Anti-HCMV IgM plus ELISA
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1. S rum seuil pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V 45 ml Diluant de l chantillon pr t l emploi conservateur 0 01 de sulfate de n omycine 0 03 de chloramph nicol 15 ml Conjugu d anti IgM humain pr t l emploi Conservateur 0 025 de p nicilline V 0 025 de sulfate de streptomycine 0 2 de Proclin 300 6 ml Tampon de lavage concentr 500 x conservateur 0 01 de 2 bromo 2 nitro 1 3 propanediol O TAEHGGE O Ja E E amp SUB 13 ml Solution de substrat pr te l emploi Solution de 3 3 5 5 t tram thylbenzidine TMB lt 0 05 dans H20 Voir avertissement et pr cautions 15 ml Solution d arr t pr te l emploi Acide sulfurique lt 1 N H2SO0 1 Sachet de conservation sachet en poly thyl ne pour conserver les barrettes de microplaques inutilis es FOL 1 Feuilles transparentes auto adh sives Feuilles transparentes auto adh sives pour recouvrir les puits des microplaques pendant l incubation BA 1 Notice du coffret Conservateurs concentration totale lt 0 11 Mat riaux n cessaires mais non fournis avec la trousse micropipettes photom tre spectral 450 nm longueur d onde de r f rence 615 690 nm laveur de microplaques incubateur pour les ELISA Avertissement et pr cautions Ne pas incorporer de r actifs Eviter le contact2. Calcul de la d termination qualitative Apr s mesure des valeurs d extinction 450 nm dans tous les puits filtre de r f rence 615 690 nm soustraire la valeur moyenne des blancs des valeurs d extinction des contr les et des chantillons Extinction moyenne des blancs lt 0 100 Apr s soustraction du blanc les valeurs des contr les doivent satisfaire les crit res de validit suivants DO moyenne de NC Calcul de la valeur seuil et de la zone grise La valeur seuil d pend de la DO moyenne de l chantillon seuil CoS X 0 250 DO moyenne de PC 0 600 chantillons OD gt CoS OD chantillons Anti HCMV positif chantillons OD lt zone grise chantillons Anti HCMV negatif CoS OD gt chantillons OD gt CoS OD x 0 9 zone grise incertain Interpr tation du r sultat Les chantillons ayant une valeur d extinction inf rieure la zone grise sont consid r s comme n gatifs Si un chantillon a une valeur d extinction gale ou sup rieure la zone grise il est consid r comme positif pour les anticorps IgM sp cifiques de HCMV Si la valeur de DO de l chantillon retest est dans la zone grise r sultat douteux nous recommandons de demander un nouveau pr l vement C 0197 189700 07 07 2010 Proc dure de pipetage pour la d termination d IgM Laisser tous les r actifs atteindre la temp rature ambiante avant emploi Pipeter les contr les et le blanc en dernier Apr s pip
3. avec les yeux et la peau Traiter tous les chantillons et les mati res utilis es pour le test comme des produits potentiellement infectieux et prendre les mesures de s curit appropri es Les contr les sont n gatifs pour anti HIV 1 2 anti HCV HBsAg anti syphilis et les transaminases lev es Ne pas pipeter la bouche Conform ment aux bonnes pratiques de laboratoire porter des gants une blouse de laboratoire et des lunettes de s curit D contaminer les mati res liquides et non combustibles avec de l hypochlorite de sodium concentration finale 3 temps d action au moins 30 minutes Neutraliser obligatoirement les d chets liquides contenant des acides avant leur limination Autoclaver obligatoirement toutes les mati res r employer pendant 1 heure 121 C La SUB est sensible la lumi re et doit tre mise l abri de celle ci Le test doit tre ex cut par des techniciens de laboratoire bien form s et agr s Ex cuter le test dans des conditions aseptiques et microbiologiqumenet contr l es Stockage Les r actifs s ils sont stock s 2 8 C sont stables jusqu aux dates de p remption figurant sur chaque tiquette individuelle Apr s ouverture des r actifs ceux ci doivent tre utilis s dans les 30 jours En cas de r p tition de tests conserver les r actifs imm diatement apr s usage 2 8 C Enfermer la dans un sachet d aluminium avec un d shydratant et la mettre la temp r
