Principes et pratique de l`électrophorèse sur gel d`agarose
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1. 0 8 Type d electrophor se DT Mira Me 15 20 min 25735 min 20 30 min 35 45 min 35 40 60 90 min dispara tront du gel Tableau Tampon d lectrophor se 1x tampon de cuvette Dilution Taille du support Tampon Eau du gel concentr 50x distill e 294 ml 392 ml 980 nl Volume total requis 300 ml 1000 ml 20 ml 1 800 DVOTEK Fax 202 370 1601 info edvotek com www edvotek com E DYOT E K La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716 Edvo Kit n 101 Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Questions d tude 1 En fonction de quels param tres l lectrophor se sur gel d agarose s pare t elle les mol cules 2 Expliquez la migration en fonction des charges 3 Quelle conclusion pouvons nous tirer des r sultats de l chantillon F 4 Pourquoi ajoutons nous du glyc rol aux solutions d chantillon avant de les d poser dans les puits 5 Que se passerait il si l on mettait du tampon au lieu d eau distill e dans la solution de la cuvette ou dans celle du gel 1 800 EDVOTEK Fax 202 370 1501 info edvotek com www edvotek com La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif E DYVOT E K Copyright 1989 202. 101 L lectrophor se sur gel d agarose continue 0 a hr gt p ne Verser Rappel L Avant de d poser les chantillons veillez ce que le gel soit correcte ment orient dans la cuvette de l appareil Le tampon d lectrophor se 1X Portez des gants et des lunettes de protection 8 PLACER le gel le support dans la cassette d lectrophor se COUVRIR le gel avec le tampon d lectrophor se 1x voir Tableau B contenant les volumes recommand s Le gel doit tre submerg dans son int grit 9 PERCER le paquet enveloppant le QuickStrip avec la pointe d une pipette DEPOSER les chantillons 35 38 pL dans les puits dans l ordre indiqu dans le Tableau 1 10 FERMER le couvercle de s curit VERIFIER que le gel soit plac dans la direction correcte 11 BRANCHER les prises la source de courant et REALISER l lectrophor se voir Tableau C contenant les du r es et les tensions 12 Une fois que l lectrophor se a t compl t e RETIRER le gel Tableau 1 Chargement du gel et le support de coulage de la cassette d lectrophor se et on f so jA Puits 3 Tube C Rouge NOTE Les colorants n ont pas besoin d tre teints Analyser et documenter les r sultats imm diatement la suite d avoir r a alis l lectrophor se Les colorants se diffuseront et finalement M lange de colorant bleu 1 2 Tableau Dur es et tensions lt gel d agarose
3. www edvotek com E DYOT E K La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716 Edvo Kit n 101 Mat riel exp rimental CHANTILLONS D LECTROPHOR SE READY TO LOAD Stocker les chantillons QuickStrip dans un r frig rateur imm diatement apr s r ception Tout autre composant peut tre conserv temp rature ambiante Composants format QuickStrip Orange Violet Rouge Bleu 1 M lange de colorant M lange de colorant bleu Bleu 1 Bleu 2 Nm O M gt REACTIFS ET FOURNITURES UltraSpec Agarose Tampon d lectrophor se 50x Solution d essai de charge de colorant Pipette de 1 ml Micropipettes de transfert Fournitures suppl mentaires Appareil d lectrophor se horizontale Source de courant continu Micropipettes automatiques avec pointes Balance Microondes plaque chauffante ou br leur Pro pipette Fioles ou vases bec de 250 ml Gants anti chaleur Lunettes de protection et gants de laboratoire jetables Syst me de visualisation lumi re blanche Eau distill e ou d ionis e 1L 800 EDVOTEK Fax 202 370 1501 info edvotek com La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101f 150716 Liste de contr le V Pr
4. plateaux et les cuvettes FORMAT D ECHANTILLONS LA PREPARATION DES QUICKSTRIPS Les tubes de QuickStrip comprennent un ensemble de microtitrage recou vert d un emballage de protection Chaque puits contient des chantillons de colorant pr aliquot s Couper ici Couper ici Couper ici Couper ici Couper ici En vous servant de ciseaux divisez soigneusement l ensemble de tubes en bandes individuelles en d coupant chaque file consultez le sch ma ci contre Veillez ne pas ab mer la pellicule de protection en s parant les chantillons e TI O I n 2 a Nn o Qa v zZz x Ww gt Q mr I Chaque groupe recevra un ensemble de tubes Rappelez aux l ves de tapoter l g rement les tubes avant de charger le gel afin de recueillir l chantillon dans la partie inf rieure du tube amp amp A D couper soigneusement chaque file de tubes 1 800 EDVOTEK Fax 202 370 1501 info edvotek com www edvotek com La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif E DYVOT E K Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716 11 Guide de l enseignant Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Edvo Kit n 101 R sultats e
