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Effets et modes d`action de deux lectines à mannose sur le puceron

1. N 0 N N Qo N NS Y m Ny NY AR S 5 y M T NV co PS ox E OY oh co co co ceu cA en Asp o n Asp e Thr Thr Ser l m Ser Q Asn Asn p Glu 7 7 9 9 Gin Glin t Pro Pro _ i Gly I Gly i 0 O Ala Ala D val T Val J Met ml Met Ile bd T lle Leu P n 1 Leu Ei Tyr m n I Phe a l 1 Phe 7 o Balatyr O Orn O Balatyr 9 im e 9 Lys i His ys l Arg b Q His O Totaux Arg n chelle chelle O 90 80 70 96 50 96 Figure 47 Repr sentation sch matique et synth tique des r sultats du dosage par chromatographie des acides amin s libres de broyats de pucerons laiss s 48 h sur d
2. 062 var 045 var 16 var3 012 var4 Ol vars 006 var6 iN 0 N IN 0 0 21 28 0 21 36 9 21 14 0 D 140 9 21 120 19 21 2X var i varg var9 var10 varll US 042 005 0 NA lt AD Ja 1 250 12 9119 12 ConA 600 8h ET var3l zm vard AG vars oo var6 0 0 912 2 0 190 0 12 26 9 21 49 var var10 varli 0028 028 l 21 E 1 2 9 21 49 ConA 600 24h nO var yi var2 di vars Lo vard 4 var jyi4 var6 pz 6 796 U U 19 12 100 9 12 E 39 21 1500 03 var8 n var9l 059 var10 009 var11 0 0 0 5 12 1 1200 15 21 100 H ol 19 12 Figure 37 Descriptif graphique de l analyse statistique des enregistrements EPG r alis s avec des pucerons de l esp ce Acyrthosiphon pisum sur des milieux standards simples ou contenant 600 ug ml de Concanavaline A Superposition des courbes de Gauss par modalit t moin amp ConA600 pour trois dur es d acquisition 4h 8h amp 24h et position des moyennes 1 amp 2 pour les 11 variables retenues dans l analyse Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 118 10 a 15 de la variabilit des donn es est de type inter modalit A contrario 85 90 de la variabilit est donc li
3. 96 Figure 27 Sch ma simplifi du circuit lectrique d enregistrement d un EPG sur milieu artificiel 97 Figure 28 Comportement de larves de l esp ce A pisum mises en condition de choix entre deux milieux de compositions diff rentes irais ato eot et ei er e RS RUE CREE Sees E e qe Perque 102 Figure 29 Comportement de larves de l esp ce A pisum intoxiqu es par de la Concanavaline A a 400 ug mI l puis mises en condition de choix entre deux milieux de compositions diff rentes 103 Figure 30 Comportement de larves de l esp ces A pisum mises en condition de choix entre du milieu standard Ap2 et une solution de saccharose 10 96 tto t e tr etats pda nO 105 Figure 31 Quantit s de milieu marqu 14C inuline avec ou sans ConA 200 ug ml 1 ing r es par des larves de l esp ce Acyrthosiphon pisum pendant des dur es comprises entre 2 h et 16 h 107 Figure 32 Quantit s de milieu marqu 4c inuline avec ou sans ConA 400 ug ml 1 ing r es par des larves de l esp ce Acyrthosiphon pisum pendant des dur es comprises entre 2 h et 48 h 107 Figure 33 Quantit s de milieu ing r es en 48 h par des pucerons adultes de l esp ce Acyrthosiphon pisum fix s sur des milieux standards Ap2 contenant 200 400 ou 800 ug ml l de Concanavaline A 109 Figure 34 Analogies entre le type d ondes C et G observab
4. eene 232 233 Annexe 13 Abr viations utilis es dans les figures 44 45 et 54 Ponsen 1972 1987 333 Chapitre 1 Contexte de l tude 12 Chapitre 1 Pr sentation du contexte de l tude Introduction Les pucerons infestent la plupart des plantes cultiv es et constituent un des groupes d insectes les plus nuisibles en r gions temp r es Les d g ts sont caus s par des toxicoses ou des affaiblissements de l h te Ils sont d autant plus graves que ces insectes poss dent un formidable pouvoir de multiplication Par ailleurs les pucerons sont les principaux vecteurs de virus v g taux Leur contr le chimique pose souvent des probl mes du fait qu ils se fixent g n ralement la face inf rieure des feuilles et qu ils sont difficiles atteindre par les traitements et les cas de r sistance aux produits chimiques sont de plus en plus fr quents L utilisation de vari t s r sistantes apparait aujourd hui comme l une des composantes majeures de la strat gie de lutte contre ces insectes L introduction dans le g nome du v g tal d une partie des facult s de d fense de la culture est en effet un objectif s duisant et la s lection vari tale classique a d j permis d enregistrer des r sultats int ressants contre de tr s nombreux insectes Smith 1993 Mais cette approche pr sente n anmoins des limites et des inconv nients Elle suppose notamment que le s lectionneur dispose de g ne
5. eese 224 Annexe 6 Corr lation entre le type d ondes enregistr es sur un graphe d EPG et les activit s de p n tration des stylets d un puceron Tjallingii 1990 Van Helden 1995 Repr sentation sch matique des diff rents types d ondes observables sur un EPG Tjallingii 1988 225 Annexe 7A Fen tre de travail du logiciel d analyse des donn es EPG MacStyletiM sentis 226 Annexe 7B Statistiques calcul es par MacStyletlM sees ener nennen 226 Annexe 8 Discriptif sch matique du dispositif labor pour enregister le comportement d alimentation des PUCETONS sur imilieu artiHolel uero tete ree rete vaste sven ONE ma nt nie etienne 227 Annexes 9A F Descriptifs graphiques des analyses statistiques des enregistrements EPG r alis s avec A pisum sur milieux standards simples ou contenant 400 ou 600 ug ml l de ConA Histogrammes et courbes de Gauss par modalit pour des dur es d acquisition de 4h 8h et 24h pour chacune des 11 variables retenues dans les analyses 228 230 Annexe 10 R sultats des dosages ELISA r alis s sur une gamme de Concanavaline A 0 01 10000 ng puits avec 3 concentrations diff rentes de conjugu 231 Annexe 11 Repr sentation sch matique de tubes digestifs de diff rentes esp ces aphidiennes Ponsen Annexes 12A C Tableaux des r sultats des analyses des acides amin s libres de pucerons entiers et de leur miellat pucerons laiss s 48 h sur milieux ConA ou GNA
6. seen ener enne enne 205 Fiche N 10B M thode indirecte de dosage de la GNA par ELISA protocole Kirkegaard amp Perry Laboratories Inna DECEM 205 Fiche N 11 Ajustement des donn es d inhibition de croissance des pucerons au mod le de Michaelis MOMS aos epe eri e repr pea ne pee Etpe erster ee sores ento eere eere qoos 206 Fiche N 12 D finition du taux intrins que d accroissement naturel rm d une population de pucerons 207 Fiche N 13 Principe de la m thode du Jackknife pour estimer la variance du rm d une population de i soc ere ne Semen tree vannes Some O M M N 208 Fiche N 14A Mod lisation de la dynamique de ponte des pucerons Guy Bonnot comm pers 209 Fiche N 14B Justification du choix du mod le utilis pour d crire la dynamique de ponte des pucerons 210 Fiche N 15 Mesure de l ingestion de milieu marqu inuline l4c EY RSR ie tee ee 211 Fiche N 16 R colte du miellat excr t par des pucerons sur milieu artificiel 211 Fiche N 17 Protocole d lectrophor se sur plaque de gel 212 Fiche N 18 Pr paration des chantillons de miellat de tube digestif et d h molymphe avant dosage de la ConA PAL ELISA rita ro ee enr IH Ao ERR GER hls cies ta etes 213 Fiche N 19 Solution physiologique insecte liquide Yeager Nardon 1978 213 Fiche N 20 Pr paration des coupes histologiques ss 214 Fiche N
7. 5 10 15 20 Ajustement effectu y P B x P e 8 25 30 Jours Figure 16 Effets de doses subl tales de la Concanavaline A et de la lectine du perce neige GNA sur la survie et la f condit du puceron vert du p cher Myzus persicae la l gende est expliqu e dans le texte l erreur standard est report e pour chaque point de la figure B les valeurs des param tres P1 P2 et P3 observ s ou donn s par le mod le sont pr sent es dans le tableau de la figure C erreurs standards entre parenth ses N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 73 3 2 Performances biologiques de M persicae et d A solani sur des pommes de terre transg niques exprimant les genes de la GNA et ou de la BCH 3 2 1 Estimation des taux d expression des transg nes 3 2 1 1 Dosage de la GNA par chimioluminescence Cette technique de dosage ECL fiche protocole N 7 nous a permis de mettre en vidence la pr sence de la GNA dans les feuilles des lign es de pommes de terre de notre derni re s rie exp rimentale janvier 1995 GNA2 23 GNA2 28 GNA2 30 et PWG6 85 L intensit de coloration des taches obtenues est cependant tr s variable en fonction des d p ts 5 6 par modalit Ceci pourrait tre li une expression diff rentielle du g ne de la GNA dans les feuilles pr lev es diff rents niveaux de la plante mais la technique des d p ts pourrait aussi expliquer cette variabi
8. Annexe 12A s n OL ee Sarre Gr ES 69 Eti ELz zc Ps y Jouan SYND zs 0 EX G1 zeg EE Le 9i VNENYUCD COFYNDVOOrW UES D0ZWUO guus ANS OOFYNEVIMYNENGYNENUIONS Wu0D ODBEYUOCVOOF USD OOZYUOD MOUs BEQEPOW xe ueyodde as sedque oc sap suasieaduoc op orbujpgulzied uou 199 2 sunos euo snos eureojA er ep jegiodde n Ry Sued XNA sep juemgsuoo GUUR apoy DAV Sump wiwo ua sid uou L ze 8L wre TA bri 15 59 51 ys cet 98 54 mm aequis uojmueu2a p Bui yjouru sayniq sasuuog s1enue suoJeond TYY B Annexe 12 ca opt che sz ees evo upm um340eg EVNE WNDVYUOD 00FYNO OF VGZ Vu gaua NO CO YNEVOZY NENS VN OUIOULE OD 00AT uV UNIQUE agapo xar juguoddgei os saaua ou sop suosieedw ap efbijewesed ueu 156 Z SONOS ewo snos eureo1A e ep seuodde p RERSULAd XNA sap puenisunoo patus apoy jay Sue a9duio3 ua sud uou 1 ra aeot H6 FAS RS as ev S3Ale 2J seauuoq sJanua suoJsangd TYY V Seuppow sp sexx ea rump spp msan ecu 3nes qeueozm 2p CUT chap v an uoquaojo2 sp suki sa gong t uns surgdogda n mp wos summo auis pucr SET sp L4 p sep airo u mad mot c V ND aod ouf p 2 DOBVUCD p0p Vu F uz vao mod ent g ap amatus X sum s mod sud sg sxervodusoo 4 enar uwo an w ap neo e poodsazo mriuajaz ep sdwa yop 20d p st110mo2 uos vore ano sp podde suns v v
9. 104 deuxi me acide amin excr t quantitativement en situation t moin 105 son rapport de coloration sur les deux canaux de l autoanalyseur le distingue tr s clairement de la cystine 106 une voie Pro gt Arg encore mal connue a t r cemment mise en vidence au laboratoire par marquage radioactif Liadouze non publi Febvay er a 1995 Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 172 Nous serons un peu plus bref sur l interpr tation de l effet de la GNA qui comprend aussi des donn es faibles doses o l on observe clairement effet probiotique Une analyse des miellats figure 49 partie droite annexe 12C avec donn es chiffr es montre que m me la plus forte dose utilis e 400ug ml la GNA ne semble pas induire des symp mes aussi importants que la ConA On observe bien la stimulation de l excr tion d arginine mais ici l effet semble plus marqu sur l histidine et un peu moins au d triment de la lysine que dans le cas de la ConA Il y a donc bien conservation de l effet sur l excr tion Arg Orn Pro d un cot et His de l autre mais dans des modalit s l g rement diff rentes Par contre l effet de fuite de l asparagine est tr s peu visible avec la GNA nous observons simplement une tr s l g re accumulation de Asn Glu Gln dans les miellats haute dose de GNA On observe galement dans ces conditions une accumulation de compos s ninhydrine positifs non identifi s dans les
10. N e et E ky Ty kat On Noe ka CT Qi Nye 7 UM 4 Pour simplifier cette criture posons T t T Qi Ne 5 d apr s 2 on a dQ kn T Ta eO Nee um 6 en postulant que la solution de cette quation soit de la forme key TF On xry 6 on obtient dQ dC 7 ep On 1 dT Q dT 7 En identifiant membre 4 membre 6 et 7 on obtient dC ky T __ ky T dT ks Ne dC soit 2 k N eU nt dT k N soit Cur k 21 et T A 32 53 ka N Hec p et donc On 21 0 es ET o ky T A e kay T 8 ky kz k N si T O alors t T et Qro 0 2 0 A ko n ky k N donc A 0 21 ks 8 devient alors RUN er Ky Ny kT Or 21 0 e 21 21 0 e 32 ks a ky k ky k N E soit en k 21 E Je ho 32 a1 d La fonction de ponte 3 y L Kiz Q devient t kz k ig ue ke t y 32 Roi Nofe ka D o7 At 9 kz ER kz Des ajustements r alis s avec cette fonction ont montr la tr s forte liaison entre E et hs et ont attribu des valeurs gales aux deux param tres Compte tenu de cette redondance le mod le a t simplifi comme suit crivons 9 sous la forme k t Tp kz t7 Ty e e k k N y 32 R51 1 9 TER on peut d montrer que si kj et ky tendent vers la m me valeur k alors le mod le 9 tend vers la forme y k N t je 10 Sion pose P N nombre to
11. amd WHd 166 SNJ omosos4 np P AMEN ap waan ne Panona as mod amiyapide T861 MAYO 19 Bozma ap SANTE sap strep aima ap apqrasiraou wou ameenb zunp aa unsayn ap sopeuroal 961 77 12 utN sanmd sap sgus pL sop TITS E 3p sapuojoud suorng2ourpouu 3 aod VIId mE 1nq30 NE S3 Q152243J SUOISST WET RN erosa STEP 12271p aseqn saxde amydnz LSI IP i reyzsng 2p smod sap myrasa1d rmmapon np SAINS sap assodg ma amps T1 SOIIE 12 WHd sao sap arsejdradq osnanbnui g Ip suomng122s sop uongjuzuiding L66L reizsng 21947 unsziur zp 2130poudioui cionu 12 sew e IP uoneaumpoui EWS eoat ae sapuna sonbpeurseri soununqje 12 Hansip songs asnanbnru v ap SANTA suspe amaro p anm ma sarad Samma aam p ATTEND eT ap HOTEL aum 1661 TEYZSN me 4 PATATE qumuauiane sape 12 s31rmguum SUR emil amesso WWISIPOYETRS np neue LRGL 77 1 re1z5ng SWAG op SIWR SUNOS sap VOIES ON 2p 936621442 9SIEATIEUI tes FHd C11 np 214oujseur say se 2ururejsit p uone ePLGL TIR AWH B OP MES np s2un29 sap Jed sagipsus szurejuxxurpe SONT SUOJIEN ORAL TE 22 suigjoci 31q02122 D x tt DureUEIQUIN 31 Igesuurad e IP 2onnumup me Vid UWS 2 SUEP SINMA 3p IUIS ZLAL LUI A 2u amp ef W JAH AMMU NP 250349p IP S3UISTUe23U SIT MAL 5220273 721U1 21 2013 u2 9 TRAT WSIC 12 roszUaMY 25501 ua ampio v 22 amyd 2 278 vrisoqm 2p SAISON sap somone jer 86 THIZSNZNSASIp aqm np soseuryorgim 19 sosepndadrp sap Prang ap gonnurmmp Tu
12. l aide du logiciel ADE 3 6 Chessel et Dol dec 1995 Le tableau des donn es brutes est report en annexe 4 L origine des lectines test es est donn e dans la fiche protocole N 2 2 9 2 Comparaisons des taux de survie Les taux de survie 96 un jour donn sont compar s par un test standard de comparaison de pourcentages loi Hyperg om trique n 40 60 traitement vs t moin Les concentrations l tales 50 sont calcul es partir du logiciel Toxico M annexe 5 Febvay amp Rahb 1991 La th orie de ce calcul consiste lin ariser par l utilisation des probits la sigmoide correspondant au pourcentage de mortalit par rapport au logarithme de la concentration Bliss 1935 Cette transformation permet notamment de fournir un intervalle de confiance la CL50 Pour les prot ines moins toxiques il est possible de demander le calcul de la CL20 et de son intervalle de confiance N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 57 2 9 3 Comparaisons des masses moyennes Dans un premier temps les masses moyennes des pucerons de chacune des boites d une modalit donn e sont compar es par une analyse de variance a un facteur ANOVA StatView 49 Abacus Inc USA pour d celer un ventuel effet bo te Un test de comparaison des moyennes a posteriori Test de Bonferroni Dunn SuperANOVA Abacus Inc USA permet ventuellement de supprimer une boite de l analyse Les masse
13. 4 3 mm Host planis Mostly Leguminosae of the tribes Genisteae Cytisus Genista Sarothamnus Sparnum lrtoleae Medicago Meltiorus Ononis Trifolturr Trigonella Fabeae Lathyrus Lens Pisum Vicia Hedysareae Hippocrepis Onobrychis and also colonizing few members of other tribes e g Lurus Loteae Astragalus Galegeae and Giycine Phaseoleae Under dry condi tions someumes found on Capsel a bursapasiorts There is much evideucc tial at least in Europe many populations occur with particular host plant prelerences e g pea feeding populitiuns ac distinguishable from those colonizing AMfedicugu M ller 1990 One form which lives only on Oron is probably a distinc species Virus wansmission A vector of more than 30 virus diseases including non persistent viruses of beans peas beet clover cucurbits Narcissus and Cruciferae and the persistent viruses pea enation mosaic and pea leat roll Distribution Onigininally probably palaearctic now almost world wide although a number of the earlier records of A pinon from outside Enrape apply te species such as Macrosiphem euphorbiae and Aulgcorthum solani C 1 E Dietrisution Map 23 revised 1982 Biology Helocyclic on various leguminous hosts in temperate regions in warmer climates there is presumably facultative anholocycly Both apterous and alate males are known Cock 1963 gives an account of the ecalngy nf A pisum in North America Stary and Gonzalez
14. A plus fort grossissement les cellules pith liales de l estomac d A pisum portent leur face apicale une bordure stri e Elles semblent pr senter les m mes caract ristiques que les cellules intestinales de vert br s microvillosit s recouvertes de glycocalix mitochondries nombreuses gouttelettes lipidiques La qualit des coupes ne nous permet pas n anmoins de distinguer du r ticulum endoplasmique granulaire et l appareil de Golgi Forbes 1964 les d crit chez M persicae L intestin est la continuation tubulaire de l estomac Il est divis en deux r gions La premi re d entre elles s tend de la boucle en sortie de l estomac la boucle abdominale figure 43 Il existe ensuite une zone de transition jusqu la seconde r gion qui s largit Apr s une succession de boucles celle ci rejoint le proctodeum Les cellules pith liales de la premi re r gion renferment chacune quelques vacuoles et un noyau quasi sph rique alors que celles de la seconde partie de l intestin sont fortement vacuolis es et ont des noyaux ovoides Les surfaces libres des cellules triangulaires de l intestin sont stri es les microvillosit s apparaissent bien plus longues que celles de l estomac et offrent une plus ou moins grande lumi re Dans la seconde r gion de l intestin en particulier au niveau des boucles situ es dans le thorax Ponsen d crit des triplets de petites cellules la cellule du milieu poss dant un grand noyau sp
15. Debray et al 1981 Debray et Roug 1984 Van Eijsden et al 1994 Les travaux sont bas s sur l tude des structures cristallines de complexes lectine monosaccharide Derewenda et al 1989 Bourne et al 1990b Loris et al 1994 ou de complexes lectine oligosaccharide Bourne et al 1990a Bourne et al 1992 Delbaere et al 1993 Rini et al 1993 Trois groupes d acides amin s du site de liaison aux monosaccharides des lectines tudi es sont impliqu s directement liaisons hydrog ne dans l interaction mol culaire avec le mannose Imberty et P rez 1994 et van Eijsden et al 1994 d crivent en particulier les acides amin s intervenant dans l interaction de la ConA de la lectine de la lentille LcH ou de la lectine du du pois PSA avec le mannose Mais la conformation de la prot ine la pr sence de cations Mn et Ca proximit du site de liaison ou l intervention de mol cule d eau pour stabiliser le complexe form sont autant de facteurs qui sont aussi impliqu s dans la sp cificit de reconnaissances des sucres par les lectines Bourne ef al 1990a Imberty et Perez 1994 Il nous parait difficile dans le cadre des travaux pr sent s dans cette th se de rentrer plus dans les d tails de ces interactions mais le mod le biologique dont nous disposons A pisum milieux artificiels d finis ConA GNA parait favorable l investigation des interactions lectines oligosaccharides in vivo Chap
16. Dv dur e de vie moyenne j 22 2 0 7 a 23 5 1 0 a 23 2 0 5 a 21 8 0 8 a 20 3 0 6 b mortalit des adultes J20 5 21 96 5 96 25 96 30 Effets Croissance d dur e de la p riode pr reproductive 9 7 0 1 a 9 80 D b 8 5 0 1 a 10 1 0 2 b 99 02 b sur masse moyenne J20 31505 a 23600 b 218 D b les masse rapport e au t moin J20 100 96 75 96 69 96 adultes gain de masse de Jg J20 46 a 619 6 b 56 b F condit Dr dur e de la p riode reproductive 11 2 0 5 ab 10 6 0 4 ab 11 2 0 3 a 10 1 0 4 b 9 2 0 3 c Lv nombre de larves pondues puceron 20 5 1 3 a 167 D bi 18 7 0 7 a 13 3 0 5 c 11 6 0 4 d Lv Dv 0 94 0 07 a 0 72 0 04 b 0 81 0 03 a 0 62 0 03 c 0 57 0 02 c Lv Dr 1 81 0 07 a 1 58 0 06 b 1 67 0 05 ab 1 33 0 03 c 1 27 0 03 Md larves pondues en une dur e gale d 17 1 1 0 a 13 8 0 8 b 13 9 0 6 a 10 8 0 5 b 9 5 0 5 b DT dur e pour doubler la taille de la population 3 12 3 38 2 91 3 81 3 94 selon Taux intrins que d accroissement naturel rm SDjack Birch 1948 Wyatt amp White 1977 0 222 0 005 a 0 215 0 006 a 0 205 0 005 b 0 197 0 005 b 0 238 0 006 a 0 227 0 005 0 182 0 004 b 0 174 0 004 b 0 176 0 003 b 0 166 0 003 b Tableau 9 Effets de do
17. a y standard Ap2 C Saccharose 10 25 25 O fixation totale 0 0 Heures Figure 30 Comportement de larves de l esp ce A pisum mises en condition de choix entre du milieu standard Ap2 et une solution de saccharose 10 Les larves sont conditionn es au pr alable 15 heures sur A milieu Ap2 B milieu Ap2 400 ug ml 1 de Concanavaline A 100 75 50 25 Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 106 La figure 30A montre logiquement que le milieu Ap2 est pr f r a la solution de saccharose Ap2 est riche en acides amin s qui sont aussi des phagostimulants Il est int ressant de constater que les larves font leur choix tr s rapidement en moins de 30minutes Comme dans les tests pr c dents il faut attendre environ deux heures pour voir toutes les larves fix es Sur la figure 30B il apparait que les larves pr alablement intoxiqu es se fixent toujours pr f rentiellement sur les milieux Ap2 Elles semblent donc incapables ou tout au moins faiblement capables d associer le contexte gustatif et la toxicit 10 15 d entre elles se fixent sur les milieux saccharose dans les quatre premi res heures Il pourrait s agir de larves reconnaissant effectivement le milieu Ap2 et qui le consid rant comme toxique se fixeraient pr f rentiellement sur le milieu saccharose mais un pourcentage important de larves ne sont pas fix es pendant ces qua
18. a 45 5 4 b 501 41 6 a 129 13 bc 201 18 10 b 53 4 10 c 824 82 15 a 130 11 c 14 491 52 16 b 88 10 10 c Tableau 14 Quantit s de milieu Ap2 marqu avec ou sans ConA 400 ug mI 1 ing r es par des larves de l esp ce Acyrthosiphon pisum pr alablement intoxiqu es ou non ConA 400 ug ml 1 pendant des dur es de 2h 48h Les quantit s moyennes ing r es sont exprim es en nanolitres L erreur standard SE est donn e entre parenth ses Sur une m me ligne les valeurs suivies par des lettres diff rentes diff rent milieu marqu en C Inuline Les r sultats exprim s sur la figure 32B et le tableau 14 moiti droite sont plus tranch s que ceux de la figure 31 D s la seizi me heure les pucerons pr alablement intoxiqu s puis transf r s sur milieux standards commencent tre significativement moins affect s que les pucerons intoxiqu s continuellement Vingt quatre heures apr s avoir subi cette intoxication les larves transf r es sur milieu Ap2 s alimentent normalement en effet dans l intervalle de temps 24 48 h elles ing rent autant que des larves non intoxiqu es 290 nl vs 320 nl figure 32A amp B Le nombre de mues est un autre indice qui permet de rendre compte des effets de l intoxication nombre indiqu entre crochets dans le tableau 14 Dans le cas pr sent les larves pr alablement intoxiqu es puis transf r es s
19. la dur e de vie d une g n ration d veloppement larvaire vie adulte 30 35 jours Un premier test a t r alis avec une dose de 80 ug ml une dose suppos e induire une inhibition de croissance comprise entre l IC20 et l IC50 Cette estimation est relativement impr cise car il existe une variabilit de la r ponse du clone LLOI aux diff rents tests d intoxication aigu que nous lui avons fait subir Ce premier test sur la f condit avec la dose de ConA 80 ug ml confirme cette variabilit puisqu l issue des 8 jours de d veloppement J7 l inhibition de croissance observ e n est que de 10 tableau 8 Le test a cependant t Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 66 poursuivi avec cette dose puis recommenc avec deux autres doses 100 ug ml et 200 ug ml induisant respectivement des inhibitions de croissance d environ 50 et 60 9549 Le tableau 8 r sume les performances des larves d une part et des adultes d autre part intoxiqu s aux trois concentrations de ConA Les courbes de survie et de f condit sont d crites dans la figure 15 La masse moyenne des jeunes adultes J7 sur milieux t moins et leurs dur es de vie moyenne ne sont pas significativement diff rentes d un test l autre laissant penser que ces deux lots de pucerons sont identiques En r alit il n en est rien La figure 15B et surtout la figure 15C ainsi que les estimations des rm montrent que le lot de
20. 100 80 60 40 mannane 20 ConA 1 5 uM mannane GNA mannane mannane GNA 8 uM mannane 0 1 1 10 Concentration en mannane mM chelle Log x 0 1 Figure 53 R sultats graphiques des exp riences d inhibition comp titive de la toxicit de trois lectines mannose glucose par le mannose et le mannane Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 166 3 3 3 Exp riences d inhibition comp titive de la toxicit par des mannosides 3 3 3 1 Exp rience 7 v vo De nombreuses tudes toxicologiques chez le rat introduction de ce chapitre montrent qu en incorporant dans un aliment contenant de la ConA un sucre appropri mannane o m thyl mannoside mannose il est possible d obtenir une inhibition partielle ou totale des effets toxiques de la lectine Conform ment la d finition des lectines ces exp riences d montrent que la ConA agit bien comme une lectine c est dire en interagissant avec des sucres vraisemblablement des r sidus mannosides de r cepteurs membranaires selon la r action lectine sucre c ine lectine sucre Les anglo saxons d signent cette r action par le terme lectinic reaction Le sucre ajout en exc s dans l aliment d place l quilibre en lib rant des lectines complex es et en abaissant donc la dose active de lectine Nous avons repris cette d marche qui consiste rajouter un sucre appropri pour inhiber l action de
21. 1317 119 919 6 0 2 5 74 1 G4 130 17 ConA600 28 6 4 1 3 8 1 17 2 505 1250 34 8 180 12 14718 17 8 4 9 3 5 0 7 78 70 9 143 18 P 35 4 53 2 78 5 97 9 83 81 8 53 5 43 7 31 8 23 1 60 2 8 h T moin 27 14 26 16 7 3 7 4 1 0 1320 565 374 26 208 30 38 2 2 9 9 5 3 2 52 4 3 6 192 30 ConA600 28 13 8 2 3 16 6 2 8 3 9 0 6 45 8 674D 360 17 181 28 34 5 24 7 5 18 58 1 2 8 173 29 P 90 9 98 9 92 4 24 6 55 5 65 4 51 7 32 4 57 6 21 2 63 8 24 h T moin 127 349 56 40 4 65 80 14 89 13 154 30 798 83 256 6D 71 4 4 5 18 6 3 10 1 1 6 188 34 ConA600 28 42 3 4 0 51 0 4 6 11 3 1 1 124 16 22209 778 55 102 10 67 7 2 6 20 7 2 2 11 60 81 8 P 28 8 18 5 6 7 9 6 6 84 25 5 7 47 8 61 3 46 8 0 3 Tableau 16 Valeurs moyennes de chacune des 11 variables retenues pour l analyse statistique des enregistrements EPG obtenus avec des pucerons de l esp ce Acyrthosiphon pisum sur milieux standards simples ou contenant de la Concanavaline A Les pucerons ont t test s sur des milieux ConA 400 ou 600 ug ml au cours de deux exp riences ind pendantes Les valeurs sont calcul es SE pour des dur es d acquisition de 4h 8h et 24h La probabilit d galit des moyennes est donn e test Mann Whitney StatView 4 Les temps sont exprim s en minutes var 4 5 6 7 amp 11 Chapitre 3 Ef
22. 21 Pr paration des tampons phosphates Sorensen x M zone tampon 5 0 8 2 215 Fiche N 22A Fixateurs utilis s pour la fixation des larves de pucerons en vue d observations en microscopie lectronique transmission sise 216 Fiche N 22B Fixation et d shydratation des larves de pucerons en vue d observations en microscopie lectronique transmiIsSiON eene eene ene enne nennen nennen terere trennen rennen nennen 216 Fiche N 22C Inclusion dans la London Resin White Newman et al 1982 217 Fiche N 23 Extraction des acides amin s libres broyats de pucerons extraits de miellat 217 Liste des annexes Annexes 1A F Fiches descriptives des six esp ces de pucerons utilis es au cours de notre travail Acyrthosiphon pisum Aphis gossypii Myzus persicae Aulacorthum solani Macrosiphum euphorbiae Macrosiphum albifrons d apr s Blackman et Eastop 219 221 Annexe 2 Exemples d esp ces aphidiennes r sistantes aux insecticides d apr s Devonshire 1989 222 Annexes 3A amp B Mode d action de la lectine du haricot PHA et de la Concanavaline A sur des animaux de laboratoires rats principalement tableau non exhaustif 223 Annexe 4 Tableau des donn es brutes sur lequel l ACP de la figure 9 a t r alis e 224 Annexe 5 Notice d utilisation du programme ToxicologielM
23. Bot 1994 Vol 45 N 274 p 623 631 Shibuya N Goldstein I J Van Damme E J M et Peumans W J Binding properties of a mannose specific lectin from the snowdrop Galanthus nivalis L bulb J Biol Chem 1988a Vol 263 N 2 p 728 734 Shibuya N Goldstein I J Van Damme E J M et Peumans W J Binding properties of a mannose specific lectin from the snowdrop Galanthus nivalis bulb J Biol Chem 1988b Vol 263 N 2 p 728 734 Shukle R H et Murdock L L Lipoxygenase trypsin inhibitor and lectin from soybeans effects on larval growth of Manduca sexta Lepidoptera Sphingidae Env Entomol 1983 Vol 12 N 3 p 787 791 Bibliographie 192 Simon J C Dedryver C A Pierre J S Tanguy S et Wegorek P The influence of clone and morph on the parameters of intrinsic rate of increase in the cereal aphids Sitobion avenae and Rhopalosiphum padi Entomol exp appl 1991 Vol 58 p 211 220 Sj lander A Magnussen K E et Latkovic C The effect of Concanavalin A and wheat germ agglutinin on the ultrastructure and permeability of rat intestine Int Archs Allergy appl Immun 1984 Vol 75 p 230 236 Smith C M Plant resistance to insects a fundamental approach New york John Wiley amp Sons Ed Wiley 1993 270 p Srivastava P N et Auclair J L Characteristics and nature of proteases from the alimentary canal of the pea aphid Acyrthosiphon pisum Harr Homoptera Aphididae J Insect P
24. Boulter Gatehouse et al 1990 faible GNA lectine de perce neige Tabac Hom Mp protection moyenne non Hilder Gatehouse et al 1994 Axis lectine Luzerne oui 1 USDA 1993 Inhibiteurs de prot ase CpTI serpine de ni b Tabac Lep Hv bonne expression non Hilder Gatehouse et al 1987 OCI oryzacystatine I de riz Peuplier Col Cp protec signif non Lepl Jouanin et al 1995 OCI Tabac Col oui non Masoud et al 1993 TI PI serpines de tomate et pdt Tabac Lep Ms oui non Johnson et al 1989 Autres g nes ISA neurotoxine de scorpion Tabac Lep Hv n gatif pas d activit non Pang et al 1992 o Al Inh o amylase de haricot __Pois Col Cm bonne protection non Shade Chrispeels er al 1994 Tableau 4 Exemples de plantes transg niques produites pour la r sistance a des insectes non exhaustif abr viations d insectes Col opt res Du Diabrotica undecimpunctata Ag Anthonomus grandis Cp Chrysomela populi L pidopt res On Ostrinia nubilalis Hv Heliothis virescens Sl Spodoptera littoralis Ms Manduca sexta Hz Heliothis zea Ha Heliothis armigera Kl Keiferia lycopersicella Md Malacosoma disstria Ld Lymantria dispar Homopt res Mp Myzus persicae 1 r f rence USDA 1993 Record of environmental release permits to February 1993 USDA APHIS Biotechnology permit unit 6505 Belcrest road Hyattsville Maryland 2 cit par Dale et al 1993 N Sa
25. Erythrina cristagalli ECA Y L5390 Galanthus nivalis GNA purif Glycine max SBA Y L1395 Lens culinaris LcH Y L9267 Maackia amurensis MAA purif Narcissus pseudonarcissus NPA purif Phaseolus coccineus PCA Y L3138 Phaseolus lunatus LBA E L1701 Phaseolus vulgaris PHA Y L9017 Pisum sativum PSA Y L5380 Robinia pseudoacacia RPA E L4101 Sambucus nigra SNAI purif Sambucus nigra SNA2 purif Sophora japonica SJA Y L6138 Trichosanthes kirilowii TKA E L5600 Triticum vulgaris WGA Y L9640 Tulipa sp TL purif Ulex europaeus UEA Y L6762 Urtica dioica UDA purif Vicia faba VFA E L4801 Vicia villosa VVAg Y L4011 Vicia villosa VVAm E L4603 Y Sigma E EY Laboratories purif purifi es par Van Damme amp Peumans Universit Leuven Belgique Fiche N 3 Composition du milieu standard Ap2 Milieu Qtit pour Ordre Pds Mol mM 100 ml 1 Saccharose 342 3 584 20000 2 L Amino acides mg Alanine 89 09 20 06 178 71 B ta Alanine 89 10 0 70 6 22 Arginine 174 20 14 06 244 90 Asparagine H20 150 14 19 88 298 55 Acide Aspartique 133 11 6 63 88 25 Cyst ine 121 16 2 44 29 59 Acide Glutamique 147 13 10 15 149 36 Glutamine 146 15 30 49 445 61 Glycine 75 07 22 19 166 56 Histidine HCl H20 209 63 6 49 136 02 Isoleucine allo free 131 18 12 56 164 75 Leucine 131 18 17 65 231 56 Lysine HCl 182 65 19 22 351 09 M thionine 149 21 4 85 72 35 Ornithine HCl 168 62 0 56 9 41 Ph nylalanine 165 19 14 04 231 93 Proline 115 13 11 23 129 33 S rine 105 09 11 8
26. Food and Agriculture Organisation GalNAc N ac tyl galactosamine GIcNAc N ac tyl glucosamine GNA lectine du perce neige Galanthus nivalis L GNA2 construction simple de plasmide avec le g ne de la GNA GSAII BSII GUS gene de la B glucuronidase IP inhibiteur de prot ase LBA lectine du haricot de Lima Phaseolus lunatus L LcH lectine de la lentille Lens culinaris Medick MAA lectine de maackia Maackia amurensis Koch MPA lectine de l oranger des osages Maclura pomifera NPA lectine de la jonquille Narcissus pseudo narcissus L OSA lectine du riz Oryza sativa L PCA lectine du haricot d Espagne Phaseolus coccineus L PHA lectine du haricot commun Phaseolus vulgaris L PNA lectine de I arachide Arachis hypogaea L PSA lectine du pois commun Pisum sativum L PWA lectine de Phytolacca americana L PWG6 doubles construction de plasmide avec le g ne de la GNA et WAI RCA lectine du ricin Ricinus communis L RIP prot ines inhibitrices de ribosomes RPA lectine du robinier faux acacia Robinia pseudacacia L RSA lectine du champignon Rhizoctonia solani SBA lectine du soja Glycine max L Merr SDS PAGE sodium dod cyl sulphate polyacrylamide gel SJA lectine de sophora Sophora japonica L SNA lectine du sureau noir Sambucus nigra L STA lectine de la pomme de terre Solanum tuberosum L TKA lectine de la cucurbitac e Trichosanthes kirilowii Maximow TL lectine de l
27. Podila G K et Kolattukudy P E Identification of a fungal cutinase promoter that is inducible by a plant signal via a phosphorylated trans acting factor Proc natl Acad Sci USA 1991 Vol 88 p 8208 8212 Bale J S Strathdee A T et Strathdee F C Effects of low temperature on the arctic aphid Acyrthosiphon brevicorne Funct Ecol 1994 Vol 8 p 621 626 Banwell J G Boldt D H Meyers J et Weber F L J Phytohemagglutinin derived from red kidney bean Phaseolus vulgaris a cause for intestinal malabsorption associated with bacterial overgrowth in the rat Gastroenterology 1983 Vol 84 p 506 515 Barbieri L Battelli M G et Stirpe F Ribosome inactivating proteins from plants Biochim Biophys Acta 1993 Vol 1154 N 3 p 237 282 Barendse G W M et Peeters T J M Multiple hormonal control in plants Acta Bot Neer 1995 Vol 44 N 1 p 3 17 Barondes S H Bifunctionnal properties of lectins lectins redefined Trends Biochem Sci 1988 Vol 13 p 480 482 Barton K A Whiteley H R et Yang N S Bacillus thuringiensis 6 endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to lepidopteran insects Plant Physiol 1987 Vol 85 p 1103 1109 Berthomieu P Obtention de choux transg niques tol rants aux noctuelles par transformation g n tique avec un g ne codant pour une 6 endotoxine de Bacillus thuringiensis Th se 3 me Cycle Universit Paris Sud Centre d Orsay 1992 Bev
28. Q AT toxicit non d montr e ricine non toxique ni inhibitrice 0 0196 sur SI et Hv Lox inhibitrice de croissance sur Hv PHA 50 de mortalit sur Ef 1 5 27 sur NI 0 1 Peu toxique sur pucerons 0 196 OSA non test e sur homopt res WGA 75 80 mortalit pour NI moins toxique pour Nc Tr s peu d effet sur Ap UDA faible r duction de croissance de Ap 0 025 ConA toxique dose moyenne 20 0196 pour cicadelles et pucerons Ap Mp Ago CL50 0 015 sur Ap GNA toxique doses moyennes pour NI Nc et Ap moindre effet sur Mp PSA toxique forte dose sur NI et Ap Q AI faiblement inhibiteur sur Ap ricine RIP tr s toxique 0 025 sur Ap Lox toxique sur NI et Mp CL50 lt 0 05 liaison de la PHA l intestin moyen de Cm liaison de ConA sur portions ant rieures de l intestin moyen pucerons hyperactivit s cr toire lors de l intoxication aigu Q AII inhibiteur digestif RIP ARNr N glycosidase lectine vectrice Lox effet sur la qualit des prot ines sur les membranes pith liales Tableau 3 Exemples de prot ines toxiques utilisables pour la protection des plantes contre des insectes non exhaustif note les concentrations actives ou l tales sont g n ralement donn es en du poids frais de l aliment qui est solide pour les col opt res et l pidopt res 0 1 1mg g et liquide pour les homopt res 0 1962 1mg m
29. Vol 2C p 167 198 Hull R Risks in using transgenic plants Science 1994 Vol 264 N 5166 p 1649 1650 Ilharco F A et van Harten A Systematics in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1987 Vol 2A p 51 78 Imberty A et Perez S Molecular modelling of protein carbohydrate interactions understanding the specificities of two legume lectins towards oligosaccharides Glycobiology 1994 Vol 4 N 3 p 351 366 Iperti G Comportement naturel des coccinelles aphidiphages du Sud Est de la France leur type de sp cificit leur action pr datrice sur Aphis fabae Entomophaga 1966 Vol 11 N 2 p 203 210 Iyer P N S Wilkinson K D et Goldstein I J An N acetyl D glucosamine binding lectin from Bandeiraea simplicifolia seeds Arch Biochem Biophys 1976 Vol 177 p 330 333 Jaff W G et Seidl D S Toxicology of plant lectins in Food Poisoning New York Ed Marcel Dekker 1992 Vol 7 p 263 290 Janzen D H et Juster H B Insecticidal action of the phytohemagglutinin in Black Beans on a bruchid beetle Science 1976 Vol 192 p 795 796 Bibliographie 186 Janzen D H Juster H B et Liener I E Insecticidal action of the phytohemagglutinin in black beans on a bruchid beetle Science 1976 Vol 192 p 795 796 Jayne Williams D J The relationship between the intestinal microflora and the effects of diets containing Raw Navy Beans
30. alis es dans des chantillons pr par s ainsi La dissection elle m me pourrait induire des art facts En effet apr s d capitation des adultes le tube digestif est tir pour tre pr lev Cet tirement peut provoquer des dommages au niveau des cellules pith liales qui rendent ventuellement difficilement discernables d ventuelles l sions li es l intoxication elle m me Des larves n onates sont pr alablement intoxiqu es pendant 48 h sur des milieux artificiels simples ou contenant de la ConA 200 400 ou 800 ug ml Elles sont ensuite fix es l abdomen ouvert dans un tampon phosphate contenant 1 de glutarald hyde et 0 5 de paraformald hyde osmolarit totale mesur e 400 mOsM pendant 20 heures temp rature ambiante A l issue de ce traitement les chantillons sont lav s dans du tampon phosphate 0 175 M seul en l g re hyperosmolarit 360 mOsM froid 4 C dans 5 bains d une heure Les larves sont post fix es dans du tampon phosphate 0 2 M contenant 2 de t troxyde d osmium OsO4 pendant 2 h temp rature ambiante Les chantillons sont d shydrat s par traitement thylique standard et inclus dans de la LR White London Resin White selon le protocole d crit par Newman et al 1982 fiche protocole N 22C Les coupes sont effectu es avec un diamant paisseur 100 nm Elles sont mont es sur des grilles recouvertes de Formvar9 et contrast es l ac tate d uranyle
31. coupe C Les deux coupes A et B sont effectu es des niveaux identiques de l estomac partie interm diaire A la plus forte concentration les changements cellulaires sont beaucoup plus visibles les cellules pith liales sont hypertrophi es Sous la bordure stri ee dans les cryptes le cytoplasme s claircit D les noyaux ovo des s orientent dans l axe des cellules pith liales La bordure stri e est visible et semble se d tacher La lumi re de l estomac est envahie de d bris Mais il est difficile sur ces seules observations de d terminer leur origine d bris membranaires et ou mat riel cytoplasmique 89 Ces doses induisent respectivement en 7 jours des inhibiteurs de croissance d environ 40 et 75 95 figure 9 90 Conventionnellement cet axe correspond une droite joignant les centres des parties apicale et basale d une cellule pith liale Planche II Coupes transversales d une larve d Acyrthosiphon pisum au niveau de l estomac interm diaire larve non intoxiqu e A x 500 larve ayant ing r du milieu contenant 10 ug ml de ConA B1 x 500 B2 x 1250 larve ayant ing r du milieu contenant 400 ug ml de ConA C1 x 500 C2 x 1250 Planche III Immunohistochimie sur coupes de larves d Acyrthosiphon pisum intoxiqu es par la ConA Les coupes estomac interm diaire sont soumises a un anticorps anti ConA et la lectine est visualis e par la coloration brune Toutes les lames so
32. e l h t rog n it intra individuelle des pucerons de chaque modalit ce qui est assez typique des analyses comportementales de type EPG qui n cessitent donc un nombre souvent lev de r p titions La figure 38 r sume l ensemble de ces informations Elle correspond au d pouillement graphique de l analyse en composantes principales norm e ACPn ex cut e sur le tableau 55 x 5 des donn es correspondant aux enregistrements de 24h de la deuxi me s rie de mesures avec la ConA 600 ug ml N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 119 56 3 96 Figure 38 D pouillement graphique des deux premiers facteurs de l ACP norm e ex cut e sur le tableau des donn es relatives aux enregistrements EPG de 24 h r alis s avec des pucerons de l esp ce Acyrthosiphon pisum sur des milieux standards simples ou contenant 600 ug ml de Concanavaline A A Diagramme des valeurs propres B Cercle des corr lations variables facteurs C Plan factoriel F1 F2 repr sentation des centres de gravit par modalit T t moins C ConA 600 et liaisons modalit s pucerons Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 120 Seules les cinq variables permettant de discriminer significativement les pucerons de chaque modalit sont retenues pour l analyse var 3 4 5 7 amp 11 La repr sentation en to
33. es 51 2 3 Composition et pr paration des milieux artificiels 51 2 4 Principe des tests de toxicit aigu in vitro 52 2 5 Caract ristiques des lign es de pommes de terre transg niques test es 52 2 6 Estimation des taux d expression des transg nes par immunod tection sur membrane de nitrocelulos sas ns Non ns nent 53 2 7 Estimation indirecte du taux d expression des transg nes par dosage ELISA d intestins d PUCEONS 5 asset en ten en 54 2 8 Principe des tests long terme in vitro ou sur plantes transg niques 54 2 9 M thodes d analyse des donn es sse 56 RN Cr M 58 3 1 Effets des lectines induits par ingestion sur milieux artificiels 58 3 2 Performances biologiques de M persicae et d A solani sur des pommes de terre transg niques exprimant les g nes de la GNA et ou de la BCH 73 A DISCUSSION estet eee ed Heint alt toi tn ecu ustedes 86 Chapitre 3 Effet des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 92 TM TROUT COT RM c 92 2 Mat riels et M thodes niiina CU Hoe est assiette 92 2 1 Acyrthosiphon pisum et la Concanavaline A le puceron et la lectine Ies d ard ML 92 2 2 Principe des micro tests de CHOIR soie eec eroe ti Fe spen ce es Deed tovs 92 2 3 Mesure du taux d ingestion des pucerons 94 2 4 Technique d lectrop n trogra
34. es sur une membrane nitrocellulose en pincant la feuille Incubation la membrane de nitrocellulose est mise incuber dans le tampon PBS Tween lait sous agitation 1 h temp rature ambiante ou toute la nuit 4 C Elle est ensuite mise incuber avec la solution contenant l anticorps primaire GNA 2 2 anticorps monoclonal anti GNA s rum de lapin dilu au 1 10000 pendant 2 h temp rature ambiante ou toute une nuit 4 C sous agitation Apr s trois lavages de cinq minutes dans le tampon PBS Tween lait la membrane est incub e dans la solution contenant l anticorps secondaire anti lapin IgG coupl une peroxidase HRP Horseradish peroxidase s rum de ch vre de Biorad dilu au 1 10000 pendant 1h30 temp rature ambiante ou une nuit 4 C La membrane est lav e deux fois 5 min et une fois 15 min dans du tampon PBS contenant 0 1 de Tween 20 Elle est enfin rinc e deux fois dans de l eau pour liminer le Tween qui inhibe l activit de la HRP puis est stock e dans de l eau R v lation nous avons utilis le kit de r v lation ECL d Amersham Dans une chambre noire un volume de solution 1 est m lang un volume de solution 2 raison de 0 125 ml cm de nitrocellulose Le r actif est vers directement sur la membrane apr s limination soigneuse de la derni re solution de ringage Apr s 1 min exactement d incubation temp rature ambiante le r actif est limin la membrane e
35. la lutte chimique contre les aphides se limite l application de solutions base d arsenic ou de nicotine L normit des d g ts caus s par les pucerons est due la prodigieuse f condit de ces insectes D apr s H aumur les pucerons peuvent fournir dix g n rations par an Une femelle pond ordinairement une cinquantaine d oeufs ou m me de petits pucerons qu seront tous des femelles Celles ci pondent leur tour d autres femelles dont les g n rations se succ dent jusqu en automne en r sulte que les descendants de a premi re femelle seraient en automne de 30 billions d individus pour 8 g n rations de 20 femelles chacune Aussi a t on pu dire que la v g tation enti re du globe viendrait Qispara tre s ces insectes se multioliaient sans interruption Le cultivateur s en d barrasse de diff rentes mani res Par l crasement la main sur les plantes basses et rameaux peu nombreux Par la taille en janvier et f vrier des bouts de branches ou les pucerons d posent leurs oeufs avec incin ration imm diate de ces branches Par les injections d eau froide ou m me d eau de chaux ph niqu e d eau de savon d eau sal e ou de d coction de tabac de noyer dabsinthe Per le badigeonnage avec un lait de chaux m lang d acide ph niqu Par les insufflations de poudres insecticides poussi res de tabac de feuilles d absinthe de t tes de pyr thre lanc es avec un soufflet ident
36. lectine du pois PSA et du perce neige GNA se montrent galement actives sur C maculatus Czapla et Lang 1990 Peu de travaux mentionnent la toxicit des lectines sur des L pidopt res hormis ceux de Czapla et Lang sur la pyrale du mais Ostrinia nubilalis H bner tableau 3 Une lectine de C salpiniac es Bauhinia purpurea L BPA est tr s toxique vis vis de la pyrale de m me que les seules lectines test es des familles de Poac es WGA et d Euphorbiac es RCA Toutes les lectines des autres familles n induisent aucun effet Ainsi la pyrale ne semble pas sensible aux lectines des Solanac es trois prot ines test es ni celles des Fabac es treize prot ines test es Citons encore le cas de la lectine du soja SBA qui provoque seulement une inhibition de croissance des larves d O nubilalis de l ordre de 25 la concentration de 1 Czapla et Lang 1990 alors que Shukle et Murdock 1983 observent cette m me concentration une forte toxicit vis vis de Manduca sexta L 98 Ces premiers r sultats sur Col opt res et L pidopt res montrent qu il est difficile de corr ler l activit insecticide des lectines leur seule sp cificit osidique in vitro telle que nous l avons d finie pr c demment des lectines d une m me classe induisent des effets diff rents sur un m me insecte Les travaux de Czapla et Lang visent mettre en vidence une corr lation entre l activit entomotoxique
37. nous les consid rerons toutes ag es de 24 h au moment du d pot 40 Les deux premi res lettres correspondent correspondent aux initiales du nom latin de la plante dont sont purifi es les lectines Derni re lettre A pour agglutinine de Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 52 concentrations comprises entre 5 ou 10 ug ml et 750 pg ml ou 1500 ug ml suivant la toxine est pr par e pour chaque prot ine Les solutions sont ensuite coul es entre deux feuilles de Parafilm en conditions st riles fiche protocole N 4 Par la suite nous emploierons indiff remment le terme milieu pour d signer la solution Ap2 ou l ensemble du dispositif solution Parafilm support 2 4 Principe des tests de toxicit aigu 7 vitro Au jour JO des larves n onates sont d pos es sur des milieux artificiels contenant les prot ines purifi es aux concentrations indiqu es pr c demment 5 1500 pg ml n 3 ou 5 x 20 nombre indiqu dans le texte Une heure apr s le d p t le pourcentage de larves fix es sur les milieux est relev C est un indice de l acceptabilit du milieu par les pucerons Rahb et al 1988 Les larves non fix es sont remplac es Les pucerons sont laiss s sur les milieux le temps de leur d veloppement jusqu l ge adulte 7 jours Les milieux sont chang s au jour J3 ou J4 ou d s qu une contamination est observ e La mortalit des larves est relev e
38. p 80 85 Montgomery M E et Arn H Feeding response of Aphis pomi Myzus persicae and Amphorophora agathonica to phlorizin J Insect Physiol 1974 Vol 20 p 413 421 Montgomery M E et Nault L R Comparative response of aphids to the alarm pheromone E B farnesene Entomol exp appl 1977 Vol 22 p 236 242 M ller F P Differential alarm pheromone responses between strains of the aphid Acyrthosiphon pisum Entomol exp appl 1983 Vol 34 p 347 348 Murdock L L Huesing J E Nielsen S S Pratt R C et Shade R E Biological effects of plant lectins on the Cowpea Weevil Phytochemistry 1990 Vol 29 N 1 p 85 89 Naberjee R Mande S C Ganesh V K D Dhanaraj V Mahanta S K Suguna K Surolia A et Vijayan M Crystal structure of peanut lectin a protein with a unusual quaternary structure Proc Natl Acad Sci USA 1994 Vol 91 p 227 231 Nakata S et Kimura T Behavior of ingested Concanavalin A in the gastrointestinal tract of the rat Agric Biol Chem 1986 Vol 50 N 3 p 645 649 Nakata S et Kimura T Concanavalin A binding glycoprotein fraction in the small intestine and feces of rats Agric Biol Chem 1990 Vol 54 N 1 p 239 240 Nardon P Etude des interactions physiologiques et g n tiques entre l h te et les symbiotes chez le Col opt re Curculionide Sitophilus sasakii S oryzae Th se d tat es sciences naturelles INSA Lyon UCB Lyon I 1978 Nentwig W
39. r f Immulon 3 011 010 3750 DYNATECH Laboratories lecteur de plaques r f AXIA MicroReader Biom rieux 498 120 photom tre automatique photom trie faisceau vertical pipettes multicanaux labsystems Finnpipette Digital MCP 50 300 ul 4142417 8 trous Solutions stocks Tween 20 polyoxy thyl nesorbitan monolaurate r f Sigma P1379 tampon phosphate salin PBS r f Sigma P4417 vendu sous forme de cachet dissoudre 1 cachet par 200 ml d eau pure donne un tampon 0 01 M tampon phosphate 0 0027 M Chloride de Potassium 2 7 mM pH 7 4 25 C Solution stock e 4 C g latine 5 25 g de g latine dissous dans 500 ml d eau distill e par chauffage bullition r partis en flacons st riles et garder 4 C tampon carbonate bicarbonate 1 M pH 9 5 dissoudre 35 g de carbonate de sodium ou 95 g de carbonate de sodium 10 H20 et 56 g de bicarbonate de sodium dans 800 ml d eau distill e et compl ter le volume 1 litre stocker 4 C Fiche N 9B Dosage de la ConA par ELISA Proc d BRAB Etape 1 D poser 100 ul puits selon le plan de plaque Recouvrir la plaque d une feuille autocollante Incuber 30 min 37 C Sensibilisation de la plaque avec l anticorps primaire aConA dilu 5 ug ml 1 dans le Tampon C biC Vider la plaque laver 1 fois avec du PBS Tween Saturation Saturer les sites de la plaque avec 100 ul de la solution PBS g latine pe
40. s par Leclant 1981 eise ain neret e MS ee alee 15 Figure 4 Extrait de Les amis du cultivateur par E Deli ge instituteur paru chez H Matot Reims en 1903 cit par Grison 1992 ione re eee ee on eire ine CORE eet tale nee died 18 Figure 5 Exemples de pratiques pouvant tre mises en place dans le cadre d une lutte int gr e contre les pucerons d apr s Harrewijn et Minks 1989 is 20 Figure 6 Int gration globale et valuation d un projet de cr ation de cultivars r sistants aux pucerons et aux virus qui leur sont associ s d apr s Comeau 1992 iii 25 Figure 7 A Classification des sucres selon M kel bas e sur la position des groupements hydroxyles en C 3 et C 4 du cycle pyranose B Structures des sucres reconnus par les lectines des cinq principales 4 E EXTC ISERE Eee EEE sass veh sess tte ep o e RE Figure 8 Dispositif exp rimental mis en place pour tester les effets des plantes transg niques sur la croissance et la f condit des pucerons M persicae et A solani isol s individuellement sur une feuille 55 Figure 9 D pouillement graphique des deux premiers facteurs de l ACP norm e se rapportant au tableau 27 lectines x 12 variables mortalit et inhibition de croissance 59 Figure 10 Effets de deux lectines mannose la Concanavaline A et la lectine du perce neige GNA sur la croissance du puceron du pois Acyrthosiphon pisum eese 61 Figure 11 Effets d
41. s variant tr s significativement d une modalit l autre quantit au moins multipli e ou divis e par deux par rapport au t moin La figure 47A et l annexe 12A montrent que les quantit s totales d acides amin s libres dos es dans les broyats de pucerons des modalit s ConA200 ConA400 et GNA sont du m me ordre de grandeur et toutes inf rieures celle de la modalit t moin Par contre cette diff rence n est pas observ e pour les pucerons fortement intoxiqu s par la ConA Leur profil Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 154 Pucerons donn es exprim es en Pucerons donn es brutes
42. ses Nous les r sumons dans les annexes 3A et 3B Un des modes d action invoqu s chez le rat serait une liaison des lectines PHA ou ConA avec des groupements r cepteurs de la surface des cellules de la muqueuse intestinale pouvant induire des d faut d absorption des nutriments Pusztai 1991 Nous reprenons plus en d tail ces hypoth ses en introduction du Chapitre 4 3 2 4 Les fonctions des lectines dans la plante Depuis de nombreuses ann es des tudes sont consacr es la mise en vidence des fonctions physiologiques des lectines v g tales Ces recherches s effectuent selon deux approches accumulation des informations sur les propri t s biochimiques des lectines et sur leur distribution dans les tissus aux diff rents stades de croissance des plantes 2 laboration d hypoth ses concernant les fonctions des lectines sur la base des informations acquises et confirmation de ces hypoth ses par des exp riences ad quates Les premiers travaux sur les lectines se sont principalement ax s sur les prot ines des graines mais leur distribution ne se limite pas seulement cet organe de r serve Des lectines sont d tect es aussi bien dans les feuilles que dans les tiges ou les racines En outre dans une m me plante quelle que soit la famille v g tale consid r e les propri t s des lectines peuvent diff rer d un tissu un autre A la suite de ces tudes des hypoth ses sur les fonctions physiologique
43. toxique ou le temps de la mesure abscisses de la courbe le nombre d individus test s et le nombre de morts observ s Le calcul des pourcentages de mortalit est r alis par Le programme Si vous r alisez un test dose mortalit vous souhaiterez probablement r aliser la courbe de mortalit en fonction du logarithme de la concentration en toxique Cette transformation pourra tre r alis e automatiquement par le programme Si votre s rie de tests comporce un lot t moin et que vous souhaitez corriger les mortalit s des diff rents lors selon le formele d Abbott corrig 00 E uoa in vous devez enter ies H Q t moin donn es correspondant au t moin en premi re ligne du tableau de donn es Le programme Toxicologie peut r aliser cette correction et dans ce cas attribue automatiquement la premi re ligne du fichier au t moin Un fichier de donn es comprendra donc au minimum 3 colonnes et autant de lignes que de tests r alis s Elles sont pr c d es par 4 premi res lignes et premi re colonne utilis es comme descripteurs Il se pr sentera dans sa forme lz plus simple comme ci dessous LRIISS C 1 1935 The calculation of the dosage monalit curve Ann Appi Bioi 22 134 167 Corr lation entre le type d ondes enregistr es sur un graphe d EPG ct les activit s de p n tration des stylets d un puceron Tjallingii 1990 Van Helden 1995 D signation Fr quence en Hertz
44. tr s variable 0 02 244 244 0 5 4 4 7 l1 18 4 6 corr lations tissus du v g tal piderme piderme m sophylle tout tissu toute cellule vivante tubes cribl s phlo me non d termin tubes cribl s phlo me tubes cribl s phlo amp me tout tissu xyl me activit du puceron contact lectrique des stylets salivation de la gaine enfoncement des stylets piq re de l extr mit des stylets non d termin non d termin salivation d eau ingestion passive travail m canique des stylets ingestion active 1 pour EZ p pic w grandes ondes 2 extracellulaire i intracellulaire Repr sentation sch matique des diff rents types d ondes observables sur un EPG Tjallingii 1988 A AM C E F G PC LUZ Lanan I1 yan B M UN D 100 mV Fen tre de travail du logiciel d analyse des donn es LPG Macstylet G Febvay amp Y Rahb INSA INRA 406 F 69621 Villeurbanne cedex adresse intemet fehvay nra von fr The main window working window Screen A cortral 1 hour The part nf rhe sipral visible on seen B of signal ie displayed NTI TAN TT Te cee i A time bar of red length which can be moved m panied anywhere oo ont esl swa B 100 seconds MEC 1 2 DTA y CHO Ett tki H m ph MEE eee Classical serail bar sliowing quick sins e B Screen B zoom within sorea A vt DO anly a small n signal is diapi
45. 0 200 400 ou 800 ug ml de ConA Le miellat excr t tombe dans une coupelle Apr s 48h d intoxication il est r colt ind pendamment dans chacune des cinq coupelles de chaque modalit par deux rin ages de 100 ul d eau distill e et r cup r dans un tube Eppendorf pr alablement pes vide Les chantillons sont ensuite d shydrat s au Speed Vac et l Eppendorf est nouveau pes pour estimer les poids secs de miellat r colt Les pucerons t moins ou intoxiqu s sont pes s et r partis dans des Eppendorfs raison de 5 mg de pucerons environ par tube Les chantillons de miellat et de pucerons sont conserv s 20 C quelques jours dans l attente de l extraction des acides amin s libres fiche protocole N 24 et de leur dosage chromatographique N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 129 Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 130 3 R sultats 3 1 Les tissus cibles de la Concanavaline A Les r sultats du chapitre pr c dent d montrent que les pucerons m me fortement intoxiqu s continuent de s alimenter et ing rent de grande quantit de Concanavaline A Une question tait donc de savoir s ils excr tent la lectine ou si celle ci est retenue ou d grad e dans le tube digestif Nous avons donc essay de mettre en vidence la pr sence de ConA dans le miellat de pucerons intoxiqu s par visualisation lectrophor tique directe puis par d tection
46. 0 1 0 05 C P 0 028 gt 0 IC20 i140 1C50 630 Fiche N 12 D finition du taux intrins que d accroissement naturel rm d une population de pucerons On appelle taux intrins que d accroissement naturel le taux d accroissement par individu dans des conditions d termin es de temp ratures d humidit relatives etc et dans un milieu illimit o les effets d augmentation de densit ne peuvent se faire sentir 66 9 Ce taux repr sent par le symbole rm ou r pour certains auteurs est encore appel param tre de Malthus capacit inn e d accroissement en nombre taux ultime d accroissement etc D apr s le mod le de Lotka 1925 cit par Dajoz 1974 dans une population a croissance exponentielle si l on d signe l effectif par N et le temps par t nous avons la relation dN P pl r N d o en int grant Ni Ny e t t N p tant l effectif au temps t et N au temps z ro L unit du rm unit de taux d accroissement nombre de femelles femelle unit de temps g n ralement le jour Remarque dans un certain nombre de cas il peut tre plus facile ou plus utile de calculer le coefficient d accroissement A pour une unit de temps d termin e jour semaine ann e On utilise alors la relation Nou Nw e D abord utilis dans le cas de populations humaines le taux intrins que d accroissement naturel a ensui
47. 1 3 Man a1 3Man 1 2 contrairement la ConA Kaku et Goldstein 1992 3 Robert et Goldstein 1983 cit s par Kaku et Goldstein 1992 ont rapport que la plupart des lectines des L gumineuses et en particulier la ConA poss dent des sites de fixation des ligands hydrophobes La GNA comme la NPA ne semble pas comporter de tels sites dans sa structure mol culaire Kaku et Goldstein 1992 Si comme nous le supposons l interaction lectine puceron est de type lectine r cepteur glycosyl ces diff rences de sp cificit s osidiques peuvent expliquer pourquoi les modes d action de la ConA et dela GNA semblent diff rer L tape ult rieure de notre tude consisterait d sormais d terminer les m canismes mis en jeu dans l interaction au niveau subcellulaire et mol culaire Or bien que les propri t s biologiques des lectines soint tudi es depuis de nombreuses ann es les premiers travaux visant expliquer les interactions mol culaires lectines oligosaccharides n ont t publi s que tr s r cemment Ceci s explique principalement par la complexicit des ph nom nes mis en jeu et des techniques mettre en oeuvre pour les appr hender Les tudes d crites ce jour portent uniquement sur des lectines de L gumineuses Elles permettent de mieux comprendre pourquoi en d pis de la tr s forte homologie structurale de certaines lectines celles ci pr sentent des sp cificit s osidiques parfois tr s diff rentes
48. 16 2 0 4 18 0 0 3 ajl 17 9 0 6 a be les Lv nombre de larves pondues puceron 49 2 2 2 a 58 3 2 8 b 49 40 77 a 47 7 1 5 a 50 7 41 9 a 51 6 2 3 ab adultes F condit Lv Dv 2 20 0 09 a 2 64 0 12 b 2 21 0 09 a 2 12 0 06 a 2 22 0 08 2 30 0 09 a a Lv Dr 2 83 0 10 3 23 0 13 2 98 0 09 2 96 0 11 3 00 0 13 2 91 0 15 Md nombre de larves pondues en une dur e 38 2 1 3 a 45 5 1 6 b 40 8 1 5 ab 42 5 1 1 b 39 1 1 0 a 39 3 1 5 a gale ad DT dur e pour doubler la taille de la popu 3 24 3 16 3 45 3 57 3 30 3 25 lation Taux intrins que d accroissement naturel rm SDjack Birch 1948 0 214 0 004 0 219 0 005 0 201 0 004 10 194 0 004 0 210 0 003 0 213 0 005 a a b b a a Wyatt amp White 1977 0 206 0 004 ab 0 221 0 007 a 0 195 0 004 cd 0 193 0 004 d 0 203 0 003 be 0 206 0 004 ab Tableau 12 Performances biologiques d Aulacorthum solani sur pommes de terre transg niques janvier 1995 Les masses sont indiqu es en ug les dur es en jours L erreur standard SE de chaque valeur est donn e entre parenth ses sur une m me ligne les valeurs suivies par des lettres diff rentes diff rent significativement au seuil de 5 voir Mat riels amp M thodes pour les tests appliqu s Ti F de pucerons 5 60 EN un W Larves cumulees puce
49. 3 celui de l aspartate et de la m thionine par 1 9 et celui de l aspargine par 1 6 La figure 47A ne permet pas de rendre compte clairement d ventuelles diff rences entre les profils ConA200 ou ConA400 et GNA C est ce qui explique que nous ayons transform les donn es pour obtenir la figure 47B Les profils des pucerons ayant ing r de la ConA diff rent totalement des profils des pucerons plac s sur milieux GNA Pour condenser l information contenue dans cette figure trois analyses factorielles des correspondances AFC sont conduites figure 48 la premi re A porte uniquement sur les dosages des modalit s ConA AFC ConA la seconde B prend en compte les dosages des modalit s GNA AFC GNA dans la troisi me C les profils en acides amin s libres des pucerons intoxiqu s par la ConA 200 et 400 ug ml et par la GNA 400 ug ml sont compar s AFC ConA GNA Certes trois AFC sont conduites s par ment alors que nous raisonnons sur les donn es d une m me exp rience mais chacune des cartes factorielles permet ainsi d illustrer sans confusion les r ponses aux trois questions que nous nous sommes pos es en introduction de cette exp rience sur l aminoacid mie Les deux premiers facteurs de l AFC ConA repr sentent 82 de l inertie totale La statistique d inertie donn es non montr es r v le que l axe 1 discrimine surtout les pucerons t moins des insectes fortement intoxiqu s Cet axe est principalement d
50. 377 385 Lyon J P L chers experimentaux de Chrysopes et d Hym nopt res parasites sur pucerons en serres d aubergines Ann Zool Ecol Anim 1979 Vol 11 p 51 65 Macintosh S C Kishore G M Perlak F J Marrone P G Stone T B Sims S R et Fuchs R L Potentiation of Bacillus thuringiensis insecticidal activity by serine protease inhibitors J agric Food Chem 1990 Vol 38 N 4 p 1145 1152 Maisonneuve J C La lutte biologique sous serre en France en 1992 De nouvelles perspectives apr s deux ans de tassement Phytoma 1993 Vol 452 p 9 12 M kel D Studies in hemagglutinins of leguminosae seeds Ann Med Exp Biol Fen 1957 Vol 35 Suppl N 11 p 1 56 Mallet J et Porter P Preventing insect adaptation to insect resistant crops are seed mixtures or refugia the best strategy Proc R Soc Lond B 1992 Vol 250 p 165 169 Mandal D K et Brewer C F Interactions of Concanavalin A with glycoproteins formation of homogeneous glycoprotein lectin cross linked complexes in mixed precipitation systems Biochemistry 1992 Vol 31 p 12602 12609 Bibliographie 188 Marco Y Roby D Schneider M et Toppan A Promoteur v g tal microorganismes et cellules v g tales contenant une unit d expression d une prot ine d int r t comprenant le dit promoteur France N WO 94 21793 1994 03 23 Markkula M Tittanen K Hamalainen M et Forsberg A The aphid midge Aphidoletes aphid
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53. Acyrthosiphon pisum eese 149 Planche VI Observations au microscope lectronique transmission de l ultrastructure de la face apicale d une cellule m sent rique d une larve du puceron du pois Acyrthosiphon pisum intoxiqu e pendant 48 h sur un milieu contenant 400 ug mr de Liste des tableaux Tableau 1 Exemples d antagonistes potentiellement utilisables pour lutter contre des pucerons 22 Tableau 2 Tactiques d utilisation in planta de g nes gouvernant la synth se de prot ines entomotoxiques d apr s McGaughey et Whalon 1992 isses ii nennen trennen 30 Tableau 3 Exemples de prot ines toxiques utilisables pour la protection des plantes contre des insectes non exhaust its sitene medien dienen ete dw 31 32 Tableau 4 Exemples de plantes transg niques produites pour la r sistance des insectes non exhaustif 34 Tableau 5 Origines et caract ristiques mol culaires des lectines v g tales test es sur les pucerons 39 40 Tableau 6 Sp cificit s osidiques des lectines v g tales test es sur diff rentes esp ces de pucerons en particulier Acyrthosiphon pisum eese esee eene teeth tene retener innen enne 43 Tableau 7 Exemples de propri t s biologiques des lectines et des applications qui en r sultent d apr s Lis amp Sharon 1986 nue iv oss tb ep e let pU RO p Dip aed b tene dd eit 44 Tableau 8 Effets de d
54. BSA Pour notre dosage l utilisation de l un ou l autre de ces milieux de saturation n a pas d importance Ternynch et Avrameas 1991 La fiche protocole N 10B d crit en d tail la proc dure appliqu e r f Vector L1240 stock e 4 C Fiche N 10B M thode indirecte de dosage de la GNA par ELISA protocole Kirkegaard amp Perry Laboratories Inc Etape 1 D poser 100 ul puits selon le plan de plaque Incubation de la GNA gamme de GNA dans le Coating Buffer chantillons secs repris dans le m me tampon Recouvrir et incuber 1 h temp rature ambiante Vider la plaque laver 1 fois avec la Wash Solution Saturation Saturer les sites de la plaque avec 250 ul de la BSA Diluent Blocking Solution pendant 5 min Rincer 3 fois avec la Wash Solution Etape 2 D poser 100 pl puits selon le plan de plaque Incubation de l anticorps primaire Recouvrir et incuber 1 h temp rature ambiante s rum lapin GNA dilu 1 2000 dans la BSA Diluent Blocking Solution Rincer 5 fois Etape 3 D poser 100 ul puits selon le plan de plaque Recouvrir et incuber 1 h temp rature ambiante Incubation de l anticorps secondaire s rum ch vre olgG Lapin coupl la peroxydase dilu 1 3000 dans BSA Diluent Blocking Solution Rincer 5 fois R v lation coloration ABTS GE D poser rapidement 100 ul puits de la solution substrat ABTS fra c
55. Biever D et Fischhoff D A Genetically improved potatoes protection from damage by colorado potato beetles Plant Mol Biol 1993 Vol 22 N 2 p 313 321 Peumans W J Allen A K Nsimba Lubaki M et Chrispeels M J Related glycoprotein lectins from root stocks of wild cucumbers Phytochemistry 1987 Vol 26 p 909 912 Peumans W J De Ley M et Broekaert W F An unusual lectin from stinging nettle Urtica dioica rhizomes FEBS L 1984 Vol 177 p 99 103 Piek T Neurotoxins from venoms of the hymenoptera 25 years of research in Amsterdam Comp Biochem Physiol 1990 Vol 96C p 223 233 Pimentel D Some aspects of integrated pest management Cornell USA Ed Cornell University 1986 Status of integrated pest management Pistole T G Interaction of bacteria and fungi with lectins and lectin like substances Ann Rev Microbiol 1981 Vol 35 p 85 112 Pitrat M et Lecoq H Relations g n tiques entre les r sistances par non acceptation et par antibiose du melon Aphis gossypii Recherche de liaisons avec d autres g nes Agronomie 1982 Vol 2 p 503 508 Ponsen M B The site of potato leafroll virus multiplication in its vector Myzus persicae An anatomy study Th se d tat Universit de Wageningen NDL 1972 147p Ponsen M B Alimentary tract in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam Ed Elsevier 1987 Vol 2A p 79 95 Poretz R D Riss H Timberlake J W et
56. Chien S Purification and properties of hemagglutinin from Sophora japonica Biochemistry 1974 Vol 13 p 250 256 Potrykus I Gene transfer to plants assessment of published approaches and results Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1991 Vol 42 p 205 225 Powell G Hardie J et Pickett J A Responses of Myzus persicae to the repellent polygodial in choice and no choice video assays with young and mature leaf tissue Entomol exp appl 1995a Vol 74 p 91 94 Powell k Antimetabolic effects of plant proteins on homopteran insects pests Ph D Universit de Durham GBR 1993 Powell K S Gatehouse A M R Hilder V A et Gatehouse J A Antimetabolic effects of plants lectins and plant and fungal enzymes on the nymphal stages of two importante rice pests Nilaparvata lugens and Nephotettix nigropictus Entomol Exp Appl 1993 Vol 66 p 119 126 Bibliographie 190 Powell K S Gatehouse A M R Hilder V A et Gatehouse J A Antifeedant effects of plant lectins and an enzyme on the adult stage of the rice brown planthopper Nilaparvata lugens Entomol exp appl 1995b Vol 75 p 51 59 Powell K S Gatehouse A M R Hilder V A Van Damme E J M Peumans W J Boonjawat J Horsham K et Gatehouse J A Different antimetabolics effects of related lectins towards nymphal stages of Nilaparvata lugens Entomol exp appl 1995c Vol 75 p 61 65 Prosser W A Simpson S J et Douglas
57. Dale 1993 Deblock 1993 Sciences 1993 Sawahel 1994 Chapitre 1 Contexte de l tude 28 le m canisme de r sistance est parfaitement connu ce qui est rarement le cas lors de la s lection vari tale classique Outre l avantage d une r sistance intrins quement marqu e utile pour toutes les phases de s lection il est alors plus facile d anticiper par des exp rimentations les probl mes de sp cificit de contournement de r sistance ou de marquage de la virulence L exp rience dans ce domaine est limit e mais cependant instructive bien avant la commercialisation des vari t s incorporant un g ne de B thuringiensis le probl me des ravageurs r sistants a t int gr la strat gie d faut d tre r solu McGaughey et Whalon 1992 Cette prise de conscience est assez unique dans le domaine et peu envisageable pour la cr ation vari tale classique o l investissement cognitif sur les m canismes de r sistance est presque toujours r alis a posteriori la protection de tissus difficiles d acc s par les produits phytosanitaires classiques est effective pour peu que l expression tissu sp cifique soit maitris e Si l heure actuelle les promoteurs utilis s pr sentent des caract ristiques fonctionnelles assez impr visibles Sciences 1993 les recherches se multiplient pour atteindre plus efficacement des insectes aux modes alimentaires aussi vari s que les ravageurs foreurs piqueurs o
58. Est Mais elle s tend en fait toutes les r gions en champs ou en serres Ce puceron est surtout dangereux comme vecteur de virus il transmet au melon les virus de la mosaique du concombre CMV de la mosa que de la past que 1 et 2 WMVI et WMV2 et du rabougrissement jaune du melon MYSV Pitrat et Lecoq 1982 Les difficult s croissantes rencontr es pour combattre A gossypii par les m thodes de lutte chimique conventionnelles conduisent essayer d obtenir des vari t s r sistantes soit par la s lection vari tale classique Pitrat et Lecoq 1982 soit par la cr ation de plantes transg niques exprimant une ou des prot ine s insecticide s Dans l Introduction nous avons pr cis que notre d marche s inscrit dans un programme labor au sein de l INRA et visant la cr ation d une cucurbitac e transg nique r sistante cet insecte Deux esp ces v g tales le concombre Cucumis sativus L ou le melon Cucumis melo L sont vis es dans ce programme Le choix futur de l une ou l autre de ces deux esp ces pour la r alisation des transformations g n tiques sera fonction des facilit s de transformation et de r g n ration des connaissances g n tiques acquises sur ces esp ces ainsi que de l int r t scientifique de cr er une plante transg nique si l approche de la s lection vari tale classique parait offrir des solutions Le puceron du pois A pisum constitue cependant l insecte mod le utilis au cou
59. Jean Marie Legay ex Directeur de la Formation Doctorale pour les conseils qu il m a prodigu s et pour avoir accept d tre membre du jury Merci galement Monsieur Guy Riba directeur du d partement de Zoologie de l INRA pour sa pr sence en tant que membre du jury J ai vraiment beaucoup de plaisir associer ce travail tous les membres du laboratoire chercheurs ou techniciens Je voudrais en particulier remercier Christiane la partie consacr e l histologie n aurait pas t r alisable sans son aide et Josette qui a effectu les dosages d acides amin s libres Je ne voudrais pas non plus oublier Gabrielle pour son aide pr parations des solutions de milieu tests de toxicit etc et Alain plantations ni Bernard Simon et Hubert pour leurs conseils pertinents et avis s ni bien s r Annie pour ses talents de relectrice Je tiens galement remercier chaleureusement le personnel du Centre de Microscopie Electronique Appliqu e la Biologie et la G ologie de l Universit Claude Bernard Leur patience et leur pers v rance ont permis de surmonter les nombreuses difficult s rencontr es pour l observation de l ultrastructure de l intestin des pucerons J ai t aid dans la frappe de ce manuscript par Christelle Je la remercie d avoir sacrifi certains de ses samedis et de ses dimanches pour qu il soit r dig dans les temps Et puis je m en voudrais de ne pas associer mes parents ce travail Merci
60. Lectine ing r e amp 0 0 0 200 400 600 800 Concentration en ConA en ug mI 1 Figure 41 Estimations B des quantit s de ConA excr t es dans le miellat de pucerons laiss s 72 h sur milieu contenant 200 C2 400 C4 ou 800 C8 ug mI l de lectine dosage ELISA C des quantit s de ConA ing r es en 48 h par des pucerons sur ces diff rents types de milieu dosage l aide d un marqueur radioactif A gamme talon dosage ELISA 83 es cellules intestinales ont une vie br ve subissant donc un turn over assez rapide Elle sont remplac es par des cellules basales Raccaud Schoeller 1980 Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 132 La technique ELISA permet de doser la ConA dans des extraits de miellat de pucerons intoxiqu s avec une beaucoup plus grande sensibilit que la technique d lectrophor se Apr s un dosage en sandwich nous obtenons une gamme de sensibilit comprise entre 1 et 30 ng de lectine d pos e par puits mat riel amp m thodes Pour ce dosage des extraits secs de miellat comme pour les dosages ELISA suivants nous avons tabli une gamme talon Nous obtenons une parfaite lin arit dans la gamme 1 10 ng figure 41A Cette gamme permet de d duire les quantit s de lectine en ng dos es dans les miellats figure 41B Apr s 24 h d intoxication nous d tectons de la lectine uniquement dans les miellats des pucerons tr s fortement intoxiqu s Encore cet
