Produire de grandes quantités de cellules : guide de
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1. l am lioration des rendements cellulaires par rapport aux flacons des 175 cm 2 m me encombrement permet d augmenter la productivit tout en simplifiant les manipulations necessite bien moins d espace en incubateur qu avec les rollers les flacons les bo tes et les chambres CellSTACK avec le Inconv nients Chaque Corning HYPERFlask Vessels n cessite 565 mL de milieu volume difficilement pipetable seulement 4 des 10 couches peuvent tre observ ee directement par microscopie E Cube System Corning Le syst me E Cube est un bior acteur a perfusion de petite dimension 25 4 cm x 35 6 cm qui utilise en parall le le module brevet 10 Stack CellCube Corning repr sentant une surface de culture de 8500 cm 2 Les modules CellCube pr sentent une surface de culture en polystyrene trait e pour la fixation des cellules et sont continuellement perfus s avec du milieu pour une productivit accrue de cellules Corning a d velopp le module CellCube comme une chambre de croissance parall le qui est integr e dans un syst me de bior acteur pour la culture de masse Le syst me est id al pour produire de grandes quantit s de cellules ou des prot ines recombinantes des vaccins et des vecteurs viraux pour la th rapie g nique Kotani et al 1994 Contrairement aux bior acteurs fibres creuses les cellules peuvent tre directement r colt es partir des syst mes E Cube Le syst me E Cube compren2. 09 cellules Figure 3 risques accrus de d versements accidentels du milieu et de contaminations Tableau 2 rendements cellulaires et volumes de milieu recommand s avec les boites Corning Plats Corning Zone de rendement cellulaire Volume moyen croissance moyen 35 mm 8 cm 8 0x105 1 6 2 4 mL 60 mm 21 cm 2 1x106 4 2 6 3 mL 100 mm 55 cm 5 5 x 106 10a15 mL 150 mm 148 cm 1 48 x 107 30 45 mL 245 mm carr 500 cm 5 0 x 10 7 100 150 mL En supposant un rendement moyen de 1x10 cellules cm partir de 100 culture confluente Flacons Roller Le concept de culture cellulaire en rotation a t d velopp par George Gey 1933 la Johns Hopkins University comme un moyen pour produire de plus grandes quantit s de cellules adh rentes Les premiers travaux ont t r alis s avec des tubes de verre la fin des ann es 1950 les rollers en verre taient couramment utilis s pour cultiver de grandes quantit s de cellules en particulier pour la production de vaccins viraux Whittle et Kruse 1973 Mather 1998b Corning propose des rollers en polystyrene de quatre tailles de 490 cm 2 1750 cm en surface de croissance figure 5 et tableau 3 Ces rollers sont disponibles soit avec la surface de culture standard ou la surface CellBIND Corning Surface pour am liorer l adh rence cellulaire Corning propose galement des rollers r utilisables en verre PYREX pour ses caract ristiques de clart o
3. 125 mL Spinner Flask 1 25 x 108 100 to 125 mL 250 mL Spinner Flaskt 2 5 x 10 125 to 250 mL 500 mL Spinner Flask __ 50x10 __ 250 vo 500 mL 1L Spinner Flask 1 0 x 10 0 5 to IL 3L Spinner Flask 3 0 x 10 1 5 to 3L 6L Spinner Flask 6 0 x 10 3 0 to 6 0L 15L Spinner Flaskt 1 5 x 1019 7 5 to 15L 36L Spinner Flask 3 6 x 10 18 to 36L En supposant un rendement moyen de 1x10 cellules cm2 partir de 100 culture confluente Figure 10 Spinners en verre r utilisables Figure11 Spinners en polystyr ne usage unique Erlenmeyers avec agitation En 1954 W R Earle utilisait des Erlenmeyers pour cultiver des cellules L929 en suspension Aujourd hui ils sont largement utilis s sur des agitateurs plateaux pour faire cro tre des bact ries des champignons et des cellules v g tales ou animales en suspension Ils sont particuli rement utiles pour la culture de lign es de cellules d insectes qui n cessitent une forte oxyg nation Corning propose des Erlenmeyers en plastique jetables ou en verre r utilisables dans une vari t de tailles 50 mL 6l et de formes figures 12 13 et le tableau 6 Les flacons en plastique Erlenmeyer sont disponibles avec des d flecteurspour am liorer le m lange et des bouchons ventil s pour accro tre les changes gazeux Avantages conomique et compact chantillonnge et r colte facilites optimisation des changes gazeux par rapport aux flacons spinner demandent
