32524_serocp_iga_f_SeroCP IgA 32524_ver3.qxd
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1. SeroCP IgA MIFCp IgA Pos Neg Sp cificit Pos 1 1 0 Neg 34 1 33 33 34 x 100 97 1 Tableau 5 Sensibilit et sp cificit du test SeroCP IgA compar au test SeroFlA MIF Savyon L tude portait sur des patients adultes Sensibilit 23 25 x 100 92 SeroFlACp IgA SeroCP IgA Pos 25 23 Sp cificit 44 50 x 100 88 Total 75 6 Sensibilit et sp cificit du test Sero CP IgA compar au test MIF d un centre de r f rence Une tude a t r alis e dans un centre de r f rence pour les chlamydia La technique utilis e est une technique en MIF Les r sultats ainsi obtenus donnent n 176 patients une sensibilit de 90 33 une sp cificit de 83 33 Pr cision Intra essai pr cision du SeroCP IgA est montr e ci dessous Echantillon No de d termination Valeur CV en double moyennes Positif N gatif 10 0 172 4 1 Echantillon No de d termination Valeur CV en double moyennes res aie M193 01F 04 10 13 SAVYON DIAGNOSTICS Ltd 3 Habosem St Ashdod 77610 Israel Tel Kuo C C Jackson L A and Grayston J T 1995 Chlamydia pneumoniae TWAR Clin Microbiol REV 8 451 461 Saikku P Leinonen M Tenkanen L Linnanmaki E Ekman M R Manninen V Manttari M Frick M H and Huttunen J K 1992 Chronic Chlamydia pneumoniae infection as a risk fac2. O savyonpiacnostics LT SeroCP IgA REF B193 01M Test ELISA pour la detection des anticorps IgA anti Chlamydia 8c 2 fe pneumoniae dans le serum humain Pour usage professionnel uniquement CE 048 seroCP IgA Utilisation Le coffret SeroCPTM est destin la d tection des anticorps IgA sp cifiques de Chlamydia pneumoniae dans le s rum humain Le kit SeroCP IgA est un test immunoenzymatique utilisant un antig ne adsorb ELISA La trousse Savyon SeroCP IgA est utilis e comme aide dans le diagnostic d un infection C pneumoniae Pour usage diagnostique in vitro Generalites Chlamydia pneumoniae TWAR est l un des agents infectieux associ de nombreuses pathologies incluant des infections du syst me respiratoire des voix basses et hautes 1 Bien que C pneumoniae puisse provoquer de graves infections telles que des pharyngites des sinusites des bronchites aigu s et des pneumonies communautaires la majorit des infections sont b nignes asymptomatiques et donc d un diagnostic difficile Ces infections si elles ne sont pas d cel es ni trait es peuvent conduire des affections prolong es et persistantes Des tudes r centes montrent une association possible entre C pneumoniae et des infections chroniques 2 La pr valence des anticorps s riques de C pneumoniae chez les enfants d ge pr scolaire est faible et augmente jusqu 50 chez les adultes Cependant la
3. chronique Le test SeroCPTM mis au point par Savyon Diagnostics Ltd est un test ELISA utilisant des corps l mentaires d antig nes de C pneumoniae TWAR 183 ce qui permet un diagnostic plus pr cis des anticorps sp cifiques de C pneumoniae Pour le diagnostic complet d une infection pr sente chronique ou pass e il est recommand de d terminer les anticorps IgG IgM et IgA sp cifique de C pneumoniae Dans le cas d une r infection le niveau des anticorps IgA et IgG augmente rapidement le plus souvent d s la premi re ou la deuxi me semaine 8 Principe du Test Des plaques de micro titration SeroCPTM sont enduites de corps l mentaires purifi s d antig nes de C pneumoniae TWAR 183 Le s rum tester est dilu puis mis incuber dans les plaques pr enduites du test SeroCP Lors de cette tape Les anticorps sp cifiques de C pneumoniae de l chantillon de s rum vont se fixer aux antig nes immobilis s Les anticorps non sp cifiques sont limin s par lavage On introduit une IgA anti humaine conjugu e de la peroxydase de raifort HRP Durant cette tape le conjugu HRP va se fixer au complexe antig ne anticorps fix auparavant Le conjugu non li est limin par lavage L introduction de substrat de TMB provoque l hydrolyse du substrat par la peroxydase ce qui donne une solution bleue de substrat r duit On introduit la solution d arr t la couleur bleue vire au