5. sistant Le gel contient des capillaires microscopiques qui agissent en tant que tamis mol culaires Les propri t s du gel condi tionnent la vitesse de migration des mol cules les petites mol cules migrent plus rapidement que les grandes De plus des mol cules de m me masse et charge peuvent pr senter des formes diff rentes celles de forme plus compacte les formes arrondies sont plus compactes que les formes allong es migrent plus rapidement Des facteurs tels que la charge la taille et la forme des mol cules ainsi que les conditions de tamponnage la concentration du gel et la tension lectrique ont un impact sur la mobilit des mol cules dans le gel Parmi des mol cules de masse et de forme mol culaire semblable les plus charg es migreront plus vite Par ailleurs diff r entes mol cules interagissent des degr s variables avec l agarose Moins l interaction est ais e plus la migration des mol cules est ralentie Dans cette exp rience nous soumettrons divers chantillons l lectrophor se sur gel d agarose et nous observe rons la vitesse et la direction de leur migration Les colorants A B C et D sont tous trois n gativement charg s et ont des pH neutres Cependant ces mol cules diff rent par leur structure leur composition chimique et leur charge Le colorant F a une charge nette positive et migrera donc dans la direction oppos e que celle des autres colorants De plus une combinaison de coloran
6. 15 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716 Guide de l enseignant Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Edvo Kit n 101 Guide de l enseignant APER U DES PR PARATIFS R ALISER PAR L ENSEIGNANT AVANT L EXP RIENCE Cette section explique les pr paratifs de laboratoire recommand s et leur dur e approximative Pr parer les QuickStripsTM Jusqu une journ e avant la r alisation Pr parer le tampon TAE dilu de l exp rience Pr parer le m lange d agarose et verser le gel 1 800 DVOTEK Fax 202 370 1501 info edvotek com www edvotek com E DYOT E K La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716 Edvo Kit n 101 Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Guide de l enseignant Pr paratifs pr alables ELECTROPHORESE SUR GEL D AGAROSE NOTE Cette exp rience requiert un gel d agarose 0 8 par groupe d l ves Afin de pipetage est d obtenir de meilleurs r sultats nous recommandons l utilisation de 7x14 cm x P A E A de gel et le placement du gabarit peigne dans la fente du milieu Vous pouvez exp riences de la S rie 100 choisir de pr parer les gels en avance ou de permettre aux l ves de les pr parer d EDVOTEK sont pr vues pour des eux m mes Cette tape prendra 30 40 minute
7. FE O ra K THE BIOTECHNOLOGY EDUCATION COMPANY Edvo Kit n Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Edvo Kit n 101 Objectif exp rimental L objectif de cette exp rience est de d velopper une compr hension de base de la th orie de l lectrophor se et d acqu rir une familiarit pratique avec les processus de s paration de diverses mol cules par lectrophor se horizontale sur gel Consulter les instructions de stockage page 3 1 800 DVOTEK e fax 202 370 1501 e www edvotek com info edvotek com 101f 150716 Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Edvo Kit n 101 Table des Mati res Page Mat riel exp rimental 3 Fournitures suppl mentaires 3 Contexte 4 Pr sentation de l exp rience Dispositif exp rimental 5 L lectrophor se sur gel d agarose 7 Questions d tude 9 Guide de l enseignant 10 Pr paratifs 11 R sultats et analyse de l exp rience 12 Questions d tude et r ponses 13 Appendices 14 A Guide de d pannage 15 B Pr paration de lots de gel d agarose 16 Des fiches de donn es de s curit sont disponibles sur notre site internet www edvotek com EDVOTEK et The Biotechnology Education Company sont des marques d pos es appartenant EDVOTEK Inc Ready to Load QuickStrip DuraGel et UltraSpec Agarose sont des marques d pos es appartenant EDVOTEK Inc 1 800 DVOTEK Fax 202 370 1601 info edvotek com