4. 850 6360 1720 8500 NA NA Volume de travail 45 68 100 150 170 255 1300 1900 560 565 1700 2550 500 1000 500 1000 Avantages Simple utiliser et r colter Simple utiliser et r colter moins d encombrement en incubateur Simple utiliser et r colter conomique charge de travail r duite scale up facile moins d encombrement en incubateur Tr s compact moins d encombrement en incubateur rendement 10x plus lev qu en flacon de 175 cm avec le m me encombrement rendements plus lev s charge de travail r duite Scale up facile conomique et compact tr s simple d utilisation chantillonnage et la r colte facilit Scale up facile tr s simple d utilisation chantillonnage et la r colte facilit charge de travail r duite D savantages charge de travail encombrement charge de travail risques de renversement et de contamination charge de travail encombrement equipement sp cifique observation des cellules difficile manipulation des liquides observation des cellules difficile limit e aux 4 premi re couches manipulation des liquides requiert une expertise sp cifique observation des cellules impossible quipement sp cifique pompe ne fonctionne que sur les cellules en suspension nettoyage et autoclavage n cessaire n cessite un agitateu
5. CellSTACK 1 dans les m me conditions Tableau 4 rendements cellulaires et volumes de milieu recommand es avec les CellISTACK Culture Chambers Corning Corning Vessel Growth area Average cell yield Media volume 1 Stack 636 cm 6 36 x 107 130 to 190 mL 2 Stack 1 272 cm 1 27 x 108 260 to 380 mL 5 Stack 3 180 cm 3 18 x 10 650 to 900 mL 10 Stack 6 360 cm 6 36 x 108 1 300 to 1 900 mL 40 Stack 25 440 cm 2 54 x 10 5 200 to 7 200 mL En supposant un rendement moyen de 1x1 0 cellules cm partir de 100 culture confluente Corning HYPERFlask Vessels Les Corning HYPERFlask Vessels utilisent un film de polystyrene permeable au gaz pour permettre les changes gazeux entre les cellules le milieu de culture et l environnement atmosph rique Cela permet d obtenir une surface de croissance des cellules plus grande que dans les flacons traditionnels 175 cm 2 avec le m me encombrement Les Corning HYPERFlask vessels sont con ues pour tre enti rement remplis et ferm s avec un bouchon standard II n est pas n cessaire d utiliser un bouchon d gazage en raison de l change de gaz travers la couche ultra mince Chaque Corning HYPERFlask vessel pr sente une surface de culture totale de 1720 cm 2 soit 10 fois la surface d un flacon 1175 standard Avantages Les dix films interconnect s en polystyr ne permettent l change de gaz directement dans le milieu aucun mat riel suppl mentaire requis
6. et ses coll gues ont mis au point le flacon spinner en verre tel qu on le connait aujourd hui et en 1958 ils ont r alis sur ce mod le des fermenteurs de 20 litres Pour les lign es qui peuvent tre cultiv es en suspension les spinners offrent un moyen simple et tr s conomique pour produire un grand nombre de cellules De nombreuses lign es de cellules adapt es peuvent atteindre des densit s de 1 2x10 cellules mL ou plus dans ces flacons Mather 1998b lyer et al 1999 Corning propose des spinners de 125 mL 36 en verre r utilisables avec des syst mes d ouverture vari s Figure 10 et tableau 5 Des spinners a usage unique en polystyrene sont galement disponibles en 125 mL 500 mL 1L et 3L Figure 11 Ces flacons spinner jetables sont pr ts a l emploi et ne n cessitent aucun nettoyage assemblage et st rilisation Avantages conomique et compact les cellules se r coltent facilement manipulation ais e par rapport aux autres syst mes scale up possible Inconvenients Uniquement pour les cellules en suspension difficile de nourrir les cultures __ xige l utilisation d un agitateur magn tique qui occupe plus d espace en incubateur charge de travail significative pour d contaminer nettoyer et st riliser les spinners en verre Tableau 5 Rendemenis cellulaires et volumes de milieu recommand s avec les spinners Corning Corning Spinner Flasks Average Cell Yield Working Volume