4. jaune puis on la lit l aide d un lecteur ELISA une longueur d onde de 450nm L absorbance est proportionnelle la quantit d anticorps sp cifiques fix s aux antig nes de l enduit Schema de la proc dure du test SeroCP IgA Puits de plaque de micro titration aha d antig nes de C pneumoniae Introduction de 2 x 50ul de contr les n gatifs Introduction de 1 x 50ul de oe positif et de sp cimens dilu s Couvrir la plaque et laisser incuber 1h a 37 C dans 100 d humidit Laver 3 fois avec le tampon de lavage 300 350ul Introduire 50ul de ir HRP dilu a 1 300 Couvrir la plaque et laisser mane 1h a 37 C dans 100 d humidit Laver 3 fois avec le a de lavage 300 350pl Introduire oni substrat TMB Couvrir la plaque et laisser incuber ae 15 mn a temp rature ambiante Ajouter 100ul si solution d arr t Lire ea a 450nm Calculer et interpr ter les r sultats Composition des Reactifs Coffret de 96 tests R f rence SAV 193 096 1 Plaque de micro titration enduite d antigenes de C pneumoniae 96 puits s cables 8x12 enduits d antig nes de C pneumoniae plac s dans un sachet d aluminium contenant une carte de dess chant 1 plaque Tampon de lavage concentr 20x tampon PBS Tween 1 flacon 100 ml Diluant de s rum bleu solution tampon pr te l emploi Contient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon 30 ml Diluant de conjugu vert solution tampon pr te l emploi C
5. tapes de lavage S cher les plaques et le portoir en les tapotant doucement sur du papier absorbant 4 Incubation avec le conjugu 4 2 4 3 4 4 4 5 Peu avant de l utiliser diluer le concentr de conjugu HRP pour obtenir la solution voulue Diluer le concentr de conjugu HRP 1 300 avec le diluant de conjugu Par exemple pour deux barrettes pr parer un minimum de 3ml de conjugu HRP dilu m langer 10l de concentr de conjugu HRP a 3ml de diluant de conjugu Pipetter 50ul de conjugu dilu dans chaque puits Couvrir les plaques avec un couvercle pour plaques et mettre incuber durant 1 heure 37 C dans une chambre humide Jeter le liquide contenu dans les puits et laver comme d crit l tape 3 5 S cher les plaques et le portoir en les tapotant doucement sur du papier absorbant propre 5 Incubation avec du substrat TMB Note le substrat TMB est pr t l emploi 5 5 2 Pipetter 100uI de substrat TMB dans chaque puits Couvrir les plaques avec un couvercle pour plaques et mettre incuber durant 15 minutes temp rature ambiante Arr ter la r action en introduisant 100pl de solution d arr t 1M H SO dans chaque puits 6 D termination des r sultats Essuyer soigneusement le dessous de la plaque v rifier l absence de bulles d air dans les puits et lire 450nm dans les 30 minutes qui suivent l arr t de la r action ce Criteres d acceptabilite du test Le t
6. ance statistique significative au diagnostic s rologique de C pneumoniae Cependant il convient de prendre en compte d ventuelles r actions crois es avec les anti C trachomatis On ne peut tablir un diagnostic d finitif sur la base d une seule analyse s rologique Il convient de prendre en compte toutes les donn es cliniques et les r sultats de laboratoire Les chantillons pr lev s trop t t lors d une primo infection peuvent ne pas contenir d anticorps d celables Si l on soup onne une infection chlamydiae effectuer un deuxi me pr l vement 14 21 