosphere 2006 10 080 Cleland EE 2012 Biodiversity and Ecosystem Stability Nature Education Knowledge 3 10 14 Cline J
124. E 22 mm et bouchon appropri C85173701 Chromatographic Specialities Tube en corex centrifugation de 30 ml Fioles jaug es de classe A de 25 ml Fiole jaug e de 10 ml Pipette volum trique de classe A de 5 ml Pipette volum trique de classe A de 10 ml Pipette volum trique de classe A de 25 ml Pipette de transfert en verre jetable 204 Seringues capacit de 500 ul et de 1 000 ul Cylindre gradu de 1 000 ml tol 5 0 ml Tubes jetables de 15 ml avec bouchons Ampoules a d cantation de 250 ml Colonnette de verre pour sulfate de sodium Appareil Soxtec et ses composantes Cartouche en cellulose Laine de verre D contaminer la laine de verre l aide d hexane cf 6 6 avant son utilisation NOTE Toute la verrerie est lav e selon le document de r f rence interne DR 09 04 COL 01 intitul Instructions de lavage Lorsqu une vitesse de rotation est prescrite une v rification visuelle approximative est faite au d but de l utilisation de l appareil concern Reactifs et talons Tous les solvants utilis s sont de qualit pesticide ou l quivalent Les r actifs commerciaux utilis s sont de qualit ACS moins d indication contraire L eau utilis e pour la pr paration des r actifs est de l eau d min ralis e trait e sur charbon activ et filtr e sur une membrane de 5 um Acide sulfurique CAS n 7664 93 9 H2SO4 Solution d acide sulfurique 50 96 V V Dil
125. GGGG GCACGGGGGG 3 Muyzer et al 1993 Sequencing primers contained the Ion Torrent adaptor A followed by a 10 nt sample specific multiplex identifier MID forward or adaptor trP1 reverse at their 5 end Ion Torrent adaptors and MID sequences are listed in Tableau A4 1 Amplifications were conducted in 50 uL volumes using the 2X Phusion High Fidelity PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific Inc Waltham MA USA PCR mixtures contained 200 uM of each dNTP 3 5 mM of MgCh 0 6 g L of bovine serum albumin BSA 0 2 uM of each primer and 5 ng of the extracted DNA Amplification was carried out with a Techne Genius Thermocycler Bibby Scientific Ltd 43 Staffordshire UK After an initial two minute denaturation step at 94 C a total of 40 amplification cycles were carried out consisting of 15 seconds denaturation at 94 C 15 seconds annealing and 15 seconds elongation at 72 C The amplification process was concluded with a final 10 minute elongation step at 72 C To increase the specificity and yield of the amplification process Korbie and Mattick 2008 the annealing temperature was decreased from 67 5 to 62 5 C during the first 10 cycles and then kept at 62 5 C for the remaining 30 cycles The PCR conditions were optimized for the sequencing primers that had a strong tendency to dimerize Dimerization was not a problem for DGGE primers but the same PCR conditions were used Amplification specificity and yield was checked on
126. Laisser d gazer ainsi pendant 10 15 minutes 13 Placer dans un tube de 50 ml Sarstedt l entourer d aluminium et le conserver 4 C Pr paration du montage sandwich Figures A1 3 et A1 4 S assurer que les vitres et les espaceurs sont propres laver avec de l thanol 9594 2 Placer la grande vitre 20x20 plat sur un espace propre et y d poser deux espaceurs de 1 5mm d paisseur un chaque extr mit de la vitre le c t arrondi des espaceurs doit tre au sommet de la plaque 175 3 D poser la petite vitre 16x20 sur les espaceurs 1 5mm 4 Ouvrir les pinces sandwich l aide de la vis pour permettre aux plaques de s y glisser 5 Ins rer un des c t s du sandwich dans la pince et visser l g rement Faire la m me chose pour l autre c t Grande vitre Petite vitre Espaceurs ince sandwich Figure A1 3 Montage sandwich utilis pour couler le gel 6 Humecter l g rement surface de la bande de caoutchouc du portoir ceci permettra de v rifier si les vitres sont bien plac es et pour emp cher que le gel coule 7 Placer le montage dans la fente d alignement qui se trouve sur le portoir Poser le montage sur la bande ponge en caoutchouc situ e sur le support sandwich de mani re ce que la petite vitre soit vers soi 8 Desserrer les vis et ins rer la carte d alignement entre les vitres 9 Pousser la carte sur les espaceurs pour que ces derniers soient bien au fond des pince
127. Leung Morritt and Crane 2002 ainsi que de la repr sentativit de ces esp ces Forbes and Calow 2002 il est tr s pr occupant de constater qu il existe peu de donn es cotoxiques pour les esp ces peuplant les cosyst mes terrestres et que ces donn es sont fortement polaris es envers certaines esp ces Les communaut s microbiennes jouent un r le de premier plan dans le bon fonctionnement des cosyst mes terrestres van der Heijden Bardgett and van Straalen 2008 et sont parmi les plus diversifi s sur Terre Roesch et al 2007 Constatant que ces communaut s sont virtuellement absentes des bases de donn es cotoxiques terrestres Sun Pan and Zhou 2012 Suter II Traas and Posthuma 2001 l objectif principal de cette th se est donc de d velopper une approche analytique permettant de quantifier la perte de diversit bact rienne caus e par l ajout de pentachloroph nol PCP des chantillons de sol La diversit bact rienne sera tudi e l aide de la technique de l lectrophor se sur gel en gradient d naturant Denaturing Gradient Gel Electrophoresis ou DGGE Bien que le DGGE soit actuellement incapable de produire des estim s de diversit corr l s la vraie diversit bact rienne des sols Blackwood Hudleston Zak and Buyer 2007 il a t rapport que cette technique pourrait y arriver Loisel et al 2006 ce jour aucune approche analytique n a t d velopp e en
128. Lorsqu on a plus d une amplification faire multiplier les volumes pr sent s au Tableau A1 1 par le nombre d amplifications r aliser Tenir compte qu il faut au moins un blanc de m thode consid rer donc au moins une r action de plus par rapport au nombre chantillons analyser En r gle g n rale il faut pr parer une r action de plus que le nombre d chantillons analyser en incluant le blanc de m thode 6 ce 165 Pr parer la recette PCR dans un tube eppendorf st rile de 1 5ml Ajouter les ingr dients dans le m me ordre que d crit dans les tableaux disponibles en annexes Pr lever 49 ul de cette solution et la distribuer dans les tubes eppendorf st riles de 0 5ml qui seront utilis s pour les chantillons d ADN tester Avec une pipette P2 ajouter 1 ul des chantillons d ADN dans chacun des tubes Ins rer les tubes dans l appareil Techne Genius et allumer l appareil S assurer que le programme 1 a t s lectionn Appuyer sur le bouton START Fermer le couvercle et laisser le programme rouler Amplification Les conditions des cycles d amplification doivent tre optimis es en fonction du Tm des amorces et de la recette PRC utilis e Le touchdown PCR vise augmenter la sp cificit du produit amplifi Le d tail des cycles utilis s pour certaines paires d amorces sont fournies en annexes Les conditions utilis es pour les amorces 341f GC et 534r sont pr sent
129. Philippot L 2013 Insights into the resistance and resilience of the soil microbial community FEMS Microbiology Reviews 37 2 112 129 doi 10 1111 j 1574 6976 2012 00343 x Groombridge B and Jenkins M 2002 World Atlas of Biodiversity Earth s Living Resources in 21st Century University of California Press Haegeman B Hamelin J Moriarty J Neal P Dushoff J and Weitz JS 2013 Robust estimation of microbial diversity in theory and in practice The ISME Journal Retrieved from doi 10 1038 ismej 2013 10 Hammer Ryan P and Harper D 2001 PAST Paleontological Statistics software package for education and data analysis Palaeontologia Electronica 4 1 9 pp Hill TCJ Walsh KA Harris JA and Moffett BF 2003 Using ecological diversity measures with bacterial communities FEMS Microbiology Ecology 43 1 11 Hooper DU Chapin FS Ewel JJ Hector A Inchausti P Lavorel S Wardle DA 2005 Effects of Biodiversity on Ecosystem Functioning A Consessus of Current Knowledge Ecological Monographs 75 1 3 35 doi 10 1890 04 0922 Hose GC and van den Brink PJ 2004 Confirming the species sensitivity distribution concept for endosulfan using laboratory mesocosm and field data Archives of Environmental Contamination and Toxicology 47 511 520 Hugenholtz P 2002 Exploring prokaryotic diversity in the genomic era Genome Biology 3 2 1 8 doi doi 10 1186 gb 2002 3 2 review
130. Potentially Affected Fraction ou PAF est utilis e comme mesure de sensibilit et ou stress toxique ressenti par un cosyst me Cet indicateur g n ralement d termin partir d une distribution de sensibilit des esp ces Species Sensitivity Distribution ou SSD est notamment utilis dans le but de d velopper des EQC pour les sols les s diments et l eau dans plusieurs pays Gaudet Bright Adare and Potter 2001 Scott Fordsmand and Jensen 2001 Sijm van Wezel and Crommentuijn 2001 Stephan 2001 L int gration de l approche SSD en ARE fut la cons quence de maintes observations selon lesquelles la distribution de sensibilit de plusieurs esp ces envers un contaminant avait des similitudes avec la distribution log normale Kooijman 1987 Suter IL 2001 van Straalen and Dennenman 1989 van Straalen and van Leeuwen 2001 La courbe SSD est donc une repr sentation empirique de la variabilit des r ponses toxiques observ es chez diverses esp ces composant un cosyst me face un contaminant L information v hicul e par cette courbe est purement statistique n a pas d interpr tation biologique Suter II et al 2001 D s lors tout comme dans le cas de la mod lisation concentration r ponse aucune raison ne justifie l utilisation d une forme particuli re de distribution Aldenberg and Jaworska 2000 Bien qu elle cherche mod liser la sensibilit d un cosyst me face un contaminant les courbes SSD s
131. R Huys G and Swings J 2004 Identification of lactic acid bacteria culture dependent and culture independent methods Trends in Food Science amp Technology 15 7 8 348 359 doi http dx doi org 10 1016 j tifs 2003 12 007 Thakuria D Schmidt O Mac Siurtain M Egan D and Doohan FM 2008 Importance of DNA quality in comparative soil microbial community structure analyses Soil Biology and Biochemistry 40 1390 1403 Torsvik V and Ovreas L 2007 Microbial Phylogeny and diversity in soil In J D van Elsas J K Jansson amp J T Trevors Eds Modern Soil Microbiology second edition pp 23 54 Boca Raton CRC Press U S Environmental Protection Agency 2007 Ecological Soil Screening Levels for Pentachlorophenol Washington Retrieved from http rais ornl gov documents eco ssl_pep pdf U S Environmental Protection Agency 2013 ECOTOX User Guide ECOTOXicology Database System Version 4 0 http www epa gov ecotox 141 van den Brink PJ Brock TCM and Posthuma L 2001 The value of the species sensitivity distribution concept for predicting field effect Non confirmation of the concept using semifield experiments In L Posthuma G W Suter II amp T P Traas Eds Species sensitivity distributions in ecotoxicology pp 155 193 Boca Raton Lewis Publisher van der Heijden MGA Bardgett RD and van Straalen NM 2008 The unseen majority soil microbes as drivers of plant divers
132. TAAGGAGAAC LM900 MID AAGAGGATTC LM3000 MID TACCAAGATC Scln MID CAGAAGGAAC 300 MID CTGCAAGTTC S900 MID TTCGTGATTC S3000 MID TTCCGATAAC 281 Tableau A4 2 Diversity indices calculated from the DGGE RADs elongation framework or the Ion Torrent PGM datasets For the Ion Torrent indices the numbers 2 3 and 4 refer to the dissimilarity level number of bases used for the initial pseudo single linkage algorithm Huse et al 2010 Ion Torrent datasets were either normalized at 5 000 reads or corrected at 35 000 reads using the elongated DGGE RADs ee DGGE DGGE Ion Torrent Ion Torrent Ion Torrent Ion Torrent Ion Torrent 400 ng well 200 ng well 3 3 normalized 2 corrected 3 corrected 4 corrected 4133 3809 4474 2296 7751 6245 4864 1306 1268 1723 987 2657 2018 1451 3 628 637 653 413 981 7122 448 1062 934 2322 1411 3629 2829 2065 e 4237 3913 2887 2234 6418 52770 4272 S 2567 1865 1961 1516 3583 2936 2333 aw 1439 1061 1583 1267 2749 2178 1641 2836 2836 2022 1988 4746 3890 3217 1012 817 629 583 1105 652 432 A 235 190 86 86 117 87 65 94 43 37 37 55 37 24 T 132 70 151 149 231 153 107 A 1136 808 430 420 664 468 355 E 443 300 175 174 227 181 143 va 190 88 134 135 188 135 99 457 320 245 244 377 260 209 e 12 4 11 9 9 0 3 7 19 2 18 1 16 6 e 5 9 6 1 7 9 3 0 12 6 11 8 10 7 x 3 2 4 3 6 2 2 3 8 5 8 3 7 3 A 5 3 5 4 6 9 3 3 12 5 11 8 10 8 E 12 5 12 1 5 1 3 6 17 2 16 0 14 8 9 6 7 8 4 9 3 4 13 4 12 6 11 6 z 6 7 5 8 4 5 3
133. UNIVERSITE DE MONTREAL DETERMINATION DE L IMPACT DU PENTACHLOROPHENOL SUR LA DIVERSITE BACTERIENNE DANS LES SOLS A PARTIR DE LA TECHNIQUE DE L LECTROPHORESE SUR GEL EN GRADIENT D NATURANT JONATHAN LALANDE D PARTEMENT DE G NIE CHIMIQUE COLE POLYTECHNIQUE DE MONTR AL THESE PR SENT E EN VUE DE L OBTENTION DU DIPL ME DE PHILOSOPHIAE DOCTOR G NIE CHIMIQUE JUIN 2013 O Jonathan Lalande 2013 UNIVERSITE DE MONTREAL ECOLE POLYTECHNIQUE DE MONTREAL Cette th se intitul e D TERMINATION DE L IMPACT DU PENTACHLOROPH NOL SUR LA DIVERSIT BACT RIENNE DANS LES SOLS PARTIR DE LA TECHNIQUE DE L ELECTROPHORESE SUR GEL EN GRADIENT D NATURANT pr sent e par LALANDE Jonathan en vue de l obtention du dipl me de Philosophiae Doctor a t d ment accept e par le jury d examen constitu de M JOLICOEUR Mario Ph D pr sident Mme DESCH NES Louise Ph D membre et directrice de recherche M VILLEMUR Richard Ph D membre et codirecteur de recherche M HENRY Olivier Ph D membre M JUCK David Ph D membre iii D DICACE N espere rien de l homme s il travaille pour sa propre vie et non pour son ternit Antoine de Saint Exup ry iv REMERCIEMENTS Six ann es pour en arriver la Six ann es parsem es de joies et de d ceptions de hauts et de bas Afin de conclure enfin diront certains comme il se doit cette aventure pleine de rebondissement qu est
134. Ut opt iN ipe a m METH VI dU E EUIS XVII LISTE DES TABLEAUX XX LISTE DES FIG RES ini er Ei Tr cree rrcrrerrcrrerrcrrerrcrrerrercereercereeeceeeeecerceecteceecercrecereeecree XXII LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS 0 ssseccsscsssscccssecesseccsssecssssscescssssesescsceseesssscsscsecesscscess XXV INTRODUCTION ai A A 1 CHAPITRE 1 REVUE DE LITTERATURE 0 ss00cseccsssseceescecsscccesscccescsscseccessssesscscescsssseceesessescseces 3 1 1 Diversit biologique dans les cosyst mes naturels 3 VAs H tatettendancess Lu emt eite ime e o etes TE rire stie Onda iot es 3 1 1 2 Lien biodiversit fonction stabilit ss 5 11 3 Quantification de la biodiversit senrega orana Ee Pre ae PERENNE NENE Re dires fe 5 1 2 valuation de l effet des contaminants sur les populations et les cosyst mes 9 1 2 1 Essais de toxicit sur les populations ss 9 1 2 2 valuation de la sensibilit des cosyst mes 14 1 2 3 Particularit s des cosyst mes terrestres iii 16 1 3 Importance structure et diversit des communaut s microbiennes des sols 19 1 4 Evaluation de l effet des contaminants sur la communaut microbienne d un sol 20 144 ApprochesTornctionnelless eie ett Lr e e ome et eel estie feo eq ee deals eR DN ERA ERE V 21 1 4 2 Approclies mol culaires eet ber RR eee e RNC ERE RE dent ea ee Eee e ees Eo tte 22 1 5 Le pentachloroph nol co
135. a uncorrected refers to the diversity indices xxi calculated directly from the clustered datasets normalized corresponds to the values produced by sampling all the datasets 5 000 times and corrected values were produced with the DGGE RADs sampling framework The numbers 2 3 and 4 refer to the dissimilarity level number of bases used for the initial pseudo single linkage algorithm Huse et al 2010 Except for the three lines in bold characters all linear correlations were significant NEA EI e 87 Tableau 6 1 Physico chemical properties of soils ss 98 Tableau 6 2 Initial PCP concentrations measured in the soil samples Results are presented as the mean PCP concentration for each level with the associated 9596 confidence intervals calculated whenever possible 99 Tableau 6 3 ECso values extracted from the C R curves presented in Figure 6 2 The numbers in brackets correspond to the 95 confidence intervals ccccccccscseececcccecesecccscceeseccecuceeececcecuueececceeuueeecceseeeesceccesuuauecesceeauageceseeeaes 106 Tableau 6 4 Ecotoxicological data used for SSD modeling Considering that the dataset was dominated by worms and terrestrial plants the SSD modeling process was carried out using the geometric mean of the ECso available for each taxonomic group All the ecotoxicological indicators geometric mean and ECso are given in mg PCP kg soil
136. a 1 8 w v agarose gel using an EZ Load Precision Molecular Mass Ruler Bio Rad Laboratories Inc Hercules CA USA For DGGE all amplifications were carried out in triplicate in order to assess the variability attributable to PCR amplification and DGGE profiling 52 3 3 DGGE profiling and analysis DGGE profiling was conducted using a D Code system Bio Rad Laboratories Inc Hercules CA USA The DNA extracted from each sample was PCR amplified three times and three different DGGE gels were produced The DNA of all the samples was amplified three times The 896 w v acrylamide gel was cast into 16 x 16 cm plates with 1 mm thick spacers and composed of a 32 5 72 5 denaturing gradient 100 corresponding to 7 M urea and 10 v v deionized formamide Approximately 400 ng of amplified DNA was loaded into the gel for each sample A blank PCR sample was also added at the beginning of each gel Electrophoresis was run at 60 C and 60V for 18 hours The gel was stained for 30 minutes in a fresh solution of SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies Carlsbad CA USA After staining the gel was photographed using a Quantum ST4 gel documentation system Vilber Lourmat Marne la Vallee France DGGE profiles analysis was done using a newly developed Matlab based program The MathWorks Inc Natick MA USA The background noise of the profiles was manually subtracted since the methodology yields results that are much more consistent
137. aFantome FacteursFantomes xf 1 NbPicsFantomes AmplitudeFantome FacteursFantomes xf NbPicsFantomes 1 2 NbPicsFantomes Vect PositionMaxFantome round xf 2 NbPicsFantomes 1 3 NbPicsFantomes fori 1 NbPicsFantomes PFantome i AmplitudeFantome 1 2 pi SigmaFantome 1 2 1 2 exp Rang Vect PositionMaxFantome 1 2 2 SigmaFantome 1 2 end PFantome sum PFantome 2 243 else PFantome zeros Longueur end Vecteur Vecteur PFantome Vect PositionMax Vect_PositionMax for a 1 NbPics Position Avant a Apres a Points Vecteur Avant a Apres a PM Vect_PositionMax a x0 ETmoyen 1E9 PM Ib SigmaMin 0 1 1E1 PM 2 ub SigmaMax 1E11 PM 2 f x Minimisation x 1 Position Points options optimset UseParallel always Algorithm interior point MaxFunEvals 30000 length x0 Maxlter 30000 length x0 TolFun 10E 21 ToIX 10E 18 TolCon 10E 18 x fmincon f x0 lb ub options Amplitude_1 a 1 x 2 Sigma 1 a 1 x 1 end Position min Avant max Apres Points Vecteur min Avant max Apres x0 Sigma l Amplitude 1 Vect PositionMax Ib zeros length x0 1 ub zeros length x0 1 Ib 1 NbPics 1 SigmaMin Ib NbPics 1 2 NbPics 1 IET Ib 2 NbPics 1 3 NbPics 1 Vect PositionMax 5 ub 1 NbPics 1 Sigma 1 ub NbPics 1 2 NbPics 1 1 25 Amplitude 1 ub 2 NbPics 1 3 NbPics 1 Vect PositionMax 5
138. acide ac tique glacial avec une pipette gradu e de 50 ml 3 Ajouter l acide ac tique glacial dans le b cher en prenant soin de rincer la coupelle ayant servi a peser le TRIS 4 l aide d une pipette gradu e de 50 ml pr lever 50 ml de la solution EDTA 2Na 0 5M pH 8 0 pr par e au point 3 1 2 du protocole d extraction d ADN PE42B et transf rer dans le b cher de 500 ml 5 Ajouter de l eau d ionis e jusqu ce que le volume dans le b cher soit d environ 400ml 6 Ins rer un barreau magn tique et agiter jusqu dissolution compl te du TRIS 7 Transvider le contenu du b cher dans un ballon jaug de 500ml 8 Compl ter 500 ml avec H20 d ionis e en prenant soin de rincer au moins trois fois le b cher ayant contenu la solution 9 Sceller le ballon et l inverser au moins treize fois pour homog n iser la solution 10 R partir le contenu du ballon dans deux bouteilles en verre de 500ml avec bouchon en t flon 11 Autoclaver les bouteilles pendant 30minutes Pr paration de la solution TAE 1X 1 A l aide d une micropipette P10 ml pr lever 10 ml de la solution TAE 50X et transf rer dans une autre bouteille de 500 ml 2 l aide d un cylindre gradu de 500 ml pr lever 490 ml d eau d ionis e et la transf rer dans cette autre bouteille de 500 ml On obtient donc une solution de TAE 1X Amplification PCR La recette utiliser d pend de ce que l on cherche amplifier Cette derni
139. ack dots correspond to the ECso of these 14 species 108 XXV LISTE DES SIGLES ET ABR VIATIONS La liste des sigles et abr viations en ordre alphab tique ACV ADN ARE ARN ASTM DGGE EC ED x EQC FDA HAP HCx LC LDx LOEC LOEL NOEC NOEL NGS OECD OTU Analyse du cycle de vie Ad nosine d soxyribonucl ique Analyse de risque environnemental Ad nosine ribonucl ique American Society for Testing and Materials Electrophor se sur gel en gradient d naturant Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Concentration dose ayant un effet sur x de la population Effect concentration Crit re de qualit environnementale Environmental Quality Criteria Fluoresc ine diac tate Hydrocarbure aromatique polycyclique Concentration pr sentant un risque pour x des esp ces Hazardous concentration Concentration dose mortelle pour x de la population Lethal concentration Plus faible concentration dose ayant un effet d celable Lowest observed effect concentration limit Plus forte concentration dose sans effet d celable No observed effect concentration limit Nouvelles technologies de s quen age d ADN Next generation Sequencing Organisation de Coop ration et de D veloppement Economique Organisation for Economic Co operation and Development Unit taxonomique op rationnelle Operational Taxonomic Unit XXVI PAF Fraction des esp ces potentiellement affect
140. ages Effectivement en tenant compte de l abondance relative des diff rentes esp ces composant les communaut s tudi es une mesure bas e sur la diversit microbienne a peu de chances d augmenter suite une contamination m me si le contaminant est facilement biod gradable De plus en divisant la communaut microbienne en plusieurs composantes distinctes les esp ces plut t qu en un tout homog ne les mesures de diversit pourraient tre plus sensibles une contamination que les mesures fonctionnelles Finalement cet indicateur correspond ce que la mod lisation SSD cherche reproduire r ponse de communaut face un stress toxique mesur l chelle microscopique plut t qu l chelle macroscopique Par contre l utilisation de la diversit microbienne en tant qu indicateur de toxicit pr sente y galement des difficult s Premi rement les approches mol culaires ne permettent pas la 34 consid ration simultan e des diff rents groupes composant les communaut s microbiennes Le domaine des bact ries pr sentant g n ralement la plus grande diversit g n tique dans les sols est g n ralement s lectionn La limitation la plus importante l utilisation d une mesure bas e sur la diversit bact rienne des sols est sans contredit la capacit des techniques actuelles produire rapidement et faible co ts un estim quantitatif de diversit Les plateformes NGS poss
141. alite xx Int14 Int14 1 elseif Qualite xx 15 Int15 Int15 1 elseif Qualite xx 16 Int16 Intl6 1 elseif Qualite xx 1 D m D 262 263 Int17 Int17 1 elseif Qualite xx 18 Int18 Int18 1 elseif Qualite xx 19 Int19 Int19 1 else Int20 Int20 1 end end for yy 1 Longueur Miscall Miscall 10 Qualite yy 10 end Qmoy mean Qualite C4 C4 i Debut Longueur GC Qmoy Int1 Int2 Int3 Int4 Int5 Int6 Int7 Int8 Int9 Int10 Int11 Int12 Int13 Int14 Int15 Int16 Int17 Int18 Int19 Int20 Miscall end end break elseif sum Seq1 Ec5 gt NumMin if length Sequence Debut end gt 1 if length Sequence Debut end lt 250 Ech5 E5 1 Header Structure 1 Header Ech5 E5 1 Sequence Sequence Debut end Qual5 E5 1 Header Quality i Header Qual5 E5 1 Sequence num2str Qualite Debut end E5 E5 1 Sequence Sequence Debut end Qualite Qualite Debut end v v 0 0 0 0 QQHD Il gt Calcul du GC for j 1 length Sequence if strempi Sequence j A 1 A A elseif strempi Sequence j T 1 T T 1 elseif strempi Sequence j G G G elseif strempi Sequence j C C C 1 264 end end GC G C A T G C Longueur length Sequence Intl 0 Int2 0 Int3 0 Int4 0 Int5 0 Int6 0 Int7 0 Int8 0 Int9 0 Int10 0 Int11 0 Int12 0 Int13 0 Int14 0 Int15 0
142. alite xx 8 Int8 Int8 1 elseif Qualite xx 9 Int9 Int9 1 elseif Qualite xx 10 Int10 Int10 1 elseif Qualite xx Int1 1 Int11 1 elseif Qualite xx Int12 Int12 1 elseif Qualite xx 12 Int13 Int13 1 elseif Qualite xx 14 Int14 Int14 1 elseif Qualite xx Int15 Int15 1 elseif Qualite xx 16 Int16 Int16 1 elseif Qualite xx 17 Int17 Int17 1 elseif Qualite xx 18 Int18 Int18 1 elseif Qualite xx 19 Int19 Int19 1 else Int20 Int20 1 end end D m os for yy 1 Longueur Miscall Miscall 10 Qualite yy 10 end Qmoy mean Qualite C2 i Debut Longueur GC Qmoy Int1 Int2 Int3 Int4 Int5 Int6 Int7 Int8 Int9 Int10 Int11 Int12 Int13 Int14 Int15 Int16 Int17 Int18 Int19 Int20 Miscall end end break elseif sum Seq1 Ec3 gt NumMin if length Sequence Debut end gt 1 if length Sequence Debut end lt 250 Ech3 E3 1 Header Structure i Header Ech3 E3 1 Sequence Sequence Debut end 259 Qual3 E3 1 Header Quality i Header Qual3 E3 1 Sequence num2str Qualite Debut end E3 E3 1 Sequence Sequence Debut end Qualite Qualite Debut end 2 Il Il v 0 0 0 0 AAS Il Il gt Calcul du GC for j 1 length Sequence if strempi Sequence j A 1 A A elseif strempi Sequence j T 1 T T 1 elseif strempi Sequence j G 1 G G 1 elseif strempi Seque
143. alyser Pour pouvoir utiliser ce logiciel il faut que la cl de s curit petite cl USB mauve soit connect e l ordinateur Dans la fen tre qui appara tra Figure A1 9 s lectionner l option Molecular weight afin de proc der la quantification des bandes DGGE ou PCR LINE Molecular om conti Image weight ny 9 enhancement ee Optical density Optical density Optical density 1D free form grid 4 Reset default eo Load a template file parameters x Cancel Help Figure A1 9 Options d analyses ou de modifications d image offertes par Bio 1D La premi re fen tre qui appara tra permettra de corriger les imperfections dues au coulage du gel les fameux smilings ainsi que de d finir les bandes de migration Figure A1 10 Cette fen tre permettra galement de d finir le nombre de couloirs de migration pr sents sur le gel ainsi que de 189 d finir la position de chaque couloir Dans un premier temps s lectionner le nombre de couloirs de migration pr sents sur le gel a analyser Si le gel DGGE n est pas parfait des smilings appara tront sur l image le gradient de d naturant n est pas quivalent sur une tranche horizontale du gel le m me brin d ADN migrera g n ralement un peu plus bas dans les puits situ s au centre du gel formant ainsi un front de migration convexe voir Figure A1 10 Bio 1D permet de corriger les images avec plus ou moins de succ s se
144. an IJ 2013 Plotting positions for fitting distributions and extreme value analysis Canadian Journal of Civil Engineering 40 2 130 139 doi 10 1139 cjce 2012 0427 Gans J Wolinsky M and Dunbar J 2005 Computational Improvements Reveal Great Bacterial Diversity and High Metal Toxicity in Soil Science 309 5739 1387 1390 doi 10 1126 science 1112665 Gaudet CL Bright D Adare K and Potter K 2001 A rank based approach to deriving Canadian soil and sediment quality guidelines In L Posthuma G W Suter II amp T P Traas Eds Species sensitivity distributions in ecotoxicology pp 255 273 Boca Raton Lewis Publisher Giddings JM Solomon KR and Maund SJ 2001 Probabilistic risk assessment of cotton pyrethroids II Aquatic mesocosm and field studies Environmental Toxicology and Chemistry 20 3 660 668 Girvan MS Campbell CD Killham K Prosser JI and Glover LA 2005 Bacterial diversity promotes community stability and functional resilience after perturbation Environmental Microbiology 7 3 301 313 Glenn TC 2011 Field guide to next generation DNA sequencers Molecular Ecology Resources 11 5 759 769 doi 10 1111 j 1755 0998 2011 03024 x 128 Green V Stott D and Diack M 2006 Assay for fluorescein diacetate hydrolytic activity Optimization for soil samples Soil Biology and Biochemistry 38 4 693 701 doi doi 10 1016 j soilbio 2005 06 020 Griffiths BS and
145. analys le processus d longation est propre chaque chantillon Afin de valider ce mod le d longation les communaut s bact riennes des m mes chantillons de sol ont t tudi es a partir du DGGE et de l Ion Torrent une nouvelle technologie de s quen age Deux sols de texture diff rente ont t utilis s afin de valider ce mod le Chaque sol a t contamin avec du pentachloroph nol trois concentrations diff rentes en plus de l chantillon non contamin Afin d tudier l effet cotoxique du pentachloroph nol sur la diversit bact rienne des sols les deux sols mentionn s ci haut ont t contamin s cette fois sept concentrations diff rentes en triplicata En parall le l activit hydrolytique de la fluoresc ine diac tate a t mesur e dans tous les chantillons de sol La diversit et l activit hydrolytique de tous les chantillons ont t utilis es afin de produire des courbes concentration r ponse repr sentatives de l effet du PCP sur les communaut s bact riennes diversit ou plus g n ralement microbienne activit de la fluoresc ine diac tate Aussi en utilisant les donn es cotoxiques terrestres disponibles dans les bases de donn es pour le pentachloroph nol une courbe de sensibilit des esp ces a t trac e pour ce contaminant Les indicateurs cotoxiques extraits des courbes concentration r ponse et de la courbe de sensibilit des esp
146. and Services Product Types Primers Oligos Nucleotides invitrogen custom dna oligos Technical Resources for Oligonucleotides DNA Oligo FAQ html 5 Lock K De Schamphelaere KAC and Janssen CR 2002 The effect of lindane on terrestrial invertebrates Archives of Environmental Contamination and Toxicology 42 217 221 Loisel P Hamelin J Godon J J Haegeman B and Harmand J 2009 E Patent 132 Loisel P Harmand J Zemb O Latrille E Lobry C Delgen s J P and Godon J J 2006 Denaturing gradient electrophoresis DGE and single strand conformation polymorphism SSCP molecular fingerprintings revisited by simulation and used as a tool to measure microbial diversity Environmental Microbiology 8 4 720 731 doi 10 1111 j 1462 2920 2005 00950 x Loman NJ Misra RV Dallman TJ Constantinidou C Gharbia SE Wain J and Pallen MJ 2012 Performance comparison of benchtop high throughput sequencing platforms Nature Biotechnology 30 5 434 439 doi 10 1038 nbt 2198 Lopes AR Faria C Prieto Fernandez A Trasar Cepeda C Manaia CM and Nunes OC 2011 Comparative study of the microbial diversity of bulk paddy soil of two rice fields subjected to organic and conventional farming Soil Biology and Biochemistry 43 1 115 125 doi 10 1016 j soilbio 2010 09 021 Lorenz N Hintemann T Kramarewa T Katayama A Yasuta T Marschner P and Kandeler E 2006 Response of microbial activity and
147. andard deviation was set at a mean value of 2 0 pixels and forced to vary randomly for every OTU between 10 of the mean value Peak intensity x was evaluated for all of the pixels x values over the whole gel vertical length set at 1024 pixels The in silico profiles were obtained by summing up the intensity corresponding to every OTU contained within a given dataset for every pixel The image representing the in silico DGGE gel was created in 16 bits uncompressed TIFF format maximum greyscale value of 65535 The intensities of all the vertical profiles were first normalized so that the maximum greyscale value for every sample equals 50000 This step was seen as analogous to adjusting the exposition time when photographing DGGE gels Two dimensional profiles were considered to be 175 pixels wide all filled with the previously generated one dimensional profiles In order to reproduce some of the difficulties associated with the analysis of real DGGE gels an additional background noise calculated from the profiles mean intensity level and randomly adjusted was added 4 2 3 2 Profiles analysis In silico DGGE profiles were analyzed using four different software programs TotalLab Quant TotalLab Ltd Newcastle upon Tyne UK GelCompar II Applied Maths Inc Austin USA BIO 1D advanced Vilber Lourmat Marne la Vall e France and a Matlab based program The MathWorks Inc Natick USA specifically developed for this paper The main
148. anic carbon content and pH are presented in Tableau 5 1 Each soil was divided into four subsamples one was kept clean and the three others were contaminated with pentachlorophenol PCP at concentrations of 100 900 and 3 000 mg kg dry wt soil Tableau 5 1 Physico chemical properties of the soils used in the study Soil sand loam clay Total organic carbon pH LM 58 24 18 2 8 0 4 7 39 0 03 S 98 2 0 2 2 0 1 6 68 0 03 Contamination was performed by dissolving the appropriate amount of PCP in 5 mL of dichloromethane in empty 250 mL amber bottles The bottles were gently shaken during dichloromethane volatilization in order to recover PCP on the bottle walls After complete dichloromethane volatilization soil samples 40 g were added to the bottles and mixed at room temperature in a tumble action agitator for 24 hours in order to recover the PCP from the bottle walls Samples were humidified with distilled water to 60 of the soils water holding capacity 72 and finally manually mixed Soil samples were kept in the dark at room temperature for 28 days prior to DNA extraction 52 3 2 DNA extraction and PCR amplification DNA extractions were carried out using a slightly modified version of a previously described bead beating method Biirgmann Pesaro Widmer and Zeyer 2001 Briefly soil 300 mg and 0 1 mm diameter zirconia silica beads were mixed in a 1 1 ratio w w Bead beating was done at maximum s
149. antes dans le calcul Tableau 1 2 Liste non exhaustive des indices de diversit utilis s afin de quantifier la diversit des communaut s biotiques S correspond au nombre d esp ces observ es pi correspond l abondance relative de l esp ce de rang i et N correspond au nombre d individus contenus dans l chantillon Indice Formule R f rence Richesse S S Blackwood et al 2007 S Shannon F 2 pi ln pj Blackwood et al 2007 i 1 Shannon nb effectif exp Jost 2006 S Simpson D 2 p2 Magurran 2004 i 1 Simpson nb effectif 1 D 1 S p2 Jost 2006 i 1 Pi Berger Parker 1 d 1 max p Blackwood et al 2007 Shannon quit J H in S Blackwood et al 2007 1 Simpson quit Ep Jp Blackwood et al 2007 S Smith et Wilson quit Evar Voir Magurran 2004 S In p 2 l Epar 1 arctan CE mp B Xj ee 5 i 1 La repr sentativit de ces indices d pendra donc de la capacit de la m thode d chantillonnage utilis e identifier toutes les esp ces composant une communaut et estimer le plus pr cis ment possible l abondance de ces esp ces En pratique toutes les esp ces ne seront pas chantillonn es et l abondance des esp ces chantillonn es peut varier en fonction de plusieurs facteurs grosseur des organismes facilit de capture m thode d chantillonnage etc Dans tous les cas les indices calcul s correspondent une e
150. artiellement corrig es il a t possible de montrer que la diversit estim e l aide des deux approches taient fortement corr l e D s lors utilis es des fins comparatives l une ou l autre de ces techniques g n rerait des r sultats similaires Ce manuscrit intitul Can DGGE and Ion Torrent sequencing yield similar quantitative conclusions when comparing the diversity of soil bacterial communities a t soumis la revue FEMS Microbiology Ecology Le troisi me manuscrit chapitre 6 a cherch valuer l utilit des indices de diversit afin de quantifier l effet du PCP sur les communaut s bact riennes des sols La r ponse obtenue l aide d indices de diversit fut compar e celle produite par des mesures de potentiel d activit hydrolytique de la FDA Cet essai fut s lectionn puisqu il produit des r sultats corr l s aux mesures de biomasse microbienne un indicateur s tant av r sensible au PCP Les indices de diversit furent plus de 25 fois plus sensibles au PCP que la mesure du potentiel d activit de la FDA De plus il n a pas t possible de diff rentier les courbes concentration r ponse produites partir des indices de Simpson 1 D ou Shannon exp et la SSD repr sentative de l effet du PCP sur les cosyst mes terrestres pour tous les percentiles de distribution situ s entre 10 et 50 Ce manuscrit intitul Assessing the impact of pentachlorophenol on soil
151. as suffisamment long Ouvrir la valve de sortie et la valve reliant les deux chambres laisser couler Si le volume de solution vers dans les chambres fait en sorte que le liquide d passe la marque de crayon indiquant le bas des puits stopper l coulement laisser s couler et polym riser dans un b cher l aide d une seringue verser tr s d licatement une mince couche d eau d ionis e la surface du liquide l air inhibe la r action de polym risation Laisser polym riser pendant 1 heures Apr s une heure enlever l aide d une seringue la couche d eau la surface du gel Verser 50 uL de solution de persulfate d ammonium et 5 uL de TEMED dans le 5 mL de solution d ur e formamide basse concentration 180 21 l aide d une seringue injecter assez rapidement mais pas trop cette solution afin de remplir le montage sandwich 22 Ins rer imm diatement mais d licatement le peigne d sir puits longs ou courts et laisser polym riser pendant environ une heure Pr paration du bain DGGE 1 Retirer le gel du support et de l ponge de caoutchouc en faisant pivoter les chevilles de 180 vers le haut et en tirant par la suite vers l ext rieur Retirer le peigne d licatement Nettoyer les puits en injectant du TAE 1X l int rieur des puits avec une micropipette de 1 ml quelques reprises Faire glisser les fentes sur chacune des pinces sandwich sur le support migra
152. as two very different techniques were compared some divergences were to be expected However considering the good agreements between the diversity indices calculated using the DGGE RADs elongation framework and DNA sequences clustering at 98 when working on in silico DGGE profiles such significant divergences were somewhat surprising The patterns of the observed discrepancies led to the hypothesis that apart from the fact that two different techniques were used both datasets were biased to a certain extent 79 DGGE m lon Torrent I I l ii B E j M mm l Lcn L300 L900 L3000 Scn S300 S 900 S 3000 Simpson s 1 D o 200 409 600 800 1009 1209 1400 i h EE 8 M RN Lcin L 300 L 900 L 3000 S_cn S 300 S 900 S 3000 Shannon exp o 1009 2009 3009 009 009 6000 14X10 12 10 L I OTUrichness Hann E Lcin L 300 L 900 L 3000 S cin S 300 S 900 S 3000 Figure 5 2 Diversity indices estimated using DGGE or Ion Torrent sequencing The error bars correspond to the 95 confidence intervals that were calculated from the DGGE gel triplicates DGGE diversity estimates were calculated from the RADs elongation framework presented in Lalande et al 2013 Ion Torrent sequencing datasets were clustered at the 98 similarity level using Mothur Schloss et al 2009 80 5 2 4 2 Biases in DGGE results Almost a
153. ase of diversity or activity were extracted Tableau 6 3 105 A B 100 80 c 9 60 2 T T 2 2 Z 40 D 4 2 o o Q 20 a 0 0 10 100 1000 10000 0 10 100 1000 10000 PCP concentration mg kg dry wt soil PCP concentration mg kg dry wt soil C D 100 g c S o 5 o E E 2 9 Z 40 E gt o QO 20 x 0 0 10 100 1000 10000 0 10 100 1000 10000 PCP concentration mg kg dry wt soil PCP concentration mg kg dry wt soil Figure 6 2 Concentration response C R curves produced by the four indicators The reduction percentages were calculated from the diversity or activity of the uncontaminated samples corresponding to a 0 reduction A Simpson s 1 D B Shannon exp C Community richness D FDA hydrolytic activity For C R modeling the diversity indices calculated for the most contaminated samples were excluded from the data fitting process since these diversity increases were associated with an important PCP toxicity not shown by DGGE profiles The horizontal and vertical solid soil LM and dotted soil S lines show the position of the ECs on the x axis As demonstrated by the ECso the sensitivity of the different indicators was highly variable The FDA hydrolytic activity was by far the least sensitive indicator of the impact of PCP 106 contamination It is interesting to note that except for community richness both soils were equally sensitive to PCP Tableau 6 3 ECso val