8. entent tout ce qui se passe pendant une exp rience les condi tions exp rimentales leurs id es leurs observations et bien s r toutes les donn es d coulant de l exp rience Aujourd hui vous prendrez des notes sur votre exp rience dans un cahier de laboratoire ou sur une fiche en papier Avant de commencer l exp rience Lisez attentivement l introduction et le protocole Utilisez cette information pour former une hypoth se exp rimentale Pr voyez les r sultats de l exp rience Au cours de l exp rience Notez vos observations Apr s l exp rience Interpr tez les r sultats ceux ci confirment ils ou infirment ils votre hy poth se Si vous deviez refaire l exp rience que changeriez vous R visez votre hy poth se en prenant compte de ce changement 1 800 EDVOTEK Fax 202 370 1501 info edvotek com www edvotek com La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif E DYVOT E K Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716 Edvo Kit n 101 Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Dispositif exp rimental Pr parer le gel d agarose dans le support de coulage Q D Enlever les vis de jointure et le peigne puis submerger le gel dans le tampon l int rieur de la cassette d lectrophor se 8 D poser chaque chantillon dans un puits cons cutif O Ferm
9. er le couvercle brancher les prises la source de courant et r aliser l lectrophor se Apr s l lectrophor se transf rer le gel pour visualisation Analyser la plaque lumi re blanche 1 800 EDVOTEK Fax 202 370 1501 info edvotek com www edvotek com E DVOT E K La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716 Edvo Kit n 101 Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose L lectrophor se sur gel d agarose IMPORTANT L Ca f Le tampon y L eau distill e concentre Cette exp rience requiert du gel de 7x10 ou 7x14 cm Placer le gabarit peigne dans la fente du milieu Dans le cas o vos connais sances sur la pr paration du gel d agarose et la r alisation de l lectrophor se seraient limit es vous pourrez con sulter des instructions d tail l es et des ressources utiles sur www edvotek com Portez des gants et des lunettes de protection 1 DILUER le tampon concentr 50x avec de l eau distil l e afin d obtenir du tampon 1x voir Tableau A 2 MELANGER la poudre d agarose avec le tampon 1x dans une fiole de 250 ml voir Tableau A 3 DISSOUDRE la poudre d agarose en faisant bouillir la solution CHAUFFER la solution dans le microondes haute temp rature pendant 1
10. erv s 101fr 150716 15 APPENDICES Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Edvo Kit n 101 Appendice B Pr paration de lots de gel d agarose Afin de gagner du temps une quantit plus importante de solution d agarose peut tre pr par e l avance et dis tribu e en classe par la suite Le tampon dilu qui n a pas servi pourra tre utilis post rieurement et la solution de gel d agarose solidifi e peut tre refondue Tableau D Preparation d un lot de tampon d lectrophor se La pr paration d une quantit lot de 3 litres de a A tampon d lectrophor se 1x est d taill e dans le N distill e requis Tableau D Lot de tampon d lectrophor se 60 nl 2 940 ml 3000 ml 3 L Lot de gels d agarose 0 8 Note La pr paration en quantit lot de gel d agarose 0 8 est d crite dans le Tableau E Le poids du contenu de la bouteille d UltraSpec Aga 1 Utiliser une fiole de 500 ml pour pr parer le gel dilu rose du kit figure normale ment sur l tiquette Lisez celle ci attentivement Si la quantit d agarose n y est pas sp cifi e ou si le sceau de fermeture de la bouteille 2 Verser 3 0 g d UltraSpec Agarose dans la solution de gel Tournoyer d licatement afin d enlever les grumeaux 3 A l aide d un marqueur indiquer le volume de concentration de la solution sur la en plastique est rompu fiole pesez l agarose afin de vous a
11. incipes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose L exp rience n 101 est con ue pour 8 gels Stocker les chantillons QuickStrip dans un r fri g rateur imm diatement apr s r ception Tout autre composant peut tre conserv temp rature ambiante D OO OOO LOULOU Les composants du kit sont exclusivement d usage ducatif Ils ne doivent en aucun cas tre utilis s pour rendre des diagnostics ou des effets m dicaux et ne doivent pas tre consom m s par des personnes ni par des animaux www edvotek com EDVOTEK Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Edvo Kit n 101 Contexte L lectrophor se sur gel d agarose est commun ment utilis e pour s parer des mol cules en fonction de leur charge leur taille et leur forme Il s agit d un moyen de s paration particuli rement efficace pour des biomol cules charg es telles que l ADN l ARN et les prot ines Bien que l lectrophor se sur gel d agarose soit une technique simple et ais e elle poss de un pouvoir de s para tion efficace Le gel est fabriqu travers la dissolution de poudre d agarose dans de la solution tampon bouillante La solution est ensuite refroidie jusqu 60 C puis vers e dans un plateau de support o elle se solidifie Le sup port est alors submerg dans un appareil d lectrophor se lectrodes contenant de la solution tampon Afin de les p