jours plus tard et proc der une nouvelle analyse 10 Performances Caracteristiques Tableau 3 Sensibilit du test SeroCP IgA pour des populations choisies compare a un test MIF du commerce L tude a t men e par un laboratoire de r f rence sur des patients atteints d affections respiratoires chez lesquels on soupconnait une infection C pneumoniae Population test e Nombre de s rums Patients positifs au 28 test PCR Enfants souffrant 26 de pneumonie Enfants avec titre d IgG 28 lev par test MIF Tableau 4 Sp cificit du test SeroCP IgA pour une population saine compar un test MIF du commerce L tude a t men e sur 35 chantillons de s rum provenant d enfants ne pr sentant pas d anticorps IgG sp cifiques ni de C pneumoniae ni de C trachomatis r sultat obtenu par test MIFCp et MIFCt
7. bouts jetables Tube volum trique de 1 litre Une fiole jaug e de 50ml Bouteille pour la solution de lavage Papier absorbant Agitateur vortex Bain Marie a 37 C ou une chambre humide plac e dans un incubateur a 37 C 10 Lecteur ELISA quip d un filtre 450nm 11 Eau distill e en bouteille Se tars DR Pr cautions D emploi a Diagnostique IN VITRO Ce kit contient des s rums humains qui ont t test s par des techniques approuv es par la FDA et CE lls ont t trouv s d pourvus d antig ne HBs d ac VIH 1 et 2 et anti HCV Comme aucune technique ne peux garantir l innocuit absolue des mat riels test s ceux ci doivent donc tre manipul s comme potentiellement infectieux selon les recommandations publi es dans le manuel S curit biologique dans les laboratoires de microbiologie et de biologie m dicale 1988 de CDC NIH National Institute of Health Institut National de la Sant am ricain 2 La solution de substrat TMB est une substance irritante pour la peau et les muqueuses Eviter tout contact direct 3 Lacide sulfrique dilu 1M H SO est un agent irritant pour les yeux et la peau En cas de contact avec les yeux laver imm diatement et abandamment avec de l eau et consulter un sp cialiste Ne jamais verser de l eau dans ce produit En cas d accident ou de malaise consulter imm diatement un m decin si possible lui montrer l etiquette 4 Tous les composants de
8. difficult d effectuer des pr l vements au niveau des sites infect s affecte les performances du d pistage direct de C pneumoniae Aussi la m thode utilis e en routine pour le diagnostic de C pneumoniae est la s rologie La s rologie est un outil non invasif pour le d pistage des infections chroniques C pneumoniae 3 pour lesquelles les m thodes de d pistage direct sont peu efficaces 4 Lors d une primo infection il se produit une r ponse rapide des anticorps IgM souvent en une ou deux semaines L apparition des isotypes IgG et IgA peut ne survenir que 6 a 8 semaines apr s Les anticorps IgM diminuent entre le 2 me et le 6 me mois apr s une infection aigu 5 Le taux des anticorps IgG augmente puis diminue lentement les anticorps IgA ont tendance dispara tre rapidement 6 En cas de r activation les anticorps IgM peuvent ne pas appara tre ou n appara tre qu un titre faible aussi l absence des anticorps IgM n exclue pas une infection en cours 7 Le taux des anticorps IgG et IgA augmente rapidement entre la premi re et la deuxi me semaine qui suit une r activation 3 La persistance de taux lev en IgA peut tre le signe d une infection chronique a C pneumoniae 6 2 Les anticorps IgG persistent longtemps et diminuent tr s lentement Leur pr sence indique un contact un moment ind termin avec le C pneumoniae Cependant des taux lev s peuvent indiquer une infection en cours ou