154. at these dominance profiles were very similar to those produced by DNA sequences clustering algorithms when using a similarity level of 98 The elongation model calibrated with the sequencing datasets used to synthesize the in silico DGGE profiles showed great potential Calibrated in order to reproduce the rank abundance distributions generated by sequencing datasets clustering at 98 similarity the framework allowed the estimation of the diversity of the studied communities with a precision generally higher than 5 A very significant correlation was found between those DGGE based diversity estimates and true diversity at a similarity level of 98 R gt 0 99 Using two different techniques to study the same bacterial communities allowed identifying biases in the results of both technologies For DGGE it was clearly shown that injecting too much DNA in the wells 400 ng could cause localized gel saturation hampering the brightest peaks to reach their full intensity and thus underestimating the dominance of the communities Injecting less DNA 200 ng was a simple remedy against this problem The situation was much more complex for Ion Torrent sequencing Used at the limit of its capacity the quality of the dataset produced by this platform was low As a consequence biases linked with sampling depth and sequencing errors xvi were identified Furthermore it was qualitatively shown that GC content considerations were susceptible
155. ate de sodium et le transf rer dans un b cher de 100 ml Ajouter environ 60 ml H2O ajouter un barreau magn tique et agiter sur une plaque magn tique Ajuster le pH 5 2 l aide du pH m tre avec une solution d acide ac tique concentr 4 151 Voir le PSO E3 pour l utilisation du pH m tre Transf rer quantitativement dans un ballon de 100 ml et compl ter jusqu au trait jauge avec de l eau distill e Pr paration de 20 ml d une solution Hoechst 0 8 ug ml Il faut d abord pr parer une solution Hoechst de 2mg ml 1 2 3 4 Peser 2mg de colorant Hoechst dans un tube eppendorf de 1 5ml st rile Avec une micropipette ajouter 1ml de tampon TE dans le tube M langer pour dissoudre le colorant Hoechst Envelopper le tube dans du papier d aluminium et conserver 4 C jusqu l utilisation Dilutions de la solution Hoechst 2mg ml pr par es le jour m me de l analyse par fluorom trie On effectue une dilution s rielle partir de trois tubes 2 tubes de 15 ml et 1 tube de 50 ml Les quantit s peuvent tre modifi es selon le nombre d chantillons analyser par fluorom trie Cependant s assurer de conserver les m mes proportions l l aide de la micropipette P200 pr lever 25 ul de la solution Hoechst concentr e 2 mg ml et le transf rer dans un tube centrifugeuse jetable de 15 ml l aide de la pipette automatique P5000 ajouter 2 5 ml de tampon TE
156. atifs de diversit Il a t voqu qu une technique de profilage tr s r pandue l lectrophor se sur gel en gradient d naturant DGGE pourrait poss der cette capacit Donnant g n ralement de l information uniquement sur les esp ces les plus abondantes des communaut s tudi es il a t montr que cette technique pourrait galement contenir de l information sur leur richesse Par contre aucune approche n a pour le moment t d velopp e afin d utiliser cette information De plus l analyse des profils DGGE pr sente des difficult s particuli res lorsque des Vill communaut s tr s diversifi es sont tudi es D s lors il est difficile d affirmer que l information produite sur les esp ces les plus abondantes des communaut s est quantitativement repr sentative Afin de d velopper une approche permettant d utiliser toute l information extraite des profils DGGE le pentachloroph nol semble tre une substance id ale En effet ce contaminant se retrouve fr quemment dans les cosyst mes naturels canadiens poss de des propri t s physico chimiques susceptibles de faire varier sa toxicit en fonction de la composition du sol utilis et a t test sur plusieurs esp ces terrestres diff rentes De plus son effet sur les microorganismes du sol a fait l objet de quelques publications Il sera int ressant de comparer la r ponse et la sensibilit d un indicateur bas sur la diversit bact rie
157. avec de l hexane Param tre du GC FID 1 Installer la colonne factorFOUR de Varian sur le GC 2 R gler les temp ratures du d tecteur et de l injecteur 250 C SANT ET SECURIT RECOMMANDATION S 210 211 4 CIRAIG Centre Interuniversitaire de R f rence sur l Analyse l Interpr tation et la Gestion du cycle de vie des produits proc d s et services PROTOCOLE EXP RIMENTAL Protocole PE71G Nombre de pages 6 Version 1 Date 05 02 13 Auteur s Jonathan Lalande Approuv par Signatures Date Louise Desch nes Lucie Jean Titre Mesure du potentiel d activit hydrolytique de la fluoresc ine diac tate FDA dans un chantillon de sol Mots cl s FDA sols OBJECTIF Ce protocole modifi de Green at al 2006 a pour objectif de mesurer le potentiel d activit hydrolytique de la fluoresc ine diac tate FDA d un sol Puisque plusieurs enzymes sont impliqu s dans le processus d hydrolyse de la FDA en fluoresc ine lipases est rases et prot ases ce test se veut tre tr s g n ral L activit hydrolytique de la FDA d un sol est corr l e aux mesures de biomasse microbienne Pour r aliser ce test on va introduire dans un chantillon de sol un 212 substrat cibl par l enzyme test et on mesurera apr s une p riode d incubation les produits de la transformation enzymatique MAT RIEL Balan
158. ax Apres lt Longueur 300 Max max Apres 300 else Max Longueur end figure 2 hold on plot Rang Min Max Vecteur Min Max plot Rang Min Max P Min Max Rang Min Max P3 Min Max Rang Min Max PFantome Min Max title Verification des pics hold off AcceptationPic while size AcceptationPic 1 prompt La forme des pics est elle acceptable Si non il faudra changer les parametres initiaux O N dlg title Verification du pic num_lines 1 def O options Resize on options WindowStyle normal AcceptationPic inputdlg prompt dlg titlejnum lines def options if strempi AcceptationPic 1 N 0 amp amp strempi AcceptationPic 1 0 0 AcceptationPic end end AcceptationPic strempi AcceptationPic 1 N if AcceptationPic 234 235 InfoPic while size InfoPic 1 prompt Position centrale des pics Emplacement des premiers points utilisables Emplacement des derniers points utilisables Position centrale des pics fantomes Debut des pics fantomes Fin des pics fantomes Facteurs multiplicatifs fantomes dig title Entrez les informations demandees sur le pic que vous voulez quantifier num lines 1 A num2str Vect PositionMax B num2str Avant C num2str Apres D num2str Vect PositionMaxFantome E num2str AvantFantome F num2str ApresFantome G n
159. bands are known to superpose to a certain extent datasets used to generate in silico profiles were further clustered using the RDP pipeline Cole et al 2009 with similarity levels ranging from 96 to 100 This step aims to determine whether the DNA band superposition process is numerically similar to the clustering of DNA sequences at a specific similarity level For simplicity in the particular context of this publication RADs and diversity indices calculated from the pyrosequencing datasets used to generate the in silico DGGE profiles will be referred to as the true RADs and true diversity for a certain similarity level The peak to signal ratio PSR 1 SBP a parameter analogous to the SBP Loisel et al 2006 was extracted from all the in silico DGGE profiles For each sample the PSR was calculated as the area under all the peaks divided by the area under the whole profile The background noise added under the DGGE profiles when synthesizing the image was subtracted before calculating the PSRs This parameter represents the percentage of all the DNA sequences loaded into a DGGE profile contained within the most abundant OTUs the peaks The remainder belongs to the OTUs not abundant enough to produce a visible band on the gel These OTUS are incidentally unaccounted for in the diversity estimates produced through DGGE and will be dealt with by the elongation framework introduced below Finally considering that small peaks may not be v
160. bouton Lumi re permanente sauf si vous portez 186 les quipements de s curit n cessaires 2 Ouvrir la porte et d poser sur le transilluminateur centr sur la plaque de verre de ce dernier le gel analyser 3 S lectionner le filtre appropri en fonction de la substance utilis e afin de colorer le gel Normalement les positions 1 et 2 correspondent respectivement des filtres appropri s pour le SYBR green et le bromure d thydium Par contre le filtre 1 peut tre utilis afin de photographier des gels color s au bromure d thydium produisant ainsi un bruit de fond inf rieur celui g n r par le filtre 2 Les autres positions 3 6 ne contiennent aucun filtre 4 Fermer la porte de l appareil Capture d image avec le logiciel Quantum Capt Seules quelques fonctions du logiciel Quantum Capt sont d crites ici Plusieurs options se rapportant l acquisition d image Touche User profile situ e tout en haut de la fen tre principale vers le centre peuvent tre modifi s par l utilisateur Le logiciel permet galement de modifier l image prise section Enhance en haut droite Quantum Capt offre galement un module d analyse d image Image analysis en bas gauche quoique limit par rapport aux capacit s de Bio 1D Ce dernier sera donc pr f r afin d analyser les gels 1 Double cliquer sur l ic ne du logiciel Quantum Capt sur l ordinateur con
161. c g sol sec Msol sec 2 Au besoin laisser s cher le sol sous hotte quelques jours avant la contamination Remarque La contamination d un sol peu humide se fait de mani re plus homog ne qu avec un sol contenant une trop grande quantit d eau Un sol trop humide aura tendance former des agr gats dans l agitateur par culbutage ou encore s agglom rer dans le fond de la bouteille 3 Une journ e avant le d but des essais d terminer le taux d humidit initial des sols utilis s voir le protocole standard d op ration PSO A7 Suite au pr l vement des chantillons afin de d terminer le taux d humidit conserver les sols de facon limiter l vaporation Le taux d humidit du sol est d termin l aide de la formule suivante RA Msol initial sol final Humidit base humide psec seh Msol initial Mcoupelle Contamination du sol Se placer sous une hotte chimique ET NON SOUS UNE HOTTE BIOLOGIQUE 1 Toute la verrerie et les instruments utilis s afin de contenir et contaminer les sols doivent tre pr alablement nettoy s Pour ce faire rincer 3 fois a hexane 3 fois l ac tone et finalement 3 fois l eau d ionis e Laisser s cher avant d utiliser 2 Identifier une bouteille s rologique pour chaque niveau de concentration d sir Co C7 3 Pr lever l aide d une petite spatule m tallique la masse de contaminant requise afin d obtenir la concentration d
162. cace afin d tudier des contaminations m talliques Demanou et al 2006 Li et al 2006 Renella Mench Gelsomino Landi and Nannipieri 2005 et organiques Li Zhang Wu Zhang and Zhang 2008 Macur et al 2007 Zielezny Groeneweg Vereecken and Tappe 2006 pour ne citer que ces publications Par contre cet outil ne peut pas tre consid r comme tant quantitatif Effectivement en consid rant uniquement les esp ces les plus abondantes les m thodes de profilage sous estiment la diversit des communaut s tudi es Hill et al 2003 Narang and Dunbar 2004 Plus encore il a t d montr que ces estim s n taient pas corr l s la diversit r elle des communaut s Blackwood et al 2007 et ne peuvent donc pas tre utilis s m me des fins comparatives Par contre partir de communaut s bact riennes simul es un lien entre le bruit de fond en dessous des bandes visibles sur les profils DGGE et la richesse de la communaut a t tabli Loisel et al 2006 Ces m mes auteurs ont par la suite brevet une approche permettant d estimer l indice de Simpson D partir de profils DGGE Loisel Hamelin Godon Haegeman and Harmand 2009 Aucune approche permettant l tude g n rale et quantitative de la diversit microbienne des sols partir du DGGE n a jusqu maintenant t d velopp e Un l ment fondamental qui n a re u aucune attention dans la litt rature est la repr sentativit des
163. caisses Desjardins Nestl Rio Tinto Alcan RONA SAQ Solvay Total Umicore and Veolia Environment 113 CHAPITRE7 DISCUSSION GENERALE La m thode d longation pr sent e dans cette th se s est av r tre un outil tr s puissant afin d estimer la diversit bact rienne des sols tudi s Effectivement bien que produits partir d une technique tant pr alablement reconnue pour g n rer de l information uniquement sur les esp ces le plus abondantes des communaut s tudi es les estim s de diversit produits partir du DGGE pour le second manuscrit ont t jug s plus fiables que ceux produits partir de l Ion Torrent PGM Par contre il est tout de m me important de mettre ces r sultats en perspectives D abord le PSR est un param tre ayant une tr s grande influence sur les indices de diversit estim s partir des profils DGGE Bien que l approche utilis e afin d analyser les profils ait t en mesure d estimer ce param tre avec une pr cision de 2 5 pour tous les profils in silico analys s pour le premier manuscrit il est tr s probable que la m me pr cision ne puisse pas tre atteinte lorsque des profils exp rimentaux sont analys s Effectivement le passage du produit PCR dans le gel DGGE est susceptible de g n rer un bruit de fond qui peut difficilement tre s par du signal laiss par les esp ces cibl es par les amorces PCR Aussi les conditions menant la product
164. cal data used for SSD modeling Considering that the dataset was dominated by worms and terrestrial plants the SSD modeling process was carried out using the geometric mean of the ECs available for each taxonomic group All the ecotoxicological indicators geometric mean and ECs are given in mg PCP kg soil The PAF potentially affected fraction of species corresponds to the cumulative proportion of species affected above their ECso at a given PCP concentration See the Material and methods section for the calculations Taxonomic group Terrestrial plants Nematodes Arthropods Worms Geometric mean of the ECso 22 6 23 87 135 1 PAF 12 5 S 62 5 87 5 Species name Lactuca sativa Brassica rapa Raphanus sativa Avena sativa Panagrellus redivivus Plectus communis Folsomia candida Eisenia fetida andrei Eisenia andrei Eisenia fetida Lumbricus terrestris Enchytraeus albidus Eudrilus eugeniae Lumbricus rubellus ECso 8 3 9 9 55 7 57 3 47 9 87 62 8 63 7 77 4 125 7 136 158 5 996 9 Number of data 11 19 Standard deviation T 1 9 30 1 75 3 57 47 6 159 3 637 9 The SSD curve describing the sensitivity of terrestrial species to PCP was compared to the C R curves representing the effect of PCP on soil bacterial community diversity 1 D and exp indices 108 Figure 6 3 The curves drawn using community richness were very diffe
165. ce analytique avec pr cision 0 0001 g Erlenmeyers de 125 mL Ballons jaug s de 10 25 50 et 1000 mL B chers de 25 50 et 1000 mL Pipette P1000 Dispensettes 10 et 50 mL Filtres avec membrane PVDF de 0 45 um Millipore Seringue de 5 mL Ac tone Acide chlorhydrique 1M Substrat FDA Sigma cat no F7378 Fluoresc ine sel de sodium Sigma cat no F6377 Phosphate de sodium tribasique Na3PO4 12H20 Sigma cat no S7778 Spectrophotometer Varian Cary Bio 100 Agilent Technologies Inc pH m tre PREPARATION DES SOLUTIONS Solution de substrat 4 9 mM 1 2 Peser la balance 51 0 mg de substrat FDA dans un b cher de 25 mL Dissoudre dans environ 20 mL d eau d ionis e et agiter l aide d un agitateur magn tique jusqu dissolution compl te Verser dans un ballon jaug de 25 mL et compl ter jusqu au trait de jauge en prenant soin de rincer 3 fois le b cher Tampon phosphate de sodium 60mM pH 7 6 l Dans un b cher de 1 L peser 22 74 g de phosphate de sodium 213 2 Ajouter environ 700 mL d eau d ionis e 3 Agiter l aide d un agitateur magn tique jusqu dissolution complete 4 Ajuster le pH 7 6 avec de l acide chlorhydrique 1M ATTENTION 5 Verser dans un ballon jaug de 1 L et compl ter jusqu au trait de jauge en prenant soin de rincer 3 fois le b cher Solution standard de fluoresc ine 600 uM 1 A la balance peser 2 26 mg de fluoresc
166. ce sens Cette th se pr sentera donc les diff rentes tapes de d veloppement et de validation d une telle approche Cette derni re sera par la suite utilis e dans le but d valuer l utilit d une mesure de diversit comme indicateur de la toxicit du PCP sur les communaut s bact riennes des sols Le premier chapitre de cette th se s attarde sur la pr sentation et la critique des l ments ayant abouti l hypoth se de recherche Cette hypoth se les objectifs qui en d coulent ainsi que la 2 m thodologie g n rale du projet sont pr sent s au chapitre 2 Par la suite un aper u g n ral de l approche analytique permettant de quantifier la diversit bact rienne des sols partir de la technique du DGGE sera pr sent chapitre 3 Ce cadre de travail sera valid th oriquement chapitre 4 et exp rimentalement chapitre 5 Le chapitre 6 pr sente l application de ce cadre de travail afin d valuer l effet du PCP sur la diversit bact rienne des sols S ensuivront une discussion g n rale une pr sentation des contributions de cette th se et finalement quelques conclusions et recommandations permettant d orienter de futurs travaux de recherche CHAPITRE1 REVUE DE LITT RATURE La pr sente th se tant centr e sur l valuation de l effet du PCP sur la diversit biologique des bact ries dans le sol il est logique de d buter cette revue sur des notions de diversit 1 1 Di
167. ciels d analyse de gels commerciaux qui soustraient le bruit de fond l aide d une bille virtuelle roulant sous les profils DGGE cette approche utilise un profil de bruit de fond d fini manuellement par l utilisateur Le bruit de fond ainsi soustrait est utilis afin de d finir un nouveau param tre le ratio pic sur signal qui contient ix Vinformation sur la richesse des communaut s tudi es Une fois le bruit de fond soustrait l information sur les esp ces les plus abondantes de la communaut est g n r e l aide d un algorithme d optimisation facilitant l analyse de profils complexes partir des informations extraites des gels DGGE abondance relative des esp ces les plus abondantes et richesse des communaut s un mod le empirique a t d velopp afin de produire des estim s de diversit quantitatifs partir du DGGE La distribution rang abondance produite par l analyse des bandes DGGE est premi rement multipli e par le ratio pic sur signal extrait du profil Par la suite en utilisant un mod le d abondance empirique la distribution loi de puissance un mod le d longation des distributions rang abondance DGGE a t d velopp Ce mod le a t param tr en observant les distributions rang abondance des communaut s bact riennes in silico utilis es afin de construire les profils analys s Puisque le param trage du mod le d pend du ratio pic sur signal de l chantillon
168. co teux d effectuer des essais de toxicit une chelle pouvant servir de proxy pour un cosyst me en entier les tests de toxicit sont plut t r alis s en laboratoire sur des populations esp ces uniques Les donn es de toxicit concernant les diff rentes populations test es sont ensuite utilis es afin de pr dire l effet des contaminants sur les cosyst mes 1 2 1 Essais de toxicit sur les populations L valuation de l effet d un contaminant sur une population c est dire un groupe d organismes appartenant la m me esp ce se fait g n ralement l aide de tests r alis s en laboratoire Ces essais sont pour la plupart normalis s et leur r alisation doit respecter certains crit res stricts Par exemple la norme de l American Society for Testing and Materials ASTM concernant les tests de toxicit ciblant le ver Eisenia fetida sp cifie le nombre d organismes devant tre utilis s pour chaque r plica l ge et la taille requise des organismes la dur e du test la composition du milieu de test pH duret de l eau composition du sol et plus encore ASTM International 2012 L effet des contaminants sur les populations est repr sent sous la forme de courbes concentration r ponse Plusieurs sous chantillons du m me milieu sol s diment eau sont contamin s diff rentes concentrations augmentant g n ralement en s rie g om trique L Organisation de 10 Coop ration et de D velo
169. cotoxicologie terrestre m rite plus d attention Bien entendu les mesures fonctionnelles d activit microbienne ou enzymatique pr sentent un int r t certain lorsque l on s int resse l tat g n ral d un sol Par contre si l objectif est de proposer un indicateur pouvant 117 potentiellement tre normalis qui permet de mesurer l effet d un contaminant ou de comparer l effet de plusieurs contaminants sur la communaut bact rienne d un sol les indices de diversit pr sentent un potentiel sup rieur aux indicateurs fonctionnels Tel que mentionn pr c demment les indices de diversit permettent de fractionner les communaut s bact riennes en unit s taxonomiques plut t que de consid rer ces derni res comme un tout homog ne Tel qu anticip le fait de fractionner les communaut s bact riennes en plusieurs sous groupes a permis aux indicateurs bas s sur la diversit 1 d tre plus sensibles au PCP qu un indicateur fonctionnel et 2 de ne pas augmenter suite l ajout de contaminant dans le sol Une autre difficult li e l utilisation de mesures fonctionnelles afin d valuer la toxicit des contaminants envers les communaut s bact riennes des sols est de choisir quelle s fonction s doit doivent tre mesur e s En effet d pendamment de son mode d action toxique ou de sa conformation spatiale un contaminant risque d affecter certaines fonctions du sol plus que d autres La perte de diversi
170. could arise 1f PCP exerts a strong toxic effect on bacterial communities hampering the species that were able to tolerate lower PCP concentrations to proliferate Since these samples are quite similar to their clean counterparts especially for S3000 it is also possible that the profiles were mostly constructed with DNA belonging to dead samples Marschner et al 2001 Il Il t1 LI es d TTE AL PPPE Um is LMcin LMsoo LMooo LM3ooo Scin S300 Soo Sooo LMen LM300 LMooo LM3000 Scen Ssoo Sooo S3ooo Figure 5 1 DGGE profiles of the 8 samples analyzed The DNA loaded on the gel was extracted and amplified from a sandy loam LM or sandy soil S Samples were either clean cln or contaminated with pentachlorophenol PCP at concentrations ranging from 300 to 3 000 mg kg dry wt soil Left 400 ng of PCR product per well Right 200 ng of PCR product per well 78 Although DGGE and Ion Torrent sequencing yielded similar index values in some cases most diversity estimates were found to diverge to varying extents Figure 5 2 Most of the DGGE 1 D estimates are higher than their sequencing counterparts indicating differences in the dominance profiles drawn from both techniques The picture is more complex for exp and OTU richness since both soils show different patterns Indeed most of the DGGE estimates are higher than the sequencing results for soil LM but the opposite is observed for soil S Of course seeing
171. cs Will et al 2010 The primary objective of this paper was to validate the DGGE RADs elongation framework on pentachlorophenol PCP contaminated soils The second objective was to determine whether the potential biases in sequencing datasets could cause important intra sample distortions in the 71 relative abundances of OTUs 5 2 3 Methods 5 2 3 1 Preparation of spiked soils About 2 kg of sandy loam LM and sandy soil S were sampled near Montr al QC Canada immediately sieved 2 mm mesh and stored at 4 C until use The particle size distribution was determined according to American Society for Testing and Materials ASTM methods D1140 00 ASTM International 2006 and D422 63 ASTM International 2007a The soils were classified according to the USDE classification system sand 2mm 50um silt 50 2um and clay lt 2um Total carbon TC was measured by combustion with an induction furnace LECO Corporation St Joseph MI according to the ASTM method D2974 07a ASTM International 2007b Total inorganic carbon TIC was performed with a phosphoric acid treatment followed by an infrared determination Total organic carbon TOC was calculated from the difference between TC and TIC Soil pH was determined with distilled water using potentiometry Orion Surfow semi micro Ross combination pH electrode according to ASTM method D4972 01 ASTM International 2007c with a soil to water ratio of 1 2 Soil granulometry total org
172. d Results MoyShannon ICShannon MoySimpson ICSimpson MoyRichesse ICRichesse 276 ANNEXE 3 R SULTATS SUPPL MENTAIRES ASSOCI S AU PREMIER MANUSCRIT CHAPITRE 4 Tableau A3 1 Complete results produced from the comparison of DGGE and sequencing based dominance profiles for all software programs similarity levels and cut off values Voir fichier TableauA3 1 xlsx 2 Tableau A3 2 Optimal parameters obtained for all the sample software pairs Ball size and similarity level values were selected as those simultaneously generating APSR AH and AI D values lower than 10 over the widest range of cut off values Indicators were averaged over all the acceptable cut off values cut off increased in 0 2 increments PONES S De CORNE IS Cut off APSR AH AID Deucuipran program ball size similarity level range FUG 100 98 0 4 3 0 14 1 0 4 6 10 6 S BF100 98 0 4 3 0 1 5 0 5 3 6 8 3 z SAF 100 98 04 18 1 0 0 1 5 3 10 1 amp FUGo7 98 0 6 3 0 0 7 0 2 2 1 17 8 E BFo7 97 12 30 2 3 03 0 3 21 8 B SAFo7 98 0 6 3 0 1 3 0 3 1 2 12 8 2 FUGos 98 0 4 3 0 0 6 1 2 7 9 14 9 BFo5 98 0 4 3 0 1 3 0 2 0 9 13 0 SAF95 98 0 2 3 0 3 3 0 1 0 0 11 6 FUG 100 10 96 2 2 3 0 2 1 2 8 6 7 16 7 L BF100 5 100 0 8 3 0 0 4 1 0 2 1 13 2 S SAF 100 10 98 0 8 2 2 0 6 0 9 0 2 15 4 amp FUGo7 5 100 2 8 3 0 6 3 41 8 7 22 0 g BFo7 5 9
173. d poser dans un b cher de 25ml 2 Avec la m me pipette gradu e pr lever la quantit n cessaire de la solution 80 d ur e et la d poser dans le b cher de 25ml 3 Pr parer environ 5 mL suppl mentaires d une solution ayant une concentration entre 096 et 32 5 gel empilement 177 Note lors de l valuation d un nouvel chantillon faire un gel dont l chelle de gradient s tend de 0 80 ensuite diminuer l chelle du gradient en fonction des bandes qui d finissent l chantillon Lorsque les solutions sont termin es faire d gazer les solutions sous agitation dans une jarre ana robie pendant 15 min tout en s assurant de bien agiter les solutions avec des barreaux magn tiques Recouvrir les solutions d gaz es et les conserver sur de la glace jusqu leur utilisation Pr paration de la chambre gradient et pr chauffage du tampon La chambre gradient Figure A1 5 permet la formation d un gel ayant le gradient le plus lin aire possible Figure Al 5 Chambre gradient Bio Rad mod le 485 La chambre doit tre positionn e sur une plaque agitatrice sur lev e dont la hauteur aura t pr alablement r gl e par essais et erreurs de fa on ce que la totalit des solutions d ur e formamide soit coul e en un maximum de 10 minutes A cette tape il est possible de pr parer le tampon mettre dans le bain migratoire Figure A1 6 afin qu il soit la bonne temp rature
174. dans le premier manuscrit 114 contenaient des s quences d une longueur variant entre 200 et 300 paires de bases tandis que les amorces PCR employ es dans le cadre du second manuscrit ont cibl une r gion entre 130 et 170 paires de bases Il a t montr que la longueur des s quences consid r es avait un impact sur les estim s de diversit produits par les plateformes NGS Morales Cosart Johnson and Holben 2009 Il est donc possible que l utilisation d amorces PCR diff rentes ciblant des sections plus longues ou plus courtes du g ne 16S modifie la correspondance ayant t trouv e entre le processus de co migration des s quences d ADN sur les gels DGGE et celui du groupement des s quences un pourcentage de similitude donn De plus en produisant les profils DGGE in silico une s quence repr sentative unique a t s lectionn e pour chaque OTU D s lors sur ces profils de migration une esp ce OTU tait l origine d une bande DGGE tant donn la variation intra esp ce du g ne 16S bact rien une esp ce unique peut produire plus d une bande DGGE Dowd et al 2008 D pendamment de la fr quence d occurrence de ce ph nom ne et du degr de similitude entre le g ne 16S des bact ries faisant partie d une m me esp ce les indices de diversit produits par le DGGE et les NGS pourraient diverger Ce ph nom ne peut en partie du moins expliquer le fait que les droites de r gression prod
175. differences between software programs were mostly associated to their background subtraction or peak delimitation algorithms These parameters were therefore further studied Background subtraction The background subtraction algorithms evaluated in this paper were limited to the popular rolling ball approaches included in TotalLab GelCompar II and BIO 1D and the approach developed for the Matlab based program TotalLab Quant and GelCompar II include practically the same algorithm a virtual ball whose diameter is chosen by the user rolls under the profiles and subtracts the signal located under the top of the ball BIO 1D s algorithm is slightly different since it first subtracts the signal from the center of the ball and then asks the user to define a threshold level to adjust profile baseline intensities to zero GelCompar II and BIO 1D both propose an optimal ball size for a given gel 41 and 72 pixels 50 for the synthesized image respectively Every profile was therefore analyzed with each software program using ball radiuses of 20 41 72 and 144 94 for BIO 1D since it was the maximum size allowed by the software TotalLab Quant and BIO 1D do not require the redefinition of the peaks when modifying the ball size and additional radiuses of 5 and 10 were added for these software programs Background subtraction with the Matlab based program worked differently After trying to develop an automated calculation procedure to deri
176. e il est possible de d finir un profil de soustraction commun Apr s avoir cliqu sur D bruiter il suffit de cliquer ensuite sur Toutes les pistes afin d appliquer la soustraction tous les profils 194 Lin aire La soustraction lin aire consiste faire passer une ligne horizontale afin de soustraire le bruit de fond d un profil Cela ne correspond pas l apparence du bruit de fond repr sentatif d un profil DGGE issu d une communaut bact rienne de sol S paration des bandes 85724 42865 lf 76 EEE EME SEE w AVE li o as 112 83 4sleiiea 15 i Figure A1 13 S paration des bandes d finies La s paration des bandes se fait en faisant bouger la ligne de d but et de fin de chaque bande Figure A1 13 Lorsqu un grand nombre de bandes sont d finies cette op ration requiert beaucoup de patience La s paration des bandes pour les gels PCR se fait beaucoup plus ais ment Volume de r f rence Cette option n est pas utilis e Calibration Pour les gels d agarose v rification du produit PCR cliquer d abord sur diter marqueurs calibration en haut et droite de la fen tre et entrer les quantit s d ADN correspondant aux diff rents fragment
177. e directement par le lecteur microplaque voir le protocole PSO E19 pour le fonctionnement du fluorom tre Convertir les valeurs de fluorescence obtenues partir de la courbe standard d ADN V rification de l ADN extrait par migration sur gel d agarose 1 l 2 Peser directement dans un erlenmeyer de 250 ml 0 5000 g d agarose Pr lever dans un cylindre gradu 50 ml de tampon TAE 1X et verser dans l erlenmeyer contenant l agarose Faire chauffer cette solution afin de solubiliser compl tement l agarose m langer de temps autre pendant le chauffage le chauffage devrait tre d environ 1 minute 158 4 Verser cette solution dans un moule a gel en plastique dont les deux extr mit s ont t bouch s par du ruban autocollant masking tape 5 Fixer rapidement le peigne l extr mit du gel avant que ce dernier ne se solidifie 6 Laisser le gel se solidifier entre 30 et 45 minutes en s assurant que le moule a gel est de niveau Lorsque le gel s est solidifi retirer d licatement le peigne et d poser le moule dans le bain de migration rempli avec du tampon TAE 1X 7 D poser dans des eppendorf de 0 2 ml 1 ul de tampon de migration l aide d une pipette automatique de 2 ul 8 Dans le premier eppendorf d poser 5 ul de la solution standard d ADN Ladder 1 kb l aide d une pipette automatique de 20 ul 9 Dans les autres eppendorf d poser 5 ul des chantillons d ADN
178. e fact that the diversity of the most contaminated samples LM and S7 was higher than that of the less contaminated ones One possible explanation is that the PCP affected all the bacterial species thus hampering the apparition of bright bands on the DGGE profiles while causing a significant decrease in microbial biomass 50 if the FDA assay results are considered Considering the effect of pH on the aqueous solubility of PCP Arcand et al 1995 it is not surprising that this effect appeared at lower PCP concentrations for soil S than 110 for soil LM Tableau 6 1 Another element that could potentially explain these observations is the persistence of DNA in soils which makes dead organisms detectable by PCR DGGE Marschner et al 2001 In fact all the profiles probably contain the DNA of dead organisms However since PCP induces bacterial mortality it is highly plausible that the most contaminated samples contain a higher proportion of DNA from dead organisms This can artificially inflate the apparent diversity of the bacterial communities and thus reduce the sensitivity of the structure based metrics It would be interesting to verify whether treating the samples with ethidium monoazide bromide prior to DNA extraction Pisz Lawrence Schafer and Siciliano 2007 or amplifying RNA instead of DNA Pennanen et al 2004 two methods proposed to target the active members of the bacterial communities would yield different results
179. e fluoresc ine Compl ter jusqu au trait de jauge avec du tampon phosphate boucher et inverser au moins 13 fois Verser dans des b chers de 50 mL Ajouter l aide d une pipette P1000 0 5 mL de tampon phosphate suppl mentaire Les solutions standards contiendront respectivement 0 0 3 0 6 0 9 1 5 et 3 umol de fluoresc ine Arr t de la r action Les tapes qui suivent doivent tre r alis es le plus rapidement possible 1 Apr s 2h d incubation injecter dans chaque erlenmeyer 2 0 mL d ac tone l aide d une dispensette pr alablement calibr s 2 Agiter les erlenmeyers 3 Faire de m me avec les b chers de 50 mL contenant les solutions standards de fluoresc ine Filtration 1 Pr parer un grand b cher contenant de l eau d ionis e et un autre vide qui seront utilis s afin de laver la seringue 2 Pr lever l aide d une seringue de 5 mL environ 2 5 mL de solution standard de la moins concentr s a la plus concentr s 3 Visser au bout de la seringue un filtre avec une membrane de PVDF de 0 45 um n utiliser qu un filtre pour les standards 4 Filtrer le liquide directement dans une cuvette pouvant tre lue par le spectrophotom tre ne filtrer que la quantit requise 5 Pr lever l g rement plus de liquide dans le standard suivant et apr s avoir reviss le filtre filtrer quelques gouttes dans le b cher vide pour laver le filtre 215 6 Reprendre les tapes 4
180. e gants lors des tapes impliquant le dichlorom thane e R aliser toutes les tapes sous une hotte chimique R F RENCES Protocole standard d op ration PSO A7 Mesure du poids sec Protocole standard d op ration PSO A 23 D termination de la capacit de r tention d eau au champ d un chantillon de sol RECOMMANDATION S Certains contaminants sont photor actifs Les chantillons et extraits doivent donc tre opaques ambr s ou recouverts d aluminium Leurs bouchons doivent tre en t flon ou si ce n est pas le cas placer de l aluminium avant le couvercle 4 CIRAIG Centre Interuniversitaire de R f rence sur l Analyse l Interpr tation et la Gestion du cycle de vie des produits proc d s et services Universite dh WER de Montr al montrent NILE PROTOCOLE EXP RIMENTAL Protocole PE71F Nombre de pages 9 Version 1 Date 19 F vrier 2009 Auteur s Lucie Jean Approuv par Jonathan Lalande Signatures Date Titre Quantification du pentachloroph nol PCP par dosage par chromatographie en phase gazeuse coupl e un d tecteur ionisation de flamme gaseuze Mots cl s sol eau pentachloroph nol PCP GC FID chromatographie en phase OBJECTIF 202 Cette m thode adapt e de Pu et Cutright 2006 s applique au dosage du pentachloroph nol PCP dans les mati res liquides aqueuses les mati res solides
181. e it correlates well with microbial biomass Swisher and Carroll 1980 and is widely accepted as a simple method to measure total microbial activity Adam and Duncan 2001 Furthermore by comparing the diversity based C R curves to the terrestrial SSD drawn for PCP the ability of such indicators to derive relevant EQCs was assessed 6 2 3 Material and methods 6 2 3 1 PCP contaminated soil microcosms Approximately 2 kg of sandy loam LM and sandy S soils were sampled near Montr al Qu bec Canada immediately sieved 2 mm mesh and stored at 4 C until use The particle size distribution was determined according to the D1140 00 ASTM International 2006 and D422 63 ASTM International 2007a ASTM methods The soils were classified according to the USDE classification system sand 2mm 50um silt 50 2um and clay lt 2 um Total carbon TC was measured through combustion with an induction furnace LECO Corporation St Joseph MI according to the D2974 07a ASTM International 2007b ASTM method Total inorganic carbon TIC was performed with a phosphoric acid treatment followed by an infrared determination Total 98 organic carbon TOC was calculated from the difference between TC and TIC Soil pH was determined with distilled water using potentiometry Orion Surfow semi micro Ross combination pH electrode according to the D4972 01 ASTM International 2007c ASTM method with a soil to water ratio of 1 2 Soil granulometry
182. e microbienne l re de la microbiologie mol culaire Les approches mol culaires sont principalement bas es sur l tude de l ad nosine d soxyribonucl ique ADN ou de l ad nosine ribonucl ique ARN extrait du sol L mergence de ces techniques est intimement li e ce qui a t d nomm la Grande anomalie du d compte sur plaque traduction libre de Great plate count anomaly Staley and Konopka 1985 Cette expression fait r f rence la grande diff rence existant entre le nombre de microorganismes pouvant tre cultiv s en laboratoire sur des boites de P tri et celui pouvant tre observ directement au microscope Cela a men la conclusion que la majorit des esp ces microbiennes jusqu 99 Hugenholtz 2002 requi rent des conditions de croissance diff rentes de celles g n ralement utilis es en laboratoire Cela constituait un probl me important pour le domaine de la phylog nie microbienne qui tait principalement bas sur l tude d esp ces isol es et cultiv es au laboratoire Depuis le domaine de la phylog nie microbienne s est transform A l heure actuelle la phylog nie procaryotique est largement bas e sur l tude de la composition du g ne codant pour la petite unit ribosomale le g ne 16S Rajendhran and Gunasekaran 2011 Ce gene essentiel au bon fonctionnement de la cellule sert de marqueur permettant de classer les procaryotes en esp ces En r gle g n rale la composit