61. Nous donnons une interpr tation de cette observation dans le chapitre 4 La mise en oeuvre de la technique d lectrop n trographie sur milieux artificiels s est av r e d licate mais l analyse des enregistrements obtenus permet de discriminer les pucerons intoxiqu s et les pucerons normaux m me si les profils des enregistrements sont tr s variables quelle que soit la modalit Cette variabilit s explique assez facilement par les conditions exp rimentales Certains pucerons sont vraisemblablement tr s g n s par le fil d or encoll sur leur abdomen De plus l troitesse de la cage dans laquelle ils sont transf r s pour les mesures ne leur permet pas r ellement de se d placer annexe 8 A quelques exceptions 71 Les six autres variables sont galement supprim es dans la mesure o elles n apportent aucune information suppl mentaire N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 121 pr s aucun puceron c bl n est rest fix plus de 20 heures au cours de nos diff rentes acquisitions alors qu en conditions normales sur milieux artificiels un puceron reste fix beaucoup plus longtemps L lectrop n trographie sur milieux artificiels pr sente donc un inconv nient majeur limitant son application des tudes sur des dur es assez courtes 16 20 h au plus et avec un grand nombre de r p titions minimum 20 par modalit L analyse statistique nous am ne la conclusion que
62. Phaseolus vulgaris on the growth of japanese quail Coturnix coturnix japonica J appl Bact 1972 Vol 35 p 331 344 Jepson P C Croft B C et Pratt G E Test systems to determine the ecological risks posed by toxin release from Bacillus thuringiensis genes in crop plants Mol Ecol 1994 Vol 3 N 1 p 81 89 Johnson R Narvaez J An G H et Ryan C A Expression of proteinase inhibitor I and inhibitor II in transgenic tobacco plants Effects on natural defense against Manduca sexta larvae Proc natl Acad Sci USA 1989 Vol 86 N 24 p 9871 9875 J rdens R ttger D The role of phenolic substance for host selection behaviour of the black bean aphid Aphis fabae Entomol exp appl 1979 Vol 26 p 49 54 Jouanin L Berthomieu P Bonad Bottino M Pannetier C Lepl J Chaufaux J et Tourneur J Utilisation des techniques de g nie g n tique pour l obtention de plantes tol rantes aux insectes Il me Conf rence Internationale sur les Ravageurs en Agriculture 1990 Versailles FR p 275 281 Jouanin L Brasileiro A C M Leple J C Pilate G et Cornu D Genetic transformation a short review of methods and their applications results and perspectives for forest trees Ann Sci Forest 1993 Vol 50 N 4 p 325 336 Kaku H et Goldstein I J Methods in enzymology 1989 Snowdrop lectin Vol 179 p 327 331 Kaku H et Goldstein I J Interaction of linear manno oligosaccharides with th
63. Sans pr tendre tre exhaustif nous avons rassembl dans le tableau 1 des exemples de pr dateurs utilis s en lutte biologique contre les pucerons 8 Les parasitoides sont des entomophages interm diaires entre les parasites et les pr dateurs ils exploitent d abord leur victime en vrais parasites puis finissent par la tuer et la consommer dans un acte final s apparentant la pr dation Antagonistes Insectes parasitoides Mode d activit Application Disponibilit Europe Pucerons vis s R f rences res ap Aphidius matricariae cosmopolite aphidiide adapt aux cultures sous abri Aphidius sp aphidiides Dioeretella rapae aphidiide cosmopolite polyphage Ephredrus cerasicola aphidiide exotique d Europe Lysiphlebus testaceipes aphidiide introduit en France Praon sp aphidiides Trioxys sp aphidiides Hym nopt res chalcidiens Aphelinus sp aphelinides sp cifiques Endoparasitoide solitaire Endoparasitoides solitaires Endoparasitoide solitaire Endoparasitoide solitaire Endoparasitoide solitaire Endoparasitoides solitaires Lib ration inondative ou inoculative en serre Lib ration inondative ou inoculative en serre Lib ration inondative ou inoculative en serre et en verger Lib ration inondative Lib ration inondative ou inoculative Commercialis lev en laboratoire incidence naturelle Faune endog ne lev en laboratoire Elev en labor
64. Vol 24 p 159 170 Wang M B Boulter D et Gatehouse J A A complete sequence of the rice sucrose synthase 1 RSs1 gene Plant molec Biol 1992 Vol 19 p 881 885 Wang P Hammer D A et Granados R R Interaction of Trichoplusia ni granulosis virus encoded enhancin with the midgut epithelium and peritrophic membrane of four lepidopteran insects J Gen Virol 1994b Vol 75 N Part 8 p 1961 1967 Ward E R Ryals J A et Miflin B J Chemical regulation of transgene expression in plants Plant Mol Biol 1993 Vol 22 p 361 366 Wassef N M Richardson B G et Alving C R Specific binding of Concanavalin A to free inositol and liposomes containing phosphatidyl inositol Biochem Biophys Res Com 1985 Vol 130 p 76 83 Wilson A B King T P Clarke E M et Pusztai A Kidney bean Phaseolus vulgaris lectin induced lesions in rat small intestine 2 microbiological studies J Comp Path 1980 Vol 90 p 597 602 Wiseman B R Plant resistance to insects in integrated pest management Plant Dis 1994 Vol 78 N 9 p 927 932 Wright C S Gavilanes F et Peterson D L Primary structure of wheat germ agglutinin isolectin 2 peptide order deduced from X ray structure Biochem 1984 Vol 23 p 280 287 Wright J P Fisher D B et Mittler T E Measurement of aphid feeding rates on artificial dits using 3H inulin Entomol exp appl 1985 Vol 37 p 9 11 Wyatt J T et White P F Simple estimation
65. a 0 379 0 005 a 0 309 0 008 b 0 303 0 010 b 0 301 0 008 b 0 304 0 008 b Tableau 10 Performances biologiques du puceron du p cher Myzus persicae sur pommes de terre transg niques Les dur es sont indiqu es en jours L erreur standard SE de chaque valeur est donn e entre parenth ses sur une m me ligne les valeurs suivies par des lettres diff rentes diff rent significativement au seuil de 5 voir Mat riels amp M thodes pour les tests appliqu s Le jour Jog correspond au premier jour o une diff rence significative appara t entre les 3 modalit s au niveau de la mortalit Wode pucerons survivants Hombre total de larves yuceroas imitiaur 0 100 80 60 40 20 60 Larves cumwlees pucerons initiaux 20 25 Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 78 Lu T moin y PBG6 47 pontes cumul es 30 Jours PWG6 85 35 Modalit s P1 Lv mod le observ mod le P2 d observ P3 mod le T moin PBG 47 PWG 85 68 8 1 D 74 3 3 2 56 7 0 8 52 1 4 0 74 5 14 62 1 3 8 4 7 0 1 5 9 0 1 6 1 0 1 7 1 0 1 8 4 0 1 8 9 0 2 0 21 0 02 0 20 0 01 0 15 0 01 Ajustement effectu y P B x Bye 7 Figure 19 Performances biologiques du puceron vert du p cher Myzus persicae sur deux lign es de pommes de terre transg niq
66. ac tique 50 ul ac ac tique 4 5 ml de t 4 5 ml de Scintillant E299 Scintillant E299 Tpi Pi Blanc Traitement intox ou t moin s o puceron 10 ul milieu Ap2 ou Ap2 ConA 200ug ml dilution au 1 1000 10 ul dans 10 ml eau pure 100 ul 100 nl solution m re Ap2 Q 69 200 ul solu ne 500 ul H20 24 h dans pot de comptage neutraliser avec 50 ul ac ac tique t 4 5 ml de t 4 5 ml de Scintillant E299 Scintillant E299 Tl i T2 i T moins calibration d ingestion COMPTAGE Fiche N 76 R colte du miellat excr t par des pucerons sur milieu artificiel 20 pucerons g s de7j X5 cupule st rile 72h enlever exuvies et pucerons morts s cher les cupules reprendre le miellat par 2 rin ages avec 2 5 ml H20 pure ajouter 5 volumes thanol 95 pr cipitation 1 nuit 4 C centrifugation 20 000 g 15 min 4 C Been ae culot surnageant s ch au SpeedVac reprendre par 2 rin ages avec 300 ul H20 pure et transvaser dans un eppendorf s cher et reprendre dans le tampon d introduction ELECTROPHORESE Fiche N 77 Protocole d lectrophor se sur plaque de gel 1 Pr parations des gels gel de s paration running pH 8 8 Tris 1 5 M 15 acrylamide m langer eau distill e 2 35 ml tampon sep 2 5 ml SDS 10 100 ul acrylamide 5 ml d gazer a temp rature ambiante pendant plus de 15 min just
67. adapt A pisum au laboratoire Rahb et al 1988 Nous avons ainsi d termin le taux d ingestion d adultes et de jeunes larves de l esp ce A pisum intoxiqu s avec de la Concanavaline A 2 3 1 Taux d ingestion d adultes de l esp ce A pisum intoxiqu s par la ConA Des larves n onates sont laiss es sur milieux Ap2 jusqu leur mue imaginale Dix jeunes adultes par modalit sont transf r s dans des cages individuelles sur des milieux contenant 0 200 400 ou 800 ug ml de ConA et de l inuline marqu e hydroxy 4C m thyl 6 8 mCi g r f Sigma la concentration de 9 uCi 333 kBq ml soit environ 20 cpm nl Chaque milieu est pr par en coulant 10 ul de solution Ap2 avec ou sans ConA entre deux feuilles de Parafilm sur un support cylindrique de 9 mm de diam tre milieu inuline 14C 10ul ilm support plexiglass parafilm eppendorf coup Figure 24 Dispositif mis en place pour mesurer individuellement les quantit s de milieux marqu s l inuline 14C ing r es par des pucerons larves ou adultes Apr s 24 h les larves pondues sont supprim es avec un pinceau en vitant de perturber les adultes Au bout de 48 h les larves sont supprim es et les miellats sont collect s l eau distill e Miellats et pucerons sont pool s et dig r s dans 200 ul de solu ne Solu ne 350 Packard pendant 24 h fiche protocole N 15 Les extraits sont ensuite neutralis s avec 50 ul d acide a
68. alis Plusieurs faits int ressants ressortent de l analyse en composantes principales des lectines mannose glucose se r v lent parmi les plus toxiques des lectines test es Elles induisent des mortalit s et des inhibitions de croissance significatives la plus forte concentration test e 250 ug ml Il s agit de la ConA de la GNA de la PSA et de la LcH cependant toutes les lectines mannose glucose ne montrent pas les m mes effets toxiques tant au niveau de la mortalit VVAm la CPA et la VFA sont inactives qu au niveau de la croissance VVAm CPA et VFA inhibent tr s peu la croissance 250 pg ml contrairement ConA GNA PSA et LcH Le graphe en toiles de la figure 9C2 illustre parfaitement cette observation mise part la lectine de l amaranthe dont la toxicit a t confirm e par une exp rience compl mentaire Rahb communication personnelle les lectines des autres classes ne pr sentent pas de propri t s aphidotoxiques int ressantes exploiter dans le cadre de notre tude L ECA et la BSII peuvent cependant tre distingu es car elles induisent des inhibitions de croissance de l ordre de 40 50 96 250 ug ml L objectif principal de ce premier criblage tait de mettre en vidence une ventuelle corr lation entre la sp cificit osidique des lectines et leur activit insecticide Les faits pr c dents d montrent clairement qu aucune r gle g n rale ne vient corr
69. amp Francis 1995 p 59 90 Van Damme E J M Smeets K Torrekens S Van Leuven F Goldstein I J et Peumans W J The closely related homomeric and heterodimeric mannose binding lectins from garlic are encoded by one domain and 2 domain lectin genes respectively Eur J Biochem 1992 Vol 206 N 2 p 413 420 Van der Salm T Bosch D Honee G Feng L X Munsterman E Bakker P Stiekema W J et Visser B Insect resistance of transgenic plants that express modified Bacillus thuringiensis CRYIA b and CRYIC genes a resistance management strategy Plant Mol Biol 1994 Vol 26 N 1 p 51 59 Van Eijsden R R De Pater B S et Kijne J W Mutational analysis of the sugar binding site of pea lectin Glycoconjugate J 1994 Vol 11 N 4 p 375 380 Van Helden M The resistance of lettuce to the aphid Nasonovia ribisnigri Th se Universit de Wageningen 1995 122p Vranken A M Van Damme E J M Allen A K et Peumans W J Purification and properties of an N acetylgalactosamine specific lectin from the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani FEBS Lett 1987 Vol 216 p 67 72 Wang J L Cunningham B A et Edelman G M Unusual fragments in the subunit structure of Concanavalin A Proc Natl Acad Sc USA 1971 Vol 68 p 1130 1134 Wang M Boulter D et Gatehouse J Characterization and sequencing of cDNA clone encoding the phloem protein PP2 of Cucurbita pepo Plant Molecular Biology 1994a
70. biologie des pucerons 70 En terme d effets sur la croissance et sur la mortalit des larves les t moins des deux tests sont identiques Les donn es traduisant ces effets sont donc analys es globalement tableau 9 Par contre pour certaines variables se rapportant la f condit d Md rm les deux tests sont consid r s ind pendamment Ainsi le nombre total de larves Lv pondues par les pucerons t moins du deuxi me test est sensiblement plus faible que celui des pucerons t moins du premier test De plus il existe un d calage d un jour entre les premi res pontes de ces deux lots variable d Ces deux observations apparaissent clairement sur la figure 16C et se traduisent par des rm l g rement mais significativement diff rents Dans le second test les adultes sont pes s J20 jour que nous pensions correspondre la moiti de la p riode reproductive Le gain de masse des pucerons entre le jour J8 qui correspond approximativement la mue imaginale et le jour J20 est significativement plus important pour les adultes plac s sur milieux lectines 62 96 et 56 pour les deux concentrations de GNA 46 pour les pucerons t moins Ils rattrapent partiellement leur retard de croissance initial sans le combler compl tement cependant puisqu J20 ils sont toujours significativement plus petits que les pucerons sur milieux t moins La f condit totale est moindre pour les adultes intoxiqu s 29 pour la GNA 2
71. canismes de r sistance mis en jeu par les plantes non h tes ou r sistantes ces insectes pour exemples Van Helden 1995 Nous avons transpos cette technique l tude du comportement d alimentation de pucerons de l esp ce A pisum sur des milieux artificiels contenant de fortes concentrations de Concanavaline A Bien que des exp riences d EPG sur milieu artificiel aient d j t r alis es Van Helden Tjallingii communication personnelle aucun de ces travaux n a t publi et il existe donc encore tr s peu de supports d analyse des signaux obtenus dans ces conditions tr s diff rents bien s r de ceux enregistr s in planta Avant de revenir plus en d tail sur les mat riels et m thodes utilis s dans le cadre de notre tude il nous semble n cessaire de d crire le principe de l EPG Les pi ces buccales des pucerons sont constitu es de stylets capables de p n trer dans les tissus v g taux pour atteindre les tubes cribl s du phlo me figures 2 3 et 26 f 4S puro xL pee AUTRE Figure 26 Repr sentation sch matique d un puceron en position de recherche de nourriture sur une feuille Ce comportement d alimentation a vivement int ress les entomologistes car il ne se limite pas en fait une simple recherche de nourriture et une salivation mais inclut des activit s vari es et complexes telles que le mouvement des stylets la salivation et des interactions avec le v g tal Tjal
72. ce biais M thodologie A pr parer le jour m me du test pour une plaque G latine 5 dissoudre au bain marie bouillant PBS un litre 5 comprim s PBS g latine ajouter 1 2 ml de g latine 5 10 8 ml de PBS PBS Tween ajouter 1ml de Tween 20 1 litre de PBS NB la solution de PBS Tween ne se garde pas plus d une nuit 4 C PBS Tween g latine ajouter 1 2 ml de g latine 5 a 10 8 ml de PBS Tween tampon carbonate bicarbonate 0 1 M pH 9 5 15 ml diluer 10 fois le tampon stock 1M R actifs anticorps de capture anticorps de lapin fraction Ig G primaires anti ConA r f Sigma C7401 titre 15 8 1 875 mg ml d antis rum avec 1 mg ml ConA anticorps biotinyl anticorps de ch vre anti ConA r f Vector BA 0004 avidine r f Pierce 21121X peroxidase biotinyl e r f Pierce 29139X Tous ces r actifs ont t re us sous forme de poudre pure lyophilis e Ils ont t repris dans de l eau ultra pure et aliquot s de mani re avoir des aliquotes de 100 ul contenant la quantit n cessaire de r actifs pour une plaque Ces aliquotes sont conserv es 20 C antig ne ConA r f EY Laboratories L1104 substrat peroxydase kit solutions TMB Peroxydase Substrate et Peroxydase Solution B 2 TMB Microwell Peroxydase Substrate System Kirkegaard amp Perry Laboratories Inc 50 76 00 Mat riel microplaques de titration en polystyr ne 96 trous
73. cellulaires 88 La technique ELISA ne permet pas de doser la ConA complex e des dosages r alis s sur les culots se sont toujours av r s n gatifs N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 143 de ces r gions du tube digestif Par extrapolation nous mettons l hypoth se que les cellules pith liales de l intestin sont capables de fixer les m mes quantit s de ConA que les cellules pith liales de l estomac qui correspond quand m me une portion beaucoup plus courte que l intestin Une deuxi me s rie de dosages a consist rajouter de la ConA dans les m mes proportions que pr c demment 500 ng extrait des broyats de pucerons intoxiqu s 200 400 ou 800 ug ml de lectine La figure 46 montre que les intestins des pucerons intoxiqu s fixent plus de ConA que les estomacs et que ce sont ces derniers qui ont perdu une portion de leur capacit de fixation par rapport la situation t moin plante ou milieu sans lectine De plus la proportion ConA libre dos e sur ConA ajout e fix e est identique pour les trois modalit s La premi re observation sugg re que les estomacs ayant d j fix de la lectine sont partiellement satur s La seconde observation indique que l estomac d un puceron intoxiqu la concentration de 200 ug ml fixe les m mes quantit s de lectine qu un estomac de puceron intoxiqu la concentration de 400 ou 800 ug ml Il serait
74. champignons entomopathog nes les Hyphomyc tes et les Zygomyc tes sont actuellement consid r s comme des biopesticides potentiels contre les pucerons C est le cas en particulier de certaines esp ces des genres Verticillium Fusarium Conidiobolus Entomophtora Erynia Neozygites et Zoophthora tableau 1 Mais l efficacit des formules base de champignons entomophages dans le contexte local de la culture sous abri reste d montrer notamment cause des conditions relativement s ches qui caract risent la saison hivernale des cultures sous nos latitudes Rabasse et al 1984 Deux autres antagonistes utilis s en lutte biologique ont retenu notre attention les virus et les bact ries Les baculovirus en particulier font l objet de nombreux travaux Ils s attaquent uniquement des invert br s de mani re tr s sp cifique Ils ne pr sentent donc aucun danger pour les mammif res et autres vert br s et leur emploi permet une intervention pr cise sans risque d effets n fastes sur les ennemis naturels du ravageur vis Cunningham 1988 Le bacille entomophage le mieux connu en lutte biologique et le seul qui soit commercialis et utilis sur une grande chelle est le Bacillus thuringiensis Il accapare environ 90 du march actuel des biopesticides Riba et Silvy 1993 Aronson 1994 Bien qu une description plus d taill e de ces antagonistes ne serait pas sans int r t nous nous limiterons cette vocation I
75. cifiquement aux sucres L administration d un anticorps anti sucrase isomaltase une enzyme sp cifique des glycoprot ines membranaires induit des effets similaires ceux de la ConA Lorenzsonn et Olsen 1982 ce qui am ne les auteurs de cette tude sugg rer que les effets de la lectine r sulteraient d une interaction lectine r cepteur et non d un processus purement intracellulaire Les observations de Larue Achagiolis et al 1992 corroborent cette hypoth se la lectine en interagissant avec certains groupements glycosyl s de la paroi intestinale du rat r duit la prise alimentaire en emp chant l absorption intestinale D autres travaux sugg rent que la lectine agirait sur la perm abilit membranaire des cellules pith liales Sj lander et al 1984 L hypoth se d une interaction des lectines avec les groupements glycosyl s de la paroi intestinale du rat est aujourd hui bien admise et Schumacher et al 1993 utilisent par exemple classiquement des lectines pour identifier par immunohistochimie la nature des sucres la surface du petit intestin Pusztai et al 1979b d montrent que les l sions induites par la lectine du haricot PHA au niveau de la bordure en brosse des ent rocytes du duod num du rat sont r versibles au moins en d but d intoxication si l ingestion de la lectine cesse Au contraire si les animaux continuent de consommer la lectine ces l sions deviennent irr versibles Une proportion non n glig
76. cis ment au poids mol culaire d une sous unit ConA PM d c b a PM T kda A ha 45 kia 30 kda 20 1 kda am an m ji Figure 42 Comparaison des profils lectrophor tiques des broyats d estomacs de pucerons adultes pisum laiss s 72 h sur des milieux Ap2 simples a ou contenant 200 ug ml 1 de ConA b 400 ug ml 1 c ou 800 ug ml 1 d PM profils des marqueurs de poids mol culaires La fl che indique la bande correspondant au poids d une sous unit ConA 26 kDa 85 Les endopeptidases rompent les liaisons peptidiques CO NH l int rieur de grosses mol cules prot iques pour les r duire l tat de peptides Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 134 Cette observation et les tudes de Nakata et Kimura 1986 1990 qui montrent que la lectine est tr s r sistante la prot olyse intestinale chez le rat nous confortent dans l id e que la ConA ne serait pas ou tr s partiellement d grad e dans le tube digestif Le pH dans la lumi re de l estomac peut tre estim 6 8 dans l estomac contre 7 5 dans l intestin Rahb communication personnelle Nous avons dit ant rieurement qu il faut un pH inf rieur 5 6 pour que la ConA sous forme t tram rique se dissocie en dim re et un pH inf rieur 5 pour qu elle perde sa capacit de reconnaissance des sucres Liener ef al 1986 La lectine ne serait donc pas non plus dissoci e dans le
77. contraignante en main d oeuvre elle ne n cessite pas un relev quotidien Elle minimise galement les risques de perturber les adultes et de blesser les plantes et donc d introduire un artefact in valuable dans les r sultats finaux La validit de cette m thode simplifi e est estim e pour juger de la pertinence de son utilisation pour des tests rapides sur un grand nombre de plantes transg niques 46 Dans certaines boites des pucerons stress s peuvent par exemple mettre des ph romones d alarme et perturber l alimentation des autres pucerons L effet bo te se traduit par une population d adultes de tailles homog nes mais plus petites que dans les autres boites Dans l ensemble nous l observons assez rarement et surtout dans des conditions exp rimentales limites d p t rapide des larves dans les grandes s ries effectif initial de larves limit obligeant inclure les individus ventuellement stress s par la manipulation etc Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 58 Deux autres param tres populationnels sont utilis s dans notre analyse 1 la dur e moyenne d une g n ration Elle est calcul e par l quation de Wyatt amp White 1977 T d 0 738 2 la dur e n cessaire a une population pour doubler sa taille Elle est d duite de l quation de Birch DT In 2 r 2 9 5 Comparaisons des variables f condit Mod lisation de la dynamique de ponte Les variable
78. cr tion un d tachement progressif de la membrane apicale exfoliation une accumulation importante dans la lumi re stomacale de d bris membranaires et de mat riels cytoplasmiques Il ne semble pas que la bordure stri e soit elle m me directement atteinte Il n y a pas lyse de l pith lium Les cellules pith liales ne perdent pas leur int grit en particulier leur noyau ne semble pas d truit Les l sions que nous observons sont similaires sur plusieurs points avec celles d crites chez le rat Une tude plus d taill e sur l ultrastructure de la bordure stri e nous permettrait de confirmer ou d infirmer cette analogie Lorenzsonn et al 1982 observent localement une destruction des microvillosit s et l apparition de v sicules entre ces microvillosit s Les coupes que nous avons observ es en microscopie lectronique ne sont malheureusement pas assez r solutives pour permettre la distinction de ces sympt mes Nos observations ne permettent pas de montrer si des l sions apparaissent dans l intestin des larves tr s fortement intoxiqu es Mais nous avons n anmoins montr que cette r gion du m sent ron serait capable de fixer comme l estomac de grandes quantit s de lectine in vitro mais semble t il aussi in vivo Les r sultats d tudes sur le mode d action de la ConA sur l pith lium de rat indiquent que la lectine agirait en se liant un r cepteur de type glycoprot ine membranaire du fait de sa sp
79. d constituer une part plus importante de ce travail mais a du tre limit e pour des raisons ext rieures l organisation de la th se Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 50 Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 1 Introduction Depuis quelques ann es les recherches se sont intensifi es pour mettre en vidence des prot ines entomotoxiques La derni re partie du chapitre 1 r sume l avanc e de ces travaux Si les premi res tudes ont essentiellement port sur les Col opt res les Homopt res sont d sormais galement vis s Il est aujourd hui envisageable d exploiter les propri t s toxiques de certaines prot ines pour cr er par g nie g n tique des plantes r sistantes aux insectes Une tape importante pour juger si un g ne est exploitable ou non en transg n se est la caract risation de la toxicit et du mode d action de la prot ine cod e vis vis de l insecte vis Notre travail sur les lectines et les pucerons s inscrit pr cis ment dans cette d marche Des tudes ant rieures ont montr que des lectines taient toxiques vis vis de diff rentes esp ces d Homopteres Gatehouse ef al 1992 Rahb et Febvay 1992 Habibi et al 1993 Powell et al 1993 Rahb et Febvay 1993 Les lectines constituent une classe de prot ines aux propri t s physico chimiques et biologiques tr s vari es Les pucerons quant eux repr sentent une
80. de Lutte Biologique OILB peut tre consid r e dans son sens le plus strict comme l utilisation d organismes vivants ou de leurs produits pour emp cher ou r duire les pertes ou dommages caus s par des organismes nuisibles Ce concept fait galement r f rence toute modification de l environnement dans le respect des r gles cologiques de stabilit et d quilibre qui conduisent au maintien des organismes nuisibles en dessous d un seuil conomique La grande diversit des ressources biologiques en principe exploitables en lutte N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 21 biologique donne lieu diverses techniques utilisables Cloutier et Cloutier 1992 Deux grands types d interventions sont distingu es les interventions visant exploiter des organismes vivants antagonistes ou des produits d riv s d organismes vivants dans le but pr cis d liminer les ravageurs 2 les interventions visant diminuer l activit des ravageurs fond es sur l usage a de substances comme les ph romones agissant sur leur comportement b de cultivars montrant une r sistance aux ravageurs c de substances comme les juv noides perturbant leur d veloppement d de substances chimiost rilisantes ou de m les st riles Nous ne d taillerons pas ces deux derni res possibilit s d intervention dans la mesure o elles ne sont pas appliqu es pour les pucerons 1 3 3 1 Antagoniste
81. de Parafilm support PVC Fiche N 5 Dosage de la GNA par immunod tection sur membrane de nitrocellulose Technique par d p t en tache Dot blot Extraction Une feuille est coup e roul e dans un eppendorf capuchon perc pr alablement pes vide et plong e dans de l azote liquide 2 10 feuilles par plante sont ainsi r colt es Les chantillons sont ensuite lyophilis s et stock s 20 C Les extraits secs sont broy s pes s et dilu s dans un tampon Tris HCl 50 mM pH 9 5 contenant 1 d une solution de PMSF dans de l thanol 36 mg ml raison de 1ml de tampon pour 10 mg de poudre L ensemble est laiss sous agitation 4 C pendant une nuit Apr s centrifugation 11000 rpm 5 min 4 C 800 900 ul de surnageant sont r cup r s et stock s 20 C Un dosage des prot ines totales des extraits est r alis suivant la technique de Bradford Fiche Protocole N 6 La concentration moyenne des extraits a t estim e 5 ug de prot ines par 9 5 ul d chantillon Une gamme t moin de GNA 0 2 est pr par e partir d une solution m re de GNA 5 ng ul Chaque extrait t moin contient de la GNA d fini gamme 0 2 des prot ines totales 9 5 ul 5 ug d extrait d un chantillon t moin D p t Blotting 200 ul par extrait sont d pos s sur une membrane de nitrocellulose l aide du dispositif suivant ai 200 ul Tris HCl 50mM membrane nitrocel
82. de la moyenne calcul e pour chaque modalit et d pos s individuellement sur leurs milieux artificiels respectifs Chaque jour la m me heure jusqu la mort de tous les pucerons le nombre d individus morts et le nombre de larves pondues dans chaque boite sont not s 2 8 2 Intoxication subl tale d A pisum par la ConA 2 me s rie Une seconde s rie de tests a consist placer dans un premier temps des larves n onates sur des milieux Ap2 contenant 0 100 150 200 250 300 350 ou 400 pg ml de ConA AM n 4x20 pour la modalit t moin n 2x20 pour les modalit s ConA De m me que dans 4 Nous reviendrons sur ces hypoth ses dans le chapitre Discussion 45 Les bo tes sont plus petites que celles utilis es pour les tests d intoxication aigu diam tre 18 mm hauteur 15 mm 100 ul de milieu coul s par bo te N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 55 la premi re s rie la mortalit est relev e au jour J7 et les apt res survivants sont pes s Apr s calcul des inhibitions de croissance les modalit s ConA100 et ConA200 sont retenues pour la suite de l exp rience IC respectives 47 et 60 En nous basant sur leurs masses 20 individus de chacune des modalit s t moin ou ConA sont choisis puis transf r s dans des boites individuelles Les larves pondues et les adultes morts sont relev s quotidiennement Les pucerons survivants so
83. de r sistance aux virus et aux insectes dans les plantes in La lutte biologique Boucherville Canada Ed Ga tan Morin 1992 Chap 24 p 451 470 Lapointe S L et Tingey W M Glandular trichomes of Solanum neocardenasii confer resistance to green peach aphid Homoptera Aphididae J econ Entomol 1986 Vol 79 N 5 p 1264 1268 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 187 Larocque A M et Houseman J G Effect of ingested soybean ovomucoid and corn protease inhibitors on digestive processes of the european corn borer Ostrinia nubilalis Lepidoptera Pyralidae J Insect Physiol 1990 Vol 36 p 691 697 Larue Achagiotis C Picard M et Louis Sylvestre J Feeding behavior in rats on a complete diet containing Concanavalin A Reprod Nutr Dev 1992 Vol 32 N 4 p 343 350 Latg J P et Papierok B Aphid pathogens in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1988 Vol 2B p 323 336 Leclant F Les effets nuisibles des pucerons sur les cultures in Les pucerons des cultures Paris Ed INRA ACTA 1981 Vol p 37 56 Legavre T Vers de nouvelles strat gies de contr le des Potyvirus I Inhibition de la transmission par pucerons II Recherche de nouveaux g nes de r sistance d riv e du pathog ne Th se 3 me Cycle Universit Paris Sud Centre d Orsay 1993 Leon A Etude d une l gumineuse tropicale n
84. de s ve 2 ng de prot ines sont ainsi r coltables et quantifiables par Dot Blot ou ELISA Pour l heure nous sommes confront s un probl me pratique de mise en oeuvre de cette technique au laboratoire de nos coll gues britanniques inversement nous ne disposons pas des 57 Avec A solani et M euphorbiae sur pomme de terre D sir e Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 90 autorisations n cessaires pour exp rimenter leurs plantes transg niques dans notre laboratoire Cependant la sensibilit de cette m thode ne permettra que des mesures approximatives du taux d expression de la GNA excluant donc de mettre en vidence une ventuelle variation de cette expression Or ce dernier point est essentiel pr ciser Nous ne savons pas par exemple si le taux d expression varie en fonction de l ge des plantes Il est possible que la variation de l expression soit tr s diff rente d une lign e l autre Les conditions de multiplication des transplants exclue a priori une variabilit intralign e Gatehouse communication personnelle Toutes ces interrogations soulignent l importance des travaux visant trouver un promoteur phlo me sp cifique pour viser plus pr cis ment les insectes phlo mophages que sont les pucerons Gatehouse ef al 1995b N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 91 Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alim
85. des cellules animales induite par ces mol cules Goldstein et Hayes 1978 Goldstein et Poretz 1986 Au regard des observations de Kr pe 1956 cit par Goldstein et Poretz 1986 et de ses propres tudes M kel 1957 sugg re que les monosaccharides r agissant avec les lectines peuvent tre divis s en quatre classes Cette classification se base sur la structure st r o isom rique des groupements hydroxyles en C 3 et C 4 du cycle pyranose figure 7 Elle permet ainsi de distinguer dans un premier temps quatre groupes de lectines 1 les lectines telles celles de Lotus tetragonolobus et Ulex europaeus L se liant au L fucose sucre de la classe I 2 les lectines comme celle du soja se liant au galactose et ou la N ac tylgalactosamine sucres de la classe II 3 les lectines telles la ConA ou la GNA se liant au mannose et ou au glucose sucres de la classe III selon M kel 4 ce jour il n a pas encore t mis en vidence de lectines interagissant avec l un des sucres de la classe IV idose gulose L glucose et L xylose oe v Y LEO mI m qoon q 1H H OH a on Henani aide sialiaae CHOH H os on Onl D galactise B D plicuse CIRH IH NHCOCH L NHCOCII B DN bylgaluctussmine Be De Nsacitylphiacusamime Figure 7 A Classification des sucres selon M kel bas e sur la position des groupements hydroxy les en C 3 et C 4 d
86. des 11 variables retenues pour l analyse statistique des enregistrements EPG obtenus avec des pucerons de l esp ce Acyrthosiphon pisum sur milieux standards simples ou contenant de la Concanavaline A 115 10 Listes des fiches protocoles Fiche N 1 Origine et levage des pucerons ss 197 Fiche N 2 R f rences des lectines v g tales test es sur pucerons 197 Fiche N 3 Composition du milieu standard Ap2 sise 198 Fiche N 4 Pr paration des milieux Ap2 uccisi eee ense stet te te Rte rere Eee eR Ere REP e Eee Eee eiii 198 Fiche N 5 Dosage de la GNA par immunod tection sur membrane de nitrocellulose Technique par d p t en tache Dot Blot eee eee ee e e biete ipee esie vem de ote eee on 199 Fiche N 6 Dosage des prot ines par la m thode de Bradford 1976 200 Fiche N 7 D tection de la GNA dans des feuilles de pomme de terre par chimioluminescence Enhanced Luminescence Detection ECL Tissue Blot 201 Fiche N 8 Dissection des tubes digestifs de pucerons 202 Fiche N 9A Dosage sp cifique de la ConA par une m thode immunoenzymatique quantitative l ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ss 203 Fiche N 9B Dosage de la ConA par ELISA proc d BRAB esee 204 Fiche N 10A Dosage sp cifique de la GNA par une m thode immunoenzymatique quantitative l ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
87. des lectines et leur origine botanique S ils demandent tre compl t s pour les lectines de la famille des C salpiniac es des Poac es et des Euphorbiac es cette d marche reste int ressante En effet la recherche des lectines toxiques pour un insecte donn peut tre r alis e selon deux tapes compl mentaires 1 criblage de lectines dans un large spectre de sp cificit s osidiques et de diff rentes origines v g tales 2 criblage de lectines d une m me famille v g tale choisie par l tape pr c dente et g n ralement sp cificit osidique plus restreinte C est la d marche que nous adoptons dans le cadre de notre tude sur les pucerons et qui explique que nous nous int ressons particuli rement aux lectines de la famille des Amaryllidac es qui sont des lectines mannose strict GNA et lectine de la jonquille NPA 24 Des lectines quiperont tr s probablement dans les ann es qui viennent des plantes transg niques commercialis es r sistantes des col opt res et des l pidopt res tableau 4 Ainsi par exemple l quipe de Gatehouse a cr des tabacs r sistants la noctuelle Heliothis virescens F par l introduction des g nes de la lectine du pois PSA et d un inhibiteur trypsique du ni b La relative r sistance des lectines la prot olyse permet d esp rer que ce m canisme de contournement de toxicit ne soit pas un obstacle majeur leur utilisation Des toxicit s
88. dos les acides amin s libres de broyats de pucerons adultes laiss s 48 h sur des milieux contenant des concentrations plus ou moins toxiques de ConA 200 800 ug ml ou de GNA 5 400 ug ml Le miellat excr t par les insectes est galement analys Les concentrations en GNA de 5 ug ml et de 20 ug ml ne sont pas toxiques mais induisent au contraire une stimulation significative de la croissance des pucerons Chapitre 2 figure 13 A 400 pg ml la GNA induit une inhibition de croissance approximativement identique celle induite par la ConA 200 ug ml IC 50 figure 10 Nous cherchons ainsi mettre en vidence avec l outil diagnostic du profil des acides amin s libres d j utilis au laboratoire pour tudier les effets de la symbiose sur A pisum Liadouze et al 1995 1 si l intoxication par la ConA et la GNA se traduit par une modification significative et interpr table du profil en acides amin s libres des pucerons et de leur excr tion 2 si l effet probiotique induit par la GNA se traduit aussi par une modification identifiable de ces profils 3 si la modification ventuelle de l aminoacid mie est identique pour la ConA et pour la GNApar une analyse comparative des profils soit concentrations similaires ConA400 GNA400 soit effets toxiques induits similaires ConA200 GNA400 3 2 2 1 Dosages des acides amin s libres des broyats de pucerons entiers Les repr sentations
89. es de la fonction les corr lations entre param tres et surtout le crit re d optimalit somme des carr s des carts r siduels La prise en compte de ces caract ristiques repose sur l hypoth se que le mod le retenu est exact et que la variance de la fonction d ajustement est constante dans tout le domaine explor Or pr cis ment dans tous les ajustement effectu s l examen des r sidus montre que 1 la variance de la fonction d ajustement n est pas constante dans tout le domaine pour des y grands les r sidus sont importants et inversement 0 10 20 30 40 Nombre total de larves pondues jour 5 Graphes des r sidus calcul s pour l ajustement des donn es observ es correspondant au nombre de larves pondues par jour par des pucerons de l esp ce Myzus persicae sur des milieux standards Ap2 Les fl ches d signent les r sidus les plus importants ou ne se distribuant pas al atoirement Ceci peut s expliquer facilement par le fait que les pucerons ne pondent pas en continu variabilit intra individuelle ni de mani re synchrone variabilit inter individuelle I aurait fallu augmenter soit le pas des observations relev toutes les 6 ou 12 h soit le nombre des individus pour minimiser ces facteurs et obtenir un meilleur lissage de la courbe de f condit des donn es observ es 2 le mod le n glige certains points r sidus tr s importants ce qui est sans aucun doute la cons quence de la remarque
90. famille d insectes tr s large comprenant en particulier de nombreuses esp ces fortement nuisibles Il est donc important dans un premier temps de pouvoir valuer les crit res de sp cificit de l interaction pucerons lectines notamment en confrontant une large gamme de lectines un puceron mod le et en pr cisant l activit des plus int ressantes d entre elles sur plusieurs esp ces d int r t agronomique Une trentaine de lectines ont ainsi t test es sur notre puceron mod le A pisum Les lectines mannose glucose induisent les effets toxiques les plus int ressants en particulier la Concanavaline A ConA et la lectine du perce neige GNA Ces r sultats ont guid notre choix vers l tude de ces deux toxines La ConA s av re galement toxique pour cinq autres esp ces de pucerons appartenant deux tribus taxonomiques Des toxicit s diff rentielles sont cependant observ es entre ces esp ces Inversement nous avons galement constat que des lectines sp cificit s osidiques tr s proches lectines mannose n induisent pas les m mes effets toxiques Nous d crivons les effets de concentrations subl tales ie induisant des inhibitions de croissance sans mortalit larvaire appr ciable de la ConA et de la GNA sur la f condit de pucerons plac s sur des milieux artificiels Les biologistes mol culaires esp rent faire s exprimer les lectines de telles concentrations dans la s ve phlo mienne de pla
91. final les acides amin s et le saccharose sont pes s individuellement sur la microbalance Mettler quantit s pour 100 ml voir fiche protocole N 3 Ils sont dissous dans 40 ml d eau ultra pure plus 20 ml de la solution de vitamines Apr s agitation barreau magn tique ultra sons le pH est amen 7 avec KOH 5 M Le KH PO est ajout et dissous par agitation Le pH est nouveau ajust 7 5 le volume final est ajust 100 ml Il faut alors v rifier que la pression osmotique soit d environ 1200 mOsM Febvay et al 1988 la solution est filtr e travers un filtre de 0 45 um Disposable Filterware Nalgene 9 et stock e par quantit s aliquotes de 5 ou 10 ml 20 C jusqu l utilisation cinq six semaines maximum Coulage des milieux les milieux sont d congel s temp rature ambiante ou par ultra sons Apr s incorporation ou non des prot ines tester 750 ul de milieux sont coul s en atmosph re st rile entre deux films de Parafilm tendus sur un support cylindrique tube de polyvinylchloride PVC 35 millim tres de diam tre 20 millim tres de hauteur Srivastava et Auclair 1971 Les boites ainsi obtenues sont utilis es le jour m me ou stock es 4 C pour tre utilis es le lendemain ou stock es 20 C pour une utilisation ult rieure dans un d lai d un mois lorsqu elles ne contiennent pas de prot ines ou d autres compos s sensibles la d cong lation milieu feuille
92. forte mortalit m me moyenne dose 50 ug ml C est donc une lectine tr s int ressante de par ses effets atypiques La figure 9 rassemble le diagramme des valeurs propres le cercle des corr lations variables facteurs plan F1 F2 et les cartes factorielles des vingt sept lectines plan F1 F2 issus de cette analyse Pr s de 50 de la variabilit totale est port e par l axe 1 et 78 par les trois premiers axes Le cercle des corr lations F1 F2 met clairement en vidence la redondance importante de certaines variables ce qui n est pas tonnant compte tenu de leur d finition mais permet de d finir cinq groupes L analyse de la matrice des corr lations permet par ailleurs de rendre compte de cette redondance donn e non montr e elle indique logiquement des corr lations positives 20 70 entre les mortalit s relev es deux intervalles de temps successifs pour une m me concentration par exemple md3c et md7c sont fortement corr l es Les douze variables permettent cependant une analyse un peu plus fine trois axes factoriels informatifs que la prise en compte unique des CL50 et IC50 L interpr tation du cercle des corr lations et des cartes factorielles est rendue possible gr ce la statistique d inertie les variables mortalit s en particulier md3a md3b md3c et md7c contribuent essentiellement la d finition de l axe 1 Celui ci traduit parfaitement l effet majeur de toxicit g n rale et la corr l
93. important de la d crire dans une partie d di e 2 Les plantes transg niques offrent des perspectives prometteuses pour lutter contre les insectes ravageurs Le g nie g n tique offre la possibilit d incorporer des g nes trangers dans le g nome de certaines esp ces v g tales tel par exemple un g ne codant pour une prot ine entomotoxique La transg n se ouvre ainsi a priori d immenses perspectives d am lioration des plantes cultiv es entre autres dans le domaine de la protection contre les pathog nes et les ravageurs Dans les paragraphes qui suivent nous d crirons dans un premier temps les avantages que pr sente cette nouvelle approche de lutte tout en montrant ses limites tant au niveau technique qu au niveau agronomique probl me d apparition de populations d insectes r sistants Dans un second temps nous d crirons les mol cules susceptibles d tre exploit es dans une telle strat gie en d finissant au pr alable les crit res auxquels les prot ines doivent r pondre pour tre consid r es comme de bonnes candidates la transg n se 2 1 Avantages et inconv nients pr sent s par les plantes transg niques Certains des avantages des plantes transg niques ont t voqu s dans le paragraphe pr c dent consacr aux cultivars r sistants Mais la transg n se pr sente des avantages et inconv nients sp cifiques par rapport l am lioration g n tique traditionnelle Potrykus 1991
94. int ressant d estimer la quantit de ConA qu un estomac est capable de fixer Pour plusieurs raisons la technique ELISA ne nous permet pas de le faire directement En effet la lectine soluble des extraits peut tre soit de la ConA ing r e et non complex e aux cellules pith liales soit de la ConA ing r e complex e et ou fix e apr s ajout et partiellement resolubilis e par le Tween 20 De plus m me si nous savions exactement quoi correspond la lectine soluble dos e comme nous travaillons sur des d bris cellulaires nous ne pouvons pas estimer par ce protocole la quantit de lectine complex e in vivo la surface des cellules pith liales La seule r ponse apport e par la figure 46 serait qu apr s avoir incub l quivalent d un estomac de puceron moyennement ou fortement intoxiqu 48 heures avec 500 ng de ConA cet estomac semble se saturer en lectine 3 2 Cons quences de l intoxication par la ConA sur la physiologie d A pisum 3 2 1 Histopathologie de l action de la ConA sur A pisum La planche II correspond des coupes transversales au niveau de l estomac d une larve normale coupe A d une larve intoxiqu e 48 h une concentration faiblement toxique de ConA 10 pg ml coupe B et d une larve fortement intoxiqu e 400 ug ml coupe C 99 D s la concentration faible une modification histo cytologique est d celable les cellules pith liales semblent se gonfler excroissance de la face apicale
95. la GNA a t dos e dans huit extraits ind pendants plantes diff rentes et dans deux aliquotes par extrait Le taux d expression de la GNA est de l ordre de 0 3 pour l une ou l autre des lign es Mais les r sultats sont assez variables d une feuille l autre voire m me entre les deux aliquotes de chaque extrait Ce dernier point souligne l impr cision de la mesure effectu e par cette technique Il ressort que les taux d expression que nous avons mesur ici sont plus faibles que ceux mesur s ant rieurement par Gatehouse et ses collaborateurs 1995a sur des plantes des m mes lign es taux valu s 1 2 96 lign es sur lesquels a t effectu le test biologique de juillet 1993 avec M persicae Au cours de notre s jour Durham en janvier 1995 nous avons nouveau appliqu cette technique de dosage pour valuer les taux d expression de la GNA dans les lign es qui ont alors fait l objet de tests biologiques avec A solani r sultats paragraphe 3 2 3 Nous ne sommes pas en mesure de pr senter ces r sultats ici mais quoi qu il en soit les taux mesur s semblent inf rieurs 1 96 51 Temps d exposition du film autoradiographique sur la membrane de nitrocellulose trop long 52 Ces plantes ont galement fait l objet de tests biologiques avec A so ani mais l exp rience a t rapidement stopp e en raison de mauvaises conditions exp rimentales Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des puceron
96. la courbe pr sente une bonne lin arit le coefficient de corr lation dose DO R2 est gal 0 90 Au del de 100 ug ml la courbe atteint une phase plateau interpr table comme une saturation des tubes digestifs en GNA A partir de la courbe de la figure 18B et des DO mesur es pour les extraits de tubes digestifs des modalit s plantes transg niques nous pouvons d duire les concentrations en GNA dans la s ve phlo mienne de ces plantes Ce raisonnement repose sur deux conditions le taux de r tention de la GNA par des pucerons sur milieu artificiel est analogue celui des pucerons sur plantes 2 les concentrations en GNA dans la s ve doivent tre comprises entre 5 et 100 uig ml l La sensibilit du dosage ne permet pas de quantifier avec pr cision la GNA en de de cette gamme lorsque nous travaillons avec des d p ts quivalents deux tubes digestifs Or pr cis ment les concentrations estim es sont au mieux de 5 ug ml dans la s ve des lign es GNA2 23 et PWG6 85 tableau de la figure 18B Les valeurs pour GNA2 28 et GNA2 30 53 Chaque extrait correspond au broyat de deux tubes digestifs N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 75 sont donn es titre indicatif Pour chaque modalit un seul extrait est dos ce qui rajoute une incertitude la mesure obtenue A 1 5 DO 405 nm 0 5 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
97. la lectine en utilisant trois sucres auxquels la ConA se lient de mani re tr s affine le mannose l a methyl mannoside GMM et le mannane par ordre croissant d affinit pour la ConA Poretz et Goldstein 1986 Des larves sont laiss es le temps de leur d veloppement larvaire sur des milieux contenant de la ConA de la GNA ou de la NPA des concentrations choisies pour inhiber leur croissance d environ 50 en 7 jours respectivement 160 ug ml soit 1 5 uM 400 ug ml 8 uM et 500 pg ml 13 uM A ces solutions nous avons rajout l un des sucres cit s pr c demment aux concentrations de 1 mM ou 10 mM figure 53 Les r sultats obtenus avec l MM sont difficilement interpr tables car cette mol cule m me faible dose s av re phagor pulsive pour les pucerons La figure 53 montre que le mannose et le mannane forte concentration induisent galement une inhibition de la croissance Le rapport molaire maximum sucre lectine que nous pouvons tester est donc de l ordre de 1 10000 En rajoutant 10 mM de mannose au milieu contenant 1 5 uM de ConA rapport 1 6700 nous obtenons une tr s faible mais significative p 5 ANOVA inhibition de l intoxication IC 65 96 vs 55 96 figure 53A Le r sultat avec la GNA est identique figure 53C La toxicit de la NPA n est pas affect e par le mannose figure 53C En ce qui concerne le mannane l ajout de ce polyoside ne s accompagne pas d une att nuation de l inhibition de
98. les pucerons semblent s habituer la lectine au sens comportemental du terme la concentration de 400 ug ml Ces r sultats peuvent sembler contradictoires en comparaison de ceux obtenus pr c demment avec les larves plac es sur des milieux contenant un traceur radioactif mais l EPG et la mesure de l ingestion ne fournissent cependant pas le m me type d information De plus pour des questions techniques et m thodologiques l EPG est conduite sur des jeunes adultes L apparente contradiction des r sultats s expliquerait simplement par une moindre sensibilit des adultes aux effets toxiques de la ConA Les r sultats des tests d intoxication subl tale chapitre 2 et d ingestion de milieu contenant de l inuline marqu e et de tr s fortes concentrations de lectine corroborent cette observation C est ce qui explique aussi qu avec la ConA 600 ug ml les adultes qui se sont mieux fix s que les pucerons de la l re s rie avec la ConA 400 ug ml ne semblent pas affect s dans les premi res heures d intoxication Seuls les enregistrements sur 24 h traduisent dans ce cas une diminution de la prise alimentaire L EPG confirme que cette diminution est la cons quence d une inhibition indirecte de l ingestion les pucerons ne refusent pas les milieux toxiques Ce mode d action de la ConA nous laissent supposer que par extrapolation les lectines mannose glucose pourraient assurer une bonne protection contre les pucerons et leur vir
99. litt rature Bevan et al 1989 Ohl et al 1990 Yang et Russell 1990 Wang et al 1992 Bhattacharyya et al 1993 Bostwick et al 1994 Wang et al 1994a Wang et al 1994b Nous avons eu la chance de pouvoir tester les performances biologiques de pucerons sur des pommes de terre transg niques Ceci prouve en tout cas que des biologistes mol culaires en l occurrence l quipe de J Gatehouse de l Universit de Durham et celle du groupe Axis sont eux m mes convaincus du r alisme de l approche plantes transg niques r sistantes aux homopt res A l heure actuelle leur travaux s orientent par exemple aussi vers la recherche d autres promoteurs permettant l expression phlo mienne comme celui de la lectine PP2 du potiron Cucurbita maxima Wang et al 1994a Le raisonnement pr c dent repose sur l extrapolation des r sultats obtenus in vivo aux effets susceptibles d tre observ s in planta Nous admettons que cette extrapolation appelle une certaine prudence Par exemple nous constatons nous m me que le potentiel biotique 108 diff re sensiblement entre les pucerons d levage et ceux plac s sur milieu artificiel Mais le type d tude que nous avons men e implique n cessairement de travailler sur de tels milieux que l quipe de Lyon consid re par ailleurs comme optimaux en premi re g n ration notamment en ce qui concerne la nutrition azot e Les dosages de GNA r alis s sur des extraits de feuille
100. miellat et a fortiori nous ne d tectons plus ou tr s peu de ConA apr s 24 h d intoxication Cette interpr tation nous semble plausible mais elle repose sur une hypoth se importante que nous avons omise et qui est l absence de d gradation de la lectine par le tube digestif Ce point ne peut tre tranch dans l tat actuel de nos donn es mais les r sultats suivants sur le contenu peptidasique du tube digestif d A pisum montrent que cette d gradation toutes les chances d tre faible sur les p riodes exp rimentales tudi es dans cette partie 84 Nous avons repris ici les donn es de la figure 33 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 133 3 1 3 Profil enzymatique du tube digestif d A pisum et devenir de la ConA ing r e L tude du profil enzymatique du puceron du pois A pisum puceron entier tube digestif glandes salivaires miellat a fait l objet d une publication r cente Rahb ef al 1995 Nous ne reprendrons ici que les r sultats se rapportant l activit peptidasique des diff rentes sections du tube digestif Nous renvoyons la publication pour les d tails concernant la technique de dosage semi quantitatif utilis e syst me API Bio M rieux Marcy l Etoile Paris L activit peptidase est d tect e dans trois r gions distinctes du tube digestif l estomac l intestin qui constituent le m sent ron et le rectum nous d finissons tr s pr cis men
101. moins par leur pic unique Bien que paraissant minime cette diff rence ne doit pas tre n glig e si l on s int resse par la suite la distinction des deux intoxications annexe 12C Le profil des acides amin s libres des miellats des pucerons intoxiqu s par la ConA se diff rencie fortement de ceux des pucerons t moins en particulier le taux d asparagine est multipli par 21 dans les extraits ConA800 L acide glutamique la glutamine et la cystine quasiment absents dans les miellats des pucerons t moins sont trouv s en plus forte quantit dans les miellats des pucerons intoxiqu s Il apparait distinctement sur les figures 49 et 50A que l augmentation du degr d intoxication se traduit par une augmentation de l excr tion de l asparagine principalement mais aussi de la glutamine de l acide glutamique Les anomalies d excr tion de la cystine non prise en compte dans AFC voir annexe 12C et dans une moindre mesure de l histidine et de l arginine apparaissent quant elles d j lors de l intoxication moyenne 200 ug ml La carte factorielle de la figure 50C montre une diff rence entre le pucerons intoxiqu s par la ConA et ceux intoxiqu s par la GNA au niveau des acides amin s excr t s arginine 30 et lysine 16 96 expliquent l essentiel de cette discrimination ConA vs GNA L asparagine n est pas prise en compte dans l analyse AFC ConA GNA miellat pour ne pas masquer l information apport e
102. observations variable d 1 3 et 1 8 jours de d calage pour PBG6 47 et PWG6 85 respectivement 3 2 3 Performances biologiques d A solani sur des pommes de terre transg niques exprimant la GNA seule ou en combinaison avec le BCH f vrier 1994 janvier 1995 Nous avons galement observ les performances biologiques du puceron commun des serres A solani sur six lign es transg niques Les lign es PWG6 85 et PBG6 47 ont fait l objet d un premier test f vrier 1994 Un second test janvier 1995 a t effectu sur PWG6 85 et quatre autres lign es transform es trois exprimant la GNA seule GNA2 23 GNA2 28 GNA2 30 la quatri me WA19 12 transform e avec le g ne de WAI mais ne l exprimant pas Cette derni re constitue ainsi un t moin transform par opposition la modalit t moin qui correspond des plantes non transform es var D sir e Par souci de clart les courbes de survie et de f condit des modalit s du second test sont repr sent es sur deux figures distinctes figures 21 amp 22 Les courbes des modalit s t moin et GNA2 23 apparaissent dans les deux figures pour faciliter l analyse globale des r sultats Les valeurs moyennes du tableau 11 et les courbes de la figure 20 se rapportant au premier test n cessitent peu de commentaires la f condit d A solani est r duite de mani re drastique sur la lign e PWG6 85 et surtout sur la lign e PBG6 47 Ces r sultats particuli rement int ressa
103. oesophage ni dans l intestin ni dans le rectum Par contre 800 ug ml l ensemble du tube digestif est marqu planche IV coupe A l exception de l oesophage et de la valvule oesophagienne coupe B La coupe A se situe au niveau de l estomac ant rieur la boucle thoracique 2 me boucle de l intestin apr s l estomac en particulier est tr s marqu e Nous pensons que l estomac la tr s forte concentration en lectine est satur et que celle ci transite dans l intestin La coupe A nous permet difficilement de d crire les effets de l intoxication au niveau des cellules intestinales Les cellules de la premi re section de l intestin apparaissent toujours marqu es de facon tr s dense et tout particuli rement dans la r gion du p le apical La coloration est plus diffuse dans la partie post rieure peut tre simplement parce que moins de lectine transite jusque dans cette r gion 91 Des coupes de larves intoxiqu es 800 ug ml ou 200 ug ml pr sentent la m me couleur bleue confirmant l inexistence d interactions non sp cifiques des r actifs utilis s dans notre protocole Planche IV Immunohistochimie sur coupes de larves d Acyrthosiphon pisum intoxiqu es par la ConA 800 ug ml Les coupes localisent la lectine dans les diff rentes r gions du tube digestif Planche V Observations au microscope lectronique a transmission de l ultrastructure des cellules m sent riques d une larve du puc
104. of intrinsic increase rates for aphids and tetranychid mites J appl ecol 1977 Vol 14 p 757 766 Yang N S et Russell D Maize sucrose synthase 1 promoter directs phloem cell specific expression of GUS gene in transgenic tobacco plants Proc natl Acad Sci USA 1990 Vol 87 N 11 p 4144 4148 Zaccomer B Strat gies pour interf rer avec la r plication virale dans des plantes transg niques le syst me mod le du TYMV Turnip Yellow Mosaic Virus Th se de 3 me Cycle Universit de Paris Sud Centre d Orsay 1993 Bibliographie 194 Publications Communications Publications Bournoville R Badenhausser I Imwinkelried J et Sauvion N Multiplication of the lupine aphid on different genotypes of white lupine Proceedings 7th International Lupin Conference 1990 Temuco Chile Nov 25th Dec 2nd p 116 Sauvion N Bonad Bottino M Jouanin L et Rahb Y Les plantes transg niques r sistantes aux insectes InfoZoo 1995 Vol 10 p 3 13 Rahb Y Sauvion N Febvay G Peumans W J et Gatehouse A M R Toxicity of lectins and processing of ingested proteins in the pea aphid Acyrthosiphon pisum Entomol exp appl 1995 in press Sauvion N Rahb Y Peumans W J Van Damme E Gatehouse J A et Gatehouse A M R Effects of GNA and other mannose binding lectins on development and fecundity of the potato peach aphid Myzus persicae Entomol exp appl 1995 in press Gatehouse A
105. ow les quantit s de lectines ing r es sont telles que les effets toxiques les affectent profond ment au point de les obliger a s arr ter de se nourrir et de les faire r partir sur tous les milieux sans discrimination A long terme cela conduit une localisation progressive sur les milieux d pourvus de ConA mais sans choix clair ce qui est observ Cette derni re hypoth se nous semble la plus plausible au vu des microtests de choix mais deux nouveaux protocoles ont t labor s pour la confirmer 3 1 2 R ponse apport e par les tests de conditionnement Deux lots de larves sont d pos s sur des milieux standards contenant 400 ug ml de Concanavaline A figure 29 Elles sont ainsi intoxiqu es pendant une nuit 15 h Les larves du premier lot 6 larves x 24 r p titions sont ensuite mises en condition de choix entre du milieu Ap2 et du milieu ConA 400 pg ml Si les larves d tectent de mani re gustative la ConA elles devraient rapidement la reconnaitre et se fixer pr f rentiellement sur le milieu Ap2 Un second lot de larves est mis en pr sence de deux milieux standards identiques t moins La figure 29A montre que des larves m me fortement intoxiqu es se fixent rapidement et indiff remment sur les deux milieux Ap2 Les pourcentages de fixation aux diff rents intervalles de temps sont identiques ceux not s dans le test pr c dent avec l acide chlorog nique figure 28A Il apparait sur la figure 29B q
106. par les autres acides amin s 92 ici ce terme d excr tion est compris dans une acception g n rale bilan excr tion assimilation qui ne pr sage forc ment pas de ph nom nes affectant la fonction physiologique d excr tion sensu stricto Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 160 53 ile val pro gly Y leu phe T moin dus tyr i D thr ser zlu 53 ConA800 asp met his ala Mid ConA400 ile Y val pro GNA400 1 45 cp 12 ais T 7 T moin met his 86 GNA 20 25 4 11 3 25 asp ConA400 ala leu amp tyr ser i Figure 50 T moin D pouillement graphique des deux premiers facteurs des AFC r alis es sur les donn es relatives aux acides amin s libres pro 4 dos s dans les miellats de pucerons om thr 3 Mts E A pucerons intoxiqu s sur milieux ConA Con2200 B pucerons sur milieux GNA ile C comparaison entre les pucerons Y intoxiqu s par la ConA et ceux intoxiqu s par la GNA Asn est soustraite ici de l analyse pour ne pas masquer l information Cys apport e par les autres acides amin s his gin GNA400 5 Les acides amin s contribuant la d finition des axes 6 12 sont repr sent
107. partie du tube digestif Il se compose d une partie tubulaire et dilat e que nous appelons estomac par analogie avec le terme employ par Ponsen 1972 1987 2 d un tube plus fin tr s long et repli en huit boucles Nous le d signons par le terme intestin La transition entre ces deux parties anatomiques est marqu e par une boucle Nous n observons pas de caeca gastriques s ouvrant au voisinage de la valvule oesophagienne Le m sent ron est entour par une tunica propria similaire celle de l oesophage Son pith lium est compos d une couche monocellulaire simplement s par e de l h molymphe pas une lame basale et la tunica propria figure 54 L estomac d A pisum pr sente de grandes analogies avec celui de M persicae d crit par Ponsen 1972 Trois sections diff rent par leurs caract ristiques morphologiques et histologiques la r gion ant rieure se compose de cellules quasi cubiques la r gion m diane ou interm diaire se caract rise par des cellules columnaires Elles s cr tent des mat riaux par constriction cellulaire de la surface apicale la r gion post rieure se compose de cellules cuboidales qui s cr tent des mat riaux par bourgeonnement de la membrane apicale figure 45C et figure 54 Ponsen observe que les deux processus de s cr tion se d roulent durant tout le stade larvaire et se poursuit pendant la vie adulte sans aucune d g n ration ou multiplication des cellules
108. pea aphid Acyrthosiphon pisum Entomol exp appl 1994 Vol 70 p 91 96 Griffiths D C et Pickett J A A potentiel application of aphid alarm pheromones Entomol exp appl 1980 Vol 27 p 199 201 Grison P Chronique historique de la zoologie agricole fran aise Millau Fr Ed INRA 1992 Vol 1 366 p Habermann E Bee and wasp venoms Science 1972 Vol 177 p 314 322 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 185 Habibi J Backus E A et Czapla T H Plant lectins affect survival of the potato leafhopper Homoptera Cicadellidae J Econ Entomo 1993 Vol 86 N 3 p 945 951 Hankins C N Kindinger J I et Shannon L M The lectins of Sophora japonica II purification properties and N terminal amino acid sequences of five lectins from bark Plant Physiol 1988 Vol 86 p 67 70 Harrewijn P Integrated control of potato aphids in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1989 Vol 2C p 279 284 Heie O E Palaeontology and phylogeny in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1987 Vol 2A p 367 392 Heie O E Why are there so few aphid species in the temperate areas of the southern hemisphere Eur J Entomol 1994 Vol 91 N 1 p 127 133 Herrbach E R le des s miochimiques dans les relations pucerons plantes I G n ralit
109. pour la transg n se visant la protection des plantes Apr s un bref historique sur les d couvertes se rapportant aux lectines et leur d finition g n rale nous pr sentons certaines des propri t s biologiques des lectines v g tales permettant de mieux comprendre les fonctions qui leur sont attribu es Nous terminons enfin cette pr sentation des lectines par une revue d taill e de tous les travaux se rapportant leurs propri t s insecticides et ou faisant r f rence leur potentiel d utilisation dans une strat gie de cr ation de plantes transg niques r sistantes des insectes principalement Col opt res et L pidopt res 3 1 Histoire de la d couverte des lectines D finition g n rale Il faut remonter aux ann es 1888 et 1889 pour que Stillmark d crive pour la premi re fois les propri t s d agglutination d une lectine A partir d extraits de graines de ricin Ricinus communis L cet auteur obtient une pr paration de prot ines partiellement purifi es qui agglutinent les globules rouges du sang D autres prot ines v g tales pr sentant les m mes caract ristiques sont d couvertes par la suite la crotine Croton tiglium L l abrine Abrus precatorius L et la robine Robinia pseudoacacia L En 1898 Elfstrand utilise le terme d haemagglutinine pour d signer ces mol cules La toxicit de l abrine et de la ricine attirent l attention de Paul Ehrlich le p re de l immunologie qui d montr
110. pr c dente Enfin les r sidus ne sont pas al atoires en effet l ajustement passe en dessus des derniers points exp rimentaux relev s apr s le 24 ou 25 me jour 10 5 10 15 20 25 30 Jour Le mod le est donc pas encore optimalement adapt aux donn es Il traduit mal le fait que les pucerons s arr tent de pondre quelques jours variables selon les modalit s avant de mourir Nous aurions vraisemblablement pu obtenir un meilleur ajustement soit en appliquant le m me mod le mais sur un intervalle de temps correspondant la dur e moyenne de ponte des pucerons p riode reproductive calcul e pour chaque modalit en effectuant une nouvelle analyse sur le m me intervalle de temps en utilisant une pond ration des points observ s Mais finalement nous avons gard le premier mod le la premi re solution n glige la p riode post reproductive qui est un param tre important pour d crire les effets toxiques et il n est pas certain que la deuxi me solution nous aurait fourni plus d informations que nous en apportait le premier ajustement Fiche N 15 Mesure de l ingestion l aide de milieu marqu inuline 14C Ap2 CO p D Q 20 000 cpm ul miellat x3 puceron puceron r cup ration par 2 x 250 ul H2O 200 ul solu ne 200 ul solu ne 500 ul H20 24 h dans pot 24 h dans pot de comptage de comptage neutraliser avec neutraliser avec 50 ul ac
111. pr sentent g n ralement pas d activit par ingestion leur pr sence dans des produits destin s l alimentation pose cependant des probl mes particuliers d acceptabilit par les consommateurs Nentwig 1993 Certains venins expriment galement des activit s hydrolytiques qui se sont av r es tr s toxiques chez certains insectes test s 3 mais leur probable phytotoxicit ne semble pas leur promettre un avenir dans le domaine qui nous int resse 2 3 3 Les g nes d origine v g tale utilisables en transg n se Ces derni res ann es quelques toxines v g tales ont t tudi es telles que les RIP Prot ines Inhibitrices de Ribosomes ou d autres inhibiteurs enzymatiques Gatehouse ef al 1990b Ferrari et al 1991 Barbieri et al 1993 Strittmatter et Wegener 1993 Mais les RIP sont des toxines trop g n rales pour envisager une large utilisation en transg n se Purcell et al 1994 montrent aussi que certaines enzymes du m tabolisme glucidique perturbent l alimentation des pucerons Une autre enzyme la lipoxyg nase de pois se r v le toxique pour un autre homopt re le delphacide du riz Nilaparvata lugens Stal Cette enzyme pourrait avoir pour cible des composantes membranaires de l pith lium intestinal Powell et al 1993 Mais les travaux sur les prot ines d origine v g tale restent encore limit s deux grandes classes de prot ines v g tales les inhibiteurs de prot ases et les lectines L
112. pucerons du deuxi me test est moins performant que celui du premier test Cette observation rejoint celle faite pr c demment concernant la variabilit des r sultats obtenus sur milieux artificiels Cette variabilit montre la n cessit de bien constituer ses lots de pucerons t moins randomnisation pour diminuer au maximum ce que l on pourrait appeler l effet puceron influence maternelle sur les performances des pucerons bien connue des aphidologistes Elle impliquera ici que nous n analyserons pas globalement mais parall lement les r sultats des deux tests Seules les masses des adultes du deuxi me test sont relev es au jour J15 correspondant approximativement la moiti de la p riode reproductive du lot t moin La croissance des adultes s av re beaucoup plus importante sur les milieux lectines 104 et 107 pour les deux concentrations de ConA 6 6 pour les pucerons sur milieux t moins Ces r sultats sugg rent que l inhibition de croissance observ e la fin du stade larvaire est compens e au cours de la vie adulte La comparaison des masses J15 conduirait m me conclure que les pucerons sur milieux lectines sont capables de rattraper compl tement leur retard de croissance pas de diff rence significative J15 entre les masses moyennes des pucerons sur milieux lectines et celles des pucerons sur milieux t moins p gt 0 05 Mais ces r sultats sont analyser avec prudence la comparaiso
113. que les lign es transform es 41 Le pourcentage d ail s est de l ordre de 1 10 96 suivant les esp ces Nous ne les avons pas inclus dans le calcul des inhibitions de croissance car ils sont g n ralement plus petits que les apt res de m me ge N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 53 Le travail de transformation de la pomme de terre a t r alis sur la vari t D sir e La technique de transformation transfert indirect via Agrobacterium les constructions de plasmides et les conditions de r g n ration des explants ne sont pas d taill es dans le cadre de cette these Ces informations sont donn es en partie par Gatehouse ef al 1995a Les trois g nes utilis s pour ce travail de transformation codent pour la GNA la chitinase du haricot BCH Broglie et Broglie 1993 et l inhibiteur alpha amylase du bl WAI Kashlan et Richardson 1981 Quatre constructions ont t r alis es deux constructions simples la premi re avec le g ne de la GNA la seconde avec le g ne de WAI appel es respectivement GNA2 et WAIO deux doubles constructions l une avec les g nes de la GNA et de WAI PWG6 l autre avec les g nes de la GNA et de la BCH PBG6 Le g ne de la B glucuronidase GUS a t choisi comme g ne rapporteur Il a permis de s lectionner les plants transform s exprimant les ARN messagers des g nes introduits Gatehouse ef al 1995a L tape suiv
114. r partition spatiale mosaique multilignes de lign es exprimant des g nes diff rents rotation de lign es exprimant des g nes diff rents maintien de plantes refuges plantes n exprimant pas de g ne entomotoxique permettant le maintien de populations d insectes sensibles Tableau 2 Tactiques d utilisation in planta de g nes gouvernant la synth se de prot ines entomotoxiques d apr s McGaughey et Whalon 1992 Il existe cependant une controverse quant aux tactiques optimales adopter Mallet amp Porter 1992 estiment que la meilleure approche est l utilisation conjointe de l expression tissu sp cifique des mol cules entomotoxiques du m lange de lign es transg niques et de plantes refuges et la combinaison de plusieurs g nes codant pour des prot ines aux modes d action diff rents Une utilisation conjointe de B thuringiensis et d un inhibiteur de prot ase est d j rapport e par MacIntosh et ses collaborateurs 1990 Ces auteurs montrent que l adjonction d un inhibiteur de prot ase une serpine dose subl tale dans une solution de toxines de B thuringiensis elle seule induisant peu de mortalit augmente le pouvoir pathog ne de la toxine Si le m canisme de ce ph nom ne n est pas encore lucid il a n anmoins pu tre reproduit in planta Cet exemple souligne l int r t des recherches sur les autres prot ines susceptibles d tre utilis es dans une strat gie de cr ation de plantes tr
115. s des techniques de transformation g n tique d pend encore de l esp ce v g tale consid r e La technique utilisant les bact ries Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes pour le transfert indirect d ADN dans les cellules v g tales est essentiellement limit e aux dicotyl dones L lectroporation qui permet de transformer les monocotyl dones dont les c r ales grande importance conomique comme le riz et le bl n cessite de maitriser la r g n ration de plantes partir de protoplastes 5 difficile mettre en oeuvre chez de nombreuses esp ces v g tales La biolistique permet cependant de contourner ce probl me dans certains cas comme pour le riz ou le mais Cao et al 1990 la transg n se v g tale se base sur la recombinaison ill gitime de g nes trangers transg nes introduits artificiellement De ce fait chaque transformant exprime le transg ne un niveau extr mement variable selon le site o il a t ins r dans le g nome nucl aire Deblock 1993 Une technique telle que la recombinaison homologue permettrait de 14 L lectroporation consiste soumettre un m lange de protoplastes et d ADN un courant lectrique faible et puls pour fragiliser la membrane du protoplaste et induire la formation de pores par lesquels les mol cules d ADN peuvent p n trer 15 Cellule v g tale ou microbienne non sexuelle d barrass e de sa paroi 16 Projection grande vit
116. s en caract res gras et entour s 3 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 161 3 3 Informations compl mentaires sur le mode d action de la Con A Quatre derniers r sultats ou interpr tations nous apportent des informations qui nous semblent importantes pour la compr hension du mode d action cellulaire de la Concanavaline A ainsi que sur la diff renciation de ces modes d action au sein des lectines mannose 3 3 1 Stimulation de croissance induite par la GNA et la NPA Comparaison avec la Con A Nous avons d j soulign figure 13 que les lectines mannose strict GNA NPA et ASA induisent des stimulations de la croissance du puceron du p cher M persicae la concentration de 10 ug ml La Concanavaline A lectine glucose mannose est au contraire toxique d s la concentration de 15 ug ml figure 13 Sur la figure 10 la toxicit de la GNA 3 vis vis d A pisum se manifeste faible dose L exp rience d ingestion de tr s faibles concentrations de GNA et de ConA a donc t reconduite avec A pisum pour tester sp cifiquemant cet effet probiotique d j signal 120 s 100 E L 5 80 t en x 60 fm 2 S 2 40 E 2 4 20 0 0 25 5 10 50 100 200 Concentration en lectine ug ml 1 chelle Log Figure 51 Comparaison des effets de la ConA et de la GNA faibles concentrations sur la croisance d