12. minute RETIRER soigneu sement la fiole du microondes et MELANGER la solution en faisant tournoyer la fiole Continuer CHAUFFER la solution par p riodes de 15 minutes jusqu ce que l agarose soit compl tement dissolue la solution doit tre claire comme de l eau 4 Laisser REFROIDIR l agarose jusqu 60 C en tournoyant d licatement la fiole afin de permettre une dissipation r guli re de la chaleur 5 Pendant que l agarose refroidit FERMER le support de coulage l aide des vis de jointure caoutchout es PLACER le gabarit peigne dans la fente centrale 6 VERSER la solution d agarose refroidie dans le support de coulage Le gel devrait se solidifier au bout d une vingtaine de minutes maximum Le gel se raffermira et deviendra moins transparent en se solidifiant 7 ENLEVER les vis de jointure et le peigne En enlevant le peigne prendre soin d viter d endommager les puits Tampon Eau Quantit concentr 50x distill e d agarose Total 29 4 ml 0 23 q Taille du support du gel 0 6 ml 1 0 ml 49 0 nm 0 399 PRET CAEG continue 1 800 EDVOTEK Fax 202 370 1501 info edvotek com www edvotek com La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif E DYVOT E K Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716 Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Edvo Kit n
13. r parer pour l lectrophor se les chantillons sont m lang s avec des composants qui leur donnent plus de densit tels le glyc rol ou le sucrose Ces derniers rendent les chantillons plus denses que le tampon d lectrophor se Les chantillons peuvent alors tre d pos s l aide d une micropipette ou d une pipette de transfert dans des encoches cr es dans le gel partir d un gabarit lors du coulage Gr ce leur densit les chantillons sont submerg s dans la solution tampon et demeurent dans les puits L appareil d lectrophor se est branch une source de courant continu direct et mis sous tension Les mol cules charg es contenues dans les chantillons p n trent alors le gel travers des capillaires Les mol cules dont la charge nette est n gative migrent vers l lectrode positive de l appareil d lectrophor se anode alors que les mol cules dont la charge nette est positive migrent vers l lectrode n gative cathode Dans une certaine fourchette plus le champ lectrique est fort plus les mol cules migrent rapidement Le tampon sert la fois de conducteur l lectricit et de contr le du pH En effet le pH influence la charge et la stabilit des mol cules biologiques L agarose est un polysaccharide d riv de l agar Dans cette exp rience on se sert d Ultra Spec Agarose Ce composant est constitu d un m lange d agarose et d hydrocollo des qui rend le gel transparent et r
14. s l ves qui ont d j appris des techniques de micropipetage r A in jee et d lectrophor se sur gel Pr paration individuelle de gel d agarose Chaque groupe d l ves peut verser son propre gel avant de r aliser l exp rience Siles l ves ne savent pas utiliser les micropipettes nous Voir la description du dispositif exp rimental Les l ves auront besoin de tampon sugg rons de r aliser Cat n concentr 50X d eau distill e et de poudre d agarose S 44 Bases du Micropipetage ou Cat n S 43 DNA DuraGel Pr paration de lots de gel avant de tenter cette exp rience de niveau plus avanc Afin de gagner du temps une quantit plus importante de solution d agarose peut tre pr par e l avance et distribu e plus tard en classe Voir Appendice B Pr paration de gels en avance Les gels peuvent tre pr par s l avance et conserv s pour une utilisation post POUR L ELECTROPHORESE rieure Les gels solidifi s peuvent tre stock s sous tampon dans le r frig rateur Chaque groupe d l ves pendant un maximum de deux semaines doit avoir Du tampon concentr 50x Ne pas permettre aux gels de geler 20 C car cela les d truirait De l eau distill e L UltraSpec AgaroseT Les gels qui ont t retir s des plateaux de support pour stockage doivent tre Leeanna uici refix s aux supports l aide de quelques gouttes d agarose fondue Ceci les emp chera de glisser dans les