183. e optimise l amplitude et l cart type correspondant chaque pic tout en permettant aux positions centrales visuellement estim es de varier de quelques pixels vers la gauche ou vers la droite Les r sultats sont pr sent s sur un graphique et l analyste peut accepter ou refuser ces derniers S il y a refus de nouvelles positions centrales peuvent tre fournies et ou plus ou moins de pics peuvent tre consid r s simultan ment L analyse se poursuit jusqu ce que tous les pics aient t quantifi s L abondance relative des diff rentes bandes est ensuite d termin e partir des amplitudes optimis es Les r sultats g n r s par l analyse des profils DGGE bruit de fond et abondance relative des bandes seront utilis s par le mod le d longation des RAD DGGE pr sent au chapitre suivant M 130129 _A6S1 importe g Figure 2 File Edit Select View Image Layer Colors File Edit View Insert Tools Desktop Window Help gt P amp ssp 609 ES Position centrale des pics O08 BH Rh OR s EJ m m 1820 1866 1962 2099 2163 2415 2497 x 107 Verification des pics Emplacement des premiers points utilisables 25 1724 Emplacement des derniers points utilisables 2620 Position centrale des pics fantomes 0 Debut des pics fantomes 0 Fin des pics fantomes 0 Facteurs multiplicatifs fantomes 1 Bs 0 2 gt 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 px 25095 v 130129 A6S1
184. e par bris m canique des cellules microbiennes avec des billes de verre zirconium silice 0 lmm de diam tre et d une solution tampon de lyse compos e d hexadecyltrimethylammonium bromide dithiothreitol CTAB DTT B rgmann et al 2001 Thakuria et al 2008 146 MATERIEL R actifs Hexadecyltrimethylammonium bromide CTAB BioChemika Ultra 52365 FW364 5 dessiccateur Dithiothreitol DTT Sigma Grade molecular biology D9779 FW154 3 chambre froide 4 C NaCl Anachemia ACS grade AC 8304 FW58 44 EDTA Fisher molecular grade BP120 500 FW372 24 Sodium Phosphate NaH2PO4 H20 Anachemia grade ACS Ac tate de potassium Sigma P1190 FW 98 14 dessiccateur Ac tate de sodium tri hydrat Anachemia 79948 380 Acide ac tique Fisher UN 2789 TRIS bio Rad 161 0119 FW121 14 Chloroforme Fisher Scientific C606 1 Alcool Isoamyl 3 m thyl 1 butanol Aldrich 32002 1 Solution de Phenol Chloroform isoamyl alcohol 25 24 1 Sigma BioUltra 77617 chambre froide 4 C Polyethylene glycol 6000 BioChemika Ultra 81253 laboratoire Phosphate de potassium KH2PO4 et KoHPOA Polyvynilpolypyrrolidone Sigma biology molecular grade P6755 laboratoire Solution HCI 10M Solution HCl 3M Solution NaOH 10M Solution Hoechst 33258 2 mg ml Sigma no 33258 Solution d ADN 100ug ul D1501 Sigma Eau d ionis e quipements Billes zirconium silice 0 1mm de diam tre autoclavables
185. ed an acceptable fit if a distinct model parameterization is used to predict mid and low abundance values Starting right after the last DGGE peak above the optimal cut off value the elongation framework was therefore divided into two distinct steps both based on Eq 3 The first step elongated the truncated DGGE based RADs until a richness of 699 was reached using a PLD exponent a of 0 875 for all the samples The abscissa x value in Eq 3 producing an abundance just below that of the last retained peak was selected as the starting x value for the elongation This initial abscissa was distinct for all samples and once determined was increased by one each time a species was added to the RAD The other parameter of Eq 3 Xmin varied between 54 500 and 3000 and was optimized for each sample to ensure continuity in the predicted abundance values at the junction of the two elongation steps The second elongation step produced abundance values for species of rank 700 and more In this second step species rank corresponded to abscissa values The PLD parameters a and x are functions of the PSR values and were determined using relationships derived from the true community RADs Eq 4 and 5 For both elongation steps predicted abundance values were rounded to the nearest integer Considering that the elongation framework was designed to work in absolute abundance when a value of 1 was reached singletons were added until the sum of the abundance
186. el whole genome sequencing BMC Genomics 7 1 216 Pinto AJ and Raskin L 2012 PCR Biases Distort Bacterial and Archaeal Community Structure in Pyrosequencing Datasets PLoS ONE 7 8 e43093 doi 10 1371 journal pone 0043093 Pires ACC Cleary DFR Almeida A Cunha A Dealtry S Mendonga Hagler LCS Gomes NCM 2012 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis and Barcoded Pyrosequencing Reveal Unprecedented Archaeal Diversity in Mangrove Sediment and Rhizosphere Samples Applied and Environmental Microbiology 78 16 5520 5528 doi 10 1128 aem 00386 12 Pisz JM Lawrence JR Schafer AN and Siciliano SD 2007 Differentiation of genes extracted from non viable versus viable micro organisms in environmental samples using ethidium monoazide bromide Journal of Microbiological Methods 71 3 312 318 doi 10 1016 j mimet 2007 09 015 Polz MF and Cavanaugh CM 1998 Bias in Template to Product Ratios in Multitemplate PCR Applied and Environmental Microbiology 64 10 3724 3730 Posthuma L Suter II GW and Traas TP 2001 Species Sensitivity Distribution in Ecotoxicology Boca Raton Lewis Publisher 136 Posthuma L Traas TP and Suter Il GW 2001 General introduction to species sensitivity distributions In L Posthuma G W Suter II amp T P Traas Eds Species sensitivity distributions in ecotoxicology pp 3 10 Boca Raton Lewis Publisher Pu X and Cutright TJ 2006 Sorption desorpt
187. ell Canada Bombardier Cascades Mouvement des caisses Desjardins Groupe Electricite de France Gaz de France Eco Entreprises Quebec Hydro Quebec Johnson amp Johnson Groupe Louis Vuitton Mo t Hennessy Michelin Nestl Recyc Quebec Rio Tinto Alcan RONA Societe des Alcools du Quebec Solvay Total Umicore and Veolia Environment 68 CHAPITRE 5 VALIDATION DE LA M THODOLOGIE D ELONGATION DES RAD DGGE SUR DES CHANTILLONS DE SOL CONTAMINES AU PENTACHLOROPHENOL Cette section est centr e autour du second manuscrit intitul Can DGGE and Ion Torrent sequencing yield similar quantitative conclusions when comparing the diversity of soil bacterial communities section 5 2 soumis la revue FEMS Microbiology Ecology soumis le 23 avril 2013 5 1 Lien entre le premier et le second manuscrit Le premier manuscrit a permis la validation th orique de la m thodologie d longation des RAD issues des gels DGGE Par contre la validit de cette approche doit encore tre montr e exp rimentalement En effet les gels DGGE exp rimentaux sont imparfaits et repr sentent donc un d fi plus important que les profils in silico Avant de l utiliser il est donc imp ratif de tester cette approche sur des chantillons r els Le second manuscrit vise donc comparer les estim s de diversit produits partir du DGGE et partir de l Ion Torrent une plateforme NGS Pour ce faire deux sols de texture diff rente sont divis s
188. ence on the 1 D values than Figure 5 4 suggests Although not shown in Tableau 5 3 the pseudo single linkage clustering identified proportionally more potentially erroneous sequences in the contaminated sample datasets Considering that these datasets were dominated by longer sequences 160 bases instead of 136 bases it can be hypothesized that many sequencing errors were located at the end of the sequences where the per base quality scores were relatively low 84 Tableau 5 3 Potential influence of sequencing errors on the indices calculated from sequencing datasets The values correspond to the relative index variation in when the pseudo single linkage clustering algorithm Huse et al 2010 is applied using a dissimilarity of 2 or 4 bases instead of 3 Dissimilarity of 2 bases Dissimilarity of 4 bases Sample 1 D exp OTU richness 1 D exp OTU richness LMcin 69 24 6 34 22 8 LM300 35 32 7 25 28 10 LMoo0 48 36 3 35 38 12 LM3000 51 28 6 30 27 9 Sein 42 22 7 24 19 8 S300 25 22 6 21 21 8 S900 39 26 5 27 25 8 S3000 45 22 T 20 17 7 The relationship between sequence length or GC content and quality was further investigated The upper part of Figure 5 5 presents the relationship between the sequences average quality and trimmed length Then extracting the sequences corresponding to bins of particularly low deletion percentages amplicons were ordered by increasing GC content values in order
189. ent in the ecotoxicological databases generating data about soil bacterial communities allows us to tackle this problem Furthermore considering their importance in terrestrial ecosystems generating information about the effect of xenobiotics to these communities would be of high environmental relevance To do so ecological diversity indices present many advantages compared with functional indicators but also many difficulties Being able to accurately estimate the diversity of these very complex communities is without a doubt the major one In one publication it was shown that denaturing gradient gel electrophoresis DGGE a widespread profiling method is theoretically able to yield quantitative information on the relative abundance of the dominant species but also on the richness of the studied communities However no framework has been developed in order to use this information Furthermore the analysis of complex DGGE migration profiles of soil bacterial communities presents many difficulties It is therefore hard to say that the information extracted from the DGGE migration profiles can be used to quantitatively study bacterial community diversity In order to develop a framework allowing quantifying the effect of xenobiotics on the diversity of soil bacterial communities pentachlorophenol seems to be an ideal case study This contaminant is ubiquitous in Canadian terrestrial ecosystems possesses interesting physico chemical properti
190. entative of the studied bacterial communities 97 While some papers have studied the impact of pentachlorophenol PCP on soil bacterial communities most targeted integrative microbe mediated functions with variable results Marti et al 2011 Megharaj et al 1998 Scelza et al 2008 Since soil bacterial communities are composed of thousands of interacting species all different in terms of their ecological niche and metabolic potential Stres and Tiedje 2006 assessing the impact of PCP using ecological diversity indices Magurran 2004 shows great potential By fractioning these communities into species instead of considering them as a whole diversity indices can potentially be more sensitive than functional measures Furthermore if the range of sensitivity of bacterial species to PCP is similar to what is observed for higher species a single test could yield enough information to derive relevant EQCs The aim of this paper was to assess the usefulness of indicators based on the diversity of soil bacterial communities to assess the toxicity of PCP The contaminant was mainly chosen because many authors have studied its toxicity to microbial communities and other terrestrial species Through concentration response C R modeling the sensitivity of diversity indices in detecting PCP was compared to an integrative functional indicator the soils fluorescein diacetate FDA hydrolytic activity The FDA hydrolysis assay was chosen becaus
191. er simultaneously the richness of the community number of species and the relative abundance of the different species could be more sensitive to xenobiotics than functional parameters However it is still technically difficult to accurately estimate the diversity of soil microbial communities First of all the molecular approaches used to study microbial diversity are not able to consider at once all the microorganisms bacteria archaea and fungi composing these communities As a consequence bacterial communities the most diversified of these subgroups are selected by most of the authors Then it was shown that the widespread profiling methods only able to yield quantitative information about the relative abundance of the most abundant species are unable to xiii produce diversity estimates correlated to the actual diversity of soil bacterial communities The newer next generation DNA sequencing technologies theoretically allow studying the diversity of bacterial communities with an unprecedented depth However many authors showed that diversity estimates produced from sequencing results may be biased to an unknown extent Furthermore sequencer availability may still be problematic for many researchers Many limitations hampering the estimation of the effect of xenobiotics in terrestrial ecosystems have been identified Terrestrial ecotoxicological data are scarce and do not concern enough different species Being almost abs
192. ergences between DGGE based RADs and true RADs and had to be subtracted An important objective of this paper was to evaluate the extent of DGGE bands clustering From the in silico DGGE profiles produced here when studying complex soil bacterial communities co migration events can be seen as the norm rather than the exception As unambiguously demonstrated by other authors Schmalenberger and Tebbe 2003 all DGGE bands can be expected to contain many different OTUs Working with in silico profiles led to the observation that peaks are indeed formed by the addition of one dominant and many rare phylotypes Even though a high number of OTUs had the exact same calculated Tm and therefore co migrated on the in silico profiles OTU positions were predicted from the sequences calculated Tm cases in which two dominant OTUs shared the same Tm were not observed in any sample It is important to keep in mind that this situation could happen in other samples For all the samples it was still possible to identify certain peaks formed by the exact co migration of many mid dominant phylotypes leading to the appearance of a dominant DGGE band Euclidean distance values presented in Figure 4 3 were mostly driven by the presence of certain important peaks with no corresponding dominant OTUs For some samples the presence of a very abundant OTU in the true RADs associated with a DGGE band having a much lower relative abundance also had a significant impact on the
193. eros NbPics 10 for a 1 NbPics if a lt length AvantFantome Parametres a Vect PositionMax a Amplitude 1 a Sigma_1 a Avant a Apres a y Vect PositionMaxFantome a AvantFantome a ApresFantome a FacteursFantomes else Parametres a Vect PositionMax a Amplitude 1 a Sigma 1 a Avant a Apres a y 0 0 0 0 end end Matrice Matrice Parametres csvwrite InfoResultats 2 Matrice j j NbPics yc DernierPic Si l utilisateur a appuyi par erreur sur cancel while size DernierPic 1 prompt Y a t il encore des pics a quantifier O N dig title Autres pics num_lines 1 def O options Resize on options WindowStyle normal DernierPic inputdlg prompt dlg_title snum_lines def options if strempi DernierPic 1 N 0 amp amp strempi DernierPic 1 0 0 DernierPic 239 end end DernierPic strempi DernierPic 1 N if DernierPic DernierPic Si l utilisateur a appuy 2 par erreur sur cancel while size DernierPic 1 prompt Vous avez vraiment termine O N dig title Verification du pic num lines 1 def N options Resize on options WindowStyle normal DernierPic inputdlg prompt dlg_title num_lines def options if strempi DernierPic 1 N 0 amp amp strempi DernierPic 1 0 0 DernierPic end end DernierPic strempi DernierPic 1 0 end close all if ma
194. erte de fonction ou l effondrement de l cosyst me 1 1 3 Quantification de la biodiversit Jusqu maintenant la biodiversit a t pr sent e d un point de vue plut t th orique Par contre afin de comparer la diversit de diff rents cosyst mes ou d valuer l effet de diff rents traitements sur ces derniers il importe d tre en mesure de quantifier la diversit La diversit biologique a t divis e en trois l ments les diversit s a pha beta et gamma Whittaker 1972 La diversit totale dans une r gion donn e diversit gamma a t d finie l aide de deux l ments la diversit valu e une chelle plus locale diversit a pha ainsi que les diff rences de diversit locales au sein de la r gion globale diversit beta La pr sente th se se concentrera uniquement sur la diversit alpha La quantification de la biodiversit passe g n ralement par la d termination de la distribution rang abondance Rank abundance distribution o RAD repr sentant la communaut tudi e La RAD Figure 1 1 est une repr sentation graphique permettant d observer l volution de l abondance relative ou absolue des esp ces composant une communaut en fonction du rang de celles ci le rang correspond simplement la position d une esp ce donn e lorsque toutes les abondances sont tri es en ordre d croissant Communaut Communaut 2 Abondance relative 0 20 40
195. ery indicative of true community dominance profiles DGGE based RADs were truncated by subtracting all the peaks with relative abundances smaller than a certain cut off Since it was impossible to objectively choose an appropriate cut off percentages between 0 and 3 0 in 0 2 increments were successively used in order to identify the optimal value for subsequent analyses This truncation was judged necessary because it was 52 observed that DGGE based and true RADs were deviating at a certain relative abundance value The PSR values were modified to take into account the peaks that were removed from the DGGE based RADs To compare DGGE based and true community dominance profiles true RADs had to be modified For all the samples the true distributions were truncated by keeping the same number of OTUs as the number of peaks above the cut off percentage True PSRs were then calculated as the number of sequences in the truncated RADs divided by the number of sequences in the complete distributions Finally since DGGE band quantification yields results in relative abundance true RADs were transformed accordingly This truncation lead to the calculation of biased diversity indices and was solely used for comparative purposes The representativeness of DGGE based dominance profiles was evaluated using four indicators The first indicator was used to verify whether PSRs can be accurately extracted from DGGE profiles 1 APSR Deviation percenta
196. es 92 The story is different when using the elongation framework presented in this paper Considered to be the best available technology DNA sequencing was used with the aim of validating the framework In doing so biases linked to DGGE profiling and especially to the Ion Torrent datasets were clearly identified Since the true diversity of the studied samples is unknown it is impossible to determine which technology produces the most accurate diversity estimates While divergences exist it is important to note that the diversity estimates produced by both technologies are highly correlated when the bias linked to sampling depth is corrected Tableau 5 4 Considering the variability of OTU richness with respect to the correction methodology it is not advisable to recommend this indicator to compare the diversity of soil bacterial communities This supports a previous conclusion stating that the actual technologies do not allow the production of richness based metrics suitable to be used to quantitatively compare the diversity of soil bacterial communities Pinto and Raskin 2012 Unlike richness exp and especially 1 D estimates were very robust Even before bias correction the DGGE and Ion Torrent sequencing indices were significantly correlated p lt 0 05 However these high correlations do not mean that the indices were accurate Questions can be raised about the accuracy of the Ion Torrent diversity estimates Indeed even though it
197. es potentially allowing this substance to exhibit different toxicities in different soil types and most of all was tested on many different terrestrial species Furthermore its effect on soil microorganisms was already studied by some authors It will be interesting to compare the sensitivity of ecological diversity indices and functional measures to detect pentachlorophenol To do so the assay of fluorescein diacetate hydrolytic activity seems to be perfectly suited it is a simple assay producing results well correlated with microbial biomass measures that were shown by some authors to be sensitive to pentachlorophenol contamination xiv On the basis of the above mentioned limitations the projects main objectives are the following 1 Develop an analytical approach allowing the extraction from DGGE migration profiles information on the relative abundance of the dominant species and on the richness of the studied communities 2 Using in silico DGGE migration profiles develop an empirical framework allowing the accurate estimation of the diversity of soil bacterial communities using the information extracted from the profiles 3 Validate the framework on real samples by comparing the diversity estimates produced by DGGE and by a next generation sequencing technology 4 Quantify and compare the effect of pentachlorophenol on the diversity of soil bacterial communities and on the soils fluorescein diacetate hydrolytic activity
198. es DGGE a t d velopp e et calibr e Ce mod le d longation se base sur le ratio pics sur signal Peaks to signal ratio ou PSR un param tre estim suite l tape de soustraction du bruit de fond des profils DGGE Cette approche a permis d estimer avec une tr s bonne pr cision la diversit bact rienne r elle des communaut s tudi es Ce manuscrit intitul 4 new framework to accurately quantify soil bacterial community diversity from DGGE a t publi dans la revue Microbial Ecology Dans le but de valider la m thode d longation des RAD DGGE le second manuscrit chapitre 5 a compar les estim s de diversit produits par le DGGE et par la plateforme NGS Ion Torrent PGM La comparaison de ces deux techniques a permis d identifier des distorsions dans les r sultats produits par les deux approches Pour le DGGE il a t d montr que la quantit d ADN 37 normalement inject e dans les puits pouvait causer une saturation locale du gel Ce ph nom ne qui se produit dans les r gions du gel o une grande quantit d ADN migre r duit artificiellement l abondance estim e des esp ces les plus dominantes d une communaut Pour l Ion Torrent les multiples sources de distorsions furent majoritairement reli es la qualit des s quences produites erreurs de s quen age fr quentes trop peu de s quences par chantillon et faible qualit des s quences riches en GC Une fois ces distorsions p
199. es amplifications il devrait y avoir entre 45 et 50 ul de solution 10ul de tampon de migration 2X gel loading dye Retirer le peigne et le ruban adh sif du support et d poser le support dans la cuve lectrophor se remplie de solution TAE 1X Avec la pipette P200 charger les puits avec les solutions d ADN et les marqueurs attention aux bulles d air S assurer de bien noter les correspondances puits chantillon Avec une pipette P20 injecter Sul de la solution contenant des standards massiques d ADN EZ load mass standard dans un puits Mettre le couvercle en place en prenant soin de bien brancher les p les au bon endroit rouge avec rouge et noir avec noir Couvrir pour prot ger de la lumi re et allumer l appareil Mettre l appareil en mode mA appuyer sur la touche permettant de s lectionner le mode jusqu ce que la lumi re soit vis vis le mode mA Appuyer sur le bouton STOP jusqu ce que le symbole dEq apparaisse Mettre l appareil en mode V S assurer que le voltage est de 100 l cran Si ce n est pas le cas ajuster avec les fl ches situ es droite de l cran Mettre l alimentation en marche appuyer sur RUN et laisser migrer pendant 45 minutes ou jusqu ce que le marqueur de migration ayant la vitesse de migration la plus rapide atteigne minimalement le centre du gel D brancher l appareil lectrophor se retirer le couvercle et le support D poser le gel sur
200. es sequence quality The same quality decrease seems to be observed for sequences having a GC percentage lower than 48 However since very few sequences corresponded to these GC bins these deletion percentages should be considered with caution 5 2 4 4 Comparing the outcomes of diversity studies based on DGGE and Ion Torrent sequencing Until now the values of the diversity indices produced by DGGE and Ion Torrent sequencing were quantitatively compared While this methodology made it possible to identify potential biases in the results of both techniques the main objective of this paper was to find out if the DGGE RADs elongation framework could yield quantitative conclusions similar to those found by next generation sequencing technologies Tableau 5 4 presents the linear correlation between Ion Torrent and DGGE diversity indices when applying various correction methodologies These methodologies aimed at reducing the biases in the datasets making the indices more comparable 87 Tableau 5 4 Slopes and coefficients of correlation of the linear regressions conducted between Ion Torrent sequencing and DGGE based diversity estimates All the coefficients were determined by forcing the intercept of the regression line to be the origin For the Ion Torrent data uncorrected refers to the diversity indices calculated directly from the clustered datasets normalized corresponds to the values produced by sampling all the datasets 5 000 times
201. esents the mean APSR AH A1 D and Deucuipean values produced by each software program when the parameters presented in Tableau 4 2 are used Tableau 4 2 Parameters that made it possible to minimize indicator values when simultaneously considering all the samples Optimal Optimal cut off Closest Software program ball size value similarity level Matlab based framework 1 0 98 TotalLab Quant 20 1 6 96 GelCompar II 41 1 0 96 BIO 1D 4 0 4 98 50 D Matlab based framework TotalLab Quant 4096 B amp GelCompar Il mBIO 1D 30 20 4 10 0 10 20 Indicator mean value all samples 30 40 4 1 d APSR AH AID D EUCLIDEAN Figure 4 3 Indicator values obtained using the parameters presented in Tableau 4 2 reported as the mean of all nine samples Error bars correspond to the maximum and minimum values All diversity measures were calculated using truncated RADs 60 The differences in the results presented in Tableau 4 1 and 4 2 for the three commercial software programs are noteworthy Taking TotalLab Quant as an example a ball radius of 20 was never found to be optimal when considering samples individually Still this ball size was selected as the best compromise when simultaneously considering all samples This observation is also true for the similarity level that made it possible to minimize the differences between DGGE and pyrosequencing based R
202. essais de toxicit et produire une distribution de sensibilit des esp ces courbe SSD partir des donn es cotoxiques concernant les esp ces terrestres chapitre 6 viii Extraire des courbes concentration r ponse et SSD certains indicateurs cotoxiques fr quemment utilis s dans la litt rature et comparer la sensibilit des cosyst mes terrestres au PCP l chelle microscopique et macroscopique chapitre 6 2 4 Pr sentation des manuscrits Le premier manuscrit chapitre 4 pr sente les tapes de d veloppement de la m thodologie permettant de quantifier la diversit bact rienne dans les sols partir de la technique du DGGE Les travaux pr sent s dans ce manuscrit se sont bas s sur l analyse de profils DGGE in silico construits partir des r sultats d une plateforme NGS En travaillant avec des communaut s bact riennes connues il a t possible de comparer les profils de dominance produits par plusieurs logiciels d analyse de gels DGGE aux profils r els caract risant ces communaut s Cela a galement donn l opportunit d tudier l occurrence et l influence des pisodes de co migration des s quences d ADN sur les estim s de diversit produits l aide de cette technique Reconnaissant la sup riorit d une approche analytique bas e sur le logiciel Matlab d velopp e dans le cadre de ce projet une m thode empirique permettant de compl ter les RAD partielles issues de la quantification des band
203. est que l ADN des bact ries tu es par l ajout de PCP n a pas pu tre compl tement d grad en 28 jours En fait les deux ph nom nes se sont probablement produits simultan ment forte concentration le PCP a probablement induit une forte mortalit et inhib la croissance de toutes les esp ces bact riennes Si l inhibition de la croissance des esp ces bact riennes constitue un effet r el du PCP l inclusion de l ADN appartenant des organismes morts est un art fact des tudes bas es sur l extraction de l ADN contenu dans le sol Cet art fact a le potentiel de gonfler les estim s de diversit produits partir du DGGE ou des NGS De plus l effet quantitatif de cet art fact a probablement augment en parall le avec la concentration en PCP ajout e aux sols modifiant ainsi la forme des courbes concentration r ponse trac es partir des indices de diversit Tel que discut dans le troisi me manuscrit il serait int ressant de quantifier l effet de cet art fact en traitant les sols avec du bromure d thydium monoazide Pisz et al 2007 ou encore en amplifiant l ARN plut t que l ADN Pennanen et al 2004 Ces deux m thodes permettent de cibler les membres actifs des communaut s bact riennes Malgr toutes les distorsions mentionn es pr c demment inh rentes au mod le d longation pr sent dans cette th se mais galement aux plateformes NGS l utilit des indices de diversit dans le domaine de l
204. et autres erreurs d amplification peut tre r duite en abaissant le nombre de cycles d amplification au minimum n cessaire i e afin d obtenir suffisamment d ADN pour l analyse Finalement plusieurs techniques de purification peuvent am liorer la qualit des amorces 27 1 4 2 3 Analyse du produit amplifi Paide du DGGE La technique du DGGE est une m thode de profilage permettant de s parer les brins d ADN amplifi s sur la base de leur composition Plusieurs autres techniques de profilage existent et il a t rapport que ces derni res g n rent des r sultats tr s similaires D s lors le choix d une ou l autre repose le plus souvent sur l expertise et l quipement disponibles afin de r aliser une tude Oros Sichler et al 2007 Le DGGE est sans contredit la plus utilis e des techniques de profilage recherche Compendex Le DGGE se fait sur un gel d acrylamide ayant un gradient lin aire d ur e et de formamide deux agents permettant la d naturation de l ADN Pour faire du DGGE l amorce forward doit contenir une pince GC s quence de 40 bases G ou C Sheffield Cox Lerman and Myers 1989 Dans l ADN le lien G C est plus fort que le lien A T Tel que pr sent la Figure 1 7 cette pince GC se d nature difficilement et maintiendra les brins d ADN ensembles lorsque ces derniers migreront vers le bas du gel Le produit PCR est introduit dans un puits situ en haut du gel Sous l impulsion
205. ette 3 l aide d une seringue de 1 ml et d un filtre millipore 0 22 um filtrer la solution de fa on st rile dans un tube eppendorf 1 5 ml st rile 4 Faire des aliquots dans des tubes eppendorf st riles de 0 5 ml Le volume des aliquots d pend du volume g n ralement utilis pour une s rie d amplification nombre d chantillons X volume ajout par chantillion 5 Congeler 20 C jusqu utilisation Pr paration des solutions d amorces 10 pmol ul 1 la r ception des amorces dissoudre ces derni res dans de l eau d ionis e st rile de fa on obtenir des solutions dont la concentration est de 100 pmol ul 2 l aide d une pipette P1000 pr lever 900 ul d eau d ionis e st rile et transf rer dans un tube eppendorf st rile de 1 5 ml 3 l aide d une pipette P200 pr lever 100 ul de la solution d amorce 100 pmoles ul et la transf rer dans le tube eppendorf st rile de 1 5 ml 4 Faire des aliquots dans des tubes eppendorf st riles de 0 5 ml le volume des aliquots a pr parer d pend de la quantit d amorces ajout e lors des r actions PCR et du nombre d chantillons analyser simultan ment 5 Ces tapes doivent tre r p t es pour chacune des amorces Pr paration d une solution TAE 50X 1 la balance peser 121g de TRIS dans une coupelle et transf rer dans un b cher de 500 ml 163 2 Sous une hotte chimique pr lever 28 55 ml d
206. ffect of PCP on soil bacterial diversity was measured using a new framework that made it possible to estimate soil bacterial diversity using PCR denaturing gradient gel electrophoresis DGGE technology Three diversity based indicators were compared to the assay of fluorescein diacetate FDA hydrolytic activity a simple measure well correlated with microbial biomass Results showed that the Shannon exp and Simpson 1 D indices were at least 25 times more sensitive to PCP than the FDA assay Furthermore it was demonstrated that the exp and 1 D concentration response curves where highly similar to the SSD corresponding to PCP in terrestrial ecosystems and that the diversity based 10 effect concentrations EC10 were comparable to PCP soil screening levels adopted by various regulatory agencies If these observations may be generalized to other contaminants this cost effective methodology has the potential to help fill many gaps in terrestrial ecotoxicological databases and more broadly in the understanding of the impact of xenobiotics or complex mixtures on terrestrial ecosystems 6 2 2 Introduction Aspecies sensitivity distribution SSD is a statistical distribution fitted from ecotoxicological data on a limited set of species used to infer the impact that a contaminant could have on an entire ecosystem Posthuma Traas and Suter II 2001 Policymakers use the framework to derive environmental quality criteria EQC For acceptable
207. files chiefly made it possible to accurately estimate the true diversity of communities For all the samples analyzed the estimated Shannon and Simpson s 1 D were accurate at 10 Richness estimations were less accurate ranging from 11 to 31 of the expected values The framework showed great potential to study the structure and diversity of soil bacterial communities 4 2 2 Introduction Considering the importance of diversity with regards to ecosystem functioning Hooper et al 2005 and its resistance and resilience to perturbations Girvan et al 2005 it is of great importance to be able to routinely assess and compare soil microbial community diversity across a large scale of management practices and treatments Indeed soil microbial communities are among the most diverse and abundant on Earth Roesch et 46 al 2007 and play a key role in terrestrial ecosystems van der Heijden et al 2008 Even if these communities can be studied in great depth using modern metagenomics Simon and Daniel 2011 researchers still require cost effective methods to reliably estimate the diversity of multiple samples Fingerprinting techniques such as denaturing gradient gel electrophoresis DGGE have been successfully used in many diversity studies Nakatsu 2007 For such complex communities interpreting the outcome of DGGE based diversity surveys even though they are of widespread use is not an easy task Initially developed as a
208. fois l ADN appartenant aux cellules mortes et viables Marschner Yang Lieberei and Crowley 2001 Afin d avoir suffisamment d ADN pour permettre son analyse il faut amplifier l extrait de fa on s lective Tel que pr sent la Figure 1 5 le g ne 16S bact rien se divise en plusieurs sections conserv es lignes minces et sections hypervariables V1 V9 Les sections conserv es correspondent des r gions probablement vitales au bon fonctionnement de la petite unit ribosomale ayant de fait subi tr s peu de mutations au fil du temps elles sont donc communes un grand nombre d esp ces appartenant un m me groupe phylog n tique Les r gions hypervariables changent d une esp ce l autre et peuvent donc servir de marqueur phylog n tique 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 bp V1 v2 V3 V4 V5 V6 V7 v8 v9 CONSERVED REGIONS unspecific applications VARIABLE REGIONS group or species specific applications Figure 1 5 Repr sentation sch matique des r gions conserv es et hypervariables V1 V9 du g ne 16S bact rien tir de http www alimetrics net en index php dna sequence analysis L amplification PCR se fait partir de deux amorces appel es forward et reverse sp cifiques aux organismes l tude La s quence de nucl otides composant chaque amorce est compl mentaire une r gion conserv e du g ne amplifier Le choix des amorces es
209. g les s ries de donn es 115 Le paragraphe pr c dent ainsi que le second manuscrit dressent un portrait peu reluisant des NGS Il est donc tr s important de nuancer ces propos Les plateformes NGS sont des outils excessivement puissants afin d tudier la diversit ainsi que la phylog nie microbienne des sols ou de tout autre cosyst me Le nombre la qualit et la longueur des s quences lues par ces appareils augmentent de fa on constante Les difficult s rencontr es dans le second manuscrit ont t partiellement caus es par la technologie Ion Torrent qui n est certainement pas aussi mature que d autres plateformes 1 e 454 pyrosequencing mais aussi parce que la longueur des amplicons d passait l g rement lorsque les amorces sont consid r es les capacit s th oriques de l appareil Il est probable que toutes les plateformes NGS auraient produit des r sultats semblables si elles avaient t utilis es la limite de leurs capacit s Lorsque la longueur des amplicons se situe en de des limites de l appareil utilis l effet du pourcentage GC ou de la longueur des s quences sur l abondance relative des OTU est probablement bien moindre que ce qui a t qualitativement observ dans le second manuscrit Le second manuscrit a permis de montrer que l utilisation du DGGE ou de l Ion Torrent taient en mesure de mener des conclusions cologiques semblables lorsque la diversit des communa
210. ge of DGGE based PSRs compared to true PSRs calculated from sequencing dataset clustering Since the main objective of this paper was to determine whether DGGE could be confidently used to assess the diversity of soil bacterial communities two ubiquitous diversity indices were calculated to characterize the RADs representing the communities dominance profiles These indices were calculated using PAST software Hammer Ryan and Harper 2001 2 AH Deviation percentage of DGGE based Shannon indices from corresponding expected values 3 AI D Deviation percentage of DGGE based Simpson s 1 D indices from corresponding expected values In order to further characterize the similarity between DGGE and clustering based dominance profiles the Euclidean distance Legendre and Legendre 1998 was calculated Unlike the two previous diversity indices this measure associated every DGGE peak to its principal underlying OTU To do so theoretical OTU migratory positions were associated with actual peak locations in the in silico profiles Since the measure was calculated using the truncated RADs produced by both approaches certain peaks did not match any OTU theoretical position and vice versa In these cases the relative abundance of the corresponding peak OTU was set at 096 53 4 Deucupean Calculated using Eq 2 where Apgar corresponds to peak relative intensities Aoru represents OTU relative abundances and n corresponds to RAD
211. gical diversity Indices tE 95 G 221 ME To Di 95 6 2 2 IMEFOGUCTION E 95 6 2 3 Material and methods 1 2 aee restes e eee axes eias ek yay neue unde a poke E ERR a EUER PEE E ERE ns 97 Sr EE CIO cs A 103 6 2 5 DISCUSSIOR 2 iie E REA Ere EE REPERI ARTE P IRI DS HS Casha DRE ENS AIRE NER GEGEN REN EN 109 6 2 6 Acknowledgements oer rr enn Eno nona Renee aS Sa FERRE ie E notes E SERA EARS ERR VERS REERM EQ aEKE ani 112 CHAPITRE 7 DISCUSSION GENERALE 0000se0sesssessssesseessscsssecsscesseeesecsssesseecsseessenssecsscesseeesees 113 CONCLUSION 55 258 EE a EEEE 119 Contributions scientifiques esee onore tono tueur are ooa besdcnonsecnscecsecccies ssndenonsespsceesevecseaseensueessneees 119 Contributions pratiqUes 5 1 io oo se paso oo ona o oo sua o oo oaa E Ra oo suas Sa oo ERE SE SERRE RERO SUY a EFIE SERERE EISE ARSAV RSSA 120 Perspectives et recommandations roe e epos oa nna b oo npn hh rana ka SEES u a RR SE ERR RR EE riidassa iai 120 BIBLIOGRAPHIE E M 123 ANNEXES c RM 144 XX LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 1 Nombre d esp ces d crit et estim pour les trois domaines biologiques Tir de Groombridge et Jenkins DOD Ves Re ENEE D D AUS UT CU Us us ah 4 Tableau 1 2 Liste non exhaustive des indices de dive