117. s et ph romones d alarme Agronomie 1985a Vol 5 N 3 p 283 286 Herrbach E R le des s miochimiques dans les relations pucerons plantes II Les substances all lochimiques Agronomie 1985b Vol 5 N 4 p 375 384 Herrbach E Alarm pheromones and allelochemics as a means of aphid control Neth J Plant Path 1992 Vol 98 p 63 71 Higgins T J V Chandler P M Zurawski G Button S C et Spencer D The biosynthesis and primary structure of pea seed lectin J Biol Chem 1983 Vol 258 p 9544 9549 Hilder V A et Gatehouse A M R Phenotypic cost of an extra gene Transgenic Res 1991 Vol 1 p 54 60 Hilder V A Gatehouse A M R et Boulter D Potential for exploiting plant genes to genetically engineer insect resistance exemplified by the Cowpea Trypsin Inhibitor gene Pestic Sci 1989 Vol 27 p 165 171 Hilder V A Gatehouse A M R et Boulter D Transgenic plants conferring insect tolerance protease inhibitor approach Transgenic plants 1993 Vol 1 p 317 338 Hilder V A Gatehouse A M R Sheerman S E Barker R F et Boulter D A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco Nature 1987 Vol 300 p 160 163 Hilder V A Powell K S Gatehouse A M R Gatehouse J A Gatehouse L N Shi Y Hamilton W D Merryweather A Newell C A Timans J C Peumans W J Vandamme E J M et Boulter D Expression of snowdrop lectin in transgenic tobacco plants results in ad
118. s sont des exemples typiques d all lochimiques nutritifs Rahb et al 1992 Des tudes r centes montrent aussi qu un mauvais quilibre nutritif peut ralentir la croissance des pucerons Febvay et al 1988a Febvay et al 1988b Girousse et al 1991 Girousse et Bournoville 1994 Il parait cependant illusoire de chercher cr er une plante dont l antibiose serait uniquement obtenue par des carences quelconques ou un d s quilibre en acides amin s Comeau 1992 b Evaluation d un projet de cr ation de cultivars r sistant aux pucerons Prise en compte du probl me de transmission de virus L laboration d un projet relatif la production de cultivars r sistant aux pucerons peut tre r sum e uc et uc Ecologie Epid miologie Lutte int gr e Compromis conomiques et sociaux Dm Su Fau rand rand auxiliaires Dm x Cultivars r sistants Evaluation de l efficacit et de gt penc conomique co ts la dur e des r sistances penc Lutte Lutte phytog n tique biologique M thodes culturales Figure 6 Int gration globale et valuation d un projet de cr ation de cultivars r sistants aux pucerons et aux virus qui leur sont associ s d apr s Comeau 1992 Chapitre 1 Contexte de l tude 26 Si le probl me de transmission virale par ces insectes a t parfois n glig par les s lectionneurs dans le pass aujourd hui les programmes de
119. sch matiques de la figure 47 donnent un apercu global et tr s synth tique des r sultats obtenus La figure 47A repr sente le tableau des donn es brutes correspondant 20 acides amin s dos s dans les broyats de pucerons entiers extraits des modalit s ConA et GNA rapport es aux doses estim es dans les broyats de pucerons normaux Les quantit s totales d acides amin s sont galement compar es au t moin derni re ligne Les cercles gris indiquent une valeur sup rieure celle mesur e chez le t moin et inversement les carr s blancs indiquent une valeur inf rieure La taille des cercles ou des carr s est proportionnelle la diff rence lectine t moin chelle donn e La figure 47B est construite selon le m me principe Les donn es compar es au t moin correspondent dans ce cas pour chaque modalit aux moyennes des concentrations 3 5 r p titions rapport es la quantit totale profils en 96 Les donn es brutes correspondant aux dosages des acides amin s libres des miellats sont galement transform es en donn es relatives par rapport la quantit totale profils en 96 pour obtenir la figure 49 Une analyse univari e permet de pr ciser les diff rences observ es entre les modalit s pour chaque acide amin Mais la figure 48 est suffisamment explicite pour justifier que nous donnions les r sultats d taill s de cette analyse en annexes 12A C et que nous nous int ressions qu aux acides amin
120. seed lectins and isolectins FEBS Lett 1984 Vol 176 p 120 124 Delannay X Lavallee B J Proksch R K Fuchs R L Sims S R Greenplate J T Marrone P G Dodson R B Augustine J J Layton J G et Fischhoff D A Field performance of transgenic tomato plants expressing the Bacillus thuringiensis var kurstaki insect control protein Biotechnology 1989 Vol 7 N 12 p 1265 1269 Delbaere L T J Vandonselaar M Prasad L Quail J W Wilson K S et Dauter Z Structure of the Lectin IV of Griffonia simplicifolia and its complex with the Lewis b Human blood group determinant at 2 0 A resolution J Mol Biol 1993 Vol 230 p 930 965 Derewenda J Yariv J Helliwell J R Kalb A J Dodson E J Papiz M Z Wan T et Campbell J The stucture of the saccharide binding site of Concanavalin A EMBO J 1989 Vol 8 p 2189 2193 Devonshire A L Resistance of aphids to insecticides in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1989 Vol 2C p 123 140 Diaz L C Melchers L S Hooykaas P J J Lugtenberg B J J et Kijne J W Root lectin as a determinant of host plant specificity in the Rhizobium legume symbiosis Nature 1989 Vol 338 p 579 581 Dixon A F G The way of life of aphids host specificity speciation and distribution in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevi
121. shydrater 2 x 10 min dans de l alcool 95 96 2x 15 min dans de l alcool 100 96 alcool butylique autant de temps que les pi ces sont rest es dans le fixateur Seconde inclusion dans la paraffine afin d liminer progressivement l alcool butylique passer les pi ces dans trois bains de paraffine l inclusion se fait entre deux barres de Lenckart Obtention des coupes Le bloc de paraffine obtenu est taill de fa on ce qu il reste le minimum de paraffine autour des pi ces Les coupes sont r alis es l aide d un microtome Historange LKB L paisseur choisie est de 6 um Le ruban obtenu est d coup et d pos sur une lame pr alablement enduite d albumine glyc rin e Une goutte d eau distill e est d pos e afin que les morceaux de paraffine adh rent la lame La lame est d pos e sur une platine chauffante la paraffine s tend Le surplus d eau est limin et la lame est mise s cher une nuit dans une tuve 37 C Coloration 1 D paraffinage passage durant quelques secondes dans Tolu ne 2 x Alcool 100 2 x Alcool 95 96 eau 2 bleu Toluidine 1 o pH 4 8 quand le pH est acide on augmente la s lectivit de la coloration au BT bleu s chage au alcool eau NA eau x distill e toluidine distill e papier butylique III tolu ne montage 5 min 0 C filtre 3 bains d
122. sod 1u2u spunqqerasmas pucxdIsainxs su x ol o E yu semppour ssp serre sop supp wasusanhwn samon maipu sp xnruv xnsp ss gms uugeaojous sp stacey sap aem 7 gms zung v Sp 107072 30802 gurges susum zpir 7 4 y mep pliers ui ad iat 7 NND V0 OOF VNOVOOFV ESD AOTY UcDyumu gr N N MOP V NENOCV NEWS WM ot V90 00 V Toyo rV Ue Xo CV Uc UI seya pupuu xm auku se s2uuzAcni op scm m uxo op onbinsunenal aod pe T vs Lg Ir FTL F6 1 ect pzu WVW VND Vue uus om uou gon CO SE n ne ven 35 apqeqoad Se NE sane SaQUUOG JEN TVV Abr viations utilis es dans les figures 44 45 ct 54 Ponacn 1973 amp 1987 Annexe 13 ABBREVIATIONS USED IN FIGURES ng AL an aad ii boc ha ra eu v eb non ei eme en epe FI ead at le f fie lig AL eh oe abdominal ganglion ascending intestine nn ominzl looz anal opening afferent anlivary duel aconsory salivary gland bascphilze mescaermai ceil tdlacdaack corpus ailatum canca body Cornua euarciarum compound eve ely peu oly peg arum eneniele spbuneult eireuroesoplkagral connective ervabal common salivary duct cuticle duntocerebrinn dereiai gland cell descending intestine dorsal lale docu vessel Zimekzell eosinophilic body 5 pi phnrmenjpen gikttabory organ epidermal invagination embrranic mesodermal cell epiderznia eaidermai cell Specs bL efferent salivary ducs eye tu kerele i t ic
123. t moin J7 100 90 100 51 39 Survie Dv dur e de vie moyenne j 20 5 1 0 22 1 1 2 19 3 0 8 a 26 5 0 7 b 29 1 0 4 c mortalit des adultes a J20 45 96 22 96 45 96 0 96 0 96 Effets Croissance d dur e de la p riode pr reproductive 10 6 02 a 11 3 0 2 b 10 7 0 3 a 14 1 0 c 14 8 0 3 c sur masse moyenne J15 1359 101 ab 1487 67 b 1154 34 a les masse rapport e au t moin J15 100 109 85 adultes diff rence de masse de J7 J15 6 6 104 96 107 96 F condit Dr dur e de la p riode reproductive 9 4 0 5 9 9 0 5 9 2 04 a 9 5 069 a 11 5 0 6 b Lv nombre de larves pondues puceron 27 8 1 3 a 24 5 0 8 b 20 6 2 2 19 6 1 4 20 8 0 8 Lv Dv 2 14 0 13 a 1 71 0 15 b 1 69 0 18 a Em 0 07 0 95 0 04 b Lv Dr 2 99 0 11 a 2 51 0 13 b 2 19 0 16 2 05 0 06 a 1 83 0 05 b Md larves pondues en une dur e gale d 24 8 1 3 24 1 0 9 3o 2 0 20 0 1 4 20 5 0 7 DT dur e pour doubler la taille de la 2 61 2 86 3 27 4 10 4 33 population Taux intrins que d accroissement naturel rm SDjack Birch 1948 selon Wyatt amp White 1977 0 244 0 003 a 0 224 0 005 a 0 224 0 008 b 0 208 0 006 b 0 212 0 008 a 0 206 0 010 a 0 169 0 005 b 0 156 0 006 b 0 160 0 004 b 0 151 0 004 b Tableau 8 Effets de doses subl
124. t moin k 0 O ConA 400 7b y O fixation totale Bii 2596 ye ge ene ke seems ease nests oO 0 B 0 8 16 24 32 al fi Heures Figure 28 Comportement de larves de l esp ce A pisum mises en condition de choix entre deux milieux de compositions diff rentes A milieu Ap2 vs milieu Ap2 B milieu Ap2 vs milieu Ap2 400 ug ml 1 d acide chlorog nique C milieu Ap2 vs milieu Ap2 400 ug ml 1 de Concanavaline A N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons ConA 400 ug ml _ Intoxication 15h 100 75 fixation 50 t moin Or t moin bis 7 fixation totale 0 ConA 400 ug ml 1 Intoxication 15h 100 t moin ConA 400 25 fixation totale 0 103 standard Ap2 standard Ap2 100 75 et OOo Q 50 standard Ap2 Heures ConA 400 ug ml 1 Figure 29 Comportement de larves de l esp ce A pisum intoxiqu es par de la Concanavaline A 400 ug ml 1 puis mises en condition de choix entre deux milieux de compositions diff rentes A milieu Ap2 vs milieu Ap2 B milieu Ap2 vs milieu Ap2 400 ug ml 1 de Concanavaline A 25 0 100 75 50 0 Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 104 soit ils ne font pas cette association et continuent de s alimenter jusqu au moment
125. tat de travaux visant d montrer le r le des lectines dans ce processus de reconnaissance bact rie plante Kaminski 1987 Diaz et al 1989 4 de nombreuses autres fonctions des lectines autres que celles de la reconnaissance de bact ries ou de microorganismes que nous venons d voquer sont avanc es fonction dans l longation des parois cellulaires fonction de co facteurs enzymatiques agissant avec des enzymes glycoprot iques intervention dans le transport des glucides et dans leur mise en r serve dans les graines contr le de la division cellulaire mitog nicit et de la germination intervention dans les processus de reconnaissance de cellule cellule Etzler 1986 Kaminski et al 1987 La litt rature tr s abondante r v le l int r t de nombreuses d quipes de recherche pour confirmer ou infirmer ces hypoth ses Etzler 1986 remarque cependant juste titre que la sp cificit osidique des lectines n est probablement qu une des propri t s fonctionnelles de ces mol cules En plus de leurs sites de fixation aux sucres certaines lectines poss dent en effet des sites leur permettant de se lier avec d autres types de ligands La Concanavaline A par exemple poss de un site de liaison sp cifique au myo inositol Wassef et al 1985 Ainsi d autres fonctions encore inexplor es pourraient tre li es la pr sence de ces autres sites non sucre sp cifiques Nous avons d crit la situation chez les pl
126. test e Afin de faciliter la comparaison entre ces esp ces de tailles tr s diff rentes les masses moyennes sont exprim es en pourcentage par rapport celles des pucerons t moins Les masses et respectivement les mortalit s des pucerons t moins au jour J7 sont 1 540 mg pour A pisum 5 de mortalit 2 200 mg pour M albifrons 4 de mortalit 0 235 mg pour M persicae 2 de mortalit 0 127 mg pour A gossypii 10 de mortalit 0 239 mg pour M euphorbiae 10 de mortalit 0 343 mg pour A solani 4 de mortalit Les CL20 et les CL50 sont valu es pour ces six esp ces La ConA s av re l tale faibles concentrations pour A pisum et M albifrons leurs CL50 sont respectivement de l ordre de 310 ug ml intervalle de confiance 230 390 et 330 ug ml intervalle de confiance 280 380 Pour M persicae M euphorbiae et A solani les valeurs des CL50 exc dent 1500 ug ml leurs taux de mortalit respectifs cette concentration sont 15 25 et 0 96 alors que la CL50 pour A gossypii est valu e 1200 ug ml 65 96 de mortalit la concentration de 1500 ug ml Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 62 E z Masse moyenne rapport e au t moin O Acyrthosiphon pisum Aphis gossypii Macrosiphum albifrons Macrosiphum euphorbiae 7774 Myzus persicae O Aulacorthum solani 125 100 75 50 25 0 1 10 100 1000 C
127. their status compared to Bacillus thuringiensis as microbial insecticides Outl Agric 1988 Vol 17 p 10 17 Czapla T H et Lang B A Effect of plant lectins on the larval development of European Corn Borer Lepidoptera Pyralidae and Southern Corn Rootworm Coleoptera Chrysomelidae J econ Entomol 1990 Vol 83 p 2480 2485 Dajoz R Dynamique des populations Paris Ed Masson et Cie 1974 301 p Dale P J The release of transgenic plants into agriculture review J Agr Sci 1993 Vol 120 p 1 5 Dale P J Irwin J A et Scheffler J A The experimental and commercial release of transgenic crop plants Plant Breed 1993 Vol 111 N 1 p 1 22 Dawson G W Hallahan D L Mudd A Patel M M Pickett J A Wadhams L J et Wallsgrove R M Secondary plant metabolites as targets for genetic modification of crops for pest resistance Pest Sc 1989 Vol 27 p 191 201 DDE Caen Caen l levage des coccinelles 10 ans Direction des Espaces Verts 1984 Deblock M The cell biology of plant transformation current state problems prospects and the implications for the plant breeding Euphytica 1993 Vol 71 N 1 2 p 1 14 Debray H Decout D Strecker G Spik G et Montreuil J Specificity of twelve lectins towards oligosaccharides and glycopetides related N glycosylproteins Eur J Biochem 1981 Vol 117 p 41 55 Debray H et Roug P The fine sugar specificity of the Lathyrus ochrus
128. tiques sont vivipares elles donnent directement naissance de jeunes larves capables de s alimenter et de se d placer aussit t produites Dans nos r gions temp r es les pucerons pr sentent en g n ral un cycle annuel complet holocycle qui comprend la g n ration amphisexuelle Printemps S Fondatrig nes Fondatrice Fondatrig nes ail es _ Virginipares m apt res d 9 i apt re apt re Sexupares Virginipares P di gt ail es Virginipares Oeuf d hiver Plante h te primaire Figure 1 Repr sentation sch matique du cycle de vie des pucerons en r gions temp r es En r alit dans une r gion donn e l adaptation des pucerons aux conditions particuli res du milieu peut se traduire par de nombreuses variantes au niveau des phases du cycle changement de plante h te appartenant une m me esp ce ou non perte de la possibilit de se reproduire par voie sexu e pour revue Dedryver 1982 La repr sentation ci dessus est donc effectivement tr s sch matique et ne traduit que partiellement la complexit des cycles chez les pucerons Au cours de ce cycle les morphes apparaissent successivement parmi lesquels les virginipares qui ont fait l objet de notre tude Celles ci sont les formes femelles reproduction parth nog n tique qui sont l tat adulte soit ail es soit apt res Ces derni res ont un r le essentiellement reproductif alors que les ail es assurent d abor
129. totales 2 Blue sensitive X Ray film Fiche N 6 Dosage des prot ines par la m thode de Bradford 1976 Principe e colorant utilis le bleu de Coomassie se fixe aux prot ines par liaisons lectrostatiques en milieu hydroalcoolique acide L interaction colorant prot ine provoque une modification des maxima d absorption du bleu de Coomassie 465 nm rouge 595 nm bleu d pendante de l affinit de la prot ine pour le colorant affinit assez fortement li e la taille de la prot ine les prot ines de masses mol culaires inf rieures 20 kDa ont une faible affinit pour le bleu de Coomassie Pr paration du colorant le bleu de Coomassie Brillant Blue G 250 Sigma est dissous raison de 100 mg pour 50 ml d alcool thylique 95 Ajouter 100 ml d acide ortho phosphorique RP 85 Merck et compl ter le volume 1 litre avec de l eau distill e Apr s une nuit de repos 4 C le r actif est filtr sur papier puis conserv l obscurit 4 C Mode op ratoire la prot ine utilis e pour tablir les gammes talons est la s rum albumine bovine BSA exempte d acides gras fraction V Sigma La gamme talon est r alis e avec des quantit s de BSA allant de 2 20 ug Cette gamme est refaite pour chaque solution de Bradford pr par e 50 ul de soude 1M sont ajout s 20 ul de l chantillon prot ique 1 ml de bleu de Coomassie est ensuite ajout au tube incub pendant 5 mi
130. tube digestif Les dosages ELISA pr c dents montrent que des pucerons adultes intoxiqu s sont capables d ing rer de grandes quantit s de lectine 1 ug en 48 h Si celle ci n est pas dissoci e d grad e et ou excr t e elle se fixe donc dans le tube digestif Une tude histologique minutieuse nous a permis de d crire l anatomie de cet organe Cette tape descriptive nous a sembl essentielle pour comprendre le site et le mode d action de la ConA 3 1 4 Anatomie du tube digestif d une larve d A pisum au dernier stade larvaire L4 Le tube digestif des insectes comprend trois parties anatomiquement et histologiquement bien diff renci es le stomodeum ou intestin ant rieur le m sent ron ou intestin moyen le proctodeum ou intestin post rieur Le stomodeum et le proctodeum qui sont des d riv s ectodermiques pr sentent un rev tement cuticulaire comportant donc de la chitine Le m sent ron peut tre consid r au moins dans certains cas comme une formation endodermique Raccaud Schoeller 1980 L organisation g n rale du tube digestif d A pisum parait relativement simple compar e celle d autres insectes voire d autres Homopt res Grass 1951 Nous avons reconstitu celle ci par superposition de coupes s ri es d une larve de stade 4 figure 43 Les circonvolutions boucles du tube digestif le diam tre de ses diff rentes parties et leurs superpositions dans des plans diff rents r
131. ug ml de ConA Elles sont fix es dans une solution de Bouin alcoolique pendant 24 h avant d tre incluses dans de la paraffine et coup es 5 um d paisseur tapes 1 et 2 de la fiche protocole N 20 Les coupes sont alors mont es sur des lames recouvertes de poly L lysine agissant comme colle Elles sont d paraffin es et hydrat es par des bains successifs de xyl ne thanol et eau L immunomarquage est r alis gr ce au kit Vectastain Elite ABC Vector Laboratories Inc USA Les coupes sont d abord incub es dans du m thanol contenant 2 d H5O afin d liminer les peroxidases endog nes Elles sont ensuite rinc es dans du tampon TBS Puis elles sont incub es dans la solution TBS contenant 2 de s rum normal de ch vre TBS SNC afin de masquer les ventuels sites non sp cifiques Elles sont mises en pr sence de l anticorps anti ConA7 dilu 1 ug ml dans du TBS SNC ou pour les t moins de 75la ConA et la FITC fluorescein isothiocyanate sont complex es a raison de 1 mole de ConA pour 3 6 moles de FITC R f Sigma C 7642 76 Tampon phosphate salin r f SIGMA p 4417 voir fiche protocole N 9A 77 Anticorps de lapin fraction IgG primaires anti ConA r f SIGMA C 7401 voir fiche protocole n 9A N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 127 sp cificit not s pour non sp cifiques NS en pr sence de s rum de lapin pr immun dilu au 1 1000 me dans l
132. un premier temps que nous pouvons extrapoler ces r sultats aux conditions in planta Deux autres questions d coulent alors de la pr c dente les plantes sont elles capables d exprimer des taux lev s de prot ines dans leur s ve pho mienne autrement dit est il r aliste de vouloir faire s exprimer une lectine un taux de 100 200 ug ml dans la s ve d une plante Chapitre 5 Conclusions amp Perspectives 176 2 les biologistes mol culaires sont ils capables de diriger l expression d un g ne de lectine dans la s ve phlo mienne un taux de cet ordre Du fait de la difficult d analyse du compartiment cibl et des donn es fragmentaires qui sont disponibles sur sa composition la r ponse la premi re question n est pas aussi simple qu on pourrait le penser La s ve phlo mienne d un v g tal est g n ralement relativement pauvre en prot ines au regard de ses autres composants tels que les acides amin s ou les glucides Leur concentration mesur e dans des exsudats de types divers varie de 0 2 2 mg ml pour les esp ces v g tales standard qui ont t tudi es Fife et al 1962 Hall et Baker 1972 Tammes et Van Die 1964 Ziegler 1975 cit s par Fisher et al 1992 N anmoins chez certaines familles comme les Cucurbitac es ce taux peut tre cinquante fois plus lev 40 100 mg ml Eschrich et Heyser 1975 Allen 1979 Cronshaw et Sabnis 1989 bien que toutes ces prot ine
133. unit s Poids mol c Polym re Polypeptide ET L3 II 12 5 Nbre de sites de liaison aux sucres par S unit 2 R f rences 1 Kaku et al 1992 2 Van Damme et al 1992 anavalia ensiformis L Dt Fabac es 3 Goldstein et Poretz 1986 4 Wang et al 1971 Zicer arietinum L Fabac es Nom commun francais anglais Ail garlic Canavalia jack bean Pois chiche chick pea Perce neige snowdrop Lentille salanthus nivalis L Amaryllidac es wens culinaris Medick Fabac es 3 p70 6 Foriers et al 1981 Pois commun garden pea 3 p75 8 Higgins et al 1983 9 Pusztai 1991 3 p80 Hopp et al 1982 et Horstman et al 1978 cit s par 3 Amaryllidac es isum sativum L Fabac es icia faba L Fabac es 7icia villosa Roth Fabac es sriffonia simplicifolia Wek Caesalpiniac es 10 EY Laboratories P O Box 1787 San Mateo CA 94401 3 p91 11 Iyer et al 1976 Bl commun wheat germ Triticum vulgare Vill 3 p103 12 Allen et al 1973 13 Wright 1984 14 Raikhel et al 1993 Ortie dioique stinging nettle Amaranthe peanut Poac es Jlex europaeus L Fabac es Jrtica dioica L Urticac es Amaranthus caudatus L Amaranthac es Fabac es 16 Peumans et al 1984 17 Vector Laboratories Inc 30 Ingold Road Burlingame CA 94010 rtocarpus integrifolia Lam Morac es Bryone dioique white bry
134. uoydioyriCoy npe un p jmsearp aqm np sesjessue uonaes aun zjyuasjidor 4 ami tl 2 unsaur ap erred ouiginop ep ap 12 q unsaiut 2p nmd argruraxd ej ap D meunsod tueuse ap g arrpgurreiur MWASI ap Vi jmeugiut IVUMSI J OP neaAiu ne 20215404 snz amp jy AP PATEL eur p JUSOATP QTI np ALLASI uoroes Cf SNL Ny E rare P IE m s WD AM Y Y ATOS A 9 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 139 digestif Nous retiendrons en particulier que la section ant rieure est form e d une simple couche de cellules squameuses qui font saillie dans la lumi re et qui s cr tent des gouttelettes cireuses figure 45F Le rectum est lui m me divis en une r gion ant rieure constitu e d une monocouche cellulaire relativement fine et d une r gion post rieure form e par invagination de l piderme figure 44B vue sagittale D une mani re plus g n rale nous constatons que le m sent ron ne poss de pas de glande mucus comme chez les vert br s pour la lubrification des particules alimentaires Mais cette observation s applique tous les insectes Raccaud Schoeller 1980 Nous n observons pas non plus de membrane p ritrophique 7 un manchon mince et transparent s parant le contenu du tube digestif de l pith lium et emballant la nourriture pendant son passage le long du m sent ron Cette formation s observe chez de nombreux insectes comme les Dipt res Enf
135. ventuels effets additifs ou synergiques de la GNA et de la chitinase du haricot A solani est particuli rement affect sur la lign e PBG6 47 exprimant ces deux prot ines Nous ne disposons pas d informations suffisantes r sultats de tests de toxicit avec BCH et BCH GNA par exemple pour argumenter de tels effets mais il est certain que les chitinases exprim es dans ces pommes de terre pour leur pouvoir antifongique poss dent aussi une toxicit aphidienne comme cela a t mesur au laboratoire sur A pisum Rahb et Febvay 1993 Les r sultats prometteurs enregistr s une premi re fois avec la lign e PWG6 85 n ont pas t confirm s dans le second test avec A solani Les lign es transform es r cemment cr es constructions simples avec le g ne de la GNA se sont av r es d cevantes Plusieurs facteurs peuvent expliquer ces r sultats Une variabilit li e aux insectes n est pas exclue Nous avons ainsi constat l apparition de nombreux ail s dans la population dont sont issus les pucerons utilis s en janvier 1995 Il est possible que parmi ces pucerons certains soient des sexupares Les dosages de la GNA dans les extraits de feuilles nous laissent cependant supposer que cette variabilit est surtout li e aux plantes elles m mes Les lign es test es en janvier 1995 expriment faiblement la GNA moins de 1 des prot ines totales solubles vs 1 2 pour les lign es test es en juillet 1993 malheureusement
136. videmment esp r mais nullement acquis a priori car les constructions utilis es pour la transformation et notamment le promoteur CaMV 35S ne sont pas optimis s pour une expression phlo me sp cifique La concentration en GNA dans la s ve phlo mienne des plantes transg niques compte tenu de toutes nos hypoth ses serait cependant au maximum de l ordre de 5 ug ml et semblerait variable selon les lign es Par manque de temps nous n avons pas pu recommencer ce dosage sur des broyats de vingt tubes digestifs par exemple ce qui nous aurait permis de doser la GNA avec une plus grande pr cision puisque nous serions alors dans la gamme de sensibilit de la m thode ELISA utilis e 3 2 2 Performances biologiques de M persicae sur des pommes de terre transg niques exprimant la GNA seule ou en combinaison avec la BCH juillet 1993 Des tests long terme similaires dans le principe ceux d crits pr c demment sur milieux artificiels ont t men s avec M persicae sur les deux lign es PWG6 85 et PBG6 47 La premi re exprime la GNA seule alors que la seconde exprime galement la BCH Les param tres d crivant la dynamique de f condit des pucerons sur des plantes de ces lign es sont compar s ceux de pucerons plac s sur la vari t D sir e A J6 pour chaque lign e transg nique trente jeunes adultes sont plac s individuellement dans des cages 3x10 plantes De m me quarante pucerons sont isol s sur
137. virus sont transmis d une plante une autre par la salive des pucerons Apr s ingestion ils traversent la paroi intestinale se dispersent dans l h molymphe et envahissent les glandes salivaires d o 1ls pourront tre inject s avec la salive dans les tissus d une autre plante Ce cycle impose donc une absorption des particules virales par les cellules pith liales mettant en jeu une interaction virus r cepteur dans les cellules animales les r cepteurs viraux caract ris s sont principalement de nature glycoprot ique et interagissent avec des h magglutinines virales L interaction lectine r cepteur et virus r cepteur pr senterait donc une grande analogie La possibilit d une interaction comp titive entre certaines lectines et les virus circulants n est pas exclue et cette possibilit pourrait tre exploit e en marge des propri t s directement toxiques des lectines Enfin se pose aussi le probl me du risque d apparition d une r sistance l intoxication La ConA semble se lier un tr s grand nombre de r cepteurs de la surface des cellules m sent riques Cette observation sugg re que nous nous trouvons vraisemblablement dans un cas d interaction peu sp cifique toxine famille de r cepteurs ou tout au moins r cepteurs pr sents en forte densit plut t que dans un cas d interaction stricte toxine r cepteur unique De plus la lectine agit en acc l rant le processus naturel de remplacement de
138. ws sopa sa zed snonw op 237eu2 p vua opus no 2nboAcuad ji vm SITANLONT sap mondrosqe WeIyIPOM na saprnsam SAMIR sap wmd ej ms rone ANNE n anaa sump 2itorxi ap suamrumaA 94 sathydxa emod uogsazitp np v SQUERISAL 2722 Ip zitpiqguraA e apeunsajur ogse3 USARP ep E saqggsrs24 Juou2ATIE 24 2urgui s2 2 IUOS SIUIL SII GRAL U ES Sakos Sop osscay ud zutipuoq ep op asepndzdourue IWMI EL 12 2urje pe asvizudsogd ej osecas ep INS DPN ACTE IITs I np aonr2duoo e 2p suoneueA 29 v ursa 2p a nedepe asuodar ej ap uoniqnqui mi vr Sao PT Sis Ten 12 AMT sop sameqmau sap 2SUALV H PN EI ap arma ui HOTT m1 y UD FHd efos Iun ENGL 70 22 HUERUY asguppurgiua IP our ui uonuqui yuo u 2 eRLAL VON ses ap ziXoom Tou 1 2p 2nbiurse d ouesquiow e 12424 g 2dzssed y yuo osnoaubuui e 2p SANI sop uoneijojx2 sowosossydospzipyp 12 2 e2rde 2 on2e4 zp uoreunog sasou sp 98903 UD aINDIO t 2p Ud SHISOTTIN sap uamrassmnooov 86I P i2 ary aajne ameqngpao aired TROL WONG 12 UUZUINTT opurszjur arum 2un sum uornalur sde uod ma VOM yoo Annexe 4 Tableau brut des donn es sur lequel l ACP de la figure 9 a t r alis e lignes les 27 lectines test es ACA titre indicatif colonnes les 12 variables permettant de d crire les effets de ces lectines mortalit s aux jours 1 3 ou 7 dl d3 d71 pour les concentrations a b ou c respectivement 10 ig ml 50 ug ml t 250 pa ml inhibiti
139. 10 h apr s l introduction des insectes 2h p 13 4h p 21 6h p 31 8h p 6496 12h p 2 3 96 Nous constatons galement que m me au dernier relev 48 h 20 environ des larves sont fix es sur les milieux ConA et dix autres pour cent ne sont fix es sur ni l un ni l autre des milieux Sur ces deux points cette situation diff re compl tement de celle observ e avec l acide chlorog nique Ces r sultats nous am nent supposer que malgr la tendance choisir les milieux qui en sont d pourvus la ConA n est pas phagor pulsive pour les pucerons Apr s un certain laps de temps il semble vident que les pucerons soient perturb s mais deux cas de figures peuvent alors se pr senter soit les pucerons r alisent que ce qu ils ing rent les perturbe et ils arr tent d ing rer le milieu incrimin ce qui suppose une capacit de discrimination de la ConA ou une association avec la toxicit 67 Confirm par une exp rience classique de toxicit cette dose en situation de non choix N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 101 page blanche Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 102 100 100 t moin O t moin bis Bl 75 g O fixation totale a E 50 ae a y 25 oe 0 75 75 E P t moin i 50 2 ac chlorog nique oO fixation totale 25 0 bii 75 E
140. 133 Figure 43 Vue dorsale du tube digestif d une larve d Acyrthosiphon pisum au dernier stade larvaire L4 135 Figure 44 Vue sagittale A et transversale B d une larve de Myzus persicae d apr s Ponsen 1972 montrant en particulier la position de l oesophage f de l estomac st de l intestin 1 et du rectum hg 137 Figure 45 Section transversale du tube digestif d une larve de Myzus persicae au niveau de l estomac ant rieur A de l estomac interm diaire B de l estomac post rieur C de la premi re partie de l intestin D et de la deuxi me partie de l intestin E La figure F repr sente une section transversale du tube digestif d un adulte Acyrthosiphon pisum au niveau de la section tubulaire du proctodeum d apr s Ponsen 1972 amp 1981 iade ie ety e rper pente tene e een tege 138 Figure 46 Dosage ELISA de la ConA dans des broyats de tubes digestifs de pucerons intoxiqu s ou non par de la lectine incub s dans une solution de PBS contenant 500 ng de ConA par quivalent tube CUS OSU Ser PEE RERO a iss irse iter petto sume ee aree eee Deere nee E eines 142 Figure 47 Repr sentation sch matique et synth tique des r sultats du dosage par chromatographie des acides amin s libres de broyats de pucerons laiss s 48 h sur des milieux Ap2 contenant de la ConA ou de la Figure 48 D pouillement graphique des deux premiers facteurs des AFC r alis es sur les donn es relatives aux acides amin s libres dos
141. 15 ug ml 35 pour la GNA 450 ug ml alors qu en comparaison nous observons 19 pour la ConA a 140 ug ml variable Lv tableau 9 Les effets sur la ponte sont ainsi parfaitement corr l s avec les inhibitions de croissance observ es la fin des stades larvaires L impact global de l intoxication par les lectines sur la dynamique de reproduction des pucerons est refl t par la r duction significative du taux intrins que d accroissement naturel rm Comme pour A pisum le doublement de la dose de GNA bien que diminuant significativement la croissance des adultes et le nombre de larves pondues ne se traduit pas par une r duction significative de ce param tre populationnel La r duction du rm se manifeste sur la figure 16C au niveau des ajustements d crivant la f condit des adultes les deux doses de GNA alt rent les dynamiques de pontes en d calant le pic de reproduction d environ deux jours 10 8 vs 12 2 et 12 6 Il n y a pas de diff rence sensible entre les deux mod les d ajustements obtenus pour ces deux modalit s Modalit s T moin ConA1 40 T moin GNA o 15 GNA4590 Concentration en lectines ug ml 0 140 0 215 450 Effets mortalit Jg 9 96 21 5 96 12 96 4 96 sur les nombre de pucerons inclus dans l analyse ult rieure 18 18 19 19 20 larves masse moyenne Jg ug 22201 a 1890 ab 221 0 a 153 7 be 1406 c masse rapport e au t moin J8 100 85 100 69 63 Survie
142. 1978 discuss the parasite com plex of A pisum in central Asia Mackay ef aj L983 sturtied sexual morph production Eastop 1971 gives references to a selection oF the enormous literature on this species Probably relatively few genotypes have been distributed outside Europe and hence the biology and host plant relations of introduced populations may show significant differences Blackman 1981 2n 8 M M Fiche descriptive du puceron du pois Acyrthosiphon pisum Harris d apr s Blackman et Eastop 1985 101 Aphis gossypii Glover Melon Aphid Coton Aphid Plate31 Appearance in life Apterae are very variable in colour Large specimens are dark green almost black hut the adults produced in crowded colemes ar high temperature may be less than 1 mm Jong and very pale yellow to almost white Most commonly light green mortled with darker green with dark siphunculi and a pale or dusky cauda Often ant attended Apterae 0 9 1 8 mm alatae I 1 1 8 mm Hast plants Petremely polyphagous Crap plants attacked incluce cotton cucurbits citrus coffer cocoa eggplant peppers potato okra and many ormamerital plants including Hibiscus Regarded as a major pest of cotton and cucurbits on which it builds up large populations Virus transmission Known to transmit over 50 piant viruses including non persistent viruses of beans and peas crucifers celery cowpea cucurbits Dahlia lettuce onion pawpaw peppers soybe
143. 2 heures de plus 15 vs 13 h mais cette diff rence n est pas significative p 53 96 Sur une p riode de 24 h l intoxication se traduit par une diminution sensible des dur es pass es en phase d ingestion variable 8 p 10 4 et une augmentation de la dur e des phases C p n tration des stylets sans ingestion variable 9 p 6 1 96 indiquant un ph nom ne net d habituation la pr sence de la ConA Paradoxalement nous observons que les pucerons plus fortement intoxiqu s de la deuxi me s rie de tests 600 u ml semblent tre moins vite affect s que les individus de la s rie pr c dente Nous avons cependant constat une diff rence tr s sensible du comportement des pucerons de chacune des s ries dans les premi res heures d enregistrement Il semblerait que les adultes de la premi re s rie se soient fix s plus difficilement La comparaison des valeurs moyennes des variables 1 et 2 de chaque lot de pucerons t moins permet de rendre compte de cette diff rence tableau 16 au cours des 8 premi res heures d enregistrement les pucerons t moins de la premi re s rie de mesures sont sortis deux fois plus souvent que ceux de la deuxi me s rie variable 1 Une part de la variabilit entre les pucerons intoxiqu s et les non intoxiqu s des premiers enregistrements pourrait donc s expliquer par le fait que les pucerons sont perturb s au moment o nous les transf rons Ils ont d autant plus de mal se fixer sur
144. 3 124 28 Thr onine allo free 119 12 10 67 127 16 Tryptophane 204 23 2 09 42 75 Tyrosine 181 19 2 13 38 63 Valine 117 15 16 29 190 85 B Ala Tyr 288 00 3 79 109 15 Total 260 3567 Rapport Sacch AA 2 25 3 Divers mg Citrate de Calcium 10 00 Benzoate de Cholest rol 2 50 MgSO4 7H20 242 00 4 Vitamines mg Acide p aminobenzoique 10 00 Acide L Ascorbique 100 00 Biotine 0 10 D Pantoth nate de Calcium 5 00 Chlorure de Choline 50 00 Acide Folique 1 00 i Inositol anhydre 42 00 Amide Nicotinique 10 00 Pyridoxine HCl 2 50 Riboflavine 0 50 Thiamine HCl 2 50 5 M taux traces mg CuSO4 5H20 0 47 FeCl3 6H20 4 45 MnCl2 4H20 0 65 NaCl 2 54 ZnCI2 0 83 6 KH2P04 250 pH ajust 7 5 avec KOH Fiche N 4 Pr paration des milieux Ap2 Vitamines M taux traces Divers les solutions de micro composants sont pr par es l avance Les vitamines 4 les m taux 5 et autres compos s 3 sont pes s avec une microbalance Mettler mod le AE163 pr cision 10 ug et dissous dans 150 ml d eau ultra pure solution stock concentr e 5 fois concentrations finales fiche protocole N 3 Apr s agitation barreau magn tique ultra sons le volume d eau est ajust 200 ml dans une fiole jaug e La solution finale est aliquot e dans des flacons de 20 ml Ils sont conserv s 20 C jusqu trois ou quatre mois Chaque flacon contient la quantit n cessaire en vitamines pour pr parer 100 ml de milieu Ap2 Le milieu Ap2
145. 3 5 0 5 20 8 0 8 13 1 0 2 14 8 0 3 0 23 0 03 AB Ww Ajustement effectu ys B Bx Be Tr N Jours Figure 15 Effets de doses subl tales de la Concanavaline A sur la survie et la f condit du puceron du pois Acyrthosiphon pisum la l gende est expliqu e dans le texte l erreur standard est report e pour chaque point de la figure B les valeurs des param tres P1 P2 et P3 observ s ou donn s par le mod le sont pr sent es dans le tableau de la figure C erreurs standards entre parenth ses N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 69 les pucerons peu ou pas intoxiqu s figure 15B et tableau 8 Ces observations expliquent les diff rences significatives observables pour les rapports Lv Dv et Lv Dr tableau 8 Cependant compte tenu de la remarque pr c dente sur le lot t moin du deuxi me test et au vu des diff rences significatives constat es entre les deux modalit s du premier test pour la variable Lv ainsi que ceux de M persicae plus loin nous ne conclurons pas que les pucerons fortement intoxiqu s sont capables de compenser long terme au niveau de la f condit les effets induits par la lectine en d but de croissance La vitesse de croissance en terme de croissance des populations des lots de pucerons test s de chaque modalit est exprim e par le rm Comme avec la plupart des pr c dentes variables les deux lots t moi
146. 3a Lyon 4 5 06 1993 Sauvion N Febvay G et Rahb Y M canismes de la toxicit de certaines lectines v g tales pour les pucerons Homoptera Aphididae Potentiel d utilisation de ces toxines prot iques pour la cr ation de plantes transg niques r sistantes aux homopt res phlo mophages 1eme Colloque de Physiologie de l Insecte 1993 Tours 16 17 09 1993 p Sauvion N M canismes de la toxicit de certaines lectines v g tales pour les pucerons Potentiel d utilisation de ces toxines prot iques pour la cr ation de plantes transg niques r sistantes aux pucerons ler Colloque des Doctorants de l INSA 1994 Villeurbanne 20 04 94 Sauvion N Febvay G et Rahb Y M canismes de la toxicit de certaines lectines v g tales pour les pucerons 4emes Journ es Interaction Plante Insecte 1994 Renne 4 5 07 1994 195 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons Rapports Sauvion N Etude des caract ristiques de croissance et de multiplication du puceron Macrosiphum albifrons sur diff rents g notypes de lupins Rapport Maitrise Biophysiologie Appliqu e aux Production V g tales Univers Sc Angers 1989 Sauvion N R le des prot ines dans les r actions de d fense des plantes aux agressions parasitaires rapport bibliographique DEA Anal yse et Mod l isation des Syst mes Biologiques Univers Sc Lyon I 1992 Sauvion N Analyse comportementale et biochimique d un
147. 7 dans l alcool m thylique Elles sont observ es sous un microscope lectronique transmission Philips CM 120 L ensemble de ce travail de pr paration des coupes et de leurs observations a t r alis avec l aide du personnel du Centre de Microscopie Electronique Appliqu e la Biologie et la G ologie CMEABG de l Universit Claude Bernard Lyon 1 78 Tampon phosphate Sorensen monosodique dipotassique pH 7 2 Voir fiche protocole n 21 79 Les fiches protocole n 22A et 22B donnent la composition des solutions utilis es et d taillent les tapes de fixation et de d shydratation 80 Membrane support de 100 200 vitant la coupe d tre abim e sous le faisceau d lectrons 81 Technique utilis e au Centre de Microscopie Electronique Appliqu e la Biologie et la G ologie de l Universit Claude Bernard Lyon 1 Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 128 2 5 Analyse des acides amin s libres de puceron entier et de miellat 2 5 1 Principe du dosage par chromatographie sur colonne de r sine changeuse de cations Les acides amin s libres de pucerons entiers et de leur miellat apr s intoxication sur milieux contenant de la Concanavaline A sont dos s par chromatographie sur colonne de r sine changeuse de cations Dans ce proc d la colonne est remplie d une r sine synth tique contenant des groupements sulfoniques SO pr alablement quilibr e avec un
148. 981 Monoecious holocyclic with alate males in North Amer ica put the population in England seems to be anholocyclic Frazer and Gill 1981 have studied developmental parameters ot M albifrons In Canada 2n 10 Fiche descriptive du puceron du lupin Macrosiphum afbitrons Essig d apr s Blackman et Hastop 1985 124 Resistance of aphids v insecticides ul EE MK TABLE 11 1 1 1 Examples of insecticide resistant aphid species for which published bicassay data are available EE Species tor which pubashed bioassay data are available Species Insecticide HKelerences class Aphis fabae Scopoli oF Hlinakova and Hurkova 1978 Aphis gossypii Glover OP Kung et al 1964 carb Furk et al 1980 Silver 1984 pyr Zilbermints and huravieva 19884 Brevicoryne brassicae Linnaeus OP Ripper 1961 Chactusiviiun fruguefuli Cockerell oc Shanks 1967 Crromaphis juglandicola Kalteneaen OP Michelbacher et al 1854 Fruluvieras pruri Geofroy OP Hurkova 197Ja Myzoceilis coryli Goeze carb A iniszee 1989 Myzus persicee Sulzer OP and many e g Hurkova 1973b Sawicki and carb Rice 1978 Baker 19785 Attia et al 19791 per Sawicki and Rice 1978 Attia and Karnilton 1978 Otto 1880 oc Bauernfeing and Chapman 1886 Phoradan amp umwult Schranx OP many e g Hrdy and Zeleny 1268 Muir 1979 cerb Muir 1979 Lewis and Madge 1984 Schizaphis graminum Rondan i OP Tee
149. 989 Ces premi res lectines observ es pour leur propri t insecticide s av rent tr s rapidement non exploitables dans le cadre d une strat gie de cr ation de plantes transg niques r sistant aux insectes la PHA et la lectine du haricot ail sont galement toxiques pour les mammif res Pusztai et al 1979a Des auteurs ont alors proc d au criblage syst matique d un grand nombre de lectines vis vis de diff rents insectes Comme pr c demment les essais s effectuent dans un premier temps sur Col opt res En 1990 Murdock et ses collaborateurs testent dix sept lectines contre la bruche du ni b C maculatus sur milieux artificiels Cinq d entre elles induisent un retard significatif du temps de d veloppement de la bruche des concentrations comprises entre 0 2 96 et 1 0 96 tableau 3 les lectines N ac tyl galactosamine GalNAc de l oranger des osages MPA et de l arachide PNA les lectines N ac tyl glucosamine GlcNAc de la pomme de terre STA de Datura stramonium DS A et du bl WGA Parmi ces cinq mol cules la WGA s av re la plus toxique Deux autres lectines a GlcNAc les lectines du riz OSA et de l ortie UDA se montrent aussi int ressantes que la WGA Huesing et al 19912 Czapla et Lang 1990 testent galement une trentaine de lectines et montrent que seules trois d entre elles sont toxiques pour Diabrotica undecimpunctata howardii Barber 6 des doses de 1 2 les le
150. 993 Vol 5 238 p Frazer B D Coccinellidae in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1988a Vol 2B p 231 248 Frazer B D Predators in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1988b Vol 2B p 217 230 Gatehouse A M R et Boulter D Assessment of antimetabolic effects of trypsin inhibitors from Cowpea Vigna unguiculata and other legumes on development of the bruchid beetle Callosobruchus maculatus J Sci Food Agric 1983 Vol 34 p 345 350 Gatehouse A M R Boulter D et Hilder V A Novel insect resistance using protease inhibitor genes in Molecular Approaches to Crop Protection 199 1a p 63 77 Gatehouse A M R Dewey F M Dove J Fenton K A et Pusztai A Effect of seed lectins from Phaseolus vulgaris on the development of the larvae of Callosobruchus maculatus mechanism of toxicity J Sci Food Agric 1984 Vol 35 p 373 380 Bibliographie 184 Gatehouse A M R Down R E Powell K S Sauvion N Rahbe Y Newell C A Merryweather A et Gatehouse J A Transgenic potato plants with enhanced resistance to the peach potato aphid Myzus persicae Entomol exp appl 1995a soumis Gatehouse A M R Down R E Powell K S Sauvion N Rahb Y Newell C A Merryweather A et Gatehouse J A Transgenic potato plants with enhanced resistance to the peach potato
151. A ACA PNA Jacaline BDA CSA ECA SBA PCA LBA PHA L ou E SNA SJA TKA TL VVA UEAI MAAI MAA II RPA Sp cificit s osidiques Man BMan Man gt aGlc gt GlcNAc Man BMan f tuine a an gt amp Glc gt GlcNAc a Man gt aGlc GlcNAc Man gt aGlc GlcNAc Man BMan SSE 3 3 aGlcNac BGlcNac GlcNac B1 4GlcNac 5 gt BGlcNac gt NeuSAc L Fuco1 2GalB1 4GIcNAc gt GIcNAc B1 4GIcNAc 1 3 BGIcNac GalNAc Galp1 3GaINAc gt amp et BGal aGal aGalNAc GalNAc gt Lac gt Mel BGal GalB1 4GIcNAc gt amp GalNAc gt Ga a et BGalNAc gt a et BGal idem PHA GalNAca 1 3 L Fuca1 2 Galp gt GalNAc Galp1 4GIcNAcD1 2Man GalNAc Lac gt Gal GalNAc gt Gal BGal GalNAc gt Lac gt Gal f tuine aGalNAc aL Fuc Neu5Ac complexe complexe Tableau 6 Sp cificit s osidiques des lectines v g tales test es sur diff rentes esp ces de pucerons en particulier Acyrthosiphon pisum partiellement d apr s Goldstein et Poretz 1986 r f rences plus pr cises dans le tableau 5 Fuc fucose Gal galactose Glc Glucose GalNAc N ac tylgalactosamine GlcNAc N ac tylglucosamine Lac lactose Man mannose Mel m libiose Neu5Ac acide neurosaminique sialique Chapitre 1 Contexte de l tude 44 L appartenance de lectines un classe donn e signifie qu elles poss dent les m mes sp cif
152. A M R Shi Y Powell K S Brough C Hilder V A Hamilton W D O Newell C A Merryweather A Boulter D et Gatehouse J A Approaches to insect resistance using transgenic plants Philos Trans R Soc Lond Biol 1993 Vol 342 N 1301 p 279 286 Georghiou G P The occurence of resistance to pesticides in arthropods an index of cases reported through 1980 Rome FAO 1981 192 p Gibson R W et Rice A D Modifying aphid behaviour in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1989 Vol 2C p 209 224 Girousse C Bonnemain J L Delrot S et Bournoville R Sugar and amino acid composition of phloem sap of Medicago sativa a comparative study of two collecting methods Plant Physiol Biochem 1991 Vol 29 p 41 48 Girousse C et Bournoville R Role of phloem sap quality and exudation characteristics on performance of pea aphid grown on lucerne genotypes Entomol exp appl 1994 Vol 70 p 227 235 Givovich A Sandstrom J Niemeyer H M et Pettersson J Presence of a hydroxamic acid glucoside in wheat phloem sap and its consequences for performance of Rhopalosiphum padi L Homoptera Aphididae J chem Ecol 1994 Vol 20 N 8 p 1923 1930 Goldstein LJ et Hayes C E The lectins carbohydrate binding proteins of plants and animals Adv Carbohydr Chem Biochem 1978 Vol 35 p 127 334 Goldstein I J Hughes R C Monsigny M O
153. B 1993 Vol 342 p 265 270 Burgess E P J Main C A Stevens P S Christeller J T Gatehouse A M R et Laing W A Effects of protease inhibitor concentration and combinations on the survival growth and gut enzyme activities of the black field cricket Teleogryllus commodus J Insect Physiol 1994 Vol 40 N 9 p 803 811 Caillaud C M Analyse des m canismes de la r sistance de lign es de bl Triticum monococcum au puceron des c r ales Sitobion avenae Th se 3 me Cycle Paris XI Centre d Orsay 1994 Calatayud P A Rahb Y Tjallingii W F Tertuliano M et Le R B Electrically recorded feeding behaviour of cassava mealybug on host and non host plants Entomol Exp Appl 1994 Vol 72 N 3 p 219 232 Cao J Wang Y C Klein T M Sanford J et Wu R Plant gene transfer New York Ed Alan Liss 1990 Transformation of rice and maize using the biolistic process Vol 129 p 21 33 Carver M Biological control of aphids in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1989 Vol 2C p 141 166 Bibliographie 182 Castle S J et Berger P H Rates of growth and increase of Myzus persicae on virus infected potatoes according to type of virus vector relationship Entomol exp appl 1993 Vol 69 p 51 60 Chambers R J Syrphidae in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Els
154. Concentration en GHA dans le milieu artificiel cen pug l 1 0 7 0 65 0 6 0 55 0 5 0 45 0 4 0 35 0 5 0 25 0 2 0 15 0 1 0 05 DO 405 nm 5 5 in 15 20 25 30 35 40 45 5 Concentration en GHA cen pug l 1 Figure 18 Quantit s de GHA dos es par ELISA dans les tubes digestifs de pucerons de l esp ce Smwu 8I cru intoxiqu s 8 jours par la lectine sur milieux artificiels La figure E reprend les donn es de la figure A mais se rapporte uniquement aux extraits de tubes digestifs des pucerons intoxiqu s aux concentrations comprises entre 5 et 50 pg mki Le tableau en m daillon donne les concentrations en GHA dans la s ve phlo mienne des diff rentes lign es transg niques estim es indirectement de ce dosage voir texte pour plus de d tails 54 Les DO des extraits quivalents deux tubes digestifs dilu s au 1 2 1 5 et 1 10 ont galement t mesur es mais ne sont pas exploitables Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 76 En r sum il ressort logiquement que la GNA n est pas d tect e dans les tubes digestifs des pucerons pr lev s sur les plantes t moins var D sir e ou lign e WAI9 12 L information de cette s rie de dosage est cependant que de la GNA est clairement d tect e dans des tubes digestifs de M persicae s alimentant sur les lign es transg niques t moignant de la pr sence de la lectine dans la s ve phlo mienne de ces plantes Cela tait
155. Denis B reng re Fr d rique Anne et Papy pour vos encouragements Mention sp ciale quand m me Guillaume pour ses superbes dessins Ce travail te doit aussi beaucoup Jo l et pas seulement pour les quelques heures de relecture que je t ai impos e Enfin Anne je ne saurais trop louer ta patience et te remercier pour le soutien que tu m as toujours apport en particulier pendant ces derniers mois Liste des abr viations ACA lectine de l amaranthe Amaranthus caudatus L ACP Analyses en Composantes Principales ADN acide d soxyribonucl ique AFC Analyse Factorielle des Correspondances ARN acide ribonucl ique ASA lectine de l ail Allium sativum L BCH chitinase du haricot BDA lectine de la bryone dio que Bryonia dioica Jacq BPA lectine de Bauhinia purpurea L BSII lectine de Griffonia simplicifolia Welw Baill ConA lectine de la canavalia Canavalia ensiformis L DC CPA lectine du pois chiche Cicer arietinum L CpTI serpine inhibiteur de prot ase du ni b Vigna unguiculata Walp CSA lectine du gen t balais Cytisus scoparius Link DDT dichloro diph nyl trichloro thane insecticide DIMBOA 24 dihydroxy 7 m thoxy 1 4 benzoxine 3 one acide hydroxamique DSA lectine de la Datura stramonium L ECA lectine du flamboyant Erythrina cristagalli L ECL Enhanced ChimioLuminescence EHL lectine d Eranthis hyemalis L Salisb ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay FAO
156. M R Down R E Powell K S Sauvion N Rahbe Y Newell C A Merryweather A et Gatehouse J A Transgenic potato plants with enhanced resistance to the peach potato aphid Myzus persicae Entomol exp appl 1995 soumis Gatehouse A M R Down R E Powell K S Sauvion N Rahb Y Newell C A Merryweather A et Gatehouse J A Transgenic potato plants with enhanced resistance to the peach potato aphid Myzus persicae Entomol exp appl 1995 soumis Sauvion N Rahb Y Delobel B Chen J Q et Febvay G Chemical and behavioural characterisation of a resistance in melon to the melon aphid Aphis gossypii Glover Entomol exp appl 1995 in prep Colloques Poster Febvay G Sauvion N et Rahb Y A Macintosh program for the analysis of EPGrams an example to the analysis of melon resistance to Aphis gossypii XIX International Congress of Entomology 1992b Beijing CHI 28 06 04 07 1992 Febvay G Sauvion N et Rahb Y Etude d une r sistance du melon au puceron Aphis gossypii aspects comportementaux et m thodes d analyse EPG acquisition informatis e logiciel d exploitation des donn es 2emes Journ es Interactions Plante Insecte 1992 Versailles 14 15 05 1992 Sauvion N Febvay G et Rahb Y Analyse comportementale et biochimique d une r sistance du melon au puceron Aphis gossypii intervention potentielle des prot ines phlo miennes 3eme Journ es Interaction Plante Insecte 199
157. N d ordre 95 ISAL0042 Ann e 1995 THESE pr sent e devant l Institut National des Sciences Appliqu es de Lyon pour obtenir le grade de Docteur Formation Doctorale Analyse et Mod lisation des Syst mes Biologiques par SAUVION Nicolas DEA Analyse et Mod lisation des Syst mes Biologiques Effets et modes d action de deux lectines mannose sur le puceron du pois Acyrthosiphon pisum Harris Potentiel d utilisation des lectines v g tales dans une strat gie de cr ation de plantes transg niques r sistantes aux pucerons Soutenue le 20 juin 1995 devant la commission d examen NARDON Paul Prof INSA de Lyon Directeur th se LEGAY Jean Marie Prof UCB Lyon 1 Pr sident GATEHOUSE Angharad Res Fellow Univ Durham GB Rapporteur BOURNOVILLE Ren DR INRA Rapporteur ROUGE Pierre Prof UPS Toulouse Rapporteur RAHBE Yvan CR INRA RIBA Guy DR INRA R sum Nous avons recherch des prot ines toxiques pour les pucerons Homopteres insectes piqueurs suceurs phlo mophages et tudi le mode d action de certaines d entre elles Ce travail constitue une premi re tape d un programme de cr ation de plantes r sistantes aux pucerons par g nie g n tique Les caract ristiques toxicologiques de nombreuses prot ines sont valu es par des tests d ingestion sur milieux artificiels d finis Des lectines d origine v g tale se liant au mannose pr sentent des propri t s toxiques int ressantes Notre tud
158. PBS Tween g latine tampon PBS Tween g latine dosage ELISA voir fiches protocole N 9A amp 9B solution satur e en PTU Ph nylthio ur e inhibiteur de la m lanisation Fiche N 79 Solution physiologique insecte formule de Yeager adapt e aux charancons Nardon 1978 NaCl 10 g KCI 1 5g CaCl2 0 5 g NaHCO3 0 18 g NaH2 PO4 0 01 g Glucose lg L vulose 0 4 g Maltose 15g qsq 1000 ml d eau p o 400 mosM pH 6 8 Mat riel Fiche N 20 Pr paration des coupes histologiques 1 Fixation du mat riel dans le liquide de Duboscq Brasil 24 h 8 j Composition 160 ml d alcool 80 96 60 ml de formol 15 ml d acide ac tique 1 g d acide picrique 2 Doubles inclusions g lose paraffine Pr paration de la g lose 1 3 g de g lose dans 100 ml d eau distill e Jaisser gonfler 1 2 heure dissoudre chaud filtrer conservation 4 C Premi re inclusion dans la g lose hydrater les pi ces pucerons par simple rin age l eau dissoudre la g lose en plagant le tube au bain marie bouillant avec un compte goutte faire un coussinet de g lose sur une lame propre laisser prendre la g lose placer les pi ces a la surface liminer le plus d eau possible recouvrir d une couche de g lose laisser prendre mettre trente minutes dans de l alcool 70 afin de durcir la g lose d couper la g lose en petits blocs contenant les pi ces et les d
159. Rahb et Febvay 1993 Rahb et al 1995 Mais les donn es se rapportant certaines d entre elles s accordent mal avec les mod les d ajustement utilis s Or ces r sultats semblent montrer une toxicit diff rentielle des diverses classes de lectines test es qui est mal rendue par ces seuls indices synth tiques Il nous a donc sembl int ressant de reprendre les donn es brutes masses mortalit s pour les soumettre une analyse en composante principale ACP Ce type d analyse permet en effet de condenser de synth tiser et d interpr ter dans un espace intelligible deux ou trois dimensions les r sultats se rapportant aux mortalit s et aux inhibitions de croissance des pucerons intoxiqu s Cette m thode d analyse pr sente l int r t de bien visualiser les diff rentes classes de lectines et donc de permettre une comparaison des effets toxiques de chacune d entre elles Les donn es utilis es sont la mortalit des pucerons J1 J3 et J7 pour chacune des trois concentrations de lectines test es a 10 ug ml b 50 ug ml c 250 ug mE neuf variables sont donc d finies la variable not e md3b se rapporte par exemple la mortalit au troisi me jour pour la concentration de 50 ug ml D Le facteur temps est ainsi inclus dans l analyse les inhibitions de croissance engendr es par les trois concentrations a b et c variables ICa ICb et ICc Tous les calculs et les figures sont r alis s
160. Spider venoms are not suitable insecticides Toxicon 1993 Vol 31 N 3 p 233 234 New T R Neuroptera in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1988 Vol 2B p 249 258 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 189 Newman G R Jasani B et Williams E D The preservation of ultrastructure and antigenicity J Microscopy 1982 Vol 1982 p 5 6 Niemeyer H M Hydroxamic acids 4 hydroxy 1 4 Benzoxazin 3 ones defence chemicals in the gramineae Phytochemistry 1988 Vol 27 N 11 p 3349 3358 Nijveldt W Cecidomyiidae in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1988 Vol 2B p 271 278 Norton G Proteinase inhibitors in Toxic substances in crop plants Cambridge J P F D Mello C M Duffus amp J H Duffus Eds Ed R Soc Chem 1991 p 68 107 Nottingham S F Hardie J Dawson G W Hick A J Pickett J A Wadhams L J et Woodcock C M Behavioral and electrophysiological responses of aphids to host and non host plant volatiles J chem Ecol 1991 Vol 17 p 1231 1242 Novakova N et Kocourek J Studies on phytohemegglutinins XX Isolation and characterization of hemagglutinins from scarlet runner seeds Phaseolus coccineus L Biochem Biophys Acta 1974 Vol 359 p 320 333 Nsimba Lubaki M Peumans W J et Allen
161. a to euch first sork since Seginnirg of penetration Her X om uo Wo MOM E uvooo02odu af E gt Cumetetion ate far saan merh ln amm omm gans emet ha P Seeuvuourun A 221121 _ Ez 1I 173781 0 000700 Gereral satisics Analysis of each penetzauan Descriptif graphique du dispositif labor pour enregistrer le comportement d alimentation des pucerons sur milieu artificiel I 1 1 1 TWEEN i i 1 i i M LAU ECS ESS ex m A T moin ConA400 Descriptif graphique de l analyse statistique des enregistrements EPG r alis s avec A pisum sur milieux standards simples ou contenant 400 ug mi de ConA Histogrammes et courbes de Gauss par modalit t moin amp ConA400 pour une dur e d acquisition de 4 h pour chacune des 11 variables retenues dans l analyse ConA 400 4h ConA400 T moin Desenptif graphique de l analyse statistique des enregistrements EPG r alis s avec A pisum sur milieux standards simples ou contenant 400 jig ml de ConA Histogrammes et courbes de Gauss par modalit t moin amp ConA4 00 pour une dur e d acquisition de 8 h pour chacune des 11 variables retenues dana l analyse 440 var7 ConA 400 8h 3 faj AE f d gt E i E 2 E E F E e E Y var6 2 ConA400 amp var7 Descriput graphique de l analys
162. a tomate Fischhoff et al 1987 Delannay et al 1989 Van der Salm et al 1994 du coton Perlak et al 1990 du peuplier McCown et al 1991 Jouanin et al 1993 de la pomme de terre Cheng et al 1992 et du mais Koziel et al 1993 Plante Insecte Test labo Test serre champ Equipe ann e Esp ce v g tale Ordre esp ce Col opt res G nes utilis s L pidopt res Homopt res Toxines de Bacillus thuringiensis CryIA a amp b Tabac Lep Ms expression faible non Vaeck van Montagu ef al 1987 PGS protection forte Barton et al 1987 non 1 USDA 1993 Warren et al Hv Ms bonne protection CryIA b amp c modifi Coton Lep Hv bonne expression Perlak et al 1990 Monsanto protection forte 2 Jenkins et al 1991 1993 protection lev e oui CryIA b Mais Lep On bonne protection Koziel et al 1993 Colza 1 USDA 1993 Riz Lep oui 1 USDA 1993 CryIA b Tomate Lep Ms Hz Ha KI protection forte non Fischoff et al 1987 moyenne non Delannay et al 1989 oui 1 USDA 1993 Noyer Lep 1 USDA 1993 B t k Pomme de terre Lep Ms non Cheng et al 1992 CrylllA Pomme de terre Col Ld tr s bonne protection Perlak ef al 1993 Monsanto CryIA a modifi Peuplier Lep Md Ld protection forte non 2 McCown et al 1991 moyenne Lectines PSA lectine de pois Tabac Lep Hv protection moyenne
163. a tulipe Tulipa sp UEA lectine de l ajonc d Europe Ulex europaeus L UDA lectine de l ortie dioique Urtica dioica L VFA lectine de la f ve Vicia faba L VVA lectine de la vesce Vicia villosa Roth WAI inhibiteur alpha amylase du bl WAIO construction simple de plasmide avec le g ne de la WAI WGA lectine du germe du bl commun Triticum vulgare Vill Sommaire Avant DropOS nine nn ei RATE Ten ut e dte D 2 in 3 Liste d s Abr viations ns o e orae aa erae eara nno aae oo Leo S rane or apa ouo e sa suneos aon oa rosse otstes eotea osoa A SOMMAILE csdecccecsiccecacscicccessucdatecedectacebicdesacceecccesbucdesesedecedasbicdesaedeccacessucdabasececcocedscdesaedeasasesacese Listedes TOMES DC E 6 Liste des planoles reete pte ei bere velot teta telo pelle eet erben UU edes 8 run Enni qu 9 Listes des fiches protocoles eiie esistere tUe pue et PY ere eisin LE REQUE Ea Neia 10 Liste des ANNEXES ani rs listes bob esatta St ne de nn en tives tes e ios ote 11 Chapitre 1 Pr sentation du contexte de l tude csccssscssscsssscsssccssscsssssssscsssscssscssee 12 MiroduCUOn e meate 12 1 La biologie des pucerons implique des moyens de lutte sp cifiques 13 1 1 Biologie des pucerons nement nine ME ede rra Rs 13 1 2 N cessit s conomiques justifiant l tude pr sent e 16 1 3 Moyens actuels de lutte contre les pucerons Av
164. acintosh program for the analysis of EPGrams an example to the analysis of melon resistance to Aphis gossypii XIX International Congress of Entomology 1992 Beijing CHI 28 06 04 07 1992 Ferrari C Barbieri L et Stirpe F Effects of plant ribosome inactivating proteins on ribosomes from Musca domestica Comp Biochem Physiol 1991 Vol 100B N 2 p 223 227 Fischhoff D Bowdish K Perlak F Marone P McCoormick S Niedermeyer J Dean D Kusano Kretzmer K Mayer E Rochester D Rogers S et Fraley R Insect tolerant transgenic tomato plants Bio Technology 1987 Vol 5 p 807 813 Fisher D B Wu Y et Ku M S B Turnover of soluble proteins in the wheat sieve tube Plant Physiol 1992 Vol 100 N 3 p 1433 1441 Forbes A R The morphology and fine structure of the gut of the green peach aphid Myzus persicae Sulzer Homoptera Aphididae Mem ent Soc Can 1964 Vol 36 p 1 74 Foriers A Lebrun E Van Rapenbush R de Neve R et Strosberg A D The structure of the lentil Lens culinaris lectin amino acid sequence determination and prediction of the secondary structure J Biol Chem 1981 Vol 256 p 5550 5560 Forrest J M S Galling aphids in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1987 Vol 2A p 341 354 Fraval D Dossier de la cellule environnement de l INRA la lutte biologique Paris A Fraval Ed INRA 1
165. ackman ef l 1978 and anholocyelic clones often darker green in colour frequenily nave one or two chromosomes dissociated Fiche descriptive du puceron du p cher Myzus persicae Sulzer d apr s Blackman et Eastop 1985 Macrosiphum euphorbiae Thomas PoiatoAphid Plate 109 solanifoli Ashmead Appearance in life Adult apterae medium sized ta rather large spindle shaped or pear shaped usually some shade of green but sometimes yellowish pink or magenta often rather chiny Eyes are distinctly yeddich Legs siphunculi and cauda mainly same colour as body but siphunculi often darker towards apices antennae usually only dark apically but sometimes almost entirely dark Im matures rather Jong bodied paler than adults with a dark spinal stripe and a light dusting of whitish grey wax Alatar have pale greenish to yellow brown thoracic lobes and usually only the antennae and sipnunculi noticeably darker than in the aptera Apterae 1 7 3 6 mm alatae 1 7 3 4 mm Host plants Primary host Rase spp highly polyphagous on secondary hosts feeding on over 200 plant species in more than 20 different families Solanaceae especially Salonum fuberosum are particularly favoured secon dary hosts Virus transmission A vector of over 40 non persistent viruses and 5 persistent viruses including beet yellow net pea enajon mosaic pea leaf roll and potato leaf roll However it appears 10 be unimportant as a vector of potato lea
166. action des lectines sur les pucerons 122 Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 1 Introduction Apr s avoir montr comment la ConA affecte les performances biologiques d A pisum et son comportement alimentaire l tape suivante de notre tude consiste d montrer son lieu d action quelle est sa cible physiologique et comment agit elle sur cette cible Notre hypoth se de travail est qu elle se lie au niveau de l pith lium intestinal et qu elle induit une perturbation du fonctionnement du tube digestif Du fait de la toxicit de certaines lectines vis vis des mammif res chapitre 1 de nombreuses tudes toxicologiques sont conduites sur des animaux de laboratoire et en particulier le rat Pusztai 1991 Lorenzsonn et Olsen 1982 ont d montr par exemple que la ConA affecte de mani re irr versible l pith lium intestinal du rat et perturbe sa digestion La lectine provoque la rupture puis la d sint gration de la bordure stri e de la surface apicale des cellules pith liales entrainant une alt ration du cytosquelette suivie d une lyse cellulaire Les effets induits par la ConA sont inhib s lorsque des mannosides notamment mannane et mannose sont administr s par injection ou incorpor s dans la nourriture simultan ment avec la lectine Pusztai 1991 Larue Achagiotis et al 1992 Ces r sultats d montrent que la toxicit est corr l e la propri t des lectines de se lier sp
167. amin tr s largement majoritaire 270906 de la s ve des plantes h tes principales de A pisum f ve pois luzerne et un syst me de transport efficace doit tre pr sent dans le tube digestif d A pisum Si ce syst me est perturb il peut th oriquement en r sulter une sous assimilation de cet acide amin et une augmentation de ses teneurs dans le miellat Deux arguments militent un peu contre cette interpr tation qui sont d une part la sp cificit non absolue des systemes de transport des acides amin s Asn ne devrait pas tre le seul afficher ce comportement 0 et d autre part la portion m sent rique concern e ne semble pas celle sp cialis e dans les ph nom nes d absorption 9 Enfin une derni re hypoth se peut tre voqu e qui est la stimulation de la transformation excr tion d asparagine partir d un pr curseur imm diat Asp ou Gln 10 Il est difficile de trancher avec les seuls l ments dont nous disposons mais il parait certain qu un syst me de transport de cet acide amin au travers de l pith lium intestinal est profond ment perturb 99 C est dire d barrass s de leurs symbiotes 100 qui sont un puits majeur Glu Gln chez A o sum Febvay ef a 1995 101 est vrai que Asp Glu et Gln montrent des accumulations relatives analogues Asn mais seulement tr s forte dose 102 Caract ris s par des bordures stri es tr s d velopp es du type de celles observ es plus e
168. an M Shufflebottom D Edwards K Jefferson R et Schuch W Tissue specific and cell specific activity of a phenylalanine ammonia lyase promoter in transgenic plants EMBO J 1989 Vol 8 N 7 p 1899 1906 Bhattacharyya L et Brewer C F Interactions of concanavalin A with asparagine linked glycopeptides structure activity relationships of the binding and precipitation of oligomannose and bisected hybrid type glycopeptides with concanavalin A Eur J Biochem 1989 Vol 178 p 721 726 Bhattacharyya L Ceccarini C Lorenzoni P et Brewer C F Concanavalin A interactions with asparagine linked glycopeptides bivalency of high mannose and bisected hybrid type glycopepides J Biol Chem 1987a Vol 262 N 3 p 1288 1293 Bhattacharyya L Haraldsson M et Brewer C F Concanavalin A interactions with asparagine linked glycopeptides bivalency of bisected complex type oligosaccharides J Biol Chem 1987b Vol 262 N 3 p 1294 1299 Bhattacharyya P M Peng J Y Elmer J S Laco G Shen P Kaniewska M B Kononowicz H Wen F J Hodges T K et Beachy R N Specificity of a promoter from the rice tungro bacilliform virus for expression in phloem tissues Plant J 1993 Vol 4 N 1 p 71 79 Bieri M Baumgartner J U Bianchi G Delucchi V et Von Arx R Development and fecundity of the pea aphid Acyrthosiphon pisum Harris as affected by constant temperatures and pea varieties Mit Schweiz Entomol Gese
169. an strawberry sweet potato tobacco and tulips A vector of the persistent viruses cotton anthocyanosis Ebr rosette lily symptomiess and pea enation mosaic Distriburion Virtually world wide but in golder temperate regions confined ro glasshouses where it is a major ost Particularly abundant and well distributed in the tropics including many Pacific islands Biology The taxonomic status of A gossypii is problematic and hence the interpretation of biological information is difficult Although anhalocyclic in Europe A gossypii is closely related to European Aphis species of the frangulae group utilizing Frangeda alnus as primary host Thomas 1968 This indicates a palaearctic origin However Kring 1959 demonstrated holocyclic overwintering by A gossypii in Connecticut U S A with Cuatelpa bignonioides and Hibiscus syriacus utilized as primary nesis Either separate Nearctic and Palaearctic species are confused under the same name or more probably A gossypii has re acquired its holocycle in North America utilizing new primary host plants On a world wide basis gossypii comprises an indefinite number of annolocyclic lines some of which may have particular hasz plant associations For example gossypii occurs on chrysanthemums and cucumbers in British glasshouses but aphids from chrysanthemums will not colonize cucumber and vice versa although both can be reared on cotton The chrysanthemum living form has acquire
170. analyse pour mortalit ou ponte nulle Les r sultats avec M persicae o deux groupes t moins avaient aussi t r alis s sont beaucoup plus homog nes soulignant le caract re atypique de la variabilit observ e ici Il peut paraitre paradoxal de constater que l intoxication se traduit par une long vit accrue des pucerons D s le jour J20 la mortalit est significativement plus grande sur les milieux t moins 45 96 compar es celles des pucerons sur milieux lectines au cours de l une ou l autre des deux exp riences ConA80 22 ConA100 ou 200 0 96 De m me la p riode reproductive des adultes Dv de la modalit ConA200 est plus longue de deux jours vs t moins ce qui leur permet de pondre finalement autant de larves Lv que 49 es larves n onates ont t d pos es sur des milieux contenant des concentrations de ConA comprises entre entre 50 et 600 ug ml A J7 les deux lots de larves ayant subi les effets recherch s inhibition de croissance de 50 96 et de 60 96 ont t conserv s pour la suite du test mat riels amp m thodes Modalit s T moin ConAgo T moin ConA 99 ConA2 909 Concentration en lectine ug ml 0 80 0 100 200 Effets mortalit J7 3 96 7 96 25 96 28 96 37 sur les nombre de pucerons inclus dans l analyse ult rieure 11 9 9 19 17 larves masse moyenne J7 ug 1461 70 a 1310 92 a 1450 52 a 73923 b 565 22 c masse rapport e au
171. and medecine London Liener I E Sharon N Goldstein I J Eds Acadamic Press Inc 1986 p 251 265 Sylvester E S Virus transmission studies in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1988 Vol 2B p 69 82 Sylvester E S Viruses transmitted by aphids in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1989 Vol 2C p 65 88 Tazaki K et Yoshida K The bark lectin of Robinia pseudoacacia purification and partial characterization Plant Cell Physiol 1992 Vol 33 p 125 129 Ternynck T et Avrameas S Techniques immuno enzymatiques Paris Soc Fr Immunologie Ed INSERM 1991 108 p Tjallingii W F Electronic recording of penetration behaviour by aphids Entomol exp appl 1978a Vol 24 p 521 530 Tjallingii W F Mechanoreceptors of the aphid labium Entomol exp appl 1978b Vol 24 p 531 537 Tjallingii W F Electrical nature of recorded signals during stylet penetration by aphids Entomol exp appl 1985a Vol 38 N 2 p 177 186 Tjallingii W F Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets Entomol exp appl 1985b Vol 38 N 2 p 187 193 Tjallingii W F Stylet penetration activities by aphids Th se d tat Wageninggen NDL 1985c Tjallingii W F Wire effects on aphids during electrical recording of stylet penetration Entomo
172. ani isol s individuellement sur une feuille Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 56 Pour chaque lign e t moin ou transg nique test e trente lots de deux femelles sont ainsi r partis sur diff rentes plantes Le nombre de plantes test es par lign e et par cons quent le nombre de cages par plante varie en fonction du nombre de plantes disponibles au moment du test quatre a dix suivant les lign es Apr s 24 h de ponte les femelles sont retir es jour JO Nous laissons deux larves se d velopper pendant 6 a 8 jours pr cis dans le texte des r sultats A l issue de cette p riode de d veloppement larvaire une femelle par cage est conserv e pour la suite du test Pour l esp ce A solani les pucerons ont alors t pes s J8 Les larves filles sont d nombr es quotidiennement la m me heure et limin es jusqu la mort de tous les individus 2 9 M thodes d analyse des donn es 2 9 1 Analyse globale des effets de vingt sept lectines Ant rieurement notre tude des tests de criblage ont t r alis s au laboratoire sur des prot ines de classes tr s diff rentes venins antibiotiques enzymes diverses inhibiteurs de prot ases hormones peptidiques etc Ils ont r v l que certaines lectines pr sentaient des propri t s aphidotoxiques int ressantes Ces lectines ont t soumises aux analyses pr c demment d crites pour d terminer leurs CL50 et leurs IC50
173. ansg niques alors que dans un premier temps seule la forte activit entomopathog ne des toxines de B thuringiensis avait t exploit e 2 3 Genes exploitables pour la cr ation de plantes transg niques r sistantes aux insectes ravageurs La strat gie de cr ation de plantes transg niques r sistantes aux insectes a repos jusqu ce jour sur l identification de m canismes g n tiques simples conf rant des r sistances des ravageurs cibles Le seul m canisme actuellement exploit est le plus trivial d entre eux et Col opt res Cm Callosobruchus maculatus Du Diabrotica undecimpunctata Insectes cibles L pidopt res On Ostrinia nubilalis Hv Heliothis virescens Homopt res Ef Empoasca fabae NI Nilaparvata lugens Prot ines utilisables Zs Zabrotes subfasciatus ST Spodoptera littoralis Nc Nephotettix cincticeps Tissus cibles R f rences Ao Acanthoscelides obtectus Ms Manduca sexta Ap Acyrthosiphon pisum mode d action Tc Tribolium castaneum Hz Heliothis zea Mp Myzus persicae Ag Anthonomus grandis Ha Heliothis armigera Ago Aphis gossypii Ld Leptinotarsa decemlineata Toxines de B thuringiensis toxines L pido CryI A G CryIA c et CryIE b intestin moyen d s quilibre 1 CryII B C DL5020 1ug sur SI du transport ionique toxines mixtes L pido et CryIC DL50 1 5 ug sur SI r cepteur de CryIA c Dipt res CryIIA Btk CL50 0 0001 sur SI et amino pe