15. ssurer d utiliser la quantit 4 Chauffer la solution d agarose tel qu indiqu dans la section sur la pr paration ad quate individuelle de gel La dur e de chauffage varie en fonction du volume total de solution tampon 5 Laisser refroidir la solution d agarose jusqu 60 C en tournoyant d licatement la fi ole afin que la chaleur se dissipe uniform ment S il y a eu de l vaporation ajouter de l eau distill e pour maintenir le volume de concentration indiqu sur la fiole dans l tape 3 6 Distribuer le volume de solution d agarose refroidie n cessaire au coulage de gels individuels Pr voir 30 ml pour des supports de 7x7 cm 50 ml pour des supports de 7x10 cm et 60 ml pour des supports de 7x14 cm Tableau Pr paration d un lot d UltraSpec Agarose 0 8 Quantit 50X Tampon Eau d Agarose Concentr distill e 8 mI ml 7 Laisser le gel finir de se solidifier Il se raffermira et refroidira au bout d une vingtaine de min utes Pr parez enfin le gel pour la r alisation de l lectrophor se 3 0 7 5 382 5 1 800 DVOTEK Fax 202 370 1601 info edvotek com www edvotek com E DYOT E K La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716
16. t analyse de l exp rience 123456 123456 Dans le sch ma ci dessus les positions relatives des colo Puits 1 rants sont respect es mais Puits 2 ne sont pas repr sent es DT chelle Putsa Bleut Puits 5 M lange de colorant Puts Mange de colorant eut 1 800 DVOTERK Fax 202 370 1501 info edvotek com www edvotek com E DYVOT E K La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716 Consulter les r ponses aux questions d tude contenues dans le kit APPENDICES Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Edvo Kit n 101 Appendices A Guide de d pannage B Pr paration de lots de gel d agarose Des fiches de donn es de s curit sont disponibles sur notre site internet www edvotek com 1 800 DVOTEK Fax 202 370 1601 info edvotek com www edvotek com E DYOT E K La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716 Edvo Kit n 101 Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose APPENDICES Appendice A Guide de d pannage PROBLEME CAUSE SOLUTION Le gel n a pas t correctement pr par si que le tampon d lectrophor se a t correctement Les bandes ne sont pas
17. ts sera d pos e dans un m me puits lors de cette exp rience Ceci d montrera le pouvoir de s paration de m langes complexes de colorants en composants individuels de l lectrophor se sur gel d agarose 1 800 DVOTEK Fax 202 370 1601 info edvotek com www edvotek com E DYOT E K La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r serv s 101fr 150716 4 Edvo Kit n 101 Principes et pratique de l lectrophor se sur gel d agarose Pr sentation de l exp rience OBJECTIF EXP RIMENTAL L objectif de cette exp rience est de d velopper une compr hension de base de la th orie de l lectrophor se et d acqu rir une familiarit pratique avec les processus de s paration de diverses mol cules par lectrophor se horizontale sur gel S CURIT EN LABORATOIRE 1 L utilisation courante de gants et lunettes de protection est une bonne pratique de laboratoire 2 Soyez prudent avec l utilisation d appareils pour chauffer ou fondre des r actifs 3 NE PIPETTEZ PAS DE REACTIFS A LA BOUCHE UTILISEZ LES PRO PIPETTES 4 Soyez prudent en vous servant d quipement lectrique dans le laboratoire 5 Lavez vous toujours soigneusement les mains avec du savon et de l eau apr s avoir touch des r actifs ou des mat riaux biologiques en laboratoire CAHIERS DE LABORATOIRE Les scientifiques docum
18. visibles sur le gel L appareil d lectrophor se ou la source Contacter le fabriquant de l appareil d lectrophor se ou de de courant ne fonctionne pas correctement la source de courant Les colorants devraient migrer au moins Les bandes ne sont 3 5 cm support de 7x7 cm et au moins Veiller laisser progresser le gel d au moins 6 cm peu pr s toujours pas visibles 6 cm support de 7x14 cm par rapport une heure 125 V aux puits Veiller pr parer le gel d agarose la concentration ad quate Les chantillons Ready to Load servant de r f rence doivent tre analys s avec un gel d agarose 0 8 Il n y a pas de s paration Un gel de concentration erron e a servi entre les bandes la r alisation de l lectrophor se Je ne vois pas le colorant Le peigne n a pas t plac dans la position qu il fallait Veiller positivement charg sur Le colorant s est coul du gel placer le peigne dans les fentes situ es au milieu du plateau le gel de support Il n y a pas suffisamment i i d chantillon dans mon Le QuickStrip s est dess ch Ajouter 40 uL d eau pipeter d licatement de haut en bas afin QuickStrip de m langer avant de charger 1 800 EDVOTEK Fax 202 370 1501 info edvotek com www edvotek com La reproduction m me partielle de ce document n est autorisee qu des fins ducatives sans but lucratif E DYVOT E K Copyright 1989 2015 EDVOTEK Inc Tous droits r s
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