4. Anti HCMV IgM plus ELISA ELISA pour la d tection d anticorps IgM Anti cytom galo virus dans du s rum et du plasma humain Conditionnement 807 034 96 tests coffret de tests complets Usage pr vu Les infections par le cytom galovirus humain HCMV virus de la famille des B herpes sont r pandues dans le monde entier taux de pr valence 40 100 Alors qu une infection par le HCMV est asymptomatique chez la majorit des personnes immunocomp tentes elle peut conduire de graves complications chez les personnes dont le syst me immunitaire est affaibli ou ne s est pas encore totalement d velopp h patite r tinite pneumonie etc HCMV est l organisme pathog ne le plus fr quent des infections cong nitales Approxima tivement 10 des enfants infect s cong nitalement par HCMV pr sentent des sympt mes la naissance ict re h patospl nom galie h morragies p t chiales et chorior tinite Les receveurs de greffes d organes et de moelle osseuse et les patients atteints du SIDA constituent d autres groupes de patients pour lesquels une infection aigu par HCMV est tr s grave Gr ce des tests s rologiques il est possible de diff rencier une infection par le CMV d une infection par l EBV ou par un toxoplasme La d tection d une IgM anti CMV est le signe d une infection aigu 2 3 Principe de la m thode ELISA classique Le test anti HCMV IgM ELISA est un titrage immunoenzymatique utilisant un
5. antig ne adsorb ELISA pour le diagnostic in vitro tr s sensible bas sur un m lange de diff rents antig nes HCMV naturels 1 Si l chantillon test contient des anticorps sp cifiques ils se lieront l antig ne dans les puits de la microplaque Les anticorps non sp cifiques sont limin s par une tape de lavage Pour viter des r sultats faux positifs dus aux facteurs rhumato des RF et pour r duire la comp tition avec IgG le test doit tre r alis avec un adsorbant des RF Le complexe anticorps antig ne form est d tect en utilisant un anticorps monoclonal sp cifique dirig contre l IgM humaine La pr sence d anticorps li s est mise en vidence l aide d une r action enzymatique donnant un produit color en utilisant la TMB 3 35 5 t tram thylbenzidine comme substrat La r action enzymatique est arr t e avec de l acide sulfurique Mesurer la densit optique 450 nm aide d un spectrophotom tre longueur d onde de r f rence 615 690 nm m a trousse contient 1 Microplaque 12 barrettes s cables de 8 puits chacune tapiss s par diff rents antig nes HCMV sp cifiques 1 0 ml Contr le CMV IgM n gatif pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V 1 0 ml Contr le CMV IgM positif pr t l emploi humain conservateur 0 005 de gentamicine 0 05 de streptomycine 0 05 de p nicilline V 1 0 ml
6. ature ambiante avant ouverture Remettre les barrettes inutilis es avec le d shydratant dans le sachet refermable et les conserver ainsi 2 8C Ne pas toucher avec les doigts le bord sup rieur ni le fond des puits Pr paration des r actifs Diluer le tampon de lavage avec de l eau d min ralis e ou d sionis e par exemple diluer 2 ml 1 litre Le tampon ainsi pr par est stable pendant une semaine conserv 2 8 C Tous les autres composants du test sont pr ts l emploi Tous les r actifs sont sp cifiques d un lot ne pas les utiliser avec des trousses d autres lots Ne pas utiliser de r actifs d autres fabricants Pr paration des chantillons Utiliser des chantillons de s rum ou plasma frais sans h molyse Des chantillons de s rum ou de plasma forte lip mie ict riques ou conta mination microbienne et des pr parations d immunoglobuline concentr es risquent de donner des r sultats de test non fiables Eviter de congeler et d congeler les chantillons plusieurs reprises Si les chantillons doivent tre transport s les emballer conform ment aux exigences r glementaires pour le transport de mati res infectieuses Ne pas inactiver les chantillons car il pourrait se produire des r actions non sp cifiques Performance du test Suivre strictement le protocole voir la proc dure de pipetage Diluer tous les contr les et chantillons dans le rapport 1 21 en utilisant le dilua