174. antages et TCO CLUS INES omoi Leste cote rr o aestu eee tunt detulit Cos Deco ie uel ade tent 18 2 Les plantes transg niques offrent des perspectives prometteuses pour lutter contre l s INSECIES TAV dE OUS trac eorr US EHI QU ten RU anne Set le tn ere 21 2 1 Avantages et inconv nients pr sent s par les plantes transg niques 2T 2 2 Probl me du risque d apparition de populations d insectes r sistantes dux entoImotoxiDES eloquens cero eb ta aon end avete eb el etat re Ped bead else stat 29 2 3 Genes exploitables pour la cr ation de plantes transg niques r sistantes aux insectes TaVABOUES iussis eene teen BUT SNNT Rege ek be esa TYN Y HEU ERa dva ee tee 30 3 Les lectines v g tales sont des candidates int ressantes pour la transg n se visant la protection des plantes rettet etienne inea eua 6d re Pe du pa cad Uh 37 3 1 Histoire de la d couverte des lectines D finition g n rale 37 3 2 Propri t s g n rales des l ctines issues 38 3 3 Action des lectines sur les insectes in planta et in vivo Connaissances ze saci P 46 Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 4500 I TIO CI CHOU SE Tc m 50 2 Mat riels et M thodes uae ito ed dee st tence Ae Pede tira aee L a tete 51 2 1 Origines et levage des TIsECleS ei ees eno EOS Rene init 51 2 2 Origines des lectines purifi es test
175. ante a consist estimer les taux d expression des transg nes dans ces plants en dosant les prot ines recombinantes par la technique d immunomarquage sur d p ts en tache En ce qui concerne la GNA simples ou doubles constructions et la BCH les concentrations mesur es dans les extraits tissulaires des transplants sont de l ordre de 1 296 des prot ines solubles totales Bien que de l ARN ait t dos dans tous les plants transform s avec le gene de WAI cette prot ine n est pas d tect e dans les extraits des transformants PWG6 ni W AIO Afin de confirmer que la GNA et la BCH sont correctement synth tis es par les pommes de terre transform es des extraits de feuilles sont pass s en lectrophor se SDS PAGE les bandes prot iques obtenues sont transf r es sur membrane de nitrocellulose pour tre ensuite immunomarqu es avec des anticorps sp cifiques et visualis es par chimioluminescence syst me ECL principe expliqu dans la fiche protocole N 7 la GNA et la BCH sont clairement mises en vidence masses mol culaires respectives 12 kDa et 30 kDa Gatehouse et al 1995a Dans le cas de WAI aucune prot ine marqu e n est r v l e Sur la base des r sultats de ces dosages une premi re lign e de pomme de terre transform e avec la double construction BCH GNA a t retenue pour les tests biologiques ainsi qu une seconde transform e avec la construction WAI GNA elles sont nomm es respectivement PBG6 47 e
176. antes mais la pr sence des lectines dans le monde vivant est beaucoup plus large La fonction physiologique g n rale en supposant qu elle existe de ces mol cules que l on trouve dans des organismes aussi diff rents que les champignons les v g taux les bact ries les virus les insectes ou les mammif res reste trouver Au niveau des plantes la fonction de d fense clairement mise en vidence pour certaines lectines pourrait tre un aspect secondaire qui aurait t s lectionn de par l avantage s lectif qu il conf re 3 3 Action des lectines sur les insectes 7 p anfa et n vivo Connaissances actuelles Bien qu aujourd hui encore les fonctions des lectines dans les plantes ne soient pas encore bien comprises des tudes mettent clairement en vidence que ces mol cules jouent un r le de d fense contre certains insectes phytophages Afin d exploiter cette propri t des quipes se sont r cemment orient es vers la recherche de lectines v g tales pr sentant des effets 31 Blocage de la croissance des hyphes filaments myc liens p n trant dans les tissus du v g tal N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 47 toxiques sur des insectes consid r s comme d importants ravageurs en agriculture et susceptibles d tre utilis es dans une strat gie de cr ation des plantes transg niques r sistantes ces insectes Les premiers travaux portant sur l identification de lectine
177. apeunsa1vt uondaosqe asmaneri xLG6T 17 12 SIM asoan np TONPSTTNN gap mennrmir am g AIO anraa qaad TRL WHd ESGL 77 7 PME JG L OEH 39 SIUH 4 DURE EL Op 12 spidi sop sgurue 4906 SUBAY 19 2pexew sopie sop uonidiosqe 2p rona Surpord sap uonsaip vl 2p suoneiape Annexe 3B animaux de laboratoire rats principalement suite tableau non exhaustif Mode d action de la lectine du haricot PHA et de la Concanavaline A sur des vil ad 3p sdioonue p uonongosd op exc 3urziss np PIRE ap Tonnvmmp 2un2op nue 93 20 np ymqmnarz sdiconue gt 86T 19 12 TM uma arn yerta SANTA sap mmmmrosmoo 1 sz md nononpoad O86 JP 1a vos agqurtp salon sap uodsmen ap ms sauunnjazr sap 12a a 86I 77 17 rsg sajrumsarut SINSO ora L861 7013 MSN Sap suoponmnsap Sa Wawanhey auzeduroae wes Ty quawaddiyjaaz C46 msng 12 12217 ms un saura sap DONA g DAR 11382 ut JBUSTUL QU El ORGL TE 22 swo SOUUIUTIEY Hynes sanne SIP uormeuruir 32 30 e1311 051 ORS IP B LOS IA t zL6L Swena mmap Junouurod swooped Sop 2nburssds 2ouzi3upt Iun p uon npur 19 2u amp vf p16 1p we AVE JU WEE SIEI SOP ZIO MINI juaurameommisrs 210001 mi VHd Woop snonm ap zamquaurapddns acstrm suma f86T PP 12 19pmmpofg monemoj ey d smanun sa nondiosge p ms nae preannd samo umsajut PIG 1712 300H sump aisuamr opqm 2p 2ubisigzjre 2s20d31 snoaur 2p uong12gsaad amp u yyer 13442 ur JD FR6L jm 22 ropueuis j2 2908
178. aphid Myzus persicae Entomol exp appl 1995b soumis Gatehouse A M R Hilder V A Powel K Boulter D et Gatehouse J A Potential of plant derived genes in the genetic manipulation of crops for insect resistance in Proc Sth Int Symp Insect Plant Relationships Dordrecht NDL S B J Menken J H Visser amp P Harrewijn Ed Kluwer Acad Publ 1992 p 221 234 Gatehouse A M R Howe D S Flemming J E Hilder V A et Gatehouse J A Biochemical basis of insect resistance in winged bean Psophocarpus tetragonolobus seeds J Sci Food Agric 1991b Vol 55 p 63 74 Gatehouse A M R Minney B H P Dobie P et Hilder V A Biochemical resistance to bruchid attack in legume seeds investigation and exploitation in Bruchids and Legumes Economics Ecology and Coevolution Dordrecht NDL Fujii K Gatehouse A M R Johnso C D Mitchel R Yoshida T Ed Kluwer Acad Publ 1990b p 241 256 Gatehouse A M R Powell K S Van Damme E J M Peumans W J et Gatehouse J A Chap 3 Insecticidal properties of plant lectins their potential in plant protection in Lectins Biomedical perspectives London A Pusztai amp S Bardocz Ed Francis amp Taylor 1995c p x x Gatehouse A M R Shackley S J Fenton K A Bryden J et Pusztai A Mechanism of seed lectin tolerance by a major insect storage of Phaseolus vulgaris Acanthoscelides obtectus J Sci Food Agric 1989 Vol 47 p 269 280 Gatehouse
179. aphique des deux premiers facteurs de l ACP norm e ex cut e sur le tableau des donn es relatives aux enregistrements EPG de 24h r alis s avec des pucerons de l esp ce Acyrthosiphon pisum sur des milieux standards simples ou contenant 600 ug ml 1 de Concanavalin A sesse tae erdt er ette dirait times Mesh gti 11 8 Figure 39 Descriptif de la d marche et des techniques utilis es pour l tude du mode d action cellulaire de la Concanavaline A sur le puceron Acyrthosiphon pisum eese rennen 123 Figure 40 Comparaison des profils lectrophor tique d extraits secs de miellat de pucerons laiss s 72 h sur des milieux standards simples d contenant 100 ug ml de ConA e ou 100 ug mi de peroxydase f ou les deux prot ines ces m mes concentrations g eese eren 130 Figure 41 Estimations B des quantit s de ConA excr t es dans le miellat de pucerons laiss s 72 h sur milieu contenant 200 C2 400 C4 ou 800 C8 ug ml l de lectine dosage ELISA C des quantit s de ConA ing r es en 48 h par des pucerons sur ces diff rents types de milieu dosage l aide d un marqueur radioactif gamme talon dosage ELISA 131 Figure 42 Comparaison des profils lectrophor tiques des broyats d estomacs de pucerons adultes A pisum laiss s 72 h sur des milieux Ap2 simples a ou contenant 200 ug ml l b 400 ug ml l c ou 800 ug ml d de Con dere E eves UB REA IRI
180. ar du B caryophyll ne Cet inhibiteur minimise la dispersion des pucerons au moment de l attaque d un pr dateur multipliant de fait l efficacit de cet antagoniste et diminuant du m me coup les risques d expansion d ventuels virus transport s par les pucerons Roitberg et Myers 1978 1 3 3 3 Obtention de plantes r sistantes aux pucerons par la s lection vari tale classique Parmi les divers insectes phytophages peu sont aussi sp cialis s que les pucerons dans le choix des plantes h tes Ainsi alors que la plupart des macrol pidopt res sont capables d attaquer des plantes appartenant plus d une famille 90 des esp ces de pucerons accomplissent leur cycle biologique sur un seul h te et sont alors inf od s une seule ou un petit nombre d esp ces v g tales troitement apparent es Comeau 1992 Certes un puceron tel que M persicae est extr ment polyphage Blackman et Eastop 1985 Malgr tout chez plusieurs esp ces cultiv es une r sistance vari tale cet insecte peut tre d cel e Auclair 1989 La sp cificit alimentaire des pucerons facilite en g n ral la t che de cr ation de 9 Myzus persicae s attaque plusieurs esp ces de Prunus divers arbustes ainsi que nombre de l gumes dont le c leri la laitue la betterave la tomate l aubergine la pomme de terre les crucif res les cucurbitac es etc Chapitre 1 Contexte de l tude 24 cultivars r sistants car de l gers c
181. asse Il aurait t int ressant de pouvoir ausssi exprimer les concentrations en nombre de sites de liaison aux sucres pour mettre en vidence une ventuelle corr lation entre ce nombre et le degr d intoxication Mais nous ne connaissons pasle nombre de sites de liaison aux sucres de la GNA et de la NPA et nous ne pouvons donc pas comparer les effets toxiques des trois lectines sur la base de ce crit re La Concanavaline A est une prot ine t tram rique de 106 kDa chapitre 1 Sur A pisum nous estimons de fa on assez impr cise l IC20 0 03 uM et l IC50 0 47 uM Pour la GNA t tram re 50 kDa ces param tres sont estim s respectivement 0 2 et 3 5 uM En ce sens elle parait donc beaucoup moins toxique pour le puceron du pois M persicae est moins sensible ces deux lectines ainsi qu la NPA figure 52B C est ce que nous montre aussi la figure 13 Les IC20 molaires pour la ConA la GNA et la NPA sont respectivement de 0 09 uM 2 8 uM 4 8 uM les IC50 de 7 31 uM 12 6 uM et 22 6 uM La ConA apparait donc plus toxique que la GNA ou la NPA pour les deux pucerons test s Le fait le plus marquant est surtout que la ConA et les deux lectines mannose strict pr sentent des courbes dose r ponse tr s diff rentes avec des activit s diff rentes faibles doses La ConA est active d s les faibles doses encore que nous observons une certaine variabilit de la r ponse des pucerons l intoxication ces conc
182. ation n gative entre la mortalit et la croissance figure 9B Ce premier axe prend en compte principalement deux groupes de lectines oppos s sur la carte factorielle C1 un groupe rassemblant les lectines GNA LcH ECA PSA GSII CPA et SJA un second qui comprend les prot ines UEA VVAg VVAm VFA PCA LBA TKA BDA et CSA Ce dernier groupe inclut des lectines n induisant aucun effet toxique mortalit ou croissance m me long terme et forte dose Le premier groupe doit tre consid r avec attention La lecture de la carte factorielle C1 aurait tendance nous amener conclure que les lectines GSII et CPA par exemple pr sentent les m mes propri t s aphidotoxiques Or la statique d inertie nous montre que leurs coordonn es sur la carte factorielle sont quasi identiques uniquement du fait de mortalit s comparables observ es d s les premiers jours quelles que soient les concentrations Mais seule la GSII qui induit une forte inhibition de croissance la dose de 250 ug ml pr sente pour nous de l int r t Cette observation s applique aussi aux lectines SJA et PHA qui se r v lent donc peu int ressantes en terme de toxicit vis vis des pucerons Le second axe prend en compte les variables inhibition de croissance notamment faibles doses et quatre lectines ConA SNA2 TL et MAA Elles induisent un effet sur la croissance d s les faibles doses Cette observation s applique principalement la ConA et
183. atoire Finlande Elev en masse France Myzus persicae Acyrthosiphon kondoi A pisum Cavariella aegopodii M persicae Hyperomyzus lactucae pucerons des c r ales M persicae M persicae Brevicoryne brassicae Aphis gossypii M persicae Therioaphis trifolii f maculata Eucallipterus tiliae T trifolii Tinocallis platani A pisum Eriosoma lanigerum Myzocallis annulatus Schizaphis graminum T trifolii f maculata 1 Q 3 Q 1 Q 1 Q 3 4 1 Q 2 3 4 2 G 2 G Col opt res coccinellides et autres Adalia bipunctata cosmopolite de l h misph re Nord Coccinella septempunctata Coccinella undecimpunctata introduit d Europe en Am rique Cycloneda limbifer exotique de Cuba Propylea quatuordecimpunctata indig ne Semiadalia undecimpunctata exotique d Europe Dipt res Aphidoletes aphidimyza cecidomyiide cosmopolite Lib ration inondative en serre Lib ration inondative en serre Lib ration inondative en serre Lib ration inondative en serre Lib ration inondative Lib ration inondative Lib ration inoculative ou inondative Faune indig ne lev e en laboratoire Faune indig ne lev e en laboratoire Elev e en laboratoire Europe Elev e en laboratoire Europe Elev e en laboratoire Commercialis M persicae et autres pucerons des serres M persicae Macrosiphum euphorbiae Aulacorthum solani M persicae et a
184. avec les sucres de la surface des h maties L tape importante dans l histoire des h magglutinines est la d couverte que certaines d entre elles agglutinent les globules rouges appartenant uniquement un groupe sanguin donn syst me A B O sans affecter les cellules sanguines des autres groupes Renkonnen 1948 Boyd et Reguera 1949 cit s par Pusztai 1991 Cette d couverte am ne Boyd remplacer le terme d h magglutinine par celui de lectine du latin legere choisir pr f rer 25 Cet historique est un bref r sum des synth ses de Kocourek 1986 et Pusztai 1991 des r f rences plus pr cises concernant un point particulier de notre propos pourront donc tre retrouv es dans ces revues 26 En 1982 les termes abrine et ricine furent nouveau pr cis s abrine d signe la toxine d Abrus precatorius la prot ine agglutinante de cette plante tant appel e agglutinine d Abrus precatorius de m me pour Ricinus communis le terme ricine s applique en fait la cytotoxine Jusqu cette date ricine et abrine d signaient des pr parations contenant et la toxine et l agglutinine d o une certaine ambigu t lorsqu on se r f re a la litt rature ant rieure 1982 Kocourek 1986 Chapitre 1 Contexte de l tude 38 pour mettre en avant la propri t de ces mol cules s lectionner sp cifiquement les cellules sanguines Du fait des d couvertes relatives la structure chimique des gly
185. ayed PA NN ELAR SRAREER LORD RRR D d a Na ES 100 Tire n seconds Time and voliage of the canar 369 00 WHI n Serre B 10 pare para TIME 373 2 position 12 CDD C22 Gov Gua eo 0 EU EZ CE LG Next hour 7 Pr sal I on Screen B CC 33963 pai Qj ur Feus sour m 7 previous file To size the height xamw cscol Ta resize the width To mark Lw begining and the resolution of screen I of the seron B ole defined wave of the seccn D or A leZt or right To l a speculied mack ce ail marks Statistiques calcul es par MacStylevt Les statistiques calcul es par Mac Stylet sont pr sent es en tableau un premier tableau de statistiques g n rales et 3 tableaux qui analysent sp cifiquement en terme EPG chaque p n tration du stylet Statistiques Sietisties batasan md 320000 5 90 _ _ 24 Pots ib T ncxecyoengmnz seeoctuanuts 1 T ia 61 1008 E atr 29528 43115 413 22118 n 17447 Joe 3 23 17 34 1 23 41 n 3 9 9 o 2 E 9 Famn stay war nas 1477 115664 9 5415 467 1 191023 0 amp 1239472 Successive peceleiisns tiw parom far phices sccepi am 4 ain No Stork time bee yvousun Li 160 7225 14798 zTr40 44193 265533 Tris 3318 zzn5ia Suc 6 o 1 e i L 5 Ph P G846806006 M 0govouutnonu Et clo ee 93 sir w o0 ooaonon Hs s0000006 wa wn Oovwvdeds EERE EERS E Tis
186. c tique glacial et mis compter dans 4 5 ml de liquide scintillation Emulsifier Scintillator 299 Packard avec une fen tre 14C de pr comptage de 80 d efficacit et affichant un bruit de fond de 20 cpm Le calcul de la radioactivit int gre ce bruit de fond et le signal recueilli pour un chantillon froid puceron scintillant solu ne eau acide ac tique 25 cpm La radioactivit de dix chantillons de 100 nl de milieu standard marqu est mesur e La moyenne calcul e sur ces dix chantillons permet de convertir la radioactivit mesur e pour chacun des extraits de pucerons en nl de milieu ing r Les quantit s moyennes de milieu 60 Compos non assimilable et m tabolisable utilis pour mesurer l ingestion ou les volumes d h molymphe chez diff rents insectes 61 Nous consid rons le volume de miellat rejet par les larves comme n gligeable par rapport celui de l adulte la radioactivit totale mesur e est donc selon notre raisonnement la somme de la radioactivit du puceron et de celle de son miellat N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 95 ing r es par les pucerons de chacune des modalit s sont compar es n 10 ANOVA test de Bonferroni Dunn pour mettre en vidence l effet des diff rentes concentrations de lectines 2 3 2 Taux d ingestion des larves d A pisum intoxiqu es par la ConA Des larves g es de 1 2 h sont transf r es sur des mili
187. chaque jour Au jour J7 les pucerons apt res survivants sont pes s individuellement sur une microbalance Setaram mod le Y 214N Lyon France pr cision 1 ug La toxicit de chaque prot ine est ainsi exprim e in fine par deux indices dont le calcul est pr sent plus loin 1 la CL50 la concentration en prot ine n cessaire pour tuer la moiti des individus de la population initiale J7 2 l IC50 ou l IC20 la concentration en prot ine induisant une inhibition de croissance de 50 96 ou 20 96 J7 par rapport aux individus sur les milieux t moins fiche protocole N 11 2 5 Caract ristiques des lign es de pommes de terre transg niques test es 6 lign es transg niques de pommes de terre ont t test es avec Myzus persicae ou Aulacorthum solani dans le laboratoire de nos coll gues anglais au cours de trois exp riences ind pendantes et r alis es soit par A M R Gatehouse juillet 1993 soit par R Down et moi m me f vrier 94 et janvier 95 Myzus persicae Aulacorthum solani l re s rie 2 me s rie juillet 93 f vrier 94 janvier 95 T moin Xx X X PBG6 47 X X PWG6 85 X X X GNA2 23 X GNA2 28 X GNA2 30 x WAI9 12 X a lign e t moin correspond la vari t D sir e utilis e pour l levage des pucerons et l origine des lign es transform es elle n est cependant pas transform e mais multipli e v g tativement dans les m mes conditions
188. choix de larves de l esp ce A pisum mises en pr sence de deux milieux artificiels de compositions diff rentes par exemple l un contenant de la ConA l autre pas De nombreuses exigences ont d tre 58 en association avec J Q Chen un th sard du laboratoire qui travaille sur un autre mod le plante puceron N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 93 remplies et test es pour que ce test de choix soit fiable Le dispositif d crit sur la figure 23 est le meilleur compromis que nous ayons trouv pour r pondre ces exigences l espace dans lequel les larves sont transf r es est confin 10 x 10 mm mais n entra ne pas de g ne m me tr s mobiles celles ci se fixent donc rapidement sur l un ou l autre des milieux les deux milieux sont suffisamment proches pour que les larves puissent ventuellement se d placer de l un vers l autre avant de faire leur choix comportement d preuve caract ristique des pucerons dans chaque configuration de choix vingt vingt quatre lots de pucerons sont test s pour que les r sultats soient statistiquement exploitables les larves fix es sur l un ou l autre des milieux peuvent tre compt es diff rents intervalles de temps 15 min 48 h sans qu elles soient perturb es en regardant par l extr mit coup e de l eppendorf le nombre de larves dans chaque lot n 6 est d fini de mani re que les diff rences entre les tau
189. cificit osidique Nos exp riences d inhibition comp titive de la toxicit de la ConA par un sucre appropri ne permettent pas de confirmer clairement cette interpr tation Les r sultats obtenus avec la GNA et la NPA nous indiquent cependant que nous ne nous sommes pas plac s dans les conditions exp rimentales id ales pour observer l inhibition attendue de la toxicit concentrations plus fortes en sucre 95 Il est en effet assez tonnant que ces lectines mannose strict n interagissent pas avec le mannose ajout Cette observation pourrait cependant s expliquer par une tr s forte affinit des lectines pour leurs r cepteurs physiologiques ventuellement suivie par une s questration physique internalisation par exemple les soustrayant l quilibre comp titif avec le ligand libre Un immunomarquage sur coupes de larves ayant ing r du milieu contenant la ConA plus un sucre appropri devraient apporter des l ments d observations suppl mentaires L exp rience d inhibition sur coupes devra tre galement reconduite avant que nous ne remettions ventuellement en cause notre hypoth se de travail L intoxication cellulaire par de la Con A est par contre indiscutable Nous pouvons nous demander s il existe une relation entre les fonctions de cellules m sent riques et leur sensibilit la toxine Ces cellules la fois s cr trices et absorbantes offrent des diff rences d une r gion l autre qui refl tent des r le
190. coconjugu s des diff rents groupes sanguins l implication des sucres dans les r actions d agglutination est rapidement soupconn e Apr s l hypoth se mise par Sumner et Howell en 1936 il faut ainsi attendre 16 ans pour que Watkins et Morgan tablissent les fondements de la th orie relative la sp cificit osidique de l inhibition de la r action d h magglutination La multiplication des d couvertes sur les lectines isol es aussi bien de tissus de v g taux sup rieurs que de champignons mais galement partir d animaux d invert br s de bact ries et de virus conduit les chimistes rechercher une d finition pr cise pour les caract riser Goldstein ef al 1980 les d finissent comme des prot ines d origine non immune qui se lient aux glucides agglutinent les cellules ou pr cipitent les polysaccharides ou les glycoconjugu s Cette d finition a t adopt e par le Comit de Nomenclature de l Union Internationale de Biochimie Dixon 1981 Elle implique que les lectines sont multivalentes c est dire qu elles poss dent au moins deux sites de fixation aux sucres leur permettant d agglutiner les cellules v g tales ou animales de pr cipiter les polysaccharides les glycoprot ines les peptidoglycanes ou les glycolipides Le terme origine non immune permet de distinguer les lectines des anticorps anti sucres qui peuvent agglutiner des cellules De plus de nombreuses lectines sont trouv es chez les plantes et le
191. contrairement aux trois esp ces cit es pr c demment ce puceron se caract rise par une grande sp cificit alimentaire il n est en effet inf od qu au genre Lupinus Disposant de pucerons aux r gimes alimentaires tr s vari s du monophage strict au tr s polyphage nous pouvions d s lors observer si cette caract ristique pouvait influer sur le degr de toxicit induite des lectines Pour chacune des six esp ces d Homopt res qui viennent d tre cit es des pr cisions sur leur biologie leurs plantes h tes et les virus qu elles transmettent sont report es en Annexe 1 A F Chapitre 1 Contexte de l tude 18 1 3 Moyens actuels de lutte contre les pucerons Avantages et inconv nients Plusieurs strat gies ont t d velopp es pour combattre les pucerons Tr s rudimentaires il y a encore 50 ans les m thodes de lutte devinrent plus efficaces avec l apparition des produits chimiques de synth se Aujourd hui la lutte contre les insectes fait appel au concept de lutte int gr e Celle ci implique l emploi judicieux et harmonieux de plusieurs moyens de lutte si les pesticides chimiques ne sont pas exclus la lutte biologique et la s lection vari tale classique ou transg n se sont des armes privil gi es Les paragraphes suivants d crivent ces diff rents moyens utilis s pour combattre les pucerons 1 3 1 La lutte chimique une m thode de lutte rapide et efficace Avant la seconde guerre mondiale
192. cr t e La ConA n est pas profil e ou 82 Le milieu Ap2 ne contient pas de prot ines dans sa composition figure 40 profil a Cependant certaines exp riences r v lent quelques contaminations des milieux et donc des miellats correspondants le coulage des milieux en conditions st riles rigoureuses n tant pas syst matiquement r alis pour les exp riences de courtes dur es N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 131 tr s faiblement profil g d tect e dans les miellats La bande not e par la fl che 1 ne correspond d ailleurs vraisemblablement pas la lectine comme les autres bandes mineures d sign es par la fl che 2 elle correspondrait plut t un polypeptide qui serait un produit de d gradation excr tion desquamation des cellules pith liales 3 Il ne semble pas y avoir de polypeptide majeur de d gradation de la conA peu de bandes de faible PM mais seule une d tection sensible par immuno empreinte Western Blot pourrait confirmer ce point 3 1 2 Dosage ELISA d extraits de miellat 1000 A gamme talon DO 450 nm 1 10 Quantit de ConA ng par puits Quantit de ConA dos e ng chelle Log T TT TT 1 T C2 C4C8 T C2 C4C8 T C2 C4 C8 0 24h 24 48 h 48 72 h 3500 1250 3000 en 1000 E 2500 5 v 2000 50 8 B 3 1500 S 500 E 2 1000 ES 2 T Milieu ing r E actin 250 5 500 9
193. croissance induite par la Con A figure 53D Par contre ce sucre semble inhiber compl tement la toxicit de la GNA figure 53E Ces r sultats nous am nent plusieurs r flexions d une facon g n rale les doses de ligands comp titifs utilis es nous semblent assez lev es et nous observons par exemple avec le mannose soit une absence totale de comp tition 1 mM soit une faible lev e de l inhibition la dose la plus lev e pour ConA et GNA et des rapports sucre lectine de plus de 5000 Nous pouvons interpr ter cela soit comme un indice de l existence d une interaction toxique de nature non lectinique soit comme l indice d une tr s forte affinit lectine cible physiologique incapable d tre d plac e m me par de tr s forts exc s de ligands libres 95 le mannane est un polyoside d riv du mannose en l occurence dans nos exp riences isol d une bact rie Saccharomyces cerevisiae M est utilis aux concentrations de 250 ug ml et 2500 ug ml Sur l axe des abcisses de la figure 53D nous exprimons ces concentrations en quivalent molaire de mol cules de mannose mannose moins une mol cule d eau N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 167 2 l autre point important est la r action tr s diff rente de la ConA et de la GNA vis a vis du ligand polyosidique mannane L incapacit de ce dernier a lever la toxicit de la ConA nous ram ne au point pr c dent su
194. ctine Une telle situation si elle tait reproduite in planta pourrait donc affecter fortement la dynamique des populations de pucerons et ainsi le statut h te d une vari t exprimant le g ne de cette toxine Malheureusement cette situation d intoxication aigu in planta constitue encore l heure actuelle un objectif atteindre En effet les taux d expression du g ne de la GNA dans la s ve phlo mienne des plantes transg niques mises notre disposition semblent encore relativement faibles Avant de tester ces plantes avec l esp ce M persicae nous avons observ les effets induits in vitro par la GNA sur ce puceron Des tests de toxicit conduits simultan ment avec la ConA et deux autres lectines mannose strict la lectine de l ail ASA et la lectine de la tulipe NPA permettent une comparaison int ressante de la toxicit de ces lectines sp cificit s osidiques tr s proches Seule la GNA la plus forte concentration 1500 ug ml a un effet marqu sur la survie 42 96 mortalit vs 5 avec la ConA Cette observation confirme avec une autre lectine que Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 88 l esp ce polyphage M persicae est moins sensible a la toxicit des lectines 4 mannose que l esp ce oligophage A pisum En terme de gain de masse toutes les lectines mannose test es induisent un effet significativement d l t re en particulier la plus forte dose Bien que ces
195. ctines du ricin RCA de Phytolacca americana L PW A et de l algue marine bleue Codium fragile Suringar Har Bien que moins toxiques certaines des autres lectines test es la WGA notamment inhibent cependant de plus de 40 la croissance des larves La lectine d Eranthis 32 Ni b Vigna unguiculata L Walp 33 Dans les graines des diff rentes vari t s de Phaseolus vulgaris les concentrations en lectine varient de 1 3 96 Gatehouse ef a 1990b 34 Huesing et al 1991b ont cependant remis en cause ces r sultats sugg rant que la toxicit induite par la toxine purifi e s expliquerait en fait par une contamination des pr parations par un inhibiteur d a amylase o AI 35 Ces m canismes de d toxification serait bas sur 1 une prot olyse partielle des lectines ing r es 2 une incapacit des toxines intactes de passer au travers des pores de la membrane p ritrophique et donc de se lier l pith lium m sent rique 36 La chrysom le macul e du concombre col opt re dont les larves sont des ravageurs majeurs du mais Chapitre 1 Contexte de l tude 48 hyemalis L Salisb EHL se r v le galement toxique pour D undecimpunctata Kumar et al 1993 de m me que la SNA I Gatehouse et al en pr paration Il semble que les lectines galactosamine et glucosamine soient plus particuli rement toxiques pour les esp ces de col opt res tudi es mais des lectines mannose
196. cu artificiel onde pd sur plante Figure 35 Analogie entre le type d ondes pd observable sur les enregistrements EPG d un puceron sur plante et des ondes induites par un puceron sur milieu artificiel Les ondes pd sont corr l es une activit de p n tration des stylets dans une cellule Sur plantes ces ondes sont corr l es une p n tration des stylets dans une cellule vivante La chute de potentiel observ e s expliquerait par la diff rence de potentiel entre l ext rieur de la cellule et son cytoplasme Ce n est bien s r pas le cas en milieu artificiel o l on observe qu une composante r sistive du signal alors qu elle est essentiellement lectromotrice dans les pd de plantes et ses caract ristiques temporelles y sont galement tr s diff rentes ni m me dur e ni m me structure en sous phases figure 35 On peut n anmoins raisonnablement supposer qu il s agit de traces du m me acte comportemental tentative de ponction intracellulaire mais son aspect anecdotique en milieu artificiel nous conduit n gliger cette s quence Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 114 3 3 3 Analyse statistique 3 3 3 1 Choix des variables ou param tres analyser A la suite de l analyse statistique pr liminaire effectu e partir du logiciel MacStylet nous avons choisi des param tres qui permettent soit de qualifier nombre des diff rentes phases soit de quantifie
197. d la dispersion des colonies Miyazaki 1987 2 Avec L3 et L4 larves d apt res du 3 me et 4 me stade N3 et N4 larves pt roth ques du 3 me et 4 me stade VA adulte virginipare apt re VL adulte virginipare ail N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 15 3 ils appartiennent l ordre des H mipt res sous ordre des Homopt res Blackman et Eastop 1985 au m me titre que les cicadelles les psylles les aleurodes ou les cochenilles Blackman et Eastop 1985 Alford et al 1994 Ils se nourrissent tous exclusivement aux d pens des plantes phytophages et poss dent un syst me buccal de type piqueur suceur mari s AEL c noch par E Ce proa Barchal dala parmar seeds sages Lb Dei Lbr ie Pu iat m cane Figure 2 Vue de profil de la r gion ant rieure d Aphis fabae Scop montrant la disposition relative des diff rents l ments de la t te d apr s Weber 1928 cit par Leclant 1981 leurs pi ces buccales sont transform es et adapt es au pr l vement d une alimentation liquide non disponible en surface mandibules et maxilles ont la forme de stylets accol s en faisceau sur leur longueur qui coulissent les uns par rapport aux autres en d limitant les canaux salivaire et alimentaire Canni Ste oe Crud dires Dance Vy gis mred bsd asta nets mao Figure 3 Vue en perspective de l extr mit des stylets d un puceron d apr s Taylor amp Robertso
198. d resistance to organophosphorus and carbamate insecticides the cucumber living form has not this example shows that in certain respects it may be necessary ro consider separate populations of A gossyps as distinct tax onomic entities The literature on A gossypii is extensive see Barbagallo 1966b pp 217 23 and Kranz ef af 1977 pp 328 29 for short introductory accounts 2n 8 Fiche descriptive du puceran du melon Aphis gossypii Glover d apr s Blackman et Eastop 1985 Myzus persicae Sulzer Green Peach Aphid Peach Potato Aphid Plate 81 Appearance in life Adult apterae small to medium sized whitish green pale yelluw green grey greci iiid g ecu pink vr ied wore decply pagiueuted green or magenta in cold conditions rather uniformly coloured not shiny Alatae havea black tenu al dorsal patch on the abdomen unmatures of the alate morph especially in autumn populations are often pink or red In colonies curling young jcaves of peach in spring oc in more dispersed populations on many other plants often on older leaves Apterae and alatae 1 2 2 1 mm Host plants Primary host usually Prunus persica sometimes P migra P manelle and possibly P serotina and pcach a amp mond hybrids Secondary hosts are in over 40 different plant families and include very many economically important plants Virus transmission The most important aphid virus vector shown to be able to transmit well over 100 plant v
199. dae Stary 1988a Cependant des r sultats prometteurs pour lutter contre M persicae ont t observ s en serre avec Aphelinus asychis Walker Ramakers 1989 De nombreuses recherches portent sur l impact de coccinelles Coleoptera Coccinellidae sur les pucerons Iperti 1966 Frazer 1988b Frazer 1988a Mais si diverses esp ces de ces pr dateurs ont t test es avec succ s en France notamment dans des cultures abrit es Moinet 1994 ou en ext rieur comme pour les exp riences de la ville de Caen DDE Caen 1984 leur exploitation commerciale et leur r elle efficacit posent encore des probl mes Rabasse 1985 Cloutier et Cloutier 1992 Maisonneuve 1993 Quoique son usage ne soit pas encore tr s r pandu l esp ce de c cidomyiide Aphidoletes aphidimiza Rondani Diptera Cecidomyiidae est offerte sur le march pour combattre les pucerons en serre dans certaines conditions Markkula et al 1979 Rabasse 1985 Nijveldt 1988 Cloutier et Cloutier 1992 D autres pr dateurs m riteraient d tre plus tudi s les larves de syrphides Diptera Syrphidae par exemple sont extr mement voraces et constitueraient d excellents aphidophages Chambers 1988 Des Neuropt res de la famille des Hemerobiidae ou des Chrysopidae se sont galement montr s efficaces pour combattre des pucerons tels que M persicae et A gossypii et pourraient donc tre aussi exploit s en lutte biologique Lyon 1979 New 1988
200. dans une moindre mesure la MAA Les effets induits par SNA2 ne seront pas comment s car ils sont peut tre biais s par la pr sence d une alt ration des milieux en fin d exp rience La SNAI s av re d ailleurs peu active Les r sultats obtenus avec la lectine de la tulipe TL sont difficilement interpr tables forte inhibition de la croissance aux concentrations a et c faible inhibition la concentration b pas d effet dose clair Le troisi me axe prend en compte les lectines SNAI UDA et RPA L information qu il porte s av re peu int ressante pour l interpr tation de nos r sultats il distingue les lectines pour lesquelles les mortalit s un jour donn dj diff rent fortement entre les concentrations a et c mdja gt mdjc ou inversement L interpr tation globale des informations port es par les deux premiers axes nous am ne distinguer en ombr sur la figure 9C1 et en plus de la lectine de l amaranthe a ConA dont les effets sur la croissance mais non sur la mortalit se manifestent d s les faibles doses a PSA la GNA la GSII l ECA et la LcH dans l ordre d croissant de la valeur de la variable ICc dont les effets se manifestent par une mortalit importante d s les premiers N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 61 jours m me la dose moyenne de 50 ug ml et une forte inhibition de croissance Comme avec la ConA l inhibition de croissance induite
201. de Gauss des figures 36 et 37 rendent compte galement de cette variabilit pour certaines variables Le calcul des rapports de corr lations modalit variable c est dire le pourcentage de la variance d une variable expliqu e par la partition t moin lectine nous indique qu environ N variables 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Nom variables n Nb np Nb C Nb G D np D C D G D G np G C np d G 4h T moin 16 17 664 19 9 3 7 2 805 28 69 14 139 18 100 24 58 5 7 6 29 4 59 12 1 2 6 97 24 ConA400 22 20 6 3 1 23 5 3 3 3 604 1366 86 11 97 15 45 14 42 0 6 1 40 9 4 6 17 1 2 1 45 14 P 52 1 48 6 21 8 33 9 32 8 8 1 4 3 9 6 12 7 13 9 5 3 8 h T moin 16 25 0 4 7 28 5 5 2 4 3 0 7 46 102 19 284386 113 27 62 3 65 25 7 4 6 12 0 2 9 89 18 ConA400 22 29 4 4 2 33 2 4 6 4 9 06 50 7 128 17 2056 5402 477 58 37 8 4 4 14 5 0 7 53 12 P 6 49 7 50 22 7 73 9 38 4 10 5 3 9 10 5 7 1 44 6 9 5 24 h T moin 16 45 6 7 1 50 8 8 0 7 511 8412 195 26 624 103 107 23 61 4 5 7 26 2 4 0 12 3 2 8 97 22 ConA400 22 45 6 5 6 50 5 6 2 6 9 1 0 8965 23467 456 81 8526 48 8 5 0 37 1 3 8 14 2 4 6 81 26 P 6 99 7 97 5 67 6 80 9 43 3 20 1 54 5 10 4 6 1 55 3 65 1 4h T moin 27 8 317 9 7 2 0 2 705 1240 32 8 18403
202. de cette gamme de concentrations d une fa on plus g n rale dans le dernier chapitre de cette th se Bien que toutes les esp ces test es soient fortement affect es la plus forte concentration appliqu e inhibitions de croissance nous observons des relations dose r ponse tr s diff rentes Deux groupes de pucerons apparaissent clairement Les plus sensibles d entre eux sont incapables de survivre jusqu l ge adulte une concentration sup rieure 750 ug ml A pisum et M albifrons Cependant dans ce groupe les r ponses aux faibles concentrations 100 ug ml diff rent sensiblement A pisum est l esp ce la plus sensible dans toute la gamme de concentrations test es alors que le seuil de toxicit pour M albifrons se situe au del de 100 ug ml Globalement le profil des courbes d inhibition de croissance de toutes les esp ces test es peut d ailleurs tre divis en deux traduisant probablement deux phases distinctes dans l intoxication Ceci est particuli rement vrai pour M persicae dans la gamme de concentrations 15 250 ug ml les inhibitions de croissance sont significatives mais elles ne different pas entre elles plateau de toxicit interm diaire Au del de 500 ug ml la croissance est d autant plus faible que la concentration est forte Cette observation explique que l ajustement par une quation du type logarithmique soit un peu meilleur qu un ajustement de Michaelis Ce m canisme d intoxica
203. de prot ases par exemple Gatehouse et Boulter 1983 Broadway et Duffey 1986 Burgess et al 1994 et nous y reviendrons ult rieurement Chapitre 4 amp Discussion finale N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 89 Les premiers tests biologiques effectu s sur des pommes de terre transg niques s av rent tr s variables M persicae et surtout A solani semblent affect s sur les lign es PWG6 85 et PBG6 47 tests de juillet 1993 et f vrier 1994 la pr sence de la GNA diminue significativement les dynamiques de f condit de ces pucerons en retardant leurs pics de reproduction entrainant des rm sur les plantes t moins significativement sup rieurs ceux observ s sur plantes transg niques Dans le cas de M persicae cette diff rence se traduirait en 30 jours par une multiplication th orique par 95 000 de la taille de la population sur les plantes t moins mais seulement de 8 500 10 500 sur plantes transg niques En comparant ces r sultats ceux obtenus sur milieux artificiels et avec les m mes pr cautions que celles avanc es pr c demment nous pourrions estimer que la pr sence de GNA dans la s ve phlo mienne des plantes transg niques induirat les m mes effets qu une concentration d environ 300 ug ml dans une solution standard Ap2 ce qui semble manifestement tr s au dessus de la r alit mesur e par les dosages d intestins de pucerons Nous ne discuterons pas ici des
204. ded protection against aphids Transgenic Res 1994 Vol 4 p 18 25 Hines M E Nielsen S S Shade R E et Pomeroy M A The effect of two proteinase inhibitors E 64 and the Bowman Birk inhibitor on the developmental time and mortality of Acanthoscelides obtectus Entomol exp appl 1990 Vol 57 N 3 p 201 207 Horejsi V Haskovec C et Kocourek J Studies on lectin XXXVIII Isolation and characterization of the lectin from black locust bark Robinia pseudoacacia L Biochem Biophys Acta 1978 Vol 532 p 98 104 Horejsi V et Kocourek J Studies on phytohemagglutinins XVII Some properties of the anti H phytohemagglutinin of the furze seeds Ulex europaeus L Biochem Biophys Acta 1974 Vol 336 p 329 337 Huang H C Harper A M Kokko E G et Howard R J Aphis transmission of Verticillium albo atrum to alfalfa Can J Plant Pathol 1981 Vol 5 p 141 147 Huesing J E Murdock L L et Shade R E Rice and stinging nettle lectins insecticidal activity similar to wheat germ agglutinin Phytochemistry 1991a Vol 30 N 11 p 3565 3568 Huesing J E Shade R E Chrispeels M J et Murdock L L c amylase inhibitor not phytohemagglutinin explains resistance of common bean seeds to Cowpea Weevil Plant Physiol 1991b Vol 96 p 993 996 Hughes R D Biological control in the open field in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1989
205. diff rentielles entre esp ces de Col opt res sont n anmoins d j attribu es ce ph nom ne La toxicit mammalienne de certaines lectines est relev e RCA OSA WGA UDA et doit tre g r e avec pertinence a contrario la possibilit d effets positifs sur la nutrition de mammif res a t observ e et peut servir d attrait suppl mentaire pour ce type de genes 37 Une des deux lectines purifi es de la baie du sureau Sambucus nigra L sp cifique de l acide sialique 38 Sphinx du tabac N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 49 Ces tudes sur les Col opt res et les L pidopt res n ont t suivies que tr s r cemment par des travaux sur les Homopt res Powell et al 1993 La GNA s av re tr s toxique pour un delphacide et une cicadelle du riz N lugens et Nephotettix cinciteps Uhler La WGA montre aussi une toxicit int ressante vis a vis de ces esp ces et d une autre cicadelle Empoasca fabae Harris Habibi et al 1993 Simultan ment une tude de la toxicit des lectines sur les pucerons est initi e dans notre laboratoire Rahb et Febvay 1993 Elle est l origine des travaux pr sent s ici Nous revenons au cours de la pr sentation de notre travail sur les r sultats d crits par K Powell et les chercheurs de son laboratoire d accueil avec lesquels nous avons collabor Les travaux de Rahb et Febvay 1993 montrent qu administr e en milieu artificiel la
206. dit et une alt ration de la dynamique de reproduction rm est observ e sur tous les milieux contenant de la GNA ou de la ConA Avec toutes les pr cautions qui s imposent il est possible d extrapoler les r sultats obtenus in vitro avec ceux susceptibles d tre observ s sur des plantes transg niques exprimant un taux lev le g ne de la GNA Ainsi sur la base des r sultats obtenus sur milieux artificiels sur une p riode de 30 jours la taille d une population de pucerons sur plantes t moins serait potentiellement multipli e par 1200 environ rm 0 238 alors que sur des plantes transg niques exprimant la GNA 450 ug ml 9 4 uM dans la s ve phlo mienne la taille de la population serait multipli e en une m me dur e par un facteur 200 rm 0 176 Ce calcul est bien s r th orique et n glige de nombreuses hypoth ses En particulier il n est pas tenu compte de la diff rence importante de taux d ingestion dans les deux situations plante vs milieu ni des possibles interactions toxicit x tat nutritionnel qui pourraient jouer en faveur d une toxicit accrue sur plante dans la mesure o les milieux artificiels utilis s sont des milieux tr s riches et quilibr s en azote par rapport la s ve phlo mienne Prosser ef al 1992 Douglas 1993 Calatayud et al 1994 Liadouze et al 1995 Ces types d interaction toxine x nutrition ont d j t identifi s pour d autres insectes avec des inhibiteurs
207. dix plantes t moins diff rentes La variable N du tableau 10 indique le nombre de pucerons inclus dans l analyse les individus supprim s 4 5 et 8 respectivement pour les plantes t moins PBG6 47 et PWG6 85 sont morts pr matur ment Nous attribuons cette mortalit aux conditions exp rimentales insecte bless feuille abim e et non aux effets induits par les plantes J6 la survie n est pas significativement diff rente entre les pucerons sur plantes transg niques et ceux sur plantes t moins p gt 5 N anmoins le tableau 10 et la figure 19A indiquent que les pucerons meurent plus rapidement sur les plantes transg niques Mais ces lign es transform es ont surtout des effets marqu s et significatifs au niveau de la f condit L optimum du nombre de larves pondues par femelle et par jour est 4 1 et 4 2 pour PBG6 47 et PWG6 85 respectivement alors que celui de l ajustement obtenu pour les pucerons sur plantes t moins s l ve 5 4 figure 19C Les taux intrins ques d accroissement naturel rm sont galement significativement plus faibles pour les pucerons sur plantes transform es en comparaison de ceux des plantes t moins proc dure de Conover p 5 96 Cependant ces taux ne sont pas diff rents entre PBG6 47 et PWG6 85 p 90 95 La diff rence entre les plantes t moins et les plantes transg niques s explique principalement par le d calage des premiers jours de ponte Cette observation s applique principalement au
208. donn dans les tableaux de r sultats Chaque jour un nouveau lot de jeunes adultes est utilis Tous les r sultats se rapportent donc des pucerons g s de 9 jours exactement 2 4 5 Analyse des donn es EPG Onze variables ou param tres sont consid r es pour analyser le comportement d alimentation des pucerons et sont d finies plus loin tableau 15 Afin de mettre en vidence les effets de l intoxication au cours du temps les analyses statistiques portent sur trois dur es d enregistrement pour chaque puceron 4 8 et 24 heures Une premi re approche analyses univari es concerne la capacit de chacune des onze variables discriminer significativement les deux lots de pucerons Les donn es se rapportant chaque lot sont compar es par un test U de Mann Whitney Une analyse en composantes principales norm e ACPn est ex cut e sur les donn es se rapportant aux enregistrements de 24 h des pucerons du test avec la lectine 600 ug ml Seules cinq variables permettant de discriminer les pucerons intoxiqu s des non intoxiqu s sont prises en compte dans l analyse Tous les calculs et les graphiques sont issus du logiciel ADE 3 6 Chessel et Dol dec 1994 Les figures sont regroup es et mise en page sous MacDrawPro Deux modules d ADE HistoClass et Gaussclass tracent pour chaque variable et chaque lot de pucerons les histogrammes et les courbes de Gauss ce dernier descriptif graphique est donn en annexe
209. e Macrosiphum albifrons clone Ma LLO1 fourni par R Bournoville INRA Lusignan a t captur dans un champ de lupin blanc du Centre de Recherche de Lusignan Il est lev sur Lupinus albus cv Lublanc Le puceron du melon Aphis gossypii clone Ag LMOI fourni par G Labonne INRA Montpellier est lev sur melon Cucumis melo cv V drantais Macrosiphum euphorbiae clone Me LRO1 fourni par Y Robert INRA Rennes est lev sur pomme de terre Solanum tuberosum cv BF15 Aulacorthum solani clone As LO1 a t captur sur des Saint Paulia en 1993 dans la serre du laboratoire et transf r pour l levage sur aubergine cv Violette de Barentane Les pucerons que nous avons fournis au laboratoire de Biologie Mol culaire de l Universit de Durham ont t lev s sur pomme de terre Solanum tuberosum cv D sir e Les plantes de culture ainsi que les levages sont tous plac s dans les conditions d clairage et d hygrom trie d crites pr c demment Fiche N 2 R f rences des lectines v g tales test es sur pucerons Origine v g tale Abr viations R f rences ordre alphab tique d apr s EY Lab Allium sativum ASA purif Amaranthus caudatus ACA E L8201 Arachis hypogaea PNA Y L0881 Artocarpus integrifolia Jacalin L3515 Griffonia Bandeiraea simplicifolia BSII Y L7508 Bryonia dioica BDA E L8002 Canavalia ensiformis ConA E L1104 Cicer arietinum CPA Y L3141 Cytisus scoparius CSA E L3201
210. e voir Mat riels amp M thodes pour les tests appliqu s Le jour Jog correspond la dur e de vie moyenne calcul e la plus courte N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons Hombre total de larresipuceronas initiaur 81 uri 5 ode pucerons 5 25 20 Larres cum wlees pucerons IRitiaur y 10 RENEE TX ARR KKK pontes cumul es T moin 1 PGG6 47 PWGO6 85 0 4 Modalit s PI Lv P2 d P3 mod le observ _ mod le observ mod le T moin 25 8 0 3 25 5 3 2 7 8 0 1 9 2 0 3 0 32 0 02 PBG 47 1 9 0 1 1 6 0 7 8 1 0 1 0 50 0 10 PWG 85 110 4 0 2 9 6 2 0 8 1 0 1 110 6 0 4 0 38 0 04 3 Ajustement effectu B C x P5 y P B x P e 2 1 0 5 10 15 20 25 30 Jours 35 Figure 20 Performances biologiques du puceron commun des serres Aulacorthum solani sur deux lign es de pommes de terre transg niques PBG6 47 et PWGO6 85 la l gende est expliqu e dans le texte l erreur standard est report e pour chaque point de la figure B les valeurs des param tres P1 P2 et P3 observ s ou donn s par le mod le sont pr sent es dans le tableau de la figure C erreurs standards entre parenth ses Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 82 La seconde s rie inclut la lign e PWG6 85 pour confirmation des performanc
211. e aussi bien sur le coton malvac e que sur le melon cucurbitac e C est dans les zones temp r es que l aphidofaune est la plus vari e Mais ces insectes sont pr sents aussi bien sous les climats tropicaux que dans les zones subarctiques Dixon 1987 Strathdee et al 1993 Bale et al 1994 Heie 1994 D un point de vue g n ral les aphides poss dent trois caract ristiques marqu es 1 ils sont paurom taboles leurs diff rents stades larvaires ressemblent aux adultes mis part l absence d ailes d velopp es pour les futurs ail s ont le m me mode de vie se nourrissent de la m me mani re et font les m mes types de d g ts que ces derniers 1 90 des esp ces aphidiennes se nourrissent sur des h tes appartenant au m me genre ou la m me famille de v g taux Chapitre 1 Contexte de l tude 14 Le d veloppement larvaire des esp ces tudi es au cours de notre travail peut tre sch matis L gt L4 VA L L lt N3 gt N4 gt VL 2 ils sont plurivoltins et pr sentent donc plus de deux g n rations par an Leur cycle volutif est h t rogonique c est dire caract ris par l alternance entre une g n ration amphisexuelle comportant des m les et des femelles f condables et une ou g n ralement plusieurs g n rations ne comportant que des femelles parth nog n tiques Les femelles f cond es sont toujours ovipares alors que les femelles parth nog n
212. e de mortalit transformation des pourrentages de mortalit en probits Ce programme calcule l quation de la droite de r gression et les doses temps l tales Giff rents niveaux de mortalit 50 avec leur intervalle de confiance Il r alise le test d ad quation une relation lin aire test du chi2 et le graphe de la droite de r gression avec son intervalle de confiance Le calcul comprend 2 tapes La premi re tape correspond la transformation des pourcentages de mortalit en probits et le caicul d une droite de r gression pr visionnelle non pond r e et ne prenant pas en compte les observations avec ou 100 de mortalit Cette droite pr visionnelle permet Le calcul des valeurs probits pour les observations avec 0 ou 100 ce mortalit et de la pond ration affecter chaqne point La deuxi me tape r alise alors le calcul de la droite de r gression pond r e et de son intervalle de confiance Les personnes int ress es par la th orie de cette m thode se reporteront la publication de Riiss 1935 7 lcs donn es de mortalit analyser doivent tre enregistr es dans un fichier ind pendamment idu programme Toxicologie Ceci est facilement r alisabie l aide d un tableur Excel par cxemple en suivant les instructions ci dessous Les donn es stock es dans un fichier analvsable par Toxicologie comprennent pout chaque test ou lot ligne du fichier la concentration er
213. e riz OCI faibl inhib 0 1 sur Ag cyst ine digestives effets indirects Lectines Lectines galactosamine PHA Phaseolus vulgaris RCA Ricinus communis Lectines glucosamine OSA Oryza sativa WGA Triticum vulgaris UDA Urtica dioica Lectines mannose ConA Canavalia ensiformis mannose glucose GNA Galanthus nivalis mannose PSA Pisum sativum mannose glucose Autres Inhibiteurs d a amylase a AI Inhibiteurs ribosomaux RIP Lipoxygenase Lox prot ines v g tales PHA toxique 596 sur larves de Cm non toxique pour Zs Controverse sur la toxicit de cette lectine RCA tr s toxique pour les larves de Du 10096 mortalit 296 OSA toxique sur Cm Effet identique ceux de WGA WGA retard de d veloppement des larves de Cm 1 UDA Toxique Effet identique ceux de WGA ConA sans effet sur Cm 196 Pas d effet sur Du 296 GNA LC59 0 9 pour Cm PSA sans effet sur Du 196 et 2 LC50 1 5 pour Cm a AI toxique pour Cm 0 5 1 ricine CL5940 00596 Cm Ag PHA pas d effet sur On 296 RCA tr s toxique pour On 10096 de mortalit 296 OSA non test e sur les L pidopt res WGA Tr s toxique pour On 100 mortalit C 2 Pas d effet sur Hv Ms 196 UDA non test e sur les L pidopt res ConA sans d effet sur On 296 GNA non test e sur les L pidopt res PSA pas d effet sur On C296
214. e 30 s ADN ARN et certaines prot ines deviennent bleues 3 Rouge Ponceau Bleu de Heidenhain ROUGE PONCEAU BLEU de HEIDENHAIN ACIDE PHOSPHOTUNGSTIQUE Rouge Ponceau 5 1g Bleu aniline 0 5 g Acide phosphotungstique 2 5 g Acide ac tique 1 ml Orange G 2g Eau distill e 50ml Eau distill e 100 ml Acide ac tique 8 ml Eau distill e 100 ml rouge acide bleu de Icool eau eau phospho eau eau alcool alcool mt distill e POnCeau distill e Eno ouel distill e Heidenhain H distill e 95 100 M tolu ne mont 2 4 min ungs que 2 6 mi 15 20 min 2 2 bains 2 bains Fiche N 27 Pr paration de tampons phosphate Sorensen x M6 zone tampon 5 0 8 2 Solution de Phosphate monosodique x M NaH PO4 2H50 PM 156 x 156 Eau distill e qsq 1000 ml Solution de Phosphate disodique x M Na5HPO 12H50 P M 358 x 358g Eau distill e qsq 1000 ml M lange tampon pH 6 8 7 0 7 2 7 4 7 6 7 8 Phosphate 51 ml 39 ml 28 ml 19 ml 13 ml 8 5 ml monosodique Phosphate 49 ml 61 ml 72 ml 81 ml 87 ml 91 5 ml disodique N B Le phosphate disodique 0 2 M cristallise facilement lors du stockage froid On peut galement pr parer un tampon monopotassique dipotassique Solution de phosphate monopotassique KH PO4 PM 136 x 136g Eau distill e qsq 1000 ml Solution de pho
215. e avant de couler les gels ajouter TEMED 5 ul persulfate 50 ul volume de solution finale 10 ml agiter et remplir les plaques gel d espacement stacking pH 6 8 Tris 0 125 M 4 acrylamide m langer eau distill e 6 1 ml tampon esp 2 5 ml SDS 10 100 ul acrylamide 1 3 ml d gazer a temp rature ambiante pendant plus de quinze minutes juste avant de couler les gels ajouter TEMED 10 ul 0 1 persulfate 50 ul 0 05 volume de la solution finale 10 ml agiter et remplir les plaques 2 Kit de calibration de PM Pharmacia LKB Phosphorylase b 94 kDa Bovine S rum Albumine 67 kDa Ovalbumine 43 kDa Carbonic Anhydrase 30 kDa Soybean Trypsin Inhibitor 20 1 kDa a Lactalbumin 14 4 kDa 3 Solutions utilis es acrylamide solution d acrylamide 30 et de bisacrylamide 0 896 ou bisacryloycystamine 1 35 96 SDS 10 solution de Lauryl sulfate 10 dans l eau tampon s paration Tris base 18 2 g SDS 10 4 ml qsq 100 ml eau pH ajust par HCl pH 8 8 Tris 1 5 M SDS 0 4 tampon espacement Tris base 6 06 g SDS 10 4 ml qsq 100 ml eau pH ajust par HCl pH 6 8 Tris 0 5 M SDS 0 4 persulfate solution extemporan e de persulfate d ammonium 1046 dans l eau TEMED TEMED pour lectrophor se tampon de migration Tris base 3g glycine 14 4 g SDS 10 10 ml qsq 11 eau Tris 0 025 M 0 192 M glycine SDS 0 1 solution de d p t des chantillons Dithiotr
216. e dans le cas de l expression de g nes d origine v g tale 2 les toxines d origine v g tale peuvent tre consid r es comme des g nes naturels de d fense des plantes contre les insectes A cet gard elles sont donc a priori plus m me de servir pour cette fonction ayant d j t partiellement s lectionn es pour cela au cours de l volution 3 en liaison avec l argument pr c dent l acceptabilit par le consommateur de telles plantes transg niques est vraisemblablement meilleure Dans un contexte d interrogation sur les manipulations g n tiques ceci est un argument non n gligeable discussion finale 21 Effets n gatifs sur les performances agronomiques de la plante transform e 4 priori les biologistes mol culaires les consid rent comme n gligeables mais l heure actuelle peu de travaux ont t publi s confirmant ce point de vue Hilder et Gatehouse 1991 Chapitre 1 Contexte de l tude 34 2 3 2 Les g nes d origine microbienne ou animale utilisables en transg n se La premi re toxine entomophathog ne utilis e en transg n se est la toxine de B thuringiensis Depuis 1983 date laquelle Barton et Brill proposent l insertion du g ne de la endotoxine dans les chromosomes d une plante Landry 1992 de nombreuses quipes rapportent le transfert de g nes de toxines sp cifiques aux L pidopt res dans les chromosomes du tabac Barton et al 1987 Vaeck et al 1987 de l
217. e de la masse la plus faible concentration test e 10 ug ml ANOVA test de comparaison a posteriori des moyennes par un test de Bonferroni Dunn pe OOWMLag elja VY De og Coma Mawe maveane mg Ic un 53x91 Mace manane my w w iw m otrermtnution m beetles igo rie i rats 7 rer eph Come nti gt che er eme Lapa 7 Figure 13 Effets de quatre lectines mannose sur la croissance du puceron du p cher Myzus persicae voir le texte pour la signification des abr viations et les calculs d ajustement des donn es Cet effet n est pas observ avec la ConA ni dans le pr sent test avec M persicae ni dans le pr c dent test avec les diff rentes esp ces aphidiennes Ces effets ne sont pas non plus observables avec la RSA la MAA et les deux inhibiteurs de prot ases figure 14 Aux fortes concentrations toutes les prot ines except e MAA entrainent des effets d l t res au niveau de la croissance Ceux ci sont statistiquement significatifs pour les quatre lectines mannose glucose la concentration de 250 ug ml et plus p 0 009 La ConA et la GNA commencent m me tre actives d s la concentration de 50 ug ml p lt 0 05 A l exception de l ASA et de WAI qui n induisent des effets sur la croissance qu la plus forte dose test e et de la MAA qui est ici totalement inactive il est possible de calculer les valeurs des IC50 pour toutes les autres prot ines figures 13 amp 14 Ces
218. e la Concanavaline A sur la croissance de six esp ces de pucerons 62 Figure 12 Taux de survie des larves de l esp ce Myzus persicae sur des milieux artificiels contenant 1500 ug ml de lectine du perce neige Galanthus nivalis GNA de lectine de la jonquille Narcissus pseudonarcissus NPA de lectine de l ail Allium sativum ASA ou de lectine de Canavalia ensiformis CODA iie set re t PER RR SEE PETERE tn trente mn enter Ur Pec rer PEE e 63 Figure 13 Effets de quatre lectines mannose sur la croissance du puceron du p cher Myzus persicae 64 Figure 14 Effets de deux lectines RSA MAA et de deux inhibiteurs de prot ases CpTI WAI sur la croissance du puceron du p cher Myzus persicae sss 65 Figure 15 Effets de doses subl tales de la Concanavaline A sur la survie et la f condit du puceron du pois Acytthosiphonpisum usine er RO RED e TURRIS pde tester Di ee eed 68 Figure 16 Effets de doses subl tales de la Concanavaline A et de la lectine du perce neige GNA sur la survie et la f condit du puceron vert du p cher Myzus persicae ss 72 Figure 17 Quantit s de GNA dos es dans des extraits de tissus foliaires des lign es transg niques PWG6 85 et PBG6 47 plantes t moins var D sir e ss 74 Figure 18 Quantit s de GNA dos es par ELISA dans les tubes digestifs de pucerons de l esp ce Aulacorthum solani into
219. e les premi res pontes 1 0 et 1 3 jour pour GNA2 28 et GNA2 30 respectivement variable d tableau 12 Ce retard de maturit se traduit par un d calage de 1 5 2 jours des pics de f condit obtenus apr s ajustement des donn es figure 21C A contrario nous n observons pas un tel d calage pour la lign e GNA2 23 Les pucerons sur cette lign e s av rent encore bien plus performants que les pucerons t moins et nous aurons soin d en reparler en discussion finale Modalit s T moin GNA2 23 GNA2 28 GNA2430 PWG6 85 WAI9 12 Prot ines exprim es GNA GNA GNA GNA WAI non chitinase exprim e N nombre de larves dans la population Jo 57 33 45 35 38 44 Effets masse moyenne Jg ug 556 24 a 545 29 ab 536 27 ab 430 27 b 532 25 ab 565 18 a sur les masse rapport e au t moin 100 98 96 77 96 102 larves n nombre de pucerons inclus dans l analyse ult rieure 17 15 20 22 23 21 masse moyenne Jg des pucerons retenus 699 49 a 537 86 ab 570 47 ab 465 32 b 563 32 ab 625 29 ab masse rapport e au t moin 100 77 82 67 81 89 Survie Dv dur e de vie moyenne 31 5 0 4 31 1 0 5 31 5 0 4 31 5 0 3 31 8 0 1 31 4 0 5 Effets Croissance d dur e de la p riode pr reproductive 13 1 0 2 a 12 9 0 3 a 14 1 0 2 b 14 4 0 2 b 13 4 02 a 13 2 0 3 a sur Dr dur e de la p riode reproductive 17 4 0 5 ab 18 1 0 6 a 16 7 0 5
220. e porte sur la Concanavaline A lectine de Canavalia ensiformis L DC ConA qui est une lectine mod le tr s tudi e du point de vue biochimique et la lectine du perce neige Galanthus nivalis L GNA dont les caract ristiques en font un bon candidat l application envisag e Nous mettons en vidence une variabilit de la toxicit des lectines mannose chez six esp ces de pucerons La ConA est moins active sur les esp ces polyphages Elle n est pas phagor pulsive pour notre puceron mod le Acyrthosiphon pisum Harris et agit en quelques heures aux doses moyennes notamment en inhibant l ingestion Une adaptation comportementale moyen terme 24 h 48 h est galement mise en vidence Des techniques de marquage r v lent que la cible physiologique primaire de la ConA est la portion ant rieure du m sent ron Elle s y fixe en tr s grande quantit Apr s liaison aux cellules pith liales la lectine induit une hypertrophie de ces cellules et un d tachement de leur membrane apicale Des exp riences de comp tition lectines mannosides indiquent que la liaison toxine pith lium ne semble pas d pendre uniquement d une interaction sucre lectine Nous observons galement une forte perturbation du m tabolisme des acides amin s des pucerons Le mode d action de la ConA et de la GNA diff rent sensiblement sur ce point Les premiers tests biologiques effectu s sur des pommes de terre transg niques exprimant de mani re con
221. e que les h magglutinines pr sentent aussi la propri t d tre antig niques C est d ailleurs par des exp riences avec ces deux mol cules qu Ehrlich tablit certains des concepts fondamentaux de l immunologie En 1902 Landsteiner d montre la r versibilit de l interaction entre la ricine ou l abrine et les rythrocytes Quelques ann es plus tard en 1908 Landsteiner et Raubitschek mettent en vidence que toutes les h magglutinines ne sont pas n cessairement aussi toxiques que la ricine ou l abrine Par exemple les agglutinines isol es du haricot commun Phaseolus vulgaris L du pois Pisum sativum L ou de la lentille Lens culinaris Medick sont des prot ines solubles dans l eau et relativement peu toxiques Nous savons aujourd hui qu il est possible de trouver de telles prot ines h magglutinantes dans les v g taux sup rieurs de tout groupe taxonomique Les recherches sur la Concanavaline A de la l gumineuse tropicale Canavalia ensiformis sont initi es en 1916 par Jones et Johns Trois ans plus tard Sumner r ussit obtenir la forme cristallis e de cette prot ine Il faut cependant attendre 1936 pour avoir une description d taill e de ses propri t s h magglutinantes et de sa capacit pr cipiter les polysaccharides Sumner et Howell 1936 cit s par Kocourek 1986 Sur la base de leurs observations ces auteurs mettent les premiers l hypoth se que l agglutination r sulte de la r action de la lectine
222. e r sistance du melon au puceron Aphis gossypii intervention potentielle des prot ines phlo miennes rapport technique DEA Anal yse et Mod l isation des Syst mes Biologiques Univers Sc Lyon I 1992 Fiches Protocoles Fiche N 7 Origines et levage des pucerons Le puceron du pois Acyrthosiphon pisum a t initialement introduit dans le Laboratoire de Biologie Appliqu e de l INRA INSA de Lyon par un chantillon collect sur luzerne en 1986 Rahb ef al 1988 Ce clone Ap LLOI poss de les caract ristiques nutritionnelles du biotype nomm Lusignan Srivastava et al 1985 Febvay et al 1988 et a t appel LLO1 Les pucerons sont lev s sur des jeunes f ves Vicia faba cv Aqualduce 21 C en lumi re artificielle 16 h jours 8 heures nuit et 60 70 d hygrom trie Les f ves sont utilis es un ge de 3 5 semaines Le puceron du p cher Myzus persicae est lev sur f ve dans les m mes conditions qu A pisum depuis sept ans Ce clone Mp LBO1 est issu d une fondatrice captur e l INRA de Bordeaux sur Prunus persica en 1989 Cette souche a t utilis e pour les tests d intoxication aigu Les pucerons ayant servi pour les tests sur plantes transg niques sont d une origine diff rente Ils ont t fournis au laboratoire de Biologie Mol culaire de l Universit de Durham par le Scottish Crops Research Institute Invergowerie Dundee UK et ont t lev s sur chou cv Chines
223. e rat 30 es lectines sont g n ralement pr sentes en grande quantit dans les graines et plus faciles purifier Chapitre 1 Contexte de l tude 46 d fense des lectines contre certains champignons pathog nes est cependant d montr sugg rant qu une des fonctions des lectines est de prot ger les plantes de ces champignons au moment de l imbibition de la germination et des premiers stades de d veloppement Etzler 1986 La r sistance de certaines plantes aux infections bact riennes se trouve galement li e la pr sence de lectines qui interviendraient dans un processus de reconnaissance et d encapsulation de ces agents infectieux 2 au contraire d autres tudes sugg rent que les lectines favorisent l invasion des plantes par des pathog nes en servant de r cepteurs pour des phytotoxines ou de mol cules d adh sion pour le pathog ne L infection de la canne sucre par le champignon Helminthosporium sacchari est un exemple de ce type de pathog n se Etzler 1986 3 la symbiose entre les bact ries du genre Rhizobium et les L gumineuses est un processus complexe qui s tablit en plusieurs tapes adh sion de la bact rie aux racines internalisation et nodulation Elle conf re aux L gumineuses la propri t de fixer l azote atmosph rique Ce processus requiert un haut degr de sp cificit un souche de Rhizobium peut noduler uniquement certaines l gumineuses Une litt rature abondante fait
224. e solution acide de fa on ce que ces groupements soient compl tement charg s par Ht A la r sine sous forme H est ajout e la solution acide pH 2 5 du m lange d acides amin s maintenant les aminoacides sous forme de cations Sous cette forme ils ont tendance d placer les protons li s aux particules de r sine et donc s y fixer L importance des d placements varie faiblement selon les diff rents aminoacides en raison des diff rences l g res dans leur degr d ionisation A pH 2 5 la plupart des acides amin s basiques lysine arginine et histidine sont solidement li s la r sine par des forces lectrostatiques et les plus acides acide glutamique et acide aspartique sont les moins li s Lorsqu on augmente graduellement le pH la temp rature et la concentration en lithium des tampons aqueux d lution les aminoacides acides migrent dans la colonne des vitesses diff rentes et peuvent tre parfaitement s par s Le cycle d analyse comprenant la r g n ration dure environ 2 h l arginine luant en 125 min Ils sont analys s quantitativement en sortie de colonne par une r action la ninhydrine et un d tecteur spectrophotom trique double longueur d onde autoanalyseur System 6300 Beckman Inc USA 2 5 2 Pr paration des extraits de miellat et de pucerons entiers pour les dosages des acides amin s libres Des jeunes adultes 5x25 sont transf r s sur des milieux standards Ap2 contenant
225. e statistiquc des enregistrements EPG r alis s avec A pisum sur milieux standards simples ou contenant 400 ugm de ConA Histogrammes et courbes de Gauss par modalit t moin amp ConA4 00 pour une dur e d acquisition de 24 h pour chacune des 11 variables 1ctcnucs dans l analyse varll varl0 var8 ConA 400 24h ConA400 1200 E a Ju 5 5 4 e a 3 d 3 Annexe 10 R sultats de dosages ELISA r alis s sur une gamme de Concanavaline A 0 01 10000 ng puits avec 3 concentrations diff rentes de conjugu anti ConA secondaire biotinyl La proc dure suivie est d crite dans les fiches protocole N VA amp 9B 1000 1000 10 2 5 pe ml 0 1 pe ml T minn tage 3 unison avidire ConA 01 0 5 cunjugue voujusu x 0 01 e g 8 8 E 8 8 100 XX 200 100 0 wu pep od Concentration en cntigene ng puits 100 1 Annexe 11 Kepr sentatian sch matique de tubes digestits de diff rentes especes apbidienres Ponsen 1987 Le od out EUOLTEPAMAqgE jo Ja 2p TREIGT TACT SLAT LLET Wasuag Hiao gy To mepris DEAN A D por torse pepmird yy jb smeeppfass cup pe amey SOUSSE cup jo Bue rses asraamtyg arzjag sconk sd ap jq pum isnanuury sgu snz4urojdZ4 g tisureg sasopdunenQ rmuiagspeg 0 tppugseup sens srqdnssqesgng 0 tuo Hage hante ar 3 Musee npydoxap saxo y po weed anaip ap Jo ucrjsqguraesadel ar enzaqos nureg COLE Hp
226. eTBS SNC Un ringage est ensuite effectu avant l incubation dans du TBS SNC contenant l anticorps secondaire biotinyl ch vre anti IgG lapin Apr s un nouveau rin age le complexe avidine peroxidase est mis en contact La ConA coupl e la peroxidase est r v l e par le substrat diaminobenzidine DAB Les coupes sont color es au bleu de toluidine 1 o pH 4 5 avant d tre observ es Dialux 20 et photographi es Avant immunod tection certaines coupes de larves intoxiqu es par la ConA 200 400 ou 800 ug ml ont t incub es pendant 2 h dans une solution de TBS contenant 10 ug ml d a m thyl mannoside Nous esp rions ensuite observer une diminution plus ou moins compl te de l intensit de coloration des coupes apr s immunomarquage 2 4 Microscopie lectronique transmission MET Nous avons recherch les effets ventuels de la Concanavaline A sur l ultrastructure des cellules pith liales du tube digestif de l esp ce A pisum Ces investigations sont men es sur des larves et non sur des adultes principalement pour des raisons pratiques Apr s plusieurs essais infructueux il s est av r impossible d obtenir une bonne fixation des adultes entiers avec l abdomen ouvert pour favoriser la p n tration des fixateurs Une am lioration de la technique aurait du tre obtenue en diss quant le tube digestif pour ne fixer que cet organe Mais nous n avons pas obtenu un gain sensible de la qualit des coupes r
227. eable de la PHA 5 et plus de la quantit intub e dans l estomac traverse l pith lium intestinal et peut tre d cel e par des m thodes immuno cytochimiques dans les lysosomes et les vacuoles de la r gion du corps de Golgi des ent rocytes Lorenzsonn et Olsen 1982 Luly et Emmelot 1975 quant eux d montrent que la ConA inhibe in vitro la Na K ATPase des membranes des h patocytes de rat Enfin il est important de noter que la lectine est tr s r sistante la prot olyse intestinale Nakata et Kimura 1990 1991 retrouvent ainsi plus de 90 de la ConA intacte dans les f ces de rat La multiplicit de ces observations r sum es dans les annexes 3A amp 3B d montre que le mode d action des lectines au niveau cellulaire est encore imparfaitement compris Nous ne disposons d aucune information sur ce mode d action chez les insectes Gatehouse et al 1984 avancent n anmoins une hypoth se reprenant les observations faites sur le rat pour expliquer la toxicit de la PHA vis vis de la bruche Callosobruchus maculatus Les tudes toxicologiques effectu es sur des mammif res constituent donc nos seules r f rences pour tenter de comprendre le mode d action de la ConA sur A pisum N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 123 Notre objectif est de d terminer dans un premier temps quel niveau la ConA agirait dans le tube digestif puis de d crire les l sions qu elle induit e
228. elle du tableau 6 N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 41 pr sentons le mode d action des lectines mannose glucose chapitre 4 Vu le contexte de notre tude nous nous attachons plus particuli rement sur les fonctions connues ou hypoth tiques des lectines dans les plantes 3 2 1 Les caract ristiques physico chimiques des lectines De nombreuses lectines purifi es ce jour comprennent des sucres li s de fagon covalente la chaine polypeptidique et sont de ce fait des glycoprot ines Pusztai 1991 Ce n est cependant pas le cas de toutes les lectines Ainsi la ConA et la GNA que nous avons tudi es ne sont pas glycosyl es Olson et Liener 1967 Shibuya et al 1988a La masse mol culaire des lectines varie norm ment d une mol cule l autre L agglutinine d Urtica dioica L UDA la lectine la plus petite isol e ce jour a une masse mol culaire de l ordre de 8 9 kDa Broekaert et al 1989 alors que celle de l une des lectines isol es de Phaseolus lunatus L est de 245 kDa EY Laboratories Inc San Mateo CA 94401 Except e ce jour l UDA toutes les lectines sont constitu es d au moins deux sous unit s Ainsi la ConA t tram re de 106 kDa est constitu e de quatre sous unit s identiques de 26 5 kDa Pour cette lectine l association de ses sous unit s est d pendante du pH en dessous d un pH de 5 6 seules deux sous unit s s associent pour former un dim
229. entaire des pucerons 92 Chapitre 3 Effet des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 1 Introduction Dans ce chapitre nous abordons la premi re tape de notre tude visant caract riser le mode d action des lectines sur les pucerons Avant de nous int resser aux cons quences physiologiques de l ingestion de lectines mannose glucose chapitre 4 nous avons recherch les effets sur le comportement d alimentation des pucerons Cette approche vise r pondre un objectif principal formuler des hypoth ses expliquant le mode d action de la Concanavaline A au niveau tissulaire et permettant de fixer les orientations de notre travail Il faut signaler ici que dans le courant de notre travail de th se nos coll gues de Durham avaient mis en vidence un effet de la GNA sur l ingestion de la cicadelle N lugens Powell et al 1995b et mis l hypoth se que ces lectines pouvaient agir en tant qu antiapp tants anti feeding compound Il nous a donc sembl pour des raisons que nous discuterons en fin de chapitre qu il tait essentiel de mieux caract riser les donn es relatives ce type d effet tant au point de vue des doses utilis es de la dynamique de la r ponse que de la finesse de la description de l alt ration comportementale Trois techniques compl mentaires sont donc mises en oeuvre notamment pour r pondre une question r currente dans ce chapitre les pucerons et A pisum en par
230. entrations puis dans une gamme moyenne l IC est stable 50 96 et forte dose elle est tr s toxique La GNA et la NPA pr sentent un seuil d intoxication partir des doses moyennes Ceci sugg rerait des m canismes d action diff rents Mais il serait pr matur d avancer des hypoth ses plus pr cises Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 164 Mr Masse moyenne rapport e au t moin 956 0 02 1 Concentration en lectine UM chelle Log Masse moyenne rapport e au t moin 96 0 1 5 30 Concentration en lectine uM chelle Log Figure 52 Comparaison des effets de lectines mannose glucose sur la croissance A du puceron du pois Acyrthosiphon pisum B du puceron du p cher Myzus persicae Concentrations inhibitrices exprim es en moles ml de milieu N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 165 Masse moyenne J 7 M t moin Masse moyenne 147 55 t moin Masse moyenne 147 55 t moin 100 oo a A N 100 oo e a e I o N e 80 60 40 20 ConA mannose mannose ConA 1 5 uM mannose GNA mannose mannose GNA 8 uM mannose NPA mannose i o mannose 0 1 NPA 13 7 uM mannose 1 Concentration en mannose mM chelle Log x 0 1 ConA mannane