9. es IgM donne un r sultat n gatif et que les r sultats de l analyse des IgA reste identique valeur limite l chantillon doit tre consid r comme n gatif Os L interpr tation des r sultats en fonction de la combinaison des anticorps IgG IgA et IgM est pr sent e au Tableau 2 Tableau 2 Interpr tation des r sultats en fonction de la combinaison des anticorps IgG IgA et IgM Taux d anticorps sp cifiques aux chlamydiae IgG IgA IgM Interpr tation des r sultats N gatif N gatif N gatif N gatif ou au del du degr de sensibilit de ce test N gatif N gatif ou positif Positif Indication d une primo infection Positif Positif ou n gatif Positif Indication d une primo infection Positif N gatif N gatif Indication d une infection en cours ou pass e Positif ou limite Positif N gatif Indication d une infection en cours r cente ou chronique N gatif Positif N gatif ll est n cessaire de proc der d autres analyses l aide d une autre m thode s rologique L obtention de r sultats similaires pourrait alors indiquer une infection aigu ou en Cours Limite de la technique de Les plaques sont enduites de corps l mentaires intacts de C pneumoniae qui poss dent certains facteurs antig niques d terminants communs galement aux corps l mentaires de C trachomatis Une valuation diagnostique compl te de ce coffret r v l une tend
10. est peut tre valid d apr s les conditions suivantes Si ces conditions ne sont pas remplies le test doit tre refait 1 Contr le Positif La valeur d absorbance du contr le positif doit tre gt 0 8 450nm 2 Contr le N gatif La valeur d absorbance du contr le n gatif effectu en double doit tre ntre 0 1 lt NC lt 0 4 450nm Calcul de la valeur seuil COV et de l index COI La valeur seuil COV est calcul e selon la formule suivante COV NC x 2 NC Moyenne des absorbances du contr le n gatif pass en double exemplaire 450nm Pour normaliser les r sultats obtenus nous vous conseillons de rendre les r sultats en index COl en calculant tout simplement un ratio COI Absorbance de I chantillon 450nm D O COV Interpr tation des R sultats Tableau 1 Correlation entre l absorbance 450nm et la pr sence des anticorps IgA C pneumoniae Absorbance a 450nm R sultats D O lt COV N gatif Pas d anticorps IgA sp cifiques de C pneumoniae d celables COV lt D O lt COV x 1 1 Valeur limite Pr sence de faibles taux d anticorps IgA sp cifiques de C pneumoniae D O gt COV x 1 1 Positif Taux d celables d anticorps IgA sp cifiques de C pneumoniae 1 Note Il convient d effectuer une analyse des anticorps IgG et IgM ou d analyser un second chantillon de s rum pr lev 14 21 jours apr s le premier test Si l analyse des IgG et d
11. la trousse ont t test s par lot Ne pas m langer les composants de diff rents lots et ne pas utiliser d l ments provenant d autres fournisseurs Conservation et Stabilit des R actifs 1 Tous les composants de la trousse doivent tre conserv s entre 2 8 C Dans ces conditions les r actifs non ouverts sont stables jusqu la date de p remption Gx indiqu e sur l tiquette L exposition des composants munis de leur bouchon d origine ou sc ll s la temp rature ambiante durant quelques heures ne peut pas endommager les r actifs NE PAS CONGELER 2 Une fois le coffret ouvert les l ments se conservent pendant 90 jours 3 Le sachet d aluminium contenant les barrettes doit tre soigneusement referm sans oublier le sachet d shydratant 4 Diluer le tampon de lavage concentr au 1 20 dans l eau distill e Exemple pour une barrette pr parer 100ml de tampon de lavage 5ml de tampon de lavage concentr 95ml d eau distill e La solution reconstitu e est stable 21 jours 2 8 C Pr l vement des chantillons Recueillir les chantillons de s rum en respectant l asepsie Ne pas utiliser de s rums inactiv s par la chaleur ll est recommand de ne pas utiliser de s rums pr sentant une lip mie ou troubles Les particules et les pr cipit s contenus dans le s rum peuvent fausser les r sultats De tels chantillons doivent tre clarifi s par centrifugation ou filtrage avant analyse Co