7. moins de manipulation scale up jusqu 1L de milieu en un flacon de 3L Inconv nients syst me r serv aux cellules en suspension _ n cessite des agitateurs Figure13 Flacon Fernbach de 3L en plastique Corning Tableau 6 Rendements cellulaires et volumes de milieu recommand s avec les Erlenmeyers Corning Flacons Shaker Corning Rendement moyen des Volume de travail cellules mLErlenmeyer 50 mL 2 0x107 15a20 mL Erlenmeyer 125 mLmL 5 0 x 10 7 37 5 50 mL Erlenmeyer 50 mL 1 0x108 75 100 mL Erlenmeyer 500 mLmL 2 0x 108 150 a 200 mL Erlenmeyer 1L 4 0 x 10 8 300 400 mL Erlenmeyer 2L 8 0 x 10 8 600 800 mL Flacon Fernbach 3L 1 2x 109 1 0 1 2L Erlenmeyer 4L f 1 6x109 1 2 1 6L Erlenmeyer 6L t 2 4x 109 2 0a2 4L En supposant un rendement moyen de 1 x 10 6 cellules mL d une culture utilis e au volume de travail maximal t Uniquement disponible en verre S lection du meilleur syst me La d marche de s lection du syst me le mieux adapt vos besoins n cessite de r pondre de mani re approfondie ces 5 questions adh sion cellulaire ou cuture en suspension rendements d sir s en cellules ou en produits cellulaires besoins en mat riel et en espace charge de travail requise investissements n cessaires et niveau d expertise Une fois que chacun de ces cinq domaines aura t soigneusement valu et compris le choix du syst me qui r pond le mieux vos b
8. 00 150 mL Flacon Roller 850 cm 8 5 x 10 170 a 255 mL Flacon Roller 1700 cm 1 7x 108 340 a 510 mL Flcon Roller 1750 cm 1 75x108 350 525 mL En supposant un rendement moyen de 1x10 cellules cm2 partir de 100 culture confluente Chambres de culture CellSTACK Corning Les chambres de culture CellS TACK Corning sont des chambres multi couches qui assurent une surface de culture largie et une diminution de la charge de travail adapt es la production de grandes quantit s de cellules adh rentes figure 6 Les chambres CellSTACK sont disponibles en quatre tailles qui conviennent a une utilisation dans un laboratoire de recherche La couche unique 1 STACK avec 636 cm2 de surface de croissance cellulaire 2 STACK avec 1 272 cm2 de surface de culture 5 STACK avec 3 180 cm2 de surface de culture et les 10 STACK avec 6 360 cm 2 de surface de culture tableau 4 Il existe galement la chambre de culture CellSTACK 40 avec une surface de culture de 25 440 cm2 qui peut facilement produire plus de 2 5x1 0 cellules Toutefois en raison de sa grande taille elle n cessite un quipement sp cial et n est pas recommand e pour une utilisation en laboratoire de recherche Les chambres de culture CellSTACK sont disponibles soit avec la surface de culture standard ou la surface CellBIND Corning pour am liorer l adh rence cellulaire Les chambres CellSTACK sont munies de deux ouvertures de 26 mm de diam tre qui permettent un
9. 225 Figure 4 Bo te de culture carr e 245mm Bo tes de culture Les bo tes de culture circulaires en verre ont t mises au point par Richard Petri en 1877 quand il tait assistant au laboratoire de microbiologie de Robert Koch La simple bo te de P tri en verre a t largement utilis e dans les premiers temps de la culture cellulaire comme un contenant st rile pour la conservation de cultures en attente Les bo tes de Petri en polystyr ne dont la surface est trait e pour la culture cellulaire sont disponibles depuis les ann es 1960 Corning propose des bo tes circulaires en quatre tailles de 35 mm 150 mm de diam tre tableau 2 La plus grosse boite de150 mm de diam tre pr sente une surface de culture d environ 148 cm Toutefois pour la production de plus grandes quantit s de cellules Corning propose la bo te carr e de 245 mm de c t qui pr sente une surface de culture largie de 500 cm Figure 4 Avantages des bo tes de culture une alternative conomiques aux flacons acces direct la surface cellulaire ce qui facilite la r colte en particulier par grattage moins encombrantes que les flacons en incubateur la croissance cellulaire peut tre rapidement d termin e avec un microscope Aucun mat riel suppl mentaire requis Inconv nients grand nombre de bo tes manipuler pour produire des grosses quantit s de cellules il faut une surface totale en bo te de 20 500 cm pour obtenir 1x1