231. epr sentent au mieux la r alit Les repr sentations sch matiques des coupes longitudinales ou transversales des figures 44 45 et 54 sont le fruit du remarquable travail de Ponsen 1972 3 1 4 1 Le stomodeum Le stomodeum est un tube fin uniforme s tendant de la bouche au m sent ron Il semble donc constitu uniquement d un oesophage not oe sur la figure 43 Nous ne distinguons pas de dilatation stomod ale ou de diverticules signalant la pr sence d un jabot L oesophage est constitu d une simple couche de cellules pith liales squameuses qui s cr tent une intima chitineuse figure 45A La valvule oesophagienne est une invagination de l oesophage dans l estomac Elle est constitu e de deux couches cellulaires la couche int rieure est la continuit de celle de l estomac la couche ext rieure est constitu e de cellules quasi cubiques Ces deux couches sont s par es par un espace contenant un mat riau fibrilleux Bien que non li e des fibres musculaires la fonction de la valve est vraisemblablement d emp cher le flux retour de l aliment liquide de l intestin moyen vers l intestin ant rieur N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 135 boucle thoracique oesophage proctodeum rectum estomac intestin boucle abdominale Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 136 3 1 4 2 Le m sent ron Le m sent ron constitue la plus grande
232. er N WV co ox a oun Asn Glu Gin Q O Pro Gly Ala Val Cys O 1 O Met 5 d Ile D P Leu Tyr o Phe Q Balatyr o O O Try Orn Q Lys His e e Q Arg O 1 o chelle C 250 100 Figure 49 Repr sentation sch matique et synth tique des r sultats du dosage par chromatographie des acides amin s libres de miellats de pucerons laiss s 48 h sur des milieux Ap2 contenant de la ConA ou de la GNA Valeurs dos es pour chaque acide amin rapport es la valeur des t moins tableau de donn es relatives rapport es aux acides amin s totaux Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 158 3 2 2 2 Dosage des acides am
233. er 1987 Vol 2A p 197 208 Dixon H B F Defining a lectin Nature 1981 Vol 292 p 192 Dobbins J W Laurenson J P Gorelick F S et Banwell J E Phytohemagglutinin from red kidney bean Phaseolus vulgaris inhibits sodium and chloride absorption in the rabbit ileum Gastroenterology 1986 Vol 90 p 1907 1913 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 183 Dong T X Ng T B Wong R N S Yeung H W et Xu G J Investigation of hemagglutinating activity in seeds of various Trichosanthes species Family Cucurbitaceae and comparison of lectins isolated from seeds and tubers of Trichosanthes kirilowii Int J Biochem 1993 Vol 25 N 3 p 411 414 Douglas A E The nutritional quality of phloem sap utilized by natural aphid populations Ecol Entomol 1993 Vol 18 N 1 p 31 38 Dreyer D L et Jones K C Feeding deterrency of flavonoids and related phenolics towards Schizaphis graminum and Myzus persicae aphid feeding deterrent in wheat Phytochemistry 1981 Vol 20 p 2489 2493 Edelman G M Cunningham B A Reeke G N Becker J W Waxdal M J et Wang J L Covalent and three dimensionnal structure of Concanavalin A Proc Natl Acad Sci USA 1972 Vol 62 p 2580 2585 Efron B The jackknife the bootstrap and other resampling plans Philadelphia Society for industrial and applied mathematics SIAM Ed J W Arrowsmith 1982 Vol 1 92 p Eisemann C H Donaldso
234. er D Edwards G A Gatehouse A M R Gatehouse J A et Hilder V A Additive protective effects of different plant derived insect resistance genes in transgenic tobacco plants Crop Protection 1990a Vol 9 p 351 354 Boulter D Gatehouse A M R et Hilder V A Engineering enhanced natural resistance to insect pests a case study Plant Gene Transf 1990b Vol 129 p 267 273 Bourne Y Roug P et Cambillau C X ray structure of a man 1 3 B Man 1 4 GlcNac lectin complex at 2 1 A resolution J Biol Chem 1990a Vol 265 N 30 p 18161 18165 Bourne Y Roug P et Cambillau C X ray structure of a biantennary octasaccharide lectin complex refined at 2 3 A resolution J Biol Mol 1992 Vol 267 N 1 p 197 203 Bourne Y Roussel A Frey M Roug P Fontecilla Camps J C et Cambillau C Three dimensional crystal structures of complexes of Lathyrus ochrus isolectin I with glucose and mannose fine specificity of the monosaccharide binding site Proteins 1990b Vol 8 p 365 376 Bowers W S Nishino C Montgomery M E et Nault L R Structure activity relationship of analogs of the aphid alarm pheromone E D farnesene J Insect Physiol 1977 Vol 23 p 697 701 Bradford M M A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding Anal Biochem 1976 Vol 72 p 248 254 Brewer C F Bhattacharyya L Brown R D et Koe
235. er S A Plaisted R L et Tingey W M Heritability of trichome density and droplet size in interspecific potato hybrids and relationship to aphid resistance Crop Sci 1984 Vol 24 p 320 322 Metcalf R L et Luckman W H Introduction to insect pest management New York Ed Wiley 1982 2ed 577 p Miles P W Feeding process of Aphidoidea in relation to effects on their food plants in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1987 Vol 2A p 321 340 Miles P W The responses of plants to the feeding of Aphidoidea principles in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1989 Vol 2C p 1 22 Miles P W Aphid salivary secretions and their involvement in plant toxicoses in Aphid plant genotype interactions Amsterdam Campbell R K Eikenbary R D Ed Elsevier 1990 p 131 147 Miller R P The jackknife a review Biometrika 1974 Vol 61 N 1 p 1 15 Mittler T E Applications of artificial feeding techniques for aphids in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1987 Vol 2B p 145 170 Miyazaki M Forms and morphs of aphids in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1987 Vol 2A p 27 50 Moinet M L L industrie des pr dateurs Sc Vie 1994 Vol 920
236. eron du pois Acyrthosiphon pisum a cellule pith liale de l estomac b membrane apicale d une cellule pith liale de l estomac c microvillosit s des cellules pith liales de l intestin 1 re partie l lumi re m mitochondrie mv microvillosit s N noyau chelle donn e sur chaque coupe Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 150 Les observations effectu es au microscope lectronique apportent une vision plus d taill e de l organisation d une cellule pith liale de l estomac planche V A Nous nous sommes int ress s en particulier aux microvillosit s de la bordure stri e Dans l estomac elles apparaissent relativement courtes 1 um et de formes irr guli res B alors que dans l intestin partie 11 dans les replis elles sont deux trois fois plus longues 3 4 um et de forme homog ne C Ces coupes effectu es sur des larves t moins sont compar es des coupes r alis es sur des larves intoxiqu es la concentration de 400 ug ml Les microvillosit s de l intestin ne pr sentent aucune l sion donn es non montr es mais l immunocytochimie montre qu cette concentration la lectine ne transite pas jusque l Elle ne peut donc pas y induire d ventuels effets sur la structure des microvillosit s Nous observons sur la planche VI deux phases du remplacement d une bordure stri e l ancienne membrane apicale et ses villosit s se distinguent clairement au dess
237. erties functions and applications in biology and medecine Orlando USA Irvin E Liener Nathan Sharon Irwin J Goldstein Eds Academic Press Inc 1986 Vol 560 p Lis H et Sharon N Biological properties of lectins in The lectins properties functions and applications in biology and medecine Orlando USA Liener LE Sharon N Goldstein I J Acadamic Press Inc 1986 p 266 293 Lord J M Roberts L M et Robertus J D Ricin structure mode of action and some current applications FASEB J 1994 Vol 8 N 2 p 201 208 Lorenzsonn V et Olsen W A In vivo responses of rat intestinal epithelium to intraluminal dietary lectins Gastroenterology 1982 Vol 82 p 838 848 Loris R Casset F Bouckaert J Pletinckx J Daothi M H Poortmans F Imberty A P rez S et Wyns L The monosaccharide binding site of lentil lectin an X ray and molecular modelling study Glycoconjugate J 1994 Vol 11 N 6 p 507 517 Lotan R Cacan R Cacan M Debray H Carter W G et Sharon N On the presence of two types of subunit in soybean agglutinin FEBS L 1975 Vol 57 p 100 103 Lotan R Siegelman H W Lis H et Sharon N Subunit structure of soybean agglutinin J Biol Chem 1974 Vol 249 p 121 124 Luly P et Emmelot P Studies on plasma membranes XXIII Hormone like action of Concanavalin a on plasma membranes inhibition of Na K ATPase Chem Biol Interaction 1975 Vol 11 p
238. es structure et fonctionnement des membranes Tableau 7 Exemples de propri t s biologiques des lectines et des applications qui en r sultent d apr s Lis amp Sharon 1986 Mitog nicit Certaines lectines peuvent stimuler les mitoses des lymphocytes ou l induction de transformations blastiques La ConA et la PHA la lectine du haricot commun Phaseolus vulgaris sont en particulier des lectines mitog nes qui font l objet de nombreux N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 45 travaux en immunologie Ces lectines provoqueraient une transformation des lymphocytes apr s reconnaissance d un r cepteur sp cifique leur surface Toxicit vis vis des mammif res les lectines font l objet de nombreuses tudes toxicologiques Depuis des ann es elles sont en effet retrouv es dans beaucoup de plantes destin es l alimentation animale ou humaine la lectine de la l gumineuse tropicale Canavalia ensiformis n est qu un exemple parmi d autres et induisent fr quemment une diminution de la valeur nutritionnelle des mati res premi res v g tales qui en contiennent Jaff et Seidl 1992 Les haricots contiennent ainsi des fractions prot iques h magglutinantes qui affectent la croissance et peuvent causer la mort d animaux qui en consomment Le mode d action des lectines n est qu imparfaitement connu Les travaux d quipes comme celle d A Pusztai permettent cependant d avancer quelques hypoth
239. es tudes fines de synergie Mais l impossibilit actuelle d un levage continu en milieu artificiel est un r el obstacle l approche volutive du probl me de contournement des r sistances transg niques chez les pucerons et aux exp riences moyen terme A plus long terme des tudes sur la nature biochimique des r cepteurs mis en jeu dans l intoxication pourront tre entreprises L isolement des prot ines de la bordure stri e par exemple celles excr t es dans le miellat par Western Blot d p t et transfert sur membrane de nitrocellulose apr s lectrophor se puis le marquage avec une lectine biotinyl e est une technique couramment utilis e pour caract riser les glycoprot ines membranaires Elle pourrait tre appliqu e avec la ConA ou la GNA Nous pouvons aussi envisager d isoler les r cepteurs par chromatographie d affinit en vue de leur caract risation biochimique C est initialement ce qui tait pr vu dans la partie finale de cette th se N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 179 Nous avons fait remarquer pr c demment l importance de conduire des tests in planta en atmosph re contr l e pour extrapoler les r sultats obtenus sur milieu artificiel Mais l ultime tape des essais en plein champs pourra seule permettre de juger de l efficacit de la strat gie mise en oeuvre La disponibilit de plantes transg niques exprimant la lectine avec un promoteur ad qua
240. es concentrations en toxine Mais si nous savons que la lectine est capable de s accumuler et de se fixer dans l intestin notre travail ne nous permet pas d affirmer que l ensemble du m sent ron est atteint L analyse des pools d acides amin s libres s av re souvent assez complexe En effet cet outil diagnostic refl te un quilibre global synth ses catabolisme excr tion compartimentations dont il peut tre difficile de distinguer des l ments directement interpr tables Lorsque cela est possible comme nous allons le tenter ici il faut galement garder l esprit que l interpr tation propos e si coh rente soit elle peut ne pas tre la seule possible et donc ne repr senter que partiellement la r alit Quoiqu il en soit de l interpr tation physiologique sous jacente il ressort de cette exp rience que les situations analys es peuvent tre distingu es assez clairement par leurs profils d acides amin s tant au niveau des pools libres totaux que pour ceux pr sents dans les miellats excr t s Ceci ressort de la distribution graphique des classes et des individus dans les figures 48 et 50 ou seules les modalit s de l effet probiotique de la GNA semblent difficiles d m ler que ce soit dans les miellats figure 50B ou dans les libres totaux figure 48B La puissance de cet outil semble donc a priori satisfaisante Un autre point technique souligner est la reproductibilit des r sultats pour la si
241. es de soude N pour claircir la solution Refroidir On obtient ainsi une solution stock de paraformald hyde 20 96 d osmoralit 3 800 mOsM environ conservation un mois au r frig rateur Tetroxyde d osmium Formule OsO4 PM 254 Improprement appel acide osmique il est commercialis pur cristallis en ampoule de 0 25 g 0 5 g 1 g 5g T troxyde d osmium 4 Bien laver deux ampoules d OsO4 de 0 5 g Dans un flacon fermant herm tiquement et tr s propre verser 25 ml d eau distill e Sous la hotte poser l ampoule sur un papier filtre et la strier transversalement l aide d une pointe de diamant chauffer au rouge une baguette de verre et l appliquer rapidement sur la strie l ampoule doit de briser sinon r p ter l op ration Transf rer tous les morceaux des deux ampoules et les cristeaux d OsO dans le flacon Laisser dissoudre une nuit temp rature ambiante La solution se conserve dans une double enceinte bien ferm e Fiche N 22B Fixation et d shydratation des larves de pucerons en vue d observations en microscopie lectronique a transmission Solution de d part M lange final peut se conserver a pr parer extemporan ment Fixation ald hydique 1 volume de glutarald hyde 4 LR 100 mOsM 1 volume de paraformald hyde 2 0 5 100 mOsM 2 volumes de tampon phosphate 0 2 M 0 1 M 200 mOsM mono Na diK pH 7 4 Osmolari
242. es ci les cystatines et les serpines sont majoritairement mises en vidence chez les plantes Ceci explique que les travaux visant tester l efficacit d IP pour prot ger les plantes de l attaque des insectes ravageurs aient principalement fait appel a des g nes d origine v g tale de ces deux classes Broadway et al 1986 Gatehouse et al 1991a Gatehouse et al 1992 Bonad Bottino 1993 Hilder et al 1993 Les IP v g taux sont de petites prot ines comptant une centaine d acides amin s Les serpines sont les mieux connues et sont r parties en sept familles suivant des homologies de s quences 1 inhibiteur de trypsine du soja Kunitz 2 Bowman Birk 3 inhibiteurs de trypsine de l orge 4 inhibiteurs de la pomme de terre I PI I 5 inhibiteurs de la pomme de terre II PI ID 6 inhibiteurs des cucurbitac es 7 inhibiteurs bi fonctionnels de mais Ragi I 2 En revanche les cystatines sont regroup es dans une seule famille qui sera sans doute appel e tre subdivis e lorsque de nouvelles s quences auront t isol es Les IP ont pour cible primaire les prot ases digestives des insectes et se comportent comme des analogues de substrat une fois reconnus par les prot ases ils forment avec elles des complexes non convalents stables emp chant leur dissociation ult rieure et la lib ration de l enzyme Bode et Huber 1992 L effet d l t re des IP a t principalement tudi avec des serpines sur des la
243. es de 6 8 um d paisseur Celles ci sont color es apr s d paraffinage au bleu de Toluidine et par un m lange Rouge Ponceau Bleu de Heidenham La fiche protocole N 20 donne plus de d tail sur les diff rentes tapes de ce protocole Les coupes sont observ es sous un microscope r f Dialux 20 Leitz Inc Wetzlar Allemagne en immersion et photographi es 2 3 2 Histofluorescence Des larves n onates sont plac es sur des milieux standards Ap2 contenant de la ConA FITC la concentration de 102 ug ml 0 1 uM Elles sont laiss es 48 h sur ces milieux puis sont fix es dans du tampon phosphate monopotassique disodique 67 mM pH 7 2 contenant 3 de paraformald hyde pendant 24 heures 4 C Les larves sont pr par es par double inclusion g lose g latine puis coup es en coupes fines de 6 8 um tapes 1 et 2 de la fiche protocole N 20 Apr s d paraffinage celles ci sont observ es sous un microscope fluorescence Laborlux S Leitz Inc Wetzlar Allemagne avec un filtre FITC en immersion et photographi es 2 3 3 Histopathologie Des larves n onates sont laiss es 48 heures sur des milieux standards contenant 0 10 100 ou 400 ug ml de ConA Elles sont fix es pr par es et les coupes sont effectu es et observ es selon la m thodologie d crite au paragraphe 2 3 1 2 3 4 Immunomarquage Des larves de stade 3 sont intoxiqu es 48 heures sur des milieux standards contenant 200 400 ou 800
244. es intoxiqu es du second test ing rent deux fois moins de milieu standard que les larves normales du premier test figures 31A amp B Le tableau 14 moiti gauche et la figure 32 compl tent ces r sultats En intoxicant des larves avec des milieux ConA 400 ug ml marqu s nous pouvons observer la cin tique de l intoxication cette concentration un peu plus lev e figure 32A Toutes les larves se fixent rapidement sur les milieux standards ou ConA D s la huiti me heure l intoxication se traduit par une diminution significative des volumes de milieux ConA ing r s p 0 01 96 Apr s 24 h d intoxication les larves semblent s arr ter de s alimenter les quantit s ing r es en 24 h et en 48 h sont du m me ordre de grandeur Mais nous relevons qu elles restent parfaitement fix es pendant l intervalle de temps 24 48 h Il s av re qu une mue intervient pr cis ment dans cet intervalle de temps Nous pr f rons donc conclure que l intoxication 400 ug ml se traduit par un taux d ingestion tr s faible mais pas nul d s la vingt quatri me heure N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 109 Modalit s Ap2 Ap2 Ap2 ConA400 ConA400 Ap2 ConA400 ConA400 11 4 2 9 2 1 18 2 0 15 2 Dur e 26 8 1 35 5 27 4 1 25 3 1 92 7 0 a 140 18 7 d ingestion 35 5 34 6 2 20 3 1 b b 60 7 136 11 8 a
245. es milieux Ap2 contenant de la ConA ou de la GNA Valeurs dos es pour chaque acide amin rapport es la valeur des t moins tableau A donn es brutes tableau B donn es relatives rapport es aux acides amin s totaux N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 54 96 28 6 Al oa val E ConA400 ConA200 m d ile ser as ET w phe D his ala om glu lys met T moin ConA800 68 155 ConA200 GNA400 va met iJe ser gly leu asn phe pro lys glu SED his ConA400 T moin iv CA BR xs NE imm tn ag GNAS met GNA400 Figure 48 D pouillement graphique des deux premiers facteurs des AFC r alis es sur les donn es relatives aux acides amin s libres dos s dans les broyats de pucerons A pucerons intoxiqu s sur milieux ConA B pucerons sur milieux GNA C comparaison entre les pucerons intoxiqu s par la ConA et ceux intoxiqu s par la GNA Les acides amin s contribuant la d finition des axes sont repr sent s en caract res gras et entour s Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 156 est de plus tr s diff rent des autres modalit s En particulier le taux d arginine est multipli par 3
246. es observ es par cette lign e d une part avec M persicae et surtout avec A solani Les autres lign es n avaient jamais t test es auparavant et nous ne disposions pas de PBG6 47 pour cette deuxi me s rie Malheureusement le tableau 12 et les courbes de la figure 22 montrent que toutes les performances biologiques des pucerons sur la lign e PWG6 85 sont dans ce cas identiques ceux plac s sur les plantes t moins transform es lign e WAI9 12 ou non vari t D sir e Pour les autres plantes aucun lot de pucerons de l une ou l autres des lign es transg niques test es n est sensiblement affect ni en terme de survie figures 21A et 22A ni globalement en terme de f condit tableau 12 La lign e GNA2 23 semble m me induire des effets positifs Pour certaines variables des diff rences significatives p lt 5 apparaissent entre les lign es GNA2 28 ou GNA2 30 et les plantes t moins Cette remarque s applique en particulier au taux intrins que d accroissement naturel et les r sultats des estimations par les deux m thodes sont peu tranch s mais conduisent diff rencier ces deux lign es Mais nous remarquons n anmoins que le nombre total de larves pondues variable Lv ne diff re pas significativement entre les pucerons plac s sur plantes t moins et ceux d pos s sur les plantes des lign es GNA2 28 et GNA2 30 Les diff rences entre les rm s expliquent donc uniquement par le jour de d calage existant entr
247. es techniques d crites pr c demment 18 Des travaux ont port sur le tabac la pomme de terre le colza la luzerne repr sentant des situations vari es de pollinisation de dispersion des graines de propagation Sciences 1993 19 Heliothis virescens Fab P oala interpunctella Hbn et Plutella xylostella L respectivement Noctuelle verdoyante du tabac Pyrale indienne de la farine Fausse teigne des Crucif res 20 eptinotarsa decemlineata Say Doryphore de la pomme de terre Chapitre 1 Contexte de l tude 30 3 maintien d une proportion d individus sensibles au sein de la population cible pour diluer le g ne de r sistance dans la population Le tableau 2 donne un apercu des tactiques envisageables Strat gies Tactiques Strat gie au niveau du g ne lign e exprimant un seul g ne lign e exprimant plusieurs g nes issue d une transformation par une construction multig nique ou chim rique lign e exprimant plusieurs g nes issue d un croisement de lign es exprimant chacune un seul g ne lign e d addition Choix du promoteur expression constitutive tissu sp cifique inductible liciteur blessure Taux d expression du g ne expression faible dose visant g rer la croissance et non radiquer l insecte cible expression forte dose expressions diff rentielles Strat gie aux champs m lange des graines de lign es exprimant des g nes diff rents
248. esse de billes de tungst ne d or ou de platine enrob es d ADN travers les parois des cellules 17 La recombinaison homologue est encore une technique peu performante Ce ph nom ne ne se produit que lorsque de longues s quences d ADN sont strictement homologues entre l ADN de l h te et l ADN tranger Lorsque cette technique est appliqu e aux cellules somatiques capables dans un certain nombre de cas de N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 29 pallier les difficult s qui sont li es l insertion au hasard des transg nes et am liorerait du m me coup la reproductibilit de la transg n se Sciences 1993 les g nes utilis s pour la transg n se comportent des r gions r gulatrices fonctionnelles mais plus ou moins bien d finies une r gion dite codante comprenant les exons et les introns du g ne ainsi qu un terminateur de transcription Par le recours aux techniques de microinjection et de biolistique le nombre de copies des g nes transf r s est impr visible et varie g n ralement de 1 100 Deblock 1993 Sciences 1993 Ces g nes sont essentiellement organis s en tandems int gr s dans des endroits apparemment quelconques du g nome de l h te L ensemble de ces processus est donc assez peu contr l de sorte que l expression des transg nes est elle m me souvent difficile valuer De plus les diff rents l ments qui composent un g ne fonctionnent avec des eff
249. essentiellement de son acceptabilit par les autorit s et le public En effet la cr ation de plantes transg niques et d une mani re plus g n rale la transg n se v g tale ne va pas sans soulever un grand nombre de probl mes d ordre thique Parmi ceux ci figurent notamment la crainte de voir se rompre certains quilibres biologiques Plus prosaiquement surgissent aussi divers probl mes li s la politique des brevets la propri t intellectuelle vis vis d tre vivants g n tiquement modifi s ou encore aux cons quences b n fiques ou non qu aura le d veloppement de la transg n se sur le march agricole traditionnel ainsi que sur les changes entre pays industrialis s et pays en voie de d veloppement Enfin si nous avons beaucoup parl des plantes transg niques nous sommes conscients que la g n tique classique est loin d avoir perdu de son efficacit De fait les exploits de la g n tique mol culaire ne font qu apporter au mieux un outil de plus pour remodeler les g nomes ouvrant ainsi un pool nouveau de g nes l exploitation par l homme et permettant simplement de surmonter certaines barri res g n tiques qui taient jusqu ici ferm es Bibliographie 180 Bibliographie Alford D V Commeau M F Coutin R et Fraval A Ravageurs des v g taux d ornement arbres arbustes fleurs Paris Ed Manson Publishing Ltd amp INRA 1994 464 p Allen A K A lectin from the exudate o
250. eur est combattu au stade le plus sensible de la culture ce stade peut tre diff rent en fonction de l esp ce d pr datrice R ciproquement les stades sensibles des ravageurs en g n ral le stade larvaire sont constamment vis s Boulter 1993 cet argument de l exposition permanente du ravageur n est pas univoque L exposition de l environnement est bien plus limit e que dans les traitements insecticides classiques 12 Chaque franc investi engendre 300 francs de b n fices 13 Cet avantage l est surtout en comparaison d une protection chimique Il faut noter que cette protection permanente n est pas la r gle g n rale pour les r sistances classiques qui peuvent tre tr s d pendantes du stade de d veloppement de la plante N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 27 mais les ravageurs peuvent rester longtemps sur les plantes avant d tre tuer L impact de ce type d exposition reste sujet discussion dans la mesure o elle d pend de tr s nombreux facteurs Nous reviendrons sur ce point quand nous d finirons le concept de gestion de r sistance la protection de tissus difficiles d acc s par les produits phytosanitaires classiques est effective Nous verrons dans le cas des plantes transg niques que ceci suppose parfois de maitriser l expression tissu sp cifique de nouveaux biotypes de pucerons se manifestent assez souvent apr s l implantation de cultivars r sis
251. eux Ap2 simples ou contenant 400 ug ml de ConA Elles sont laiss es pendant 22 h sur ces milieux A l issue de ce pr traitement dix larves de chaque lot pr alablement intoxiqu es ou non sont mises je ner 2 h puis transf r es individuellement sur des milieux contenant de l inuline marqu e la concentration d finie pr c demment Dix autres larves de ces m mes lots sont d pos es sur des milieux contenant de l inuline marqu e et de la ConA 200 ug ml Ces quarante premi res larves sont laiss es 1 h sur leurs milieux respectifs Simultan ment d autres lots sont pr par s pour tester des dur es d ingestion de 2 h 4h 8 h et 16 h milieu Ap2 milieu Ap2 ConA 400 ug ml 1 conditionnement EA 22h je ne ET ET LE ingestion E 1 48h M Ap2 ConA Comptage Ap2 ConA Figure 25 Protocole pour mesurer les quantit s de milieu marqu ing r es par des larves de l esp ce Acyrthosiphon pisum pr alablement intoxiqu es ou non Les quantit s ing r es sont mesur es pour des temps d ingestion compris entre 1h et 48h Une seconde exp rience ind pendante de celle que nous venons de d crire est conduite selon le m me protocole l exception pr s que les dur es d ingestion s chelonnent de 2 h 48 h et que la concentration de ConA dans le milieu marqu est do
252. evier 1988 Vol 2B p 259 270 Cheng J Bolyard M G Saxena R C et Sticklen M B Production of insect resistant potato by genetic transformation with a endotoxin gene from Bacillus thuringiensis var kurstaki Plant Sci 1992 Vol 81 p 83 91 Chessel D et Dol dec S Logiciel ADE Version 3 6 Analyses multivari es et expression graphiques des donn es environnementales Villeurbanne Fr URA CNRS 1451 UCB Lyon 1 1994 Chrispeels M J et Raikhel N V Lectins lectin genes and their role in plant defense Plant Cell 1991 Vol 3 p 1 9 Cloutier C et Cloutier C Chap 1 Les solutions biologiques de lutte pour la r pression des insectes et acariens ravageurs des cultures in La lutte biologique Boucherville Canada Ed Ga tan Morin 1992 p 19 88 Comai L Impact of plant genetic engineering on foods and nutrition Annu Rev Nutr 1993 Vol 13 p 191 215 Comeau A Chap 23 La r sistance aux pucerons aspects th oriques et pratiques in La lutte biologique Boucherville Canada Ed Ga tan Morin 1992 p 433 449 Conover W J Pratical nonparametric statistics 2ed New York Ed John Wiley amp Sons 1980 495 p Corcuera L J Plant chemicals and resistance of cereals to aphids Ambio 1990 Vol 19 p 365 367 Cronshaw J et Sabnis D D Phloem proteins in Sieve elements comparative structure induction and development Berlin Springer 1989 p 257 283 Cunningham J C Baculoviruses
253. f both dicots and monocots but not Gramineae Bulbs especially tulips often have large populations of A solani and it is a common pest in glasshouses and on pot plants Common on potatoes Virus transmission A vector of about 40 plant viruses inchiding bnth persistent and non persistent viruses of beet and potato M ller e af 1973 studied intra epecific variation in the ability to transmit pes enarion mosaic virus Distribution Probably of European origin hu now almost world wide Biology The biology of A salani is complicated like rhar af many of the most important aphid pest species by the occurrence of numerous races or subspecies including some with parriculat hast plant associations Muller 1970 1976 Polyphagous forms of A solani with both holocycly and holocycly occur Holocyelic A solani have either apterous or more rarely alate males and the unusual ability to overwinter as eggs on many different hos plant Fiche descriptive du puceron commun des serres Audacorthem solani Kaltenbach d apr s Blackman et Eastop 1985 Macrosiphum Oestlund Aphidinae Macrosiphini A genus of about 120 species with elongate legs and antennae with long siphun culi having polygonal reticulation over the distal 5 30 mostly 8 13U in apterae and 15 25 in alatae with hairs of medium length and with little dorsal abdominal pigmentation Several of the well known species rosae euphorbiae pallidum alternate from Ro
254. f roll under field conditions in comparison with Myzus persicae Robert 1971 Distribution Apparently of North American origin now almost world wide although it has only recently spread through Central Asia and the Middle East and has not yer been recorded from the Indian subcontinent except Ceylon Ainiogy Meteroecious holocvelic in north eastern U S A with wild or cultivated Rosa spp as primary host plants Shands er af 1972 studied the ecology of populations on Rosa palustris in Maine in Europe and probably elsewhere M euphorbiae is mainly anholocyclic although sexual morphs are sometimes produced in small numbers and the holocycle may sometimes occur Miller 1971b The literature on M euphorbiae is very large Meier 1961 pro vides a general account of the aphid in Europe Barlow 1962 studied its development on potato MacGillivray and Anderson 1964 studied the factors controlling sexual morph production Parasites and hyperparasites were Fiche descriptive du puceron de la pomme de terre Mucrosiphi euphorbiae Thomas d apr s Blackman et Eastop 1985 Aulacorthum Mordvilka Aphidinae Macrosiphini Nearly 50 species of Aulacorthum are known of which 32 are from the eastern palaearct c and oriental region The subgenus Neonryzus only occurs in His area except for che widely distributed glasshouse pest A AN circumflexunr Most of the remaining species are western palaearcuc ihe few described fron North Amer
255. f the fruit of the vegetable marrow Cucurbita pepo that as a specificity for B 14 linked N acetyl glucosamine oligosaccharides Biochem J 1979 Vol 183 p 133 137 Allen A K Neuberger A et Sharon N The purification composition and specificity of wheat germ agglutinin Biochem J 1973 Vol 131 p 151 162 Allen W A et Rajotte E G The changing role of extension entomology in the IPM area Annu Rev Entomol 1990 Vol 35 p 379 397 Allingham P Kerlin R L Tellam R L Briscoe S J et Standfast H A Passage of host immunoglobulin across the midgut epithelium into the haemolymph of blood fed buffalo flies Haematobia irritans exigua J Insect Physiol 1992 Vol 38 p 9 17 Alston F H et Briggs J B Inheritance of hypersensitivity to rosy apple aphid Dysaphis plantaginea in apple Can J Genet Cytol 1970 Vol 12 p 257 258 Aronson A I Plant Breeding Reviews New York John Wiley amp Sons Inc 1994 Bacillus thuringiensis and its use as a biological insecticide Vol 12 p 19 45 Auclair J L Host plant resistance in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1989 Vol 2C p 225 266 Ayouba A Causse H Van Damme E J M Peumans W J Bourne Y Cambillau C et Roug P Interactions of plant lectins with the components of the bacterial cell wall peptidoglycan Biochem Syst Ecol 1994 Vol 22 N 2 p 153 159 Bajar A
256. fets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 116 ConA 400 4h 031 var 029 m 22 vars O17 008 2 vis sare 0 YN N YN 0 2 5 2 56 9 8 1 0 9 006 varZ 15 var8l oig var9 542 s 642 1 250 8 21 ido 0 1 2 70 12 4 592 1 250 ConA 400 8h n varl var2 var3 var5 var6 AT 013 0054 0029 4 JN VN 9 12 94 2 4 150 5 310 231 480 var8 5 var gs varl0 50 var11 ConA 400 24h var5 016 N O15 N N 004 N 140 E TE 290 79 9 1400 var varg var9 var10 var11 0046 018 026 055 005 N 0 6421 580 8 9 21 4 45 1 2 3 E 50 uma 580 Figure 36 Descriptif graphique de l analyse statistique des enregistrements EPG r alis s avec des pucerons de l esp ce Acyrthosiphon pisum sur des milieux standards simples ou contenant 400 ug ml 1 de Concanavaline A Superposition des courbes de Gauss par modalit t moin amp ConA 400 pour trois dur es d acquisition 4h 8h amp 24h et position des moyennes 1 amp 2 pour les 11 variables retenues dans l analyse N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 117 ConA 600 4h
257. fichier ind pendant pour tre relus avec un tableur Excel puis un logiciel de calculs statistiques Statview La fonction statistique int gr e de MacStylet nous permet galement de calculer les variables classiquement utilis es pour l analyse d un enregistrement EPG annexes 7A et 7B 2 4 4 Protocole de mise en oeuvre de l EPG sur milieu artificiel Neuf jours avant l enregistrement EPG des larves n onates issues d une population synchronis e de pucerons de l esp ce A pisum sont d pos es sur des milieux standards Ap2 Huit jours plus tard la veille au soir de l enregistrement dix jeunes adultes issus de cette ponte sont pr cautionneusement c bl s ils sont maintenus immobiles l extr mit d un embout plastique par une l g re aspiration nous pouvons alors sous une loupe binoculaire coller un fil d or 18 um longueur 3 cm sur les tergites abdominaux de l insecte l aide d une laque aqueuse l argent Les antennes les pattes les cornicules ne doivent pas tre encoll es Les pucerons stress s mission d une goutte de ph romone d alarme l extr mit des cornicules agitation excessive sont supprim s Chaque puceron branch est ensuite laiss une nuit sur un milieu standard Nous avons d mettre au point un dispositif particulier pour adapter la technique EPG habituellement utilis e pour des enregistrements sur plantes des mesures sur milieu artificiel annexe 8 Le matin de l enregis
258. fini par l arginine 36 la tyrosine 15 96 la proline 12 et l asparagine 8 4 Les broyats t moins contiennent en effet 3 1 5 fois moins d arginine et d asparagine et 1 6 fois plus de tyrosine ou de proline figure 47 Deux extraits de la modalit ConA800 contribuent d finir principalement 40 96 l axe 2 points excentr s sur la figure 48A L asparagine contribue pour 42 96 la d finition de cet axe et la glutamine y contribue pour 28 96 Ces acides amin s marquent une diff rence entre les modalit s ConA400 et ConA800 ainsi qu une importante variabilit intra de la modalit ConA800 Il est int ressant de constater sur la figure 48B la discrimination entre la modalit t moin et les modalit s GNA5 et GNA20 Les r sultats obtenus avec la GNA400 sont moins surprenants Pr s de 60 de l information port e par l axe 1 provient d un extrait GNAS point excentr Cet axe permet cependant de discriminer la modalit GNA400 de la modalit GNAS Rappelons que la premi re de ces modalit s correspond des broyats de pucerons fortement intoxiqu s la seconde des broyats de pucerons dont la croissance a t au contraire stimul e Cette discrimination est li e la tyrosine contribution absolue 33 46 l acide glutamique 20 et l acide aspartique 15 La figure 47B permet de comparer les quantit s relatives de l un et l autre de ces acides amin s La thr onine et dans une moindre mesure la glutami
259. gg rant un rapport de comp tition cible mannane tr s favorable la cible soit en affinit sp cifique mais nous ne connaissons pas le Km ConA mannane soit ventuellement aussi en densit de sites Ce point nous semble plausible au vu des capacit s tr s importantes de liaison de la ConA l intestin d A pisum 3 pour ce qui est de la GNA la situation diff re donc sensiblement car l inhibition est lev e d s le rapport molaire mannane lectine de 8 1000 sugg rant soit une affinit lectine cible moins forte soit une interaction lectine mannane diff rente de celle induite par la ConA Il faut en effet garder l esprit que la pr sence d un ligand efficace peut aboutir une s questration de lectine par pr cipitation par exemple Shibuya et al 19882 l emp chant par la suite d interagir avec sa cible Les pucerons sont en principe tr s sensibles la pr sence de pr cipit s dans leur alimentation et nous n avons pas observ d anomalie biologique t moignant de cela dans nos tests Ce n est cependant pas une interpr tation que nous pouvons exclure a priori 3 3 3 2 Exp rience d inhibition 7 v fro sur coupes histologiques Sur les conseils du Dr A Pusztai des coupes de larves intoxiqu es par la Con A sont incub es pendant 2 h dans une solution de TBS contenant 10 ug ml d a m thyl mannoside puis immunomarqu es Quelles que soient les coupes modalit s ConA200 400 ou 800 la couleur marron caract rist
260. hangements biochimiques peuvent donner lieu l un des deux types de r sistance observables chez une plante 1 l antix nose ou non pr f rence qui correspond une r action comportementale de rejet de la plante par l insecte un puceron est par exemple repouss par la couleur l odeur ou le go t lors des piq res exploratoires 2 l antibiose qui se traduit par des effets n gatifs de la plante sur la physiologie de l insecte diminution de la croissance du taux de reproduction quand il ne re oit pas l alimentation pr cise qui lui convient ou qu il subit l effet n gatif de substances secondaires Russel 1981 La t che du s lectionneur consiste donc faire s exprimer dans une vari t cultivable l un ou l autre de ces types de r sistance en y transf rant un m canisme de d fense naturelle a M canismes de r sistance naturelle exploitables par le s lectionneur Les recherches sur les interactions plantes pucerons permettent d envisager une prise en compte des m canismes de d fense mis en jeu contre ces ravageurs dans les strat gies de cr ation de plantes r sistantes par s lection vari tale Certains m canismes de r sistance ressemblent aux m canismes d hypersensibilit observ s dans les cultivars r sistant certains champignons comme les rouilles 9 L pinette Picea excelsa Link r agit ainsi par hypersensibilit n crotique contre le puceron Adelges abietis Linnaeus Comeau 1992 Le pom
261. haque tape le meilleur temps d incubation et la meilleure concentration de l anticorps primaire du conjugu de l avidine et de la peroxydase biotinyl e Fiche N 70A Dosage sp cifique de la GNA par une m thode immunoenzymatique quantitative l ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay Nous avons appliqu une m thode indirecte du dosage de la GNA dans des extraits de tubes digestifs de pucerons C est la m thode adapt e au Laboratoire de Biologie Mol culaire de Durham Elle est moins sensible que le dosage de type sandwich fiche protocole N 9A mais l utilisation de deux anticorps permet cependant une bonne amplification Principe de la m thode Dans un premier temps l antig ne est immobilis sur un support il est ensuite capt par un premier anticorps sp cifique anticorps primaire r f Rabbit 2 2nd bleed Lab Biol Mol Durham Dans un deuxi me temps la quantit de GNA complex e est mesur e apr s la r action de l anticorps primaire avec un second anticorps coupl la peroxydase anticorps de ch vre anti IgG de lapin R f Lab Biol Mol Durham L activit enzymatique obtenue est proportionnelle la quantit d anticorps primaire complex e la GNA Mat riel amp solutions Le mat riel utilis Durham est sensiblement le m me que celui d crit dans la fiche protocole N 9B Les solutions sont galement identiques ceci pr s que la g latine est remplac e par de la
262. hedding of the membrane surface Competitive experiments with different mannosides suggested that this interaction appeared not to be simply a consequence of binding of the lectin to mannose residues Both ConA and GNA caused distinct disturbances in the steady state levels of free amino acids in the aphid but the effects of the two lectins differed significantly from each other Effects of lectins are discussed in relation to the use of transgenic plants expressing such toxic proteins for potential control of aphid populations Avant propos Mes premiers remerciements s adresseront au Professeur Paul Nardon directeur du laboratoire de Biologie Appliqu e INRA INSA de Lyon qui m a accueilli dans son laboratoire Je tiens souligner les efforts qu il met en oeuvre pour assurer aux tudiants un soutien scientifique et mat riel leur permettant de se former la recherche et de r aliser leur travail dans de bonnes conditions Je remercie le Minist re de la Recherche et de l Enseignement Sup rieur pour la bourse qu il m a octroy e Sans cette aide je n aurais pu conduire ce travail de th se et il est fort probable que mes espoirs de faire carri re dans la recherche auraient t remis en cause Toute ma reconnaissance va l quipe puceron du laboratoire Yvan Rahb G rard Febvay et Guy Bonnot Non seulement ils m ont fait b n ficier de la compl mentarit de leur comp tences mais surtout ils ont su me transmettre toute leu
263. hement pr par e Incuber temp rature ambiante 10 30 min Sans arr ter la r action lire l absorbance 405 nm de 2 min en 2 min remarque la fiche technique de Kirkegaard amp Perry Laboratories ne donne pas la composition des diff rentes solutions Elle indique simplement que la Wash Solution et la BSA Diluent Blocking Solution contiennent du Tween 20 Nous avons cependant suppos que les diff rentes solutions sont sensiblement identiques celles utilis es dans le protocole ELISA ConA Fiche N 77 Ajustement des donn es d inhibition de croissance des pucerons au mod le de Michaelis Menten L quation r gissant le mod le de Michaelis Menten est la suivante y C Ri p x concentration en lectine y masse moyenne des pucerons C masse moyenne des pucerons sur les milieux t moins sans lectine utilis e en constante et non en param tre P inhibition th orique maximale quand x gt y C P P concentration pour laquelle IC 50 de l inhibition th orique maximale quand x P y C 2 Les concentrations inhibitrices 20 et 50 conduisant a des insectes 20 et 50 plus petits que les t moins sont d duites de ce mod le Elles sont donn es par les formules 1C20 LO F C 5 P C 1050 RC 2B4C a E Exemple de l intoxication de M persicae par la GNA 0 35 y 0 246 0 218 x 484 3 x R 0 95 0 3 0 25 C 0 246 gt P 0 15 C T 0 1137
264. hysiol 1963 Vol 9 p 469 474 Srivastava P N et Auclair J L An improved chemically defined diet for the pea aphid Acyrthosyphon pisum Ann entomol Soc Am 1971 Vol 64 p 474 478 Srivastava P N Gao Y Levesque J et Auclair J L Differences in amino acid requirements between two biotypes of the pea aphid Acyrthosiphon pisum Can J Zool 1985 Vol 63 N 3 p 603 606 Stary P Aphelinidae in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1988a Vol 2B p 185 188 Stary P Aphidiidae in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1988b Vol 2B p 171 184 Stern V M Smith R F van den Bosch R et Hagen K S The integrated control concept Hilgardia 1959 Vol 29 p 81 101 Strathdee A T Bale J S Hodkinson I D Block W C Webb N R et Coulson S J Identification of three previously unknown morphs of Acyrthosiphon svalbardicum Heikinheimo Hemiptera Aphididae on Spitsbergen Entomologia scandinava 1993 Vol 24 N 1 p 43 47 Strittmatter G et Wegener D Genetic engineering of disease and pest resistance in plants present state of the art Z Naturforsch 1993 Vol 48 N 9 10 p 673 688 Strosberg A D Buffard D Lauwereys M et Foriers A Legume lectins a large family of homologous family in The lectins properties functions and applications in biology
265. ica seem to belong to other genera e g Placoaphis The genus is defined by the parailei sided Inner faces of the spinulus antennal tubercles A solani is one of the most polyphagous aphids and A magnoliae in the East js also recorded from members of many different plant Camilics There is a similar lack of pattern in the hasts of the plant specific species Eight species of Awacormum are described from Cormpusiue 4 rum Liliavcac 3 each from Ericaceae and Labiatae and 2 from Dipsacaceae Lauraceae Oleaceae Rosaceac and Rutaceae Accounts are available Cou Europe lle Ris Lambers 19470 1949 Japan Miyazaki 1971 in Acyrthosiphon India Raychaudhuri 1980 Java van dej Gout 1917 18 aud Canada Richards 197 2b Aulacorthum solani Kaltenbach Glasshouse Potato Aphid Foxglove Aphid Plate 98 Appearance in fe Colour uf apterae variabic from a rather shiny whitish green oz yellow in which case there is usually a conspicuous bright green or rust coloured spor at che base of cach siphuneuius to a uniformly dull green or greenish brown Appendages mainly pele except for dark brown apices to the tibiae siphuncuk and ameunal segments Alatac look quite different with dark brown head and thorax much darker antennae legs and siphunculi and a varlably developed patton of uansverse dark bara on the dorsal abdomen Apterae and alatae 1 8 3 0 mm Host planis Extremely polyphagous colonizing plants in many different families o
266. icacit s tr s variables selon les cas et de mani re plus ou moins sp cifique selon le transg ne et la cellule h te Deblock 1993 Sawahel 1994 Une recherche la fois syst matique et au cas par cas doit donc tre conduite afin de pouvoir ma triser l expression des transg nes enfin le probl me des risques tant r els que potentiels est une question intrins que la m thodologie puisqu elle met en oeuvre des moyens sp cifiques de transmission de l information agents de transfert vecteurs marqueurs et g nes eux m mes Comai 1993 Dale 1993 Sciences 1993 Hull 1994 Jepson et al 1994 Sawahel 1994 D s 1982 en Europe des projets sont initi s pour valuer la nuisibilit des diss minations par les structures de propagations pollen graines des g nes introduits avec des plantes transg niques Ces projets visent aussi estimer les possibilit s de transfert de g nes soit dans les populations de plantes sauvages soit inter esp ces dans le cas des microorganismes associ s aux plantes La propagation des transg nes dans toutes les situations tudi es 3 est extr mement limit e et les facteurs susceptibles de l influencer sont de mieux en mieux appr ci s Sciences 1993 2 2 Probl me du risque d apparition de populations d insectes r sistantes aux entomotoxines Le choix de la prot ine toxique faire exprimer dans une plante transg nique doit absolument tenir compte des risques d appa
267. icit osidiques globales mais nous verrons ult rieurement que ces lectines peuvent pr senter des comportements assez diff rents vis vis de divers oligosaccharides c est le cas en particulier de la ConA et de la GNA Chapitre 4 Ce sont en fait ces mol cules complexes pr sentes sur des glycoprot ines diverses qui constituent les ligands physiologiques naturels des lectines 3 2 3 Quelques propri t s biologiques des lectines Les propri t s biologiques des lectines sont d crites en d tail par Lis et Sharon 1986 Ce paragraphe constitue un bref aper u de quelques unes d entre elles Le tableau 7 r sume en partie ces propri t s et les applications qui en d coulent L agglutination cellulaire est la manifestation la plus facile observer de l interaction entre une lectine et des cellules Elle ne peut avoir lieu que si la lectine se lie par de multiples pontages aux cellules mais il n y a pas de corr lation simple entre la concentration en lectine et le nombre de cellules agglutin es Il existe ainsi des exemples o un nombre important de mol cules de lectines se lient aux cellules sans les agglutiner En fait la r action d agglutination est sous la d pendance de nombreux facteurs tels que les propri t s mol culaires des lectines nombre de sites de fixation aux sucres masses mol culaires les caract ristiques de la surface cellulaire nombre et accessibilit des sites de fixation fluidit de la membrane cellu
268. il appr ci des producteurs et facile prescrire par les conseillers agricoles 1 3 2 La lutte int gr e un concept en d veloppement pour lutter contre les ravageurs Malgr des pandages d insecticides croissants d ann e en ann e il faut bien constater que paradoxalement les dommages caus s par les ravageurs ne diminuent pas depuis les ann es 40 ils auraient m me doubl selon Pimentel 1986 De plus l utilisation des pesticides chimiques se traduit par de nombreux effets n gatifs 1 effets sur l environnement pollution de l eau pr sence de r sidus toxiques dans les aliments impact sur la sant humaine 2 r duction du potentiel biologique qui se traduit par un nivellement de la diversit g n tique des esp ces vis es mais aussi des organismes utiles 3 s lection g n tique de ravageurs suite une exposition continue aux pesticides adaptations biochimiques ou comportementales permettant d annuler leurs effets toxiques Gould 1984 Roush et McKenzie 1987 Devonshire 1989 En 1981 Georghiou d nombre d j 400 arthropodes manifestant une r sistance une ou plusieurs classes d insecticides dont dix huit esp ces de pucerons annexe 2 Ce probl me est particuli rement grave du fait de son expansion et de sa persistance pour trois esp ces M persicae A gossypii et Phorodon humuli Schrank Devonshire 1989 La lutte chimique semble donc ne pas tre la panac e Parmi les m thodes q
269. ile de la figure 38C illustre tr s clairement la variabilit inter modalit 4 Discussion La premi re tape de notre travail pour pr ciser les m canismes d action mis en jeu dans l interaction puceron lectine a concern l tude des effets induits par les lectines sur le comportement d alimentation des pucerons Des tudes ant rieures effectu es sur milieux artificiels par nos coll gues britanniques de Durham Powell et al 1995b r v lent que la GNA 0 1 m v soit 1 mg mL agit moyen terme 24 h sur la cicadelle Nilaparvata lugens Ses effets se manifestent par une diminution des quantit s de miellat excr t es corr l e vraisemblablement une diminution des quantit s de milieu ing r es Mais cette tude n apporte qu une r ponse tr s incompl te du mode d action de la lectine sur la cicadelle L tude pr sent e dans ce chapitre visait caract riser beaucoup plus pr cis ment les effets de l intoxication de la ConA sur le comportement alimentaire des pucerons avant d entreprendre des tudes plus fines sur le mode d action cellulaire Les tests comportementaux sur les animaux de laboratoire souris rats cobayes sont bien connus et maitris s Ces tests ont pr cis ment t mis en oeuvre pour tudier le comportement alimentaire du rat sur un aliment contenant de la Concanavaline A Celle ci est refus e par les animaux mais ce comportement n est pas d une r ponse de n ophobie ni une ave
270. imaux domestiques susceptibles de consommer un produit direct ou d riv de la culture transg nique ne pas subir de modifications post traductionnelles importantes et tre le produit d un gene clon disponible et simple avoir un mode d action diff rent de celui d autres toxines d j exploit es pour pallier le risque d apparition d une r sistance des insectes cibles aux effets toxiques ne pas risquer d influer n gativement sur la physiologie de la plante Les biologistes ont retenu diff rentes prot ines entomotoxiques r pondant ces crit res Elles sont distingu es selon leur origine Ce sont des mol cules provenant de micro organismes bact ries virus champignons d animaux scorpions araign es acariens et bien entendu des plantes elles m mes Avant de les pr senter plus en d tail nous pouvons remarquer que plusieurs arguments concernant soit les modalit s de leur expression soit leur adaptation la fonction de d fense conf rent certains avantages aux g nes d origine v g tale il est probable que les difficult s d expression soient toujours plus fortes lorsque le g ne n est pas d origine v g tale ou tout au moins eucaryote c est ce qui se produit par exemple pour les toxines de B thuringiensis o des g nes synth tiques sont n cessaires leur expression correcte dans un contexte v g tal Le co t ph notypique de la transformation risque d tre galement plus important qu
271. immunologique 3 1 1 Electrophor se d extraits de miellat Des extraits secs de miellat excr t par des pucerons laiss s 72 h sur des milieux contenant de la ConA 100 ug ml ou et de la peroxydase prot ine t moin 100 ug ml sont pass s en lectrophor se kda S kda 43 kda MI kda am amm A kda mw 14 4 kia Figure 40 Comparaison des profils lectrophor tiques d extraits secs de miellat de pucerons laiss s 72 h sur des milieux standards simples d contenant 100 ug ml 1 de ConA e ou 100 ug ml 1 de peroxydase f ou les 2 prot ines ces m mes concentrations g Profils t moins extraits secs de milieu Ap2 a extraits secs de milieu contenant de la ConA b de la peroxidase c ou les deux prot ines h profils des marqueurs de poids mol culaires PM Ces profils correspondent environ 5 ug de prot ines d pos es Sur les profils b et h seule une bande majeure 27 kDa et trois plus petites bandes apparaissent La bande majeure correspond bien au poids mol culaire des sous unit s de la ConA La lectine dissoute dans les milieux ne semble pas pure ou serait l g rement d grad e les trois bandes mineures proviennent de celle ci et non du milieu Ap282 La peroxydase se caract rise par une seule bande 44 kDA profils c et h Sur les profils lectrophor tiques des miellats f et g une seule bande majeure est r v l e montrant que seule la peroxydase est massivement ex
272. imyza Diptera Cecidomyiidae and its use in biological control of aphids Ann Ent Fenn 1979 Vol 45 p 89 98 Masoud S A Johnson L B White F F et Reeck G R Expression of a cysteine proteinase inhibitor oryzacystatin I in transgenic tobacco plants Plant Mol Biol 1993 Vol 21 p 655 663 Massonie G Monet R Bastard Y et Maison P Heritability in peach of the hypersensitive reaction to the green peach aphid Myzus persicae Sulzer in S lection pour la r sistance aux insectes et aux acariens OILB SROP 1984 p 69 McCown B McCabe D Russel D Robinson D Barton K et Raffa K Stable transformation of Populus and incorporation of pest resistance bi electric discharge particle acceleration Plant Cell Reports 1991 Vol 9 p 590 594 McGaughey W H et Whalon M E Managing insect resistance to Bacillus thuringiensis toxins Science 1992 Vol 258 N 5087 p 1451 1455 McLean D L et Kinsey M G A technic for electronically recording aphid feeding and salivation Nature 1964 Vol 202 p 1358 1359 McLean D L et Kinsey M G Identification of electrically recorded curve patterns associated with aphid salivation and ingestion Nature 1965 Vol 205 p 1130 1131 McLean D L et Kinsey M G Probing behavior of the pea aphid Acyrthosiphon pisum I Definitive correlation of electronically recorded waveforms with aphid probing activities Ann entomol Soc Am 1967 Vol 60 p 400 406 Mehlenbach
273. in A pisum ne poss de pas de chambre filtrante contrairement d autres Homopteres Drepanosiphidae Lachnidae notamment Celle ci joue un r le important dans la r gulation de la pression osmotique annexe 11 Les insectes qui ing rent de grandes quantit s de nourriture tr s liquide doivent en effet lutter contre une dilution excessive de leur h molymphe et liminer un exc s de liquide des aliments pour faciliter la digestion 3 1 5 Mise en vidence de la cible primaire de la Concanavaline A dans le tube digestif Des coupes transversales r alis es sur des larves ayant ing r de la ConA FITC montrent que celle ci se fixe uniquement dans l estomac planche I es couleur verte intense Aucune fluorescence n est d tect e ici dans l intestin il i2 ni dans le rectum re Une autofluorescence naturelle apparait au niveau d un bact riome coupe B b couleur orange soutenue et au niveau de la cuticule externe c couleur jaune La coupe C montre que la lectine se lie sur toute la surface des cellules pith liales p le apical et crypte La Concanavaline A dans ces conditions exp rimentales intoxication de 48h une concentration relativement faible d environ 100 ug ml ne traverse pas la membrane apicale de ces cellules et a fortiori ne traverse pas la barri re de l pith lium stomacal Des dosages ELISA r alis s sur des extraits d h molymphe et des broyats d estomac ou d intestin de pucerons intoxiqu s com
274. in s libres des miellats Des dosages sont galement effectu s sur les miellats excr t s par les pucerons dont nous venons de d crire les profils en acides amin s libres Seules les donn es relatives rapport es a la quantit totale d acides amin s dos es sont prises en compte dans les figures 49 et 50 Nous avons essay de quantifier les valeurs de miellats excr t s en poids frais puis en poids secs Mais cette quantification s est av r e tr s impr cise notamment pour les miellats des modalit s ConA400 et ConA800 du fait des tr s faibles quantit s r colt es C est ce qui explique que nous ayons choisi de porter notre attention sur les profils Les miellats des pucerons sur milieux GNA ne pr sentent pas de diff rences majeures avec les miellats de la modalit t moin trois acides amin s contribuent n anmoins les discriminer l arginine la leucine la glycine figure 50B La ph nylalanine et la lysine semblent marquer une diff rence entre les miellats t moins et les miellats GNAS ou GNA20 contributions respectives la d finition de l axe 2 26 96 et 22 96 Le compos que nous appelons Y a un temps de r tention correspondant celui de B alanine tyrosine mais il est en fait la composante des trois pics pour la modalit t moin et de deux pics pour les modalit s ConA200 et ConA400 Le dosage est moins pr cis pour la modalit ConA800 Les miellats GNA se distinguent par contre des miellats t
275. int r t pour ces mol cules s explique du fait que comme les toxines de B thuringiensis elles existent sous la forme de larges familles multig niques tr s diversifi es qui ont probablement co volu avec les principales familles de ravageurs et renferment en leur sein des variabilit s int ressantes Elles ont en commun d tre des classes de prot ines tr s anciennes aux fonctions vraisemblablement centr es sur la r gulation du d veloppement inhibiteurs de prot ases ou les ph nom nes de reconnaissance cellulaire lectines Nous d crivons dans les lignes qui suivent les inhibiteurs de prot ases Quant aux lectines compte tenu de leur importance dans notre tude nous y consacrons un sous chapitre complet Les prot ases se r partissent en quatre classes fonctionnelles suivant leur m canisme r actionnel et le type de r sidu pr sent leur site actif prot ases s rine cyst ine m tallo prot ases et aspartyl prot ases A chacune de celles ci correspond une classe d inhibiteurs de prot ases IP tr s sp cifique Ryan 1981 Norton 1991 Les endoprot ases digestives mises en vidence chez les insectes phytophages sont presque exclusivement des prot ases 22 Anthonome du coton 23 Phospholipases et surtout prot ases tr s toxiques vis vis des pucerons par exemple Rahb et Febvay 1993 Chapitre 1 Contexte de l tude 36 cyst ine ou s rine Les inhibiteurs respectifs de cell
276. ique celui dont on se sert pour le soufrage des vignes Figure 4 Extrait de Les amis du cultivateur par E Deli ge instituteur paru chez H Matot Reims en 1903 cit par Grison 1992 Les solutions pulv ris es sur les cultures tuent les insectes mis en contact avec leurs principes actifs Schepers 1989 Apr s les ann es 40 la lutte chimique conna t de grands succ s gr ce l utilisation du DDT et autres compos s organochlor s tel le lindane Si ces insecticides pr sentent l avantage d tre persistants ils ont par contre l inconv nient de ne pas agir de fa on syst mique La pollution de la biosph re tout enti re par les r sidus d organochlor s aggrav e par un ph nom ne de concentration au sein des cha nes alimentaires am ne la FAO recommander d s 1969 le retrait des insecticides les plus r manents Aujourd hui les organochlor s sont pour la plupart interdits en Europe et en Am rique du Nord Riba et Silvy 1989 4 Propri t s insecticides d couvertes en 1938 par le Suisse Paul Muller prix Nobel en 1939 5 Terme qualifiant un pesticide capable d tre efficace apr s p n tration et diffusion l int rieur de la plante h te N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 19 Le d veloppement de pesticides syst miques tels que certains compos s organo phosphor s offre de nouvelles perspectives dans la lutte contre les aphides et les virus qui leur so
277. ique de la lectine ne semble pas affect e par ce traitement donn es non montr es Les mol cules de ConA ne semblent pas s tre d complex es de leurs ventuels r cepteurs Mais la technique de dosage utilis e amplification avidine biotine est tr s sensible et non quantitative Or les dosages ELISA pr c dents ont montr que l estomac fixe de tr s grandes quantit s de lectine Il est possible que de la ConA ait t en partie d plac e mais que les quantit s restant fix es fussent suffisantes pour que la couleur des coupes marqu es paraisse inchang e Nous n avons pas eu le temps de recommencer cette exp rience en faisant varier les dur es d incubation ou et les concentrations en sucre Ces r sultats incomplets ne r pondent donc pas de fa on univoque notre question initiale qui tait de savoir si la Concanavaline A agit ou non strictement par ses sites lectiniques 96 Cela se traduit par des mortalit s pr coces et une variabilit individuelle importante dans les tests Duport et Rahb communication personnelle Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 168 4 Discussion L ingestion de la Concanavaline A par des larves d A pisum est suivie en 48 h par l apparition d importantes l sions au niveau de l estomac Les d g ts ont une amplitude plus ou moins grande suivant les concentrations de lectine ing r es mais se traduisent toujours par une gonflement cellulaire une hypers
278. iques apparaissent en d but de phase G Elles sont not es par un point d interrogation sur la figure 34 Si nous ne pouvons expliquer la signification de ces ondes s quence comportementale br ve d initiation de l ingestion active elles sont cependant tr s importantes consid rer car elles marquent distinctement la transition entre une phase C et une phase G Or tout notre raisonnement pour interpr ter les r sultats obtenus sur milieux lectines repose pr cis ment sur cette distinction phase C phase G 70 Par souci de simplification des termes nous regroupons les ondes de type A B et C sous le terme ondes C la distinction de ces trois phases ne se justifiant pas pour notre analyse 112 Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons POULE nagnu ANS j sepuo unu p Poyga napu ans AA un p pyoad Torna ner ans 229dso JWJ 21120 Ap SAUL sap sed saynpui sapuo sa 12 stad ims werd uoydisvysadoy a qdsa op 10122nd ua p OIA suruinsiaaro sap INS sopgeA128qo H 12 7 sapo p ed a anuo sacio ery 2g aSa poyn naui IMs 8 SPUH N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 113 Un autre type d onde apparait sur certains enregistrements mais n est pas pris en consid ration dans l analyse statistique Ces ondes pr sentent de nombreuses caract ristiques du type pd pour potentiel drop chute de potentiel d fini par Tjallingii ride pd i7 sur mili
279. iruses Kennedy et af 1962 Persistent viruses transmitted include beet mild yellowing beet yellow ner beet mild yellows pea enation mosaic pea leaf roll potato leaf roll radish yellows tobacco vein distorting and tobacco yellow veinbanding The relationship with potato leaf roll has received particular attention e g Ponsen 1972 Eskanderi er al 1979 Distribution Probably of Asian origin like its principal primary host now world wide Hioiogy Hetezoecious holocyclic between Prunus and secondary host plants but anholocyclic on secondary hosts in many parts of the world where peach is absent and where the climate permits active stages to survive the winter season The literature on M persicae is immense but there have been extensive reviews of ecology van Emden ef al 1969 Mackauer and Way 1976 as well as discussions of migration and spatial dynamics Taylor 1977 biological ap proaches to control Blackman 1976 and development of resistance to insec ticides Georghiou in press This aphid has also been the subject of much laboratory research for example studies of the anatomy and function of che gut Forbes 1964 nutritional studies using host plants van Emden 1977 and aruficial diets Miter 1976 photopenodic responses Takada 1982 and genetic variation of enzyme systems May and Holbrook 1978 Takada 1979 zn 12 a form heterozygous for chromosomal translocation is world wide and common Bl
280. itol DTT 0 3 g SDS 10 4 ml Tampon Tris HCI 1 5 M pH 6 8 1 6 ml Glyc rol 87 2 5 g Bleu de bromoph nol 1 5 mg qsq 20 ml d eau bleu de Coomassie coloration des gels R brillant blue Sigma lg acide ac tique 10 v v 100 ml m thanol 40 v v 400 ml eau distill e 500 ml les gels sont color s de trente minutes a une nuit a 37 C sous agitation solution de d coloration I fixation acide ac tique 10 v v 100 ml m thanol 40 v v 400 ml eau distill e 500 ml les gels sont d color s dans deux ou trois bains 37 C sous agitation solution de d coloration II conservation acide ac tique 10 96 v v 100 ml m thanol 5 96 v v 50 ml eau distill e 850 ml Fiche N 78 Pr paration des chantillons de miellat de tube digestif et d h molymphe avant dosage de la ConA par ELISA D pot d adultes de 11 jours sur milieux Ap2 ConA 200 ConA 400 ConA 800 l re r colte de miellat voir fiche protocole N 16 h molymphe tube digestif 2 me r colte de miellat TD dans du Yeager couper f murs dissection repris avec 50 ul H20 r colter l h molymphe voir fiche protocole N 8 exsudant dans une solution de PTU eau extrait 5 10 gouttes 20 ul extrait 3 TD 20 ul s cher au SpeedVac Yeager 1 nuit 4 C 1 nuit 4 C 1 nuit 4 C rajouter 80 pl rajouter 80 ul rajouter 100 ul tampon PBS Tween g latine tampon
281. itre 5 Conclusions amp Perspectives 174 Chapitre 5 Conclusions et perspectives Nous avons choisi d aborder la conclusion de notre travail en rappelant dans un premier les r sultats fondamentaux acquis Nous en d duisons le potentiel d utilisation des lectines dans une strat gie de cr ation de plantes transg niques r sistantes aux Homopt res en g n ral et aux pucerons en particulier Nous avangons ensuite les perspectives plus ou moins court terme sur lesquelles notre travail d bouche Enfin il nous a sembl important d apporter quelques r flexions tr s succinctes sur l avenir des plantes transg niques au moment o la transg n se tant v g tale qu animale suscite de nombreuses interrogations 1 Caract ristiques biologiques et mode d action de la toxicit des lectines mannose sur A p sum Le premier objectif de notre travail tait d largir la panoplie des g nes susceptibles d tre utilis s en transg n se v g tale pour cr er des plantes r sistantes aux pucerons Nous avons d crit dans le premier chapitre les prot ines actuellement exploitables pour lutter contre divers autres insectes Col opt res L pidopt res toxines de Bacillus thuringiensis ou Bacillus sphaericus r f rences dans le tableau 4 polypeptides d origine fongique Purcell et al 1993 venins d arthropodes Pang et al 1992 enzymes Powell et al 1993 Purcell et al 1994 inhibiteurs enzymatiques en
282. l 1983 Vol 56 p 163 171 Billings P C Brandon D L et Habres J M Internalisation of the bowman birk protease inhibitor by intestinal epithelial cells Eur J Cancer 1991 Vol 27 p 903 908 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 181 Birch L C The intrisic rate of natural increase of an insect population J anim Ecol 1948 Vol 17 p 15 16 Blackman R L et Eastop V F Aphids on the world s crops an identification guide Chichester USA Ed John Wiley amp Sons 1985 466 p Bliss C I The calculation of the dosage mortality curve Ann Appl Biol 1935 Vol 22 p 134 167 Bode W et Huber R Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases Eur J Biochem 1992 Vol 204 p 422 451 Bonad Bottino M D fense du colza contre les insectes phytophages d pr dateurs tude d une strat gie bas e sur l expression d inhibiteurs de prot ases dans la plante Th se 3 me cycle Paris Sud Centre d Orsay 1993 Bonnot G et Febvay G AjustNonLin un logiciel d ajustement non lin aire sur Mac Micro Bulletin 1992 Vol 44 p 101 108 Bostwick D E Skaggs M I et Thompson G A Organization and characterization of Cucurbita phloem lectin genes Plant Mol Biol 1994 Vol 26 N 3 p 887 897 Boulter D Insect pest control by copying nature using genetically engineered crops Phytochemistry 1993 Vol 34 N 6 p 1453 1466 Boult
283. l les doses l tales DL50 sont donn es en ug animal quand cela a t possible 1 pour revue Bonad Bottino 1993 2 pour revue Gatehouse et al 1995 des r f rences pr cises sont donn es dans le texte 2 2 2 2 N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 33 consiste exprimer un polypeptide toxique dans l esp ce v g tale h te Hilder et al 1989 Boulter et al 1990b Gatehouse et al 1992 Gatehouse et al 1993 Dans quelques ann es cependant il est probable que les nombreux m canismes de r sistance des plantes seront exploit s En effet des progr s devraient intervenir apr s caract risation des enzymes impliqu es soit dans les voies de d fense du v g tal comme celles de m tabolites secondaires ubiquistes Dawson eft al 1989 soit dans les voies contr lant son quilibre hormonal ou trophique Barendse et Peeters 1995 2 3 1 Les crit res de choix d un g ne utilisable en transg n se Pour tre consid r e comme bonne candidate une prot ine doit r pondre plusieurs crit res montrer des niveaux de toxicit suffisants dans son environnement final d utilisation in planta administration per os tableau 3 faire preuve de caract ristiques ad quates de sp cificit c est dire avoir une toxicit pr f rentielle pour les cibles et pr senter une totale inocuit vis vis des insectes auxiliaires de l homme ou des an
284. l exp appl 1986 Vol 40 p 89 98 Tjallingii W F Stylet penetration activities by aphids new correlations with electrical penetration graphs in Insects Plants W Junk Publishers 1987 p 301 306 Tjallingii W F Electrical recording of stylet penetration activities in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1988a Vol 2B p 95 108 Tjallingii W F Continuous recording of stylet penetration activities by aphids in Aphid Plant Genotype interactions Amsterdam NDL Elsevier 1989 p 1 11 Tjallingii W F Continuous recording of stylet penetration activities by aphids in Aphid plant genotype interactions Amsterdam R K Campbell amp R D Eikenbary eds Ed Elsevier 1990a p 89 99 Tjallingii W F Stylet penetration parameters from aphids in relation to host plant resistance Symp Biol Hung 1990b Vol 39 p 411 419 Tjallingii W F Sieve element acceptance by aphids Eur J Entomol 1994 Vol 91 N 1 p 47 52 Tjallingii W F et Hogen Esch T H Fine structure of aphid stylet routes in plant tissues in correlation with EPG signals Physiol Entomol 1993 Vol 18 N 3 p 317 328 Tjallingii W J Electrical recording of stylet penetration activities in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1988b Vol 2B p 95 108 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines s
285. l exp appl 1976 Vol 19 p 52 56 Schumacher U Madry H Adam E Peumans W J Van Damme E J M Grant G Bardocz S et Pusztai A Analysis of lectin binding sites in the gut of hooded lister rats with special emphasis on recently detected lectins Acta Histochem 1993 Vol 94 N 2 p 163 166 Sciences A d Les techniques de transg n se en agriculture Applications aux animaux et aux v g taux Acad mie des Sciences CADAS Rapport commun n 2 Paris Ed Lavoisier 1993 160 p Shade R E Schroeder H E Pueyo J J Tabe L M Murdock L L Higgins T J V et Chrispeels M J Transgenic pea seeds expressing the alpha amylase inhibitor of the common bean are resistant to bruchid beetles Biotechnology 1994 Vol 12 N 8 p 793 796 Shaposhnikov G C Evolution of aphids in relation to evolution of plants in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1987 Vol 2A p 409 414 Shen Z M Shi W X Sun C et Yang J T Conformation and activity of mannose specific and N acetylgalactosamine specific lectins from Vicia villosa seeds Biochimie 1993 Vol 75 N 11 p 949 954 Shi Y Wang M B Powell K S Van Damme E Hilder V A Gatehouse A M R Boulter D et Gatehouse J A Use of the rice sucrose synthase 1 promoter to direct phloem specific expression of beta glucuronidase and snowdrop lectin genes in transgenic tobacco plants J Exp
286. l de la production varie selon les esp ces mais il se compte souvent en centaines de milliers de francs Comeau 1992 C est pourquoi la cr ation de cultivars r sistant aux pucerons se fait de facon sporadique m me pour les esp ces agricoles les plus importantes Pourtant ce co t est bien inf rieur celui de la recherche d un nouvel insecticide Boulter 1993 estime 4 ou 5 millions de dollars US le co t de la cr ation d une nouvelle vari t transg nique alors que l effort de recherche d un insecticide s l ve 22 5 millions de dollars US L int r t port par les industries phytosanitaires la s lection vari tale d pend donc essentiellement du rapport co t de production b n fices Dans le cas o un cultivar r sistant couvre une grande surface des rapports tr s attractifs peuvent tre obtenus allant jusqu un rapport de 1 300 2 alors qu aujourd hui la production de nouveaux pesticides ne permet qu un rapport d environ 1 5 Comeau 1992 il existe un d lai important entre l initiation d un projet de cr ation d un cultivar r sistant et l obtention des b n fices figure 6 lutilisation de cultivars r sistants est plus saine pour l agriculteur et pour l environnement les al as notamment climatiques des itin raires techniques sont r duits pas de lessivage pas de d gradation par les UV et la protection est th oriquement active tout au long de la culturel Aussi chaque insecte ravag
287. la membrane apicale Ce mode d action peut laisser supposer que le risque d apparition d une r sistance totale l intoxication est faible Dans ce contexte peu sp cifique l apparition d un contournement fort de r sistance i e vertical peut s av rer plus improbable Cet argument se fonde videment sur l hypoth se de l absence d une interaction restreinte ConA r cepteur unique mais notre interpr tation reste totalement prouver Nous avons galement soulign 109 a seule r f rence dont nous disposons qui aborde ce sujet tendrait le confirmer mais sans donner de chiffre pr cis Mittler 1987 110 es conditions exp rimentales pourraient par exemple influer sur les r sultats Ainsi pour les tests avec Aulacorthum solani dans la 1 re s rie les plantes taient plac es dans une chambre de culture forte hygrom trie 90 et temp rature lev e 25 C conditions d levage sur riz des cicadelles utilis es Durham alors que dans la deuxi me s rie les conditions taient celles que nous avons aussi Lyon H 50 70 96 temp rature 20 C 1 Chapitre 5 Conclusions amp Perspectives 178 en fin de discussion du chapitre 3 qu un danger de contournement comportemental de la toxicit nous semble minime dans la mesure ot la lectine n est pas phagor pulsive et que la composante comportementale de l intoxication est plus indirecte Enfin le tube digestif des pucerons ne semble pas con