12. nservation Les chantillons tester peuvent tre conserver 7 jours 2 8 C rajouter de de l azide de sodium 0 1 Si le dosage est pr vu dans un d lai plus long conserver les pr l vements 20 C Il est recommand de ne pas effectuer des d cong lations successives pour cela fractionner le s rum en plusieurs aliquots R alisation du test Manuelle Proc dure sur automate disponible sur demande 1 Amener tous les r actifs et les chantillons cliniques analyser temp rature ambiante Bien m langer le contr le positif le contr le n gatif et les chantillons avant usage 1 1 D terminer le nombre total d chantillons analyser Outre les chantillons inclure les r actifs suivants dans chaque analyse deux puits de contr le n gatif et un puits de contr le positif 1 2 Retirer la plaque de micro titration de son sachet d aluminium en coupant l extr mit du sachet pr s de la partie scell e Laisser le nombre de plaques voulues dans le portoir de 96 puits Conservation les plaques non utilis es doivent tre replac es dans le sachet d aluminium avec le dess chant puis sceller le sachet en roulant l extr mit ouverte et en collant un ruban adh sif sur toute la longueur de l ouverture Note la dur e de conservation des plaques une fois replac es dans un sachet scell est de 90 jours dater du jour de premi re ouverture 2 Diluer le tampon de lavage concentr 1 20 avec de l eau d
13. ontient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon 40 ml Contr le n gatif s rum humain n gatif en IgA sp cifiques de C pneumoniae pr t l emploi Contient moins de 0 05 de proclin et moins de 0 1 d azide de sodium comme conservateur 1 flacon 2 5 ml 6 Contr le positif s rum humain positif en IgA sp cifiques de C pneumoniae pr t l emploi Contient moins de 0 05 de proclin et moins de 0 1 d azide de sodium comme conservateur 1 flacon 2 0 ml 7 Conjugu HRP concentr 300x IgA anti humaine sp cifique de la cha ne alpha conjugu e la peroxydase de raifort HRP Contient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon 0 2 ml 8 Substrat TMB solution pr te l emploi Contient de la 3 3 5 5 t tram thylbenzidine comme chromog ne et du peroxyde comme substrat 1 flacon 14 ml 9 Solution d arr t solution pr te l emploi Contient de l acide sulfurique dilu 1M H SO 1 flacon 15 ml 10 Couvercle de plaque 1 11 Manuel d instructions 1 Coffret de 192 tests R f rence SAV 193 192 1 Plaque de micro titration enduite d antig nes de C pneumoniae 96 puits s cables 8 x 12 enduits d antig nes de C pneumoniae plac s dans un sachet d aluminium contenant une carte de dess chant 2 plaques 2 Tampon de lavage concentr 20 x tampon PBS Tween 2 flacons de 100 ml chacun 3 Diluant de s rum bleu solution tampon pr te l emploi Con
14. oublement d sionis e ou de l eau distill e Par exemple pour pr parer un litre de tampon de 72 lavage ajouter 50ml de tampon de lavage concentr a 950m d eau doublement d sionis e ou d eau distill e Conservation une fois dilu e la solution peut tre conserv e une temp rature comprise entre 2 et 8 C durant 21 jours maximum Note lors d une conservation au froid des cristaux peuvent se former dans le tampon de lavage concentr 20x Il s agit d un ph nom ne parfaitement normal Faire dissoudre ces cristaux en ramenant le tampon 37 C avant de le diluer 3 Incubation des chantillons de s rums et des contr les 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 