212. hat like sampling depth and sequencing errors these distortions depend on the GC content and length of the OTUs in the dataset and are therefore sample dependent Many aspects can be used to criticize the results produced by the Ion Torrent PGM However it must be acknowledged that the platform is newer than most of the other sequencing technologies and is still rapidly evolving Since the time that thesee datasets were sequenced a new emPCR template kit was released potentially enabling the amplification of 300 bases amplicons In a press release Life Technologies already announced that the read length capabilities of the PGM reached 400 bases with good quality scores throughout the sequences lengths Life Technologies 2012 52 5 3 Can DGGE and sequencing technologies yield similar ecological conclusions when studying complex soil bacterial communities While the accessibility and high throughput of DGGE is hardly debatable its ability to produce environmentally relevant diversity estimates for soil bacterial communities remains unclear Focusing only on the communities dominant phylotypes traditional fingerprinting techniques are known to produce diversity estimates that are not correlated to the diversity of the complete communities Blackwood et al 2007 Lalande Villemur et al 2013 In the authors opinion if only dominants are to be considered DGGE should not be used to study the diversity of soil bacterial communiti
213. he complete results are presented as supplementary material TableauA3 1 xlsx To synthesize the results the parameters that were found to be optimal for all the sample software pairs are presented in Tableau 4 1 Optimal parameters correspond to the ball size and similarity level that made it possible to meet predefined criteria APSR AH and A1 D x 10 over the widest range of cut off values Indicator stability for different cut off values was deemed to be a very important aspect to consider since chance alone can yield good results for a specific cut off percentage A more complete version of Tableau 4 1 which also presents the mean values of the indicators over the entire reported cut off range is presented as supplementary material Tableau A3 2 57 Tableau 4 1 For the Matlab based framework TotalLab Quant GelCompar II and BIO 1D optimal parameters obtained for all the samples Ball size and similarity level values were selected as those simultaneously generating APSR AH and A1 D values lower than 10 over the widest range of cut off values Software Optimal Closest Cut off Sample program ball size similarity level range FUGi00 98 0 4 3 0 BF100 98 0 4 3 0 x SAF 100 98 0 4 1 8 z z FUGo7 98 0 6 3 0 amp se BF97 97 1 2 3 0 E 2 SAFo7 98 0 6 3 0 S FUGo5 98 0 4 3 0 BFos 98 0 4 3 0 SAFo5 98 0 2 3 0 FUGi00 10 96 2 2 3 0 BF100 5 100 0
214. hen kept at 62 5 C for the remaining 25 cycles DGGE profiling was conducted using a D Code system Bio Rad Laboratories Inc Hercules CA USA The 8 w v acrylamide gel was cast into 16 x 16 cm plates with 1 mm thick spacers and composed of a 32 5 72 5 denaturing gradient 100 corresponding to 7 M urea and 10 v v deionized formamide Approximately 200 ng of amplified DNA was loaded onto the gel for each sample A blank PCR sample and 60 ng of PCR product amplified from F coli genomic DNA were also added in the first two wells of each gel Electrophoresis was run at 60 C and 60 V for 16 hours The gel was stained for 30 minutes in a fresh solution of SYBR Gold nucleic acid gel stain Invitrogen Ltd and photographed using a Quantum ST4 gel documentation system Vilber 101 Lourmat Marne La Vall e France The E coli PCR product was used as a marker to ensure that gel saturation did not occur Lalande Yergeau et al 2013 The diversity of soil bacterial communities was determined from the DGGE profiles using a framework that was previously described in detail Lalande Villemur et al 2013 and further validated using next generation sequencing technologies Lalande Yergeau et al 2013 From the DGGE bands relative intensities and the peak to signal ratio a parameter extracted from the DGGE profile the framework produced a rank abundance distribution RAD representative of the studied soil bacterial community Th
215. hness and to a lesser extent for exp it is imperative to normalize the datasets to the same size Interestingly dataset normalization at 5 000 reads was less efficient than the correction framework This can probably be explained by the nonlinear sample dependent relationship between depth and richness and exp Even though certain parameters led to slopes close to one this should be mostly seen as coincidence Indeed since no parameter yielded slopes approaching unity for 1 D at the same time it seems obvious that the RADs produced by both techniques were never similar in terms of dominance profiles and lengths at the same time 5 2 5 Discussion 5 2 5 1 Challenges associated with the use of DGGE as a quantitative tool Based on in silico DGGE profiles produced from sequencing datasets of soil bacterial communities it was demonstrated that the analytical methodology used in this paper unravelled DGGE banding patterns into relevant community dominance profiles Lalande Villemur et al 2013 Recognizing similarities in the sequencing based RADs of many different soil samples an elongation framework to accurately estimate diversity indices from DGGE profiles was developed Of course working on real soil samples is much more challenging and certain biases linked to PCR amplification Polz and Cavanaugh 1998 Suzuki and Giovannoni 1996 Takahiro 2003 or the co migration of DNA sequences on the DGGE profiles Schmalenberger and Tebbe 2
216. horesis In W Ray Ed Methods in Enzymology Vol Volume 155 pp 501 527 Academic Press Nacke H Th rmer A Wollherr A Will C Hodac L Herold N Daniel R 2011 Pyrosequencing Based Assessment of Bacterial Community Structure Along Different 134 Management Types in German Forest and Grassland Soils PLoS ONE 6 2 e17000 doi 10 1371 journal pone 0017000 Nakatsu CH 2007 Soil microbial community analysis using denaturing gradient gel electrophoresis Soil Science Society of America Journal 71 562 571 doi 10 2136 sssaj2006 0080 Nannipieri P Ascher J Ceccherini MT Landi L Pietramellara G and Renella G 2003 Microbial diversity and soil functions European Journal of Soil Science 54 4 655 670 doi 10 1046 j 1351 0754 2003 0556 x Narang R and Dunbar J 2004 Modeling Bacterial Species Abundance from Small Community Surveys Microbial Ecology 47 4 396 406 doi 10 1007 s00248 003 1026 7 NCBI 2012 The NCBI Sequence Read Archive SRA Retrieved August Ist 2012 Newman MC Ownby DR M zin LCA Powell MA Christensen TRL Lerberg SB Padma TV 2001 Species sensitivity distributions in ecological risk assessment Distributional assumptions alternate bootstrap techniques and estimation of adequate number of species In L Posthuma G W Suter II amp T P Traas Eds Species sensitivity distributions in ecotoxicology pp 119 132 Boca Raton Lewis Publisher
217. hylogeny and diversity small subunit ribosomal RNA sequence analysis and beyond Microbiological Research 166 2 99 110 doi 10 1016 j micres 2010 02 003 137 Renella G Mench M Gelsomino A Landi L and Nannipieri P 2005 Functional activity and microbial community structure in soils amended with bimetallic sludges Soil Biology and Biochemistry 37 8 1498 1506 Ritz C 2010 Toward a unified approach to dose response modeling in ecotoxicology Environmental Toxicology and Chemistry 29 1 220 229 doi 10 1002 etc 7 Ritz C and Streibig JC 2005 Bioassay Analysis using R Journal of Statistical Sofiware 12 5 dot citeulike article id 813991 Roesch LFW Fulthorpe RR Riva A Casella G Hadwin AKM Kent AD Triplett EW 2007 Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity The ISME Journal 1 283 290 Roessink I Belgers JDM Crum SJH van den Brink PJ and Brock TCM 2006 Impact of triphenyltin acetate in microcosms simulating floodplain lakes IL Comparison of species sensitivity distributions between laboratory and semi field Ecotoxicology 15 5 411 Roman YE De Schamphelaere KAC Nguyen LTH and Janssen CR 2007 Chronic toxicity of copper to five benthic invertebrates in laboratory formulated sediment Sensitivity comparison and preliminary risk assessment Science of the Total Environment 387 1 3 128 140 doi http dx doi org 10 1016 j scitotenv
218. i sur le support puits troits Couvrir pour prot ger de la lumi re et laisser g lifier pendant 30 min la temp rature ambiante Prendre un nombre X nombre d chantillons analyser de tubes eppendorf st riles de 0 5 ml A l aide d une pipette P2 y d poser 1 ul de tampon de migration colorant bleu accompagnant le EZ load ces tubes ajouter Sul de solution d ADN produit PCR analyser Retirer le peigne et le ruban adh sif du support et d poser le support dans la cuve lectrophor se remplie de solution TAE 1X Avec la pipette P20 charger les puits avec les solutions d ADN et les marqueurs S assurer de bien noter les correspondances puits chantillon Avec une pipette P20 injecter Sul de la solution contenant des standards massiques d ADN EZ load mass standard dans un puits Mettre le couvercle en place en prenant soin de bien brancher les p les au bon endroit rouge 167 avec rouge et noir avec noir 14 Couvrir pour prot ger de la lumi re et allumer l appareil 15 Mettre l appareil en mode mA appuyer sur la touche permettant de s lectionner le mode jusqu ce que la lumi re soit vis vis le mode mA 16 Appuyer sur le bouton STOP jusqu ce que le symbole dEq apparaisse 17 Mettre l appareil en mode V 18 S assurer que le voltage est de 100 l cran Si ce n est pas le cas ajuster avec les fl ches situ es droite de l cran 19 Mettre l
219. i gt 5000 amp amp i lt 6250 Matrice 1 Vecteurs 4 BDF elseif 1 gt 6500 amp amp i lt 7750 Matrice 1 Vecteurs 5 BDF elseif i gt 8000 amp amp i lt 9250 Matrice i Vecteurs 6 BDF elseif 1 gt 9500 amp amp i lt 10750 Matrice 1 Vecteurs 7 BDF elseif i gt 11000 amp amp i lt 12250 Matrice i Vecteurs 8 BDF end end Matrice round Matrice Matrice Matrice 500 Resultats 1250 Vecteurs BDF 500 Image uintl16 Matrice imwrite Image Image2 tif tif Compression none 251 Nom du fichier FastaTrim m Description Cet algorithme permet d aller lire un fichier fasta et de trier les s quences enlever les amorce trier dans les bons chantillons a l aide des s quences MID appliquer un fliltre de qualit Auteur Jonathan Lalande clear all close all clc Structure fastaread Jonathan fasta a 1 Quality fastaread Jonathan qual b 1 Ecl CTAAGGTAAC Ec2 TAAGGAGAAC Ec3 AAGAGGATTC Ec4 TACCAAGATC Ec5 CAGAAGGAAC Ec6 CTGCAAGTTC Ec7 TTCGTGATTC Ec8 TTCCGATAAC Cl TE C2 c3 c4 c5 C6 Cr i C8 El 1 E2 1 E3 1 E4 1 ES 1 E6 1 E7 E8 1 NumMin 8 Primerr CCAGCAGCCGCGGTAAT 252 Primerf CCTACGGGAGGCAGCAG JoATTACCGCGGCTGCTGG Nombre size Structure 1 QualMin 2
220. ian Cary Bio 100 spectrophotometer Agilent Technologies Inc Santa Clara CA at a 102 wavelength of 490 nm For all samples the measurements were taken in triplicate Blank samples were also prepared and their filtrate absorbance was subtracted from the samples activity 6 2 3 4 Concentration response and SSD modelling C R modeling was undertaken using the extension package drc Ritz and Streibig 2005 developed for the open source statistical software R R Developement Core Team 2013 As recommended by Ritz 2010 no data preprocessing or normalization was done Curve fitting was carried out using the Weibull type 1 and 2 log logistic and log normal models with two parameters For each dataset the model that produced the lowest residual standard error was used to draw the C R curve For the SSD modeling ecotoxicological data on the toxicity of PCP to terrestrial organisms were retrieved from the ECOTOX database U S Environmental Protection Agency 2013 and the TerraSys risk assessment software Sanexen Services Environnementaux Inc 2002 Considering the arguments of Warne and van Dam 2008 the no or low observed effect concentrations NOECs and LOECs were not used In light of availability issues the selected data were restricted to the effective or lethal concentrations to 50 of the tested populations ECso and LCs0 hereafter the term ECso will include both type of indicators To include as many data as possib
221. icology pp 275 282 Boca Raton Lewis Publisher Semenzin E Temminghoff EJM and Marcomini A 2007 Improving ecological risk assessment by including bioavailability into species sensitivity distributions An example for plants to nickel in soils Environmental Pollution 148 642 647 Sheffield VC Cox DR Lerman LS and Myers RM 1989 Attachment of a 40 base pair G C rich sequence GC clamp to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single base changes Proceedings of the National Academy of Sciences 86 1 232 236 Shokralla S Spall JL Gibson JF and Hajibabaei M 2012 Next generation sequencing technologies for environmental DNA research Molecular Ecology 21 8 1794 1805 doi 10 1111 1365 294X 2012 05538 x Sijm DTHM van Wezel AP and Crommentuijn T 2001 Environmental risk limits in the Netherlands In L Posthuma G W Suter II amp T P Traas Eds Species sensitivity distributions in ecotoxicology pp 221 253 Boca Raton Lewis Publisher Simon C and Daniel R 2011 Metagenomic analyses Past and future trends Applied and Environmental Microbiology 77 4 1153 1161 doi 10 1128 aem 02345 10 139 Solomon KR Giddings JM and Maund SJ 2001 Probabilistic risk assessment of cotton pyrethroids I Distributional analyses of laboratory aquatic toxicity data Environmental Toxicology and Chemistry 20 3 652 659 Solomon KR
222. ient d naturant peut permettre la production d un indicateur cotoxique quantitativement repr sentatif de l effet du pentachloroph nol sur la diversit taxonomique des bact ries du sol L objectif principal de cette th se est donc de d velopper une approche analytique permettant de quantifier la perte de diversit bact rienne caus e par l ajout de PCP des chantillons de sol partir de la technique du DGGE Puisque l effet du PCP est d termin en comparant la diversit 35 d un chantillon propre celle d un chantillon contamin cette approche analytique devra tre en mesure de produire des estim s de diversit corr l s la diversit des communaut s tudi es Les objectifs sp cifiques de ce projet sont l 3 Proposer une approche analytique permettant d extraire des profils DGGE de l information quantitative sur la dominance et la richesse des communaut s tudi es D velopper partir de profils DGGE in silico un mod le empirique permettant de produire des estim s de diversit corr l s la diversit des communaut s tudi es partir de l information extraite des profils DGGE Valider ce mod le sur des chantillons r els en comparant la diversit estim e partir du DGGE celle produite par une plateforme NGS Quantifier l effet du PCP sur la diversit bact rienne des sols et comparer cette r ponse celle bas e sur la mesure du potentiel d
223. if strempi Sequence j G G G 1 elseif strempi Sequence j C 1 C C l end end GC G C A T G C Longueur length Sequence Intl 0 Int2 0 Int3 0 271 Int4 0 Int5 0 Int6 0 Int7 0 Int8 0 Int9 0 Int10 0 Int11 0 Int12 0 Int13 0 Int14 0 Int15 0 Int16 0 Int17 0 Int18 0 Int19 0 Int20 0 for xx 1 Longueur if Qualite xx lt 1 Intl Int1 1 elseif Qualite xx 2 Int2 Int2 1 elseif Qualite xx 3 Int3 Int3 1 elseif Qualite xx Int4 Int4 1 elseif Qualite xx Int5 Int5 1 elseif Qualite xx Int6 Int6 1 elseif Qualite xx Int7 Int7 1 elseif Qualite xx 8 Int8 Int8 1 elseif Qualite xx Int9 Int9 1 elseif Qualite xx Int10 Int10 1 elseif Qualite xx Int1 17 Int117 1 elseif Qualite xx 12 Int12 Int12 1 elseif Qualite xx 12 Int13 Int13 1 elseif Qualite xx Int14 Int144 elseif Qualite xx Int15 Int15 1 elseif Qualite xx 16 Int16 Intl6 1 elseif Qualite xx 17 Int17 Int17 1 elseif Qualite xx 18 Int18 n A elseif Qualite xx Int19 De else Int20 Int20 1 end end E m for yy 1 Longueur Miscall Miscall 10 Qualite yy 10 end Qmoy mean Qualite 272 C8 i Debut Longueur GC Qmoy Int1 Int2 Int3 Int4 Int5 Int6 Int7 Int8 Int9 Int10 Int11 Int12 Int13 Int14 Int15 Int16 Int17 Int18 Int19 In
224. imageur Quantum ST4 et des logiciels de capture et d analyse d image Quantum Capt et Bio 1D Protocole PE71E Contamination artificielle de sols au pentachloroph nol PCP 196 Protocole PE71F Quantification du pentachloroph nol PCP par dosage par chromatographie en phase gazeuse coupl e un d tecteur ionisation de flamme 202 Protocole PE71G Mesure du potentiel d activit hydrolytique de la FDA dans un sol 211 145 4 CIRAIG Centre Interuniversitaire de R f rence sur r l Analyse l Interpr tation et la Gestion du cycle de dada aaia e et ies PROTOCOLE EXPERIMENTAL Universite dh WER de Montr al wonTeeat NILE Protocole PE71A Nombre de pages 15 Version 2 Date 12 janvier 2010 Auteur s Lucie Jean Approuv par Signatures Date Jonathan Lalande Louise Desch nes Titre Extraction de l ADN total d un chantillon de sol selon la m thode CTAB DTT Mots cl s Desoxyribonuclease acide ADN sol extraction d ADN CTAB DTT OBJECTIF La m thode d extraction d ADN vise extraire l ADN d un chantillon de sol et purifier afin d liminer toutes composantes organiques pouvant nuire la quantification de l ADN des micro organismes se trouvant dans le sol l tude Ce protocole vise donc extraire l ADN d un sol selon la m thode de lyse cellulair
225. inant Boutin and Rogers 2000 von der Ohe and Liess 2004 il est pr f rable d inclure dans ces s ries de l information sur une large gamme d organismes Par contre dans plusieurs situations les donn es disponibles repr sentent de fa on disproportionnelle quelques esp ces cibl es par certains organismes r glementaires Frampton J nsch Scott Fordsmand R mbke and van den Brink 2006 Si ces esp ces sont particuli rement sensibles ou insensibles un contaminant donn la courbe SSD peut ne pas tre repr sentative de l cosyst me mod lis La question du nombre de donn es requises afin d estimer correctement les param tres d une courbe SSD est galement un l ment important consid rer Tel que rapport par Newman et al 2001 bien que les agences r glementaires recommandent l incorporation de 4 8 esp ces dans le d veloppement d EQC il apparait qu entre 40 et 60 donn es seraient n cessaires pour que la pr diction soit juste Cela d passe largement le nombre de donn es disponibles dans la litt rature pour essentiellement tous les contaminants Une valeur de 10 semble repr senter un bon compromis entre disponibilit et repr sentativit Wheeler Grist et al 2002 L approche SSD est donc utile afin de prot ger les cosyst mes mais en pratique elle pr sente quelques difficult s Les conditions dans lesquelles les tests de laboratoire sont r alis s ne sont pas repr sentatives des
226. ing all the Sambpl6s sise mr ain eee nie Eo etre estia ie eset in s eo ee ios to bo io fl su dns ERES EXER E 59 Tableau 4 3 Deviation of DGGE based diversity estimates from the indices calculated using the untruncated true RADs DGGE based indices were calculated solely from the quantified peaks with a cut off of 1 096 or using the elongated RADs Results are presented as the average minimum and maximum of all nine samples as well as the slope and coefficient of determination generated by linear regression analysis 62 Tableau 5 1 Physico chemical properties of the soils used in the study 71 Tableau 5 2 For all the samples number of reads matching both primers before and after processing The deletion percentage corresponding to the eight samples are also presented seeesssssssseeeeenenenennns 81 Tableau 5 3 Potential influence of sequencing errors on the indices calculated from sequencing datasets The values correspond to the relative index variation in when the pseudo single linkage clustering algorithm Huse et al 2010 is applied using a dissimilarity of 2 or 4 bases instead of 3 84 Tableau 5 4 Slopes and coefficients of correlation of the linear regressions conducted between lon Torrent sequencing and DGGE based diversity estimates All the coefficients were determined by forcing the intercept of the regression line to be the origin For the lon Torrent dat
227. ion behavior of PCP on soil organic matter and clay minerals Chemosphere 64 6 972 983 doi 10 1016 j chemosphere 2006 01 017 Puglisi E Vernile P Bari G Spagnuolo M Trevisan M Lillo E and Ruggiero P 2009 Bioaccessibility bioavailability and ecotoxicity of pentachlorophenol in compost amended soils Chemosphere 77 1 80 86 doi 10 1016 j chemosphere 2009 05 022 Qiu X Wu L Huang H McDonel PE Palumbo AV Tiedje JM and Zhou J 2001 Evaluation of PCR Generated Chimeras Mutations and Heteroduplexes with 16S rRNA Gene Based Cloning Applied and Environmental Microbiology 67 2 880 887 doi 10 1128 aem 67 2 880 887 2001 Quail M Smith M Coupland P Otto T Harris S Connor T Gu Y 2012 A tale of three next generation sequencing platforms comparison of Ion Torrent Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers BMC Genomics 13 1 341 Quince C Lanzen A Davenport R and Turnbaugh P 2011 Removing Noise From Pyrosequenced Amplicons BMC Bioinformatics 12 1 38 R Developement Core Team 2013 R A language and environment for statistical computing Vienna Austria R Foundation for Statistical Computing Rahman MH Okubo A Sugiyama S and Mayland HF 2008 Physical chemical and microbiological properties of an Andisol as related to land use and tillage practice Soil and Tillage Research 101 1 2 10 19 Rajendhran J and Gunasekaran P 2011 Microbial p
228. ion de chim res qui peuvent elles aussi tre amplifi es lors des cycles subs quents Takahiro 2003 Finalement la qualit des amorces utilis es est galement un aspect consid rer La r action de synth se de ces mol cules n est pas parfaite il a t rapport que l efficacit de r action est de 99 pour chaque nucl otide ajout Life Technologies 2013 Pour une amorce d une longueur de 17 nucl otides cela signifie que plus de 15 des amorces seront erron es trop courtes ou encore contenant une substitution de base Les amorces erron es ayant la capacit de s apparier sur les brins d ADN peuvent induire une variation dans la composition ou la longueur des s quences amplifi es Afin de r duire ces distorsions les conditions d amplification PCR doivent tre soigneusement optimis es Qiu et al 2001 Takahiro 2003 Tout d abord le choix d une polym rase haute fid lit permet de r duire l occurrence des erreurs d amplification Ensuite l utilisation d une temp rature d appariement lev e permet d augmenter la sp cificit de l appariement et de r duire la formation de produits non d sir s La sp cificit de l amplification peut tre augment e en r alisant un touchdown PCR c est dire de commencer l amplification avec une temp rature d appariement lev e et de r duire cette derni re au fil des cycles Korbie and Mattick 2008 L occurrence des chim res
229. ion des gels DGGE auront une influence sur les r sultats produits Afin de tracer un profil de bruit de fond aussi pr cis que possible il est primordial que le gradient d naturant choisi afin de produire le gel permette l inclusion de toutes les bandes DGGE La m me remarque s applique lorsque le gel est photographi le zoom choisi doit inclure toutes les bandes Une attention particuli re doit galement tre port e lorsque le gel DGGE est pr par afin d obtenir les profils les plus droits possible absence de smilings et autres imperfections Bien qu elles puissent tre partiellement corrig es ces imperfections modifient la forme des pics DGGE et compliquent l analyse des profils Bien entendu ces l ments ont tous la capacit de modifier la hausse ou la baisse les estim s de diversit produits par la m thode d longation Par contre lorsque cette derni re est utilis e des fins comparatives et que les chantillons compar s sont inject s sur le m me gel DGGE il est probable que l influence de ces l ments sera similaire pour chaque chantillon Aussi les observations faites dans le cadre du premier manuscrit montrent que les patrons de dominance extraits des profils DGGE sont semblables un groupement des s quences d ADN une similitude de 98 Dans les deux premiers manuscrits la longueur des s quences d ADN analys es a peu vari Effectivement les s ries de donn es utilis es
230. ion du g ne 16S de deux organismes est compar e base base et si la similitude entre les deux s quences est sup rieure ou gale 9796 il est admis que les deux organismes appartiennent la m me esp ce Stackebrandt and Goebel 1994 Cette r gle n est pas universelle la r solution du g ne 16S n est pas invariablement suffisante afin de diviser les procaryotes en esp ces Rossell Mora and Amann 2001 Par contre elle offre un cadre utile fond sur des bases scientifiques permettant le classement des procaryotes en esp ces Il est important de mentionner que des marqueurs similaires existent pour les champignons dans les sols 23 1 4 2 Extraction et amplification de l ADN contenu dans le sol Les approches mol culaires sont donc bas es sur l extraction et l amplification en cha ne par la polym rase Polymerase Chain Reaction ou PCR de l ADN contenu dans un sol Oros Sichler Costa Heuer and Smalla 2007 Les protocoles d extraction permettent de lyser les cellules afin de r cup rer et purifier leur mat riel g n tique Cette proc dure peut g n rer certaines distorsions lyse plus efficace de certains organismes Feinstein Sul and Blackwood 2009 ou adsorption de l ADN sur certaines particules de sol Yankson and Steck 2009 et doit tre optimis e en fonction du type de sol l tude De plus puisque l ADN est une mol cule pouvant persister dans le sol la proc dure d extraction r cup rera la
231. ions dans les estim s de diversit produits qui risquent d augmenter avec le niveau de contamination Dans tous les cas il serait important de proposer une approche m thodologique permettant de cibler les microorganismes vivants e G n ralisation des observations faites sur le pentachloroph nol sur d autres contaminants Les indicateurs cotoxicologiques bas s sur les indices de diversit produits dans cette th se se sont av r s sensibles au pentachloroph nol et quantitativement similaires aux crit res de qualit environnementale en vigueur pour ce contaminant dans plusieurs pays du monde La recommandation principale devant ressortir de ce travail de recherche est d tudier l effet de plus de contaminants sur la diversit bact rienne des sols Si les observations faites pour le pentachloroph nol sont g n ralisables d autres contaminants ou encore certaines classes de substances l approche propos e dans ce projet pourrait devenir un outil excessivement puissant afin d tudier l effet des contaminants sur les cosyst mes terrestres e Augmentation de la disponibilit des donn es cotoxiques terrestres Bien que le pr sent projet se soit concentr sur la g n ration de nouvelles donn es cotoxiques il a t observ que plusieurs donn es actuellement disponibles ne sont pas utilisables Il serait donc int ressant de d velopper des mod les conceptuels repr sentatifs de certains cosyst mes
232. is RAD contains information on the abundance of the different bacterial species that make up the community see the initial publication for a complete description of the framework As recommended by Jost 2006 bacterial community diversity was quantified using indices corresponding to an effective number of species Shannon expH and Simpson s 1 D and community richness Community richness corresponded to the length of the RADs produced by the framework mentioned above Using the abundance values of the RADs the Shannon and Simpson indices were calculated using Eq 1 and Eq 2 respectively expl e Xi 1 Pi ln pi 1 TE M D Xii fa Where pi corresponds to the relative abundance of the i species and S corresponds to community richness 6 2 3 3 Assay for FDA hydrolytic activity The assay for FDA hydrolytic activity was carried out as described by Green et al 2006 with minor modifications Briefly 1 0 g of soil 50 ml of 60 mM sodium phosphate buffer pH 7 6 and 0 50 mL of 4 9 mM FDA lipase Sigma Aldrich substrate solution were mixed in 125 mL Erlenmeyer flasks and placed in an incubator for 2 h at 37 C After the incubation period 2 0 mL of acetone was added to terminate the FDA hydrolysis Then using a 5 mL syringe approximately 2 0 mL of the aqueous phase was filtered through a 0 45 um PVDF membrane EMD Millipore Corporation Billerica MA directly into a colorimeter tube Filtrate absorbance was measured on a Var
233. it mesur s pour les diff rents chantillons de sol il a t possible de remarquer que les chantillons de sol les plus contamin s n taient pas les moins diversifi s Cette observation peut s expliquer de deux fa ons diff rentes Le pentachloroph nol a pu avoir un effet toxique sur toutes les esp ces xi bact riennes emp chant ainsi l apparition de bandes DGGE brillantes sur les profils et permettant par le fait m me certaines esp ces d tre suffisamment abondante proportionnellement afin de produire une bande visible sur le gel Alternativement ou parall lement il est possible que le temps d incubation de 28 jours n ait pas permis la d gradation de l ADN des bact ries tu es par l ajout de pentachloroph nol Malgr ces observations les indices de diversit se sont av r s tre beaucoup plus sensibles plus de 25 fois au pentachloroph nol que les mesures d activit hydrolytique de la fluoresc ine diac tate De plus les courbes concentration r ponse trac es l aide des mesures de diversit se sont av r es tr s similaires la courbe de sensibilit des esp ces repr sentative du pentachloroph nol Ainsi cette th se a permis le d veloppement d une m thodologie permettant de comparer la diversit de communaut s bact riennes de diff rents sols l aide du DGGE une approche tr s r pandue qui n avait pr alablement pas cette capacit De plus il a t possible de montrer que les indice
234. ity and productivity in terrestrial ecosystems Ecology Letters 11 3 296 310 doi 10 1111 j 1461 0248 2007 01139 x van Elsas JD Jansson JK and Trevors JT 2007 Modern Soil Microbiology second edition Boca Raton CRC Press van Straalen NM and Dennenman CAJ 1989 Ecotoxicological evaluation of soil quality criteria Ecotoxicology and Environmental Safety 18 241 251 van Straalen NM and van Leeuwen CJ 2001 European history of species sensitivity distributions In L Posthuma G W Suter II amp T P Traas Eds Species sensitivity distributions in ecotoxicology pp 19 34 Boca Raton Lewis Publisher Venturino A Montagna CM and de D Angelo AMP 2007 Risk assessment of Magnacide H herbicide at Rio Colorado irrigation channels Argentina Tier 3 Studies on native species Environmental Toxicology and Chemistry 26 1 177 Vig K Megharaj M Sethunathan N and Naidu R 2003 Bioavailability and toxicity of cadmium to microorganisms and their activities in soil a review Advances in Environmental Research 8 1 121 135 doi http dx doi org 10 1016 S1093 0191 02 00135 1 von der Ohe PC and Liess M 2004 Relative sensitivity distribution of aquatic invertebrates to organic and metal compounds Environmental Toxicology and Chemistry 23 1 150 156 Warne MSJ and van Dam R 2008 NOEC and LOEC Data Should No Longer Be Generated or Used Australasian Journal of Ecotoxicology
235. ity estimates Environmental Microbiology 12 1 118 123 doi 10 1111 1462 2920 2009 0205 1 x Kurata S Kanagawa T Magariyama Y Takatsu K Yamada K Yokomaku T and Kamagata Y 2004 Reevaluation and reduction of a PCR bias caused by reannealing of templates Applied and Environmental Microbiology 70 7545 7549 Lalande J Villemur R and Deschenes L 2013 A New Framework to Accurately Quantify Soil Bacterial Community Diversity from DGGE Microbial Ecology Retrieved from doi 10 1007 s00248 013 0230 3 Lalande J Yergeau E Greer CW Villemur R and Deschenes L 2013 Can DGGE and Ion Torrent sequencing yield similar quantitative conclusions when comparing the diversity of soil bacterial communities FEMS Microbiology Ecology submitted Larsen HF and Hauschild M 2007 GM Troph A Low Data Demand Ecotoxicity Effect Indicator for Use in LCIA International Journal of LCA 12 2 79 91 Lazzaro A Schulin R Widmer F and Frey B 2006 Changes in lead availability affect bacterial community structure but not basal respiration in a microcosm study with forest soils Science of the Total Environment 371 1 3 110 124 Legendre P and Legendre L 1998 Numerical Ecology Second English Edition Elsevier 131 Le tan D Le tan M Chapelle JA and Lamar RT 1996 Biological potential of fungal inocula for bioaugmentation of contaminated soils Journal of Industrial Microbiology 16 5 28
236. l est possible d injecter dans un puit du produit PCR injecter une quantit permettant d viter la saturation du gel 60 ng avec les conditions d crites dans ce protocole amplifi partir d une souche pure Ajouter un volume gal au volume contenant le mat riel g n tique de tampon de chargement 100 glyc rol colorant xyl ne cyanol et bleu bromoph nol Lorsque le gel et le tampon sont quilibr s 10 11 12 13 teindre le contr leur de temp rature et le retirer Charger les puits des chantillons l aide d embouts micro pipettes de 200ul allong s partir du c t gauche du gel Ne pas utiliser les 2 premiers puits de chacune des extr mit s du gel Replacer le contr leur Brancher les fils sur le bloc d alimentation en prenant soin de bien brancher les p les au bon endroit rouge avec rouge et noir avec noir Allumer le bloc d alimentation Mettre l appareil en mode mA appuyer sur la touche permettant de s lectionner le mode jusqu ce que la lumi re soit vis vis le mode mA Appuyer sur le bouton STOP jusqu ce que le symbole dEq apparaisse Mettre l appareil en mode V S assurer que le voltage est de 60V l cran Si ce n est pas le cas ajuster avec les fl ches situ es droite de l cran Mettre l alimentation en marche appuyer sur RUN Laisser migrer pendant 16 heures Coloration du gel QV Un A N teindre l appareil DGGE et le bloc d alimenta
237. la micropipette P 1000 avec 400 ul de tampon TE Travailler sous la hotte chimique pour les tapes qui suivent l 8 9 Ajouter 400 ul de la solution Phenol Chloroform isoamyl alcohol 25 24 1 et vortexer quelques secondes Centrifuger 16000 g pendant 5 min 4 C R colter 350 ul de la phase aqueuse phase sup rieure l aide d une pipette automatique P1000 et le transf rer dans un tube microcentrifuge de 2 ml pr alablement autoclav proc der d licatement afin de ne r colter que la phase aqueuse Ajouter 350 ul de la solution Chloroform isoamyl alcohol 24 1 ratio de 1 1 et inverser doucement quelques secondes Centrifuger 16000 g pendant 1 min 4 C R p ter les tapes 21 22 23 et de nouveau 21 en r coltant cette fois 325 ul de la phase aqueuse l aide d une pipette automatique P20 ajouter 32 5 ul de la solution d ac tate de sodium pH5 2 3M 1 10 volume l aide d une pipette automatique P1000 ajouter 715 ul d thanol 100 2 volumes Incuber le tube a 20 C pendant 15 min 10 Centrifuger a 16 000 g pendant 10 min a 4 C 11 Retirer le surnageant en inversant le tube le culot contient l ADN 155 12 Avec une micropipette P1000 ajouter 500ul d thanol 70 dans chacun des chantillons d ADN 13 Centrifuger les tubes 21000g pendant 2 minutes 4 C 14 Disposer du surnageant dans un petit b cher 15 Ass cher compl teme
238. lant sur deux ordres de grandeur dans le cas d un sol contamin au 2 4 D Macur Wheeler Burr and Inskeep 2007 peut masquer la disparition d autres esp ces ne pouvant pas d grader le contaminant Une autre limitation li e aux indicateurs fonctionnels provient du fait que ces derniers ne ciblent souvent pas les microorganismes directement Ils ciblent un processus dont l origine mane principalement de l activit des microorganismes Des facteurs autres que la toxicit des contaminants envers ces organismes peuvent donc influencer ces indicateurs Par exemple une tude r alis e sur l effet des hydrocarbures aromatiques polycycliques HAP sur l activit de quatre enzymes dans le sol a montr qu un contaminant peut influencer l activit enzymatique de deux fa ons diff rentes Ainsi l aide d un index de stabilit relative des sols Relative Soil 22 Stability Index ou RSSI Becaert Samson and Deschenes 2006 bas sur l activit enzymatique il a t possible de voir que les contaminants ont un effet la fois sur la communaut microbienne produisant les enzymes et sur les enzymes eux m mes inhibition r sultats personnels non publi s Il est donc tr s difficile d tablir l importance quantitative de chaque processus ce qui est probl matique lorsque l objectif du test est de d river une mesure de toxicit sp cifique aux communaut s microbiennes 1 4 2 Approches mol culaires 1 4 2 1 La phylog ni
239. le the EC so corresponding to all endpoints emergence growth reproduction mortality etc were included in the dataset The geometric mean was calculated if more than one data was available for a given test species Considering that the different taxa represented in the dataset were unequally represented dominated by worms and terrestrial plants the SSD curve was drawn using the geometric mean of the ecotoxicological data available for the different taxonomic groups Larsen and Hauschild 2007 The dataset was then sorted by ascending geometric mean value and a plotting position was assigned to each value using the Hazen formulae Eq 3 Fuglem Parr and Jordaan 2013 The plotting position associates each ecotoxicological indicator with a cumulative probability value 96 on the y axis Since the dataset is considered to be representative of the entire terrestrial biological community these cumulative probabilities can be seen as the cumulative percentage of species affected above their ECso when exposed at a given concentration of PCP value on the x axis This measure of risk is termed the potentially affected fraction of species PAF p 100 3 103 Where p corresponds to the plotting position in assigned to each ecotoxicological data corresponds to the data rank when the dataset is sorted in ascending order i 1 2 N and N corresponds to the size of the dataset number of ecotoxicological data Data fit
240. le was around 9500 bee Ries dee ttd btt faa tt ttum att d amettetur ee 55 Figure 4 2 Image of the gel synthesized from the datasets published by Nacke et al 2011 56 Figure 4 3 Indicator values obtained using the parameters presented in Tableau 4 2 reported as the mean of all nine samples Error bars correspond to the maximum and minimum values All diversity measures were calculated using truncated RADS ccccccccssccccesseeeseseeesssseeeceeeeceeeeeeeeeeeeseeeseeeeeeeeeeeeseseeeeeceeeeeeseeeeseeeessesseaaeaaanes 59 Figure 4 4 PSRs extracted from the in silico DGGE profiles using the Matlab based framework compared to true community richness at 98 similarity level seen 61 Figure 5 1 DGGE profiles of the 8 samples analyzed The DNA loaded on the gel was extracted and amplified from a sandy loam LM or sandy soil S Samples were either clean cln or contaminated with pentachlorophenol PCP at concentrations ranging from 300 to 3 000 mg kg dry wt soil Left 400 ng of PCR product per well Right 200 ng of PCR product per well iii 77 Figure 5 2 Diversity indices estimated using DGGE or lon Torrent sequencing The error bars correspond to the 9596 confidence intervals that were calculated from the DGGE gel triplicates DGGE diversity estimates were calculated from the RADs elongation framework presented in Lalande et al 2013 lon Torrent sequencing datasets were clustered at the
241. lengths DzucLIDEAN 2 i 1 AincGE Aioruy 2 4 2 3 4 Using PSRs to improve DGGE based diversity estimates Using PSR values extracted from the profiles an empirical framework to estimate true community diversity from DGGE was developed Since DGGE and pyrosequencing based dominance profiles were very similar when clustering the datasets at the 98 level the framework was developed to estimate true community diversity at that particular similarity level First of all RADs produced by the Matlab based framework were truncated using the optimal cut off value 1 0 After truncation RADs were normalized sum 1 multiplied by corresponding PSRs and further multiplied by 35000 This last step aimed to make it possible to work in terms of absolute rather than relative abundance The value 35000 was chosen because it was close to the number of reads per sample in the pyrosequencing datasets used in this publication Distributions were then elongated to add the species that were not accounted for in the peak quantification process This elongation framework was designed and calibrated using only the true community RADs The method was then applied without further modification over the DGGE results Although the lognormal power law and geometric distributions are the most commonly used abundance models to describe soil bacterial communities they were unable to fit the true RADs correctly The power law distribution PLD Eq 3 provid