288. laire et l tat physiologique des cellules La r action d agglutination de cellules est le r sultat d une interaction sp cifique entre la lectine et un sucre pr sent la surface de celles ci Cette r action peut tre inhib e par ajout dans le milieu r actionnel du sucre en question sous forme libre inhibition par comp tition Nous avons vu que cette caract ristique est la base de la d termination de la sp cificit osidique des lectines Elle permet inversement de pr ciser les sucres pr sents la surface des cellules Nous utilisons nous m mes cette caract ristique pour pr ciser le mode d action des lectines sur les pucerons Propri t s Applications Agglutination sp cifique des typage du sang globules rouges selon le groupe identification de nouveaux groupes sanguins sanguin Induction de la mitose tude de la constitution chromosomique de la cellule et d tection des anomalies Agglutination cellulaire recherche sur l architecture des membranes externes cellulaires leurs changements et transformations phagocytose et motilit Diminution de la croissance des cellules tumorales Pr cipitation des polysaccharides et isolement purification et tudes structurales des glucides des glycoprot ines purification des glycoconjugu s enzymes hormones mod les pour la r action antig ne anticorps test ELISA etc Liaison aux sucres tudes des sites de liaison sp cifique des prot ines et glycoprot in
289. lation du calcul voir fiche protocole N 12 Par exemple avec un puceron la probabilit de survie L est 1 ou 0 Selon la m thode du Jackknife il est possible de d terminer la variance du 7 sans utiliser les 7 mais au contraire des groupes de pucerons priv s d un individu i mi soit V mi le r calcul partir de l chantillon priv de l individu 1 on obtient Imo cab Nie n l E typ Fy Efron 1982 n Fiche N 744 Mod lisation de la dynamique de ponte des pucerons Guy Bonnot communication personnelle Hypoth se de base 1 un puceron ou une population de pucerons au d but de la vie reproductive soit To dispose d un stock initial d embryons No 2 ce pool d embryons subit une maturation proportionnelle au nombre d embryons k21 constante de vitesse de maturation des embryons 3 les embryons sont pondus avec une constante de vitesse k32 On a ainsi le sch ma de compartimentation suivant embryons embryons larves murs pondues Q ki Q ks s Q 1 2 3 Au temps t TQ Q N Q 0 Q 0 dQ Soit lt k Q 1 dt 21 1 dQ 2 ky ks 2 dt Uo s Q 3 qui d finit 1 t it de t di Ks Q gt qui d finit la ponte par unit de temps nombre de larves pondues jour dQ k co C ky t AS pu k4 Q a pour solution Q C e t par passage aux conditions initiales on calcule la constante C kih On Ny Cue dot Ky To C
290. lectine mannose glucose la Concanavaline A pr sente des propri t s toxiques int ressantes vis vis du puceron du pois A pisum Notre d marche consiste dans un premier temps pr ciser les effets biologiques de ces lectines Ceci est entrepris par l analyse des effets d une m me lectine sur diff rentes esp ces de pucerons et ceux des lectines sp cificit s osidiques tr s proches lectines glucose mannose sur un m me puceron par l observation des effets long terme de doses subl tales Dans la seconde tape de notre travail nous nous focalisons sur l tude des effets des lectines sur le comportement d alimentation des pucerons Cette approche a n cessit une importante mise au point de tests comportementaux Nous avons galement fait appel des techniques plus pr cises mais plus lourdes pour mesurer l ingestion des pucerons l aide d un marqueur radioactif et pour observer leur comportement d alimentation technique dite d lectrop n trographie Enfin dans une troisi me tape nous abordons le mode d action des lectines retenues l aide de techniques biochimiques lectrophor se histologie immunomarquage ELISA Cette approche nous permet de mettre en vidence les tissus cibles des lectines de d crire les cons quences induites par l intoxication sur la physiologie des pucerons et d laborer des hypoth ses quant au mode d action des lectines au niveau mol culaire Cette derni re tape aurait
291. les pucerons Des tests de choix des mesures de l ingestion l aide d un traceur radioactif ainsi que l observation de leur comportement alimentation par electrop n trographie permettent de pr ciser les effets des lectines sur la prise de nourriture Le dernier chapitre R sultats a pour but de pr ciser les tapes de l intoxication cellulaire au niveau des tissus cibles de la Concanavaline A En conclusion outre les perspectives d coulant de notre travail nous voquons galement d une maniere plus g n rale l avenir des plantes transg niques 1 La biologie des pucerons implique des moyens de lutte sp cifiques 1 1 Biologie des pucerons 1 1 1 L adaptation des pucerons leurs plantes h tes Les pucerons ou aphides constituent un groupe d insectes extr mement r pandu dans le monde et qui s est diversifi parall lement celui des plantes fleurs Angiospermes dont presque toutes les esp ces sont h tes d aphides Heie 1987 Shaposhnikov 1987 Il en existe galement sur les Gymnospermes ainsi que sur quelques esp ces de Pt ridophytes et Bryophytes La plupart des genres de pucerons sont inf od s une famille v g tale en ce sens ils sont dits monophages Mais nombre des pucerons s attaquant aux plantes cultiv es ont un r gime alimentaire moins restreint et se nourrissent sur des v g taux de familles tr s distinctes L esp ce A gossypii est l arch type des pucerons polyphages elle se d velopp
292. les sur les enregistrements EPG d un puceron de l esp ce Acyrthosiphon pisum sur pois et les ondes induites par des insectes de cette m me esp ce S u r m i l i e u artificiel iere EE epi nep RID EEI EN r RE SES 111 Figure 35 Analogie entre le type d ondes pd observable sur les enregistrements EPG d un puceron sur plante et des ondes induites par un puceron sur milieu artificiel Les ondes pd sont corr l es une activit de p n tration des stylets dans une cellule ss 112 Figure 36 Descriptif graphique de l analyse statistique des enregistrements EPG r alis s avec des pucerons de l esp ce Acyrthosiphon pisum sur des milieux standards simples ou contenant 400 ug ml de Concanavaline A Superposition des courbes de Gauss par modalit t moin amp ConA400 pour trois dur es d acquisition 4h 8h amp 24h et position des moyennes 1 amp 2 pour les 11 variables retenues dans l analyse eit tote tede E eet perite ed getreten 116 Figure 37 Descriptif graphique de l analyse statistique des enregistrements EPG r alis s avec des pucerons de l esp ce Acyrthosiphon pisum sur des milieux standards simples ou contenant 600 ug ml l de Concanavaline A Superposition des courbes de Gauss par modalit t moin amp ConA600 pour trois dur es d acquisition 4h 8h amp 24h et position des moyennes 1 amp 2 pour les 11 variables retenues dans l analySe eerte x SER HER einen i een pa erre eie 117 Figure 38 D pouillement gr
293. leur milieu que celui ci contient la lectine Ceci constitue ventuellement un autre exemple d interaction toxicit milieu dont nous avions parl dans le chapitre pr c dent Sur milieux contenant la ConA 600 ug ml les effets ne se manifestent qu au del de 8 h d intoxication figure 37 Pendant le temps qu ils restent fix s les pucerons intoxiqu s sortent plus longtemps leurs stylets que les pucerons normaux variable 4 p 9 6 mais pas plus souvent variable 1 p 29 96 ils restent plus longtemps en phase C variable 5 p 6 96 ils ing rent plus souvent du milieu variable 3 p 6 7 mais pas plus longtemps variable 6 p 84 et en moyenne leur phase d ingestion est moins longue variable 7 p 0 42 96 Ce comportement traduit parfaitement une perturbation des pucerons ils s arr tent provisoirement d ing rer indirectement li e l intoxication Mais celle ci ne se manifeste pas par une aversion gustative les pucerons ne d tectent pas la lectine et bien qu affect s ils persistent ing rer du milieu toxique Si l analyse univari e traduit sans ambiguit un comportement diff rent des pucerons intoxiqu s nous constatons cependant une grande variabilit du profil des enregistrements au sein d un m me lot d insectes intoxiqu s ou non Cette variabilit transparait sur les figures des annexes 9A F repr sentant les histogrammes des valeurs de chaque variable rang es par modalit Les courbes
294. lingii 1988b La plupart des connaissances acquises jusqu au d but des ann es 1970 sur le cheminement des stylets sur les r ponses du v g tal et sur les s cr tions des pucerons ont t formul es partir de r sultats exp rimentaux obtenus par des techniques qui ont apport des preuves partielles coupes histologiques ou indirectes stylectomie Miles 1987 Mais des Observations en microscopie lectronique sur l ultrastructure fine des tissus et des cellules travers s ont montr les limites des observations r alis es en microscopie optique Tjallingii et Hogen Esch 1993 L lectrop n trographie EPG est une technique relativement r cente qui a permis d apporter de nouvelles informations relatives au comportement de p n tration des stylets des N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 97 pucerons Elle est d crite sous ce terme par Tjallingii en 1978 C est un prolongement innovateur de la technique initiale invent e par McLean et Kinsey McLean et Kinsey 1964 McLean et Kinsey 1965 L EPG est bas e sur le fait que les activit s de p n tration engendrent des activit s ou modifient des signaux lectriques exog nes traversant les canaux des stylets de l extr mit de ces stylets la cavit de la pompe salivaire Ce sont ces signaux endog nes ou non que l on enregistre une fois amplifi s et qui apparaissent sous forme d ondes sur un graphe lectrique de p n
295. lit les extr mit s coup es des feuilles sont appliqu es en les pingant sur la membrane de nitrocellulose Comme nous nous y attendions aucune tache n apparait sur les d p ts WAI9 12 Par contre sur les d p ts t moins feuilles de la vari t D sir e des taches sont clairement r v l es donn es non montr es Un nouveau dosage r alis par nos coll gues britanniques montrent que cette coloration anormale est due un art fact de la technique De plus ils ont confirm les r sultats obtenus avec les plantes transg niques Si cette technique a l avantage d tre relativement simple et rapide mettre en oeuvre elle ne permet cependant qu un dosage qualitatif de la GNA Elle s av re donc utile pour effectuer un premier tri des transplants mais seul un dosage quantitatif permet d estimer si la transformation des chances de s av rer efficace pour induire une r sistance aux pucerons 3 2 1 2 Dosage de la GNA dans des extraits foliaires par immunomarquage sur membrane de nitrocellulose Au cours de notre s jour Durham en f vrier 1994 nous avons dos la GNA par immunod tection dans des extraits foliaires de pommes de terre transg niques lign es PWG6 85 et PBG6 47 Les feuilles n ont pas t pr lev es sur les plantes qui ont fait l objet des tests biologiques avec A solani pendant ce s jour mais sur des plantes plus jeunes La figure 17 montre les r sultats de ce dosage Pour chaque lign e
296. ls apparaissent en effet gu re exploitables pour lutter contre les pucerons l heure actuelle aucune publication n a fait preuve de leur potentiel d utilisation pour combattre les Homopteres 1 3 3 2 Modification du comportement des pucerons Une autre approche pour lutter biologiquement contre les pucerons est celle qui consiste modifier certaines phases de leur comportement figure 5 comme celle du choix de la plante h te par les ail s Gibson et Rice 1989 En effet les ail s sont attir s ou non vers une plante en fonction de sa couleur ou des substances volatiles qu elle met Kring 1972 La tactique consiste alors d poser sur le sol des plaques d aluminium des plaques plastiques blanches Pour les repousser les tudes sur les substances volatiles attractives ou r pulsives mises par les plantes ont t longtemps rares sur les pucerons Herrbach 1985b mais sont en net progr s Nottingham et al 1991 Powell et al 1995a Des tentatives d utilisation en pulv risation de la ph romone d alarme des pucerons le E _ farn s ne sont rapport es mais long terme les ail s semblent s habituer cette odeur Bowers et al 1977 Montgomery et Nault 1977 Griffiths et Pickett 1980 M ller 1983 Herrbach 1985a Herrbach 1992 Certains pucerons tel que M persicae s y seraient m me montr s insensibles Une autre approche originale consiste inhiber la r ponse des pucerons la ph romone d alarme p
297. ltes sont mis pondre pendant 3 ou 4 jours de suite lorsqu une longue s rie de prot ines est test e un t moin et deux trois prot ines par jour Ce protocole a t adopt en particulier pour tester une s rie de vingt sept prot ines sur A pisum et une s rie de huit toxines sur M persicae 2 2 Origines des lectines purifi es test es La plupart des lectines purifi es proviennent de chez EY Laboratories San Mateo CA USA ou de chez Sigma St Louis MO USA Leurs r f rences sont donn es dans la fiche protocole N 2 Les abr viations utilis es correspondent celles du catalogue EY Laboratories Les lectines mannose du perce neige GNA de la tulipe NPA et de l ail ASA ont t purifi es par chromatographie d affinit sur mannose agarose et analys es par chromatographie changeuse d ions Van Damme et al 1991 Van Damme et al 1992 La lectine de Rhizoctonia solani RSA est purifi e par chromatographie d affinit sur gomme arabique coupl e du s pharose 6 B Vranken ef al 1987 Ces trois lectines nous ont t fournies par W Peumans et E Van Damme Universit de Leuven Belgique Toutes les lectines test es se pr sentent sous la forme de poudre lyophilis e sans sel et de puret prot ique sup rieure 90 Leur concentration dans les milieux artificiels est exprim e en microgrammes de poudre dissoute par millilitre de milieu ug ml 1 2 3 Composition et pr paration des milieux a
298. lulose Apres d p t la membrane est satur e dans du BLOTTO Tris HCl 20 mM pH 7 2 0 9 NaCl TN contenant 5 de lait cr m pendant une nuit 4 C 1 PMSF Ph nyl m thyl Sulfonyl Fluoride inhibiteurs de prot ases Incubation Probing L anticorps anti GNA s rum de lapin est dilu au 1 5000 amp me dans 20 ml de TN La membrane est laiss e incuber pendant 2h sous agitation a 37 C On proc de ensuite trois rin ages de 10 min chacun dans du BLOTTO Une solution d anticorps s rum de singe anti lapin greff de l iode I 25 solution 10 pCi est dilu e dans 40 ml de TN La membrane est laiss e incuber dans cette solution 2h 37 C sous agitation Apr s trois lavages comme pr c demment et un rincage dans du TN la membrane est s ch e Dans une chambre noire elle est plac e entre deux feuilles de Saran Wrap On expose enfin un film autoradiographique sur la membrane apr s l avoir flash e L exposition peut s chelonner entre 2 heures et 2 jours suivant les d p ts 1125 anti IgG lapin singe anti GNA lapin nitrocellulose Les films sont scann s sur un densitom tre LKB Ultrascan XL Les densit s de coloration des taches correspondant aux d p ts des extraits de feuilles de plantes transform es sont compar es celles des taches de la gamme t moin pour estimer les concentrations en GNA celles ci sont in fine exprim es en des prot ines solubles
299. me de 1 30 ng d pos s par puits 10 300 ng ml d extrait annexe 10 Au del de 100 ng puits nous observons un bruit de fond proportionnel la quantit de lectine signal en l absence d anticorps secondaire Celui ci s expliquerait par la formation d un complexe avidine lectine due la pr sence de r sidus mannose la surface des mol cules d avidine auxquels se lient la ConA Pierce manuel d instructions Dans la gamme de lin arit 1 30 ng puits la pr cision mesur e est de l ordre de 5 6 96 nous la consid rons comme bonne Pour le dosage de chaque extrait 2 3 chantillons ind pendants sont analys s Une gamme talon de ConA r alis e pour chaque dosage permet une extrapolation des doses trouv es dans les chantillons 2 2 2 Pr paration des extraits de miellats d h molymphe d estomac et d intestin Des jeunes adultes 3 x 25 sont transf r s sur des milieux standards Ap2 contenant 0 200 400 ou 800 ug ml de ConA Les miellats sont r colt s toutes les 24 h pendant 3 jours La fiche protocole N 18 d crit en d tail la pr paration des diff rents chantillons Celle ci tant relativement longue elle s effectue la veille du dosage Les tubes digestifs sont pr lev s par dissection fiche procotole N 8 dans une solution de Yeager liquide physiologique fiche protocole N 19 Trois estomacs et trois intestins sont isol s et plong s dans 20 ul de Yeager puis broy s au potter Les chan
300. ment y avoir une phase de choc toxique suivie d une phase d habituation aux effets de la toxicit notamment ses effets comportementaux la lectine se fixe dans un premier temps aux cellules pith liales de l estomac mais tr s forte concentration elle transite aussi dans l intestin Les l sions induites seraient en d but d intoxication et m me forte concentration 400 ug ml r versibles Le mode d action de la toxine explique de mani re coh rente cette observation En effet la ConA n induit pas une destruction des cellules de l pith lium mais semble acc l rer fortement un processus naturel de remplacement de la membrane apicale en induisant une hypers cr tion des cellules stomacales l intoxication par la ConA s accompagne d importantes modifications du profil des acides amin s libres des pucerons et de leur miellats L hypers cr tion d arginine notamment corrobore l hypoth se d une stimulation des voies d excr tion du puceron plusieurs observations nous sugg rent que le mode d action de la ConA et de la GNA diff rent toxicit effet probiotique faibles doses courbe dose r ponse aux fortes doses analyse des acides amin s libres des pucerons et de leur miellat Initialement nous avions choisi la ConA comme mod le d tude des effets des lectines mannose glucose sur les pucerons Il s av re que le mode d action de la ConA ne peut pas tre g n ralis aux autres lectines de cette cla
301. miellats comme celui nomm X pr c demment mais surtout une famille de peptides vari s entourant le pic de B Ala Tyr que l on ne distingue pas aussi nettement sur les chromatogrammes des traitements la Concanavaline A donn es non montr es Il est difficile de fournir ici une interpr tation claire caract risant l effet de la GNA mais il semble bien cependant que l on puisse distinguer les effets induits par cette lectine dose toxique de ceux de la ConA figure 48 et 50 laissant ici aussi supposer des modes d actions l g rement diff rents Quant l effet probiotique de la GNA il est encore plus d licat d en d limiter les caract ristiques m taboliques faiblement marqu es au del d une simple paraphrase des donn es les miellats fournissent peu de renseignements ce sujet et les acides amin s libres totaux figure 47B montrent des situations contrast es entre GNA 5 et GNA 400 uniquement pour trois acides amin s l acide aspartique faible dose histidine faible dose et la tyrosine faible dose Nous ne pouvons pas interpr ter ces faibles diff rences Nous pouvons signaler que des stimulations de la croissance par les lectines mannose strict faibles concentrations ont aussi t observ es avec d autres insectes telle la bruche Callosobruchus maculatus ces effets ne d pendent pas du fait que les lectines soient ou non insecticides tr s fortes doses A M R Gatehouse don
302. mier sauvage Malus robusta r siste de la m me facon Dysaphis plantaginea Passerini Alston et Briggs 1970 ainsi que certaines vari t s de p chers M persicae Massonie et al 1984 Rahb et al 1988 Les recherches sur les poils glandulaires ou trichomes de Solanum sauvages apparent es la pomme de terre conduisent des r sultats int ressants pour lutter contre M persicae ou M euphorbiae Gregory et al 1986 Lapointe et Tingey 1986 Auclair 1989 Cependant si les r sistances associ es la production de substances collantes et toxiques sont efficaces elles sont aussi d origine polyg nique Mehlenbacher et al 1984 En cons quence le transfert de ces r sistances complexes cr e g n ralement des plantes afflig es de caract res agronomiquement ind sirables ce qui n cessite que celui ci soit suivi de plusieurs r trocroisements ou d une s lection r currente pour cr er un cultivar int ressant conomiquement De nombreuses tudes ont mis en vidence l importance des substances all lochimiques dans le choix de la plante h te Herrbach 1985b La litt rature fournit des exemples d all lochimiques intervenant sur 1 le comportement d preuve des pucerons ou le comportement de p n tration des stylets par stimulation ou par inhibition Ainsi la lut oline glycoside de flavone est phagostimulante pour Aphis fabae Scopoli J rdens R ttger 1979 mais anti app tante pour S graminum D
303. mmrmatidioni Zpreguz Zar eel Uer canal Ollerchamber filtergut ganaopore Haupisell mindgut ayponharyngeal guszatory organ hspaphurynx lip intestine Firat parc of incestire second part of Intestine intracellular exnalieulum rit Lignan intercellular secretory canaliculi la bitin labrum mbr me meg uig my mye Mz M 4d Ml Win D o UE ba MA ZZ enne mH m e D z bo phd php ps Hag aud ade ETUR aag sl Lh te tgr tg tpe va wai membrnnes myoepithelioid ceil mesothoracic ganglion rely Lurie pangliuz mycebome mrontacrte circuler musele fibres divuricztar muscle E F retraczer muscle of salivary pum piston Parkgclhlor manilo of allons livery duct opening ventral pharyngeal pump muscle nucleus rucinalus branch c medial dersal cerry dorsal lobe nerve ze corpus earcdincum main abdominal nerve medial darani nerve nerve p COQUE muscles ezve Lo divarienzor muaeles n pharyngeal nerve ici Deni be cultes layer af cuticule aeannoagea alas arotacere rum proboscis Pericardial cell protkoracie ganglion pharyngeal duet pharyngeal ganglion nha rages pump finn pstern principal salivary gland piston rectum aalivaey canal awivary duct cell sensiilum pore suboesophugenl gangiion stomac LW Locere curt tentarinl bar temiri tharacie gland cell tunica propria tipler cell vacualg velami
304. n temp rature ambiante La densit optique est lue 595 nm Fiche N 7 D tection de la GNA dans des feuilles de pomme de terre par chimioluminescence Enhanced Luminescence Detection ECL Tissue Blot Principe la GNA est capt e dans un premier temps par un anticorps primaire Le complexe form est captur dans un second temps par un anticorps secondaire coupl de la peroxidase La GNA est r v l e par ajout d une solution contenant du luminol la peroxidase catalyse la r action d oxydation de ce compos qui se traduit par une mission de lumi re Apr s amplification x 1000 celle ci est r v l e sur un film photosensible secondary Ab HRP oxidized product O57 peracid is light gt 2H O luminol Meee primary Ab enhancer Hybond ECL Western detection by nitrocellulose Hyperfilm ECL membrane Solutions une solution stock de PBS phosphate buffered saline solution concentr e 10 fois est pr par e et conserv e en chambre froide KH PO 2g Na HPO4 11 5g KCl 2g Nacl 80 H20 qsq 1000 ml tampon PBS Tween lait tampon de blocage et de dilution de l antis rum Lait cr m 50g PBS x10 100 ml Tween 20 10 ml H20 qsq 1000 ml D p t 5 6 feuilles sont pr lev es diff rents niveaux sur une plante et coup es en deux perpendiculairement la nervure centrale avec une lame de rasoir une lame neuve par plante Les deux extr mit s vives sont appliqu
305. n 1974 cit s par Leclant 1981 Les stylets permettent aux pucerons d effectuer des piq res dans les plantes et d atteindre les faisceaux cribro vasculaires du phlo me transporteurs de la s ve labor e aliment quasi exclusif des pucerons Au fur et mesure que l insecte enfonce ses stylets dans la plante il injecte une salive qui durcit autour de ceux ci formant une gaine s tale sorte de fourreau Chapitre 1 Contexte de l tude 16 rigide l int rieur duquel l aphide peut manoeuvrer ses stylets les ressortir s il est importun ou effectuer une nouvelle piq re Klinghauf 1987 Miles 1987 Le comportement d alimentation des pucerons est analys plus en d tail dans le Chapitre 3 1 1 2 L importance des d g ts caus s par les pucerons Le mode de nutrition des pucerons induit plusieurs types de dommages chez les plantes l mission de salive ou le simple fait d enfoncer les stylets dans la plante peut tre une occasion de transmission de particules virales Sylvester 1988 1989 Les cinq esp ces A gossypii A pisum Aulacorthum solani Kaltenbach Macrosiphum euphorbiae Thomas et Macrosiphum albifrons Essig peuvent ainsi transmettre 30 50 maladies virales diff rentes alors que Myzus persicae Sulzer est connue pour tre l esp ce vectrice la plus importante pouvant inoculer plus de 120 virus Blackman et Eastop 1985 annexe 1C 2 la salive s cr t e entre autres lors de l inse
306. n R A Pearson R D Cadogan L C Vuocolo T et Tellam R L Larvicidal activity of lectins on Lucilia cuprina mechanism of action Ent exp applic 1994 Vol 72 p 1 10 Eschrich W et Heyser W Biochemistry of phloem constituents in Encyclopedia of plant physiology Berlin GER Springer Verlag 1975 Vol 3 p 101 137 Etzler M E Distribution and function of plant lectins inThe lectins properties functions and applications in biology and medecine Orlando USA Liener LE Sharon N Goldstein I J Acadamic Press Inc 1986 p 371 437 Febvay G Bonnin J Rahb Y Bournoville R Delrot S et Bonnemain J L Resistance of different lucerne cultivars to the pea aphid Acyrthosiphon pisum influence of phloem composition on aphid fecundity Entomol exp appl 1988a Vol 48 N 2 p 127 134 Febvay G Liadouze I Guillaud J et Bonnot G Analysis of energetic aminoacid metabolism in Acyrthosiphon pisum a multidimensional approach to amino acid metabolism in aphids Arch Insect Biochem Physiol 1995 Vol 29 p 45 69 Febvay G et Rahb Y La m thode des probits sur Macintosh Micro Bulletin 1991 Vol 41 p 117 119 Febvay G Rahb Y Delobel B et Bournoville R R sistance de la luzerne Medicago sativa L au puceron du pois Acyrthosiphon pisum Harris Homoptera bases nutritionnelles Ann Soc entomol Fr 1988b Vol 24 N 4 p 473 Febvay G Sauvion N et Rahb Y A M
307. n es non publi es Ils sont aussi r v l s sur des mammif res et constituent le fondement des propri t s probiotiques de la GNA vis vis du rat d crites par Pusztai et al 1990 Ces auteurs montrent que la GNA se lie Escherichia coli et avancent l hypoth se que la lectine exerce ses effets probiotiques en bloquant la croissance des bact ries de l intestin moyen small intestine Mais cette hypoth se ne s applique vraisemblablement pas au cas des pucerons en particulier de A pisum et M persicae car leurs intestins renfermeraient tr s peu de germes Ponsen 1972 Grenier et al 1994 Le fait que nous ayons observ des effets tr s diff rents entre les lectines mannose strict et la ConA tr s faibles doses bien qu elles soient toutes toxiques fortes doses nous sugg re que ces lectines diff rent dans leur mode d action et qu elles pourraient agir sur des cibles diff rentes dans l insecte Le dosage des acides amin s libres des pucerons et de leur miellats semblent bien confirmer cette interpr tation Si la ConA et la GNA appartiennent toutes les deux au groupe des lectines mannose glucose nous avons eu l occasion d insister sur le fait que la GNA est une lectine mannose strict En effet cette lectine ne reconnait que le mannose et non le D glucose ou la N ac tyl D glucosamine comme la ConA Shibuya et al 1988b Kaku et Goldstein 1989 Kaku et Goldstein 1992 Trois autres caract ristiques li es a
308. n s indispensables comme les aromatiques et du couple Glu Gln qui est le fuel symbiotique principal chez A pisum Febvay et al 1995 Deux commentaires sur ce sympt me de stress nutritionnel 1 il est tr s diff rent de celui accompagnant l aposymbiose marqu e elle par une l vation nette de l amino acid mie et de la glutamin mie et ne traduit donc pas un vague malaise indiff renci soulignant l int r t diagnostic de l outil utilis 2 si l intoxication la ConA s accompagne d une demande nutritionnelle forte cela peut laisser pr voir une interaction forte entre tat nutritionnel et toxicit accentuant la toxicit de la lectine dans des conditions moins favorables que celles utilis es ici Cette pr diction est tr s ais e confirmer en milieu artificiel et devra tre test e rapidement Un dernier point n est pas apparu dans les analyses de miellat mais ressort assez nettement de celles des pools libres totaux comme pour les acides amin s aromatiques cit s plus haut les teneurs en proline sont constamment d prim es au cours de l intoxication Cela peut souligner soit un effet corr l au ph nom ne d hyperexcr tion li l arginine soit encore une corr lation avec les acides amin s aromatiques qui sont utilis s avec la proline par les insectes pour des besoins structuraux de d veloppement comme la synth se des tissus conjonctifs et de la cuticule Brey et al 1985
309. n aval dans l intestin mais l encore il peut y avoir des sp cialisations diff rentielles d absorption des acides amin s le long du tractus digestif 103 Une synth se et excr tion d Asn dans le miellat partir de Gln marqu e ing r e a par exemple t signal e chez les pucerons aposymbiotiques par Sasaki ef a 1993b N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 171 Le deuxi me l ment du syndrome d intoxication par la ConA en ce qui concerne le miellat est l hypers cr tion d Arginine passage de 25 50 des acides amin s du miellat suite l intoxication Ici contrairement Asn cela s accompagne d une nette perturbation globale du m tabolisme de cet acide amin c est en effet le seul acide amin s accumulant progressivement dans les pools libres totaux au cours de l intoxication figure 48A et B La ConA semble donc stimuler directement ou indirectement les voies d excr tion du puceron notamment celles de l arginine au d triment d une ventuelle voie de la lysine cette observation s accorde bien avec la localisation histologique des effets de la ConA au niveau de l estomac moyen si ge des activit s aminopeptidases basiques signal es un peu plus haut Le troisi me l ment ventuellement quantitativement mineur concerne l apparition d une excr tion d un compos ninhydrine positif identifi par X ou cystine pour signaler son temps de r tentio
310. n entre les trois modalit s n est possible qu en tenant compte du nombre de larves d j pondues au moment o les adultes sont pes s En effet J15 les pucerons sur milieux t moins sont en phase d croissante de leur ponte alors que les adultes sur milieux lectines pr sentent leurs pics de f condit Les pucerons commencent pondre avec environ 1 jour 3 jours et 4 jours de retard sur milieux ConA80 ConA100 et ConA200 respectivement tableau 8 variable d ce qui se traduit par un d calage des pics de f condit calcul s par les ajustements figure 15C Les contenus embryonnaires de ces trois lots d aphides au jour J15 sont donc tr s diff rents et la masse globale d un puceron adulte d pend minemment de ce contenu embryonnaire au moment de son pic de f condit notamment il est alourdi par des embryons arriv s maturit Une comparaison des masses des pucerons de chaque modalit pes s au m me stade de reproduction pic de f condit ou fin de p riode reproductive nous aurait vraisemblablement montr que les pucerons intoxiqu s ne compensent que partiellement leur inhibition de croissance au jour J7 Il faut noter que le probl me du r sultat du groupe t moin de la deuxi me exp rience peut avoir minimis l effet de la ConA Ce groupe et lui seul sur les cinq a pr sent une mortalit pr reproductive et larvaire voir tableau 8 anormale et que nous n expliquons pas 11 individus ont du tre retir s de l
311. n similaire l aminoacide soufr sa teneur relative dans le miellat augmente de 4 5 fois apr s intoxication mais l absence d identification ne nous permet pas d interpr ter sa pr sence Signalons cependant que certains dipeptides amides y glu Gln ou y Glu Asn ont t identifi s par une quipe japonaise dans le miellat de pucerons aposymbiotiques De tels compos s non identifi s dans nos chromatogrammes la ninhydrine pourraient plausiblement tre d tect s en accompagnement des perturbations cit es du transport de Asn Enfin le dernier l ment concerne la diminution parfois tr s importante de nombreux acides amin s indispensables dans les miellats de pucerons intoxiqu s Try Ile Val Leu Tyr Phe figure 49 et donn es chiffr es en annexe 12C Ce fait peut tre assez directement reli aux pertes prot iques li es l acc l ration tr s importante de l exfoliation de l estomac par la ConA et observ es tant en histologie que dans les lectrophor ses de miellats Ces pertes n cessitent le remplacement de mat riel cellulaire e g bordure stri e avec toutes ses enzymes et transporteurs et donc une consommation accrue d acides amin s essentiels Ce sympt me de stress nutritionnel est soulign non seulement par l accroissement d assimilation entrainant des taux tr s faibles dans le miellat mais galement par une diminution assez g n rale de l amino acid mie notamment de certains acides ami
312. nA Ces donn es sont analys es et discut es dans le chapitre 4 Cette observation a des implications importantes dans une strat gie visant cr er des plantes transg niques r sistantes aux pucerons Une expression trop faible dans la s ve phlo mienne aurait pour cons quence d augmenter plut t que de diminuer la croissance des populations aphidiennes L tape ult rieure de notre tude consiste observer les effets des lectines in vitro des concentrations susceptibles d tre exprim es dans des plantes transg niques Le premier test long terme sur A pisum avec la ConA des doses subl tales est difficile interpr ter cause des performances m diocres du lot de pucerons t moins de la deuxi me s rie Nous constatons cependant que l intoxication entrainerait une plus grande long vit des pucerons En terme de dynamique de croissance populationnelle les adultes sur les milieux ConA sont significativement affect s pour les deux tests mais le nombre total de larves pondues par les pucerons est identique pour chacune des trois modalit s du second test Ce travail n a pas t reconduit pour confirmer ou non ces r sultats Du fait des contraintes que ce type d exp rience impose au niveau de la dur e nous avons privil gi l tude des effets long terme de la GNA et de la ConA sur M persicae l esp ce utilis e dans un premier temps pour les tests biologiques sur plantes transg niques Une r duction de la f con
313. nA fluorescente A coupe au niveau de l estomac ant rieur x 125 B coupe au niveau de l estomac interm diaire x 125 C estomac post rieur x 500 140 Planche II Coupes transversales d une larve d Acyrthosiphon pisum au niveau de l estomac interm diaire larve non intoxiqu e A x 500 larve ayant ing r du milieu contenant 10 ug ml de ConA B1 x 500 B2 x 1250 larve ayant ing r du milieu contenant 400 ug ml l de ConA C1 x 500 C2 x 12805 cana itte ot te er el eti es tn Boc Ot EE RU a be canteen dent a 144 Planche III Immunohistochimie sur coupes de larves d Acyrthosiphon pisum intoxiqu es par la ConA Les coupes estomac interm diaire sont soumises un anticorps anti ConA et la lectine est visualis e par la coloration brune Toutes les lames sont color es au bleu de toluidine Larve non intoxiqu e A larve intoxiqu e la concentration de 200 ug ml B1 amp B2 larve intoxiqu e la concentration de 400 ug ml l C et 800 ug ml D T moin de sp cificit E ConA400 Grosissement x 500 except pour B2 x 1250 145 Planche IV Immunohistochimie sur coupes de larves d Acyrthosiphon pisum intoxiqu es par la ConA 800 ug ml 1 Les coupes localisent la lectine dans les diff rentes r gions du tubes digestif 148 Planche V Observations au microscope lectronique transmission de l ultrastructure des cellules m sent riques d une larve du puceron du pois
314. ndant 30 min 37 C Rincer 3 fois avec du PBS Tween Etape 2 Incubation de la ConA D poser 100 ul puits selon le plan de plaque gamme 5 ng ml1 500 ng ml 1 gamme de ConA dans PBS Tween g latine chantillons secs repris dans le PBS Tween g latine Recouvrir et incuber 30 min 37 C Rincer 5 fois avec du PBS Tween Etape 3 Incubation du conjugu D poser 100 ul puits selon le plan de plaque anticorps secondaire biotinyl ConA Recouvrir et incuber 1 h 37 C dilu 1 ug ml 1 dans PBS Tween g latine 123 5 Rincer 5 fois avec du PBS Tween Etape 4 R v lation D poser 100 ul puits selon le plan de plaque Addition de l avidine Recouvrir et incuber 1 h temp rature ambiante dilu 0 1 ug ml dans PBS Tween g latine de Oh A Vider la plaque laver 5 fois avec du PBS Tween x Addition de la peroxydase biotinyl e D poser 100 ul puits selon le plan de plaque Recouvrir et incuber 1 h temp rature ambiante H dilu 0 1 ug ml dans PBS Tween g latine Vider la plaque laver 5 fois avec du PBS Tween Coloration TMB D poser rapidement 100 ul puits de la solution substrat TMB fraichement pr par e Incuber temp rature ambiante 10 30 min Sans arr ter la r action lire l absorbance 8 E 640 nm de 2 min en 2 min remarque comme pour toutes m thodes immunoenzymatiques ce dosage a t optimis en trouvant pour c
315. nduits sur le puceron du p cher M persicae Deux tests ind pendants d une part avec la ConA la concentration de 140 ug ml et d autre part avec la GNA 215 ug ml et 450 ug ml nous permettent de d crire les effets long terme de ces deux lectines La concentration de ConA a t choisie de mani re obtenir J8 une inhibition de la croissance des jeunes adultes de l ordre de 35 96 inhibition calcul e partir de l ajustement de la figure 13 Les doses de GNA devaient induire une inhibition de croissance de 30 et 40 pour les doses respectives de 215 ug ml et 450 ug ml Le tableau 9 r sume les r sultats obtenus Les inhibitions de croissance induites par les deux doses de GNA sont en ad quation avec les r sultats attendus 31 et 37 de r duction de la croissance Par contre la croissance des pucerons est moins affect e par la ConA que nous nous y attendions IC observ e 15 vs 35 attendu Cette observation rejoint celles faites sur A pisum il existe une variabilit des r sultats d intoxication par la ConA Celle ci pourrait s expliquer par une h t rog n it de la mati re premi re poudre A 99 2 une interaction toxicit effet puceron effet maternel tel que nous l avons d fini pr c demment 50 Nous supposons que la m thode de Birch permet d obtenir le meilleur estim de la valeur du rm d une population de pucerons Chapitre 2 Effets des lectines sur la
316. ne elles contribuent respectivement pour 37 et 12 la d finition de l axe 2 permettent une discrimination t moin GNA L ornithine bien qu excentr e ne contribue pas la d finition de l axe 2 et ne doit pas tre prise en compte L AFC ConA GNA figure 48C nous am ne souligner deux points 1 l intoxication par la ConA se manifeste par une modification graduelle en fonction de la concentration en lectine du profil des acides amin s libres des pucerons 2 les intoxications par la ConA et la GNA induisent des modifications significativement diff rentes des profils de ces acides amin s libres annexes 12A amp 12B Cette diff rence est li e principalement l arginine et la glutamine Elles contribuent respectivement pour 43 et 18 la d finition de l axe 1 qui discrimine parfaitement les modalit s ConA400 et GNA400 La discrimination entre les modalit s ConA200 et GNA400 parait moins tranch e sur la carte factorielle Mais la figure 47B confirme que les broyats de pucerons intoxiqu s par la ConA200 contiennent plus d arginine x 1 6 et inversement moins de glutamine 1 6 que les broyats de pucerons intoxiqu s par la GNA Au niveau de l aminoacid mie il y a donc bien distinction entre les intoxications par les deux lectines mannose N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 157 Miellats donn es exprim es en S Y co co an Thr m m S
317. ne constitue donc qu un mod le support de nos recherches Cela explique qu plusieurs reprises nous ayons effectu des exp riences sur d autres esp ces d aphides Le premier chapitre de cette th se traite dans un premier temps de la biologie des pucerons de l adaptation leurs plantes h tes et de la gravit des d gats qu ils engendrent autant de caract ristiques qui illustrent leur importance conomique et impliquent des moyens de lutte sp cifiques Nous les d crivons bri vement pour mieux montrer ensuite l int r t de la cr ation de plantes transg niques r sistantes aux pucerons Le chapitre se poursuit alors par une revue des prot ines entomopathog nes exploitables pour cette nouvelle strat gie Nous insistons sur le potentiel d utilisation des lectines v g tales pour lutter contre les ravageurs phytophages et en particulier les Homopteres Nos r sultats sont d taill s dans trois chapitres Le premier d entre eux d crit la d marche qui nous a conduit nous int resser aux lectines mannose glucose Les effets de ces prot ines sur la biologie des pucerons survie croissance f condit sont caract ris s par des tests d intoxication aigu ou subl tale sur des milieux artificiels Les performances biologiques d aphides sur des pommes de terre transg niques exprimant le g ne de la GNA sont discut es Le second chapitre constitue la premi re tape dans la caract risation du mode d action des lectines sur
318. nes x 12 variables li es la mortalit ou la croissance Les effets de ces vingt sept lectines correspondent des doses comprises entre 10 et 250 ug ml En fait vingt huit lectines devraient apparaitre dans nos r sultats mais la lectine d Amaranthus caudatus L ACA a t supprim e de l analyse Des calculs pr liminaires prenant en compte cette lectine montrent que le premier facteur est principalement induit par celle ci ce qui g ne l tude du reste des lectines L ACA se distingue de ces derni res en induisant d s les premiers 47 Donn es brutes en annexe 5 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 59 nS ie mdlc effets d s faible dose gt effets forte dose UEA RPA Figure 9 D pouillement graphique des deux premiers facteurs de l ACP norm e se rapportant au tableau 27 lectines x 12 variables mortalit et inhibition de croissance A Diagramme des valeurs propres B Cercle des corr lations variables facteurs C1 Plan factoriel F1 F2 des lectines C2 Carte factorielle identique Cl repr sentation des centres de gravit par classe de lectines et liaisons classe points Man classe des lectines Man Glc Glc lectines GlcNAc Glc Gal lectines GalNAc autres classes de lectines Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 60 jours du test une tr s
319. neus coil of intearina waxy drop Eh pees let NT a z und ms
320. neuses par exemple peuvent s expliquer par des mutations ponctuelles simples De ce point de vue elles constituent de bons marqueurs phylog n tiques pour tudier les processus de sp ciation par des m thodes de biologie mol culaire Roug ef al 1987 En d pis de ces tr s fortes homologies structurales les sp cificit s osidiques des lectines des L gumineuses sont parfois tr s diff rentes paragraphe suivant Des travaux ont t entrepris depuis quelques ann es pour comprendre l interaction mol culaire de ces lectines avec des oses des d riv s d oses et des structures glycanniques complexes Le site de liaison au mannose de la ConA de la lectine de la lentille LcH ou de Lathyrus ochrus a par exemple t caract ris au sein des structures tridimensionnelles de ces polypeptides Derewenda et al 1989 Bourne et al 1990b Bourne et al 1992 Delbaere et al 1993 Rini et al 1993 Ayouba et al 1994 Nous revenons sur ce point lors de la discussion en fin de Chapitre 4 27 En dessous d un pH 5 le dim re conserve sa sp cificit osidique mais ne pr cipite plus les polysaccharides Goldstein et Poretz 1986 Chapitre 1 Contexte de l tude 42 3 2 2 La sp cificit osidique des lectines est la base de leur classification La sp cificit osidique des lectines se d finit en terme de concentration minimale de monosaccharides n cessaire pour inhiber l agglutination ou la r action de pr cipitation
321. nig S H Interactions of Concanavalin A with a trimannosyl oligosaccharide fragment of complex and high mannose type glycopeptides Biochem Bio Res Comm 1985 Vol 1985 N 29 p 1066 1071 Brey P T Ohayon H Lesourd M Castex H Roucache J et Latge J P Ultrastructure and chemical composition of the outer layers of the cuticle of the pea aphid Acyrthosiphon pisum Comp Biochem Physiol 1985 Vol 82A N 2 p 401 411 Broadway R M Are insects resistant to plant proteinase inhibitors J Insect Physiol 1995 Vol 41 N 2 p 107 116 Broadway R M et Duffey S S Plant proteinase inhibitors mechanism of action and effect on the growth and digestive physiology of larval Heliothis zea and Spodoptera exigua J Insect Physiol 1986 Vol 32 N 10 p 827 833 Broadway R M Duffey S S Pearce G et Ryan C A Plant proteinase inhibitors a defense against herbivorous insects Entomol exp appl 1986 Vol 41 p 33 38 Broekaert W F Nsimba Lubaki M Peeters B et Peumans W J A lectin from elder Sambucus nigra L bark Biochem J 1984 Vol 221 p 163 169 Broekaert W F Vanparijs J Leyns F Joos H et Peumans W J A chitin binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties Science 1989 Vol 245 p 1100 1102 Broglie R et Broglie K Chitinase gene expression in transgenic plants a molecular approach to understanding plant defence responses Phil Trans R Soc Lond
322. nous ne connaissons pas le taux d expression des lign es test es en f vrier 1994 M me si les r sultats des dosages et des tests biologiques pr sentent une bonne ad quation il serait imprudent d en tirer des conclusions h tives A l heure actuelle en effet aucun dosage fiable nous a permis de quantifier pr cis ment la GNA dans le compartiment alimentaire des pucerons les vaisseaux cribl s du phlo me Nous ne savons donc pas si la concentration en GNA dans la s ve labor e est r ellement diff rente d une lign e l autre d un test l autre pour une m me lign e A fiortiori nous ne connaissons pas non plus les quantit s de lectine ing r es par les pucerons sur chacune de ces lign es en fait plus que le taux d expression c est surtout ce dernier param tre qui nous int resse Une technique pourrait nous permettre de doser la GNA dans la s ve phlo mienne la stylectomie Celle ci consiste couper les stylets des pucerons en phase d alimentation et r colter le flux de s ve labor e exsudant de l extr mit des stylets sectionn s Des essais pr liminaires effectu s dans notre laboratoire ont montr la faisabilit de cette approche 10 20 nl de s ve peuvent en effet tre r colt s chaque pr l vement ce qui est quand m me une situation assez d favorable par rapport d autres couples plante puceron Girousse et al 1991 Dans une plante exprimant la GNA une concentration de 200 ug ml
323. ns ne sont pas comparables ils diff rent principalement par leur f condit totale Lv Il est int ressant de constater que m me une intoxication relativement faible 10 d inhibition de croissance 80 ug ml se traduit par un effet significatif sur ce param tre Concernant le deuxi me test les diff rences entre le lot t moin et les lots lectines s expliquent uniquement par le d calage existant au niveau du premier jour de ponte En effet les valeurs de f condit de ces premiers jours sont d terminantes dans les calculs des rm fiche protocole N 12 Si un doublement de la dose de ConA induit des effets significatifs sur la masse des pucerons J7 ou J15 il n en est pas de m me pour la vitesse de croissance Dans le cas pr sent une intoxication plus forte n entraine pas de diminution du nombre de larves pondues Lv et les courbes de f condit sont superposables sur la figure 15C les rm des modalit s ConA100 et ConA200 sont donc pratiquement identiques L utilisation de l approximation de Birch ou de la m thode de Wyatt amp White pour le calcul des rm nous am ne aux m mes conclusions concernant les diff rences observ es entre chaque modalit La m thode de Wyatt amp White conduit cependant une sous estimation de la valeur des rm 3 1 2 2 Effets de concentrations subl tales de ConA et de GNA sur la croissance et la f condit de M persicae Des tests d intoxications subl tales ont galement t co
324. nt galement pes s au 15 me jour c est dire apr s 7 jours de vie larvaire plus 8 jours de vie adulte 2 8 3 Intoxication subl tale de M persicae par la ConA et la GNA La f condit des pucerons de l esp ce M persicae intoxiqu s par de la ConA ou de la GNA a galement t valu e Le protocole suivi est identique celui que nous venons de d crire pour A pisum l exception pr s que les jeunes adultes sont pes s et transf r s au jour J8 et non J7 Deux exp riences ind pendantes ont t conduites 1 l une avec de la ConA 140 ug ml 2 une seconde avec de la GNA 215 et 450 ug ml 1 Nous avons choisi des concentrations comprises entre les IC20 et les IC50 d termin es auparavant par les tests d intoxication aigu Les vingt pucerons mis pondre sont choisis sur la base de leur masse parmi quarante soixante apt res survivants Pour la GNA les adultes sont pes s au jour J20 2 8 4 Tests biologiques long terme sur pommes de terre transg niques La f condit de M persicae ou d A solani sur des pommes de terre transg niques est valu e selon le principe que nous venons d crire pour les tests long terme sur milieu deux femelles matures sont d pos es sur une feuille et isol es dans une clip cage Figure 8 Dispositif exp rimental mis en place pour tester les effets des plantes transg niques sur la croissance et la f condit des pucerons M persicae et A sol
325. nt associ s Ces produits diffusent en effet jusque dans le phlo me le compartiment alimentaire des pucerons Deux autres familles de compos s chimiques les carbamates et les pyr thr noides de synth se largissent le spectre d action des produits phytosanitaires Les diff rences de mode d action de ces produits permettent ainsi d envisager de les utiliser en alternance pour viter a priori l ventuelle apparition de ph nom nes de r sistance des insectes ces compos s Schepers 1989 La lutte chimique apparait encore aujourd hui comme le moyen le plus efficace pour l agriculteur et le plus rentable pour les industries phytosanitaires dans le contr le des organismes nuisibles La productivit d un nouveau pesticide est g n ralement tr s lev e apr s son introduction sur le march ou tout au moins l a t par le pass Par exemple l utilisation du DDT contre le doryphore de la pomme de terre Leptinotarsa decemlineata Say et la cicadelle de la pomme de terre Empoasca fabae Harris a produit des b n fices de 29 francs par franc investi au cours des premi res ann es d utilisation Metcalf et Luckman 1982 Des infestations graves de la plupart des esp ces nuisibles peuvent tre r duites dans les heures suivant les traitements Cette action rapide alli e la facilit d utilisation et la disponibilit des compos s chimiques et de la technologie de traitement ou d application font de la lutte chimique un out
326. nt color es au bleu de toluidine Larve non intoxiqu e A larve intoxiqu e la concentration de 200 ug ml B1 amp B2 larve intoxiqu e la concentration de 400 ug ml C et 800 ug ml D T moin de sp cificit E ConA400 Grossissement x 500 except pour B2 x 1250 Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 146 L immunohistochimie sur coupe de larves intoxiqu es par de la ConA permet une analyse plus fine de l intoxication cellulaire Les trois concentrations choisies 200 400 et 800 ug mI marquent une volution dans l intoxication aigu Sur la planche III les coupes A C et D illustrent les effets de ces concentrations respectives au niveau de l estomac interm diaire La couleur marron localise la lectine La coupe A correspond un estomac de puceron normal Le t moin de sp cificit est repr sent sur la photo E coupe de l estomac d une larve intoxiqu e la ConA400 incub e en pr sence de s rum antilapin pr immun et non de l anticorps anti ConA A 200 ug ml coupe Al certaines cellules pith liales semblent simplement hypertrophi es pour d autres la membrane apicale se d tache par morceaux des d bris membranaires sont retrouv s proximit imm diate Ils sont moins marqu s que les d bris granuleux qui s accumulent dans la lumi re de l estomac A 400 ug ml nous retrouvons ces d bris granuleux Il apparait de mani re tr s caract ristique que la membrane a
327. ntation sch matique d un graphe d EPG transfert l re piq re temps de fixation 15h36 derni re onde np RE E OS END ee DE HUE m ondes G dur e d acquisition 24h ondes C np N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 115 3 3 3 2 Analyses univari e et multivari e Seules les variables 6 7 8 et 11 permettent de distinguer les deux lots de pucerons apr s les heures d intoxication avec de la ConA 400 ug ml Ces variables se rapportent toutes l onde de type G figure 36 Le tableau 16 indique plus pr cis ment que les pucerons restent en phase d ingestion sur les 4 premi res heures pendant 1 h 37 min variable 6 sur milieux ConA contre 2 h 19 min pour les pucerons sur milieux standards Les individus de chaque lot piquent aussi souvent dans leur milieu respectif 20 piq res variable 2 p 49 96 et montrent autant de phases d ingestion 3 phases variable 3 p 22 96 Cependant entre deux phases de non p n tration les pucerons non intoxiqu s ing rent plus longtemps en moyenne bien que les dur es soient variables variable 7 p 4 3 96 Les enregistrements sur 8 h indiquent un comportement des pucerons sensiblement analogue mais les donn es sur 24 h montrent que sur ce laps de temps les diff rences entre les milieux avec ou sans ConA s estompent progressivement En moyenne les individus sur milieux standards restent fix s
328. ntes transg niques lorsqu ils disposeront de promoteurs phlo me sp cifiques D ores et d j des pommes de terre transform es avec un promoteur constitutif exprimant le g ne de la GNA et ou d une chitinase ont t mises notre disposition par le D partement de Biologie de l Universit de Durham Dr J A amp A M R Gatehouse Les performances biologiques de pucerons sur ces plantes sont d crites Les r sultats obtenus sont discut s en les comparant avec ceux observ s sur milieux artificiels N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 51 2 Mat riels et M thodes 2 1 Origines et levage des insectes L origine et les conditions d levage des six esp ces de pucerons qui ont fait l objet de notre tude sont donn es dans la fiche protocole N 1 Avant chaque test les populations d aphides sont homog n is es par synchronisation de leur production Des adultes ail s matures sont transf r s sur des jeunes plants Apr s 48 h ils sont retir s et les larves issues de cette ponte sont laiss es sur les plantes le temps de leur d veloppement complet 4 stades larvaires 7 9 jours suivant les esp ces de pucerons faible densit de population Les jeunes adultes apt res obtenus sont transf r s sur de nouveaux plants et laiss s pondre 24 h Les larves issues de cette ponte sont alors transf r es sur les milieux artificiels ou les plantes transg niques tester Les adu
329. nts ne sont pas li s une mortalit plus grande des pucerons sur les plantes transg niques Les taux de survie des pucerons sur chacune des modalit s ne diff rent jamais significativement au cours des 30 jours du test figure 20A Modalit T moin PBG6 47 PWG6 85 Prot ines GNA chitinase GNA N nombi 13 18 15 Survie Dv dur e de vie moyenne 27 4 0 8 26 1 1 4 26 3 1 1 mortalit Jog 39 29 33 Croissance d dur e de la p riode pr reproductive 9 2 0 3 a 10 6 0 4 b calcul e uniquement avec les pucerons qui ont pondu Effets F condit Dr dur e de la p riode reproductive 9 9 0 9 a 0 7 0 3 43 06 b sur Lv nombre de larves pondues puceron 25 5 3 2 a 1 6 0 7 9 6 2 0 b les Lv Dv 1 34 020 a 0 08 0 04 0 60 0 14 b adultes Lv Dr 2 51 023 a 0 60 0 25 1 85 028 b DT dur e pour doubler la taille de la popu 2 97 16 91 4 12 lation Taux intrinse Birch 1948 0 243 0 040 0 173 Tableau 11 Performances biologiques d Aulacorthum solani sur pommes de terre transg niques f vrier 1994 Les dur es sont indiqu es en jours L erreur standard SE de chaque valeur est donn e entre parenth ses sur une m me ligne les valeurs suivies par des lettres diff rentes diff rent significativement au seuil de 5 les faibles valeurs obtenues avec PBG6 47 n ont pas n cessit que nous les prenions en compte dans l analyse statistiqu
330. o acid sequence involved in the putative carbohydrate binding domain of a legume lectin specific for sialylated carbohydrate chains primary sequence determination of Maackia amurensis hemagglutinin Mah J Biochem Tokyo 1994 Vol 115 N 4 p 767 777 Koziel M Beland G Bowman C Carozzi N Crenshaw R Crossland L Dawson J Desai N Hill M Kadwell S Launis K Lewis K Maddox D McPherson K Meghji M Merlin E Rhodes R Warren G Wright M et Evola S Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis Bio Technology 1993 Vol 11 p 194 200 Krasnoperov V G Shamotienko O G et Grishin E V A crustaceae specific neurotoxin from the venom of the Latrodectus mactans tredecimguttatus spider Bioorg Khim 1990a Vol 16 p 1567 1569 Krasnoperov V G Shamotienko O G et Grishin E V Isolation and properties of insectospecific neurotoxins from venom of the Latrodectus mactans tredecimguttatus spider Bioorg Khim 1990b Vol 16 p 1138 1140 Kring J B Flight behaviour of aphid Ann Rev Entomol 1972 Vol 17 p 461 492 Kumar M A Timm D E Neet K E Owen W G Peumans W J et Rao A G Characterization of the lectin from the bulbs of Eranthis hyemalis winter aconite as an inhibitor of protein synthesis J Biol Chem 1993 Vol 268 N 33 p 25176 25183 Landry B S La cr ation et le clonage des g nes
331. oborer cette hypoth se Si cette remarque s applique aux lectines mannose glucose elle est vrai aussi pour les lectines des autres classes m me si les effets diff rentiels de ces derni res sont moins contrast s Par exemple les lectines N ac tyl glucosamine se r v lent soit compl tement inactives dans la gamme de concentration test e telle WGA une lectine non prise en compte dans notre analyse Rahb et Febvay 1993 soit mod r ment actives comme l UDA soit assez toxiques comme la BSII Cette observation rejoint les conclusions d tudes ant rieures sur les effets toxiques de lectines de classes diff rentes vis vis de col opt res Gatehouse et al 1995b Ces premiers r sultats montrent que la lectine 4 mannose glucose de Canavalia ensiformis ConA et la lectine 4 mannose strict du perce neige GNA pr sentent de bonnes caract ristiques aphidotoxiques a priori int ressantes a exploiter en transg n se D autres crit res ont renforc notre choix pour ces deux lectines 1 la ConA constitue un mod le tr s tudi au niveau biochimique Nous disposons ainsi d une litt rature abondante concernant son mode d action in vivo ou in vitro sur diff rents tissus ou cellules en particulier sur l pith lium de l intestin moyen de rat et sur la nature de ses interactions avec les sucres D un point de vue pratique galement il nous tait plus facile d obtenir des produits tels que de la ConA fluorescente C
332. ogie Cellulaire de l INRA de Versailles Lise Jouanin le laboratoire de Biologie Mol culaire de l Universit de Durham en Grande Bretagne Angharad Gatehouse et le laboratoire de Biologie Appliqu e de l INRA INSA Lyon Yvan Rahb Le travail d crit dans cette th se constitue l une des tapes de ce programme de recherche l objectif en tant de caract riser la toxicit de prot ines purifi es vis vis des pucerons et d tudier le m canisme de la toxicit des mol cules candidates en l occurrence des lectines v g tales de la classe des lectines mannose la Concanavaline A ConA la lectine de la l gumineuse tropicale Canavalia ensiformis L DC et la lectine du perce neige Galanthus nivalis L GNA Connaitre le m canisme de la toxicit est important dans la mesure o cela permet 1 de surmonter de fa on rationnelle les difficult s ventuelles de mise en oeuvre de la strat gie 2 de mieux comprendre et de suivre d ventuelles apparitions de populations d insectes r sistant aux entomotoxines introduites et donc de juger de la pertinence d exploiter ou non les g nes des prot ines candidates Pour des raisons m thodologiques et pratiques notre travail est essentiellement ax sur le puceron du pois Acyrthosiphon pisum Harris Mais notre tude vise trouver une des N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 13 lectine s toxique s pour les pucerons en g n ral et A pisum
333. on alcoolique Tou oxyde de propyl ne Fiche N 23 Extraction des acides amin s libres broyats de pucerons extraits de miellat pucerons entiers miellats secs a stockage 20 C ajouter 250 ul de TCA 5 ajouter ac glucosaminique standard interne chromatographie broyer au Potter laisser incuber 2 h T ambiante agiter 4 fois centrifugation 10 min 9500 tr min 4 C surnageant repris dans un eppendorf propre ajouter 250 ul chloroforme agitation Vortex manuelle centrifugation l g re limination de la phase inf rieure chloroforme lipides TCA x3 phase sup rieure ac amin s reprise dans un eppendorf propre s chage final au Speed Vac repris dans le tampon Beckman conserver 4 C injection 1 eqv mg Autoanalyseur Chromatographie d affinit concentration 2 5 nmol ul Annexes Acyrthosiphon pisum Harris Pea Aphid Plate INI destructor pisi onobrychidis A pisum is a complex of races and subspecies with different nost plant ranges and preferences some recognizable by their morphology but the extent of interbreeding is largely unknown Appearance in life Rather large green or pink aphids with siender appendages forming colonies on young growth and developing pods of many herbaceous and some shrubby Leguminosae Immartures very lightly dusted with wax Apterae 2 5 4 4 mm alatae 2 3
334. onA FITC ou des anticorps anti ConA 2 la GNA quant elle poss de des caract ristiques qui en font le meilleur candidat l application envisag e outre les propri t s aphidotoxiques d crites dans ce chapitre la GNA est galement non toxique pour les mammif res et son g ne est d j disponible et exprim dans des plantes transg niques pomme de terre tabac par nos coll gues britanniques initialement pour sa toxicit sur d autres familles d insectes L tude du mode d action de la GNA sur les pucerons est initi e depuis plus d un an Durham Rachel Down phD et des travaux sur un autre homopt re la cicadelle du riz Nilaparvata lugens ont d j fait l objet d une th se Powell 1993 La comparaison des modes d action de la ConA et de la GNA est donc rendue possible N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 87 Par ailleurs si ces deux lectines pr sentent des propri t s toxiques int ressantes vis vis du puceron du pois il tait important de d terminer si cette toxicit se manifestait sur d autres esp ces aphidiennes en particulier le puceron du melon l aphide cible dans le cadre du programme INRA et des esp ces telles que M persicae susceptibles d tre utilis es pour tester des pommes de terre transg niques Nous avons donc intoxiqu cinq autres esp ces d aphides des concentrations de ConA comprises entre 5 et 1500 ug ml Nous discuterons de l int r t
335. oncentration en lectine ug ml 1 chelle Log x 1 Ajustement R2 IC20 IC50 CL20 CL50 A pisum logarithmique 0 94 3 33 lt 15 310 M albifrons lin aire 0 99 140 310 180 330 M persicae logarithmique 0 81 10 440 nl nl A gossypii logarithmique 0 95 17 gt 1500 ol 1200 M euphorbiae lin aire 0 93 830 21500 nl nl A solani lin aire 0 84 1070 21500 nl nl M me la dose la plus faible 15 ug ml D plus de 20 des pucerons sont morts J 7 nl ConA non l tale m me la plus forte dose 1500 ug ml l Figure 11 Effets de la Concanavaline A sur la croissance de six esp ces de pucerons Les masses moyennes SE sont rapport es la masse moyenne du t moin L ajustement des donn es par un mod le lin aire ou logarithmique choix fonction de la valeur du coefficient de corr lation permet le calcul des IC20 et IC50 Les CL20 et CL50 sont aussi donn es quand le calcul est possible N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 63 3 1 1 3 Effets de lectines mannose sur la survie et la croissance des larves de M persicae Des larves de M persicae ont t intoxiqu es par quatre lectines mannose glucose ConA GNA NPA et ASA des concentrations comprises entre 10 ug ml 1500 ug ml pendant une p riode de 8 jours n 5 r p titions de 20 pucerons par concentration test e except e pour la plus forte concentration n 3 x 20 Cette dur e correspond au temp
336. oncentrations en IP de 250 ug ml Nous pouvons cependant noter que ces auteurs confirment l absence d endoprot ase s rine chez ce puceron 4 Rahb er al 1995 comme cela avait t mentionn auparavant Srivastava et Auclair 1963 1987 Ces r sultats en contradiction avec le mode d action des IP d crit pr c demment pourraient s expliquer par une action de ces mol cules sur des cibles extra digestives qu elles atteindraient en traversant la barri re de l pith lium intestinal Rahb et Febvay 1993 En effet de tels transports trans pith liaux de prot ines ont d j t observ s chez les mammif res Billings et al 1991 et les insectes Allingham et al 1992 La compr hension du mode d action des IP n est donc pas encore compl te au moins en ce qui concerne leur mode d action chez les Homopt res Des travaux devront tre initi s dans ce sens pour exploiter ces mol cules dans une strat gie de cr ation de plantes transg niques r sistantes aux pucerons 24 Ceci correspondrait une adaptation des pucerons une alimentation faible teneur en prot ine La concentration en prot ines dans la s ve phlo mienne des plantes est de l ordre de 0 2 2 mg mI except chez les Cucurbitac es o elle peut tre 50 fois plus lev e 100 mg ml Fisher ef a 1992 N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 37 3 Les lectines v g tales sont des candidates int ressantes
337. onction d excr tion au stomodeum rectum Nous avons constat chez A pisum que cette partie du m sent ron est tr s d velopp e figure 43 Il nous parait probable que cette poche tr s dilat e joue un r le dans l osmor gulation pouvant tre rapproch de celui de la chambre filtrante observ e chez d autres Homopt res Nous pouvons rappeler que la r gulation de la pression osmotique est un processus essentiel chez ces insectes qui ing rent de grandes quantit s de nourriture liquide dont la concentration en solut s peut varier assez consid rablement La fonction de s cr tion des cellules stomacales est rapprocher du fait que les l sions observ es d butent dans l estomac et se traduisent par un acroissement tr s marqu de l envahissement de la lumi re par du mat riel cytoplasmique et autres d bris cellulaires Mais l intoxication cellulaire ne se limite pas ces simples s cr tions puisque c est l ensemble de la membrane pith liale qui semble tre rejet e et remplac e La ConA agirait donc en induisant une stimulation de la fonction naturelle de remplacement de cette membrane Figure 54 Repr sentation sch matique des diff rentes phases de s cr tion naturelle 1 4 d une cellule pith liale de l estomac interm diaire de Myzus persicae d apr s Ponsen 1972 amp 1987 Les abr viations sont donn es en annexe 15 Les dommages pourraient aussi ne pas se limiter l estomac notamment aux fort
338. ons de croissance IC au jour d7 induites aux 3 concentrations GIc GICNAc G amp IN Ac G gal ICb icc 5 94 163 89 _43l 91 B8 59 8 a 18 86 85 81 20 12 40 90 80 B 12 28 8 27 101 B9 88 F el B 42 RA n7 R3 12 3 3 15 105 67 82 13 10 8 23 99 Be a1 3 2 3 47 79 82 78 19 19 27 17 18 32 23 27 42 81 76 60 23 13 12 47 25 17 52 32 2 81 103 37 B 10 7 30 29 52 232 43 Go 91 014 co g 5 3 26 13 21 38 432 43 49 43 33 5 12 13 18 se 26 20 55 s 8 ssl 49 0 0 o ol of o 18 12 8 115 110 93 9 of o of of o 13 7 tal 81 s 103 0 12 7 7 13 15 12 25 17 86 68 72 2 o 8 15 OF 25 22 2 2s ou rs wi ae 0 0 2 7 3 10 10 25 22 87 72 s0 2 a 0 17 7 2 30 12 3 59 es 58 27 o o o o 3 12 12 15 99 89 99 22 LBA 0 o 0 o 2 5 3 8 15 97 92 90 23 TKA 2 C 2 3 D 2 5 3 a 97 92 ad 24 BDA o o 0 ol of 3 10 42 18 101 97 112 25 CSA _0 2 2 2 3 2 10 12 8 83 87 85 26 FPA 15 cl o 28 of o 30 2 10 101 85 83 27 SNA el 5 0 o 10 5 amp 42 15 74 48 5H ACA 3 o 23 43 o a a 10 ton ino as c Notice d utilisation du programme Toxicologie G Febvay amp Y Rahh INSA INRA 406 F 69621 Villeurbanne cedex adresse internet febvay inra fyon fr Introduction Le logiciel Toxicologie r alise la transformation lin aire pond r e d une courbe sigmo d
339. ony 3ryonia dioica Jacq Cucurbitac es 10 19 Peumans et al 1987 20 Barbieri et al 1993 CSA Gen t a balais ytisus scoparius Link 31 10 Young et al 1984 cit s par 10 scotch broom Fabac es meae Flamboyant eet pena ena ng GORGE RD ERU Pu E sp sc RD QU T URS corail tree Fabac es soybean PCA Haricot d Espagne haseolus coccineus L 4 112 30 runner bean Fabac es Tee ere dE DUST M Pre ees ee Be Sa aha tice SRL RT lima bean Fabac es SNA Sureau noir xambucus nigra L 2 2 120 140 3 p64 26 Broekaert et al 1984 elderberry Lonic rac es 27 Nsimba et al 1986 CT EE T Dh SUDO agn citata ido Pe ane einem a Ee dan eS es De Haan japanese pagoda tree Fabac es et al 1988 30 Ueno et al 1991 VVA Vesce Aicia villosa Roth 4 A4 ou 140 A 35 9 3 p137 Tollefsen et Kornfeld 1983 cit s hairy vetch Fabac es AB ou B4 B 33 6 par 3 et 17 32 Shen et al 1993 UEA I Ajonc d Europe Jlex europaeus L 2 60 68 Az3l 3 p201 18 gorse Fabac es B 32 33 Horejsi et Kocourek 1974 MAA I Maackia Maackia amurensis Koch 1 2 75 38 40 17 34 Konami et al 1994 II maackia Fabac es II 4 140 34 36 gp Nd a re aaa bu CE EE DL aye Lr MM LT I P A IE ubuntu ou d black locust Fabac es 36 Tazaki et al 1992 Tableau 5 Origines et caract ristiques mol culaires des lectines v g tales test es sur les pucerons classification identique c
340. oses subl tales de ConA sur la croissance la survie et la f condit du puceron du pois Acyrthosiphon pisum o poteet e etd ERR Pea E pe bre pU ebbe ie Dep ones 67 Tableau 9 Effets de doses subl tales de ConA ou de GNA sur la croissance la survie et la f condit du puceron du p cher Myzus persicae esses remet emen treten nennen 71 Tableau 10 Performances biologiques du puceron du p cher Myzus persicae sur pommes de terre TANSS NMIQUES E EE TI Tableau 11 Performances biologiques d Aulacorthum solani sur pommes de terre transg niques f vrier Tableau 13 Quantit s de milieu Ap2 marqu avec ou sans ConA 200 ug ml 1 ing r es par des larves de l esp ce Acyrthosiphon pisum pr alablement intoxiqu es ou non ConA 400 ug ml l pendant des dur es de 2h T6 h osten en aid is tenere ete ipa reple Tete der eoe de ed tend 106 Tableau 14 Quantit s de milieu Ap2 marqu avec ou sans ConA 400 ug ml 1 ing r es par des larves de l esp ce Acyrthosiphon pisum pr alablement intoxiqu es ou non ConA 400 ug ml pendant des dur es de 2b A8h e eur onte caste e ERO RU RP ER dete be bot 108 Tableau 15 Variables retenues pour l analyse statistique des enregistrements EPG obtenus avec des pucerons de l esp ce Acyrthosiphon pisum sur milieux standards simples ou contenant de la Concanavaline A5 sse pene e pO ea pi eb eden tone 113 Tableau 16 Valeurs moyennes de chacune
341. ours PWG6 85 WAI9 12 ontes cumul es 35 Modalit s PI Lv mod le _ observ P2 d mod le _ observ P3 mod le T moin GNA2 23 PWG6 85 WAI9 12 55 9 0 8 49 3 2 2 69 9 0 8 58 3 1 1 56 3 0 4 50 7 1 9 66 0 1 D 51 6 2 3 10 0 0 1 13 1 0 2 10 1 0 1 12 9 0 3 10 5 0 1 13 4 0 2 9 3 0 1 113 2 0 3 0 17 0 01 0 15 0 01 0 16 0 01 0 13 0 01 20 25 Ajustement effectu y R P x B e SP 30 35 40 45 Jours Figure 22 Performances biologiques du puceron commun des serres Aulacorthum solani sur trois lign es de pommes de terre transg niques GNA2 23 PWG6 85 et WAI9 12 compl ment figure 21 La l gende est expliqu e dans le texte l erreur standard est report e pour chaque point de la figure B les valeurs des param tres P1 P2 et P3 observ s ou donn s par le mod le sont pr sent es dans le tableau de la figure C erreurs standards entre parenth ses Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 86 4 Discussion L analyse globale r alis e partir des donn es des tests pr liminaires effectu s sur 27 lectines de classes diff rentes Rahb er al 1995 permet de mieux comprendre notre int r t pour les lectines mannose glucose A notre connaissance c est la premi re fois qu un criblage syst matique de lectines pour valuer leur toxicit vis vis d un puceron est r
342. ouvelle pour l alimentation du poulet Gallus gallus Canavalia ensiformis Th se 3 me Cycle Paris VI 1989 140 p Lepl J C Bonad Bottino M Pilate G Augustin S Delplanque A Dumanoisletan V Cornu D et Jouanin L Toxicity to Chrysomela tremulae Coleoptera Chrysomelidae of transgenic poplars expressing a cysteine proteinase inhibitor Plant molec Biol 1995 in press LeTan Dumanois V D fense du cotonnier contre les insectes ravageurs tude d une strat gie bas e sur l expression conjointe d inhibiteurs de prot ases et de toxines de Bacillus thuringiensis dans la plante Th se de 3 me Cycle Universit Paris Sud Centre d Orsay 1994 91p Liadouze I Febvay G Guillaud J et Bonnot G Effect of diet on the free amino acid pools of symbiotic and aposymbiotic pea aphids Acyrthosiphon pisum J Insect Physiol 1995 Vol 41 N 1 p 33 40 Liang X Dron M Schmid J Dixon R A et Lamb C J Developmental and environmental regulation of a phenylalanine ammonia lyase B glucuronidase gene fusion in transgenic tobacco plants Proc natl Acad Sci USA 1989 Vol 86 N 23 p 9284 9288 Liener LE Nutritional signifiance of lectins in the diets in The lectins properties functions and applications in biology and medecine Orlando USA Irvin E Liener Nathan Sharon Irwin J Goldstein Eds Academic Press Inc 1986 p 527 554 Liener I E Sharon N et Goldstein I J The lectins prop
343. par l intestin Notre observation en histofluorescence se rapporte un puceron intoxiqu une dose relativement faible Toute la lectine ing r e serait donc retenue dans l estomac qui ne serait pas encore satur en toxine Pour v rifier notre premi re hypoth se l quivalent d un estomac ou d un intestin est incub avec 500 ng de ConA dans une solution de PBS pendant 1 h 4 C Apr s centrifugation 14000 g 1 h 4 C nous dosons la lectine restant sous forme solubilis e dans l extrait surnageant 8 et nous pouvons en d duire la quantit de lectine ajout e qui s est fix e 500 400 En A lt 300 Q 5 200 2 S c 100 i pe TIN es in es in con T moin ConA 200 ConA400 ConA800 milieu plante Modalit s ConA fix e C ConA dos e Figure 46 Dosage ELISA de la ConA dans des broyats de tubes digestifs de pucerons intoxiqu s ou non par de la lectine incub s dans une solution de PBS contenant 500 ng de ConA par quivalent tube digestif es extrait d estomac in intestin La figure ci dessus indique que l intestin d un puceron non intoxiqu est capable de fixer les m mes quantit s de lectine que l estomac Nous n observons pas de diff rence entre les pucerons qui se sont d velopp s sur f ve et ceux qui se sont d velopp s sur milieu artificiel En r alit nous ne devrions pas parler d intestin ou d estomac mais d extraits