Diluer chaque s rum analyser 1 105 avec le diluant de s rum fourni comme suit introduire 10ul de s rum 200pl de diluant de s rum 1 21 puis continuer la dilution en ajoutant 25ul de dilution 1 21 100ul de diluant de s rum Pipetter 50ul de contr le positif pr t l emploi de contr le n gatif pr t a l emploi et de s rum dilu au 1 105 dans des puits s par s Le contr le n gatif doit tre pipett dans deux puits s par s Couvrir les plaques avec un couvercle pour plaque et mettre incuber durant 1h 37 C dans une chambre humide Jeter le liquide contenu dans les puits tapes de lavage remplir ras bord chaque puit avec du liquide de lavage 300 3501 puis liminer ce liquide R p ter encore deux fois pour un total de trois
15. s s a European Authorized Representative e mail support savyondiagnostics com Boulevard G n ral Wahis 53 1030 Brussels Belgium 972 8 8562920 Fax 972 8 8523176 O mama on 1822 752 00 08
16. tient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon de 60 ml 4 Diluant de conjugu vert solution tampon pr te l emploi Contient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon de 80 ml 5 Contr le n gatif s rum humain n gatif en IgA sp cifiques de C pneumoniae pr t l emploi Contient moins de 0 05 de proclin et moins de 0 1 d azide de sodium comme conservateur 1 flacon de 2 4 ml 6 Contr le positif s rum humain positif en IgA sp cifiques de C pneumoniae pr t l emploi Contient moins de 0 05 de proclin et moins de 0 1 d azide de sodium comme conservateur 1 flacon de 1 25 ml 7 Conjugu HRP concentr 300x IgA anti humaine sp cifique de la cha ne alpha conjugu e la peroxydase de raifort HRP Contient moins de 0 05 de proclin comme conservateur 1 flacon 0 2 ml 8 Substrat TMB solution pr te l emploi Contient de la 3 3 5 5 t tram thylbenzidine comme chromog ne et du peroxyde comme substrat 1 flacon 24 ml 9 Solution d arr t solution pr te l emploi Contient de l acide sulfurique dilu 1M H SO 1 flacon 30 ml 10 Couvercle de plaque 2 11 Manuel d instructions 1 Mat riel n cessaire mais non fourni Tubes a essais et portoirs pour pr parer les dilutions des s rums de patients Flacon en plastique pour la dilution du HRP conjugue anti humaine IgA Micropipettes ou pipettes multi canaux 5 50 50 200 et 200 1000 avec em
17. tor for coronary heart disease in the Helsinki heart study Ann Intern Med 116 273 278 Puolakkainen M Saikku P Leinonen M Nurminen M Vaananen P and Makela P H 1984 Chlamydia pnemonitis and its serodiagnosis in infants J Infect Dis 149 598 604 Campbell L A 1993 PCR detection of Chlamydia pneumoniae In Diagnostic Molecular Microbiology Principles and Applications Persing D H Smith T F Tenover F C and White T J Eds ASM Press pp 247 252 Henry Suchet J Askienazy Elbhar M Thibon M Revol C and Akue B A 1994 Post therapeutic evolution of serum chlamydia antibody titers in women with acute salpingitis and tubal infertility Fertility and Sterility 62 No 3 Saikku P Matila K Nieminen M S Huttunen J K Leinon M Eckman M R Makela P H and Valtonen V 1988 Serological Evidence of an Association of a Novel Chlamydia TWAR with Chronic Coronary Heart Disease and Acute Myocardial Infarction Lancet 2 983 986 Grayston J T Cambell L A Mordhorst C H Saikku P Thom D and Wang S P 1989 A New Respiratory Pathogen Chlamydia pneumoniae Strain TWAR J Inf Dis 161 618 625 Saikku P Leinonen M Tenkanen L Linnanmaki E Ekman M R Mannin V Manttari M Frick M H and Huttunen J K 1992 Chronic Chlamydia pneumoniae Infections as a Risk Factor for Coronary Heart Disease in the Helsinki Heart Study Ann of Int Med 116 273 278 e Obeli
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