242. les esp ces y participent plusieurs auteurs ont not que certains de ces indicateurs avaient le potentiel d augmenter suite une contamination En fractionnant les communaut s microbiennes en plusieurs sous parties les esp ces les indices de diversit qui consid rent la fois le nombre d esp ces pr sentes et l abondance relative de chaque esp ce pourraient tre beaucoup plus sensibles une contamination que les indicateurs fonctionnels Par contre il est techniquement difficile d estimer pr cis ment la diversit des communaut s vii microbiennes des sols D abord les m thodes mol culaires utilis es afin d tudier la diversit microbienne des sols ne permet pas de cibler simultan ment tous les microorganismes du sol Des trois sous groupes composant les communaut s microbiennes des sols bact ries arch es et champignons les bact ries sont les plus diversifi es et sont le plus souvent cibl es Ensuite il a t montr que les populaires techniques de profilage qui ne donnent de l information que sur les esp ces les plus abondantes sont incapables de produire des estim s de diversit corr l s la diversit bact rienne r elle des sols Les nouvelles technologies de s quen age d ADN r cemment arriv es sur le march ont le potentiel de permettre l tude quantitative de la diversit bact rienne des sols Par contre plusieurs auteurs ont montr que certaines difficult s techniques pourraient g
243. ll DGGE 1 D values were higher than their sequencing counterparts Among the explanations related to the sequencing datasets these types of results were to be expected if the brightest peaks on the DGGE profiles are hampered from reaching their full intensity It was hypothesized that DGGE gels could be locally saturated by DNA or dye and that the peak intensities did not vary linearly according to the amount of DNA Figure 5 3 presents the relative peak intensity when loading different amounts of PCR product originating from E coli An almost linear relationship was found when loading into a well less than 75 ng R 0 89 Beyond 75 ng for a single band the peak intensity begins to saturate 100 80 60 2 4096 20 Relative peak intensity 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Amount of DNA injected ng Figure 5 3 Intensity of the DGGE band produced by loading different amounts of a PCR product amplified from the genomic DNA of Escherichia coli All PCR products came from the same aliquot Resulting intensities calculated as the area under the peaks are reported as a fraction of the intensity corresponding to a loading of 400 ng For the DGGE based 200 ng well diversity indices presented as supplementary material Tableau A4 2 loading lower amounts of PCR product yielded lower 1 D values for all samples except S3000 This exception can be explained by the fact that different DNA extracts were used to produce the
244. lon le cas Pour ce faire cliquer sur Smiling correction en haut droite d finir une ligne de d but et de fin et cliquer sur Correct the image Si les r sultats sont insatisfaisants il est possible de r initialiser et reprendre la correction en red finissant de nouvelles lignes de d but et de fin Cette op ration permet de mieux aligner les bandes des diff rents couloirs mais m ne souvent une perte de qualit de l image tenu principal E x Comment d finir la ligne de Smiling 1 D finition de la ligne d origine 1 Cliquer sur le bouton D finition de la ligne d origine Cliquer alors sur l image pour d finir les points de la ligne d origine du Smiling 1 Modification des pistes 2 D finition de la ligne de fin 2 Cliquer sur le bouton D finition de la ligne de Fin Annuler la correction Fermer Cliquer alors sur l image pour d finir la ligne de Fin de Smiling 3 Corriger l image en cliquat sur le bouton 7 Aide 3 Correction de limage Correction de l image 9 ed Enregistrer sous Figure A1 10 Correction des smilings avec Bio 1D moins que les couloirs de migration soient parfaitement verticaux cliquer sur Lane modification en haut droite Il sera possible de d limiter les couloirs de migration m me si ceux ci sont l g rement croches Figure A1 11 Il est aussi possible de changer la largeur des diff rents couloirs pour diff re
245. ls DGGE complexes 120 e De montrer qu il est possible d extraire des profils DGGE de l information quant la richesse et l quit des communaut s tudi es et que cette information peut tre utilis e afin d estimer la diversit bact rienne partir de la technique du DGGE e De montrer que l injection d une trop grande quantit d ADN dans les profils DGGE risquait de saturer le gel localement e De montrer que l Ion Torrent risquait de g n rer des distorsions intra chantillon dans l abondance relative des OTU e De montrer la sensibilit d un indicateur bas sur la diversit bact rienne face au PCP e De faire un rapprochement entre la sensibilit des bact ries expos es au PCP et celle des communaut s biotiques macroscopiques terrestres Contributions pratiques Diff rents outils ont galement t d velopp s e Un cadre th orique permettant d extraire des profils DGGE de information quantitativement repr sentative des communaut s tudi es e Une m thode permettant d estimer la diversit bact rienne partir du DGGE e Des outils informatiques permettant l analyse des gels DGGE l aide du logiciel Matlab annexe 2 e Des donn es cotoxiques repr sentatives de l effet du PCP sur la diversit bact rienne des sols Perspectives et recommandations La m thode d longation des RAD DGGE pr sent e dans cette th se a permis de produire des courbes
246. lus importants dans ma vie m me s ils en doutent peut tre parfois mes parents Vous m avez donn les moyens de r ussir vous m avez permis d appr cier toutes ces ann es pass es aux d tudes vous m avez donn les moyens de r aliser d autres projets tout en tant tudiant vous avez t pr sents sauf dans le temps des imp ts et vous m avez toujours support dans mes choix Juste ca Oh j allais oublier un grand merci Zorro pour son amour inconditionnel vi RESUME Les communaut s microbiennes dans les sols sont parmi les plus diversifi es sur Terre Ce faisant les microorganismes du sol assurent en majeure partie plusieurs fonctions des sols tels que le cycle des nutriments et la d toxification des cosyst mes terrestres En affectant cette diversit la contamination des milieux naturels constitue un risque important pouvant r duire la capacit des cosyst mes r sister et r cup rer aux diff rentes perturbations qu ils doivent subir La diversit des cosyst mes naturels est donc une richesse pr server Effectivement il a t montr que les cosyst mes plus diversifi s taient plus r sistants et r silients aux perturbations naturelles et anthropiques Depuis le d but de l re industrielle la diversit des cosyst mes naturels est en constant d clin cause notamment de la contamination des sols de l air et des cours d eau Afin de pr dire l effet d
247. mbre de s quences lues longueur des s quences lues co ts etc Glenn 2011 Shokralla Spall Gibson and Hajibabaei 2012 Par contre tant tr s r cents comparativement au DGGE la disponibilit des s quenceurs peut constituer une limitation pour plusieurs chercheurs et ou laboratoires Bien que tr s prometteurs les NGS doivent encore faire face plusieurs d fis techniques Effectivement sur certaines plateformes les erreurs de s quengage sont encore relativement fr quentes Loman et al 2012 Quince Lanzen Davenport and Turnbaugh 2011 Ces erreurs causent une surestimation de la richesse des communaut s tudi es Kunin Engelbrektson Ochman and Hugenholtz 2010 Certains outils bio informatiques ont n anmoins t d velopp s afin d identifier et corriger les erreurs de s quen age Huse Welch Morrison and Sogin 2010 Quince et al 2011 En plus des erreurs quelques auteurs ont voqu que la capacit des NGS produire des s quences de bonne qualit pourrait varier en fonction de la composition des s quences Ainsi les s quences riches en G ou en C posent g n ralement probl me Jaenicke et al 2011 Il a m me t rapport que cette probl matique pourrait causer des distorsions intra chantillons dans l abondance relative des OTUs Pinto and Raskin 2012 Aussi d pendamment 31 de l indice de diversit utilis afin de comparer les communaut s il sera n cessaire d atteindre
248. microbial community composition in soils to long term arsenic and cadmium exposure Soil Biology and Biochemistry 38 6 1430 1437 Loy A Maixner F Wagner M and Horn M 2007 probeBase an online resource for rRNA targeted oligonucleotide probes new features 2007 Nucleic Acids Research 35 Database issue D800 804 doi 10 1093 nar gk1856 Macur RE Wheeler JT Burr MD and Inskeep WP 2007 Impacts of 2 4 D application on soil microbial community structure and on populations associated with 2 4 D degradation Microbiological Research 162 1 37 45 Magurran AE 2004 Measuring biological diversity Oxford Blackwell Science Ltd Maltby L Blake N Brock TCM and van den Brink PJ 2005 Insecticide species sensitivity distributions Importance of test species selection and relevance to aquatic ecosystems Environmental Toxicology and Chemistry 24 2 379 Marschner P Yang CH Lieberei R and Crowley DE 2001 Soil and plant specific effects on bacterial community composition in the rhizosphere Soil Biology and Biochemistry 33 11 1437 1445 doi http dx doi org 10 1016 S0038 0717 01 00052 9 133 Marti E Sierra J Caliz J Montserrat G Vila X Garau MA and Crua as R 2011 Ecotoxicity of chlorophenolic compounds depending on soil characteristics Science of the Total Environment 409 14 2707 2716 doi http dx doi org 10 1016 j scitotenv 2011 03 005 McCann KS 2000 The di
249. mme cadre d tude Lecce eee eese eee eene nnn n 31 CHAPITRE 2 PRESENTATION GENERALE DES TRAVAUX 0 ssccssesccescsescccescsssssccessscecsscsecees 33 2 1 iplsiuEBDIPE 33 2 2 Hypoth se de recherche et objectifs ssssccccssssccccsssccccsssceccassseccacssssccecssssceaessseseenees 34 2 3 M thodologie g n rale 1 eee eseazcdebedaccdssssascddecsscestabasiedebeascdetesidecdebasvedsbedaccessseas 35 2 4 Pr sentation des manuscrits ss orae ese etna unas orna nea p eina en anota ae aaa ee ag engen saa ee RE Ende 36 CHAPITRE 3 DEVELOPPEMENT D UNE APPROCHE ANALYTIQUE PERMETTANT L EXTRACTION D INFORMATIONS QUANTITATIVES D UN PROFIL DGGE ccccccccsscsscsscsscsscsccsscescescescescescesceses 38 3 1 D limitation et soustraction du bruit de FON ccccsccsscsccsscsccsccsccscsccsececcscecessecesenecs 38 3 2 Quantification des pics ER 41 CHAPITRE 4 DEVELOPPEMENT D UNE M THODOLOGIE PERMETTANT DE QUANTIFIER LA DIVERSIT DES COMMUNAUT S BACT RIENNES DES SOLS PARTIR DU DGGE 44 4 1 Pr sentation du premier MANUSCHit cccssssccccssssccccsssccccesssceccassseccaessssccensssscsanssseceeaess 44 4 2 A new framework to accurately quantify soil bacterial community diversity from DGGE 45 LP ME Ib 45 4 2 2 Introductions teet retometeiutef ertet eir B ana aire aeree 45 4 23 Methods dtr te eiu PRG EE LI ia e ORE terea REY ee eiae Eha
250. mple BF 100 and the results of the elongation process may be compared with the true RAD Results are only presented for species rank under 1200 for readability but the actual richness of this sample was around 9500 Using these elongated RADs bacterial community diversity was characterized through three indicators community richness number of species Shannon and Simpson s 1 D indices Estimated diversities were compared to true community diversity at the 98 similarity level untruncated RADs All indices were calculated using PAST software Hammer et al 2001 4 2 4 Results 4 2 4 1 Representativeness of DGGE based dominance profiles Pyrosequencing datasets of 16S rRNA gene sequences from three different environments were clustered at 95 97 and 100 similarity level generating nine theoretical bacterial communities Based on the theoretical Tm of a unique representative sequence selected for each OTU in silico DGGE profiles were derived Figure 4 2 56 F UG 60 BF00 SAFiggx FUG BFo7 SAF 57 Figure 4 2 Image of the gel synthesized from the datasets published by Nacke et al 2011 Each in silico profile was analyzed in 17 ways software programs and ball sizes and resulting RADs were truncated using various cut off values and compared to corresponding pyrosequencing datasets clustered using 5 different similarity levels from 96 to 100 This methodology generated a significant amount of data and t
251. munity RADs Developed from in silico DGGE profiles synthesized from 454 pyrosequencing datasets of soil bacterial communities Nacke et al 2011 this methodology made it possible to estimate both the Shannon H and Simpson s 1 D index Magurran 2004 with a 10 precision for the nine samples that were studied Community richness was less precise but still ranged between 10 to 30 of the expected values The framework has yet to be validated on real samples Even if next generation sequencing technologies are considered to be the most powerful tools currently available to study soil bacterial communities many potential limitations were recently associated with the techniques First an insufficient sequencing effort could prevent the recovery of the full extent of the diversity Nacke et al 2011 Also potential distortions associated with sequence GC content were identified Indeed it was demonstrated that 454 pyrosequencing platforms have more difficulty producing long high quality reads for the amplicons with high GC content Jaenicke et al 2011 In their dataset Pinto and Raskin 2012 also found that the number of reads per sample was related to the samples average GC content Based on this finding they encouraged more research to determine whether or not GC bias can affect the relative abundances of OTUs and thus cause intra sample bias Finally sequencing errors were reported to artificially inflate all richness based metri
252. must be stressed that no ball size fit all samples equally well As presented in Tableau 4 1 the closest matching similarity level was not the same for all the samples when DGGE profile background noise was subtracted using rolling ball approaches This observation mostly implies that it is impossible to know on what basis samples are compared when DGGE profiles are analyzed using automated background subtraction algorithms The conclusions that can be drawn from DGGE based diversity studies of soil bacterial communities at least when profiles are analyzed using the three commercial software programs tested in this publication are therefore highly limited It was not possible to identify any relationship between true community diversity and optimal ball radius The results produced by the Matlab based framework that was developed were completely different Indeed mean indicator values associated with this methodology were all very close to zero except for Euclidean distances discussed later and generated rather narrow error bars Furthermore results were stable over a wide range of cut off values and consistent throughout all samples Most importantly it is the only methodology that made it possible to extract accurate PSRs from DGGE profiles The ability of this framework to consistently match the samples true dominance profile at 98 similarity level should not be seen as a coincidence Using optimized Gaussian PDFs to delimit and quan
253. mutation detection tool DGGE can theoretically separate DNA sequences that differ by a single base pair Myers et al 1987 Sheffield et al 1989 Consequently in estimating community diversity from DGGE profiles visible bands are implicitly associated with unique phylotypes Since some authors Schmalenberger and Tebbe 2003 have clearly demonstrated that DGGE bands may contain many different operational taxonomic units OTUs this general consideration is known to be false Generally speaking the similarity level between the genetic markers of different organisms constitutes the baseline of OTU definition in modern microbial taxonomy It has been stated that the minimal value of 97 similarity between 16S rRNA gene sequences Stackebrandt and Goebel 1994 may lack the resolving power to relate bacteria at the species level Rossell Mora and Amann 2001 especially for short partial sequences If the similarity level that should be used is debatable the concept still provides a useful and scientifically grounded basis to estimate and compare bacterial community diversity Even though DNA band superposition on DGGE profiles has been shown to occur it is not known whether this process can be related to DNA sequence clustering at any similarity level or if both processes will consistently yield a comparable representation of soil bacterial community dominance profiles Another poorly understood and seemingly overlooked aspect of DGGE is the pr
254. n rer des distorsions dans les estim s de diversit produits par ces plateformes bien que l importance quantitative de ces distorsions n ait jamais t clairement tablie Aussi la disponibilit de ces appareils peut tre probl matique pour plusieurs chercheurs Plusieurs limitations ont t identifi es afin d estimer l effet des contaminants dans les cosyst mes terrestres L information toxicologique pour les esp ces terrestres est tr s limit e et ne concerne souvent que quelques esp ces Consid rant qu ils sont virtuellement absents des bases de donn es cotoxiques la g n ration de donn es de toxicit sp cifiques aux bact ries du sol constitue un moyen permettant de s attaquer cette probl matique Vu l importance de ces communaut s dans les cosyst mes tant du point de vue de leur diversit que de celui de leur importance fonctionnelle ces donn es constitueraient de l information hautement pertinente afin de mieux comprendre l effet des contaminants en milieux terrestres Pour ce faire une mesure de toxicit bas e sur la diversit g n tique des communaut s bact riennes dans les sols pr sente plusieurs avantages par rapport aux indicateurs fonctionnels souvent utilis s par le pass Par contre l utilisation de la diversit microbienne en tant qu indicateur de toxicit pr sente galement des difficult s la plus importante tant la capacit des techniques actuelles produire des estim s quantit
255. n APS 10 Bio Rad cat 161 0700 e Solution TEMED Bio Rad cat 161 0800 e Solution TAE 50X Tris acide ac tique EDTA e Solution d acrylamide bis 37 5 1 e Solution de formamide d ionis e e Solution de SYBR gold e Solution colorante au glyc rol 100 colorant xyl ne cyanol et bleu bromoph nol e H2O st rile e Agarose GIBCO BRL cat 15510 027 e Appareil lectrophor se Power Pac Basic M 300V 400mA 75W BIO RAD e Support lectrophor se MINI SUB DNA CELL BIO RAD USA e Roulette pour cr er le gradient dans le gel Model 475 gradient delivery system BIO RAD e Carte d alignement Protean Alignment Card BIO RAD e Appareil DGGE D Code universal mutation detection system BIO RAD USA 172 METHODOLOGIE Pr paration de la solution TAE 50X 1 2 DO N QN tA 9 la balance peser 121g de TRIS dans une coupelle et transf rer dans un b cher de 500 ml Sous une hotte chimique pr lever 28 55 ml d acide ac tique glacial avec une pipette gradu e de 50 ml Ajouter l acide ac tique glacial dans le b cher en prenant soin de rincer la coupelle ayant servi peser le TRIS l aide d une pipette gradu e de 50 ml pr lever 50 ml de la solution d EDTA 2Na 0 5M pH 8 0 pr par e au point 3 1 2 du protocole d extraction d ADN PE42B et transf rer dans le b cher de 500 ml Ajouter de l eau d ionis e jusqu ce que le volume dans le b cher soit d environ 400ml Ins
256. n pilon Ins rer l chantillon dans une cartouche en cellulose Ajouter 1 ml de standard de r cup ration 1 g L dans chacun des chantillons Pr parer le t moin sol non contamin avec ml de standard de r cup ration Mettre 50 ml de CH2Cl2 dans un b cher de m tal et quelques pierres bullition Installer le tout sur la plaque chauffante du Soxtec Introduire le support cartouche contenant les chantillons dans le Soxtec en amenant les boutons du panneau avant en position Rinsing Abaisser le levier de c t jusqu au d clanchement du syst me d immobilisation des cartouches Doucement introduire les cartouches dans les b chers m talliques en positionnant les boutons Boiling pour 15 min Placer les boutons du panneau avant en position Rinsing pour 30 minutes Apr s les 30 minutes de rin age ouvrir les valves du condenseur en tournant les manettes d un quart de tour vers la droite Lorsque presque tout le solvant est pi g dans les condenseurs appuyer sur le bouton AIR sur l unit chauffante 1046 et ouvrir la valve d vaporation sur l unit Soxtec Les derni res traces du solvant seront collect es dans les condenseurs R cup rer dans un r cipient le solvant recycl Fermer les bains du Soxtec 209 17 Resolubiliser les contaminants dans de l hexane et jauger dans des ballons de 25 ml tout d pendant de la dilution voulue DOSAGE AU GC FID Pr paration des standard
257. n sequencing platform Two differently textured soils were used a loamy and a sandy XV soil For each soil four subsamples were prepared one was kept clean and the three others were contaminated with different concentrations of pentachlorophenol The ecotoxicological effects of pentachlorophenol on the diversity of soil bacterial communities was further studied using the two same soils This time seven different pentachlorophenol concentrations were used and all the samples were prepared in triplicate The samples fluorescein diacetate hydrolytic activity was also measured Concentration response modeling was conducted on the two types of indicators diversity and activity Furthermore ecotoxicological databases were screened in order to find data on the toxicity of pentachlorophenol to terrestrial species These data were used to draw a species sensitivity distribution representative of the range of sensitivity of terrestrial species exposed to pentachlorophenol that was compared with the above mentioned concentration response curves Working on in silico DGGE profiles it was shown that the representativeness of the results produced by commercial gel analysis software programs was sample dependent On the contrary the Matlab based framework presented in this thesis allowed the extraction of accurate peak to signal ratio values and the production of representative dominance profiles for all the analyzed samples It was shown th
258. nce j C C C end end GC G C A T G C Longueur length Sequence Intl 0 Int2 0 Int3 0 Int4 0 Int5 0 Int6 0 Int7 0 Int8 0 Int9 0 Int10 0 Int11 0 Int12 0 Int13 0 Int14 0 Int15 0 Int16 0 Int17 0 Int18 0 Int19 0 Int20 0 for xx 1 Longueur if Qualite xx lt 1 Intl Int1 1 elseif Qualite xx Int2 Int2 1 elseif Qualite xx Int3 Int3 1 elseif Qualite xx 4 Int4 Int4 1 elseif Qualite xx Int5 Int5 1 elseif Qualite xx Int6 Int6 1 elseif Qualite xx 7 Int7 Int7 1 elseif Qualite xx 8 Int8 Int8 1 elseif Qualite xx Int9 Int9 1 elseif Qualite xx Int10 Int10 1 elseif Qualite xx Int1 17 Int11 1 elseif Qualite xx 12 Int12 Int12 1 elseif Qualite xx 12 Int13 Int13 1 elseif Qualite xx Int14 Int14 1 elseif Qualite xx Int15 Int15 1 elseif Qualite xx 16 Int16 Intl6 1 elseif Qualite xx 17 Int17 Int17 1 elseif Qualite xx 18 Int18 ce im elseif Qualite xx Int19 tN else Int20 Int20 1 end end D for yy 1 Longueur Miscall Miscall 10 Qualite yy 10 end 260 261 Qmoy mean Qualite C3 C3 i Debut Longueur GC Qmoy Int1 Int2 Int3 Int4 Int5 Int6 Int7 Int8 Int9 Int10 Int11 Int12 Int13 Int14 Int15 Int16 Int17 Int18 Int19 Int20 Miscall end end break elseif sum Seq1 Ec4 gt NumMin
259. nding on the sequence lengths 136 or 160 bases the levels correspond to error rates of 1 3 1 5 1 9 2 2 and 2 5 3 0 respectively Whether or not these levels are suitable for this particular Ion Torrent dataset remains an open question Since the datasets of the different samples were constructed with sequences of various lengths it is unclear whether a single dissimilarity level can be seen as suitable for all the samples or even if a single level can be seen as suitable for a given sample Considering the sensitivity of the diversity indices to sequencing errors Tableau 5 3 it would be important to develop adapt denoising tools for the newer Ion Torrent platform Such tools exist for the 454 pyrosequencing platforms i e AmpliconNoise Quince et al 2011 Even if information on the topic is very scarce it seems that the methods require adaptations before being applicable on Ion Torrent results Generally speaking assessing the accuracy of the diversity indices calculated from the sequencing datasets is not feasible Indeed sampling depth Figure 5 4 sequencing errors Tableau 5 3 and sequences length or GC content Figure 5 5 were all proven to influence the diversity indices in a sample dependent way Depending on which bias is quantitatively the most significant for a given sample and index the diversity of the sample can be underestimated or overestimated Finally next generation sequencing technologies have been reported to pr
260. nect l imageur La fen tre suivante appara tra Hi VILBER LOURMAT Figure A1 8 Fen tre principale du logiciel Quantum Capt 10 11 12 13 14 15 187 Appuyer sur le bouton Start preview situ en haut gauche section Position amp Focus Le gel devrait appara tre l cran S assurer que les bandes de migration sont bien droites Au besoin ouvrir la porte de l appareil et ajuster la position du gel pour bien le centrer Ajuster le zoom de l appareil photo afin de bien cerner les bandes photographier Faire un focus approximatif afin d obtenir les bandes les plus claires possible Normalement l ouverture de l objectif Aperture est maximale Il faut parfois r duire l ouverture afin d viter la saturation de l appareil Une fois les ajustements r alis s appuyez nouveau sur le bouton Start preview S assurer que l indicateur de saturation section Display en haut et au centre de la fen tre du logiciel est On L indicateur de saturation fera apparaitre en rouge tous les pixels correspondant un niveau de gris mesure de l intensit lumineuse maximal de l appareil Dans la seconde section Image capture appuyer sur Start exposure Avec les fl ches situ es juste au dessus de ce bouton ajuster le temps d exposition afin de bien visualiser les bandes Si possible augmenter le temps d exposition afin de voir quelques pixels en rouge l
261. ned from the initial concentrations the concentrations after 28 days were not measured Soils 10 g were dehydrated with 5 g of anhydrous magnesium sulfate A surrogate consisting of 100 uL of a solution of 2 4 6 tribromophenol 1 g L was added into each sample PCP was extracted from the soils with a Tecator Soxtec System HT 1043 extraction unit Foss NA Eden Prairie MN USA using dichloromethane HPLC grade as a solvent 10 1 ratio v w After dichloromethane volatilization the PCP was solubilised in hexane HPLC grade and measured using a gas chromatograph equipped with a flame ionisation detector GC FID Agilent model 6890N USA 99 The GC was equipped with a 60 m X 0 25 mm FactourFour capillary column Varian with a 0 25 um stationary phase The mobile phase was helium and the flow rate was set at 29 mL min The injection was made at an initial temperature of 69 C for 0 2 min and was increased at a rate of 200 C min until 300 C The temperature of the detector was 320 C The initial temperature of the oven was 30 C and increased at a rate of 10 C min until 300 C That temperature was maintained for 10 min The concentrations in the samples corresponding to levels 0 1 2 and 3 were below the detection limit of the quantification method 100 mg kg and the samples were sent to an independent laboratory Maxxam Analytics Saint Laurent Qu bec Canada PCP was quantified using a gas chromatograph coupled with a mass spectr
262. nes k 1 0 100 for i 1 NbColonnes i NbColonnes Vecteur Analyses i Vecteur Vecteur sum Vecteur Indice find Vecteur lt k 1 first if length Indice Vecteur Vecteur 1 Indice 1 end Compteur 1 PeakRatio PR i sum Vecteur xmin2 5033 6 PeakRatio 3656 alpha2 0 2665 PeakRatio 0 9350 Valeur700 xmin2 700 alpha2 Vecteurl round NbSeq PeakRatio Vecteur sum Vecteur DiffMin 100000 XDiffMin 0 DebutMin 0 for xmin 500 50 3000 for 1 1 500 if xmin l alpha lt Vecteurl end Debut 1 break end end Diff abs xmin 700 length Vecteur1 1 Debut alpha Valeur700 if Diff lt DiffMin DiffMin Diff XDiffMin xmin DebutMin Debut end end xmin XDiffMin Debut DebutMin for y length Vecteur1 699 Addition floor xmin Debut alpha Vecteurl Vecteur1 Addition Debut Debut 1 end x 700 while sum Vecteurl NbSeq 246 247 Addition xmin2 x alpha2 if x 1000 Addition floor Addition else if Addition gt 1 Addition floor Addition else Addition 1 end end Vecteurl Vecteur1 Addition x xtl if Addition 1 Addition ones NbSeq sum Vecteurl 1 Vecteurl Vecteur1 Addition break end end P Vecteurl Vect 1 length P 1 P SG 1 length P P P sum P H sum P log P D sum P 2 end 248 Nom du fichier ConstructionImage m Description Cet
263. nne des sols des mesures biochimiques cette fin la mesure du potentiel d activit hydrolytique de la fluoresc ine diac tate un essai simple produisant des r sultats corr l s aux mesures de biomasse microbienne semble tre id ale Effectivement la biomasse microbienne s est av r e tre un indicateur sensible au pentachloroph nol dans quelques tudes diff rentes Sur la base des limitations identifi es les objectifs principaux de ce projet sont les suivants 1 Proposer une approche analytique permettant d extraire des profils DGGE de l information quantitative sur la dominance et la richesse des communaut s tudi es 2 D velopper partir de profils DGGE in silico un mod le empirique permettant de produire des estim s de diversit corr l s la diversit des communaut s tudi es partir de l information extraite des profils DGGE 3 Valider ce mod le sur des chantillons r els en comparant la diversit estim e partir du DGGE celle produite par une nouvelle technologie de s quen age d ADN 4 Quantifier l effet du pentachloroph nol sur la diversit bact rienne des sols et comparer cette r ponse celle bas e sur la mesure du potentiel d activit hydrolytique de la fluoresc ine diac tate des sols Sur la base de ces objectifs une approche analytique a t d velopp e partir de profils DGGE in silico l aide du logiciel Matlab Contrairement aux logi
264. nons unicellulaires Bu e et al 2009 6000 esp ces de bact ries Roesch et al 2007 et 300 esp ces d arch es Pires et al 2012 Cette diversit g n tique et donc m tabolique permet aux communaut s microbiennes d tre impliqu es dans une multitude de processus permettant aux cosyst mes de bien fonctionner Tel que revu par van der Heijden et al 2008 les microorganismes du sol sont des contributeurs importants aux cycles du carbone de l azote et du phosphore dans les sols Il a t estim que cette communaut pourrait supporter entre 80 90 des r actions biochimiques se produisant dans les sols Nannipieri et al 2003 Les microorganismes du sol via leurs capacit s m taboliques diversifi es sont galement en mesure de d grader une multitude de contaminants participant ainsi grandement la d toxification des milieux naturels Contrairement la majorit des autres esp ces terrestres la contribution des microorganismes aux fonctions du sol peut difficilement tre divis e entre les diff rentes esp ces composant les communaut s bact riennes fongiques ou arch ennes La plupart de ces processus sont rendus possibles par l action conjointe d un grand nombre d esp ces La discussion pr sent e la section 1 1 2 Lien biodiversit fonction stabilit s applique galement aux communaut s microbiennes Le lien entre la diversit microbienne et la stabilit fonctionnelle des sols
265. nt les chantillons d ADN l air ambiant Il faut s assurer que l thanol est compl tement vapor avant de poursuivre sinon il sera impossible de suspendre l ADN il restera sous forme de pr cipit cette tape ci il est possible de laisser l thanol s vaporer durant la nuit en laissant les chantillons sous la hotte biologique 16 Dissoudre le culot faire plusieurs mouvements de va et vient avec la micropipette P200 avec 100 ul de tampon TE Mesure de la concentration d ADN dans les extractions On tablit la courbe standard d ADN partir de concentrations connues d ADN voir l exemple d une courbe standard en annexe Pr paration de la solution m re d ADN 1 Dans un tube centrifugation de 15ml peser Img d ADN 2 Avec une micropipette de 10ml ajouter 10ml de tampon TE 3 On obtient une solution m re d ADN de 100u g ml 4 Laisser l ADN se solubiliser pendant 24 heures dans une chambre froide 4 C Pr paration des standards d ADN A partir d un standard d ADN de 100 ug ml pr parer des standards pour les concentrations suivantes 25 ug ml 20 ug ml 15 ug ml 10 ug ml 5 ug ml et 2 5 ug ml Pr parer le standard de 25 pg ml 1 l aide d une seringue de 250ul pr lever 2501 de la solution d ADN de 100p g ml et le transf rer dans un tube microcentrifuge st rile de 1 5 ml 2 l aide d une seringue de 1ml y ajouter 750p de tampon TE 156 Pr parer le standard de
266. ntes sections en cliquant diff rents endroits l int rieur d un 190 couloir Cela ajoutera des lignes de d limitation l int rieur d un couloir qui peuvent tre supprim s en cliquant droite sur la souris A remarquer en bas droite de la Figure Al 11 des options qui permettent dans l ordre de modifier le type d affichage de l image fond noir et bandes blanches ou bandes noires sur fond blanc d afficher le poids mol culaire des bandes n cessite l utilisation d une chelle d ADN comme avec les gels d agarose utilis s afin de v rifier le produit PCR d imprimer l image ou de faire une capture d cran d ajuster le zoom et de modifier la brillance brightness de l image afin de mieux discerner les bandes Cliquer ensuite sur suivant Es Analyse PM 3 Analyse Quantification 4 Publication fe Menu principal Correction du Smiling HM ca e v m Gel vertical Gel horizontal Nombre de pistes Espace entreles pistes Rotation des pistes lt gt Modification des pistes ide Enregistrer sous Figure Al 11 Fen tre de d finition des couloirs de migration du logiciel Bio 1D 191 D tection des bandes Bien que Bio 1D permette la d tection automatique des bandes les profils g n r s par les communaut s bact riennes des sols sont trop complexes pour que les bandes soient d tect es automatiquement Il faut donc d finir les bande
267. ntification de la concentration en ADN dans les extractions Lecture au fluorom tre On proc de l analyse de l ADN par fluorom trie en utilisant une microplaque de 96 puits dans laquelle on introduit des quantit s fixes d ADN 50 ul et de solution Hoechst DE 0 8 ug ml 250 ul On d pose ensuite la microplaque dans le lecteur microplaque On configure les param tres du logiciel SPF Les param tres modifier sont la longueur d onde d excitation 360 nm et la longueur d onde d mission 460 nm On doit galement mettre le brassage de la microplaque ON 6 l aide d une micropipette P200 pr lever deux reprises duplicata 50 ul de tampon TE et d poser l chantillon dans les puits section Al A2 de la microplaque Ces chantillons serviront de blanc pour d finir la courbe standard l aide d une micropipette P200 pr lever deux reprises duplicata 50 ul de la solution standard d ADN 2 5 ug ml et d poser l chantillon dans les puits section B1 B2 de la microplaque R p ter l tape pr c dente pour toutes les solutions standards d ADN en les d posant dans les puits C1 C2 jusqu G1 G2 l aide de la micropipette P200 pr lever 50 ul de l chantillon d ADN et le d poser dans le puits A3 de la microplaque l aide d une pipette automatique p1000 ajouter 250 ul de solution Hoechst 0 8 ug ml dans les puits contenant 50 ul d ADN La microplaque est lu
268. oduce biased results often in relation to the sequences GC content Jaenicke et al 2011 Pinto and Raskin 2012 These authors encouraged more research to determine whether the bias can cause important intra sample distortions in the relative abundances of OTUs Pinto and Raskin 2012 Since the real diversity 91 of the studied samples is unknown it is difficult to unambiguously state that GC content or more generally quality considerations have generated such distortions However many indicators point in this direction The low deletion of sequences with GC content near 48 and alternatively the high deletion of all the sequences above a GC content of 58 is one such indicator Figure 5 5 The fact that these low GC sequences are of slightly better quality than sequences with GC content between 51 56 even though they are nearly 30 bases longer is another Figure 5 5 The fact that dataset processing removed proportionally fewer sequences for the samples dominated by low GC OTUs points in the same direction Tableau 5 2 The strong linear correlation found between Ion Torrent and DGGE 1 D values Tableau 5 4 cannot be interpreted as a lack of significant distortions Indeed the index was profoundly influenced by sequencing errors Tableau 5 3 and it was hypothesized that sampling depth through the occurrence of erroneous sequences may influence 1 D to a greater degree than what Figure 5 4 suggests It is also important to mention t
269. of all the species equalled 35 000 Figure 4 1 presents a schematic representation of the elongation framework a 0 267 PSR 0 935 4 Xmin 5034 PSR 3656 5 It must be emphasized that the elongation framework produces distributions that do not follow a particular abundance model Indeed RAD heads are drawn from peak quantification and are distribution free Mid and low abundance values are all predicted using the PLD but with different model parameterization Therefore resulting RADs do not generally follow a power law 55 512 x DGGE peaks 256 Elongated RAD 2 Elongation framework step 1 True RAD 3 128 4 a 0 875 for all samples T 5 A Xmin Vary between 500 and 3000 4 64 4 adjusted in order to ensure continuity 2 I at rank 700 Elongation framework step 2 2 32 az Eq 4 and Xmin2 Eq 5 E calculated from the sample PSR 16 Continued until the abundance of all the species sums to 35 000 8 17 I cms 4 y t T T T T T T 1 T T T T 7 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 Species rank Figure 4 1 Schematic representation of the elongation framework The framework was developed with pyrosequencing datasets containing approximately 35 000 sequences per sample The elongated RADs were therefore considered complete when the abundance of all the species summed to this value The example is given for sa
270. ofile analysis step itself In the scientific literature fingerprinting patterns were analyzed using many different software programs Although convenient it must be recognized that most were not specifically developed to analyze fingerprints as complex as those produced by soil bacterial communities personal communications It seems that the differences between software programs and more generally their capacity to quantitatively unravel the communities true dominance profile from banding patterns have never been assessed Furthermore numerical simulations demonstrated that by only enabling the consideration of the 47 most abundant phylotypes fingerprinting techniques provide an inaccurate estimation of the true diversity of microbial communities Blackwood et al 2007 Narang and Dunbar 2004 The diversity indices routinely used to quantify diversity are influenced by both the richness length and the dominance pattern conveyed by the dataset used to plot the rank abundance distribution RAD of the studied community Hill et al 2003 Magurran 2004 Traditional DGGE banding pattern analysis theoretically yields information on community dominance profiles but not on richness However based on simulated bacterial communities it was shown that the subunit background percentage SBP an indicator extractable from DGGE profiles was related to community richness Loisel et al 2006 The SBP can be seen as a measure of the proportion