344. par la GNA dose moyenne est d j lev e alors qu cette dose les autres lectines sont moins actives Les caract ristiques toxicologiques de la ConA et de la GNA sont r sum es yz MA Logix ie 041 R e nl 2 50 2 0 ug ml LJ 0 74R x 00 92 x2 R 5 99 ona CE Se Spy mit 075 Masse mopenie ng gt n in inr Masse moyenne mg Concentration en lectine cug ml tels Logxst Concentration en lectine igml tele Lope Figure 10 Effets de deux lectines a mannose la Concanavaline A et la lectine du perce neige GNA sur la croissance du puceron Acyrtosiphon pisum Chaque point correpond a la masse moyenne calcul e SE pour une concentration d finie Les donn es sont ajust e par l quation indiqu e sur la figure Les IC20 et les IC50 sont not es en ug ml ainsi que les CL50 Nous avons repr sent sur la carte factorielle C2 figure 9C2 les centres de gravit des classes de lectines et les liaisons classes points cette repr sentation permet une bonne visualisation des diff rences existant entre les lectines d une m me sp cificit osidique Les graphes C1 et C2 sont superposables 3 1 1 2 Effets de la Concanavaline A sur six esp ces de pucerons La figure 11 illustre les effets de la Concanavaline A sur la croissance de six esp ces de pucerons des concentrations comprises entre 10 ug ml et 1500 ug ml n 5 r p titions de 20 pucerons par concentration
345. particulier inhibiteurs de prot ases et lectines Gatehouse ef al 1995b Ce n est que tr s r cemment que les premiers travaux sur la toxicit de lectines vis vis d Homopt res ont t initi s Gatehouse ef al 1992 Rahb et Febvay 1992 Habibi et al 1993 Powell et al 1993 Rahb et Febvay 1993 Les anglais de Durham ont rapidement orient leurs tudes vers le mode d action de la GNA qui s av re tre une toxine assez g n rale avec une toxicit int ressante vis vis d un delphacide et d une cicadelle ravageurs du riz et dont le g ne tait disponible Parall lement Lyon et dans un premier temps ind pendamment de ces travaux l int r t de l quipe s est port sur les lectines mannose glucose Si la ConA a constitu notre mod le d tude nous nous sommes aussi int ress s la GNA du fait de notre collaboration avec l quipe de Durham Il ressort de notre travail de these que la ConA et la GNA induisent des concentrations relativement faibles 100 200 ug ml une r duction significative de la dynamique de reproduction d A pisum ou de M persicae bien que leur effet ces doses sur la croissance larvaire soit modeste notamment pour la GNA Les tudes d intoxication aigu sur six esp ces aphidiennes montrent cependant une toxicit diff rentielle de la ConA les esp ces polyphages telles Macrosiphum euphorbiae et Aulacorthum solani semblant moins sensibles que les esp ces monophages
346. phie ou EPG eese 96 3 RESUl tats DC ne Nutter eet Ae 100 3 1 La Concanavaline A est elle phagor pulsive sess 100 3 2 Mesure des volumes de milieux ing r s par des pucerons intoxiqu s par la Concanavaline A Cin tique de l intoxication sss 106 3 3 Etude du comportement d alimentation d A pisum intoxiqu sur des milieux contenant de la Concanavaline A par la technique EPG 110 A DISCUSSION iier er p dades ctim ish boda sa Lc Na dot sed igs Ee da Do Sage eS led een ssl 119 Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons e eee eere eee eee enne en 122 1 TMOG arto Pp 122 2 Mat riels et M thodes iiie e iae nsnsi PY URS SER IR vae ER TU PER ERE 124 2 1 Electrophor se monodimensionnelle sur gel de polyacrylamide en presence de bM T a at 124 2 2 Dosage de la Concanavaline A par technique ELISA 125 2 3 Microscopie photoniqUe iiie setti roe ir ia e tede rese Dae eae ede recen 126 2 4 Microscopie lectronique transmission MET sess 127 2 5 Analyse des acides amin s libres de puceron entier et de miellat 128 SM lr AME toate ot det Octet nl det nas are asa 130 3 1 Les tissus cibles de la Concanavaline A 130 3 2 Cons quences de l intoxication par la ConA sur la physiologie DAS DIS UT urnes Soares dette
347. picale se d tache avant de se d sagr ger Celle ci est aussi tr s visible sur la coupe E Nous observons ainsi une lyse cellulaire cons cutive au d collement de la membrane apicale mais non la destruction de cette membrane coupe C A 800 ug ml l accumulation granuleuse est encore plus dense Nous retrouvons l aur ole dans la lumi re stomacale caract risant le d collement total de la couronne de la membrane apicale Les cellules pith liales sont beaucoup moins volumineuses sur la coupe D que sur la coupe A1 A tr s forte intoxication elles apparaissent marqu es alors qu elles le sont moins 400 ug ml et simplement au niveau de l excroissance apicale 200 ug ml Les noyaux ne semblent pas disparaitre Ces observations nous am nent formuler l hypoth se que la lectine agirait soit uniquement en se fixant la surface des cellules pith liales soit en p n trant partiellement l int rieur de ces cellules L un ou l autre de ces modes d action se traduirait par un remplacement ou une acc l ration du remplacement des surfaces apicales des cellules stomacales Jusqu maintenant nos commentaires sur l intoxication cellulaire se sont focalis s sur l estomac Mais nous avons aussi recherch si la ConA tait d tect e dans les autres parties du tube digestif Jusqu la concentration de 400 ug ml seul l estomac semble marqu Nous avons observ de nombreuses coupes sans d tecter la lectine ni dans l
348. pl tent ces premi res observations histologiques 3 1 6 Dosage ELISA de la Con A dans l h molymphe Dans ces conditions exp rimentales 100 ug ml aucune trace de lectine n est d tect e Ce type de dosage est pourtant tr s sensible seuil de sensibilit 1 ng par extrait d pos Des dosages sur de plus grands volumes d h molymphe ont t effectu s sans plus de succ s La ConA ne traverserait donc pas la barri re de l pith lium intestinal 87 La membrane p ritrophique agit comme un ultrafiltre arr tant les grosses particules colloidales mais perm able aux enzymes et aux produits de la digestion oh f W L ch n j y ie dT ed F 4 2 In re i Planche I Coupes transversales d une larve d Acyrthosiphon pisum ayant ing r de la ConA fluorescente A coupe au niveau de l estomac ant rieur x 125 B coupe au niveau de l estomac interm diaire x 125 C estomac post rieur x 500 Voir le texte pour les abr viations Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 142 3 1 7 Dosage ELISA de la ConA dans l estomac et l intestin L histofluorescence d montre que la r gion ant rieure du m sent ron l estomac est la cible primaire de la ConA Nous ne la d tectons pas dans la r gion post rieure de l intestin Ceci peut s expliquer par deux hypoth ses 1 la lectine n est pas capable de se fixer l intestin 2 la lectine n a pas transit
349. propos s London resin hard London resin medium m lange utilis London resin soft 2 d un acc l rateur rem faible toxicit de ces produits Technique Pour la microscopie photonique il est pr f rable d effectuer une fixation ald hydique seule Pour la microscopie lectronique on peut pratiquer une double fixation mais il ne faudra pas utiliser d acc l rateur Pour une tude conjointe on peut effectuer apr s la fixation ald hydique classique un contraste avec de l acide phosphotungstique 1 poids volume dans le premier bain d alcool thylique absolu la fin de la d shydratation La d shydratation a lieu classiquement dans une s rie d alcools thyliques de degr s croissants L ac tone et l poxy 1 2 propane sont d conseiller L infiltration s effectue dans la solution commerciale soit temp rature ambiante soit ventuellement 60 C 4 bains de r sine 1 heure d intervalle nuit dans la r sine inclusion dans des moules herm tiques g lules ou verre pour viter le contact avec l oxyg ne qui emp che la polym risation polym risation 24 heures a 60 C 2 C rem l utilisation de l acc l rateur 1 goutte pour 10 ml de r sine n est pas indispensable Elle permet seulement de d marrer rapidement la polym risation attention en 10 min le m lange devient tr s visqueux Les contrastes ult rieurs sont r alis s dans l ac tate d uranyle aqueux et n
350. protocole pour estimer la concentration en GNA dans le phlo me des plantes transform es Les pucerons tant quasi exclusivement phlo mophages il est important de connaitre la concentration de la GNA dans ce compartiment cellulaire pour valuer dans quelle mesure la transformation permettra l expression d un effet aphidotoxique Six lots de larves de l esp ce A solani sont laiss s le temps de leur d veloppement complet huit jours chacun sur une plante des lign es GNA2 23 GNA2 28 GNA2 30 PWG6 85 WAI9 12 ou une plante de la vari t D sir e t moin Simultan ment des lots de larves se sont d velopp s sur des milieux artificiels Ap2 contenant 0 5 10 50 100 ou 500 ug ml de GNA A l issue des huit jours dix pucerons de chaque lot sont diss qu s et leurs tubes digestifs sont collect s voir fiche protocole N 8 Apr s broyage la quantit de GNA dans des extraits quivalents deux tubes digestifs est dos e par ELISA Les fiches protocole N 10A amp 10B d crivent en d tail ce dosage quantitatif de la GNA Les doses mesur es dans les tubes digestifs des pucerons plac s sur plantes transg niques sont compar es aux doses mesur es dans les tubes digestifs des pucerons intoxiqu s sur milieux artificiels En nous appuyant sur l hypoth se que le taux de r tention de lectine par un puceron est d une part proportionnel la concentration de lectine dans l ing r et d autre part comparable sur plante et su
351. ptidase N Ms 0 004 sur Hv toxines Col o CryIII A D Cry A toxique sur Ld 1 Chrysom Scarab Curcu CL59 20 ng cm f sur Ld et entre 1 5 sur chrysom le du peuplier Autres toxines bact riennes toxicit r v l e sur Dipt res tox Bs cellules intestinales 1 Toxines de Bacillus sphaericus en particulier Culex cyt membrane non Toxines cytolytiques Cyt de s lectivit in vitro Bt israelis moustiques 7 phospholipides insatur s Autres toxines microbiennes Cholesterol oxydase Cox toxique sur Ag toxique sur Hv non toxique sur Mp lyse intestinale micro LCs59 0 002 et Hz 0 0196 0 002 villosit s d truites Inhibiteurs de prot ases Inhibiteurs de pr s rine BBI inactif 5 sur Ao BBI toxique et inhibiteur de CpTI inactif sur Ap 0 025 inhibition des prot ases 1 serpines CpTI toxique mort larv et croissance 296 sur On BBI inhibiteur de croissance s rine digestives BBI Inh Bowman Birk soja inhibiteur sur Cm 0 596 CpTi toxique 1 sur Hv sur Ap 0 02596 d s quilibre nutritionnel CpTI Inh Bowman Birk ni b STI faiblement inhibiteur secondaire d la com STI Inh Kunitz trypsine soja 0 0196 sur On et 0 196 pensation PI II Inh tryps pomme de terre sur Hz autres cibles PI IIK inhibiteur 0 3596 sur Ms OCI inhibiteur 10 sur Tc inhibition des prot ases 1 Inhibiteurs de pr cyst ine cystatines OCI oryzacystatin
352. pucerons adultes de l esp ce Acyrthosiphon pisum fix s sur des milieux standards Ap2 contenant 200 400 ou 800 ug ml de Concanavaline A Valeurs moyennes SE de 10 pucerons compar es par une ANOVA les moyennes indiqu es avec des lettres identiques ne diff rent pas significativement au seuil de 596 La ConA la concentration de 200 ug ml n induit pas de baisse significative des quantit s ing r es par les adultes A cette m me concentration les larves sont affect es d s la seizi me heure d intoxication figure 31A Nous remarquons aussi les effets moindres de la lectine 400 ug ml sur les adultes par rapport aux larves en 48 h sur les premiers les effets sont sensibles mais non significatifs p gt 5 alors que les larves sont affect es d s la huiti me heure figure 32A Seule la concentration de 800 ug ml induit une baisse significative des quantit s de milieu ing r es p lt 1 Nous observons n anmoins que cette modification ne s accompagne pas d une perturbation majeure du comportement de fixation 80 des adultes sur milieux ConA 800 sont toujours fix s l issue des 48 h contre 90 96 90 96 et 60 96 sur milieux t moins ConA 200 et ConA 400 respectivement 3 3 tude du comportement d alimentation d A pisum intoxiqu sur des milieux contenant de la Concanavaline A par la technique EPG 3 3 1 R ponses attendues justifiant la mise en oeuvre de cette technique Nous avons soulign dans le pa
353. r cents r v lent galement que certaines lectines contiennent d autres types de sites de fixation permettant leur liaison avec des ligands de nature non osidique Barondes 1988 la restriction dans la d finition du terme de lectine une liaison sp cifique sucre prot ine semble ainsi perdre de sa g n ralit D s lors bien que la d finition g n rale de lectines de Kocourek et Horejsi ne soit pas totalement universelle nous l adopterons pour d finir les lectines qui ont fait l objet de nos travaux les lectines sont des prot ines ou des glycoprot ines d origine non immune capables de reconnaitre sp cifiquement les sucres terminaux de glycoprot ines et d autres glycoconjugu s et de s y lier avec une haute affinit de mani re r versible sans alt rer la structure covalente d aucun des r sidus ligands glycosyl reconnus Kocourek et Horejsi 1983 cit s par Pusztai 1991 3 2 Propri t s g n rales des lectines Dans cette pr sentation des propri t s des lectines nous nous sommes restreints leurs propri t s g n rales concernant leurs caract ristiques physico chimiques leurs sp cificit s osidiques la base de leur classification et leurs propri t s biologiques La nature des interactions sucres lectines est abord e en introduction d un chapitre ult rieur lorsque nous Abr v Origine v g tale Nom latin famille v g tale Allium sativum L Liliac es Caract rist Nbre de sous
354. r dur e des phases la p n tration des stylets pour chaque enregistrement Sur la base des mod les de Caillaud 1994 et de Tjallingii 1990 nous avons analys dans un premier temps vingt huit variables Mais le caract re non discriminant et ou non informatif de dix sept d entre elles nous a fait les supprimer de l analyse Les onze variables retenues sont rapport es Signification biologique nombre de phases de non p n tration des stylets nombre de phases C nombre de phases G dur e cumul e en phase np pendant le temps de fixation dur e cumul e en phase C pendant le temps de fixation dur e cumul e en phase G pendant le temps de fixation dur e cumul e moyenne en phase G entre deux phases np 1 2 3 4 5 6 7 8 dur e pass e en phase G rapport e au temps d enregistrement 4h 8h ou 24h dur e pass e en phase C rapport e au temps d enregistrement 4h 8h ou 24h dur e pass e en phase np rapport e au temps d enregistrement 4h 8h ou 24h dur e moyenne d une phase G 1 Ja dur e en phase np entre le d but de l acquisition et la premi re onde C n est pas prise en compte figure ci dessous 2 entre deux phases np plusieurs phases G peuvent tre observ es figure ci dessous Tableau 15 Variables retenues pour l analyse statistique des enregistrements EPG obtenus avec des pucerons de l esp ce Acyrthosiphon pisum sur milieux standards simples ou contenant de la Concanavaline A repr se
355. r e d ingestion en heures dur e d ingestion en heures o ConA400 Figure 32 Quantit s de milieu marqu 14C inuline avec ou sans ConA 400 ug ml 1 ing r es par des larves de l esp ce Acyrthosiphon pisum pendant des dur es comprises entre 2h et 48h les valeurs moyennes sont rapport es avec leur erreur standard A Larves pr alablement conditionn es 22h sur milieux Ap2 B Larves pr alablement conditionn es 22h sur milieux Ap2 ConA 400 ug ml 1 Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 108 Modalit s Ap2 gt Ap2 Ap2 ConA200 ConA400 gt Ap2 ConA400 i ConA200 10 1 6 2 110 Dur e 20 3 15 2 12 5 d ingestion 44 6 47 6 35 2 ab a 136 11 77 11 58 10 a b Tableau 13 Quantit s de milieu Ap2 marqu avec ou sans ConA 200 ug mI 1 ing r es par des larves de l esp ce Acyrthosiphon pisum pr alablement intoxiqu es ou non ConA 400 ug ml 1 pendant des dur es de 2h 16 h Les quantit s moyennes ing r es sont exprim es en nanolitres L erreur standard SE est donn e entre parenth ses Sur une m me ligne les valeurs suivies par des lettres diff rentes diff rent significativement au seuil de 5 test Kruskal Wallis proc dure de Conover milieu marqu en 14C inuline Nous observons au moment du relev de la seizi me heure que toutes les larves sont normalement fix es s
356. r l utilisation d une enzyme comme marqueur d anticorps ou d antig nes Elle permet de doser avec une bonne sensibilit des constituants d int r t biologique Cette technique regroupe en fait un ensemble de m thodes immunoenzymatiques Nous d crivons ici uniquement celle que nous avons utilis e pour doser la ConA Nous avons appliqu un dosage non comp titif dit de type sandwich fiche protocole N 9A c est le proc d qui donne les r sultats les plus satisfaisants aussi bien du point de vue de la sensibilit que de la reproductibilit Selon cette m thode la ConA est capt e dans un premier temps par un anticorps sp cifique immobilis sur un support anticorps primaire Dans un deuxi me temps apr s sa r action avec un anticorps biotinyl de m me sp cificit anticorps secondaire la quantit d antig ne coupl est mesur e en utilisant le proc d BRAB fiche protocole N 9A L activit enzymatique obtenue est proportionnelle la quantit d antig ne fix e par l anticorps primaire La proc dure est d taill e dans la fiche protocole N 9B Comme pour toute m thode immunoenzymatique le dosage de la ConA est optimis en trouvant pour chaque tape le meilleur temps d incubation et la meilleure concentration de l anticorps primaire 5 ug ml du conjugu 1 ug ml de l avidine 0 1 ug ml et de la peroxydase biotinyl e 0 1 ug ml 1 Dans nos conditions la m thode permet de doser la ConA dans une gam
357. r milieu artificiel nous avons essay d estimer la concentration de GNA dans la s ve phlo mienne des plantes transform es 2 8 Principe des tests long terme 7 v fro ou sur plantes transg niques Des tests long terme ont t r alis s sur milieux artificiels la fois sur A pisum et sur M persicae Ces tests visaient observer les effets de la ConA et de la GNA sur la dynamique de reproduction des pucerons pendant le temps une dur e gale au temps de d veloppement d une g n ration calcul du rm Les performances biologiques de M persicae ont t observ es ensuite sur pommes de terre transg niques 2 8 1 Intoxication subl tale d A pisum par la ConA l re s rie Des larves n onates sont obtenues partir d une population synchronis e de pucerons de l esp ce A pisum et sont transf r es sur milieux artificiels Ap2 simples ou contenant de la ConA 80 ug ml trois r p titions de 25 individus par modalit Cette concentration a t choisie au vu des r sultats de l intoxication aigu Nous nous attendions ce qu elle induise une mortalit des larves tr s faible mais une r duction significative de leur croissance IC 35 Au jour J7 dur e normale de d veloppement des larves la mortalit est relev e dans chaque boite et les jeunes adultes apt res survivants sont pes s individuellement Vingt individus sont alors choisis les vingt pucerons dont les masses sont les plus proches
358. r rigueur scientifique Yvan m a encadr tout au long des ann es du DEA et de la th se avec le dynamisme et l enthousiasme qui le caract rise J ai beaucoup appr ci ses qualit s tant scientifiques qu humaines G rard et Guy m ont apport principalement leur aide dans les analyses statistiques des donn es et dans les tapes de r daction d articles ou de la th se Une partie de ce travail a t r alis e au Laboratoire de Biologie Mol culaire de l Universit de Durham GB Je remercie John Gatehouse de m y avoir accueilli Je suis tr s reconnaissant Angharad Gatehouse pour la qualit de son encadrement et pour l int r t qu elle a port mon travail Je suis tr s honor qu elle ait accept de le juger en tant que rapporteur Je remercie vivement Monsieur Ren Bournoville directeur du laboratoire de Zoologie de l INRA de Lusignan 86 Il a guid mes premiers pas dans le domaine de la recherche et m a vivement encourag la fin de mon ann e de Ma trise poursuivre mes tudes pour effectuer une th se C est avec beaucoup de plaisir que je l ai vu accepter d tre rapporteur Mes remerciements s adressent galement au Professeur Pierre Roug directeur du laboratoire de Pharmacologie et de Toxicologie Fondamentale au CNRS de Toulouse pour avoir accept de juger ce travail en tant que rapporteur alors m me que le monde complexe des pucerons lui tait peu connu J adresse mes sinc res remerciements au Professeur
359. radioactivit des larves et de leurs miellats permet d estimer les quantit s de milieux ing r es pendant ces dur es Dans un premier temps la concentration de 200 ug ml a t choisie parce que nous pensions qu elle tait suffisamment forte pour induire un effet significatif au moins au bout de 16 h mais qu elle n tait cependant pas trop forte pour perturber les larves au point de les emp cher de se fixer Le tableau 13 et la figure 31 montrent qu effectivement les effets de cette concentration moyenne de lectine se manifeste par une diminution des volumes de milieux ing r s par des larves saines au bout de 16 h d intoxication N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 107 150 150 125 125 100 100 t y 75 de a 50 50 25 25 0 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 NT Pare dur e d ingestion e Ap2 dur e d ingestion en heures en heures 0 ConA200 Figure 31 Quantit s de milieu Ap2 marqu 14C inuline avec ou sans ConA 200 ug ml 1 ing r es par des larves de l esp ce Acyrthosiphon pisum pendant des dur es comprises entre 2h et 16h les valeurs moyennes sont rapport es avec leur erreur standard A Larves pr alablement conditionn es 22h sur milieux Ap2 B Larves pr alablement conditionn es 22h sur milieux Ap2 ConA 400 ug ml 1 1000 1000 750 750 I 500 500 250 250 75 75 0 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 du
360. ragraphe Mat riels amp M thodes l int r t de la technique d lectrop n trographie dans l tude des interactions plante insecte phlo mophage Dans le cadre de notre tude l EPG nous est apparue comme une technique particuli rement ad quate pour caract riser dans le temps et en continu les effets de l intoxication par la ConA sur le comportement d alimentation des pucerons adultes Les tests de choix nous apportent un premier l ment de r ponse quant la cin tique de l intoxication l EPG vient donc en compl ment de ces r sultats L utilisation d un marqueur radioactif a permis de mettre en vidence une diminution des volumes ing r s par les pucerons intoxiqu s au cours du temps Notre but tait de confirmer ou non que cette diminution tait li e une inhibition indirecte de l ingestion et non pas une aversion gustative Celle ci supposerait en effet que les pucerons soient capables de d tecter au sens gustatif la lectine hypoth se r fut e par les premiers tests et se traduirait plus ou moins court terme par un refus des milieux toxiques de la part des pucerons Nous observerions alors une r ponse de type tout ou rien 3 3 2 Les types d ondes observables np C et G A notre connaissance aucune publication n a jamais fait tat de l application de l EPG sur des pucerons plac s sur milieux artificiels Nous avons eu l occasion au cours d une semaine de travail dans le laboratoire de F Tjallingii Univer
361. re alors que pour des valeurs sup rieures la forme t tram rique est observ e Goldstein et Poretz 1986 De m me la GNA est un t tram re de 50 kDa constitu de quatre sous unit s identiques de 13 kDa Van Damme et al 1987 Les sous unit s constitutives d une lectine ne sont pas obligatoirement identiques Les lectines mannose strict sont par exemple des homo oligom res GNA NPA alors que les lectines mannose glucose plus large spectre de sp cificit sont g n ralement constitu es de plusieurs sous unit s et B la ConA constitue une exception tableau 5 Pour certaines lectines l activit biologique est associ e la pr sence de cations bivalents Ainsi la ConA est une m talloprot ine dont l activit biologique n cessite obligatoirement la pr sence de mangan se Mn et de calcium Ca Edelman et al 1972 En revanche l activit de la GNA n est pas d pendante de la pr sence de tels cations Van Damme et al 1987 Il existe de nombreuses homologies structurales entre les lectines v g tales tant au niveau de leurs s quences en acides amin s que de leurs structures tridimensionnelles Certains auteurs Strosberg et al 1986 Chrispeels et Raikhel 1991 sugg rent que cette structure a t fortement conserv e pendant l volution cons quence probable du maintien de fonctions physiologiques aujourd hui encore mal d finies Les diff rences constat es entre les lectines des L gumi
362. re le double 1100 ng modalit ConA400 apr s 24 h d intoxication le tube digestif est partiellement satur Bien qu intoxiqu s les pucerons continuent d ing rer du milieu en assez grande quantit et donc de la ConA 900 ng en 48 h figure 41C La lectine ing r e ne peut tre enti rement retenue et on en retrouve dans le miellat Un rapide calcul permet cependant de constater que la quantit excr t e est n gligeable par rapport la quantit retenue les quantit s de miellat r colt es correspondent aux excr tions de 75 jeunes adultes un adulte sur milieu ConA400 ing re environ 880 ng de lectine en 48 h et nous avons donc dans ces conditions un taux d excr tion n exc dant pas 0 03 modalit ConA800 le tube digestif est tr s vite satur en lectine D s 24 h nous en d tectons une tr s faible quantit dans les miellats Mais cette tr s forte concentration les pucerons sont rapidement extr mement perturb s Nous pensons qu entre la 24 me et la 48 me heure ils n ing rent d ailleurs quasiment plus de milieu m me si nous avons constat qu ils semblent rester fix s chapitre 3 Cette interpr tation n est pas contradictoire avec les r sultats de la figure 41C si nous consid rons que les quantit s qui sont ing r es par les pucerons fortement intoxiqu s peuvent l tre principalement dans les 24 premi res heures S arr tant en partie de s alimenter les pucerons n excr tent presque plus de
363. ree mannose specific bulb lectins Comparison with mannose glucose binding lectins Carbohydr Res 1992 Vol 229 p 337 346 Kaku H Goldstein I J Van Damme E J M et Peumans W J New mannose specific lectins from garlic Allium sativum and ramsons Allium ursinum bulbs Carbohydr Res 1992 Vol 229 N 2 p 347 353 Kaminski P A Structure et expression des g nes de lectine de pois Th se de 3 me Cycle Universit Paris VII 1987 Kaminski P A Buffard D et Strosberg A D The pea lectin gene family contains only one functional gene Plant molec Biol 1987 Vol 9 N 5 p 497 507 Kashlan N et Richardson M The complete amino acid sequence of a major wheat protein inhibitor of alpha amylase Phytochem 1981 Vol 20 p 1781 1784 King T P Bebgie R et Cadenhead A Nutritional toxicity of Raw Kidney Beans in pig Immunocytochemical and cytopathological studies on the gut and the pancreas J Sci Fd Agric 1983 Vol 34 p 1404 1412 Klinghauf F A Feeding adaptation and excretion in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1987 Vol 2A p 225 254 Kocourek J Historical background in The lectins properties functions and applications in biology and medecine Orlando USA Liener LE Sharon N Goldstein I J Acadamic Press Inc 1986 Vol p 3 34 Konami Y Ishida C Yamamoto K Osawa T et Irimura T A unique amin
364. reyer et Jones 1981 Schoonhoven et Derksen Koppers 1976 d montrent aussi la propri t anti app tante vis vis de M persicae de deux glycosides cyanog nes la dhurrine et l amygdaline Le DIMBOA aglycone d un glycoside ph nolique pr sent dans le mais et d autres c r ales a une action l tale sur Rhopalosiphum maidis Fitch Metopolophium dirhodum Walker et S graminum qui s accompagne d un effet phagodissuadant Niemeyer 1988 Corcuera 1990 Givovich et al 1994 Enfin deux 10 La r action d hypersensibilit correspond une r action pr coce du v g tal qui conduit la n crose tr s rapide des cellules envahies et de ce fait la mort ou l isolement du champignon parasite En l occurence avec les pucerons ceci se traduit par une impossibilit de s alimenter dans le compartiment phlo mien 11 2 premi re valuation de l app tence de la plante sur la base de ses caract ristiques de surface par des piq res de courtes dur es N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 25 glucosides ont t tr s tudi s la phlorizine sp cifique du genre Malus et la sinigrine glucoside soufr omnipr sent dans la famille des Crucif res Ils agissent plusieurs niveaux du comportement de s lection de l h te par certaines esp ces de pucerons Montgomery et Arn 1974 Herrbach 1985b 2 le comportement d ingestion Les sucres en particulier le saccharose et les acides amin
365. rique alors que les deux autres montrent des noyaux relativement petits 3 1 4 3 Le proctodeum La jonction entre le m sent ron et proctodeum est difficile 4 marquer car aucune valvule pylorique n apparait comme c est le cas chez beaucoup d insectes Nous la situons au niveau de la boucle thoracique figure 43 Le proctodeum est diff renci en une section ant rieure tubulaire d origine ectodermique relativement courte et une section tr s longue et plus large le rectum proprement dit Ponsen 1972 d crit de mani re tr s d taill e cette partie du tube 86 Elles sont cependant beaucoup plus courtes que celles des cellules pith liales de vert br s N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 137 oesophage f de l estomac st dc l intestin 1 at du rectum hg Les autres abr viations sont donn es cn annexe 13 persicae d apr s Ponsen 1972 montrant cn particulier la position de 1 Figure 44 Vue sagittale A ct transversale B d une larve de Myzus 4 Mot E m d RSS E 7 Nes P N N iN ER e SE a VW P2 ait te RS k T a C gl F f Ste Pow g prm 7 AI LAST Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 138 T oxauue UD Sup IUOS SUONPTARQE sazmm SIT SINANI FONIANNO A 2uuoiieqdcsoo naea 0 vridcid enr dit numur ur lt Segdus2 y ILR6179 cL61 suog sade p umaporaoid np exiqm uanoas FT ap neau ne umsid
366. rition de populations d insectes r sistants Ce probl me est apparu particuli rement aigu depuis la d couverte de L pidopt res Hv Pi Px ou de Col opt res Ld capables de r sister la toxine de B thuringiensis en laboratoire voire m me au champ Initialement le probl me de l apparition de r sistances B thuringiensis avait t largement sous estim les risques taient consid r s comme n gligeables en partie du fait du mode d action de ces toxines Les le ons tir es des Observations de ces derni res ann es sont l origine du d veloppement du concept de gestion de r sistance visant retarder ou pr venir l adaptation des ravageurs McGaughey et Whalon 1992 Dans le cas qui nous pr occupe concernant l introduction d une prot ine entomopathog ne dans une plante trois id es de base sont propos es pour ma triser la p rennit de la r sistance diversification des modes d action des toxines utilis es pour diminuer la probabilit d apparition d individus r sistants dans la population vis e 2 r duction de la pression de s lection sur les insectes cibles pour chacun des modes d action pour limiter l avantage s lectif conf r par la r sistance conduire la r g n ration d un organisme v g tal complet elle permet d obtenir la substitution d un g ne par un autre dans un organisme entier et non plus la simple addition d un g ne suppl mentaire comme c est le cas avec l
367. ritional value of selected cultivars J Sci Fd Agric 199b Vol 30 p 843 848 Pusztai A Ewen S W B Grant G Peumans W J Van Damme E J M Rubio L et Bardocz S Relationship between survival and binding of plant lectins during small intestinal passage and their effectiveness as growth factors Digestion 1990 suppl N 2 p 308 316 Pusztai A Grant G Spencer R J Duguid T J Brown D S Ewen S W B Peumans W J Van Damme E J M et Bardocz S Kidney bean lectin induced Escherichia coli overgrowth in the small intestine is blocked by GNA a mannose specific lectin J Appl Bacteriol 1993 Vol 75 N 4 p 360 368 Pusztai A et Stewart J C Isolectins of Phaseolus vulgaris Physico chemical studies Biochem Biophys Acta 1978 Vol 536 p 38 49 Quisenberry S S et Schotzko D J Integration of plant resistance with pest management methods in crop production systems J Agr Entomol 1994 Vol 11 N 3 p 279 290 Rabasse J M Pucerons en cultures prot g es Les probl mes pos s et les moyens de les controler en lutte int gr e D f V g 1985 Vol 234 p 13 18 Rabasse J M Dedryver C A et Latge J P Potentialit s des Entomophtorales pour la lutte contre les pucerons en serre 1984 p 273 277 Raccaud Schoeller J Le tube digestif son organisation fonctionnelle in Les Insectes physiologie d veloppement Paris Ed Masson 1980 p 146 166 Rahb Y et Febvay G Effect of ce
368. rons imitiaur N g T moin y Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 84 GNA2 23 pontes cumul es GNA2 28 GNA2 30 P1 Lv mod le observ P2 d mod le observ P3 mod le 55 9 0 8 49 3 2 2 69 9 0 8 58 3 1 1 60 7 0 9 49 4 1 7 58 1 0 6 47 7 1 5 10 0 0 1 13 1 0 2 10 1 0 1 112 9 0 3 10 9 0 2 14 1 0 2 11 7 0 1 14 4 0 2 0 17 0 01 0 15 0 01 0 15 0 01 0 16 0 01 5 M Modalit s 4 T moin GNA2 23 mod Fe GNA2 28 a i GNA2 30 E CL HI m 3 i 4 2 al d a _ Eod E E 0 20 25 Ajustement effectu y B P x p g ve 30 35 40 45 Jours Figure 21 Performances biologiques du puceron commun des serres Aulacorthum solani sur trois lign es de pommes de terre transg niques GNA2 23 GNA2 28 et GNA2 30 La l gende est expliqu e dans le texte l erreur standard est report e pour chaque point de la figure B les valeurs des param tres P1 P2 et P3 observ s ou donn s par le mod le sont pr sent es dans le tableau de la figure C erreurs standards entre parenth ses N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons Hombre total de larves pucerons imitiaur ur F de pucerons 5 Larves cumulees pucerons imitiauwr 3 10 15 85 p 20 2 T moin GNA2 23 5 30 J
369. rs de notre tude Trois raisons essentielles expliquent ce choix cette esp ce est l heure actuelle la plus tudi e au point de vue physiologique et elle est utilis e depuis plus de 7 ans au Laboratoire de Biologie Appliqu e de l INSA de Lyon pour des tudes sur la nutrition 2 A pisum est facile manipuler il se maintient au moins pendant deux g n rations sur milieu artificiel et sa taille relativement grande par rapport d autres esp ces rend les tudes sur sa physiologie plus ais es dissection histologie 3 notre d marche vise en r alit la recherche d une lectine toxique pour les pucerons au sens large et non pas seulement pour le puceron du melon Au vu des arguments pr c dents A pisum constitue un mod le d tude ad quat Les pucerons A solani M euphorbiae et M persicae posent galement de graves probl mes conomiques principalement en serre pour les deux premiers et en culture de pleins champs ou en verger pour le troisi me Ces trois esp ces sont tr s polyphages et se d veloppent rapidement sur les Solan es telle la pomme de terre Solanum tuberosum L ou l aubergine Solanum melongena L Elles ont t choisies afin de tester l Universit de Durham des lign es transg niques de pommes de terre exprimant des prot ines insecticides Nous disposions galement au laboratoire d une souche du puceron du lupin M albifrons Il nous a sembl int ressant de le tester car
370. rsion gustative conditionn e Larue Achagiotis et al 1992 Si l objectif de cette tude est identique au n tre la probl matique est sensiblement diff rente Il n existe en effet notre connaissance aucun test comportemental d crit pour les pucerons Apr s de nombreuses mises au point nous avons labor des protocoles permettant d analyser par des tests simples le comportement des pucerons en pr sence de la Concanavaline A Les tests de choix montrent que la lectine n est pas phagor pulsive mais induit tr s rapidement un effet toxique qui agit en retour sur les niveaux et les comportements d ingestion Les pucerons se sont av r s incapables de d tecter la ConA y compris des doses l tales Les mesures de l ingestion par un traceur radioactif nous confirment cette interpr tation et permettent de pr ciser la cin tique de l intoxication A la concentration moyenne de 200 ug ml les effets de la ConA se manifestent sur les larves apr s 12 16 heures d intoxication Lorsque la concentration est doubl e nous observons d s la huiti me heure une diminution significative des taux d inuline ing r e Des larves fortement intoxiqu es pendant 22 heures sur de la ConA 400 ug ml puis transf r es sur milieux standards sans ConA semblent ne plus subir les effets de l intoxication au bout de 24 h entre 24 et 48 h les larves pr alablement intoxiqu es ou non ing rent les m mes quantit s de milieu environ 300 nl
371. rtain proteins on Acyrthosiphon pisum growth and development Potential influence on insect plant relationships Sth international symposium on insect plant relationships 1992 Wageningen NDL p 301 303 Rahb Y et Febvay G Protein toxicity to aphids an in vitro test on Acyrthosiphon pisum Entomol Exp Appl 1993 Vol 67 N 2 p 149 160 Rahb Y Febvay G Delobel B et Bonnot G Amino acids and proteins as cues in aphid plant interactions XLX international congress of entomology Symposium on Homopteran feeding behaviour recent research advances and experimental techniques 1992 Beijing Rahb Y Febvay G Delobel B et Bournoville R Acyrthosiphon pisum performance in response to the sugar and amino acid composition of artificial diets and its relation to lucerne varietal resistance Entomol exp appl 1988 Vol 48 N 3 p 283 292 Rahb Y Sauvion N Febvay G Peumans W J et Gatehouse A M R Toxicity of lectins and processing of ingested proteins in the pea aphid Acyrthosiphon pisum Entomol exp appl 1995 in press Raikhel N V Lee H I et Broekaert W F Structure and function of chitin binding proteins Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1993 Vol 44 p 591 615 Ramakers P M J Biological control in greenhouses in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1989 Vol 2C p 199 208 Riba G et Silvy C Combattre le
372. rtificiels Le milieu artificiel que nous appellerons Ap2 est le milieu de base dans lequel les prot ines tester sont dissoutes Sa composition est identique celle du milieu A5 mis au point initialement pour le clone LLOI d A pisum Febvay et al 1988a sauf pour la concentration en saccharose qui est de 20 fiche protocole N 3 Le milieu standard Ap2 permet un d veloppement optimal des pucerons sur une g n ration compl te les larves de la deuxi me g n ration survivent mais ont une f condit tr s r duite Ils sont cependant g n ralement plus petits que ceux lev s sur plante h te favorable Par exemple le poids moyen de M persicae 24 h apr s la mue imaginale est de l ordre de 220 ug sur Ap2 contre 250 ug sur f ve Parall lement la f condit de la premi re g n ration est galement r duite sur le milieu Ap2 donn es non pr sent es Toutes les larves des esp ces test es except es celles d A gossypii s y fixent rapidement Le probl me rencontr avec le puceron du melon a t partiellement r solu en pla ant les larves dans l obscurit totale pendant 3 jours juste apr s leur d p t Les solutions contenant les prot ines tester sont pr par es par dilutions d une solution m re 1 mg ml Pour les tests d intoxication aigu en particulier une s rie de cinq 39 Nous pr levons les larves les plus grosses que nous supposons g es de 12h 24h Pour faciliter les calculs ult rieurs
373. rtion des stylets provoque fr quemment une r action du v g tal La salive de certaines esp ces aphidiennes telles que Schizaphis graminum Rondani et Diuraphis noxia Mordvilko est en effet toxique Miles 1990 Comeau 1992 La crispation des feuilles ou la formation de galles constituent des r actions spectaculaires souvent observ es Forrest 1987 3 les pucerons pr l vent directement dans la s ve phlo mienne une partie des produits de la photosynth se dont les acides amin s essentiels la plante Ces pr l vements lors d infestations massives par les pucerons peuvent provoquer un arr t de la croissance de la plante Miles 1989 4 les produits non assimil s ou transform s par l insecte forment le miellat rejet par l anus sur la plante Ce miellat non toxique en lui m me peut soit agir directement en occultant les stomates soit lorsqu il est trop abondant provoquer la surface des feuilles un effet osmotique de nature cr er un appel d eau travers la membrane semi perm able constitu e par l piderme de la feuille L eau ainsi soutir e de la plante s vapore tr s facilement et le miellat agit alors comme un drain dessicant tr s actif rapidement mortel dans des conditions favorisant l vaporation Comeau 1992 5 les pucerons peuvent favoriser la prolif ration de maladies fongiques soit en transportant des spores Huang et al 1981 soit en occasionnant une plus forte capture de spore
374. rves de l pidopt res aussi bien sur milieux artificiels Broadway et al 1986 Larocque et Houseman 1990 que sur plantes transg niques Hilder et al 1987 Johnson ef al 1989 Boulter ef al 1990a Certaines tudes portent galement sur des orthopt res Gatehouse ef al 1992 Burgess et al 1994 et des col opt res Gatehouse et Boulter 1983 Hines et al 1990 Des tabacs et des peupliers exprimant une cystatine pr sentent aussi une r sistance int ressante ces derniers tableau 4 Masoud et al 1993 Lepl et al 1995 Contrairement aux toxines de B thuringiensis le probl me de l apparition ventuelle de populations d insectes r sistants aux IP quel que soit l ordre d insecte consid r n a pas encore fait l objet de travaux sp cifiques Il est donc actuellement difficile de juger de la p rennit d une strat gie de d fense bas e uniquement sur des inhibiteurs de prot ases Ceux ci pr sentent n anmoins un potentiel important pour cette strat gie et la marche suivre pour mettre en place de tels programmes est pr sent relativement bien document e Boulter 1993 En ce qui concerne pr cis ment les Homopt res bien qu il soit encore trop t t pour affirmer que les IP puissent tre exploit s pour les combattre des r sultats int ressants sont d j rapport s Ainsi Rahb ef al 1993 observent des inhibitions significatives de croissance sur milieu artificiel avec A pisum pour des c
375. s dites P prot ines ne participent pas de la m me mani re au compartiment prot ique soluble et mobile qui nous int resse Si nous consid rons qu une prot ine majeure de ces exsudats peut repr senter plus de 10 96 des prot ines totales la concentration d une prot ine de ce type peut donc atteindre 20 200 ug ml voire 4 10 mg ml chez les Cucurbitac es L approche plante transg nique r sistante un puceron semble donc assez r aliste dans un premier temps pour les Cucurbitac es Les taux plus faibles de prot ines pouvant s exprimer dans la s ve des autres esp ces v g tales imposera certainement de poursuivre l effort de recherche pour trouver des lectines ou d autres toxines plus toxiques encore que ne le sont les lectines glucose mannose que nous avons test es D autres lectines de cette classe ont t purifi es r cemment en particulier des lectines suppl mentaires de la famille des Amaryllidac es Van Damme et al 1988 Certaines d entre elles pourraient r v ler des propri t s toxiques encore plus int ressantes que celle du perce neige ou du Narcisse Des lectines d autres classes devront encore tre test es Les r sultats obtenus par exemple avec la lectine de l Amaranthe nous encouragent dans cette voie La r ponse la deuxi me question nous semble d ordre technologique dans la mesure o des promoteurs dits phlo me sp cifiques sont a priori disponibles et plus ou moins d crits dans la
376. s lection prennent en compte cette interaction plantes pucerons virus Nous avons signal pr c demment que ces derniers sont en effet les l ments majeurs des dommages caus s aux plantes Outre qu ils soient responsables de maladies ils peuvent favoriser la croissance des populations de pucerons et la production d ail s conduisant l extension des pid mies pour exemples Comeau 1992 La strat gie d am lioration g n tique doit donc viser en premier lieu identifier correctement les virus associ s aux pucerons Des r sultats convaincants r sultant de cette d marche ont d ores et d j t enregistr s Par exemple des chercheurs de l INRA d Avignon ont cr une vari t de melon r sistante la fois A gossypii et aux virus qu il transmet Pitrat et Lecoq 1982 1 3 3 4 Avantages et inconv nients de la s lection vari tale pour lutter contre les pucerons La s lection vari tale classique pr sente des avantages et des inconv nients qui doivent tre consid r s lors de l laboration de programmes de s lection Certains de ces avantages ou de ces inconv nients sont d ailleurs partag s avec la cr ation des plantes transg niques que nous voquerons dans le paragraphe suivant la r duction du co t d application des traitements C est le plus trivial des avantages pour l agriculteur Ces co ts sont bien s r report s sur l investissement initial dans la vari t le co t initia
377. s paraissent encourageants et permettent d esp rer des r sultats tr s int ressants quand les biologistes mol culaires maitriseront l expression phlo me sp cifique des transg nes Nous avons soulign dans notre tude l importance de lutter contre les pucerons mais aussi de leur virus associ s Les lectines nous raisonnons bien s r sur la base de notre tude sur la ConA pourraient induire une certaine protection contre les risques de transmission virale Au niveau de la culture au m me titre que les g nes de r sistance introduits par s lection vari tale classique les lectines ralentiraient la croissance exponentielle des populations en limitant la f condit des pucerons et freineraient l expansion des colonies et des pid mies virales limitation de l pid mie secondaire et non primaire Au niveau de la plante a priori comme les pucerons ne rejettent pas un aliment contenant la lectine ceux ci seraient susceptibles de pouvoir transmettre leur virus non persistants mais galement aussi les virus circulants La plante ne devrait donc pas se trouver prot g e de ce risque par les lectines mais l absence de rejet comportemental fort antix nose ne devrait pas non plus laisser pr voir d aggravation de la vection virale comme cela arrive avec certains g nes de r sistances Castle et Berger 1993 Les caract ristiques des virus circulants laissent cependant pr sager la possibilit d une protection Ces
378. s 74 de GNA prot ines solubles totales cl c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 wl w2 w3 w4 w5 w6 w7 w8 b1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 T moin PWG6 85 PBG6 47 Figure 17 Quantit s de GNA dos es dans des extraits de tissus foliaires des lign es transg niques PWG6 S85 et PBG6 47 plantes t moins var D sir e La GNA est dos e par immunomarquage sur membrane de nitrocellulose Dot Blot Les quantit s sont exprim es en de prot ines par rapport aux prot ines solubles totales dans les extraits Pour chaque modalit les dosages sont effectu s sur deux aliquotes de huit extraits foliaires n 2x8 3 2 1 3 Estimation indirecte du taux d expression des transg nes dans la s ve phlo mienne plantes test es en janvier 1995 La GNA est dos e par ELISA dans les tubes digestifs de pucerons intoxiqu s pendant huit jours sur des milieux artificiels contenant diff rentes concentrations de cette lectine 0 500 ug ml Sur la figure 18A nous avons report la densit optique des broyats de tubes digestifs pour chaque dose d intoxication DO lue 405 nm huit minutes apr s l ajout du substrat de r v lation de la peroxidase Le bruit de fond c est dire la DO lue pour les tubes digestifs de pucerons non intoxiqu s n est pas n gligeable DO 0 100 soustrait sur la figure 18A Il s expliquerait notamment par une fixation partielle de l anticorps primaire sur les parois des puits de la plaque de d p ts Entre 5 et 100 ug ml
379. s 9A OF permettant d interpr ter plus ais ment les profils des enregistrements EPG obtenus 66 Chaque dur e s entend depuis le temps To correspondant la premi re marque C tableau 15 Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 100 3 R sultats 3 1 La Concanavaline A est elle phagor pulsive 3 1 1 Premi re r ponse apport e par les microtests de choix Un premier test comportemental a t mis au point pour mettre en vidence un ventuel effet phagor pulsif de la ConA La figure 28 illustre les r sultats obtenus avec des larves mises en condition de choix entre deux milieux Ap2 A et entre du milieu Ap2 et du milieu contenant 400 ug ml d acide chlorog nique B ou de Concanavaline A C La figure 28A montre la fiabilit du test au bout d une heure pr s de 60 des larves sont d j fix es sur l un ou l autre des milieux Ap2 et 83 le sont au bout de deux heures Le taux de fixation maximum est atteint la vingti me heure Il existe donc un temps de latence de 2 heures environ avant que la majorit des larves se fixent Certes il peut sembler tr s court mais nous verrons ult rieurement qu il est important d en tenir compte dans l interpr tation de certaines de nos observations voir paragraphe consacr l EPG sur milieux artificiels notamment Les larves se r partissent indiff remment sur les deux milieux et ce d s la premi re heure Les six lar
380. s actuels ou potentiels des pucerons Chaque esp ce animale poss de un grand nombre d antagonistes associ s de facon plus ou moins sp cifiques qui sont soit des animaux identifi s alors comme ennemis naturels soit des microorganismes pathog nes Les ennemis naturels des insectes sont des parasitoides des pr dateurs ou des parasites tels que les vers n matodes Cloutier et Cloutier 1992 Nous n voquerons pas ces derniers car ils n interviennent pas dans le cadre de la lutte contre les pucerons Les microorganismes pathog nes causent des maladies infectieuses et font partie de quatre grands groupes taxonomiques les virus les bact ries les champignons et les protozoaires En France seulement 125 ha de cultures ont t trait s en 1992 contre les pucerons avec l un ou l autre de ces auxiliaires Maisonneuve 1993 A l chelle mondiale dans tous les cas o la lutte biologique est utilis e avec succ s pour combattre les pucerons les antagonistes sont une exception pr s des parasitoides membres de la famille des Aphidiidae Hymenoptera Ichneumonidae comme cela apparait dans le tableau 1 Rabasse et al 1984 Stary 1988b Carver 1989 Les esp ces du genre Aphelinus Chalcidoidea sont en g n ral moins communes en plein champ m me dans leur habitat d origine ce qui explique qu l exception d Aphelinus mali Haldeman l impact de leur introduction soit faible ou secondaire par rapport celui des Aphidii
381. s bact ries qui ne synth tisent pas d immunoglobulines Il faut encore ajouter que contrairement aux anticorps qui ont une structure mol culaire commune les lectines pr sentent des structures tr s diverses Elles diff rent notamment beaucoup par leur masse mol culaire leur composition en acides amin s et leur structure bidimensionnelle De ce point de vue les lectines s apparenteraient d avantage des enzymes Le fait d inclure dans la d finition la caract ristique de poss der au moins deux sites de fixation osidique permet d exclure de la classe des lectines de nombreuses prot ines se liant des sucres telles des enzymes sp cifiques pour des sucres glycosidases glycosyltransf rases etc des hormones des toxines bact riennes ou des interf rons Liener et al 1986 L un des aspects les plus controvers s de la d finition de Goldstein et de ses collaborateurs est que si elle est interpr t e sensus stricto elle exclut certaines toxines v g tales telles que la ricine l abrine et la modeccine Ces prot ines proviennent de plantes dans lesquelles des lectines r pondant aux crit res de la d finition sont galement mises en vidence voir note n 26 Ces toxines pr sentent de fortes homologies composition en acides amin s structure primaire avec les lectines correspondantes mais leur tr s faible capacit d agglutination sugg re qu elles ne poss dent pas de sites multiples de fixation aux sucres Des travaux
382. s comme facteurs biochimiques de r sistance des plantes des insectes concernent essentiellement les Col opt res En 1976 Janzen et Juster montrent que des larves de la bruche du ni b 22 Callosobruchus maculatus Fabricius sont incapables d attaquer des graines de haricot commun Phaseolus vulgaris du fait de la pr sence d une lectine la PHA Des tests sur milieux artificiels contenant la lectine purifi e des concentrations variant de 0 1 5 3 montrent qu aucune larve ne survit la plus forte concentration et qu une r duction significative du temps de d veloppement jusqu l ge adulte est obtenue pour la concentration de 0 1 Depuis ces r sultats ont t confirm s par Gatehouse et ses collaborateurs 1984 Ces auteurs invoquent des l sions au niveau de l pith lium m sent rique des bruches entra nant un blocage de l adsorption des nutriments Chapitre 4 Des observations analogues sur la croissance et la survie de la bruche du ni b sont rapport es avec la lectine du haricot ail Psophocarpus tetragonolobus L DC Gatehouse et al 1991b D une mani re g n rale la plupart des vari t s de haricot ne sont pas r sistantes aux bruches bien qu elles pr sentent de fortes concentrations en lectines dans leurs graines Une des explications avanc es est l existence d un m canisme de d toxification permettant aux insectes de tol rer une alimentation riche en ce type de toxines Gatehouse er al 1
383. s dans les broyats de pucerons 155 Figure 49 Repr sentation sch matique et synth tique des r sultats du dosage par chromatographie des acides amin s libres de miellats de pucerons laiss s 48 h sur des milieux Ap2 contenant de la ConA ou de l GNA EC S 157 Figure 50 D pouillement graphique des deux premiers facteurs des AFC r alis es sur les donn es relatives aux acides amin s libres dos s dans les miellats de PU ETONS ieri tt e Pet erre tee ete 160 Figure 51 Comparaison des effets de la ConA et de la GNA faibles concentrations sur la croissance du puceron du pois Acyrthosiphon pisum esee eerte enne neenren nennen nennen trennen 161 Figure 52 Comparaison des effets de lectines mannose glucose sur la croissance A du puceron du pois Acyrthosiphon pisum B du puceron du p cher Myzus persicae Concentrations inhibitrices exprim es en MOSS Ideutliedus e cotenesDutscd etu nei RD nn 164 Figure 53 R sultats graphiques des exp riences d inhibition comp titive de la toxicit de trois lectines mannose glucose par le mannose et le mannane ss 165 Figure 54 Repr sentation sch matique des diff rentes phases de s cr tion naturelle 1 4 d une cellule pith liale de l estomac interm diaire de Myzus persicae d apr s Ponsen 1972 amp Liste des planches Planche I Coupes transversales d une larve d Acyrthosiphon pisum ayant ing r de la Co
384. s de pommes de terre transg niques montrent que les niveaux d expression sont encore assez faibles Les tests in vitro indiquent que les taux estim s pour la s ve seraient trop faibles pour induire des effets toxiques or 107 Avec des promoteurs non sp cifiques CaMV 35S mais malheureusement pas avec le promoteur phlo me sp cifique actuellement en phase de mise disposition pour tests chez plusieurs esp ces v g tales riz pomme de terre promoteur de la sucrose synthase de riz rss1 Wang ef a 1992 108 Capacit de multiplication d une esp ce sous la d pendance de deux facteurs f condit des femelles et rapidit de d veloppement N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 177 nous avons observ des effets toxiques significatifs pour certaines des lign es test es et m me tr s significatif dans un cas Nous ne disposons pas d assez d l ments pour interpr ter compl tement ces r sultats Nous ne savons pas en particulier si le taux d ingestion des pucerons sur plante est tr s sup rieur celui des pucerons sur milieu artificiel dans un tel cas concentration gale l intoxication pourrait bien tre plus forte sur plante que sur milieu Il nous est aussi difficile d interpr ter la variabilit des r sultats observ e au cours des trois s ries de tests effectu s sur plantes transg niques juillet 93 f vrier 94 et janvier 95 110 N anmoins ces tests nou
385. s de r sistance transf rables dans l esp ce v g tale consid r e et que ces g nes ne soient pas li s des caract res agronomiques ind sirables Le transfert et l expression de g nes trangers dans les plantes par les techniques du g nie g n tique constituent un moyen actuellement disponible pour contourner les difficult s inh rentes la s lection vari tale classique Depuis quelques ann es l Institut National de la Recherche Agronomique INRA a d velopp des programmes de d fense des plantes par transfert de g nes L un d eux vise la cr ation de plantes r sistantes aux virus Legavre 1993 Zaccomer 1993 D autres programmes se rapportent aux insectes phytophages et des travaux ont t r alis s sur diff rents mod les v g taux tabac Nicotiana tabaccum L Jouanin et al 1990 chou Brassica oleracea L Berthomieu 1992 cotonnier Gossypium hirsutum L LeTan Dumanois 1994 et colza Brassica napus oleifera Bonad Bottino 1993 Des g nes codant pour diff rentes prot ines entomopathog nes toxine bact rienne et ou inhibiteurs de prot ase sont utilis s Un projet est galement initi pour tester la faisabilit de la cr ation d une plante transg nique r sistante un puceron Le mod le choisi est celui d une cucurbitac e concombre ou melon et de sa r sistance au puceron polyphage Aphis gossypii Glover Ce projet est l origine d une collaboration entre le laboratoire de Biol
386. s des lectines ont t avanc es Force est de constater cependant qu l heure actuelle beaucoup de ces fonctions restent encore hypoth tiques faute de preuves formelles La sp cificit des lectines et les propri t s conf r es par leurs sites multiples de valence am nent certains auteurs les comparer des anticorps et proposer alors pour ces mol cules un r le d anticorps chez les plantes Cependant une augmentation de la synth se des lectines lors de l exposition de la plante un antig ne caract ristique importante des anticorps animaux n a jamais t d montr e Sans tre de v ritables anticorps de la plante les lectines peuvent jouer le r le de mol cules constitutives de d fense contre des parasites De nombreuses tudes r v lent ainsi l existence d interactions entre des lectines et des microorganismes Pistole 1981 Etzler 1986 Ces constatations ne prouvent pas pour autant qu in planta la fonction des lectines soit de reconnaitre les microorganimes au sens la fois de la discrimination et de la r action enclench e mais montrent simplement que par leur sp cificit osidique ces mol cules sont capables de cette reconnaissance Un r le actif de 28 triggering receptor selon Lis et Sharon 1986 29 dirige une quipe au Rowett Research Institue Aberdeen Ecosse qui s est notamment sp cialis e dans l tude des pathologies induites par les lectines chez les mammif res mod l
387. s lorsque la plante devient gluante de miellat Comeau 1992 6 enfin le miellat constitue un milieu riche pour le d veloppement de champignons saprophytes qui noircissent notamment les parties consommables des plantes Ce noircissement cr par les spores des champignons est appel fumagine et rend impropre la commercialisation des fruits 1 2 N cessit s conomiques justifiant l tude pr sent e Agronomiquement parlant le puceron du melon A gossypii constitue l insecte cible principal des travaux men s actuellement l INRA dans le domaine de la protection des plantes maraich res contre les insectes Cette esp ce est rencontr e dans presque tous les pays du monde C est un des pucerons les plus polyphages connus s attaquant un nombre consid rable de plantes herbac es appartenant aux familles les plus vari es Il poss de cependant une pr f rence marqu e pour les Cucurbitaceae melon concombre past que ainsi que pour le cotonnier et autres Malvaceae Hibiscus En France A gossypii est l esp ce 3 Les six esp ces cit es ont t utilis es au cours de notre travail Elles sont plus commun ment appel es respectivement puceron du melon puceron du pois puceron commun des serres puceron de la pomme de terre puceron du lupin et puceron vert du p cher N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 17 la plus fr quemment rencontr e dans les cultures de melon ou de concombre du Sud
388. s moyennes de chaque modalit sont ensuite compar es ANOVA test de Bonferroni Dunn pour mettre en vidence l effet des diff rentes concentrations de lectines Ces m mes tests statistiques sont appliqu s pour comparer les variables se rapportant la croissance dans les tests long terme sur milieux artificiels ou plantes transg niques Dans certains cas afin de comparer les effets de lectines qui sont test es dans des exp riences ind pendantes les masses des pucerons de chaque s rie de tests sont transform es en pourcentage par rapport la masse moyenne des pucerons sur milieux t moins Les masses individuelles exprim es en ug ou en pourcentage par rapport au t moin sont ensuite ajust es par r gression lin aire masse A Log concentration B ou par r gression non lin aire avec un mod le de Michaelis Menten fiche protocole N 11 Le choix de l un ou l autre des mod les s effectue en comparant les coefficients de r gression R2 Les ajustements non lin aires sont r alis s avec le logiciel AjustNonLin Bonnot et Febvay 1992 Lorsque la croissance est stimul e par le traitement cas de certaines lectines tr s faibles doses le point correspondant n est pas pris en compte pour l ajustement Les IC50 et les IC20 sont ensuite d duites des ajustements obtenus fiche protocole N 11 2 9 4 Calculs et comparaisons des rq Les taux intrins ques d accroissement des populations de pucerons pucerons d
389. s nn si er rate eee neue iii als 143 3 3 Informations compl mentaires sur le mode d action de la Con A 161 A DISCUSSION mM Y 168 Chapitre 5 Conclusions et perspectives 4 ceres ee eere ee eene seen eee en sese en sese tn aset ta se eno 174 1 Caract ristiques biologiques et mode d action de la toxicit des lectines mannose SUE DINHIT 44 o sid certi pU eias CHE HIS ME AL dias Fare URL e PPAR ERROR su eese aliens 174 2 Implications des connaissances sur la toxicit des lectines sur leur potentiel d utilisation en protection des cultures seeseeeeeeeeeneeeneeenetnns 175 Se Perspectives ctos nn aetate ue antennes dest eo ne aere Poe EEEE tn 178 4 Quel avenir pour les plantes transg niques 7 179 BIblGSraplie rss Re ch desert ns 180 Publications Communications eseesossesoosoesessossesossossesossossessossesossossesossossessossesossossssossossse 194 PrOUQCON l ARN EN AE ARE RS RE ER ARE 196 EXIIT Liste des figures Figure 1 Repr sentation sch matique du cycle de vie des pucerons en r gions temp r es sess 14 Figure 2 Vue de profil de la r gion ant rieure d Aphis fabae Scop montrant la disposition relative des diff rents l ments de la t te d apr s Weber 1928 cit par Leclant 1981 iniit ate 15 Figure 3 Vue en perspective de l extr mit des stylets d un puceron d apr s Taylor amp Robertson 1974 cit
390. s normal de d veloppement des larves jusqu l ge adulte Les lectines de Rhizoctonia solani RSA et de Maackia MAA S ont t test es comme lectines t moins Aucun effet sur la survie quelle que soit la dose n est observ avec l une ou l autre de ces deux lectines Il n y a pas non plus d effets significatifs sur la croissance except pour la RSA la plus forte concentration 1500 ug ml l pour laquelle l inhibition de croissance est de 43 figure 14 Simultan ment ce test des larves de M persicae ont t intoxiqu es par deux inhibiteurs enzymatiques la serpine du ni b CpTI et un inhibiteur amp amylase du bl WAIT La premi re est tr s toxique vis vis des col opt res en particulier C maculatus Gatehouse et Boulter 1983 la seconde induit des effets d l t res fortes concentrations sur A pisum Rahb et Febvay 1993 Nos coll gues britanniques travaillent sur ces deux inhibiteurs dans l optique de cr er des plantes transg niques r sistantes aux insectes et les constructions g niques correspondantes leur sont disponibles En compl ment des tests avec les lectines il tait donc int ressant d observer les effets induits in vitro par ces polypeptides sur M persicae avant d envisager de tester cette esp ce sur des plantes transform es Durant les premiers jours de d veloppement des larves les quatre lectines mannose glucose n induisent aucun effet significatif sur la survie larve
391. s permettre de localiser le s site s de liaison de la lectine au niveau subcellulaire et nous indiquer si elle est absorb e par la membrane apicale Nos investigations se porteront aussi sur le mode d action de la ConA au niveau de l intestin la quantification du nombre de mol cules de ConA fix es par l estomac et l intestin caract ristiques de saturation en utilisant de la lectine radioactive puisqu un des probl mes majeurs que nous avons rencontr dans les dosages immunologiques sur pucerons est la solubilisation de la ConA complex e Des quantifications apr s lectrophor se d naturante et immunoempreinte sont galement envisageables Western Blot l histofluorescence et les exp riences d immunomarquage sur coupes fines pourront tre reconduites avec des larves intoxiqu es par de la ConA et de la GNA en pr sence ou non de sucre appropri l tude sur milieu artificiel de l association d une lectine avec une autre toxine inhibiteur de prot ase chitinase Une des strat gie pour pallier au risque d apparition de r sistance aux toxines transf r es est en effet d exprimer simultan ment des prot ines au mode d action tr s diff rent Outre les effets de synergie toxique que l on peut attendre cet aspect de l volution des populations de ravageurs est fondamentale pour le succ s de l utilisation des vari t s r sistantes La simplicit de la mise en oeuvre des tests sur pucerons est un atout certain pour l
392. s physiologiques diversifi s s cr tion enzymes digestives substances diverses absorption excr tion r gulation osmotique Ponsen 1972 1987 consid re que l estomac est le si ge de nombreuses s cr tions L observation chez M persicae de produits de s cr tion et de fragments cellulaires en particulier au niveau de l estomac ant rieur confirme cette interpr tation Nos observations sur A pisum appuient ces faits Dans la r gion de l intestin les cellules de s cr tion sont absentes La fonction essentielle des cellules de cette r gion serait l absorption Weber 1928 Bramstedt 1948 Mackauer 1959 cit s par Ponsen 1972 Ponsen justifie cette hypoth se en faisant observer que les cellules intestinales offrent une grande surface luminale et une bordure stri e bien d velopp e planche V De plus il remarque que le mat riel pr sent dans la lumi re stomacale ne se distingue plus dans la lumi re intestinale Par dissection les l ments de l estomac sont 97 Pour des raisons techniques de fixation que nous esp rons r soudre bient t 98 Mais la concentration 2500 ug ml est cependant la concentration la plus forte accept e par les pucerons N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 169 flocculents alors que dans l intestin et le stomodeum il ne retrouve qu un liquide clair et fluide Nous observons aussi de telles diff rences chez A pisum Forbes 1964 attribue la f
393. s ravageurs des cultures Enjeux et perspectives Paris Ed INRA 1989 230 p Riba G et Silvy C La lutte biologique et les biopesticides Phytoma 1993 Vol 452 p 21 32 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 191 Riggs C D Hunt D C Lin J et Chrispeels M J Utilization of luciferase fusion genes to monitor differential regulation of phytohemagglutinin and phaseolin promoters in transgenic tobacco Plant Sci 1989 Vol 63 p 47 57 Rini J M Hardman K D Einspahr H Suddath F L et Carver J P X ray crystal structure of the pea lectin trimannoside complex at 2 6 A resolution J Biol Mol 1993 Vol 268 N 14 p 10126 10132 Roby D Broglie K Cressman R Biddle P Chet I et Broglie R Activation of a bean chitinase promoter in transgenic tobacco plants by phytopathogenic fungi Plant Cell 1990 Vol 2 p 999 1007 Roitberg B D et Myers J H Effect of adult Coccinellidae on the spread of a plant virus by an aphid J Appl Ecol 1978 Vol 15 p 775 779 Rouanet J M Besancon P et Lafont J Effect of lectins from leguminous seeds on rat duodenal enterokinase activity Experientia 1983 Vol 39 p 1356 1358 Roug P Richardson M Ranfaing P Yarwood A et Sousa Cavada B Single and two chain legume lectins as phylogenetic markers of speciation Biochem System Ecol 1987 Vol 15 p 341 348 Roush R T et McKenzie J A Ecological gene
394. s se rapportant la f condit dur e de la p riode reproductive Dr nombre total de larves pondues par femelle Lv rapports Lv Dv et Lv Dr sont compar s par un test de Mann Whitney ou de Kruskal Wallis Les comparaisons a posteriori des moyennes sont effectu es par la proc dure de Conover 1980 Les donn es correspondant au nombre total de larves pondues quotidiennement rapport au nombre d adultes initialement transf r s dans les boites individuelles sont repr sent es graphiquement Elles sont ajust es avec le logiciel AjustNonLin Bonnot et Febvay 1992 par un mod le de compartimentation trois param tres d fini par l quation y P P x P e 2 ou correspond au nombre total calcul de larves pondues par puceron P est gal la dur e th orique de la p riode pr reproductive d finie pr c demment et P repr sente une mesure de la vitesse de maturation des embryons La fiche protocole N 14A d veloppe le calcul permettant d aboutir cette quation Le choix de ce mod le plut t que d autres mod les d crits dans la litt rature est argument dans la fiche protocole N 14B 3 R sultats 3 1 Effets des lectines induits par ingestion sur milieux artificiels 3 1 1 Tests de toxicit aigu 3 1 1 1 tude pr liminaire sur A pisum justifiant notre tude sur la ConA et la GNA Nous avons ex cut une analyse en composantes principales ACP norm e classique sur le tableau 27 lecti
395. s survivantes T moin 96 de ConA jour Figure 12 Taux de survie des larves de l esp ce Myzus persicae sur des milieux artificiels contenant 1500 ug ml 1 de lectine du perce neige Galanthus nivalis GNA de lectine de la jonquille Narcissus pseudonarcissus NPA de lectine de l ail Allium sativum ASA ou de lectine de Canavalia ensiformis ConA Au jour J3 la plus forte concentration de GNA 1500 ug ml commence affecter significativement la survie 19 96 p 0 02 Au 8 me jour cette m me concentration elle est r duite 58 alors que celle des larves sur milieux t moins s l ve 88 Ainsi 48 ectines se fixant sp cifiquement la N ac tylgalactosamine GalNAc tableau 6 Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 64 compar e au t moin la GNA induit une baisse significative de la survie de 34 pendant la dur e du d veloppement des larves jusqu l ge adulte p 0 001 Aucune des autres prot ines test es lectines ou inhibiteurs de prot ases n est significativement l tale pour les larves de M persicae dans la gamme de concentration explor e Les effets des prot ines purifi es sur le d veloppement sont exprim s en terme de masse acquise gain au cours de la p riode larvaire compar e celle des pucerons sur milieux t moins figures 13 amp 14 Les trois lectines mannose strict GNA NPA ASA induisent une augmentation significativ
396. sa to herbaceous secondary hosts but most species are monoecious on a wide variety of herbs and shrubs As far as known most species have alate males About half the species are described from North America although some of these have seldom or never Deen recognized again and may really be synonyms of better known species About 36 species are known from Europe and the remainder are from Central Asia India and the Far East Three South American species may also belong in Macrosiphum Sitobion often treated as a subgenus of Macrosiphum is here treated as a separate genus Accounts of Macrosiphur are available for Europe Hille Ris Lambers 1939 Germany M ller 1969 Switzerland Meier 1961 Central Asia Nevsky 1929 Narzikulov and Umarov 1969 Japan Miyazaki 1971 Korea Paik 1965 China Tao 1963 and India David 1976 North American Macrosiphum are reviewed by Palmer 1952 Rocky Mountain region Hottes and Frison 193 Ulinois Patch 1919 eastern U S A and Soliman 1927 California MacGillivray 1968 gives more recent informa tion on some North American species Macrosiphum albifrons Essig Lupin Aphid Large 3 2 4 5 mm pale bluish grey green aphids dusted with white wax on stems and leaves of Lupinus spp Adult apierae have paie brownish siphunculi whereas the siphunculi of immatures are uniformly dark Widespread in Sursh America except in south eastern U S A and introduced into England Stroyan 1
397. sawa T et Sharon N What should be called a lectin Nature 1980 Vol 285 p 66 Goldstein I J et Poretz R D Isolation physicochemical characterization and carbohydrate binding specificity of lectins in The lectins properties functions and applications in biology and medecine Orlando USA Liener LE Sharon N Goldstein I J Acadamic Press Inc 1986 p 35 249 Gould F Role of behavior in the evolution of insect adaptation to insecticides and resistant host plant Bull Entomol Soc Am 1984 Vol 30 p 34 41 Graf B Baumgartner J et Gutierrez A P Modeling agroecosystem dynamics with the metabolic pool approach Mit Schweiz Entomol Gesel 1990 Vol 63 p 465 476 Grass P P Super ordre des H mipt roides Appareil digestif et ses annexes in Trait de Zoologie Anatomie Syst matique Biologie Paris Ed Masson et Cie 1951 Vol 10 Fasc IL p 1460 1471 Greer F et Pusztai A Toxicity of kidney bean Phaseolus vulgaris in rats changes in intestinal permeability Digestion 1985 Vol 32 p 42 46 Gregory P Tingey W M Ave D A et Bouthyette P Y Potato glandular trichomes a physicochemical defense mechanism against insects in Natural resistance of plants to pests roles of allelochemicals Whashington Green M B amp Hedin P A Eds American Chemical Society 1986 p 160 167 Grenier A M Nardon C et Rahb Y Observations on the micro organisms occuring in the gut of the
398. ses subl tales de ConA ou de GNA sur la croissance la survie et la f condit du puceron du p cher Myzus persicae Les masses sont indiqu es en ug les dur es en jours L erreur standard SE de chaque valeur est donn e entre parenth ses sur une m me ligne les valeurs suivies par des lettres diff rentes diff rent significativement au seuil de 5 voir Mat riels amp M thodes pour les tests appliqu s Lorsque les t moins ne diff rent pas significativement les valeurs moyennes des 5 modalit s sont compar es sinon chaque exp rience est consid r e ind pendamment Le jour J20 a t choisi comme devant correspondre la moiti de la p riode reproductive Hombre total de larves pucerons imitiaur 100 80 wr 60 40 20 F de pucerons T Larres cumulees pucerons 1mitiaur 20 Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 72 T moin 25 ConA140 T moin2 GNA215 GNA450 Jours Modalit s PI Lv mod le observ mod le P2 d observ P3 mod le T moin1 ConA140 T moin2 GNA215 GNA450 22 4 0 5 20 5 1 3 18 2 0 3 16 7 1 1 20 6 0 3 18 7 0 7 15 2 0 4 13 3 0 5 13 2 0 4 11 6 0 4 8 4 0 1 8 5 0 1 6 8 0 1 8 5 0 1 8 1 0 2 9 7 0 1 9 8 0 1 8 5 0 1 10 1 0 2 10 0 0 2 0 25 0 03 0 26 0 02 0 24 0 02 0 23 0 03 0 23 0 05
399. sistantes est r apparue comme l une des composantes majeures de cette approche introduire dans le g nome du v g tal une partie des facult s de d fense de la culture peut en effet permettre une plus grande souplesse dans l utilisation globale des moyens de protection Riba et Silvy 1989 Allen et Rajotte 1990 Quisenberry et Schotzko 1994 Wiseman 1994 Dans le cadre pr cis de la lutte contre les pucerons la lutte int gr e englobe toutes les techniques et mesures capables d interrompre le cycle de vie des insectes au cours de l une ou l autre de ses phases Harrewijn 1989 c AUP fF A6 i 1 oh Figure 5 Exemples de pratiques pouvant tre mises en place dans le cadre d une lutte int gr e contre les pucerons d apr s Harrewijn et Minks 1989 AU automne W hiver S printemps Su t 1 D foliation de l h te primaire pour r duire l oviposition 2 Pulv risation d huiles min rales pour tuer les oeufs d hiver 3 Elagage des h tes primaires au printemps 4 Application de moyens pour restreindre l habitat des pr dateurs celui des h tes primaires 5 D tournement des ail s de leurs plantes cibles 6 Mise en culture de vari t s r sistantes 7 Interventions pour modifier bon escient la physiologie de la plante 1 3 3 Les solutions biologiques de lutte contre les pucerons La lutte biologique telle qu elle a t d finie en 1971 par l Organisation Internationale