7. etage des contr les et des chantillons mettre la plaque incuber imm diatement tape 1 puits ui A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 Blanc 200 double test 200 double test z 200 COS 200 chantillon 1 21 partir z 23 adsorption des RF de A2 200 Recouvrir la en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 60 1 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 550 550 550 550 tape 2 puits ul CONJ 100 100 100 100 Recouvrir la en utilisant des feuilles auto adh sives inutile dans un processeur ELISA Incubation 30 1 mn 37 1 C Laver 5x voir W1 550 550 550 550 tape 3 puits ul SUB 100 100 100 100 Incubation 30 1 mn la temp rature ambiante dans l obscurit STOP 100 100 100 100 Mesurer l extinction imm diatement ou dans les 15 mn suivant l arr t 450 nm en utilisant un spectrophotom tre spectral longueur d onde de r f rence 615 690 nm En cas d utilisation de processeurs ELISA l op rateur doit valider le test sous sa propre responsabilit Performance 200 s rums de donneurs de sang sains et 110 patients atteints d infections HCMWV aigu s diff rents stades cliniques patients greff s et immunod prim s confirmation par un test d antig n mie PCR culture de virus ou s roconversion d igG tr
8. lirubine ont t ajout es 5 chantillons anti HCMV positifs et n gatifs une concentration de 4mg ml et 0 8 mg ml respectivement Ces chantillons ont t compar s des chantillons non trait s Aucune diff rence significative de r activit n a pu tre observ e En outre l addition de 20 de triol ine fluide lipidique n a pas eu d influence sur la r activit du test Limitations de la m thode La d tection d anticorps est une m thode indirecte de d tection d un organisme pathog ne Les r sultats n gatifs obtenus avec le test Anti HCMV IgM Plus ELISA n excluent pas l implication de HCMV dans une maladie D autre part un r sultat positif n est pas suffisant pour d finir une maladie La connaissance sp cifique des autres informations cliniques et des ant c dents du patient constituent des pr requis importants pour interpr ter correctement les donn es Les m thodes directes suivantes compl tent le diagnostic s rologique de HCMV test d antig n mie PCR et culture du virus Les s rums de patients atteints d une infection primaire par EBV positifs pour des anticorps h t rophiles peuvent donner des r sultats faux positifs sur Anti HCMV IgM Plus ELISA Pour l identification nous recommandons de prendre en compte les tests s rologiques sp cifiques pour EBV et la d tection des anticorps sp cifiques d anti glycoprot ine B gB Anti HCMV rec gB IgG ELISA num ro de catalogue 807 035 Mi Bi
9. nt de l chantillon Traiter au pr alable les s rums des patients par le sorbant des RF RFS L analyse qualitative des anticorps IgM peut tre r alis e en utilisant au choix une m thode manuelle ou une m thode automatique processeur ELISA pour la r alisation des tests Dilution des chantillons au 1 21 avec pr dilution dans des tubes Diluer les contr les PC et les chantillons au 1 21 dans un tube par exemple 25 ul de contr le ou d chantillon 500 pl de Bien m lan ger Les contr les n ont pas t pr trait s par l adsorbant des RF Diluer les s rums des patients dans le rapport 1 21 galement et les pr traiter par le sorbant des RF RFS Diluer d abord les chantillons avec RFS puis ajouter le diluant par exemple 25 ul d chantillon 250 ul de sorbant des RF 250ul de diluant de l chantillon dilution au 1 21 Ajouter toujours le diluant de l chantillon en dernier Apr s pipetage bien m langer Proc dure de lavage La proc dure de lavage constitue un point critique Un lavage insuffisant entra nerait une mauvaise pr cision et des r actions non sp cifiques W1 laver 5 fois avec le tampon de lavage Pour cela liminer le liquide du puits et distribuer 300 ul de tampon de lavage Remplir le puits avec au moins 250 ul de tampon de lavage volume total 550 R p ter cette proc dure de lavage 5 fois Tapoter bri vement sur la plaque apr s lavage Ne pas laisser la plaque s cher