271. oisie disparaitra au bout de quelques secondes pour laisser place la temp rature r elle qui diminuera lentement Le bain refroidissant n est pr t que lorsque la temp rature fix e est atteinte 6 7 8 9 Unit chauffante 1046 Appuyer sur le bouton Power Appuyer sur Read Set pour r gler la temp rature 1100C Ajuster la temp rature avec le bouton Set Appuyer sur Read Set pour enregistrer les changements effectu s Le bain chauffant ne sera pr t pour l extraction que lorsque la temp rature fix e sera atteinte Note La temp rature de l unit chauffante est fix e en fonction du solvant utilis voir manuel d instruction de l unit Soxtec Pr paration du standard de r cup ration 1 2 la balance peser 0 0100g de 2 4 6 tribromophenol dans un ballon de 10 ml Ajouter du m thanol et compl ter au trait de jauge On obtient un standard de r cup ration de 1 g L Bouchonner et bien m langer 208 Pr paration des chantillons et extraction par solvant l 10 11 12 13 14 15 16 Fixer une rondelle de m tal chaque cartouche destin e recevoir les chantillons et les ins rer dans le support cartouche Pr lever 10g de sol pour l analyse et 5 g pour effectuer le poids sec Pour l chantillon analyser ajouter 5g de sulfate de magn sium anhydre afin d ass cher P chantillon Uniformiser l chantillon l aide d u
272. ometer GC MS detection limit 0 1 mg kg The measurements were taken on composite samples prepared for each soil and contamination level Tableau 6 2 Initial PCP concentrations measured in the soil samples Results are presented as the mean PCP concentration for each level with the associated 95 confidence intervals calculated whenever possible PCP concentration PCP concentration Sample Sample mg PCP kg dry wt soil mg PCP kg dry wt soil LMo 0 1 So 9 1 LMi 10 Si 7 LM 24 S2 28 LM3 44 S3 44 LM 1311 S4 12947 LMs 182 4 S5 194 19 LMs 420 19 S6 440 29 LM 1774 35 S7 2111 59 6 2 3 2 Quantification of the diversity of the soil bacterial communities DNA extractions were carried out as previously described Biirgmann et al 2001 with minor modifications Soil 300 mg and 0 1 mm diameter zirconia silica beads were mixed in a 1 1 w w 100 ratio Bead beating was done at 2 800 rpm for 90 seconds with a Mini BeadBeater 8 BioSpec Products Inc Bartlesville OK USA in 650 ul of extraction buffer composed of 0 2 w v hexadecyltrimethylammonium bromide CTAB 1 mM dithioteitrol 0 2 M sodium phosphate buffer pH 8 0 1 M NaCl and 50 mM ethylenediaminetetraacetic acid Purification steps involved polyvinylpolypyrrolidone PVPP spin columns incubation centrifugation in a 20 w v polyethylene glycol and 2 5 M NaCl solution and phenol chloroform isoamyl alcohol extraction Thakuria et al 2008
273. on regarding the environmental relevance of the diversity based indicators should also be addressed Indeed for the higher organisms generally used for toxicity testing the link between the measured endpoint mortality reproduction growth etc and the species ecological function is probably a lot more straightforward than in the case of bacterial communities Even though the 111 link between bacterial more generally microbial structural diversity soil functions and ecosystem stability Girvan et al 2005 Wittebolle et al 2009 are well recognized it is not direct Deng 2012 Griffiths and Philippot 2013 It is therefore unclear how a decrease in 1 D or exp should be interpreted However similar questions can also be raised for the potentially affected fraction of species PAF Indeed SSD modeling uses ecotoxicological data produced in controlled environments often recorded for different endpoints without considering the intra and inter species interactions that could potentially modulate the impact of contaminants on real ecosystems Though presented as ECx the ecotoxicological data produced in this study should be seen as a community response to PCP rather than single species toxicity indicators Considering that the curves presented in Figure 6 3 were the same for all the percentiles between 5 and 50 it can be concluded that for the samples studied in our work the sensitivity of soil bacterial communities to PCP is n
274. onDebut i j PositionFin 1 j end end Rang 1 NbLignes Resultats Rang VolumeBlanc VolumeBandes xiswrite Lecturelmages xlsx Resultats Nom 1 AutreImage 1 while Autrelmage 1 AutreImage while size AutreImage 1 prompt Souhaitez vous lire une autre image avec les m mes couloirs O N dlg title Autre lecture 224 num_lines 1 def O options Resize on options WindowStyle normal AutreImage inputdlg prompt dlg title num lines def options if strempi AutreImage 1 N 0 amp amp strempi AutreImage 1 0 0 AutreImage end end if strempi Autrelmage 1 0 1 Nom while size Nom 1 0 prompt Nom de l image lire dlg title Entrez les informations demand es num lines 1 A G2 deb tif def A options Resize on options WindowStyle normal Nom inputdlg prompt dlg_title ynum_lines def options end im imread Nom 1 for i 1 NbLignes im2 double im i for j 1 NbEch VolumeBlanc i j sum im2 DebutBlanc 1 j FinBlanc Blanc ij mean im2 DebutBlanc i j FinBlanc VolumeBandes i j sum im2 PositionDebut i j PositionFin 1 j MoyenneBandes i j mean im2 PositionDebut i j PositionFin 1 j end end Rang 1 NbLignes Resultats Rang VolumeBlanc VolumeBandes xiswrite Lecturelmages xlsx Resultats Nom 1 AutreImage 1 else AutreImage 0 end end
275. onc de comparer des communaut s pr sentant la fois une richesse et un patron de dominance diff rents Dans le Tableau 1 2 la richesse S l indice de Shannon expP ainsi que l indice de Simpson 1 D correspondent des mesures du nombre effectif d esp ces 9 1 2 valuation de l effet des contaminants sur les populations et les cosyst mes Selon Odum 1985 une des tendances pouvant tre observ es dans des cosyst mes stress s i e contamin s est une r duction de la diversit accompagn e d une augmentation de la dominance Les indices de diversit pr sent s pr c demment constituent donc des outils int ressants afin de quantifier l effet des contaminants sur les cosyst mes Effectivement en consid rant simultan ment la pr sence et l abondance d un grand nombre d esp ces ces derniers tiennent implicitement compte des diff rentes interactions pouvant lier les esp ces composant une communaut pr dation milieu de support etc Par contre certaines difficult s viennent limiter leur utilisation en cotoxicologie Effectivement afin d encadrer de limiter ou d interdire l utilisation de certaines substances de fixer des limites d mission et de d finir des crit res de qualit environnementale Environmental Quality Criteria ou EQC il importe d tre en mesure de pr dire les cons quences que pourraient avoir ces contaminants s ils se retrouvaient dans les cosyst mes Comme il est difficile et
276. ong de ce projet Je voudrais aussi remercier Etienne et Charles pour leur curiosit sans quoi une grosse partie de ce projet n aurait pas t possible Un gros merci suppl mentaire Etienne seul cette fois pour avoir r pondu mes nombreuses questions Je m en voudrais d oublier Lucie qui m a apport une aide tr s pr cieuse au laboratoire mais aussi ce qu on pourrait appeler un support psychologique et moral lorsque les choses allaient moins bien et pas seulement au labo Dans la cat gorie support moral je ne pourrais passer sous silence l apport de PO qui a entendu plus souvent qu son tour parler de communaut s bact riennes m me si a ne fait pas n cessairement ou n cessairement pas partie de ses int r ts dans la vie Les allers et retours de l ar na seront dor navant plus reposants V Je tiens galement souligner l apport de deux personnes bien sp ciales mes yeux Nadia et Gladys qui ont partag ma vie des moments diff rents bien entendu tout au long de cette aventure Je sais que je n ai pas t toujours facile supporter surtout vers la fin du projet Un grand merci entre autres Dave Oli Gump Gab Sophie Isa Rosie Alyson et Anne Lautier pour tous ces moments partag s ainsi qu au CIRAIG en entier un groupe compos de personnes fantastiques Et finalement le plus grand des mercis deux individus que je place dans le club s lect des gens les p
277. onis e sans d passer Sceller le ballon et l inverser au moins treize fois pour bien homog n iser la solution Transvider le contenu du ballon dans une bouteille herm tiquement ferm e et conserver 4C Pr paration des solutions d acrvlamide 8 pour le gel avec un gradient d ur e p y p g g Solutions d acrylamide 8 avec 0 d ur e d naturant 25 ml 1 l aide d une pipette gradu e de Sml pr lever 5 ml d acrylamide bis 37 5 1 40 et transf rer dans un b cher de 50 ml l aide d une pipette P1000 pr lever 500 ul de solution TAE 50X et la transf rer dans le m me b cher l aide d une pipette de 25 ml pr lever 19 5 ml d H2O milli Q et ajouter au b cher Ins rer un barreau magn tique et agiter jusqu dissolution compl te Avec une seringue de 30ml et un filtre millipore 0 45 um filtrer la solution dans un tube centrifuger de 50ml Si la solution est utilis e le jour m me pour la pr paration du gel 6 Placer le tube dans de la glace et y conserver la solution jusqu son utilisation Si la solution est pr par e en avance 7 D gazer dans une chambre ana robie placer le b cher dans la chambre agitateur magn tique dans la solution placer la chambre sur une plaque agitatrice fermer la chambre herm tiquement et mettre sous vide Laisser d gazer ainsi pendant 10 15 minutes Placer dans un tube de 50 ml Sarstedt entourer d aluminium et le conserver 4 C
278. ons for Benchmarks of Soil Risk Assessments In E Zhu amp S Sambath Eds Information Technology and Agricultural Engineering Vol 134 pp 871 879 Springer Berlin Heidelberg Suter II GW 2001 North American history of species sensitivity distributions In L Posthuma G W Suter II amp T P Traas Eds Species sensitivity distributions in ecotoxicology pp 11 17 Boca Raton Lewis Publisher 140 Suter II GW Traas TP and Posthuma L 2001 Issues and practices in the derivation and use of species sensitivity distributions In L Posthuma G W Suter II amp T P Traas Eds Species sensitivity distributions in ecotoxicology pp 437 474 Boca Raton Lewis Publisher Suzuki M and Giovannoni S 1996 Bias caused by template annealing in the amplification of mixtures of 16S rRNA genes by PCR Applied and Environmental Microbiology 62 625 630 Swisher R and Carroll G 1980 Fluorescein diacetate hydrolysis as an estimator of microbial biomass on coniferous needle surfaces Microbial Ecology 6 3 217 226 doi 10 1007 bf02010387 Takahiro K 2003 Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions PCR Journal of Bioscience and Bioengineering 96 4 317 323 doi 10 1016 s1389 1723 03 90130 7 Tamames J and Rossell M ra R 2012 On the fitness of microbial taxonomy Trends in Microbiology 20 11 514 516 doi http dx doi org 10 1016 j tim 2012 08 012 Temmerman
279. ont surtout utilis es afin de prot ger les cosyst mes Pour ce faire l indicateur le plus souvent utilis pour la d rivation d EQC est la concentration pr sentant un risque pour 5 des esp ces Hazardous Concentration ou HCs Plusieurs tudes ont montr que ce percentile de distribution avait la capacit de prot ger les communaut s aquatiques Giddings Solomon and Maund 2001 Hose and van den Brink 2004 Leung Grist Morley Morritt and Crane 2007 Maltby Blake Brock and van den Brink 2005 Roessink Belgers Crum van den Brink and Brock 2006 Solomon Giddings and Maund 2001 van den Brink Brock and Posthuma 2001 Venturino Montagna and de D Angelo 2007 Wheeler Leung Morritt Sorokin and Rogers 2002 et terrestres Jensen Smith Krogh Versteeg and Temara 2007 Semenzin Temminghoff and Marcomini 2007 15 Un l ment primordial consid rer lors de la construction ou de l interpr tation d une courbe SSD est la repr sentativit de la s rie de donn e cotoxique sous jacente Premi rement tel que pr sent au Tableau 1 3 il existe de grandes diff rences entre les diff rents types d indicateurs et fonctions suivies chez une m me esp ce D s lors il est pr f rable de construire les s ries de donn es partir d essais similaires pour toutes les esp ces Puisque les esp ces taxonomiquement tr s rapproch es sont g n ralement semblables en terme de sensibilit face un contam
280. options if strempi Reposition 1 N 0 amp amp strempi Reposition 1 0 0 Reposition end end Reposition strempi Reposition 1 N Le positionnement du pic est pas correct if Reposition 0 break Le positionnement est incorrect else Decalage Reposition while size Decalage 1 prompt Position centrale pics 237 dlg title Pour repositionner les pics sans changer la forme des cloches num lines 1 A num2str Vect PositionMax def A options Resize on options WindowStyle normal Decalage inputdlg prompt dlg title num_lines def options if size Decalage 1 0 Vect_PositionMax str2num Decalage 1 end if size Vect_PositionMax 2 NbPics Decalage Donnees erronees end end P zeros Longueur NbPics for a 1 NbPics P a Amplitude_1 a 2 pi Sigma_1 a 2 1 2 exp Rang Vect PositionMax a 2 2 Sigma 1 a 2 end P2 sum P 2 P3 P2 PFantome close figure 2 if min Avant gt 100 Min min Avant 100 else Min 1 end if max Apres lt Longueur 300 Max max Apres 300 else Max Longueur end figure 2 hold on plot Rang Min Max Vecteur Min Max 238 plot Rang Min Max P Min Max Rang Min Max P3 Min Max Rang Min Max PFantome Min Max title Verification des pics hold off end end P P2 Vecteur Vecteur P Parametres z
281. or S30oo since the initial extract had been completely used Between both 76 extractions the sample was kept in the dark at 20 C The methodology for PCR amplification DGGE profiling and profile analysis was also further optimized Indeed amplifications were carried out using HPLC purified primers instead of standard purity ones Also the MgCl concentration was reduced from 3 5 to 2 5 mM the length of the denaturation annealing and elongation steps was reduced from 15 to 10 seconds and the number of PCR cycles was reduced from 40 to 35 Biases in sequencing datasets were associated with sampling depths sequencing errors and GC content considerations The impact of the sampling depth was investigated using the elongated DGGE based RADs 200 ng well Since the DGGE RADs elongation framework produced distributions containing 35 000 simulated reads they were randomly sampled without replacement using Matlab Ten different sampling runs were conducted each time taking between 100 and 30 000 reads The diversity indices computed from these partial distributions were compared to the indices calculated from the complete elongated RADs Based on these results it was possible to derive sample specific correction factors to approximate the diversity estimates that would have been calculated at a sampling depth of 35 000 reads The diversity indices are referred to as Jon Torrent corrected All of the sequencing datasets were also normalized
282. or j 1 length Sequence if strempi Sequence j A 1 A A elseif strempi Sequence j T T T 1 elseif strempi Sequence j G 1 G G 1 elseif strempi Sequence j C 1 C C l end end GC G C A T G C Longueur length Sequence Intl 0 Int2 0 Int3 0 Int4 0 Int5 0 Int6 0 Int7 0 Int8 0 Int9 0 Int10 0 Int11 0 Int12 0 Int13 0 Int14 0 Int15 0 Int16 0 Int17 0 Int18 0 Int19 0 Int20 0 for xx 1 Longueur if Qualite xx lt 1 Nr Intl Int1 1 elseif Qualite xx 2 Int2 Int2 1 elseif Ole Int3 Int3 1 elseif Qualite xx Int4 Int4 1 elseif Qualite xx Int5 Int5 1 elseif Qualite xx Int6 Int6 1 elseif Qualite xx 7 Int7 Int7 1 elseif Qualite xx Int8 Int8 1 elseif Qualite xx Int9 Int9 1 elseif Qualite xx Int10 Int10 1 elseif Qualite xx 11 Int11 Intll1 1 elseif Qualite xx Int12 Int12 elseif Qualite xx Int13 Int134 2 E 255 256 elseif Qualite xx Int14 Int144 elseif Qualite xx Int15 Int15 1 elseif Qualite xx 16 Int16 Intl6 1 elseif Qualite xx 17 Int17 Int17 1 elseif Qualite xx Int18 QU elseif Qualite xx Int19 sree else Int20 Int20 1 end end T a Ja for yy 1 Longueur Miscall Miscall 10 Qualite yy 10 end Qmo
283. ot different from the sensitivity of terrestrial communities composed of higher species exposed to the same contaminant It is also interesting to compare the diversity based C R curves with the soil screening levels adopted by various regulatory agencies for PCP In the United States threshold values of 5 mg kg for terrestrial plants and 31 mg kg for invertebrates were adopted U S Environmental Protection Agency 2007 In Canada the soil quality guideline values are 11 mg kg for environmental protection and 7 6 mg kg for human health protection Canadian Council of Ministers of the Environment 1999 In the Netherlands a similar intervention value of 12 mg kg was calculated Ministry of Housing Spatial Planning and the Environment 2009 These threshold values are all very similar to the 10th percentile of the 1 D or exp curves produced in this study These results are highly promising considering that SSD curves and EQCs are generated using dozens of ecotoxicological data on various higher species while the C R curves presented here were produced by a single experiment that used small amounts of contaminated soils In conclusion the use of structure based metrics for toxicity testing presents indisputable strengths The production of the diversity based indicators presented in this paper required small amounts of contaminated soils relied on a cost effective methodology and focused on organisms that were not grown in a laboratory but indigenous
284. owStyle normal Quantifier inputdlg prompt dlg titlenum_lines def options if strempi Quantifier 1 N 0 amp amp strempi Quantifier 1 O 0 Reposition end end Quantifier strempi Quantifier 1 N if Quantifier while DernierPic 1 InfoPic while size InfoPic 1 232 prompt Position centrale des pics Emplacement des premiers points utilisables Emplacement des derniers points utilisables Position centrale des pics fantomes Debut des pics fantomes Fin des pics fantomes Facteurs multiplicatifs fantomes dig title Entrez les informations demandees sur le pic que vous voulez quantifier num lines 1 A num2str 0 B num2str 0 C num2str 0 D num2str 0 E num2str 0 F num2str 0 G num2str 1 def A B C D E F G options Resize on options WindowStyle normal InfoPic inputdlg prompt dlg_title ynum_lines def options if size InfoPic 1 0 Vect_PositionMax str2num InfoPic 1 Avant str2num InfoPic 2 Apres str2num InfoPic 3 Vect PositionMaxFantome str2num InfoPic 4 ok lt ST2NM gt AvantFantome str2num InfoPic 5 ApresFantome str2num InfoPic 6 FacteursFantomes str2num InfoPic 7 end if numel Avant numel Apres min Vect_PositionMax lt min Avant max Vect_PositionMax gt max Apres max Vect_PositionMax gt Longueur InfoPic Donnees erronees ok l
285. pace Fin des couloirs de migration Fin du couloir de migration pour le blanc une seule valeur dig title Entrez les informations demand es sur les couloirs de migration num_lines 1 A num2str 0 B num2str 0 C num2str 0 D num2str 0 def A B C D options Resize on options WindowStyle normal InfoCouloirs inputdlg prompt dlg title jnum lines def options if size InfoCouloirs 1 0 DebutEch str2num InfoCouloirs 1 FinEch str2num InfoCouloirs 23 FinBlanc str2num InfoCouloirs 3 end if numel DebutEch numel FinEch FinBlanc 0 InfoCouloirs Revoir le nombre d l ments par vecteur ok lt NOPTS gt end end close figure 1 Largeur Moy round mean FinEch DebutEch DebutBlanc FinBlanc Largeur Moy NbEch length DebutEch PositionDebut zeros NbLignes NbEch PositionFin zeros NbLignes NbEch for i 1 NbLignes PositionDebut i DebutEch PositionFin i FinEch end fori 1 NbEch for j 1 NbLignes im j PositionDebut j i 4 PositionDebut j 1 4 65535 im j PositionFin j i 4 PositionFin j 1 4 round 65535 2 219 end end im DebutBlanc 4 DebutBlanc 4 65535 im FinBlanc 4 FinBlanc 4 round 65535 2 figure 2 imshow im Modifier while size Modifier 1 prompt Souhaitez vous apporter des modifications aux couloirs O N dig title Correction de image num lines
286. parer ses r sultats ceux produits par trois logiciels commerciaux diff rents Le manuscrit cherche galement apporter des r ponses plusieurs questions concernant l emploi du DGGE des fins quantitatives Tel que pr sent la section 1 4 2 1 La phylog nie microbienne l re de la microbiologie mol culaire la notion d esp ce en microbiologie est intimement li e la similitude qui existe entre l ADN des diff rents organismes Le processus de formation des profils DGGE est diff rent En th orie deux s quences qui diff rent d une seule base migreront des positions diff rentes En pratique lorsque la communaut tudi e est compos e de milliers d esp ces la position de migration de plusieurs esp ces peut tre identique La similitude existant entre le processus de formation des profils DGGE et le processus de groupement des s quences d ADN en OTU n a jamais t tudi e R alisant que l approche analytique d velopp e dans le cadre de ce projet permettait de produire des r sultats similaires ceux produits en regroupant en OTU les s quences d ADN similaires 98 ou plus une m thode d longation a t d velopp e Cette m thode permet partir des RAD partielles issues de la quantification des pics DGGE et des PSR extraits des profils d estimer la diversit des communaut s bact riennes tudi es 45 4 2 A new framework to accurately quantify soil bacterial community di
287. pas n cessairement une concentration test e tant tr s d pendantes du choix des concentrations test es au laboratoire il est reconnu que l incertitude sur les NOEC et les LOEC est grande Larsen and Hauschild 2007 Certains auteurs recommandent m me de ne plus produire utiliser ces indicateurs Warne and van Dam 2008 Les ECx d termin es partir de tous les points exp rimentaux sont moins incertains tant situ au centre de la distribution l indicateur le plus robuste est sans contredit l EC5o plages d incertitudes plus troites De plus les percentiles plus faibles ou plus lev s sont d pendants du choix d une forme de distribution afin de tracer la courbe concentration r ponse Figure 1 2 Un l ment central la r alisation d essais de toxicit est le choix d une fonction suivie endpoint Cette fonction correspond au type de r ponse ayant t mesur e mortalit reproduction r duction de la taille inhibition de la germination etc Le Tableau 1 3 pr sente les r sultats obtenus par Roman et al 2007 Ces derniers ont suivi simultan ment plusieurs fonctions chez plusieurs esp ces Il existe des diff rences importantes entre les diff rents types d indicateurs et les diff rentes fonctions suivies pour une m me esp ce Au niveau des fonctions suivies un facteur de 5 peut exister chez la m me esp ce i e ECso de Chyronomus riparius pour l mergence et la survie 13 Tableau
288. pe Revoir le nombre d l ments par vecteur ok lt NOPTS gt end end for i 1 length NoEch PositionDebut NoEch PositionDebut NoEch 1 Debut i PositionFin NoEch 1 PositionFin NoEch i Fin i end end close all clear im im imread Nom 1 fori 1 NbEch for j 1 NbLignes im j PositionDebut j i 4 PositionDebut j 1 4 65535 im j PositionFin j i 4 PositionFin j i 4 round 65535 2 end end figure 2 imshow im Modifier while size Modifier 1 prompt Y a t il encore des correctifs a apporter O N dig title Correction de l image num_lines 1 def O options Resize on options WindowStyle normal Modifier inputdlg prompt dlg titlenum lines def options if strempi Modifier 1 N 0 amp amp strempi Modifier 1 0 0 Modifier end end end 223 DebutBlanc zeros NbLignes NbEch for i 1 NbLignes for j 1 NbEch DebutBlanc i j FinBlanc PositionFin 1 j PositionDebut 1 j end end VolumeBandes zeros NbLignes NbEch MoyenneBandes zeros NbLignes NbEch VolumeBlanc zeros NbLignes NbEch Blanc zeros NbLignes NbEch for i 1 NbLignes im2 double im i for j 1 NbEch VolumeBlanc i j sum im2 DebutBlanc 1 j FinBlanc Blanc i j mean im2 DebutBlanc i j FinBlanc VolumeBandes i j sum im2 PositionDebut i j PositionFin i j MoyenneBandes i j mean im2 Positi
289. peed 2800 rpm for 90 seconds with a Mini BeadBeater 8 BioSpec Products Inc Bartlesville OK USA in 650 ul of extraction buffer composed of 0 2 w v hexadecyltrimethylammonium bromide CTAB 1 mM dithioteitrol DTT 0 2 M sodium phosphate buffer pH 8 0 1 M sodium chloride and 50 mM ethylenediaminetetraacetic acid EDTA Purification steps involved polyvinylpolypyrrolidone PVPP spin columns incubation centrifugation in a 20 w v polyethylene glycol and 2 5 M NaCl solution and phenol chloroform isoamyl alcohol extraction Thakuria Schmidt Mac Siurtain Egan and Doohan 2008 DNA was recovered by ethanol precipitation Sambrook Fritsch and Maniatis 1989 Purified DNA was quality checked using a 1 w v agarose gel and quantified with a TECAN GENios fluorometer Tecan Group Ltd M nnedorf Switzerland Samples were stored at 20 C For both DGGE and Ion Torrent sequencing PCR amplification targeted the V3 region of the bacterial 16S rRNA gene with primers 341f 5 CCTACGGGAGGCAGCAG 3 and 534r 5 ATTACCGCGGCTGCTGG 3 Muyzer de Waal and Uitterlinden 1993 From the results produced by the ProbeMatch tool Cole et al 2005 with the primers amplicons of bacterial origin of lengths between 133 and 178 base pairs bp were to be expected with major peaks at 136 and 161 bp and minor ones at 138 141 and 156 bp The DGGE forward primer also contained a 40 nt GC clamp at its 5 end 5 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC
290. pi Sequence j j 1 CG 1 E E 10 elseif strempi Sequence j j 1 AC E E 10 elseif strempi Sequence j j 1 TC 1 E E 8 elseif strempi Sequence j j 1 AG E E 8 elseif strempi Sequence j j 1 TG 1 E E 7 elseif strempi Sequence j j 1 GT 1 E E 10 elseif strempi Sequence j j 1 CT 1 E E 8 elseif strempi Sequence j j 1 GA E E 8 elseif strempi Sequence j j 1 CA 1 E E 7 elseif strempi Sequence j j 1 AT 1 E E 7 elseif strempi Sequence j j 1 TT 1 E E 5 elseif strempi Sequence j j 1 AA E E 5 249 250 elseif strempi Sequence j j 1 TA E E 4 end end Len length Sequence Tm 7 31 E 16 47 log Len 33 81 if Tm lt Tmin Tmin Tm end if Tm gt Tmax Tmax Tm end PositionMax round NbPixels Tm TempMin TempMax TempMin ET ETmoy ETmoy 0 1 rand 1 0 5 Vecteurs k Vecteurs k I2 pi ET 2 1 2 exp Position PositionMax 2 2 ET 2 end end for i 1 8 Vecteurs i Vecteurs i max Nombre Nombre 1 end Max 55500 max max Vecteurs Vecteurs Vecteurs Max Matrice zeros 10240 13600 BDF 2500 for 1 1 13600 if i gt 500 amp amp i lt 1750 Matrice i Vecteurs 1 BDF elseif i gt 2000 amp amp i lt 3250 Matrice i Vecteurs 2 BDF elseif i gt 3500 amp amp 1 lt 4750 Matrice i Vecteurs 3 BDF elseif
291. ppement Economique OECD recommande l utilisation d au moins 5 niveaux de contamination diff rents OECD 1992 En r alit le facteur le plus important pour le choix du nombre et des niveaux de concentration utilis s est de s assurer que les r ponses obtenues d effet sont bien r parties entre 0 et 100 Il faut id alement obtenir au moins une concentration produisant un effet presque nul une autre pr s de 100 et quelques concentrations r parties entre 10 et 90 De cette fa on il sera possible de s assurer que la courbe concentration r ponse ajust e aux r sultats est valide sur toute la gamme de pourcentages d effet La courbe concentration r ponse proprement dite est obtenue en ajustant les param tres d une distribution de probabilit s aux r sultats des essais Plusieurs formes de distributions sont couramment utilis es lognormale log logistique Weibull types 1 et 2 etc Ritz 2010 Tel que pr sent la Figure 1 2 ces mod les diff rent surtout pour les percentiles faibles lt 20 ou lev s gt 80 Le choix du mod le utiliser d pend principalement de la qualit de l ajustement galement ces mod les se pr sentent sous plusieurs formes 2 3 ou 4 param tres Ritz 2010 Les mod les 2 param tres seront born s entre 0 et 100 et peuvent tre utilis s lorsque les donn es sont pr sent es en termes de pourcentages d effet Sinon les mod les 3 une seule borne
292. que les sols utilis s au laboratoire afin de r aliser des essais de toxicit ne soient pas repr sentatifs de ceux retrouv s dans un cosyst me donn Bien qu il soit th oriquement possible d ajuster les donn es de toxicit afin de tenir compte de la biodisponibilit des contaminants dans diff rents types de sols cet ajustement peut difficilement se faire en pratique tant donn que la composition du sol ayant t utilis afin de r aliser un essai est rarement rapport e Une difficult suppl mentaire vient du fait que pour les organismes terrestres la toxicit des contaminants s exprime de deux fa ons diff rentes Pour les organismes dits sup rieurs oiseaux et mammif res l exposition face un contaminant se fait via plusieurs voies diff rentes ingestion inhalation contact etc D s lors la toxicit des contaminants doit tre rapport e sous forme de doses quotidiennes ing r es en mg de contaminant kg de masse corporelle jour Pour les autres groupes taxonomiques plantes insectes invert br s etc puisque la voie d exposition face aux contaminants se fait majoritairement par contact direct la toxicit est rapport e sous forme de concentration dans le m dia sol ou eau Afin d int grer les deux types d indicateurs dans une m me analyse il faudrait r aliser une mod lisation multim dias afin de faire le lien entre concentration dans le sol et dose ing r e par un certain r cepteur
293. quires an acceptable estimation of community richness in order to be accurate In the course of developing the elongation framework it was observed that the accuracy of H depended on the number of rare species more than on the trajectory of the RADs Therefore as long as the predicted richness was fairly accurate using one or another abundance distribution for the RAD elongation step did not change H by more than 10 even though the correspondence between the elongated and true RADs was not very good It will therefore be important to validate that the proposed elongation framework is able to yield acceptable community richness predictions on real and more challenging samples before using these values However it will always be possible to adapt the model parameterization to different situations primer pairs studied environments etc whenever necessary A question that remains is the usefulness of traditional DGGE based diversity surveys that rely solely upon the visible peaks Tableau 4 3 clearly shows that these surveys strongly underestimate the diversity of soil bacterial communities More importantly from the diversity indices presented as supplementary material Tableau A3 3 it has been observed that these studies are susceptible to erroneous ecological conclusions often showing no differences between samples when important ones exist or sometimes predicting the opposite In conclusion the framework presented in this pape
294. r Error bars correspond to the 95 confidence intervals calculated for all the lengths in each cluster eeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeesneaees 85 Figure 6 1 DGGE migration profiles corresponding to the first replicate DNA samples extracted from soil LM and soil S were subjected to PCR for the amplification of 16S rRNA gene sequences the V3 variable region The amplicons were separated on 896 polyacrylamide DGGE with a 32 5 72 596 denaturant gradient The indices number in the sample names refer to the initial PCP concentrations in Tableau 6 2 104 Figure 6 2 Concentration response C R curves produced by the four indicators The reduction percentages were calculated from the diversity or activity of the uncontaminated samples corresponding to a 0 reduction A Simpson s 1 D B Shannon exp C Community richness D FDA hydrolytic activity For C R modeling the diversity indices calculated for the most contaminated samples were excluded from the data fitting process since these diversity increases were associated with an important PCP toxicity not shown by DGGE profiles The horizontal and vertical solid soil LM and dotted soil S lines show the position of the ECso on the x axis 105 Figure 6 3 Species sensitivity distribution produced for PCP in terrestrial ecosystems The SSD curve was drawn from the geometric mean of the ECso available for the different species belonging to four taxonomic groups Tableau 6 4 The bl
295. r Organic Soils West Conshohocken PA ASTM International 2007c ASTM Standard D4972 01 Standard Test Method for pH of Soils West Conshohocken PA ASTM International 2012 ASTM E1676 12 Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm Eisenia Fetida and the Enchytraeid Potworm Enchytraeus albidus West Conshohocken PA Baillie JEM and Upham K 2013 Species Diversity Within and Among Ecosystems In R Leemans Ed Ecological Systems pp 257 271 Springer New York 124 Becaert V Samson R and Deschenes L 2006 Effect of 2 4 D contamination on soil functional stability evaluated using the relative soil stability index RSSI Chemosphere 64 10 1713 1721 Blackwood CB Hudleston D Zak DR and Buyer JS 2007 Interpreting Ecological Diversity Indices Applied to Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Data Insights from Simulated Microbial Communities Applied and Environmental Microbiology 73 16 5276 5283 doi 10 1128 aem 00514 07 Boutin C and Rogers CA 2000 Pattern of Sensitivity of Plant Species to Various Herbicides An Analysis with Two Databases Ecotoxicology 9 4 255 Boyle D 2006 Effects of pH and cyclodextrins on pentachlorophenol degradation mineralization by white rot fungi Journal of Environmental Management 80 4 380 386 doi 10 1016 j jenvman 2005 09 017 Bu e M Reich M Murat C Morin
296. r la masse exacte ajout e 9 Fermer chaque pot avec un couvercle appropri 10 Placer les pots dans l agitateur m canique et laisser culbuter pendant 24h Remarque La surface d change du sol avec les parois de la bouteille doit tre maximale pour que la cr osote puisse s absorber dans le sol 11 Apr s les 24h d agitation ajuster le contenu en eau de l chantillon environ 60 de la capacit de r tention au champ CRC pr alablement d termin e N B 1 Attention de ne pas ajouter trop d eau le sol trop humide aura tendance s agglom rer V rifier la texture obtenue avant d humidifier les chantillons N B 2 Pour les contaminants tr s peu solubles dans l eau et des concentrations tr s lev es il peut rester sur les rebords des bouteilles une certaine quantit de contaminants R cup rer la totalit du contaminant ajout aux pots en raclant les rebords des bouteilles 12 Verser la totalit de l chantillon dans un mortier ou tout autre r cipient pr alablement lav assez gros pour contenir l chantillon et bien m langer afin d uniformiser le plus possible les chantillons 13 Pr parer une portion de 10g pour les analyses chimiques voir PE71F 201 14 R introduire les chantillons dans les bouteilles ambr es bien fermer les bouchons et conserver l abri de la lumi re SANT ET S CURIT e Porter des gants pendant la r alisation des manipulations Porter deux paires d
297. r proved to be very successful at estimating true community diversity for all nine in silico DGGE profiles analyzed Though only Shannon and Simpson s 1 D indices were evaluated the very good correspondence between all the DGGE based and true community RADs at 98 similarity leads to the hypothesis that the framework will 67 accurately estimate any diversity index influenced by community structure more than richness Imperfect in nature experimental DGGE gels are much more challenging to analyze than the image synthesized here Consequently when working with experimental results deviations from true community diversity can be expected to be higher At the moment it is not possible to provide a quantitative estimate of the expected deviation Potentially important biases in sequencing datasets often linked to sequence GC content were reported Dohm Lottaz Borodina and Himmelbauer 2008 Jaenicke et al 2011 Pinard et al 2006 Pinto and Raskin 2012 Until these issues are resolved whether or not next generation sequencing platforms offer a more solid ground than DGGE to quantitatively estimate the diversity of soil bacterial community remains an open question that deserves further attention 4 2 6 Acknowledgements The authors acknowledge the financial support of the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada The CIRAIG would also like to thank its industrial partners for their financial support ArcelorMittal B
298. ragments de longueur identique mais de composition diff rente peuvent migrer des vitesses diff rentes amplifications PCR pr sentant des bandes plut t larges Le poids mol culaire d termin par le logiciel est donc approximatif Distance Pas utilis 192 Analyse PM Poids mol culaire dendrogramme et matching Ces fonctions n ont pas t utilis es jusqu maintenant mais une fois que toutes les bandes ont t bien identifi es dans les diff rents couloirs de migration la g n ration de dendrogrammes est une m thode d analyse de la structure de la communaut microbienne des sols tr s utilis e dans la litt rature Par contre la g n ration de dendrogrammes requiert que l image ait t soigneusement corrig e et n cessite l inclusion de standards d cris ci haut diff rents endroits sur le gel afin de bien aligner les bandes Analyse Quantification La quantification des bandes pour des profils DGGE complexes est une tape ardue Le logiciel Bio 1D ne permet pas d ajuster le zoom sur les courbes d intensit ce qui ne facilite pas la t che lorsque vient le temps de d finir et s parer des bandes tr s coll es les unes sur les autres Aussi travailler sur un profil contenant beaucoup de bandes devient bien vite assez archa que Il s agit l des faiblesses les plus videntes du logiciel Soustraction du bruit de fond La soustraction du bruit de fond est une tape ayant une
299. re 30 et 40 fois Le premier cycle r alis une temp rature d environ 95 C permet de d naturer s parer les deux brins compl mentaires composant l ADN Par la suite la temp rature est r duite la temp rature d pend des amorces utilis es de facon permettre aux amorces d aller s apparier la section qui leur est compl mentaire sur les brins d ADN d natur s Finalement la temp rature est ajust e 72 C la temp rature optimale pour l enzyme Taq Thermus aquaticus polym rase Une r action enzymatique compl tera les brins d ADN sur lesquels une amorce s est fix e Chaque cycle permet th oriquement de doubler le nombre de brins d ADN contenus dans le milieu de r action 25 30 40 cycles of 3 steps ROCCO ea 1 minute 94 C 45 seconds 54 C forward and reverse primers E rz CR PA 27 MEE gt v es S Pa v 2 minute 72 C N m IW emm N only dNTP s Andy Vicotrsete 1977 Figure 1 6 Principe g n ral de l amplification PCR La premi re tape la d naturation se r alise haute temp rature et permet de s parer l ADN double brin en 2 brins simples compl mentaires La deuxi me tape l hybridation permet aux amorces d aller se coller un endroit sp cifique sur les brins d ADN Finalement l tape d longation permet la Taq polym rase de prolonger les brins d ADN partir de la fin des amorces Le processus est r p t entre 30 et 4
300. rent from the SSD and were therefore not presented The SSD curve and the C R curves corresponding to 1 D both soils and exp soil LM are highly similar The C R curve corresponding to soil S exp diverged from the SSD for percentiles higher than 50 When considering the 95 confidence intervals the five curves presented in Figure 6 3 cannot be differentiated for all the percentiles between 5 and 50 100 SSD 1 D soil LM 1 D soil S 80 exp H soil LM exp H soil S 60 40 Diversity reduction or PAF 20 0 10 100 1000 PCP concentration mg PCP kg soil Figure 6 3 Species sensitivity distribution produced for PCP in terrestrial ecosystems The SSD curve was drawn from the geometric mean of the ECso available for the different species belonging to four taxonomic groups Tableau 6 4 The black dots correspond to the ECso of these 14 species 109 6 2 5 Discussion 6 2 5 1 Using diversiy indices to model the impact of PCP towards bacterial communities The objective of our work was to evaluate the usefulness of diversity indices to measure the impact of PCP on soil bacterial communities Even though it is difficult to generalize for other contaminants the results obtained here for PCP are very promising The three diversity indices calculated in this study were between 10 and over 40 times more sensitive to PCP than the FDA hydrolysis assay The diversity based ECso in our study can also be compared to