400. sit de Wageningen Pays bas de faire N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 111 quelques essais pr liminaires Mais nous ne disposions d aucune donn e complete relative aux types d ondes observables sur milieux et sur leur corr lation avec une activit de p n tration des stylets Notre premier travail a consist caract riser ces ondes en les comparant celles parfaitement d finies du mod le de Tjallingii Nous nous attendions ventuellement un cas de figure tr s simple avec des ondes traduisant l absence d activit alimentaire des pucerons et des ondes corr l es la p n tration des stylets dans le milieu non p n tration p n tration Or nous pouvons distinguer nettement deux types d ondes lorsque les stylets sont enfonc s Nous les appellerons ondes C et ondes G par analogie avec celles observables sur plantes figure 34 Ondes D signation C G Fr quence Plantes composite et tr s variable 4a8 en Hz Milieux artificiels composite et tr s variable 5 7 Nous consid rons donc que les ondes C sont corr l es des activit s diverses de salivation nous retrouvons par exemple les ondes caract ristiques de type B d finies par Tjallingii annexe 6 et de p n tration des stylets et selon notre interpr tation les ondes G sont li es une activit d ingestion active de milieu Dans tous les enregistrements des ondes caract rist
401. sphate dipotassique K3HPO PM 174 x 174g Eau distill e qsq 1000 ml ou monosodique dipotassique Les proportions des dilutions pour l obtention du pH sont sensiblement identiques pour ces diff rents phosphates sodiques ou potassiques 6 x repr sente la concentration molaire du tampon 0 2 M 0 4 M etc que l on souhaite r aliser Fiche N 22A Fixateurs utilis s pour la fixation des larves de pucerons en vue d observations en microscopie lectronique transmission Glutarald hyde Formule COH CH2 3COH PM 100 Le glutarald hyde est commercialis en ampoules scell es ou en flacons de diff rentes concentrations Glutarald hyde 4 Glutarald hyde 50 96 8ml Eau distill e 92 ml Glutarald hyde 6 Glutarald hyde 50 96 12 ml Eau distill e 88 ml Les solutions de glutarald hyde se conservent au r frig rateur Paraformald hyde Formule CH20 n PM 30 n Le paraformald hyde trioxym thyl ne est un polym re du formol Il se dissout dans l eau l g rement alcaline chaud si la solution est concentr e Paraformald hyde 20 96 Dans un erlenmeyer de 25 ml mettre 10 ml d eau distill e ti de Ajouter 2 g de paraformald hyde en poudre Laisser hydrater pendant 2 3 min et agiter 5 min dans la cuve ultra sons Boucher le r cipient avec un morceau de papier d aluminium et placer dans une tuve 80 90 C pendant 30 min 1 h Ajouter ensuite une ou deux goutt
402. sse D une mani re g n rale m me dans le cas de lectines sp cificit s osidiques tr s proches telles la GNA et la NPA le mode d action de chacune des lectines devra tre tudi pr cis ment Les tudes sur les interactions subcellulaires lectines sucres justifient notre prudence ne pas g n raliser h tivement nos r sultats nous avons montr et confirm que les lectines mannose strict en particulier la GNA induisaient un effet probiotique aux faibles concentrations C est ce qui pourrait expliquer notamment que les pucerons test s sur la lign e GNA2 23 de pommes de terre transg niques se soient montr s plus performants en terme de f condit que les pucerons sur les plantes t moins Cette observations confirme la n cessit de bien maitriser l expression des transg nes pour ne pas tre confronter ce type de probl me en plein champ 2 Implications des connaissances sur la toxicit des lectines sur leur potentiel d utilisation en protection des cultures La lecture de nos r sultats nous am ne nous poser une premi re question est il l gitime d envisager la cr ation de plantes transg niques exprimant le g ne d une lectine pour lutter contre les pucerons Nous venons de rappeler que compte tenu des activit s de toxines actuellement disponibles les pucerons doivent ing rer des milieux contenant 100 200 ug ml de lectine pour tre significativement intoxiqu s Nous admettrons dans
403. st s ch e puis plac e entre deux feuilles de Saran Wrap Un film autoradiographique est expos sur la membrane pendant 15 sec En fonction du r sultat obtenu d autres expositions sont r alis es pendant une plusieurs minutes le pic de lumi re se produit entre 5 et 20 min Apr s exposition chaque film est imm diatement d velopp et fix 3 Blue sensitive X ray film Fiche N 8 Dissection des tubes digestifs de pucerons n pince fine adh sif double face boite de P tri les pucerons vivants sont fix s dans une boite de P tri sur un adh sif double face 2 ils sont recouverts de tampon physiologique Yeager 3 extraction du tube digestif la t te est arrach e tout le tube digestif est tir l oesophage est coup juste au dessus de l estomac l intestin est coup avant la grande poche du rectum A ce stade l estomac et l intestin sont ventuellement s par s A l aide d une pince fine ils sont transf r s avec pr caution dans les solutions ad quates pour leur utilisation future Fiche N 9A Dosage sp cifique de la ConA par une m thode immunoenzymatique quantitative l ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay Nous avons appliqu un dosage de type non comp titif dit en sandwich C est le proc d qui donne en effet les r sultats les plus satisfaisants aussi bien du point de vue de la sensibilit que de la reproductibilit Principe de la m thode selon ce
404. stitutive le g ne de la GNA sont variables mais prometteurs Abstract The aim of this study is to identify proteins that are deleterious to aphids Homoptera Aphididae and to determine the mechanisms of action of some of them This work is a first step in a defence strategy against aphids based upon the use of transgenic plants expressing such toxic plant proteins Amongst the molecules tested two mannose binding lectins ConA and GNA from jackbean Canavalia ensiformis and snowdrop Galanthus nivalis respectively induced significant mortality and growth inhibitory effects on aphid nymphal development these were thus chosen for subsequent investigations Dose response curves of mannose binding lectins were shown to differ substantially between the six aphid species tested At sub lethal doses GNA and ConA adversely affected total fecundity and the dynamics of reproduction of both pea aphid Acyrthosiphon pisum Harris and peach potato aphid Myzus persicae Sulzer ConA acted as an antifeedant but not as a feeding deterrent On the model aphid A pisum high levels of ConA significantly altered ingestion rates but at moderate levels insects appeared to exhibit a time dependent tolerance of the antifeedant The stomach and anterior part of the midgut were shown to be the primary physiological targets of ConA As a result of its binding to epithelial cells the lectin was shown to induce hypertrophic growth of these cells and subsequent s
405. str es simultan ment amplificateur EPG Giga 4 voies r f Universit de Wagenigen Pays Bas Les donn es sont stock es sous forme de fichiers binaires Elles sont lues instantan ment par un logiciel en basic labor au laboratoire qui permet de visualiser en direct sur l cran d un MacIntosh le comportement d alimentation des pucerons G Bonnot non publi L acquisition est r alis e ici la fr quence de 10 Hz 10 points par seconde Cette fr quence est suffisamment r solutive dans notre protocole exp rimental pour l analyse ult rieure des profils EPG et permet des enregistrements de longue dur e sans que nous soyons confront s des probl mes de capacit de stockage des donn es8 2 4 3 M thode d analyse du signal L analyse du signal lectrique est r alis e l aide du logiciel MacStylet d velopp au laboratoire Febvay et al 1992 Pour chaque puceron le d but des diff rentes phases des ondes EPG observ es est tiquet gr ce une marque sp cifique le d but d une phase correspondant automatiquement au d but de la suivante ou la fin du signal annexe 7B Chaque marque est alors d finie par son type np C G son abscisse c est dire le temps o se situe cette marque depuis l origine de l enregistrement et son ordonn e c est dire le niveau en volt du signal lectrique ce temps Les param tres de toutes les marques affich es sur un enregistrement sont sauvegard s dans un
406. t totale 400 mOsM Temps de fixation 24 h 3 j temp rature ambiante dans des piluliers en verre de 10 ml Lavage Il est r alis avec le tampon seul en l g re hyperosmolarit Tampon phosphate mono Na di K 0 175M 350 mOsM pH 7 4 Temps de lavage 5 bains de 1 h 4 C 1 bain d une nuit Post fixation 1 volume Os04 4 96 2 80 mOsM 1 volume de tampon phosphate 0 2 M 0 1M 200 mOsM mono Na di K pH 7 4 Osmolarit totale 280 mOsM Temps de fixation 2 h temp rature ambiante D shydratation thylique standard Elle se pratique temp rature ambiante Au sortir des liquides de lavage les pi ces s journent dans les bains suivants Alcool thylique 30 un bain 10 min Alcool thylique 50 un bain 10 min Alcool thylique 70 46 un bain 10 min Alcool thylique 95 o eter steering un bain 10 min Alcool absolu eee 2 3 bains de 10 min Fiche N 22C Inclusion dans la London Resin White Newman et al 1982 Produits La London Resine White est une r sine acrylique hydrophile permettant des r actions sur coupes ultrafines immunocytochimie cytochimie commercialis e sous forme 1 d un m lange du monom re m thacrylate et d un durcisseur qui peut se conserver une ann e 4 C Trois types de m lange sont
407. t PWG6 85 Trois lign es transform es avec la construction simple GNA2 GNA2 23 GNA2 28 et GNA2 30 et une lign e transform e avec la construction simple WAI9 WAI9 12 ont galement t s lectionn es En l absence de lign e t moin transform e les plantes de la lign e WAI9 12 dans lesquelles la WAI n est pas d tect e sont consid r es comme transplants t moins Les plantes de chaque lign e sont obtenues par multiplication v g tative in vitro microbouturages des m rist mes apicaux 2 6 Estimation des taux d expression des transgenes par immunod tection sur membrane de nitrocellulose Deux techniques d immunomarquage sur membrane de nitrocellulose nous ont permis de doser qualitativement Tissue Blot ou quantitativement Dot Blot la GNA dans les feuilles des pommes de terre transg niques Les fiches protocole N 5 et N 7 d crivent pr cis ment ces deux techniques Nos coll gues britanniques ont galement dos les prot ines WAI et BCH Gatehouse et al 1995a nous commentons leur r sultats 42 R g n ration des plantules partir de protoplastes 43 Plus commun ment appel e technique Dot Blot son principe est d crit dans la fiche protocole N 5 Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 54 2 7 Estimation indirecte du taux d expression des transg nes par dosage ELISA d intestins de pucerons Lors de notre s jour Durham en janvier 1995 nous avons mis au point un
408. t broy s au potter 2 1 4 D p t des chantillons et lectrophor se 7 Les d p ts sont r alis s apr s homog n isation des extraits dans le tampon d introduction L ensemble est chauff pendant 3 minutes 100 C d naturation des prot ines et chargement en SDS puis centrifug 3 minutes 7000 g pour liminer les particules insolubles Le gel est ensuite mont dans un appareil lectrophor se Mini protean I Bio Rad et la cuve est remplie de tampon de migration Un kit de marqueurs de poids mol culaire est utilis 3 5 ug par d p t L lectrophor se est conduite tension constante 200 V et temp rature ambiante pendant 50 min environ jusqu l arriv e en bas du gel du front de migration visualis par le bleu de bromoph nol Les gels sont plac s de 20 minutes 1 nuit dans le colorant 37 C sous agitation La d coloration se fait dans 3 bains 10 min 10 min et 30 min de solution de d coloration I Puis les gels sont conserv s une nuit au minimum dans la solution II avant d tre s ch s sur un papier bristol 1 h 30 60 C l aide d un s cheur de gel LKB 73 Les compositions de toutes les solutions sont donn es dans la fiche protocole N 17 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 125 2 2 Dosage de la Concanavaline A par technique ELISA 2 2 1 Principe et m thodologie La technique ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay est bas e su
409. t ces termes dans le paragraphe suivant consacr l anatomie du tube digestif Une diff rence marqu e apparait entre les deux parties du m sent ron et le rectum au niveau de leur profil en aminopeptidases La plupart des dipeptidyl et oligopeptidyl aminopeptidases ne sont pas d tect es dans le rectum ainsi que certaines des mono aminoacyl aminopeptidases dos es Asp Glu y Glu His Hpro et Ile aminopeptidases D une mani re g n rale le m sent ron regroupe les plus grandes quantit s d enzymes La comparaison estomac intestin ne fait ressortir que peu d enzymes plus sp cifiquement exprim es dans l estomac Nous pouvons citer par exemple Arg Bala Gln Lys Met et Orn aminopeptidases ainsi que la dipeptidyl aminopeptidase Gly Ala Mais le fait le plus marquant au niveau du profil peptidasique du tube digestif d A pisum est le contraste entre les quantit s lev es en aminopeptidases et la quasi absence d endopeptidases 95 ou tout au moins leurs niveaux d activit tr s diff rents Ainsi avec les substrats utilis s aucune activit trypsique ou chymotrypsique n est d tect e except e une tr s faible activit N benzoyl leucyl arylamidase dans l estomac Nous pouvons donc conclure que le tube digestif ne pr sente pas le bagage enzymatique n cessaire pour d grader activement la Concanavaline A Les profils lectrophor tiques de broyats d estomacs de pucerons intoxiqu s pr sentent une bande 26 kDa correspondant pr
410. t de chercher encadrer la valeur 1 en faisant varier la valeur rm de fa on discr te On d montre que dans une population de pucerons qui atteint une distribution stable des ges les adultes ne constituent qu une tr s faible proportion du total la majorit des individus est constitu e par des jeunes larves Fiche N 13 Principe de la m thode du Jackknife pour estimer la variance du rm d une population de pucerons La m thode de Jackknife a t introduite par Quenouille en 1949 cit par Miller 1974 Elle permet une estimation de la variance de tout param tre li un chantillon en r duisant le biais li la r partition des al atoires Le principe de la m thode est d crit ici en nous appuyant sur notre exemple concret du calcul de la variance du r d une population de pucerons Un aspect plus th orique et g n ral de la m thode est d taill par Miller 1974 et Efron 1982 Nous souhaitons estimer la valeur du 7 d une population de pucerons ainsi que l intervalle de confiance de cette estimation sur un chantillon de n pucerons La m thode classique nous aurait conduit utiliser les 7 calcul s pour chaque individu ou r et nous aurions obtenu dans le cas d une distribution normale des F Fy F T aos Or _ 1l avec In ay n 1 n 1 ET Oc SD DAON ij n Mais dans notre cas le calcul des 7 individuels est impr cis pour des raisons intrins ques li es la formu
411. t est le pr alable cette tape ult rieure de d veloppement Les effets des lectines sur la faune auxiliaire devra aussi tre tudi e Exprim es dans la s ve phlo mienne des lectines pourraient par exemple se retrouver dans le nectar des fleurs et intoxiquer les abeilles et les autres esp ces pollinisatrices D s l obtention de construction phlo me sp cifique on pourra tester facilement cette possibilit Il faudra galement s assurer de l innocuit des ces prot ines sur les mammif res et les humains Les tudes toxicologiques sont d j largement entam es pour la ConA et aussi la GNA Mais a priori l un des crit res de choix au d part pour s lectionner le g ne d une lectine est pr cis ment l innocuit de celle ci C est ce qui explique notamment outre ses propri t s insecticides l int r t de l quipe de J Gatehouse pour la GNA 4 Quel avenir pour les plantes transg niques Si la disponibilit de vari t s transg niques r sistantes aux insectes est d j un fait accompli ou imminent tableau 4 l volution de la strat gie et de son impact restent incertain A moyen terme elle semble encore devoir d pendre des r sultats des tudes de toxicit au niveau cellulaire et des biologistes mol culaires en particulier des r ponses techniques que ces derniers apporteront aux faiblesses de certaines constructions disponibles instabilit s et effets positionnels notamment A long terme elle d pendra
412. t les perturbations physiologiques qui d coulent de l intoxication Des techniques diverses sont utilis es Les interrogations pr cises auxquelles nous avons voulu r pondre et l ensemble de notre d marche sont r sum s par une localisation sch matique de nos exp riences pr sent es r a E Microscop e lectronique transmission Microscople phaotonique L intoxiqu e ConA AUI copes serices Llongtomie 11 ConA FITC histopathulugio ConA 10 LOU don inunuod teclion Anulyse des avices amin s libres des pucerons entiers inlaxiqu s Eusa gaa i T Kleclrophorise i i estomac E pris E lt p CL PER S I eee p e won e rectum 7 T 3 ea xa Hem nn La i o Intestin ee o 1 Pa Sc I nt a 1 Le AX Analyse des acides iy k a amin s libres pyk i i l i 1 inliibition comp titive ELISA leetine surre Figure 39 Descriptif de la d marche et des techniques utilis es pour l tude du mode d action cellulaire de la Concanavaline A sur le puceron Acyrthosiphon pisum Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 124 2 Mat riels et M thodes 2 1 Electrophor se monodimensionnelle sur gel de polyacrylamide en pr sence de SDS 2 1 1 Principe Les prot ines sont solubilis es dans une solution contenant 2 de SDS Ce d tergent provoque la formation de micelles n ga
413. tal de larves pondues par les pucerons P T jour moyen calcul o les pucerons commencent pondre P k 10 devient y P p r Be 5C 2 Fiche N 14B Justification du choix du mod le utilis pour d crire la dynamique de ponte des pucerons De nombreux mod les peuvent tre appliqu s pour param trer la dynamique de f condit des pucerons quelques uns sont d crits dans la litt rature Bieri et al 1983 Graf et al 1990 Simon et al 1991 Schmitz et al 1993 Ruggle et Holst 1994 Mais ces mod les ont g n ralement le grave inconv nient d tre empiriques leurs param tres constitutifs n ayant aucune signification biologique La d marche de certains auteurs consiste ainsi appliquer un mod le et rechercher a posteriori une signification biologique plus ou moins exacte de tout ou partie des param tres Divers crit res nous ont guid dans le choix entre diff rents mod les testables et ou test s Compte tenu des remarques pr c dentes notre choix s est avant tout orient vers une fonction dont les param tres ont une valeur descriptive de la dynamique de f condit des pucerons Il a aussi t tenu compte de la simplicit de la loi d ajustement Outre les estim es des param tres certains crit res nous permettent de juger de la pertinence de l ajustement et de sa pr cision l cart type li la d termination de chaque param tre l intervalle de confiance approximatif des estim
414. tales de ConA sur la croissance la survie et la f condit du puceron du pois Acyrthosiphon pisum Les masses sont indiqu es en ug les dur es en jours L erreur standard SE de chaque valeur est donn e entre parenth ses sur une m me ligne les valeurs suivies par des lettres diff rentes diff rent significativement au seuil de 596 voir Mat riels amp M thodes pour les tests appliqu s Lorsque les t moins ne diff rent pas significativement les valeurs moyennes des 5 modalit s sont compar es sinon chaque exp rience est consid r e ind pendamment Le jour J15 correspond la moiti environ de la p riode reproductive Le jour J20 correspond au premier jour o une diff rence significative apparait au niveau de la mortalit p lt 5 Chapitre 2 Effets des lectines sur la biologie des pucerons 68 wre ode puceronas 5 Hombre total de larves pucerons initiant T moinl ConA80 60 T moin2 40 gt ConA100 20 ConA200 pontes cumul es rU os Ns aq pua d 15 s a x x E 3 Yr E 10 f 5 Modalit s P1 Ly P2 d P3 mod le observ mod le observ mod le T moin 29 8 0 6 27 8 1 3 8 6 0 2 10 6 0 2 0 35 0 03 ConAS0 26 0 0 5 24 5 0 8 8 8 0 2 11 3 0 2 0 32 0 03 T moin2 24 3 0 7 20 6 2 2 9 3 0 2 10 7 0 3 0 29 0 04 ConA100 23 4 0 4 19 6 1 4 11 9 0 2 14 1 0 4 0 23 0 02 ConA200 2
415. tants cr s par croisements intrasp cifiques notamment lorsqu ils concernent des r sistances monog niques La simplicit des m canismes actuellement transf r s en transg n se v g tale fait galement craindre que les plantes transg niques puissent tre sensibles une r action populationnelle du ravageur Mais le dogme monog nique facilement contournable moindre co t pour l insecte classiquement accept n est cependant pas g n ralisable et la nature des g nes concern s doit influer hautement sur cette possibilit Nous abordons plus en d tail ce probl me du contournement de la r sistance par les insectes dans un paragraphe ult rieur en s lection vari tale classique dans certains cas favorables il est possible que l hybridation intersp cifique fournisse des g nes ou groupes de g nes plus durables qui ont pass l preuve des mill naires en conf rant une esp ce ou un genre botanique entier une r sistance stable Mais ceci suppose cependant que ces g nes ne soient pas li s des caract res agronomiques ind sirables ou que les probl mes cytog n tiques ne soient pas insurmontables Certains des inconv nients que nous venons d voquer concernant la s lection vari tale classique peuvent tre en partie surmont s par le recours aux nouvelles m thodes de g nie g n tique Notre tude s ins rant pr cis ment dans le cadre de la strat gie plantes transg niques il nous a sembl
416. te t employ pour l tude des insectes Birch 1948 des rongeurs et diverses autres esp ces animales pour revue Dajoz 1974 L expression de rm n a de valeur que si le mod le exponentiel de croissance de la population n est pas trop loign de la r alit ce qui explique que l application est restreinte aux insectes plurivoltins g n rations courtes et chevauchantes par exemple aux drosophiles et aux pucerons L int r t du rm est donc de permettre d exprimer la vitesse de croissance d une population aphidienne et de comparer diff rentes populations dans des conditions d termin es Dans notre cas nous avons compar des populations d une m me esp ce soumises diff rentes conditions d alimentation pucerons sur plantes transg niques ou milieux artificiels L volution d une population peut tre assimil e une exponentielle Rabasse amp Shalaby 1980 Dixon 1987 il y a au bout d un certain temps une distribution stable des ges On peut alors appliquer la relation d finie par Lotka je 7 4 m d l 0 x mx et lx sont d finis dans le mat riels amp m thodes Chapitre 2 Nous avons vu que lorsque rm n est pas trop grand il est possible d utiliser l approximation de Birch 1948 tel que n Ty xX Ye a L m d 1 0 le rm de chaque population est calcul par approximations successives it rations sur cette formule l aide d une feuille de calcul Excel permettan
417. te quantit est elle tr s faible nous sommes en effet la limite du seuil de sensibilit La lectine est trouv e en un peu plus grande quantit dans le miellat qui est rejet entre la 24 me et la 48 me heure d intoxication mais principalement pour les pucerons intoxiqu s la concentration de 400 ug ml la ConA n est en effet pas d tect e dans le miellat des pucerons faiblement ou fortement intoxiqu s Entre 48 et 72 heures d intoxication seuls les pucerons sur milieux ConA800 rejettent en tr s faible quantit de la ConA Au moment de la r colte des miellats des gouttelettes d excr tion sont visibles Elles sont cependant beaucoup plus petites et plus parses pour la modalit ConA800 Malheureusement nous n avons pas pu quantifier le volume ou le poids sec de miellat r colt Les quantit s pr lev es sont beaucoup trop faibles pour ne pas conduire une estimation erron e Nous proposons une interpr tation de ces observations dont la coh rence n est pour le moins pas imm diate modalit ConA200 m me apr s 48 h d intoxication le tube digestif des pucerons n est pas satur en lectine Ces derniers n excr tent donc pas de ConA puisque toute celle qui est ing r e est fix e Les r sultats de la figure 41C peuvent conforter cette interpr tation en 48 h un adulte sur milieu contenant 200 ug ml de ConA ing re environ 500 ng de lectine alors qu un adulte tr s fortement intoxiqu Con A800 en ing
418. telle Macrosiphum albifrons Aucune relation classe de lectine spectre de toxicit n apparait clairement m me si les lectines mannose strict GNA NPA semblent les plus r guli rement actives Il est int ressant de constater que la toxicit de ces derni res ne se manifeste pas seulement sur les pucerons mais aussi sur le delphacide et la cicadelle du riz Nephotettitx cinciteps et Nilaparvata lugens Powell 1993 Le spectre d activit des lectines mannose qui sont toxiques contre des L pidopt res tableau 4 pourrait donc tre largi l ordre des Homopteres A notre connaissance c est la premi re fois que le mode d action d une lectine sur un insecte est d crit de fa on aussi pr cise Nous pouvons cependant signaler que Gatehouse ef al 1984 et Eisemann ef al 1994 ont d j avanc des hypoth ses concernant le mode d action respectivement de la PHA sur une bruche et de la ConA sur une mouche Sur le puceron mod le A pisum nous avons d montr que N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 175 la ConA n est pas phagor pulsive et il ne semble pas exag r de penser qu A pisum est incapable de d tecter sa pr sence dans son alimentation jusqu des doses relativement lev es 400 ug ml les pucerons m mes fortement intoxiqu s continuent en ing rer de grandes quantit s malgr un net effet court terme sur les taux d ingestion il semble manifeste
419. tenir le bagage enzymatique n cessaire une ventuelle destruction prot olytique de la lectine D une facon g n rale les pucerons devraient s av rer moins aptes contourner une r sistance d origine prot ique par modification de l quipement prot olytique comme cela semble se passer pour certains inhibiteurs de prot ases Broadway 1995 et qui a d j t signal pour d autres toxines comme les inhibiteurs ribosomaux RIP Gatehouse et al 1990a 3 Perspectives Pour des raisons ind pendantes de ce travail de th se nous avons du courter sensiblement notre tude Ceci nous a impos de faire des choix Nous sommes conscients de ne pas avoir approfondi certaines voies C est notamment le cas des observations en microscopie lectronique et de la caract risation biochimique mol culaire de l interaction ConA estomac Nos objectifs court terme seront donc la caract risation plus pr cise de l intoxication cellulaire par la ConA sur A pisum Nous ferons appel la microscopie lectronique pour d crire les effets de l intoxication Nous observerons ainsi les effets de doses croissantes de lectine et les effets au cours du temps Une attention particuli re sera port e sur d ventuelles l sions au niveau de la bordure stri e des cellules pith liales et sur l identification structurale du ph nom ne d exfoliation stomacale L utilisation de ConA marqu e par de l or colloidal devrait ventuellement nou
420. tes et al 1974 Chang et al 1980 Thertcaphis trifolii Monell OP Stern 1962 Walters and Forrester 1979 carb Walters and Forreater 1979 OP organophosphorus OC organochlorine carb carbamate pyr pyrethroid For a comprehenaive list of references see Georgz ou 1981 d apr s Devonshire 1989 Annexe 3A Mode d action de Ja lectine du haricot PHA er de la Concanayaline A sur des animaux de laboratoire rats principalement lableau non exhaustiri C ol 77 19 smor MNT suwuna ORS 27ar sap uonducsqe osmanrui IU juarzr2ure nuo no ope1nsajur osnonbnur e 20 4896 ATED SAMIR sap aaepnis op san2idoo24 SIUNAUS sA POLE 1u2re 131 2 2u1129 TI Vo 28 uns AUNI 2p ERGI TU 22 UEWOY nuzquuo np 2abisejoup u 12 zabrsvg amp uue onbrsd Kg spare sap uon npaa Ted vHd x986T pP 19 0H SPPAIOIS Te sap assaag Te erpioq gp Sp sssepadadi IS6 Pi easg sap RN ra saure sapie sap puns wodsuer np Wed SLNOS Te VHd 86 Pra PSN OEM sap 1109 ap son np U e op saonaga SOI D TSOL WSC 19 weoszuaxy omosos SURP LOTS 12 Jeunszjut urup2uada 244 g odzssed wI VIId segu2ugd np o3iuad souikzu2 Sap JoLEANE 12 3sgurquagjuz urisajut suep seg2ued np sonbn 09 04d xuikzu sop vore LIINU Sap 3580JQ UI 2ufipuoq EL 2p 3seurqoj3112 Ip uonmrqur sonbnejuoued 3un zu2 SIP 311A J2e AP uonnumurp aun 861 DH Bury g 23 20 s suong seamed AP so npo2 SA sup s24rp1aumadap mona
421. tics of insecticide and acaricide resistance Annu Rev Entomol 1987 Vol 32 p 361 380 Ruggle P et Holst N Life history parameters of parasitoids attacking cereal aphids Norw J Agr Sc 1994 Suppl N 16 p 83 88 Russel G E Pests some general considerations in Plant breeding for pest and disease resistance London Ed Butterworths 1981 p 10 50 Ryan C A Proteinase inhibitors in The Biochemistry of Plants New York Marcus A Ed Academic press Inc 1981 Vol 6 p 351 370 Sasaki T et Ishikawa H Nitrogen recycling in the endosymbiotic system of the pea aphid Acyrthosiphon pisum Zool Sci 1993a Vol 10 p 779 785 Sasaki T et Ishikawa H Nitrogen recycling in the endosymbiotic system of the pea aphid Acyrthosiphon pisum Zool Sci 1993b Vol 10 N 5 p 779 785 Sawahel W A Transgenics plants performance release and containment W J Microbiol Biotech 1994 Vol 10 p 139 144 Schepers A Chemical control in Aphids their biology natural enemies and control Amsterdam A K Minks amp P Harrewijn Ed Elsevier 1989 Vol 2C p 89 122 Schmitz V Dedryver C A et Pierre J S Influence of an Erynia neoaphidis infection on the relative rate of increase of the cereal aphid Sitobion avenae J Invertebr Pathol 1993 Vol 61 N 1 p 62 68 Schoonhoven L M et Derksen Koppers I Effects of some allelochimics on food uptake and survival of polyphagous aphid Myzus persicae Entomo
422. ticulier sont ils capables de d tecter dans I acceptation sensorielle du terme la pr sence d une lectine dans leur alimentation Des tests dits tests de choix sont utilis s pour mettre en vidence un ventuel comportement de rejet de milieux contenant de la ConA Nous avons ensuite incorpor un traceur radioactif dans des milieux contenant la lectine pour mesurer l ingestion de pucerons intoxiqu s et d crire la cin tique de l intoxication Enfin la technique d lectrop n trographie mise en oeuvre ici en milieu artificiel nous permet une analyse fine des diff rentes s quences du comportement d alimentation induites par l intoxication 2 Mat riels et M thodes 2 1 Acyrthosiphon pisum et la Concanavaline A le puceron et la lectine mod les test s Tous les tests d crits dans ce chapitre ont port sur des larves ou des jeunes adultes de l esp ce A pisum Les lots de pucerons sont homog n is s par synchronisation avant le transfert sur les milieux artificiels La Concanavaline A provient de chez EY Laboratories San Mateo CA USA r f L 1104 Elle se pr sente sous forme de poudre que nous stockons 20 C Les milieux artificiels avec ConA sont pr par s par dilutions d une solution m re de milieu standard Ap2 contenant 1 mg ml de lectine mat riels amp m thodes du Chapitre 2 2 2 Principe des micro tests de choix Nous avons labor un dispositif permettant de tester le comportement de
423. tielle pour l arginine la lysine l ornithine tous acides amin s basiques et riches en azote et impliqu s dans l excr tion azot e la glutamine et le tryptophane eux aussi assez riches en azote ou la B alanine et la m thionine Une double fonction s cr toire et excr toire parait donc plausible pour cette r gion m sent rique En ce qui concerne les miellats des pucerons intoxiqu s la ConA le syndrome majeur est sans conteste l augmentation constante de l excr tion d asparagine avec l intoxication d un composant mineur chez les t moins 1 396 Il passe au second rang d s la deuxi me dose pour finir pr s de 28 chez les pucerons tr s fortement intoxiqu s C est un syndrome de m me ampleur que l hyperexcr tion de glutamine chez les pucerons aposymbiotiques Sasaki et Ishikawa 1993a Douglas in press Liadouze non publi mais probablement d interpr tation diff rente la glutamine peut en effet tre consid r e comme un produit de d toxication de l ammoniaque qui s accumulerait et serait excr t massivement en l absence de recyclage par les symbiotes Une interpr tation similaire de l excr tion d asparagine devrait s accompagner de taux endog nes lev s de ce m me acide amin ce qui n est pas le cas aux doses moyennes de ConA figure 47B Une autre interpr tation de cet accroissement d Asn dans les miellats peut invoquer une perturbation de l assimilation de cet acide amin Asn est en effet l acide
424. tillons sont stock s une nuit 4 C Nous rajoutons 80 ul de tampon PBS Tween g latine chaque extrait juste avant le d p t dans les puits de la plaque ELISA Pour pr lever de l h molymphe les pucerons sont fix s vivants sur une lame gr ce un adh sif double face leurs pattes post rieures sont coup es microciseaux la goutte exsudant de l incision est pr lev e avec l embout d une seringue Hamilton et dissoute dans 20 ul d une solution de Yeager satur e en PTU Cinq six gouttes sur dix pucerons sont ainsi r colt es par chantillon Juste avant le dosage 80 ul de tampon PBS tween g latine sont rajout s aux extraits 74Ph nyl thio ur e inhibiteur de la m lanisation Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 126 2 3 Microscopie photonique 2 3 1 Coupes s ri es de larves du quatri me stade larvaire L anatomie du tube digestif de l esp ce A pisum est reconstitu e partir de coupes s ri es de larves de stade 4 A ce stade le tube digestif est bien form les larves sont plus faciles fixer et le d veloppement des embryons ne perturbe pas encore la disposition du tube digestif Des larves qui se sont d velopp es sur milieu standard Ap2 sont plong es dans un fixateur liquide de Duboscq Brazil Apr s une fixation d une dur e minimale de 24 heures les pucerons sont pr par s par double inclusion g lose paraffine puis coup s au microtome historange LKB en coupes fin
425. tion en deux temps se manifeste aussi pour A pisum et A gossypii m me si les degr s d intoxication ou les plages de seuil d intoxication ne sont pas les m mes Il pourrait tre li l existence de diff rents types de cibles physiologiques de la toxine Nous observons encore que la sensibilit diff rentielle des esp ces test es vis vis de la ConA n est pas li e leur appartenance un groupe taxonomique d fini de la famille des Aphidinae l esp ce la plus sensible A pisum et l esp ce la plus r sistante A solani appartiennent la m me tribu des Macrosiphini Ilharco et van Harten 1987 annexe 1A F Cependant ces esp ces peuvent tre ventuellement regroup es sur la base de leur sp cificit vis vis de leurs plantes h tes En effet les deux esp ces oligophages s alimentant uniquement sur Fabac es s av rent plus sensibles que les esp ces polyphages qui supportent mieux de tr s fortes doses de ConA L observation d une toxicit diff rentielle de la ConA suivant les esp ces aphidiennes cibl es soul ve le probl me de l existence de m canismes de r sistance aux fortes concentrations de toxine Nous avons vu dans le chapitre 1 que ce probl me est crucial prendre en compte dans la mise en oeuvre d une strat gie de cr ation de plantes transg niques r sistantes aux insectes Nous constatons n anmoins que la croissance est toujours affect e de mani re importante aux fortes concentrations de le
426. tives autour des prot ines Ainsi sous l influence d un champ lectrique il est possible de faire migrer et de s parer des prot ines dans un gel d acrylamide Nous avons utilis des gels 15 d acrylamide permettant une s paration optimale de prot ines ayant des PM compris entre 20 et 100 kDa 2 1 2 Pr paration des extraits de miellat Des jeunes adultes 5 x 20 sont laiss s pendant 72 h sur des milieux standards Ap2 simples ou contenant 100 ug ml de ConA ou 100 ug ml de peroxydase ou 100 ug ml de ConA et 100 ug ml de peroxydase Une tude ant rieure r alis e au laboratoire montre que la peroxydase est rejet e en quantit importante dans le miellat sans tre d grad e et en n tant pas ou tr s peu fix e dans le tube digestif r sultat non publi Cette prot ine est donc utilis e ici comme t moin de transit neutre La r colte et la d shydratation des miellats s effectuent l issue des trois jours fiche protocole N 16 Les extraits secs sont repris dans 20 ul de tampon d introduction 1 5 dithiotr itol 2 SDS Tris HCl 0 12M 0 0075 Bleu de Bromoph nol 2 1 3 Pr paration des extraits de tube digestif Quatre lots de vingt jeunes adultes sont intoxiqu s pendant 48 h avec de la ConA 200 400 ou 800 ug ml Les tubes digestifs sont pr lev s par dissection dans de l eau distill e fiche protocole N 8 et aussit t plong s dans 20 ul de tampon d introduction Les vingt tubes digestifs son
427. tration electrical penetration graph ou EPG La figure 27 d crit tr s sch matiquement le dispositif d enregistrement d ondes induites par des pucerons s alimentant sur milieu artificiel colle d argent lectrode ETS TS CUM As ESTAS IAI INTIS III II III DIDI IIa amplificateur Figure 27 Sch ma simplifi du circuit lectrique d enregistrement d un EPG sur milieu artificiel McLean et Kinsey 1967 avaient distingu 4 types d ondes diff rents sur les amplificateurs en courant alternatif mais l EPG bas e sur une analyse en courant continu est en fait bien plus r solutive Tjallingii distingue actuellement au moins huit types d ondes chacune tant caract ristique d une activit de p n tration pr cise dans les tissus d un v g tal contact des stylets avec l piderme ondes A salivations ondes B et E2p ponction dans les cellules du parenchyme ondes pd ingestion passive dans le phlo me E2w ingestion active dans le xyl me ondes G annexe 6 A partir de ces donn es nous avons interpr t les diff rentes phases d alimentation d A pisum sur milieu artificiel Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 98 2 4 2 Mode d acquisition du signal L acquisition du signal lectrique est r alis e gr ce la carte d acquisition MacADIOS SCSI convertisseur analogique num rique 12 bits GW Instruments Inc USA Les activit s de quatre pucerons sont enregi
428. tre premi res heures cons quence de l intoxication Il est donc possible que les larves sur milieux saccharose correspondent des insectes perturb s s y fixant provisoirement et non des larves refusant le mileu Ap2 La lecture du tableau des r sultats bruts donn es non montr es r v le d ailleurs que les 10 15 de larves fix es sur milieux saccharose pendant les quatre premi res heures correspondent des larves diff rentes d un relev l autre contrairement au nombre de larves fix es sur les milieux Ap2 qui est toujours constant ou croissant pour chaque r p tition les larves se fixent sur les milieux Ap2 et s y maintiennent Nous conclurons donc que les larves d A pisum dans le contexte exp rimental pr sent poss dent de faibles capacit s d association entre l intoxication par la ConA et la reconnaissance sensorielle 3 2 Mesure des volumes de milieux ing r s par des pucerons intoxiqu s par la Concanavaline A Cin tique de l intoxication 3 2 1 Mesure des volumes de milieux ing r s par des larves intoxiqu es L objectif de cette exp rience tait de d terminer si l intoxication des pucerons par la Concanavaline A se traduisait bien par une diminution des quantit s de milieux ing r es Un marqueur radioactif l inuline 4C est incorpor dans des milieux standards simples t moins contenant 200 ug ml de ConA Des larves g es de 24 26 h sont laiss es sur ces milieux pendant 2 16 h La
429. trement les milieux artificiels sur lesquels les pucerons vont tre test s sont coul s Quatre pucerons sont ensuite connect s au circuit Apr s quelques minutes les insectes qui refusent de se stabiliser dans la cage et de se fixer sont remplac s L acquisition d bute lorsque tous les pucerons semblent en position de piq re pattes cart es antennes immobiles En cours d acquisition le puceron qui ne pique pas pendant plus de 2 heures puceron ayant du mal se fixer est remplac situation ind pendante d une 63 La fr quence de 100 Hz est tr s g n ralement utilis e pour les tudes sur plantes Mais un fichier de 1h repr sente 700 Ko A 10 Hz un fichier de cette taille contient 10 h d informations 64 r f Degussa Demetron Courbevoie France 65 r f Degussa Demetron type L2027 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 99 ventuelle intoxication L acquisition est stopp e le lendemain lorsque pour les pucerons qui continuent de s alimenter l enregistrement a dur au moins 24 heures Quatre huit pucerons sont ainsi enregistr s par acquisition Au cours de deux exp riences ind pendantes vingt trente adultes sont test s successivement sur des milieux contenant de la Concanavaline A 400 ug ml et 600 ug ml A chaque acquisition deux pucerons sont d pos s sur des milieux standards deux autres sur des milieux lectines Le nombre exact d insectes test s est
430. trois lectines soient s rologiquement li es elles diff rent par le nombre de sous unit s par mol cule La GNA prot ine t tram rique s av re la plus toxique les effets de la NPA prot ine trim rique sont aussi tr s marqu s alors que l ASA prot ine dim rique manifeste une moins forte toxicit Nos r sultats tendraient confirmer l hypoth se selon laquelle leur efficacit serait corr l e au nombre de sous unit s les composant Cette hypoth se est avanc e par Powell et al 1995c qui constatent galement des effets diff rentiels de GNA NPA et ASA sur la cicadelle du riz N lugens Un article r cent montre cependant que les propri t s de reconnaissance osidique de la GNA et de la NPA sont l g rement diff rentes Kaku et Goldstein 1992 De fait il nous para t plus probable que les diff rences de toxicit observ es soient li es aux diff rences d affinit des lectines pour des oligosaccharides contenant du mannose Nous abordons plus compl tement cette question dans le chapitre 4 consacr au mode d action des lectines L intoxication aigu de M persicae nous r v le galement que les trois lectines mannose strict provoquent tr s faibles doses une stimulation significative de la croissance figure 13 A contrario la ConA la concentration de 15 ug ml induit une inhibition de croissance de 35 Il faut cependant rappeler la variabilit des r sultats observ s aux faibles doses avec la Co
431. tte m thode l antig ne doser est capt dans un premier temps par l anticorps sp cifique pr alablement immobilis sur un support anticorps primaire figure page suivante La quantit d antig ne complex est mesur e dans un deuxi me temps apr s sa r action avec un anticorps de m me sp cificit coupl une enzyme ou par un anticorps biotinyl anticorps secondaire Ce dosage suppose que l antig ne poss de plusieurs pitopes identiques ou non de fa on qu apr s sa r action avec l anticorps immobilis il puisse encore r agir avec l anticorps secondaire L activit enzymatique obtenue est proportionnelle la quantit d antig ne fix e par l anticorps primaire Utilisation du syst me biotine avidine la forte interaction entre la biotine et l avidine a t la base du d veloppement de nouveaux r actifs pouvant se substituer aux conjugu s anticorps enzymes La biotine est un hapt ne facilement couplable aux groupements amin s des prot ines et qui n alt re que peu ou pas les propri t s immunologiques ou enzymatiques de ces prot ines C est ainsi que des anticorps biotinyl s peuvent r agir avec l antig ne homologue et le complexe antig ne anticorps biotine form peut tre ensuite r v l par le proc d BRAB par exemple Bridged avidin biotin Ce proc d consiste utiliser l avidine comme pont entre l anticorps et l enzyme tous deux biotinyl s et permet donc une amplification par
432. tuation t moin en Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 170 comparaison avec ceux obtenus dans des conditions exp rimentales diff rentes toujours sur adultes de notre clone d A pisum lev sur milieu Ap2 et publi es par ailleurs dans un autre contexte Liadouze et al 1995 La fiabilit de cet outil souligne le degr assez important de l hom ostasie de l amino acid mie chez les pucerons munis de leur compl ment symbiotique id ibidum Nous discuterons tout d abord de l intoxication aigu par la ConA comparaison des t moins et des trois doses de ConA en commengant par l analyse des r sultats des miellats car l interpr tation de ce compartiment d excr tion est plus directe que celle de l quilibre global en acides amin s libres Nous pouvons cependant rappeler en introduction toute cette interpr tation les structures et fonctions hypoth tiques assign es la portion du m sent ron qui est la cible principale de la ConA i e l estomac et en particulier sa fraction m diane D apr s Ponsen 1972 et comme nous venons de le rappeler cette partie se caract rise par une activit cellulaire intense de s cr tion par un ph nom ne de constriction exfoliation avec abondance de granules basophiles par ailleurs parmi les aminopeptidases d tect es dans le tube digestif d A pisum il semble que celles qui soient les plus li es cette portion soient celles ayant une sp cificit pr f ren
433. u cycle pyranose B Structures des sucres reconnus par les lectines des cind principales classes N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 43 Aux trois premiers groupes de lectines qui viennent d tre cit s il faut rajouter aujourd hui les lectines N ac tylglucosamine comme les lectines du bl Triticum vulgare Vill ou de Datura stramonium L les lectines se liant l acide sialique telles les lectines de certains crustac s et des lectines aux sites de fixation complexes Le tableau 6 pr sente un r sum des sp cificit s osidiques des lectines test es au cours de notre tude Lectines et origines v g tales Lectines Man Gle Allium sativum Canavalia ensiformis Cicer arietinum Galanthus nivalis Lens culinaris Narcissus pseudonarcissus Pisum sativum Vicia faba Vicia villosa Lectines Gle GIcNAc Griffonia simplicifolia II Triticum vulgaris Ulex europaeus II Urtica dioica Lectines 4 GalNAc Amaranthus caudatus Arachis hypogaea Artocarpus integrifolia Bryonia dioica Cytisus scoparius Erythrina cristagalli Glycine max Phaseolus coccineus Phaseolus lunatus Phaseolus vulgaris Sambucus nigra Sophora japonica Trichosanthes kirilowii Tulipa sp Vicia villosa Lectines 4 L Fucose Ulex europaeus I Lectines autres ac sialique comp Maackia amurensis Robinia pseudacacia Abr viations ASA ConA CPA GNA LcH NPA PSA VFA VVAm GS II WGA UEA II UD
434. u inoculative caract re pizootique Biopesticide pour intervention curative ou inoculative caract re pizootique Biopesticide pour intervention curative ou inoculative caract re pizootique Souches exp rimentales Formules commerciales Mycotal Vertalec et exp rimentales Souches de laboratoire Europe Souches de laboratoire Europe M persicae et autres pucerons des serres M persicae et autres pucerons des serres Pucerons des serres T trifolii f maculata pucerons des serres pas de travaux faisant r f rences des Homopt res 1 6 9 1 9 1 9 3 6 9 Bacillus thuringiensis B endotoxine spores d endotoxines Biopesticide curatif r manent Formules exp rimentales ou marques commerciales L pidopt res Col opt res Dipt res pas de travaux faisant r f rences a des Homopt res Tableau 1 Exemples d antagonistes potentiellement utilisables pour lutter contre des pucerons les r f rences donn es correspondent des articles de synth se regroupant les travaux relatifs chaque couple antagoniste puceron 1 Cloutier amp Cloutier 1992 2 Stary 1989 3 Hughes 1989 4 Ramakers 1989 5 New 1989 6 Carver 1989 7 Nijveldt 1989 8 Chambers 1989 9 Latg et Papierok 1989 N Sauvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 23 Des repr sentants de deux taxons de
435. u puceron du pois Acyrthosiphon pisum La ConA ne s av re ici significativement toxique qu partir de la concentration 200 ug ml Ce r sultat peut sembler contradictoire avec nos conclusions ant rieures figure 10 IC20 3 ug ml mais nous avons d j soulign la variabilit des degr s d intoxication 93 ectine purifi e par Peumans et Van Damme Universit de Leuven Belgique 94 ectine provenant de chez Sigma Chapitre 4 Mode d action des lectines sur les pucerons 162 observ s avec cette lectine sur A pisum N anmoins les courbes de croissance de la Con A et de la GNA tr s faibles doses diff rent Nous pouvons conclure en effet que la GNA induit une stimulation de croissance significative des larves d A pisum aux concentrations comprises entre 5 et 50 ug ml Cette exp rience confirme donc clairement ce qui avait t observ avec M persicae savoir l existence d un effet probiotique i e stimulant sur le param tre croissance larvaire par la GNA et vraisemblablement pour toutes les lectines mannose strict contrairement ce qui est observ pour la Concanavaline A 3 3 2 Expression des concentrations de lectines test es en nombre de mol cule mole par ml Les figures 52A et B reprennent les r sultats des tests d intoxication aigu chapitre 2 en exprimant les concentrations en uM et non plus en ug ml pour comparer les interactions en nombre de mol cules et non plus en m
436. u radicicoles Bevan et al 1989 Liang et al 1989 Riggs et al 1989 Roby et al 1990 Yang et Russell 1990 Bhattacharyya et al 1993 Shi et al 1994 Wang et al 1994a Le contr le de l expression dans le temps par des promoteurs inductibles est l autre volet o la compr hension des m canismes g n tiques et mol culaires de d fense apportera de nouveaux outils la cr ation vari tale Liang et al 1989 Bajar et al 1991 Ward et al 1993 Marco et al 1994 nous avons vu pr c demment que le co t de la cr ation vari tale classique peut tre assez lev Celui de la cr ation d une plante transg nique l est d autant plus qu une fois sortie du laboratoire elle doit encore faire l objet de traitements ult rieurs dans le cadre d un programme d am lioration g n tique sur le principe classique des croisements et des s lections afin d valuer la transmissibilit du marqueur ins r et de l introduire dans un g notype lite Sciences 1993 G nie g n tique transg n se am lioration g n tique et valuation vari tale sont donc les quatre volets n cessaires l exploitation de la transg n se Ceci explique que la technologie d ensemble soit longue mettre en oeuvre et on reuse Les contraintes r glementaires joueront vraisemblablement un r le majeur dans l tablissement des co ts de production comme c est le cas dans la recherche d insecticides Sciences 1993 le succ
437. ubl e 400 ug ml La radioactivit totale des larves et de leur miellat est d termin e en suivant la m thode d taill e dans la fiche protocole N 15 Les quantit s moyennes de milieu ing r es par les pucerons dans chacune des configurations de l exp rience sont compar es par des tests param triques classiques ANOVA test de Bonferroni Dunn Pour les dur es courtes d ingestion 2 h 8 h les individus qui ont mu ne sont pas pris en compte dans l analyse Pour les dur es plus longues les individus qui manifestement ne se sont pas fix s relev s toutes les 4 h du fait d un stress li leur manipulation par exemple sont consid r s comme individus aberrants et supprim s de l analyse 62 Ce je ne permet d obtenir une meilleure fixation des larves Qui plus est apr s transfert elles sont laiss es dans l obscurit totale le temps de l exp rience Dans ces conditions les pucerons sont moins mobiles Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 96 2 4 Technique d lectrop n trographie ou EPG 2 4 1 Donn es g n rales L lectrop n trographie est une technique de plus en plus utilis e par les aphidologistes Elle permet de r pondre de nombreuses questions fondamentales sur le comportement d alimentation des insectes phlo mophages en g n ral pour revue Tjallingii 1988a De plus l EPG est un outil ad quat pour mettre en vidence dans certains cas les m
438. ue les larves intoxiqu es se fixent indiff remment sur les milieux Ap2 ou sur les milieux ConA jusqu au cinqui me relev au dela les larves se retrouvent fix es pr f rentiellement sur les milieux Ap2 5h p lt 5 Nous pouvons aussi signaler qu au dernier relev 8 h 25 96 des larves sont encore fix es sur les milieux ConA Ce test confirme que la lectine n est pas phagor pulsive et que les larves fix es sur les milieux ConA ne les d laissent que lorsqu elles sont trop intoxiqu es et non pas par le biais d une reconnaissance gustative par essence rapide de la ConA Cette interpr tation est corrobor e par le fait que les larves fortement intoxiqu es quittent plus vite les milieux ConA diff rence significative d s la cinqui me heure de ce test que les larves non intoxiqu es diff rence significative la huiti me heure figure 28C Les larves sont intoxiqu es mais elles ne reconnaissent pas la lectine La question suivante laquelle nous voulions r pondre tait de savoir si les pucerons taient capables de faire l association entre le go t de ce qu ils ing rent et son caract re toxique Un lot de larves est d pos sur des milieux standards Ap2 contenant 400 ug ml de ConA figure 30B alors qu un second lot est d pos sur des milieux Ap2 simples En vertu de nos observations pr c dentes les deux types de milieux ont le m me go t pour les pucerons Apr s une nuit les pucerons sur milieux ConA sont pert
439. ues PBG6 47 et PWG6 85 la l gende est expliqu e dans le texte l erreur standard est report e pour chaque point de la figure B les valeurs des param tres P1 P2 et P3 observ s ou donn s par le mod le sont pr sent es dans le tableau de la figure C erreurs standards entre parenth ses N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 719 t moins variable d en pondant en moyenne par jour pendant leur p riode reproductive plus de larves que les t moins variable Lv Dr Mais long terme les pucerons PWG6 85 sont moins performants car ils meurent plus rapidement que les t moins leur p riode reproductive est donc plus courte Les pucerons sur plantes PBG6 47 semblent plus affect s encore en terme de f condit ils pondent en moyenne moins de larves que les pucerons PWG6 85 variable Lv 22 larves 30 par rapport la modalit t moin Les lots de pucerons sur les deux lign es transg niques pr sentent donc des dynamiques de ponte l g rement diff rentes Cette remarque est visualis e par les valeurs moyennes de la variable Md et les ajustements de la figure 19C La diminution de la production larvaire sur les lign es transg niques s accompagne aussi d un d calage du pic de f condit Pour la lign e PBG6 47 ce d calage est de 1 6 jours alors qu il est le double pour la lign e PWG6 85 Ces d calages calcul s par les ajustements des donn es sont en ad quation avec les
440. ui sont explor es depuis cette prise de conscience les m thodes biologiques sont celles qui offrent le plus de solutions durables et en ad quation avec le respect de l environnement De fait la lutte int gr e y compris sa composante lutte biologique est une approche qui semble rallier de plus en plus de producteurs et de scientifiques pour revue Fraval 1993 La lutte int gr e se situe mi chemin entre la lutte chimique et la lutte biologique C est un compromis initi par une cole californienne Stern ef al 1959 en r ponse aux abus entrain s par une approche monolithique bas e uniquement sur l utilisation des pesticides La lutte int gr e n exclut pas le recours des pesticides chimiques elle en pr voit l usage bien maitris en l associant celui de toutes les techniques compatibles avec une saine gestion qui peuvent concourir une bonne protection des cultures tout en garantissant le respect des insectes auxiliaires et pollinisateurs Il n est plus question d liminer les ravageurs jusqu au 6 Encore cette liste ne d nombre telle que les cas de r sistance d crits dans la litt rature 7 PM Integrated Pest Management des anglo saxons Chapitre 1 Contexte de l tude 20 dernier mais d abaisser leurs effectifs de telle facon que les d g ts soient supportables La lutte int gr e d coule de fait de l emploi de moyens biologiques de lutte paragraphe suivant L utilisation des vari t s r
441. une modalit de chacun des tests de f condit sur milieux artificiels ou plantes transg niques sont calcul s par la m thode de Birch 1948 Le principe de ce calcul est d taill dans la fiche protocole N 12 La variance de chacun de ces rm globaux est estim e par la m thode du Jackknife fiche protocole N 13 Miller 1974 Efron 1982 Les rm de chaque individu d une population sont galement calcul s rm individuels Un test de Mann Whitney ou un test de Kruskal Wallis appliqu sur ces r individuels permet de comparer les r globaux de chacune des modalit s test es ces tests ne n cessitent pas que nous calculions la moyenne des rm individuels Dans les cas o nous comparons plus de deux modalit s et que l hypoth se d galit de leurs rm est rejet e la proc dure de Conover 1980 est appliqu e pour comparer deux a deux ces rm et d terminer ceux qui diff rent les uns des autres Les rm sont aussi estim s par la m thode simplifi e de Wyatt amp White 1977 qui donne r 0 738 In Md d avec d dur e moyenne en jours entre la naissance des pucerons et le moment o ils commencent pondre p riode pr reproductive et Md nombre moyen de larves pondues pendant une p riode de dur e gale d Cette m thode pr sente l avantage d tre moins contraignante en temps la dur e du test ne d passe pas 20 jours contre 30 40 pour le calcul par la m thode de Birch et surtout d tre moins
442. ur les milieux L intoxication se traduirait donc bien par une diminution des volumes ing r s et non par un arr t de la prise alimentaire Cette observation est discut e ult rieurement dans le paragraphe consacr l EPG sur milieux artificiels Des larves de deux autres lots sont fortement intoxiqu es ConA400 ug ml avant d tre transf r es sur milieux standards ou ConA 200 marqu s Dans le tableau 13 les valeurs correspondantes aux dur es d ingestion de deux et quatre heures sont donn es titre indicatif En r alit trois quatre larves uniquement sont fix es et sont prises en compte dans le calcul du volume moyen de milieu ing r alors que dans le test pr c dent la majorit des larves sont fix es d s la deuxi me heure Nous retiendrons simplement que les larves pr alablement intoxiqu es ont plus de mal se fixer rapidement sur les milieux marqu s Au relev de 8 h le pourcentage de larves fix es sur milieux standards est de 80 contre 60 sur milieux ConA non significatif p gt 5 Au relev de 16h toutes les larves de chaque modalit sont fix es Ce second test confirme que les pucerons ne semblent pas reconnaitre la lectine cette dose m me tr s intoxiqu s ils continuent d ing rer du milieu ConA 200 ug ml un taux analogue celui du milieu t moin p 67 96 Les effets de la forte intoxication initiale se manifestent donc encore au moins pendant 16 h au relev de 16 h les larv
443. ur les pucerons 193 Ueno M Ogawa H Matsumoto I et Seno N A novel mannose specific and sugar specifically aggregatable lectin from the bark of the japanese pagoda tree Sophora japonica J Biol Chem 1991 Vol 266 p 3146 3153 Usherwood P N R et Blagbrough I S Spider toxins affecting glutamate receptors polyamines in therapeutic neurochemistry Pharma ther 1991 Vol 52 p 245 268 Vaeck M Reynaerts A Hofte H Jansens S Debeuckeleer M Dean C Zabeau M Vanmontagu M et Leemans J Transgenic plants protected from insect attack Nature 1987 Vol 238 N 2 p 33 37 Van Damme E J M Allen A K et Peumans W J Isolation and characterization of a lectin with exclusive specificity towards mannose from snowdrop Galanthus nivalis bulbs FEBS Let 1987 Vol 215 N 1 p 140 144 Van Damme E J M Allen A K et Peumans W J Related mannose specific lectins from different species of the family Amaryllidaceae Physiol Plant 1988 Vol 73 p 52 57 Van Damme E J M Kaku H Perini F Goldstein I J Peeters B Yagi F Decock B et Peumans W J Biosynthesis primary structure and molecular cloning of snowdrop Galanthus nivalis L lectin Eur J Biochem 1991 Vol 202 p 23 30 Van Damme E J M Smeets K et Peumans W J Chap 4 The mannose binding monocot lectins and their genes in Lectins biomedical perspectives London Arpad Pusztai and Susan Bardocz Eds Ed Taylor
444. ur milieu Ap2 muent normalement au relev de 48 h en particulier toutes les larves ont mu une fois et 60 96 d entre elles ont mu deux fois vs 50 pour des larves non intoxiqu es Le taux d ingestion exprim en nl par heure des larves intoxiqu es par de la ConA 400 ug ml est d environ 3 nl h apr s 16 heures d intoxication tableau 14 2 me colonne Ce taux est sensiblement d croissant apr s 40 h 24 16 h d intoxication 2 8 nl h 40 h 2 20 nl h 48h 1 8 nl h 72 h Les effets toxiques de la lectine apr s 2 ou 3 jours de contact se traduisent aussi par un retard au niveau des mues 10 des larves laiss es 24 h sur milieux ConA marqu s ont mu contre 60 100 pour les autres modalit s aucune n a fait deux mues en 48 h tableau 14 4 me colonne 3 2 2 Mesures des volumes de milieux ing r s par des adultes intoxiqu s Pour des raisons pratiques l exp rience pr c dente n a pas t reconduite sur des adultes nous ne disposions pas de quantit s suffisantes d inuline marqu e N anmoins nous avons pu mesurer les quantit s de milieux ing r es en 48 h par des adultes moyennement tr s fortement intoxiqu s Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 110 3500 3000 5 9 2500 5 b 2000 2 1500 E 5 1000 g 500 0 T moin ConA200 ConA400 ConA800 Figure 33 Quantit s de milieu ing r es en 48 h par des
445. urb s8 signe de leur intoxication alors que les autres ne le sont pas Ils sont alors tous mis en condition de choix entre du milieu Ap2 et une solution de saccharose 10 Celle ci est moins riche du point de vue nutritif que le milieu standard mais elle est bien accept e par les larves Si les pucerons sont capables de faire l association entre leur perturbation et le milieu qu ils ing rent nous devrions constater qu ils choisissent pr f rentiellement la solution de saccharose du moins dans un premier temps 68 es larves sont tr s mobiles sur les milieux ConA contrairement aux larves sur milieux Ap2 qui sont toutes parfaitement fix es 69 En l absence de choix les taux de fixation des larves sur les milieux saccharose et sur les milieux Ap2 sont identiques pendant les 24 premi res heures apr s leur d p t Ce type de milieux tr s simple est par exemple utilis par les virologistes v g taux lors de leurs tests d acquisition virale N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 105 milieu standard EM conditionnement 15h standard Ap2 saccharose 10 10096 75 50 Fixation standard Ap2 saccharose 10 25 L fixation totale 096 milieu standard ConA 400 ug mr standard Ap2 re D Mad e nua conditionnement L B me 15h 100 100 15 75
446. us associ s des plantes transg niques exprimant dans leur s ve phlo mienne une lectine m me moyenne concentration 100 200 ug ml pourraient limiter la croissance des colonies de pucerons les envahissant une protection contre les attaques de virus pourrait tre effective tant l chelle de la plante qu l chelle d une culture Nous discuterons dans la conclusion finale de cette th se des possibilit s d interaction comp titive lectine virus circulants m me type de r cepteur au niveau de l pith lium intestinal Le fait que la lectine ne soit pas phagor pulsive pourrait conf rer la culture enti re une protection accrue contre le risque de propagation des maladies virales les pucerons ne d tectant pas la toxine resteront au niveau de la plante qu ils auront choisi et l expansion de la colonie sur les plantes voisines sera limit e Nous avons fait tat dans le chapitre 1 du probl me d apparition de r sistance aux transg nes Un tel danger n est pas carter avec les lectines mais un contournement comportemental de la toxicit induite par ces mol cules parait tr s peu probable compte tenu pr cis ment de leur mode d action sur le comportement des pucerons 72 Au cours des tests d intoxication long terme par exemple les adultes restent fix s sur quelques millim tres carr s de feuille de Parafilm pendant toute la dur e de l exp rience 20 25 jours Chapitre 4 Mode d
447. us de la nouvelle Sur la coupe A ce qui parait tre l ancienne lame basale se d tache partiellement de la nouvelle membrane apicale fl ches le mat riel cytoplasmique abondamment excr t est plus ou moins d sint gr et nous distinguons encore l ancienne bordure stri e La coupe B est une vue plus fort grossissement de la section situ e entre les deux fl ches sur la coupe A L ancienne membrane apicale est compl tement d tach e sur la coupe C La bordure stri e se d sint gre Par contre la surface apicale de la nouvelle cellule ne pr sente aucune modification Cette nouvelle cellule semble donc se mettre en place normalement avant d tre son tour la cible de la lectine Planche VI Observations au microscope lectronique transmission de l ultrastructure de la face apicale d une cellule m sent rique d une larve du puceron du pois Acyrthosiphon pisum intoxiqu e pendant 48 h sur un milieu contenant 400 ug ml de ConA a d collement partiel de la membrane apicale b grossissement sur la membrane apicale d coll e d collement total de la membrane apicale br bordure stri e 1 lumi re mb membrane basale mv microvillosit s chelle donn e sur chaque coupe N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 153 3 2 2 Analyse des acides amin s libres de pucerons entiers intoxiqu s avec de la ConA et de la GNA et de leurs miellats Nous avons
448. utres pucerons des serres M persicae et autres pucerons des serres M persicae et autres pucerons des serres M persicae et autres pucerons des serres M persicae A fabae A gossypii Aphis pomi Brachycaudus helichrysi M euphorbiae Phorodon humuli D G 1 G 5 6 D G a 5 D G D G D 2 7 Metasyrphus corollae syrphide exotique d Europe Episyrphus balteatus syrphide Neuropt res f Hemerobiidae f Chrysopidae Chrysopa carnea C septempunctata Lib ration inondative Lib ration inondative Elev e en laboratoire Europe Elev es en masse Europe de Est A gossypii et autres pucerons des serres Sitobion avenae A pomi B brassicae Aphis sambuci M persicae A pisum A gossypii M persicae M euphorbiae M rosae A gossypii Megoura viciae B brassicae Aphis nerii 1 8 8 5 D 6 Coelomyc tes Aschersonia aleyrodis pathog ne de cochenilles et pucerons Hyphomyc tes Fusarium lecanii large spectre souches sp cifiques de cochenilles pucerons et thrips Zygomyc tes Entomophtorales Conidiobolus obscurus pathog ne de pucerons Erynia neoaphidis pathog ne de pucerons Zoophtora radicans introduit en Isra l Mycose mortelle Lib ration de toxines Mycose mortelle Mycose mortelle Mycose mortelle Biopesticide pour intervention curative ou inoculative Biopesticide pour intervention curative o
449. uvion 1995 Mode d action des lectines sur les pucerons 35 L effort de criblage r alis sur l esp ce B thuringiensis ainsi que sur des esp ces voisines comme Bacillus sphaericus permettent d largir les spectres d h tes des endotoxines bact riennes nombreux L pidopteres Dipt res d int r t m dical certains Col opt res tableau 3 Certains ordres d insectes sont encore indemnes principalement faute de tests adapt s ou puissants de criblage Chez les Homopt res notre connaissance ces prot ines tr s haute toxicit mol culaire ne sont pas encore disponibles Des tentatives de criblage syst matique de polypeptides d origine fongique sont galement d crites et aboutissent par exemple l identification et plus r cemment au clonage d une cholest rol oxydase toxique pour un charangon Anthonomus grandis grandis Boheman Purcell et al 1993 Quant aux g nes d origine animale leur potentiel ne provient pas de criblage mais de tentatives isol es de valorisation de travaux toxicologiques plusieurs travaux mentionnent l utilisation de venins d arthropodes scorpion araign es ou acariens pr dateurs contenant des neurotoxines sp cifiques des insectes Habermann 1972 Krasnoperov et al 1990b Krasnoperov et al 1990a Piek 1990 Usherwood et Blagbrough 1991 Ces mentions ne concernent cependant qu exceptionnellement les plantes transg niques Pang ef al 1992 En fait si ces toxines ne
450. ux sp cificit s osidiques de ces deux lectines permettent de les distinguer 1 Brewer et ses collaborateurs ont montr que la ConA reconna t avec une haute affinit des structures glycanniques tri ou t tra antenn es ayant au moins deux mannoses en positions terminales non r ductrices Bhattacharyya et al 1987a Bhattacharyya et al 1987b Bhattacharyya et Brewer 1989 Mandal et Brewer 1992 Il est d ailleurs admis que la ConA comme la PSA recqui re des r sidus mannose en position terminale pour se fixer Kaku et Goldstein 1992 La ConA se lie par exemple fortement avec le trisaccharide N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 173 synth tique branch Man a1 3 Man a1 6 Man a OMe et pr cipite en sa pr sence Bhattacharyya et al 1987a Bhattacharyya et al 1987b L affinit est 42 fois plus forte pour ce trisaccharide que pour l a D Man p OMe ou amp D m thyl mannoside Brewer ef al 1985 La sp cificit osidique de la ConA pour ce sucre ci la distingue des lectines mannose strict En effet Kaku et Goldstein 1992 ont montr que les constantes d association de la GNA et de la NPA avec l a D Man p OMe sont tr s faibles 89 et 41 M respectivement alors que celle de la ConA est 160 500 fois plus forte 2 une seconde diff rence entre les deux lectines r side dans la capacit de la GNA pr cipiter en pr sence d un oligo mannoside lin aire Mans Man a 1 3 Man
451. valeurs estim es sont en particulier pour ConA GNA et NPA respectivement 774 628 et 848 ug ml 7 3 uM 12 5 uM et 23 uM sur la base des oligom res natifs Les IC20 sont estim es environ 10 N SAUVION 1995 Effet et mode d action des lectines sur les pucerons 65 141 182 et 478 ug ml pour ConA GNA NPA et ASA 0 1 uM 2 8 uM 4 9 uM 20 uM de prot ine native val UMS ai20044x Rao x i 2 gt ai LE M LI i IN us r T ns je M y C293 438 x 401532 a xj R mme dut cyrt ye 0 024 Log x 19272 gt ia EU we Comeeniretion en botine tug mit dew Logo dl Concentration en leetineg ig ant t dduk Lya ly Figure 14 Effets de deux lectines RSA MAA et deux inhibiteurs de prot ases CpTI WAI sur la croissance du puceron du p cher Myzus persicae voir le texte pour la signification des abr viations et les calculs d ajustement des donn es 3 1 2 Effets long terme de doses subl tales 3 1 2 1 Effets de concentrations subl tales de ConA sur la croissance et la f condit d A p sum Les pr c dents tests d intoxication aigu d montrent les propri t s aphidotoxiques de la Concanavaline A vis vis d A pisum Nous avons aussi observ les effets de cette lectine sur la f condit Des larves ont t intoxiqu es des doses induisant une faible mortalit doses subl tales pour permettre cette observation long terme d une dur e correspondante
452. ves de chaque lot ne montrent donc pas de tendance l agr gation Ce point tait important confirmer pour nous viter une mauvaise interpr tation des r sultats La figure 28B illustre la r action caract ristique des pucerons mis en pr sence d une substance phagor pulsive En moins d une heure les larves se fixent pr f rentiellement sur les milieux Ap2 p 6 3 96 Au bout de deux heures le rejet des milieux contenant l acide chlorog nique est encore plus manifeste p 0 5 96 Cette substance n est pas toxique pour les pucerons et on peut noter que le taux de fixation global est sensiblement identique celui du test pr c dent avec les deux milieux Ap2 Autrement dit certaines larves apr s avoir go t au milieu contenant l acide chlorog nique manifestent simplement un comportement de rejet imm diat choisissent le milieu t moin sans ambigu t et s y fixent long terme Quelques larves sont d nombr es lors des relev s sur les milieux acide chlorog nique il s agit soit de larves fix es insensibles ou moins sensibles aux effets de la substance r pulsive soit plus probablement de larves mobiles mais semblant fix es au moment du relev elles sont en nombre tr s r duit lt 3 96 en fin d exp rience tout comme les larves non fix es 0 96 Les r sultats obtenus avec la ConA sont tr s diff rents Sur milieux Ap2 le nombre de larves fix es n est significativement sup rieur que vers 8
453. x adultes de la lign e PWG6 85 qui arrivent en r alit compenser partiellement leur retard de maturit 1 8 jours de d calage avec les 55 Ils sont morts avant le jour J12 La dur e de J6 J12 correspond la dur e prise en compte pour le calcul de la variable Md L estimation des rm individuels et a fortiori des autres variables pour ces pucerons n est pas justifi e 56 Nous avons d j soulign pr c demment la pr pond rance des premiers jours de ponte dans le calcul des fm Modalit s T moin PBG6 47 PWG6 85 Prot ines exprim es GNA chitinase GNA N nombre de pucerons inclus dans l analyse ult rieure 36 25 22 Survie Dv dur e de vie moyenne 24 6 1 0 a 18 2 1 0 b 20 4 0 7 b mortalit Jog 76 96 42 96 50 96 Croissance d dur e de la p riode pr reproductive 7 1 0 1 a 8 4 0 1 8 9 0 2 c Effets F condit Dr dur e de la p riode reproductive 23 9 1 1 a 15 7 1 0 17 0 0 7 ab sur Lv nombre de larves pondues puceron 74 3 3 2 a 52 0 4 0 b 62 1 3 8 b les Lv Dv 3 08 0 09 2 84 0 18 3 03 0 16 adultes Lv Dr 3 18 0 09 a 331 018 ab 3 61 0 13 b Md nombre de larves pondues en une dur e 38 4 1 5 a 32 2 2 3 b 37 2 1 6 a gale ad DT dur e pour doubler la taille de la popu 1 81 2 24 2 30 lation Taux intrins que d accroissement naturel rg SDjack Birch 1948 Wyatt amp White 1977 0 382 0 005
454. x de fixation soient statistiquement discernables support en plexiglass ul trou par lequel les larves Y sont introduites n 6 EMI e Li milieu 20 ul Parafilm eppendorf coup Figure 23 Dispositif mis en place pour tester les larves de l esp ce A pisum en condition de choix entre deux milieux de compositions diff rentes Les tests sont effectu s avec 2 x 20 ou 24 milieux Les milieux d une m me composition sont dispos s en alternance Pour une cage nous notons lorsque nous d nombrons plus de la moiti des larves fix es sur le milieu t moin dans le cas contraire et en cas d galit La discrimination milieu t moin milieu test se fait par un test des signes la puissance de ce test est relativement faible mais la pr sence d un effet de groupe ne nous permet pas d utiliser l individu comme unit de r p tition ni m me un test des rangs sign s 59 Comportement d agr gation des larves ind pendant d une pr f rence mesur e pour un milieu Chapitre 3 Effets des lectines sur le comportement alimentaire des pucerons 94 2 3 Mesure du taux d ingestion des pucerons Le taux d ingestion des pucerons sur milieux artificiels autrement dit le volume de milieu en nl ing r par heure est calcul l aide d un marquage en 14C l inuline Le principe de cette m thode est d crit par Wright et al 1985 et a t
455. xiqu s 8 jours par la lectine sur milieux artificiels 75 Figure 19 Performances biologiques du puceron vert du p cher Myzus persicae sur deux lign es de pommes de terre transg niques PBG6 47 et PWGOHSS oraaa eee eu tee RU eret 78 Figure 20 Performances biologiques du puceron commun des serres Aulacorthum solani sur deux lign es de pommes de terre transg niques PBG6 47 et PWG6 85 eene 81 Figure 21 Performances biologiques du puceron commun des serres Aulacorthum solani sur trois lign es de pommes de terre transg niques GNA2 23 GNA2 28 et GNA21830 sss 84 Figure 22 Performances biologiques du puceron commun des serres Aulacorthum solani sur trois lign es de pommes de terre transg niques GNA2 23 PWG6 85 et WAI9 12 compl ment figure 21 85 Figure 23 Dispositif mis en place pour tester des larves de l esp ce Acyrthosiphon pisum en condition de choix entre deux milieux de compositions diff rentes 93 Figure 24 Dispositif mis en place pour mesurer individuellement les quantit s de milieux marqu s l inuline l4c ing r es par des pucerons larves ou adultes ss 94 Figure 25 Protocole pour mesurer les quantit s de milieu marqu ing r es par des larves de l esp ce Acyrthosiphon pisum pr alablement intoxiqu es ou non 95 Figure 26 Repr sentation sch matique d un puceron en position de recherche de nourriture sur une feuille

Effets et modes d`action de deux lectines à mannose sur le puceron

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