10. Flacons Shaker 3L Basique 1 48 1000 Faible Flacons Spinner 1L Basique 1 124 1000 Faible Syst me ECube Elev 1 296 3000 Faible Donn es bas es sur l hypoth se de 1x10 cellules cm2 obtenues en culture adh rente et 1x10 cellules mL en suspension Les rendements des cellules r els peuvent tre significativement plus lev s que cela en fonction de la lign e cellulaire et des conditions de culture Pour les productions de produits cellulaies des mises au point pr liminaires sont n cessaires pour d terminer les rendements des produits dans les conditions de culture Obtenir des quantit s de prot ines de 10 mg Lest courant cependant comme avec les rendements en cellules l optimisation peut donner des rendements beaucoup plus lev s Wurm 2004 Sur la base de ces rendements il est alors possible de calculer le nombre total de cellules n cessaires De plus grandes quantit s de cellules peuvent tre produites soit en augmentant le nombre de flacons ou en multipliant le nombre de lots de production Pour des laboratoires de recherche la production de plusieurs lots peut tre plus facile et plus pratique long terme Prendre le temps d optimiser les milieux et les conditions de culture peut galement augmenter de mani re significative les rendements en cellules et en produits en particulier pour les cultures en Suspension valuer l quipement et l espace n cessaire Il convient ensuite de d termin
11. Gene Therapy Human Gene Therapy 5 19 29 9 Lincoln C K and Gabridge M G 1998 Cell Culture Contamination Sources Consequences Prevention and Elimination In Animal Cell Culture Methods edited by J P Mather and D Barnes Methods in Cell Biology Vol 57 Ch 4 p 49 65 Academic Press San Diego CA 10 Mather J P 1998a Making Informed Choices Medium Serum and Serum Free Medium In Animal Cell Culture Methods edited by J P Mather and D Barnes Methods in Cell Biology Vol 57 Ch 2 p 19 30 Academic Press San Diego CA 11 Mather J P 1998b Laboratory Scaleup of Cell Cultures 0 5 50 Liters In Animal Cell Culture Methods edited by J P Mather and D Barnes Methods in Cell Biology Vol 57 Ch 12 p 219 227 Academic Press San Diego CA 12 McLimans W F 1979 Mass Culture of Mammalian Cells In Cell Culture edited by W B Jakoby and I H Pastan Methods in Enzymology Vol 58 Ch 16 p 194 211 Academic Press New York NY Corning CellBIND CelISTACK CellCube and PYREX are registered trademarks of Corning Incorporated Corning NY E Cube and HYPERFlask are trademarks of Corning Incorporated Corning NY All other trademarks in this document are the property of their respective owners Corning Incorporated One Riverfront Plaza Corning NY 14831 0001 2008 Corning Incorporated Printed in USA 3 08 65 PW CLS AN 064 REV1 For additional product or technical information please visit www c
12. Produire de grandes quantit s de cellules guide de scale up des cultures cellulaires en faible volume 1 re Partie CORNING John A Ryan Ph D Corning Incorporated Life Sciences 900 Chelmsford St Lowell MA 01851 Table des matieres Introduction 1 0 1 Choix du syst me 2 Selection du meilleur syst me 13 R f rences 17 Introduction Besoin de plus de cellules les chercheurs en sciences de la vie sont constamment mis au d fi de produire plus de cellules pour les essais cellulaires ou pour la production de prot ines recombinantes d anticorps et de vecteurs viraux Les chercheurs peuvent choisir parmi une grande vari t de flaconage et de r cipents pour la culture cellulaire de syst mes et de m thodes pour r pondre leurs besoins Ce guide Corning est con u pour aider les chercheurs s lectionner les syst mes et les m thodes les mieux adapt s leurs objectifs pour produire de grandes quantit s de cellules ou de produits cellulaires Il se concentrera sur les syst mes de base adapt s la production d au moins 1x10 9 cellules environ un gramme Ce guide n est pas con u pour les chercheurs qui ont besoin de produire des quantit s beaucoup plus importantes de cellules ou pour la production visant des applications cliniques ou industrielles bien que la plupart des informations pr