301. resFantome a Pointsf FacteursFantomes Vecteur AvantFantome a ApresFantome a PM Vect PositionMaxFantome a x0f ETmoyen 1 E4 PM lbf SigmaMin 0 1 1E1 PM 2 ubf SigmaMax 1E11 PM 2 242 f xf Minimisation xf 1 Positionf Pointsf options optimset UseParallel always Algorithm interior point MaxFunEvals 30000 length x0f MaxIter 30000 length x0f TolFun 10E 21 ToIX 10E 18 TolCon 10E 18 xf fmincon f x0f lbfubf options AmplitudeFantome a 1 xf 2 SigmaFantome a 1 xf 1 end xOf SigmaFantome AmplitudeFantome Vect_PositionMaxFantome Ibf ones length x0f 1 ubf ones length x0f 1 Ibf 1 NbPicsFantomes 1 SigmaMin Ibf NbPicsFantomes 1 2 NbPicsFantomes 1 1EI Ibf 2 NbPicsFantomes 1 3 NbPicsFantomes 1 Vect PositionMaxFantome 1 ubf 1 NbPicsFantomes 1 SigmaFantome ubf NbPicsFantomes 1 2 NbPicsFantomes 1 AmplitudeFantome ubf 2 NbPicsFantomes 1 3 NbPicsFantomes 1 Vect PositionMaxFantome 1 Positionf min AvantFantome max ApresFantome Pointsf FacteursFantomes Vecteur min AvantFantome max ApresFantome f xf Minimisation xf NbPicsFantomes Positionf Pointsf options optimset UseParallel always Algorithm interior point MaxFunEvals 30000 length x0f MaxIter 30000 length x0f TolFun 10E 21 ToIX 10E 18 TolCon 10E 18 xf fmincon f x0f 1 lbf ubf options Sigm
302. rimordial d tre en mesure de d limiter le signal attribuable aux pics visibles et le reste du profil le plus pr cis ment possible Plusieurs approches automatis es bas es sur des algorithmes d optimisation consid rant la forme des bandes DGGE ont t d velopp es et test es mais aucune d entre elles ne fut en mesure de produire des r sultats satisfaisants pour des profils DGGE exp rimentaux D s lors il fut d termin que la meilleure et possiblement la seule approche permettant de d terminer quel niveau d intensit se situent la base des bandes visible est un ajustement manuel bas sur l observation attentive du profil L analyse des profils DGGE in silico a permis d tablir que la racine des bandes visible se situait immanquablement tr s pr s des minimums visibles sur le profil L ajustement manuel doit donc majoritairement se faire dans les zones ou les bandes sont superpos es M t t ome Hu ik E m EL 1 5E 07 1 0E 07 5 0E 06 Intensit lumineuse 0 0E 00 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Position pixel Figure 3 2 D limitation entre le signal attribuable aux esp ces abondantes pics visibles et celui attribuable aux esp ces plus rares La signification des chiffres 1 2 et 3 est expliqu e dans le texte plus bas 41 D entr e de jeu il est important de mentionner que le profil permettant de d limiter les pics d pend de la
303. rk and true community richness at a 98 similarity level This similarity level was chosen since it was found to be the one that best corresponded to the extent of DGGE peak clustering Considering that a relationship between PSR and richness is clearly visible this parameter can be thought as useful to estimate community diversity from partial DGGE based RADs 61 10000 9000 4 8000 7000 6000 5000 4000 3000 4 2000 True richness at 98 similarity 1000 0 4 20 096 T T T T 30 096 40 096 50 096 60 096 PSR cut off 1 0 Figure 4 4 PSRs extracted from the in silico DGGE profiles using the Matlab based framework compared to true community richness at 98 similarity level Calculated solely from the community dominance profile the diversity indices presented so far are known to be uncorrelated with whole community diversity Blackwood et al 2007 Tableau 4 3 illustrates the comparison between richness Shannon H and Simpson s 1 D indices calculated from DGGE based dominance profiles or elongated using the PSRs with the corresponding true indices untruncated RADs at a 98 similarity level 62 Tableau 4 3 Deviation of DGGE based diversity estimates from the indices calculated using the untruncated true RADs DGGE based indices were calculated solely from the quantified peaks with a cut off of 1 0 or using the elongated RADs Results are
304. rosequencing pipeline Cole et al 2009 Datasets were further simplified by associating the relative abundance of every OTU with a unique representative sequence ensuring that every cluster generates a unique DGGE band in the in silico profiles A total of nine communities were produced ranging in richness between 1895 and 17552 OTUs and presenting a most dominant OTU relative abundance between 1 5 and 5 4 OTUs were positioned in the profiles using DNA sequence theoretical melting temperatures Tm calculated with a published predictive model Khandelwal and Bhyravabhotla 2010 This model was selected because it gave good results over a wide range of sequence lengths 15 mers to genomic Gel conditions denaturing gradient were adjusted considering that urea and formamide reduce DNA sequence melting temperatures by 2 25 C M and 0 6 C Hutton 1977 respectively ensuring that all the sequences were included in the profiles DGGE peaks were represented in the in silico profiles by Gaussian probability density functions PDFs Eq 1 A x9 I x se 20 1 The peak corresponding to each OTU was therefore completely represented by three parameters central position on the gel xoin pixels determined from the Tm amplitude 4 in greyscale intensity proportional to the OTU relative abundance in its dataset RAD and peak width c in pixels 49 standard deviation Based on observations of experimental DGGE gels the st
305. rsit utilis s afin de quantifier la diversit des communaut s biotiques S correspond au nombre d esp ces observ es pi correspond l abondance relative de l esp ce de rang i et N correspond au nombre d individus contenus dans l chantillon ssssesesesssensssssssssssssrersssessssssen 7 Tableau 1 3 Diff rences entre type d indicateur et fonction suivie pour diff rents organismes expos s au cuivre Adapt de Roman et al 2007 Toutes les valeurs sont en mg de cuivre kg de sol 13 Tableau 1 4 Nombre de contaminants et types d indicateurs couverts par la base de donn es ECOTOX U S Environmental Protection Agency 2013 pour les cosyst mes aquatiques et terrestres Si la base de donn es contenait plus d une entr e pour une m me combinaison contaminant organisme type d indicateur i e une NOEC pour la reproduction et une NOEC pour la mortalit cette combinaison a t comptabilis e une seule fols sms E E ez tee n t Pert M ev oer eb seno Hb eee e eo RE Lt EE RR LER URN 18 Tableau 4 1 For the Matlab based framework TotalLab Quant GelCompar Il and BIO 1D optimal parameters obtained for all the samples Ball size and similarity level values were selected as those simultaneously generating APSR AH and A1 D values lower than 10 over the widest range of cut off values 57 Tableau 4 2 Parameters that made it possible to minimize indicator values when simultaneously consider
306. s 10 Ensuite l aide des pouces pousser sur l extr mit sup rieure des vitres pour s assurer que les vitres et les espaceurs sont bien plat la base De cette mani re on vite que le gel coule 176 11 Enlever la carte d alignement et visser pour s assurer que les pinces sont bien serr es IMPORTANT ne pas aller plus fort que la force des doigts pour ne pas risquer de briser les vitres 12 Presser sur les deux leviers de chaque c t du support vers le centre du gel et les abaisser tourner a 180 Le montage devrait s enfoncer dans la bande ponge 13 Si le montage est herm tique l eau la surface du caoutchouc devrait s tre propag e galement le long des vitres Levier Levier Figure A1 4 Support pour le gel sandwich Pr paration du gel DGGE Le port de gants est obligatoire lors de la pr paration du gel DGGE partir des solutions stock d acrylamide contenant 096 et 8096 d ur e pr par es auparavant pr parer les deux solutions d acrylamide permettant d obtenir un gel couvrant l chelle de d naturant appropri e pour l chantillon voir les deux tableaux l annexe 1 Pour les communaut s tudi es dans ce projet des solutions ayant des concentrations de 32 5 et 72 5 sont pr par es Pour pr parer chacune des deux solutions 1 Avec une pipette gradu e de 25ml pr lever la quantit n cessaire voir Tableau A1 3 en annexes de la solution 0 d ur e et la
307. s es du type d enzyme employ ainsi que de la r gion amplifier G C Ces conditions doivent tre optimis es MAT RIEL Tubes microcentrifuges eppendorf 0 5 et 1 5 ml Fisher Scientific Embouts pour pipette st riles Seringue de 1 ml Filtre millipore st rile de 0 22 um Support a tubes microcentrifuges Pipettes P2 P20 P200 et P1000 H20 st rile Solution BSA bovine serum albumin Sigma cat A 2153 Solution d amorces 10pmoles ul Alpha DNA Phusion High Fidelity PCR Master Mix Thermo Scientific cat no F 532L Solution de MgCl 100mM Agarose Invitrogen cat no 15510 027 Bromure d thidium 10 mg ml Sigma cat no E1510 10ml ATTENTION SUBSTANCE HAUTEMENT TOXIQUE EZ Load Precision Molecular Mass Standard Bio Rad cat no 170 8356 Solution tampon TAE 50X Tris acide ac tique EDTA Appareil lectrophor se Power Pac Basic 300V 400mA 75W BIO RAD Support lectrophor se MINI SUB amp CELL GT BIO RAD Appareil PCR Techne Genius FGENO2TP Kit d extraction de gel GenElute Gel Extraction kit Sigma cat NA1111 optionnel 162 e Ethanol 100 e Spatule m tallique ou scalpel optionnel METHODOLOGIE Pr paration de la solution BSA 1 A la balance peser directement dans un tube eppendorf 1 5 ml 20 mg de BSA 2 l aide d une pipette P1000 ajouter 1 ml d eau d ionis e et agiter en effectuant un mouvement de va et vient avec la pip
308. s de PCP et de tribromophenol 1 A la balance peser directement dans un b cher de 25 ml 0 0250g de PCP et 0 0250 g de 2 4 6 tribromophenol Solubiliser avec environ 15 ml d hexane et transf rer quantitativement dans un ballon de 25 ml On obtient une solution m re de 1 g L l aide d une seringue Hamilton de 5 ml pr lever 2 5 ml de la solution m re et transf rer dans un ballon de 25 ml Compl ter au trait de jauge avec de l hexane On obtient une solution m re de 100 mg L Pr parer les standards de PCP et tribromophenol 0 2 5 5 7 5 et 10 mg L de la fa on suivante Pr parer le standard 0 mg L avec de l hexane Pr parer le standard 2 5 mg L en pr levant 6251 de chaque solution m re avec une seringue Hamilton de 1000ul et transf rer dans un ballon de 25 ml puis compl ter au trait de jauge avec de l hexane Pr parer le standard 5 mg L en pr levant 1 25ml de chaque solution m re avec une seringue Hamilton de 2 5ml et transf rer dans un ballon de 25 ml puis compl ter au trait de jauge avec de l hexane Pr parer le standard 7 5 mg L en pr levant 1 88ml de chaque solution m re avec une seringue Hamilton de 2 5ml et transf rer dans un ballon de 25 ml puis compl ter au trait de jauge avec de l hexane Pr parer le standard 10 mg L en pr levant 2 5ml de chaque solution m re avec une seringue Hamilton de 2 51 et transf rer dans un ballon de 25 ml puis compl ter au trait de jauge
309. s de diversit sont plus sensibles au pentachloroph nol que certains indicateurs fonctionnels et que la r ponse des communaut s bact riennes face une exposition au pentachloroph nol tait tr s similaire la r ponse des communaut s macroscopiques terrestres expos es la m me substance Si ces observations peuvent tre g n ralis es sur plus de contaminants l approche propos e dans cette th se constituera un outil excessivement puissant afin de mieux comprendre l effet des contaminants ou des m langes complexes sur les communaut s biotiques terrestres Et si cette similitude est tout simplement fortuite le cadre de travail pr sent dans cette th se sera tout de m me en mesure de produire de l information cotoxicologique sur les communaut s bact riennes arch ennes et fongiques des sols trois groupes absents des bases de donn es cotoxicologiques Xil ABSTRACT Soil microbial communities are among the most diversified on Earth and play key roles in many soil mediated functions such as biogeochemical cycles and xenobiotics degradation Affecting this diversity soil contamination constitutes an important risk having the potential to reduce the capacity of terrestrial ecosystems to resist and recover from the many natural and anthropogenic perturbations that they must undergo As many authors have shown diversified ecosystems are more resistant and resilient to perturbations and diversity is an asset that must be
310. s de l chelle d ADN utilis e typiquement pour 5ul d EZ load 10 20 50 70 et 100ng S lectionner le num ro du couloir correspondant l chelle d ADN La courbe de calibration devrait alors apparaitre dans le graphe gauche de la fen tre Le type de courbe de calibration peut tre choisi par l utilisateur Exp rimentale Lin aire Liss e et Logarithmique S lectionner le type de r sultat exporter vers Excel concentration volume et les couloirs pour lesquels les r sultats doivent tre export s L option Concentration ne sera disponible que si des marqueurs sont disponibles 195 Cliquer sur la fl che verte tout en bas droite de l cran afin d exporter les r sultats sur Excel Le reste de l analyse doit tre r alis en utilisant Excel Publication Cette option n est pas utilis e R F RENCE S Manuels de r f rence fournis lors de l achat des appareils conserv s dans un classeur au laboratoire dans le tiroir identifi quipement Documentation dans le dossier Syst me d imagerie 196 4 CIRAIG Centre Interuniversitaire de R f rence sur l Analyse l Interpr tation et la Gestion du cycle de vie des produits proc d s et services PROTOCOLE EXP RIMENTAL Protocole PE71E Nombre de pages 5 Version 3 Date 28 07 2009 Auteur s Jonathan Lalande Approuv par Signatures Date Lucie Jean Dx
311. s distorsions dans les r sultats de chacune des approches Ainsi il a t montr que le fait d injecter une grande quantit d ADN 400 ng dans les puits DGGE risquait de causer une saturation locale du gel Cette saturation qui survient dans les r gions du gel o une grande quantit d ADN migre peut emp cher les bandes DGGE les plus brillantes d atteindre leurs intensit s maximales Injecter moins d ADN 200 ng a permis de r gler les probl mes li s la saturation des gels La situation s est av r e tre plus complexe pour les r sultats g n r s par l Ion Torrent Utilis e la limite de ses capacit s la qualit des r sultats de s quen age produits par cette plateforme fut probl matique Ainsi des distorsions li es la faible profondeur de s quen age atteinte et aux erreurs de s quengage furent identifi s De plus il a t qualitativement montr que le pourcentage GC des s quences risquait de causer des distorsions intra chantillons dans l abondance relative des esp ces Le fait de r duire l influence de ces distorsions sur les estim s de diversit produits par chaque approche a permis l obtention de corr lations significatives R gt 0 81 entre les deux s ries de donn es Lorsqu utilis es des fins comparatives ces deux technologies peuvent donc mener des r sultats quantitativement similaires Lors de la construction des courbes concentration r ponse partir des indices de divers
312. s manuellement et soigneusement Les bandes peuvent tre d finies soit en cliquant directement sur l image la gauche de l cran ou encore en cliquant sur la courbe d intensit la droite de l image Afin de bien discerner les bandes il est possible de jouer sur la brillance de la photo Optimum display en bas au centre de l cran ou encore sur le zoom Une fois les bandes d finies il est possible de corriger la migration aligner les diff rents couloirs si des standards ont t inclus dans le gel par exemple un m lange de l ADN de quelques souches pures inject au d but au centre et la fin du gel Valeurs du marqueur Cette section s applique uniquement pour l analyse des gels d agarose PCR Cliquer sur diter le marqueur et entrer successivement le poids mol culaire de tous les fragments pr sents dans l chelle d ADN utilis Pour le EZ load il s agit de 100 200 500 700 et 1000bp Indiquer dans quel couloir de migration a t inject le standard En fonction de la position des bandes correspondant l ADN amplifi il sera possible de d terminer la taille des fragments amplifi s Attention La vitesse de migration de l ADN dans un gel est inversement proportionnelle au log du poids mol culaire du fragment D s lors un petit fragment migrera plus rapidement qu un long fragment Aussi comme le poids mol culaire des nucl otides A T G et C sont diff rents des f
313. s0003 Huse SM Welch DM Morrison HG and Sogin ML 2010 Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering Environmental Microbiology 12 7 1889 1898 doi 10 1111 1462 2920 2010 02193 x 129 Hutton JR 1977 Renaturation Kinetics and thermal stability of DNA in aqueous solutions of formamide and urea Nucleic Acids Research 4 10 3537 3555 doi 10 1093 nar 4 10 3537 Imfeld G and Vuilleumier S 2012 Measuring the effects of pesticides on bacterial communities in soil A critical review European Journal of Soil Biology 49 0 22 30 doi http dx doi org 10 1016 j ejsobi 2011 11 010 Inceoglu O Al Soud WA Salles JF Semenov AV and van Elsas JD 2011 Comparative Analysis of Bacterial Communities in a Potato Field as Determined by Pyrosequencing PLoS ONE 6 8 e23321 doi 10 1371 journal pone 0023321 Jaenicke S Ander C Bekel T Bisdorf R Dr ge M Gartemann K H Goesmann A 2011 Comparative and Joint Analysis of Two Metagenomic Datasets from a Biogas Fermenter Obtained by 454 Pyrosequencing PLoS ONE 6 1 e14519 doi 10 1371 journal pone 0014519 Jensen J Smith SR Krogh PH Versteeg DJ and Temara A 2007 European risk assessment of LAS in agricultural soil revisited Species sensitivity distribution and risk estimates Chemosphere 69 880 892 Jost L 2006 Entropy and diversity Oikos 113 2 363 375 doi 10 1111 2006 0030 1299 1471
314. scopique que macroscopique dans la capacit des cosyst mes naturels fonctionner long terme malgr les diff rentes perturbations naturelles et anthropiques que ces derniers doivent subir En ayant un effet n gatif sur la biodiversit la contamination des cosyst mes naturels risque galement de r duire la capacit de ces derniers supporter de futures perturbations Afin d viter que les activit s humaines aient des effets inacceptables sur les cosyst mes diff rents outils tels que l ARE et l ACV ont t d velopp s Une limitation importante l application de ces outils est la disponibilit des donn es cotoxiques qui font particuli rement d faut pour les cosyst mes terrestres Consid rant qu ils sont virtuellement absents des bases de donn es cotoxiques la g n ration de donn es de toxicit sp cifiques aux microorganismes du sol constitue un moyen permettant de s attaquer cette probl matique Vu l importance de ces communaut s dans les cosyst mes tant du point de vue de leur diversit que de celui de leur importance fonctionnelle ces donn es constitueraient de l information hautement pertinente afin de mieux comprendre l effet des contaminants en milieux terrestres Pour ce faire plusieurs indicateurs pourraient tre utilis s Parmi ceux ci une mesure de toxicit bas e sur la diversit g n tique des communaut s microbiennes dans les sols pr sente plusieurs avant
315. scrit Le second manuscrit a permis d tablir qu une corr lation lin aire significative existe entre les estim s de diversit produits partir du DGGE et de l Ion Torrent pour la richesse ainsi que pour les indices de Shannon exp et de Simpson 1 D Puisque la diversit r elle des communaut s tudi es dans le second manuscrit n tait pas connue il n est pas possible d affirmer que l une ou l autre des approches a la capacit de produire des estim s de diversit quantitativement repr sentatifs des communaut s tudi es Par contre la d termination de l effet cotoxique du PCP requiert de comparer la diversit de deux chantillons sol propre vs sol contamin Dans cette optique puisque les indices de diversit des deux approches taient significativement corr l s l utilisation de l une ou l autre des techniques m nerait des conclusions cologiques similaires D s lors la m thode d longation des RAD DGGE a t utilis e afin de d terminer l effet du PCP sur les communaut s bact riennes des sols Afin de pouvoir comparer la r ponse obtenue partir des indices de diversit celle g n r e par l utilisation d un indicateur fonctionnel le potentiel d activit hydrolytique de la FDA des chantillons de sol a galement t d termin Cet indicateur a t choisi puisqu il se mesure rapidement facilement et qu il est corr l aux mesures de biomasse microbienne un
316. sed to produce the 200 ng well gels led to simplified profiles fewer weak bands 52 5 2 Challenges associated with Ion Torrent sequencing In this paper the challenges associated with the use of the Ion Torrent PGM to study the diversity of soil bacterial communities were all related to the quality of the sequences The shape of the 90 predicted per base quality score produced from the current dataset was highly similar to what Loman et al 2012 observed However in this case the decrease in base quality was observed at a lower length than what was presented by the authors at position 100 instead of 125 This 25 base difference seems to correspond to the length of the forward primer and barcodes used in this study The Ion Torrent PGM was reported to generate indel errors at a rate of 1 5 per 100 bases Loman et al 2012 Furthermore Quail et al 2012 reported a similar error rate of 1 78 per 100 bases Considering that the average length of the sequences was higher in this paper than those reported in the two publications and that the average per base quality was low for all the positions greater than 100 the error rate in the Ion Torrent dataset used in this publication is probably slightly higher than what was previously reported though it cannot be quantified To tackle sequencing error difficulties a pseudo single linkage clustering algorithm was applied with dissimilarity levels of 2 3 and 4 Huse et al 2010 Depe
317. si que l utilisation du logiciel d analyse d image Bio 1D qui offre plusieurs options non inclus dans le logiciel Quantum Capt Ces logiciels peuvent tre utilis s entre autres afin de photographier et d analyser des gels d agarose v rification des extractions d ADN et des amplifications PCR et d acrylamide DGGE Pour de plus amples informations consulter les manuels d instruction de l appareil et des logiciels 185 MATERIEL e Syst me d imagerie Quantum ST4 e Logiciel Quantum Capt e Logiciel Bio 1D e Eau d ionis e e Tissus Kimwipes ou linge propre METHODOLOGIE Mise en marche et pr paration du syst me d imagerie Roulette permettant de choisirle filtre appropri 1 SYBR green 2 Bromure d thydium Lumi re blanche Lumi re permanente m me sl la porte est ouverte Lumi re UV Bouton de mise en marche Figure A1 7 Photo du syst me d imagerie Quantum ST4 et positionnement des boutons de contr le PORTER DES GANTS LORS DE TOUTES VOS MANIPULATIONS les colorants utilis s afin de visualiser l ADN sur les gels s intercalent g n ralement dans le double brin de l ADN g n rant ainsi une fluorescence mesurable Elles ont donc le potentiel de s intercaler dans n importe quel double brin d ADN 1 Appuyer sur le bouton de mise en marche de l appareil ainsi que sur le bouton Lumi re UV Ne pas enfoncer galement le
318. st essentiel lorsqu on manipule les solvants et la solution de SYBR gold 183 ANNEXE Tableau A1 3 DGGE 8 avec gel d empilement Volume requis par solution mL Gradient Volume solution 0 Volume solution 80 0 18 5 0 0 2 9 17 9 0 6 5 17 3 1 2 7 5 16 8 1 7 10 16 2 2 3 12 5 15 6 2 9 15 15 0 3 5 17 5 14 5 4 0 20 13 9 4 6 22 5 13 3 5 2 25 12 7 5 8 27 5 12 1 6 4 30 11 6 6 9 32 5 11 0 7 5 35 10 4 8 1 37 5 9 8 8 7 40 9 3 9 3 42 5 8 7 9 8 45 8 1 10 4 47 5 7 5 11 0 50 6 9 11 6 52 5 6 4 12 1 55 5 8 12 7 57 5 5 2 13 3 60 4 6 13 9 62 5 4 0 14 5 65 3 5 15 0 67 5 2 9 15 6 70 2 3 16 2 72 5 1 7 16 8 75 1 2 17 3 77 5 0 6 17 9 80 0 0 18 5 Centre Interuniversitaire de R f rence sur l Analyse l Interpr tation et la Gestion du cycle de vie des produits proc d s et services 4 CIRAIG Qs Universite dh eH de Montr al montrent Ille PROTOCOLE EXP RIMENTAL Protocole PE71D Nombre de pages 12 Version 1 Date 25 04 12 Auteur s Jonathan Lalande Approuv par Lucie Jean Signatures Date Titre Utilisation de l imageur Quantum STA et des logiciels de capture et d analyse d image Quantum Capt et Bio 1D Mots cl s Quantum STA imageur Quantum Capt Bio 1D PCR DGGE OBJECTIF 184 Ce protocole d crit l utilisation du syst me d imagerie Quantum ST4 du logiciel de capture d image Quantum Capt ain
319. st possible de voir des r gions o aucune bande n est visible La courbe de soustraction du bruit de fond devrait donc tre assez ajust e sur les profils ces endroits Par la suite il suffit de relier les points et d ajuster une courbe permettant de conserver une logique entre la hauteur relative des pics diff rents endroits sur un profil donn Les pics majeurs doivent tre majeurs les pics mineurs doivent tre mineurs et l importance relative des pics majeurs vis vis des pics mineurs doivent respecter une certaine logique visuelle Cette m thode si appliqu e correctement est privil gier Soustraction de bruit Vall e vall e Piste C Num ro de la piste e Toutes les pistes Mode d affichage du profil Minimum maximum S Proflmoyen C Profil complet Figure A1 12 Soustraction du bruit de fond l aide de l option Vall e vall e Cliquer sur Profil moyen en bas et au centre de l cran Choisir le num ro de couloir pour lequel le bruit de fond doit tre soustrait Ajuster les extr mit s de la line verte avec le d but et la fin du profil Cliquer plusieurs endroits sur le profil afin de diviser la ligne verte en plusieurs sections Ajuster toutes les sections de cette ligne afin de former un profil de soustraction Appuyer sur D bruiter Optionnel Si le bruit de fond est commun tous les couloirs gels d agarose avec le produit PCR par exempl
320. stance et ou r silience des cosyst mes face diverses perturbations La r sistance et r silience peut tre d finie comme la capacit d un cosyst me maintenir ses fonctions suite une perturbation r sistance ainsi que sa capacit r cup rer suite une perte de fonction r silience L importance de la diversit sur la stabilit fonctionnelle des cosyst mes a t tabli autant au niveau macroscopiques Hooper et al 2005 que microscopique Deng 2012 Girvan Campbell Killham Prosser and Glover 2005 Par contre le lien diversit stabilit n est pas direct Incidemment la stabilit d un cosyst me d pendrait d une s rie de facteurs biotiques et abiotiques Griffiths and Philippot 2013 Globalement la biodiversit promeut la stabilit en assurant une redondance fonctionnelle dans les cosyst mes Puisque plusieurs esp ces peuvent remplir le m me r le la perte d une esp ce peut tre compens e par une autre esp ce Cleland 2012 De cette discussion il est possible de d duire qu il est tr s difficile de pr dire la cons quence d une perte de biodiversit sur les fonctions d un cosyst me Ainsi la perte d une esp ce cl peut elle seule entra ner de graves cons quences Bien que le lien quantitatif entre biodiversit fonction et stabilit ne puisse tre tabli une perte de diversit peut tout de m me tre consid r e comme un risque pouvant terme mener une p
321. stimation de la diversit r elle des communaut s Les indices les plus fr quemment utilis s dans la litt rature sont la richesse l indice de Shannon H et dans une moindre mesure l indice de Simpson D ou 1 D Ces trois indices accordent un poids bien diff rent aux esp ces rares et abondantes un extr me la richesse accorde exactement le m me poids toutes les esp ces L indice sera donc fortement influenc par les esp ces rares et accordera tr s peu de poids aux esp ces abondances L autre extr me est repr sent par l indice de Simpson En tant qu indice de dominance Simpson accorde beaucoup plus de poids aux esp ces abondances et est tr s peu affect par les esp ces rares et ultimement par la richesse de la communaut L indice de Shannon exprim sous sa forme exp est en quelque sorte un interm diaire entre la richesse et Simpson Hill Walsh Harris and Moffett 2003 Selon Jost 2006 tous les indices de diversit ne peuvent pas tre utilis s afin de comparer quantitativement la diversit de deux communaut s Ce dernier soutient qu afin de produire des r sultats intuitifs les indices doivent tre transform s afin de repr senter un nombre d esp ces effectif Pour un indice donn le nombre d esp ces effectif se d termine en valuant quelle richesse permettrait d obtenir exactement la m me valeur num rique d indice si toutes les esp ces avaient la m me abondance relative Cela permet d
322. t galement majoritairement des ECso et d autres ECx indicateurs jug s plus fiables que les NOEC et LOEC Warne and van Dam 2008 La Figure 1 4 obtenue en r pertoriant le nombre d esp ces diff rentes test es pour chaque contaminant montre clairement que peu de connaissances toxicologiques existent quant l effet des contaminants dans les cosyst mes et ce peu importe le type de milieu Effectivement pour la majorit des contaminants des donn es n existent que pour ou 2 esp ces diff rentes Pour les organismes terrestres contact directs les quelques 600 contaminant bien tudi s gt 10 organismes test s accaparent 90 de toutes les donn es disponibles Pour l aquatique la r partition est semblable 84 des donn es concernent 1200 contaminants bien tudi s 19 JI e o Bi Contact direct Lo Un P Mam mif res Oiseaux lo e wo o OA quati ques n z S E Lo S 20 o Q im lt z tp Un So o e o o Un e e o E ar aun 2n me 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 et Nombre d organismes test s Figure 1 4 Nombre de donn es cotoxiques disponibles pour chaque contaminants r pertori es au Tableau 1 4 Les r sultats sont pr sent s sous forme de pourcentage du nombre total de contaminants Les donn es terrestres sont peu nombreuses mais galement peu diversifi
323. t taxonomique semble tre une mesure permettant de comparer l effet de contaminants ayant des modes d action diff rents De plus il s agit d une mesure qui s int gre tr s bien la mod lisation SSD qui cherche quantifier la proportion des esp ces d un cosyst me affect es par un contaminant plut t que de pr dire une perte de fonction de l cosyst me La similitude observ e dans le troisi me manuscrit entre les courbes concentration r ponse trac es partir des indices de Shannon exp ou de Simpson 1 D et la SSD est un r sultat pr sentant un fort potentiel Il serait ais d affirmer que cette correspondance n est que fortuite Par contre tant donn tr s grande diversit g n tique et m tabolique des communaut s bact riennes pr sente dans les sols il n est pas impossible que la gamme de sensibilit des diff rentes esp ces bact riennes face un contaminant soit repr sentative de la gamme de sensibilit des esp ces dites sup rieures expos es au m me contaminant D s lors il sera int ressant de tenter d tendre ces observations d autres substances que le PCP Si une telle similitude peut tre tablie pour certaines classes de contaminants ou pour les contaminants agissant selon certains modes d action toxique l utilisation du mod le d longation pr sent dans cette th se pourrait avoir un apport majeur aux domaines de l analyse de risque environnemental et de l analyse du cycle
324. t NOPTS gt end if numel Vect_PositionMaxFantome numel AvantFantome numel Vect_PositionMaxFantome numel AvantFantome min Vect_PositionMaxFantome lt min AvantFantome max Vect_PositionMaxFantome gt max ApresFantome max Vect_PositionMaxFantome gt Longueur InfoPic Donnees fantomes erronees ok lt NOPTS gt end end NbPics length Vect_PositionMax 233 AcceptationPic 1 while AcceptationPic if numel Vect_PositionMax numel Avant Avant Avant Apres Apres Avant zeros 1 numel Vect PositionMax Apres zeros 1 numel Vect PositionMax Avant 1 Avantl Apres end Apres for i 2 mumel Vect PositionMax Indice min Vecteur Vect PositionMax i 1 Vect PositionMax 1 Indice Indice Vect_PositionMax i 1 Apres i 1 Indice Avant i Indice 1 end end NbPics Vect_PositionMax Avant Apres Vect_PositionMaxFantome AvantFantome Apres Fantome FacteursFantomes Vect_PositionMax Amplitude_1 Sigma_1 PFantome NormaleDeuxPics NbPics Vect_PositionMax Avant Apres Vecteur Vect_PositionMaxFantome AvantFantome ApresFantome FacteursFantomes P zeros Longueur NbPics for a 1 NbPics P a Amplitude_1 a 2 pi Sigma_1 a 2 1 2 exp Rang Vect PositionMax a 2 2 Sigma 1 a 2 end P2 sum P 2 P3 P2 PFantome Volumes sum P 1 if min Avant gt 100 Min min Avant 100 else Min 1 end if m
325. t chapitre 5 3 1 D limitation et soustraction du bruit de fond L analyse des profils DGGE d bute par la d limitation et la soustraction du bruit de fond de l chantillon Tel que pr sent la Figure 3 1 les profils DGGE correspondant des sols non contamin s sont complexes pr sentent une forte superposition des bandes ainsi qu un bruit de fond important La nature imparfaite des profils DGGE exp rimentaux complique galement la situation 39 2 E 07 2 E 07 2 E 07 2 E 07 2 LE 07 3 E407 5 1 E 07 2 8 E 06 S 6E 06 4 E 06 2 E 06 0 E 00 T T T T T T T T T T 1 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Position pixel Figure 3 1 Profil DGGE et courbe d intensit lumineuse en niveaux de gris associ e Sur le graphique la courbe visible une intensit lumineuse de 4 10 correspond un profil DGGE o un chantillon PCR ne contenant pas d ADN a t inject Afin de faciliter l analyse les images de gels DGGE sont redimensionn es en utilisant un facteur de 10 10 240 pixels au lieu de 1024 Il a effectivement t observ ce redimensionnement facilitait la convergence du script d optimisation d crit la section 3 2 La premi re tape de l analyse consiste soustraire la portion de signal correspondant au bruit de fond Puisque l intensit de base li e au profil des chantillons analyser est plus lev e que celle g n
326. t donc un facteur qui d terminera quelles esp ces seront consid r es lorsque le produit amplifi sera analys Les tudes de diversit utilisent g n ralement des amorces dites universelles qui ciblent simultan ment un tr s grand nombre d esp ces L outil en ligne probeBase maintient une liste des 24 amorces pouvant tre utilis es afin d tudier les arch es et les bact ries Loy Maixner Wagner and Horn 2007 La sp cificit des amorces peut tre v rifi e l aide de TestPrime Klindworth et al 2013 ou Probe Match Cole et al 2009 qui v rifient quelles sont les esp ces bact riennes ou arch ennes contenues dans les bases de donn es qui seront cibl es par les deux amorces choisies Ces outils en ligne permettent galement de savoir quelle sera la longueur approximative des s quences amplifi es Il est important de mentionner qu il n existe pas d amorces permettant de cibler simultan ment les communaut s bact riennes arch ennes et fongiques constituant la communaut microbienne d un sol Les amorces offrent g n ralement une couverture lev e 96 des esp ces cibl es pour un groupe donn et cibleront galement quelques esp ces provenant des autres groupes Par contre la longueur des fragments amplifi s chez les diff rents groupes sera g n ralement variable Tel que pr sent la Figure 1 6 l amplification PCR est r alis e partir d un cycle de trois tapes r alis ent
327. t generation sequencing techniques Simon and Daniel 2011 the methods remain costly and inaccessible to many researchers Denaturing gradient gel electrophoresis DGGE is a widespread technique that was used to compare and differentiate soil bacterial communities in numerous situations Among others it was successfully used to monitor temporal variations in bacterial communities Lopes et al 2011 70 differentiate between agricultural practices Lopes et al 2011 Rahman Okubo Sugiyama and Mayland 2008 and evaluate the impact of inorganic Lorenz et al 2006 Xie et al 2011 and organic Marti et al 2011 Zielezny et al 2006 contaminants on soil bacterial community diversity However at their sensitivity threshold it was demonstrated that fingerprinting techniques such as DGGE yield estimates that are not correlated with the true diversity of the communities Blackwood et al 2007 Recently a new framework that makes it possible to generate accurate diversity estimates of soil bacterial communities from DGGE was published Lalande Villemur and Deschenes 2013 This framework associates the visible DGGE bands to dominant species and links the background noise found under the profiles to the many subdominant phylotypes Indeed using the peak to signal ratio PSR parameter partial rank abundance distributions RADs drawn from DGGE peaks quantification are corrected and then elongated in order to reproduce the true com
328. t20 Miscall end end break end end end end end end size Echl size Ech2 size Ech3 size Ech4 size Ech5 size Ech6 size Ech7 size Ech8 fastawrite Ech1 fasta Ech1 fastawrite Ech2 fasta Ech2 fastawrite Ech3 fasta Ech3 fastawrite Ech4 fasta Ech4 fastawrite Ech5 fasta Ech5 273 fastawrite Ech6 fasta Ech6 fastawrite Ech7 fasta Ech7 fastawrite Ech8 fasta Ech8 fastawrite Quall fasta Quall fastawrite Qual2 fasta Qual2 fastawrite Qual3 fasta Qual3 fastawrite Qual4 fasta Qual4 fastawrite Qual5 fasta Qual5 fastawrite Qual6 fasta Qual6 fastawrite Qual7 fasta Qual7 fastawrite Qual8 fasta Qual8 Tous C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 fastawrite JonathanM2 fasta Structure fastawrite JonathanM2 qual Quality 274 Nom du fichier InfluenceNbSeq m Description Cet algorithme permet d aller lire les distributions rang abondance se trouvant dans un fichier Excel et de proc der un pige al atoire sans replacement afin de d terminer l influence de la profondeur de s quen age sur les indices de diversit calcul s l aide des nouvelles technologies de s quen age Ce code pourrait galement tre utilis afin de normaliser la taille de diff rents fichiers de s quen age Auteur Jonathan Lalande clear all close all clc Dist xlsread RAD Mothur xlsx P C 3 A1 H150
329. than the widespread rolling ball approaches Lalande Villemur et al 2013 Banding patterns were then analyzed using Gaussian probability density functions to represent the peaks Partial rank abundance distributions RADs originating from peaks quantification were first truncated using a cut off value 1 0 that enabled the removal of the peaks that were too small to be considered representative of the communities true dominance profiles Using the peak to signal ratio PSR 74 a parameter extracted from the DGGE profiles and related to community richness Loisel et al 2006 truncated RADs were elongated in order to include in the diversity assessment the species that were not abundant enough to produce a visible band on the gel Designed to infer from the DGGE profiles the RADs that would be produced by sequencing datasets containing 35 000 reads this elongation framework yielded diversity indices that were highly similar to the clustering of the sequencing datasets at the 98 similarity level Please refer to the original publication for a more complete description of the entire profile analysis and elongation Lalande Villemur et al 2013 5 2 3 4 16S rRNA gene amplicon sequencing and bioinformatic analysis Prior to emulsion PCR amplification products intended for sequencing were purified on agarose gels using a GenElute gel extraction kit Sigma Aldrich St Louis MO USA and quantified using a PicoGreen double stranded
330. tify peaks was an interesting feature since it made it possible to determine the bands generated by two almost co migrating OTUs However the consistency of the framework was mostly associated with the manual adjustment of the background profiles that made it possible to treat every sample equally while rolling ball approaches proved to be highly dependent on how peak superposed in the profiles It must be acknowledged that this approach was long and challenging at first and thus required some training Working with in silico DGGE gels proved to be a very good way of producing such training sets Indeed real DGGE gels shared a lot of similarities with in silico profiles even if they are imperfect and therefore more challenging The cut off value that had to be applied to DGGE based RADs in order to match true RADs was surprisingly high 1 0 for the Matlab based framework Indeed more than half of the quantified 64 peaks are subtracted when using such a high cut off value In fact bands superposition was found to happen quite locally and background profiles varied irregularly throughout the profile lengths For the datasets used for this publication the background was high at the profiles center but low at their beginnings and ends Consequently rather rare OTUs will generate distinct peaks in regions where background is low while more abundant OTUs migrating in regions of high background will not These weak bands therefore generated div