10. o Rad Medical Diagnostics GmbH Industriestr 1 D 63303 Dreieich Germany Tel 49 6103 801 95 Fax 49 6103 801 724 www bio rad com techsupport bmd bio rad com Litt rature 1 DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical devices 2 Poster Evalation Of A Novel Anti Cytomegalovirus Immunoglobuline M ELISA Rothe M et coll Jahrestagung der Gesellschaft f r Virologie Erlangen 8 au 11 avril 2002 Programme et r sum s chapitre Diagnostic and Clinical Virology Page 84 3 Searching for Antibodies specific for human Cytomegalovirus Is it Diagnostically useful When and How Review article M P Landini et M Mach Scand J Infect Dis Suppl 99 18 23 1995 Guide de d pannage 1 Taux lev et inattendu de r sultats r actifs Des chantillons ou des contr les ont t pipet s avant le pipetage de ou bien le m lange a t insuffisant 2 Valeur moyenne du blanc sup rieure au crit re de validit DO Z 0 100 a devenue bleue par oxydation ou contamination b Erreur de lavage Effectuer l tape des 5 cycles de lavage Utiliser le de Bio Rad contenu dans la trousse c Erreur d incubation temp rature trop haute dur e d incubation d pass e ou plaque non incub e directement apr s la fin du pipetage d Erreur de longueur d onde une mesure sans filtre de r f rence augmentera les valeurs de DO d approximativement 0 120 Coloration jaune dans tous les puits voir 2a 2b a contamin
11. ois panels de s roconversion commerciaux ont t test s comparativement un ELISA de r f rence Le test IgM Plus ELISA a donn une sensibilit de 96 8 et une sp cificit de 97 6 20 chantillons de s rum plasma avec EDTA h parine plasma avec citrate ont t test s provenant de 20 individus 10 chantillons sur les 20 ont t additionn s de s rums de patients ayant une infection HCMV aigu Les r sultats obtenus ont t en accord pour tous les chantillons La variabilit intra s ries du test Anti HCMV IgM Plus ELISA a t tudi e en pipetant des chantillons r actifs dans 8 puits d une plaque Avec cette proc dure le coefficient de variation suivant CV a t obtenu chantillon tr s r actif 2 8 chantillon faiblement r actif 3 17 et chantillon peu r actif 1 59 La variabilit inter s ries a t valu e en testant un chantillon dans 8 s ries successives Un CV de 7 6 a t obtenu avec les chantillons tr s r actifs de 8 3 avec les chantillons faiblement r actifs et de 10 6 avec les chantillons peu r actifs Le test Anti HCMV IgM Plus ELISA a t valu sur 61 chantillons suivants risquant de donner des r actions crois es h patite C 7 h patite B 5 HSV 4 VZV 6 ANA 5 RF polyarthrite rhumato de 4 EBV 20 HAV 8 Des r actions crois es ont t observ es avec les s rums de patients infect es par EBV et HAV De l h mogjlobine et de la bi
12. pr parer un nouveau tampon de lavage b DIL ou contamin r p ter le test avec des r actifs provenant de flacons encore ferm s Utiliser les r actifs dans des conditions plus aseptiques 4 Valeur de DO moyenne de PC inf rieure lt 0 600 a Date de p remption d pass e b Temp rature trop basse ou dur e d incubation trop faible c Erreur de lavage lavage trop intensif ou contact m canique entre le distributeur et la phase solide du puits d Contamination de PC ou 3b 5 Valeur de DO moyenne de sup rieure 0 250 voir 1 et 2 a d a n a pas t pipet apr s le pipetage des chantillons pipeter tous les chantillons avant de pipeter les blancs et les contr les b Contamination par le couvercle du C 0197 189700 07 07 2010
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