13. acc s direct au fond de la chambre et offrent une plus grande flexibilit pour la manipulation aseptique des milieux dans les chambres Il existe en option des bouchons et tubes de remplissage pour le transfert aseptique direct des milieux avec pompe p ristaltique ou par gravit qui sont recommand s pour les grandes chambres CellSTACK figure 7 Pour aider les chercheurs peu familiers avec la manipulation des chambres de culture CellSTACK Corning propose un guide technique en vid o disponible sur www corning com Lifesciences Avantages des CellSTACK moins de manipulation pour produire des cellules en grande quantit seulement 2 CellSTACK 10 sont n cessaires pour obtenir 1x109 cellules scale up facilit en ajoutant simplement plusieurs couches ou plusieurs chambres gain de place en incubateur aucun mat riel suppl mentaire requis Figure 7 bouchons optionnels de remplissage pour le transfert aseptique direct des milieux Inconv nients Les grandes chambres CellSTACK sont lourdes apr s remplissage et plus difficiles manipuler Les volumes important de milieu utilis s dans les grandes chambres CellSTACK rendent la manipulation moins ais e que pour les flacons ou les boites le pipetage n est pas possible La v rification de la croissance des cellules par microscopie est impossible en CellSTACK 10 en raison de leur hauteur Cependant une culture t moin peut tre r alis e en parral le en
14. d un oxyg nateur un r servoir interm diaire les ports d acc s avec tous les tubes et les raccords n cessaires ainsi qu un module 10 Stack CellCube usage unique Le syst me n cessite une pompe p ristaltique Figure 9 et il s int gre dans la plupart des incubateurs CO 5 Le volume de milieu recommand avec un module 10 Stack CellCube est de 1700 2550 mL de milieu Figure 9 Syst me E Cube Corning Pour aider les chercheurs peu familiers avec l E Cube Corning fournit un manuel d instructions sur www corning com lifesciences qui montre l installation et l utilisation de ce produit Avantages N cessite moins de manipulation que les cultures en bo tes flacons ou roller pour produire de grandes quantit s de cellules un seul module 10 Stack CellCube permet de cultiver environ 1x109 cellules rendements cellulaires accrus en raison de perfusionde milieu en continu scale up rapide par un passage possible sur des modules 25 Stack CellCube comportant 21250 cm de surface de croissance necessite moins d espace en incubateur Inconv nients pas d observation directe des cellules en microscopie n cessite une expertise sp cifique investissement n cessaire en mat riel au d part n cessite un pompe p ristaltique Flacons Spinner En 1956 W Cherry et R N Hull ont utilis un agitateur magn tique suspendu pour cultiver des cellules en suspension dans des flacons fond rond En 1957 McLimans
15. er la capacit en espace d incubation et la disponibilit du mat riel n cessaire au laboratoire Certains syst mes de culture tels que les spinners sont beaucoup plus compacts que d autres Pensez la possibilit d emprunter de l espace en incubateur d autres laboratoires en particulier si des pi ces d incubation sont disponibles proximit Certains syst mes de culture fonctionnent avec des quipements sp cifiques comme les pompes agitateurs classiques ou plateaux Consid rez ici les budgets en quipment pr voir valuer les besoins en charge de travail et disponibilit Ensuite d terminez qui sera en charge des manipulations Les points a prendre en compte sont la disponibilit des personnes comp tentes pour les protocoles de cultures cellulaires et la charge de travail pour mener le projet son terme valuation de l expertise requise pour exploiter le syst me de culture Le syst me de culture est il facile mettre en oeuvre Cela d pend souvent de l exp rience et de l expertise des op rateurs Les personnes disponibles ont elles l expertise et l exp rience n cessaire La d cision finale En consid rant les principales questions num r es ci dessus avec les avantages et les inconv nients de chacun des syst mes de culture r sum s dans les tableaux 8 et 9 vous devriez maintenant tre en mesure de choisir le ou les syst mes qui r pondent le mieux vos besoins Gardez cependant l espr