331. ting was done as described above To quantitatively compare the different indicators the PCP concentrations corresponding to distribution percentiles of 5 10 and 50 ECs ECio and ECso were extracted from the C R and SSD curves The 95 confidence intervals associated with these percentiles were approximated using the delta method which yielded accurate results in similar situations Demidenko Williams Flood and Swartz 2012 6 2 4 Results 6 2 4 1 Using diversiy indices to model the impact of PCP towards bacterial communities Two soils were contaminated with increasing concentrations of PCP Tableau 6 2 and incubated for 28 days The two soils were chosen to assess the influence of physico chemical properties on the impact of PCP on soil bacterial communities Indeed the bioavailability and as such the toxicity of PCP were proven to be influenced by the pH Arcand et al 1995 and composition Marti et al 2011 Puglisi et al 2009 of the soils After the incubation period the soil microcosms were sampled to measure the FDA hydrolytic activity and extract total DNA From this DNA the bacterial diversity profiles were derived by PCR DGGE Figure 6 1 Even if they were produced from independently contaminated samples the DGGE migration profiles were highly replicable not shown As PCP concentrations increased bright bands probably corresponding with bacteria populations able to tolerate or degrade PCP appeared in the profiles
332. tion D brancher les fils du bloc d alimentation Retirer le support lectrophor se de la cuve Retirer le gel toujours contenu entre les pinces sandwich du support lectrophor se D visser doucement les pinces sandwich et retirer les deux vitres Soulever la petite vitre l aide d un des espaceurs 182 7 En laissant le gel sur la grande vitre couper les puits et faire une marque oblique sur le coin droit avec un des espaceurs Ceci permettra de reconnaitre les puits du gel 8 Renverser le gel sur une pelicule de plastique rigide ac tate le coin oblique se retrouve gauche et devra rester ainsi jusqu la fin de la prise de photo 9 Glisser la pellicule de plastique et le gel dans une solution de SYBR gold ATTENTION Porter des gants 10 Colorer en agitant sur une plaque rotative pendant 30 min 11 Retirer la pellicule et le gel du bassin d eau et prendre la photo sous UV voir protocole PE71D pour le fonctionnement de l appareil Quantum STA Nettoyage du mat riel Vitres espaceurs ponge caoutchouc et peigne eau savonneuse rincer eau robinet rincer avec de l H20 milli Q rincer avec de l thanol et essuyer 2 Pince sandwich support migration et contr leur de temp rature rincer avec de l H 0 milli Q 3 Cuve rincer l eau du robinet et ensuite l eau milli Q R F RENCE S Villemur Richard Protocoles de l institut Armand Frappier RECOMMANDATION S Le port des gants e
333. tion et pousser jusqu ce que l on entente un clic assez fort S il y a un deuxi me gel faire les quatre derni res tapes S il n y a pas d autre gel placer deux vitres ensemble une petite et une grande sans espaceurs les faire retenir l aide des pinces sandwich et fixer les pinces sandwich de l autre c t du support migration Pousser jusqu ce que l on entende un clic assez fort Placer le support migration avec le gel dans la cuve migration il y a un c t la position du support le point rouge doit toujours tre droite de la cuve S il est mal plac il ne pourra pas entrer Replacer le couvercle contr leur de temp rature Les boutons de la temp rature et de la pompe doivent tre ouverts La pompe permettra de remplir le bassin sup rieur Laisser quilibrer le gel dans le tampon pendant 1 heure Pendant ce temps il est possible de commencer la pr paration des chantillons voir la section suivante Pr paration des chantillons 1 Dans un tube eppendorf de 1 5ml ajouter avec une micropipette un maximum de 200 ng de mat riel g n tique provenant des amplifications PCR voir protocole PE71C par chantillon observer La quantit d ADN injecter peut tre optimis e en fonction des communaut s tudi es et des conditions du gel paisseur Injecter trop d ADN peut causer une saturation locale du gel DGGE Afin de s assurer que le gel n est pas 181 satur i
334. tivement t observ ce redimensionnement facilitait la convergence du script d optimisation d crit la section 3 2 ssssssssssssssssseeeeenee nennen 39 Figure 3 2 D limitation entre le signal attribuable aux esp ces abondantes pics visibles et celui attribuable aux esp ces plus rares La signification des chiffres 1 2 et 3 est expliqu e dans le texte plus bas 40 Figure 3 3 R sultats produits par l algorithme de quantification des pics DGGE la gauche de la figure se trouve la portion de profil analyser L information par rapport la position des pics est d termin e directement partir xxiii du profil analys et est entr e dans une bo te de dialogue a droite de la figure L algorithme optimise alors les param tres des distributions correspondant chaque pic et pr sente les r sultats sur un graphique Les r sultats peuvent tre accept s ou rejet s iii 43 Figure 4 1 Schematic representation of the elongation framework The framework was developed with pyrosequencing datasets containing approximately 35 000 sequences per sample The elongated RADs were therefore considered complete when the abundance of all the species summed to this value The example is given for sample BF100 and the results of the elongation process may be compared with the true RAD Results are only presented for species rank under 1200 for readability but the actual richness of this samp
335. to cause intra sample distortions in the relative abundance of species Furthermore all these biases were sample dependent Reducing the quantitative importance of some biases allowed finding a significant correlation between the diversity estimates produced by DGGE and Ion Torrent sequencing R gt 0 81 For comparative diversity studies these two approaches can therefore yield similar ecological conclusions While constructing concentration response curves from the ecological diversity indices it was observed that the most contaminated soils were not the least diversified ones Such a result could happen if the toxic effect of pentachlorophenol was so high that even the tolerant species were unable to grow thus hampering the apparition of bright bands on the DGGE profile At the same time it is also possible that pentachlorophenol induced a high bacterial mortality and that the DNA of these organisms released in the soil was not degraded during the 28 day incubation period Notwithstanding the above ecological diversity indices proved to be at least 25 times more sensitive to pentachlorophenol than the soils fluorescein diacetate hydrolysis activity meaning that structural changes could happen before functional losses are observed The most promising result was without a doubt a very good correspondence that was found between the diversity based concentration response curves and the species sensitivity distribution that was observed for
336. to determine how GC content could influence average quality This process was carried out individually for each length 85 100 m amp 80 D P z e steso 3 60 ps e 2 Kd E 40 s 9 amp 20 0 T T T T T T T T T T T T 126 130 134 138 142 146 150 154 158 162 166 170 174 Trimmed length bases 100 a 80 d0 2 5 60 2 2 Qa 40 2 2 A 20 0 T T T T rT Y T I 1 0 44 046 048 0 5 0 52 0 54 0 56 0 58 06 062 0 64 content Figure 5 5 Proportion of the sequences deleted when applying an average quality filter q gt 20 over the Ion Torrent dataset Upper Deletion percentages for the different trimmed lengths Lower Observing that the sequences with lengths ranging between 133 138 and 157 163 bases contained more than half of all the sequences and were of particularly good quality these sequences were extracted and ordered by increasing GC content individually for each length Results reported individually for the two clusters 133 138 and 157 163 correspond to the average deletion percentage for the different lengths in each cluster Error bars correspond to the 95 confidence intervals calculated for all the lengths in each cluster The shape of the curve presented in the upper part of Figure 5 5 corresponds relatively well with the expected sequence lengths major peaks at 136 and 161 bp and minor ones at 1
337. to the same size 5 000 reads for all samples in order to yield more comparable indices This normalization was done by sampling the sequencing datasets as described above The potential quantitative impact of sequencing errors was studied by reapplying the previously described pseudo single linkage clustering algorithm Huse et al 2010 with a lower or higher dissimilarity level 2 or 4 bases instead of 3 Finally bias linked to GC content was qualitatively investigated by reprocessing the initial Ion Torrent dataset as described above trim primers and remove sequences with homopolymers longer than 6 bases but without using any quality or length filter All the sequences were analyzed in order to determine their length GC percentage and average phred quality score IT 5 2 4 Results 5 2 4 1 Assessing the impact of PCP on soil bacterial community diversity with DGGE and Ion Torrent sequencing A visual inspection of the clean and contaminated DGGE profile samples shows that PCP changed the structure of the soil bacterial communities Figure 5 1 These structural modifications resulted in diversity decreases for all the contaminated samples when compared to their clean counterparts Even though the quantitative index values were different for DGGE and Ion Torrent both techniques showed similar trends Interestingly the diversity of LM3000 and S3000 the most contaminated samples is higher than less contaminated ones This situation
338. ually in GelCompar II while the Matlab based framework automatically and simultaneously optimizes many peaks For the Matlab based framework profile analyses are conducted in many optimization rounds In an interactive dialog box the analyst enters information on the central position of the peaks to be quantified fewer than 10 peaks for every round Central positions are determined directly from the image of the DGGE gel viewed with any image editing software program After the convergence ofthe algorithm optimized peaks are plotted against the analyzed profile The analyst can accept or reject the results If rejected the optimization routine can be run again with different 51 initial central positions or with fewer or more peaks The routine is run repeatedly until the peaks are accepted The resulting PDF parameters are then saved and the optimization moves on to other peaks until the entire profile is analyzed Peak abundances are finally determined from the PDF amplitudes 4 2 3 3 Representativeness of DGGE based dominance profiles While a similarity level of 97 is chosen in almost all sequencing based bacterial community diversity surveys it is doubtful that the value has any meaning when analyzing DGGE banding patterns If all the DGGE bands were generated by a single OTU RADs drawn from peak quantification would be very similar to RADs produced by sequencing dataset clustered at the 100 similarity level Considering that DGGE
339. ucture was compared using the Shannon and Simpson indices Considering the arguments of Jost 2006 diversities were reported in the form of an effective number of species Therefore the Shannon index was calculated as exp and Simpson was calculated as 1 D The Shannon index is reported to give more weight to rare OTUs as compared to the common ones while the Simpson index is more affected by dominants Hill et al 2003 The information conveyed by both indices was therefore seen as complementary Community richness was also compared For the Ion Torrent results richness corresponded to the actual number of observed OTUs after the clustering process For DGGE this value corresponded to the length of the elongated RADs All calculations were performed using the PAST software Hammer et al 2001 5 2 3 6 Identifying potential biases in DGGE and sequencing datasets A first analysis of the results made it possible to identify potential biases in both DGGE and sequencing based diversity estimates For DGGE it was hypothesized that peak intensities may not vary linearly based on the amount of DNA that generated the bands Different amounts 25 to 400 ng of Escherichia coli 16S rRNA gene PCR amplifications were loaded on a gel Also the DNA amplification and DGGE profiling steps were done again in triplicate this time by loading approximately 200 ng of PCR product per well It must be acknowledged that DNA extraction had to be performed again f
340. uer avec pr caution l acide sulfurique dans des proportions 1 1 V V avec de l eau et laisser refroidir Sulfate de magn sium anhydre CAS no 7487 88 9 MgSO4 Traiter le sulfate de magn sium en le chauffant 650 C pendant au moins 8 heures pour liminer l eau r siduelle et les impuret s d origine organique 205 Sulfate de sodium anhydre 12 60 mesh CAS no 7757 82 6 Na2SO4 Traiter le sulfate de sodium en le chauffant 4 650 C pendant au moins 8 heures pour en liminer l eau r siduelle et les impuret s d origine organique Hexane CAS no 110 54 3 M thanol Fisher A454 4 Dichlorom thane Aldrich 27056 3 Solutions pour courbe d talonnage avec du PCP 2 4 6 tribromophenol Omega TM 2904 M THODOLOGIE Pr paration du mat riel Tout le mat riel utilis verrerie pinces laine de verre Na2SO4 etc doit pr alablement tre d contamin avec les solvants appropri s 3 fois l ac tone et 3 fois l hexane Extraction du PCP Mati res liquides l 2 la balance pr lever et transf rer 12 0000g d chantillon aqueux avec des pipettes de transfert en verre jetable dans une bouteille extraction de 30ml et munie d un bouchon de t flon Acidifier l chantillon pH lt 2 l aide d une solution d acide sulfurique 50 96 v v en ajoutant 10ul avec une dispensette automatique munie d une seringue jetable NOTE Le volume pr cis est mesur et not apr s l e
341. ues extracted from the C R curves presented in Figure 6 2 The numbers in brackets correspond to the 95 confidence intervals ECs0 mg PCP kg dry wt soil Indicator Soil LM Soil S Simpson s 1 D 42 35 49 45 38 52 Shannon exp 45 38 52 59 47 70 Community richness 88 74 102 156 113 198 FDA hydrolytic activity 1990 1110 2870 1480 990 1970 6 2 4 2 Using the diversity of soil bacterial communities to derive EQCs For PCP in soils ecotoxicological databases Sanexen Services Environnementaux Inc 2002 U S Environmental Protection Agency 2013 contained 80 different ECso on 24 different terrestrial species However many of these data pertained to the same species Furthermore 10 of these ECso were not extracted from fitted distributions but reported as the tested concentration that produced the impact closest to 50 These values were deemed inaccurate and excluded from the dataset As shown in Tableau 6 4 the final dataset contained toxicological information on some 14 different terrestrial species and was dominated by worms and terrestrial plants The plant and nematode species were particularly sensitive to PCP To avoid the overrepresentation of certain taxonomic groups in the SSD the modeling process was carried out using the geometric mean of the EC so available for each taxonomic group x axis and the associated plotting positions y axis Tableau 6 4 107 Tableau 6 4 Ecotoxicologi
342. uites pour le second manuscrit n avaient pas des pentes unitaires L incapacit produire des droites de r gression ayant des pentes unitaires s explique probablement galement en consid rant les distorsions identifi es dans les s ries de donn es produites l aide de l Ion Torrent PGM En observant le Tableau 5 4 il est possible de constater que la pente des droites de r gression produites l aide de l indice de Simpson 1 D sont bien plus pr s de l unit lorsque les indices Ion Torrent sont corrig s Puisqu il n a pas t possible d estimer quantitativement et donc de corriger l influence des erreurs de s quen age sur la richesse des communaut s la pente des droites de r gression correspondant la richesse et dans une moindre mesure l indice de Shannon exp ne se sont jamais rapproch es de l unit Au contraire le fait de corriger les indices Ion Torrent afin de tenir compte de la faible profondeur de s quen age a fait passer les pentes initialement situ es entre 0 93 et 1 27 des valeurs situ es entre 0 51 et 0 81 Tel que mentionn dans le second manuscrit l l ment le plus important afin d tre en mesure d utiliser l une ou l autre des techniques afin de comparer la diversit des communaut s bact riennes des sols est la corr lation entre les estim s de diversit produits par les deux approches En ce sens toutes les corr lations furent significatives apr s avoir corri
343. ul l aide d une pipette automatique P1000 et le transf rer dans la colonne de PVPP pr par au point 3 2 2 Centrifuger 1000 rpm suffisamment longtemps pour que tout l chantillon passe au travers de la colonne cela devrait prendre entre 6 et 8 minutes R colter les chantillons l aide d une pipette automatique P1000 et mettre ces derniers dans des tubes microcentrifuge de 2 ml pr alablement autoclav s le volume de l extrait devrait se situer entre 550 et 600 ul le PVPP ayant rel ch un petit volume de phosphate de potassium dans l extrait 10 l aide d une pipette automatique P200 ajouter 65 ul d ac tate de potassium 5M Attention la concentration finale doit tre de 0 5M d ac tate de potassium dilution 1 10 11 Incuber le tube sur glace pendant 5 min 12 Centrifuger 16 000 g pendant 30 min 4 C 13 R colter le surnageant entre 615 et 665 ul l aide d une pipette automatique P1000 et le 154 transf rer dans un tube microcentrifuge de 2 ml pr alablement autoclav 14 l aide d une pipette automatique P1000 ajouter 650 ul de la solution Polyethylene glycol 6000 PEG 20 2 5M NaCl ratio d environ 1 1 15 Incuber le tube dans un bain temp r 37 C pendant 1 heure 16 Centrifuger 4 16 000 g pendant 30 min a 20 C 17 Retirer le surnageant en inversant le tube le culot contient l ADN 18 Dissoudre le culot faire plusieurs mouvements de va et vient avec
344. um2str FacteursFantomes def A B C D E F G options Resize on options WindowStyle normal InfoPic inputdlg prompt dlg titlejnum lines def options if size InfoPic 1 0 Vect PositionMax str2num InfoPic 13 Avant str2num InfoPic 21 Apres str2num InfoPic 3 Vect PositionMaxFantome str2num InfoPic 41 ok lt ST2NM gt AvantFantome str2num InfoPic 5 ApresFantome str2num InfoPic 6 FacteursFantomes str2num InfoPic 7 end if numel Avant numel Apres min Vect PositionMax min Avant max Vect_PositionMax gt max Apres max Vect_PositionMax gt Longueur InfoPic Donnees erronees ok lt NOPTS gt end if numel Vect_PositionMaxFantome numel AvantFantome numel Vect PositionMaxFantome numel AvantFantome min Vect PositionMaxFantome min AvantFantome max Vect_PositionMaxFantome gt max ApresFantome max Vect_PositionMaxFantome gt Longueur InfoPic Donnees fantomes erronees ok lt NOPTS gt end 236 end NbPics length Vect PositionMax close figure 2 end end Reposition while size Reposition 1 0 while size Reposition 1 prompt Le positionnement est il acceptable Si non il faudra changer le point central des pics O N dlg title Verification du pic num lines 1 def O options Resize on options WindowStyle normal Reposition inputdlg prompt dlg_title snum_lines def
345. une substance sur une communaut biologique et ainsi contr ler ou limiter son utilisation il est n cessaire de produire de l information toxicologique sur une large gamme d organismes Les donn es cotoxiques repr sentatives des diff rentes esp ces test es seront collig es et utilis es afin d estimer l effet d un contaminant sur toute une communaut Lorsque le centre d int r t est une communaut biologique voluant en milieu terrestre force est de constater que la disponibilit de ces indicateurs est tr s probl matique Les communaut s microbiennes des sols sont n cessaires au bon fonctionnement long terme des cosyst mes terrestres Or ces derni res sont virtuellement absentes des bases de donn es cotoxiques L absence de donn es pour ce groupe tr s important n est pas trang re au fait que l tude d organismes aussi petits pose des difficult s techniques particuli res Ainsi la majorit des publications s tant int ress es l effet des contaminants sur les microorganismes du sol ont utilis des indicateurs fonctionnels li s directement ou indirectement ces organismes Les indicateurs les plus utilis s sont les mesures de biomasse microbienne d activit microbienne et d activit enzymatique Bien que tr s utiles afin de d terminer l tat de sant d un sol ces indicateurs ont montr certaines limites importantes Puisque les mesures fonctionnelles sont tr s int gratrices toutes
346. une tube Eppendorf de 1 5 ml puis la seringue de 1 ml Figure A1 1 l aide d une seringue de 10 ml pr lever la solution de PVPP Transf rer 1 ml de cette solution dans la seringue de 1 ml du montage Centrifuger 1000 rpm pendant 1 min Seringue 1 mL Tube conique 15 mL PVPP Laine de verre Tube 1 5 mL Figure A1 1 Montage d une colonne de PVPP 153 Proc dure d extraction de l ADN d un sol toujours d poser les chantillons sur de la glace lors des temps d attente afin de limiter la d gradation de l ADN l 2 Peser 0 3750 g de billes Biospec de 0 1 mm de diam tre dans un tube adapt de 2 ml pour la machine Mini BeadBeater et bouchonner Autoclaver ce tube pendant 15 minutes a 120 C en position SOLIDS Travailler en mode aseptique le rayon d une flamme suffit 3 Peser directement 0 3000 g de sol dans le tube adapt pour la machine Mini BeadBeater contenant 0 3750 g de billes Biospec de 0 1 mm de diam tre pr alablement autoclav es Voir les recommandations pour les diff rents types de sol l aide d une pipette automatique P1000 ajouter 650 ul de tampon CTAB DTT 0 2 dans le tube contenant le sol et les billes et bouchonner Introduire le tube dans la machine Mini BeadBeater et homog n iser vitesse maximale pendant 90 secondes Centrifuger le tube adapt Mini BeadBeater 16 000 g pendant 5 min 4 C R colter le surnageant environ 500
347. ut s bact riennes des sols tait compar e D s lors est il possible de consid rer que les valeurs obtenues sont repr sentatives de l effet du PCP sur la diversit bact rienne des sols Il est difficile de r pondre cette question Premi rement 1l a t montr que le protocole exp rimental utilis afin d extraire l ADN contenu dans le sol Carrigg Rice Kavanagh Collins and O Flaherty 2007 Pan et al 2010 ou d amplifier cet ADN Kurata et al 2004 Takahiro 2003 pouvaient avoir un effet sur les profils microbiens g n r s partir des m thodes mol culaires Aussi les amorces PCR utilis es afin d amplifier ADN extrait bien que d sign es par le qualificatif universelles ne ciblent pas la totalit des esp ces Ainsi peu importe quelle m thode est utilis e afin d analyser l ADN amplifi le portrait des communaut s ne pourra jamais tre plus repr sentatif que le produit PCR analys Il est donc primordial d optimiser les protocoles d extraction et d amplification d ADN employ s au laboratoire Par contre m me si la diversit estim e partir des approches mol culaires n est pas quantitativement repr sentative de la diversit r elle des communaut s tudi es cela ne rend pas caduque l utilisation d un indicateur cotoxicologique bas sur la diversit bact rienne des sols Premi rement les amorces PCR universelles ne ciblent pas toutes les esp ces mais elles en ciblent tout de m
348. ve background noise profiles from DGGE gels it was observed that a manual adjustment was the best and perhaps the only way to correctly draw a line between peaks area and background This manual adjustment was based on the careful observation of the image of the gel The background profiles were derived by qualitatively ranking neighboring peaks from very weak to very bright It was observed that a background profile very close to the peaks root gives more weight to the brightest peaks and vice versa Adjusting the background level closer to or farther from the peaks root made it possible to draw the most representative picture of what is visually conveyed by the image It must be mentioned that this process is iterative During the quantification process if a peak is disproportionate as compared to its neighbors or if its optimized standard deviation is significantly different from all the other peaks it may be necessary to adjust the background profile accordingly Peaks delimitation and quantification In the four considered software programs peaks were quantified using two different general approaches The approach shared by TotalLab Quant and BIO 1D consists in delimiting peaks with two straight lines Peaks are then quantified by summing up the intensity of the background subtracted profile between these lines In contrast GelCompar II and the Matlab based framework adjust Gaussian PDFs under the peaks Eq 1 This adjustment is done man
349. ve of true community dominance profiles at 98 similarity For some samples divergence in community richness was found to be higher than 10 For some samples divergence in community richness was found to be higher than 10 These differences per se were not considered to be a strong shortcoming since the elongation framework did not specifically aim to accurately predict community richness The usefulness of the framework lies in its capacity to consider true community dominance and bring H and D indices calculation to 66 higher and more realistic richness values Results by Narang and Dunbar 2004 among others showed that diversity indices are less sensitive to richness at these high values For 1 D the elongation framework presented here is somewhat similar to a published methodology Loisel et al 2009 These authors proposed the use of a correction factor also based on the background noise level to estimate accurate 1 D values from fingerprints As a dominance index 1 D was found to be highly sensitive to the OTUs with the highest abundances Its calculation can therefore be seen as pretty robust to the elongation framework but must rely on an accurate peak quantification step As stated by Hill et al 2003 H gives more weight than 1 D to rare species and is essentially an intermediate between community richness and the Simpson index This index is therefore less affected by the peak quantification step than 1 D but re
350. versit biologique dans les cosyst mes naturels 1 1 1 tat et tendances Selon l Office qu b cois de la langue fran aise la diversit biologique ou biodiversit peut tre d finie comme le nombre et l abondance relative des g nes diversit g n tique des esp ces et des cosyst mes des communaut s pr sents dans une zone donn e Office qu b cois de la langue fran aise 2012 De cette d finition ressort l id e selon laquelle la quantification de la biodiversit doit consid rer la fois le nombre d esp ces pr sentes richesse de la communaut mais galement l abondance relative des individus au sein des diff rentes esp ces dominance et quit Ces l ments seront trait s plus en d tails subs quemment Vue sous l angle du nombre d esp ces pr sentes la biodiversit des cosyst mes naturels est astronomique Tel que pr sent dans le Tableau 1 1 plus de 1 75 millions d esp ces diff rentes ont t r pertori es uniquement pour le domaine des eucaryotes Groombridge and Jenkins 2002 Le nombre total d esp ces eucaryotes a t estim par plusieurs auteurs et se situe g n ralement entre 5 et 10 millions Baillie and Upham 2013 En ce qui concerne les procaryotes arch es et bact ries 10 000 esp ces ont t d crites mais cela pourrait ne constituer qu environ 0 1 de la diversit totale de ces deux domaines Tamames and Rossell M ra 2012 pour un total
351. versity from DGGE 4 2 1 Abstract Denaturing gradient gel electrophoresis DGGE has been and remains extensively used to assess and monitor the effects of various treatments on soil bacterial communities Considering only abundant phylotypes the diversity estimates produced by this technique have been proven to be uncorrelated to true community diversity The aim of this paper was to develop a framework to estimate a community s true diversity from DGGE Developed using in silico DGGE profiles generated from published pyrosequencing datasets this framework elongates the rank abundance distributions RADs drawn by band quantification using the peak to signal ratio PSR parameter which was proven to be related to bacterial richness The ability to compare DGGE based diversity estimates to the true diversity of communities led to a unique opportunity to identify potential pitfalls when analyzing DGGE gels with commercial analysis software programs and gain insight into the process of DNA band clustering in the profiles Bacterial diversity was compared through richness Shannon and Simpson s 1 D indices Intermediate results demonstrated that even though commercial gel analysis software programs were unable to produce consistent results throughout all samples a newly developed Matlab based framework unravelled the dominance profiles of communities from band quantification Elongating these partial RADs using the PSRs extracted from the DGGE pro
352. versity stability debate 10 1038 35012234 Nature 405 6783 228 233 Megharaj M Singleton I and McClure NC 1998 Effect of pentachlorophenol pollution towards microalgae and microbial activities in soil from a former timber processing facility Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 61 1 108 115 dot 10 1007 s001289900736 Millenium Ecosystem Assessment 2005 Ecosystems and Human Well Being Biodiversity Synthesis Washington DC Ministry of Housing Spatial Planning and the Environment 2009 Soil Remediation Circular 2009 The Netherlands Retrieved from http www esdat com au Environmental 20Standards Dutch ENGELSE 20versie o20circulair e 20Bodemsanering 202009 pdf Morales SE Cosart TF Johnson JV and Holben WE 2009 Extensive phylogenetic analysis of a soil bacterial community illustrates extreme taxon evenness and the effects of amplicon length degree of coverage and DNA fractionation on classification and ecological parameters Applied and Environmental Microbiology 75 3 668 675 Muyzer G de Waal EC and Uitterlinden AG 1993 Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes coding for 16S rRNA Applied and Environmental Microbiology 59 3 695 700 Myers RM Maniatis T and Lerman LS 1987 Detection and localization of single base changes by denaturing gradient gel electrop
353. x Apres lt Longueur 1000 Max max Apres 1000 else Max Longueur end Titre sprintf Suivi de l avancement figure 3 hold on plot Vecteur axis max Avant Max 0 1 25 max Vecteur max Avant Max title Titre hold off 240 end end j j l Pourcentages Matrice 2 sum Matrice 2 Resultats 1 j 1 j Matrice Pourcentages sort Pourcentages descend 241 function Vect_PositionMax Amplitude_1 Sigma_1 PFantome NormaleDeuxPics NbPics Vect PositionMax Avant Apres Vecteur Vect PositionMaxFantome AvantFantome ApresFantome FacteursFantomes Nom du fichier NormaleDeuxPics m Description Cet algorithme est appel par le code QuantificationPics NormaleDeuxPics re oit les param tres initiaux des distributions Gaussiennes et proc de l optimisation de ces derniers l aide de la fonction fmincon algorithme de minimisation sous contrainte Auteur Jonathan Lalande Amplitude_1 zeros NbPics 1 Sigma 1 zeros NbPics 1 ETmoyen 22 SigmaMax 26 SigmaMin 18 Longueur length Vecteur Rang 1 Longueur Vect PositionMaxFantome Vect PositionMaxFantome if Vect PositionMaxFantome 1 0 NbPicsFantomes length Vect PositionMaxFantome AmplitudeFantome zeros NbPicsFantomes 1 SigmaFantome zeros NbPicsFantomes 1 PFantome zeros Longueur NbPicsFantomes for a 1 NbPicsFantomes Positionf AvantFantome a Ap
354. xadecyltrimethylammonium bromide CTAB 1mM dithioteitrol DTT 0 2M sodium phosphate buffer pH 8 0 1M NaCl 50mM EDTA l 2 Peser 0 2000 g de CTAB directement dans un b cher de 100 ml Peser 0 0154 g de DTT dans une coupelle et transf rer dans le b cher de 100 ml Peser 2 7598 g de NaH PO4 H 0 dans une coupelle et le transf rer dans le b cher de 100 ml Ajouter environ 80 ml H20 ajouter un barreau magn tique et agiter sur une plaque magn tique Ajuster le pH 8 l aide du pH m tre avec une solution de NaOH 10 M Voir le PSO E3 pour l utilisation du pH m tre Peser 0 5844 g de NaCl dans une coupelle et transf rer dans le b cher de 100 ml Peser 1 8612 g de EDTA dans une coupelle et transf rer dans le b cher de 100 ml Agiter sur une plaque magn tique jusqu dissolution compl te des solides Transf rer quantitativement dans un ballon de 100 ml et compl ter jusqu au trait jauge avec de l eau distill e Solution d ac tate de potassium 5M l 2 Peser 12 2675 g directement dans un b cher de 25 ml Ajouter environ 20 ml H2O ajouter un barreau magn tique et agiter sur une plaque magn tique jusqu dissolution complete Transf rer quantitativement dans un ballon de 25 ml et compl ter jusqu au trait jauge avec de l eau distill e 149 Solution de Polyethylene glycol 6000 PEG 20 2 5M NaCl l 2 Peser 5 0000 g PEG directement dans un b cher de 25 ml
355. xtraction et la s paration des phases 3 4 Le rapport hexane eau est tabli 60 40 selon Pu et Cutright 2006 Y ajouter 18 ml d hexane avec une pipette gradu e en verre de 25 ml et bouchonner la bouteille Agiter manuellement la bouteille d extraction pendant environ 10 secondes puis enlever la surpression S assurer que le goulot de la bouteille est propre et sec 206 5 D poser les bouteilles sur l agitateur rotatif 25 RPM et laisser tourner pendant une nuit 6 Transf rer l chantillon dans une ampoule d cantation de 250 ml 7 Laisser les phases se s parer 8 Recueillir la phase aqueuse phase inf rieure dans la bouteille d extraction et faire passer la phase organique phase sup rieure sur une colonnette de NaSO4 anhydre puis la recueillir dans une fiole jaug e de 25 ml 9 Ajouter environ 2 ml d hexane la phase aqueuse 10 Agiter manuellement la bouteille d extraction pendant environ 10 secondes puis enlever la surpression S assurer que le goulot de la bouteille est propre et sec 11 R p ter les tapes 6 7 et 8 NOTE S il y a pr sence d mulsion la technique pour l liminer d pend de la nature de l chantillon elle peut inclure le brassage la filtration sur laine de verre la centrifugation l utilisation d un bain ultrasons l addition de sel ou d autres m thodes physiques 12 Rincer la colonnette avec 4 ml d hexane puis compl ter la fiole jaug e
356. xx Int6 Int6 1 elseif Qualite xx 7 Int7 Int7 1 elseif Qualite xx 8 Int8 Int8 1 elseif Qualite xx Int9 Int9 1 elseif Qualite xx Int10 Int10 1 elseif Qualite xx 11 Intl 1 Int11 1 elseif Qualite xx 12 Int12 Int12 1 elseif Qualite xx 12 Int13 Int13 1 elseif Qualite xx Int14 Int14 1 elseif Qualite xx 15 Int15 Int15 1 elseif Qualite xx 16 Int16 Int16 1 elseif Qualite xx 17 Int17 Int17 1 elseif Qualite xx Int18 Int18 1 elseif Qualite xx 19 Int19 Int19 1 else Int20 Int20 1 end om dope D 269 270 end for yy 1 Longueur Miscall Miscall 10 Qualite yy 10 end Qmoy mean Qualite C7 C7 i Debut Longueur GC Qmoy Int1 Int2 Int3 Int4 Int5 Int6 Int7 Int8 Int9 Int10 Int11 Int12 Int13 Int14 Int15 Int16 Int17 Int18 Int19 Int20 Miscall end end break elseif sum Seq1 Ec8 gt NumMin if length Sequence Debut end gt 1 if length Sequence Debut end lt 250 Ech8 E8 1 Header Structure 1 Header Ech8 E8 1 Sequence Sequence Debut end Qual8 E8 1 Header Quality 1 Header Qual8 E8 1 Sequence num2str Qualite Debut end E8 E841 Sequence Sequence Debut end Qualite Qualite Debut end Il v 0 0 0 0 Q0On gt Il Calcul du GC for j 1 length Sequence if strempi Sequence j A 1 A A elseif strempi Sequence j T 1 T T 1 else
357. y mean Qualite C1 7 C1 i Debut Longueur GC Qmoy Int1 Int2 Int3 Int4 Int5 Int6 Int7 Int8 Int9 Int10 Int11 Int12 Int13 Int14 Int15 Int16 Int17 Int18 Int19 Int20 Miscall end end break elseif sum Seq1 Ec2 gt NumMin if length Sequence Debut end gt 1 if length Sequence Debut end lt 250 Ech2 E2 1 Header Structure i Header Ech2 E2 1 Sequence Sequence Debut end Qual2 E2 1 Header Quality i Header Qual2 E2 1 Sequence num2str Qualite Debut end E2 E2 1 Sequence Sequence Debut end Qualite Qualite Debut end Il gt 0 0 0 0 Il 9 2 O0 Il Il Calcul du GC for j 1 length Sequence 257 if strempi Sequence j A A A elseif strempi Sequence j T 1 T T 1 elseif strempi Sequence j G 1 G G 1 elseif strempi Sequence j C 1 C C t1 end end GC G C A T G C Longueur length Sequence Intl 0 Int2 0 Int3 0 Int4 0 Int5 0 Int6 0 Int7 0 Int8 0 Int9 0 Int10 0 Int11 0 Int12 0 Int13 0 Int14 0 Int15 0 Int16 0 Int17 0 Int18 0 Int19 0 Int20 0 for xx 1 Longueur if Qualite xx lt 1 Intl Int1 1 elseif Qualite xx 2 Int2 Int2 1 elseif Qualite xx 3 Int3 Int3 1 elseif Qualite xx 4 Int4 Int4 1 elseif Qualite xx 5 Int5 Int5 1 elseif Qualite xx 6 Int6 Int6 1 258 elseif Qualite xx Int7 Int7 1 elseif Qu
358. ycle du carbone n a pas t influenc e par le PCP Quant a elle la respiration du sol a t significativement affect e par le PCP mais a la hausse Ces r sultats sont similaires 4 ceux obtenus par Megharaj et al 1998 pour des sols contamin s naturellement situ s proximit d une usine de traitement du bois mesures de biomasse microbienne et d activit enzymatique Dans une autre tude Marti et al 2011 ont tudi l effet du PCP sur la respiration cumulative et la respiration induite par l ajout de substrat Substrate Induced Respiration ou SIR de deux sols diff rents contamin s plusieurs concentrations diff rentes l aide d une mod lisation concentration r ponse ces auteurs ont g n r des param tres cotoxiques EC20 ECso et LOEC pour le PCP Ces auteurs ont galement produit des gels DGGE pour les diff rents chantillons de sols Par contre le seul param tre cotoxique d termin partir des DGGE est la LOEC qui fut d termin e visuellement Les LOEC relatifs a la SIR furent inf rieurs ceux d termin s partir des DGGE Par contre il est important de mentionner que les concentrations en PCP n ont pas t mesur es dans les sols ce qui limite l interpr tation des r sultats 33 CHAPITRE2 PRESENTATION GENERALE DES TRAVAUX 2 1 Probl matique La revue pr c dente a permis de mettre en vidence le r le crucial jou par la diversit biologique autant micro
359. ypothesis that the problem is probably quite common As the results presented in this paper suggest loading less DNA is a simple way to remedy the issue If DGGE is to be used quantitatively all gels should be run using a marker known to be below saturation If less DNA is to be loaded on the gel it can also become more important to color the DGGE gels with sensitive dyes i e SYBR gold to avoid limitations linked to fluorescence thresholds Another element that may influence the conclusions of DGGE based diversity studies is primer quality and cycling conditions Considering a coupling efficiency of 99 when producing oligonucleotides Life Technologies 2013 the synthesis of a 17 bases primer can yield over 15 erroneous incomplete sequences If annealed the erroneous incomplete primers could potentially blur the DGGE profiles and consistently produce multiple bands from a unique template This will artificially inflate the apparent diversity of the studied communities and generate complex background noise profiles that are hard to delimit If the elongation framework presented in Lalande et al 2013 and used here to calculate the DGGE based diversity indices is to be applied it is imperative to be able to draw a realistic background noise profile in order to estimate accurate PSR values The problem can be tackled by using purified primers and carefully optimized PCR conditions Indeed the HPLC purified primers and optimized PCR conditions u

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