16. esoins sera beaucoup plus facile Adh sion cellulaire La premi re tape et le plus important est de d terminer les exigences en terme d attachement de vos cellules Certaines lign es de cellules sont adh rentes c est dire qu elles ne peuvent cro tre que si elles adh rent un substrat appropri tel que la paroi d un flacon ou d un roller D autres lign es cellulaires en particulier les lign es cellulaires transform es sont capables de se d velopper soit attach es un substrat ou en suspension elles ne sont pas d pendante d un accrochage un substrat En g n ral si les cellules le permettent il est toujours plus facile de cultiver de grandes quantit s de cellules animales en suspension plut t qu en adh sion Certaines lign es cellulaires g n tiquement modifi es pour la production de prot ines recombinantes auront aussi des rendements plus lev s lorsqu elles seront cultiv es en suspension Si les cellules sont adh rentes il peut tre possible dans certains cas de les adapter une croissance en suspension Toutefois m me si cette adaptation est possible les cellules peuvent ne pas maintenir leurs caract ristiques ou ne pas produire les m mes quantit s de produit lyer et al 1999 Il peut galement tre n cessaire de s lectionner apres adaptation les cellules sur leurs caract ristiques ou sur les rendements observ s Pour les projets court terme il est inutile d essayer d adapter les l
17. g propose cing tailles allant de 25 cm a 225 cm en surface de culture tableau 1 La plupart de ces flacons sont disponibles soit avec la surface de culture standard ou la surface CellBIND Corning Surface pour am liorer l adh rence cellulaire Les flacons Corning sont disponibles avec plusieurs types de cols Pour r duire les probl mes de contamination dans les incubateurs a CO l utilisation de bouchons ventil s est fortement recommand e Avantages des flacons gtandardis s et faciles utiliser facilit du pipetage pour l entretien et la r colte des cellules la croissance cellulaire peut tre rapidement d termin e au microscope r duction des risques de d versements du milieu et de contamination de la culture aucun mat riel suppl mentaire requis Inconv nients des flacons grand nombre de flacons manipuler pour produire de grandes quantit s de cellules il faut 44 flacons T225 pour obtenir 1x1 09 cellules Figure 3 encombrement des incubateurs Table rendements cellulaires et volumes de milieu recommand s avec les flacons Corning Flacons Corning Rendement moyen des cellules Volume moyen 25 cm 2 2 5 x 106 5 7 5 mL 75 cm 7 5 x 106 15 22 5 mL 150 cm 1 5 x 10 7 30 45 mL 175 cm 1 75 x 107 35 52 5 mL 225 cm 2 29X 107 45 67 5 mL En supposant un rendement moyen de 1x10 cellules cm 2a partir de 100 culture confluente Figure 3 Flacon Corning T
18. ign es Pour les projets plus long terme il est g n ralement envisageable d essayer d adapter les lign es adh rentes pour une culture en suspension Les avantages de la croissance des cellules dans les syst mes en suspension sont les suivants Les cellules en suspension sont plus facile echantillonner mais plus difficile nourrir Plus conomique pour de grandes quantit s de cellules Moins de manipulation Optimisation des echanges gazeux Moins de volume de culture n cessaire car les cellules se d veloppent en trois dimensions au lieu de deux en culture monocouche Une autre alternative pour la culture de cellules adh rentes en suspension est d utiliser des micro transporteurs dans des spinner modifies figure 14 Les micro transporteurs sont des billes de verre ou de polystyrene de petite taille 100 a 300 um sur lesquelles les cellules s attachent tandis que les billes sont maintenues en suspension par agitation Ces micro transporteurs ne fonctionnent pas de mani re optimale avec tous les types de cellules Nous ne traiterons pas de cette technique sp cifique dans ce guide pour de plus amples informations voir les references McLimans 1979 et Freshney 2000 La croissance des cellules attach es a des substrats tels que la surface des flacons et des boites offre galement certains avantages puisque c est la m thode utilis e pour la plupart des lign es de cellules Les avantages de la croissance des cel
19. it les points suivants 1 Il peut tre plus facile et beaucoup plus pratique de produire la quantit de cellules requise en plusieurs lots plut t qu en un seul de grand volume 2 Plus grande est la capacit individuelle des contenants plus important est le risque de perte des cultures par contamination mais les contenants de grand volume n cessitent moins de travail mettre en oeuvre entretenir et r colter 3 Plus simple est le processus et le syst me de culture cellulaire plus la probabilit de succes est grande Griffiths 1990 4 Surveiller l tat de la culture pour s assurer que les cellules sont en bonne sant et produisent les rendements attendus C est beaucoup plus facile faire dans des r cipients de culture o les cellules peuvent tre directement examin es au microscope 5 Le temps n cessaire l optimisation au d marrage les milieux le s rum les densit s d ensemencement les fr quences d alimentation est profitable sur le long terme Tableau 9 Comparison des syst me Corning pour le scale up des cultures en laboratoire de recherche Corning Surface recommand e navire zone de travail Type cm 2 Volum e mL Avantages Inconv nients Type de consommable Flacons de 225 cm Boite carr e 245 mm Roller de 850 cm2 CellSTACK 10 Chambres Flacon HYPER Flask TM ECube System 10 Stack CellCube Modules Spinner 1L Erlenmeyer 3L Surface cm2 225 500
20. lules dans les syst mes avec adh sion sont les suivants plus facile nourrir mais sous cultures plus difficiles r aliser visualisation plus ais e pour v rifier l tat des cultures Evite les contraintes physiques sur les cellules en suspension caus es par l agitation et qui peuvent conduire des rendements moins lev s Adaptation des rendements d sir s en cellules ou en produits cellulaires avec le syst me de culture L tape suivante consiste calculer la quantit de cellules n cessaires pour r aliser son projet En g n ral au moins 1x1 0 cellules em peuvent g n ralement tre produites en culture adh rente et 1x10 cellules mL ou plus peuvent tre produites en suspension Tableau 8 Les rendements r els peuvent tre plus lev s en fonction de la lign e cellulaire et des conditions de culture Par exemple en optimisant tous les aspects de la production de cellules les entreprises biopharmaceutiques ont atteint des densites de 1x1 0 cellules mL et plus Wurm 2004 Tableau 8 Estimation des besoins pour produire 1 x 10 1g de cellules de mammif res Consommable plastique Niveau Nb Co t Co t Charge d expertise d unit consommable quipement de travail 225 cm flacons Simple 44 302 Aucun Elev e Bo te de 245 mm Simple 20 330 Aucun Elev e Flacon Roller 850 cm Basique 12 87 1500 Elev e CellSTACK 10 Moyen 2 390 Aucun Moyenne M QE IMAN Moyen 6 450 Aucun Moyenne
21. orning com lifesciences or call 800 492 1110 Customers outside the United States please call 978 442 2200 or contact your local Corning sales office listed below 13 Smith R E 1979 Large Scale Growth of Rous Sarcoma Virus In Methods in Enzymology Cell Culture Chapter 33 Vol 58 edited by W B Jacoby and I H Pasten Academic Press New York NY 14 Wang R J 1976 Effect of Room Fluorescent Light on the Deterioration of Tissue Culture Medium In Vitro 12 19 22 15 Wang R J and Nixon B T 1978 Identification of Hydrogen Peroxide as a Photoproduct Toxic to Human Cells in Tissue Culture Medium Irradiated with Daylight Fluorescent Light In Vitro 14 715 722 16 Whittle W L and Kruse Jr P F 1973 Replicate Roller Bottles In Tissue Culture Methods and Applications Edited by P F Kruse Jr and M K Patterson Jr p 327 331 Academic Press New York NY 17 Wurm F M 2004 Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells Nat Biotech 22 1393 1398
22. ptique et de r sistance m canique Les rollers Corning r utilisables en verre PYREX sont con us pour r sister aux st rilisations humides ou s ches et sont disponibles en surface de culture de 670 1330 cm 2 Figure 5 Roller Corning en polystyr ne Avantages des rollers vitent la formation de gradients au sein du milieu qui peuvent affecter n gativement la croissance changes gazeux am lior s tres conomiques pour cultiver de grandes quantit s de cellules adh rentes m mes techniques de culture qu avec les flacons mais moins de manipulation la croissance cellulaire peut tre d termin e en utilisant un microscope invers Inconv nients des rollers Exigent plus de place en incubateur en comparaison des flacons et des bo tes Difficult de manipulation mod r e pour produire un grand nombre de cellules 12 850 cm en roller pour 1x109 cellules Investissements n cessaires en equipement approx 1000 pour traiter 12 rollers Risque de d crochement des cellules a cause de la rotation constante des rollers qui peut tre aggrav en milieu sans s rum ou avec de faibles concentrations de serum La surface CellBIND Corning a t d velopp e pour r soudre ces probl mes Tableau 3 rendements cellulaires et volumes de milieu recommand es avec les rollers Corning Bouteilles Roller Rendement moyen des Volume moyen Corning cellules Flacon Roller 490 cm 4 9 x 10 7 1
23. r magn tique encombrement ne fonctionne que sur les cellules en suspension n cessite un agitateur sp cifique R f rences 1 Acton R T Barstad P A and Zwerner R K 1979 Propagation and Scaling Up of Cultures In Cell Culture edited by W B Jakoby and I H Pastan Methods in Enzymology Vol 58 Ch 17 p 211 221 Academic Press New York NY 2 Behie L A Kallos M S and Sen A 2004 Bioprocessing Aspects of Neural Stem Cell Production in Bioreactors BioProcessing Journal 3 27 42 3 Clark S A Griffiths J B and Morris C B 1990 Large Scale Hybridoma Production In Animal Cell Culture edited by J W Pollard and J M Walker Methods in Molecular Biology Volume 5 Chapter 52 p 681 645 Humana Press Clifton NJ 4 Freshney R I 2000 Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique 4th edition Wiley Liss Inc New York NY 5 Gey G O 1933 An Improved Technic for Massive Tissue Culture Am J Cancer 17 752 756 6 Griffiths J B 1990 Scale Up of Suspension and Anchorage Dependent Animal Cells In Animal Cell Culture edited by J W Pollard and J M Walker Methods in Molecular Biology Vol 5 Ch 12 p 49 63 Humana Press Clifton Nu 7 lyer P Ostrove J M and Vacante D 1999 Comparison of Manufacturing Techniques for Adenovirus Production Cytotechnology 30 169 1 72 8 Kotani et al 1994 Improved Methods of Retroviral Vector Transduction and Production for
24. sage unique ou en verre r utilisable Les flacons Erlenmeyer en plastique a usage unique ou en verre r utilisable For attachment dependent cells gt Flasks 1 gt Roller Bottle a PE a gt CellISTACK Culture Chamber S gt HYPERFlask Vessels ae Single flask Dolto vial 2 _ For suspension adapted cells Multiple flasks gt Spinner Flasks gt shaker Flasks Figure 2 Corning propose divers syst mes pour le scale up des cultures de cellules adh rentes Ou en suspension Flacons Les premi res fioles pour la culture cellulaire ont ete d velopp es par Alexis Carrel en 1923 Ces flacons de section circulaire a fond plat ont t fabriqu s en verre PYREX et pr sentaient un col droit ou inclin On les appelait flacons D ou le D faisait r f rence leur diam tre ainsi un flacon D 3 5 pr sente diametre de 3 5 cm William Earle introduit les flacons T en verre en 1947 qui pr sentent une section hexagonale ou rectangulaire Le T d signe dans ce cas la surface totale disponible pour la croissance cellulaire ainsi un flacon T 25 presente une surface de croissance de 25 cm Dans les ann es 1960 des flacons T col droit sont disponibles a partir de polystyrene moul qui a t trait pour am liorer la fixation des cellules Corning a d velopp le premier flacon T a col inclin en polystyrene en 1974 pour permettre un meilleur acces de la pipette a la monocouche cellulaire Cornin
25. sent es ici soient galement applicables ces situations Un objectif de ce guide est de d crire des proc dures aussi simples que possible pour augmenter les chances de succes Un deuxi me objectif est de maintenir les co ts aussi bas que possible pour que le protocole de scale up soit le plus abordable possible pour les laboratoires de recherche qui doivent g rer des budgets r duits En cons quence les syst mes de culture en fibres creuses en r acteurs lit fixe et fluidis et en bior acteurs agit s ainsi que d autres syst mes n cessitant des investissements importants ne sont pas d crits ici Les r f rences en fin de document fourniront un point de d part utile pour des informations suppl mentaires sur ces syst mes et les strat gies plus complexes Choix du syst me La premi re tape dans ce guide de choix d un syst me de scale up sera de passer en revue les syst mes que Corning recommande pour une utilisation dans les laboratoires de recherche Chaque syst me doit tre valu en fonction de vos propres besoins et situation Corning propose six syst mes pour le scale up de culturede cellules adh rentes Les flacons large surface de culture Les bo tes de culture carr s de 245 mm Les rollers Les chambres de culture CellSTACK multi couches Les HYPER Flask Les bior acteurs E Cube pour les cultures de cellules en suspension Corning propose Les flacons spinner en plastique a u
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