Kit pGLO de Transgénèse Bactérienne - Bio-Rad
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1. Biotechnology Explorer Kit pGLO de Transg n se Bact rienne R f rence 166 0003 EDU http explorer bio rad fr Stocker les composants de ce kit temp rature ambiante La duplication de toute partie de ce document n est autoris e que pour l usage en classe Pour le service technique composez le 01 47 95 69 64 Bulletin n 4006097FR Comment des m duses peuvent nous aider clairer la transgen se d Les programmes actuels de lyc e abordent la transgen se plusieurs reprises en seconde dans la partie Cellule ADN unit du vivant elle permet de soutenir l id e d universalit de la mol cule d ADN en premi re ES et L dans la partie De l information g n tique au ph notype applications c est l occasion de montrer en quoi la g n tique a des applications dans des domaines vari s en permettant la production de prot ines int r ts agro alimentaire et m dical _ En terminale S dans le th me 2 de l enseignement de sp cialit des d buts de la g n tique aux enjeux actuels des biotechnologies une prise de conscience des enjeux des biotechnologies est recherch e avec l exemple de la construction d organismes g n tiquement modifi s Pour les l ves la difficult majeure r side dans le caract re apparemment abstrait des notions abord es si elles ne font pas l objet d observations ou de manipulations de leur part A l enseignant qui souhaite permettre ses l ves une approc2. la derni re sans interruption L exc s de bulles peut tre enlev apr s que toutes les bo tes soient coul es en chauffant bri vement la surface de chaque bo te avec la flamme d un bec Bunsen Apr s avoir coul les bo tes ne les bougez pas jusqu ce que l agar se soit solidifi Jetez l exc s d agar dans la poubelle non pas dans l vier Essuyez les gouttes d agar sur les c t s des bo tes 3 Marquer les bo tes Les 40 bo tes agar fournies doivent tre marqu es avec un marqueur ind l bile sur le fond pr s du bord Indiquez sur 16 bo tes LB sur 16 bo tes LB amp et sur 8 bo tes LB amp ara 13 Bulletin n 4006097FR 4 Couler les bo tes avec l agar nutritif LB LB LB amp LB amp ara Premi re tape coulez l agar nutritif LB dans les 16 bo tes qui sont marqu es LB Faites des piles de 4 8 bo tes vides enlevez le couvercle d une bo te avec une main et coulez l agar nutritif LB avec l autre Remplissez la bo te environ un tiers un demi 12 ml d agar replacez le couvercle et continuez la pile Coulez les 16 bo tes LB de cette fa on Laissez les bo tes refroidir dans cette configuration empil e Deuxi me tape ajoutez l ampicilline hydrat e au reste d agar LB nutritif Agitez bri vement pour m langer Coulez les 16 bo tes qui sont marqu es LB amp en utilisant la technique d crite ci dessus amp 5 LB amp dE Troisi me tape ajoutez l ara
3. vous devez garder les bact ries pGLO transform es cultiv es sur les bo tes LB amp ara La meilleure fa on de conserver les bo tes est de les empiler l envers couvercle contre surface dans un endroit froid tel que le r frig rateur Ceci gardera les cellules en vie mais limitera leur croissance active jusqu ce que vous en ayez besoin pour commencer l exp rience suivante Empiler les bo tes envers permet d viter la condensation Id alement les bo tes devraient tre utilis es dans les 2 4 semaines suivantes Pour une conservation plus longue assurez vous que les bo tes sont scell es avec du Parafillm pour pr venir la dessiccation 9 Bulletin n 4006097FR Vue d ensemble de la pr paration pour l enseignant Cette partie r sume le programme recommand pour la pr paration sur la partie de l enseignant Le guide d taill de la pr paration est fourni aux pages 12 16 Pr paration de l enseignant Quand Dur e Etape 1 Lire le manuel de transgen se Imm diatement 1 heure Photocopier la fiche mode op ratoire du TP pour chaque l ve Etape 2 Pr parer les bo tes d agar nutritif 3 7 jours avant le TP 1 heure Etape 3 Pr parer les bo tes de bact ries Distribuer les solutions 24 36 heures avant le TP 30 min Etape 4 Organiser les postes de travail des l ves Avant le TP 10 min Liste de contr le V des postes de travail Postes de travail des l ves La liste indique le mat riel qui d
4. es avec l ADN pGLO est accomplie par culture sur des milieux contenant l antibiotique Les cellules transform es vont appara tre blanches sur les milieux ne contenant pas d arabinose et vertes fluorescentes quand l arabinose est inclus dans l agar nutritif La construction originale du pGLO permet pour la toute premi re fois aux enseignants et aux l ves non seulement de r aliser une transgen se mais aussi de visualiser facilement les m canismes de la r gulation des g nes ainsi que ceux de la s lection g n tique La fluorescence est facilement observable avec une lampe UV de grande longueur d onde peu co teuse Pour que vos l ves tirent le plus grand profit de cette exp rience ils doivent savoir ce qu est un g ne et comprendre la relation entre les g nes et les prot ines Ce kit de transformation pGLO fournit l occasion d une activit pratique suppl mentaire qui est la purification de la prot ine recombinante fluorescente partir des bact ries transform es utilisant le kit de chromatographie GFP ref 166 0005EDU 3 Bulletin n 4006097FR Liste de contr le V pour l inventaire du kit Cette partie liste les composants fournis dans le kit de transgen se bact rienne Elle liste aussi les accessoires requis Chaque kit contient le mat riel n cessaire pour quiper 8 postes de travail Utilisez ceci comme une liste de contr le pour r capituler vos besoins avant de commencer les exp riences Tous les co
5. Bulletin n 4006097FR Solution de transformation bact rienne Le cation Ca de la solution de transformation 50 mM CaCl pH 6 1 neutralise les charges n gatives r pulsives des phosphates de l ADN et des phospholipides de la membrane cellulaire permettant ainsi l ADN d entrer dans les cellules Choc thermique Le choc thermique augmente la perm abilit de la membrane cellulaire l ADN Alors que le m canisme n est pas connu la dur e du choc thermique est critique et a t optimis e pour le type de bact ries utilis es et pour les conditions de transgen se employ es Stabilisation du milieu La p riode d incubation de 10 minutes suivant l ajout du milieu nutritif LB permet aux cellules de cro tre et d exprimer la r sistance l ampicilline de mani re ce que les cellules transform es survivent sur les bo tes de s lection l ampicilline La culture stabilis e peut tre incub e temp rature ambiante ou 37 C toute la nuit pour augmenter l efficacit de la transformation de plus de 10 fois La r gulation du g ne pGLO Dans tous les organismes l expression r gul e des g nes permet l adaptation diff rentes conditions ou vite une surproduction de prot ines inutiles Les g nes impliqu s dans l hydrolyse des diff rentes mol cules sources de nutriments sont de bons exemples de g nes hautement r gul s Par exemple T arabinose ose en C5 est la fois source d nergie et source d
6. de la GFP de Bio Rad L aussi le processus entier est visible avec une lampe UV Nous cherchons continuellement am liorer nos programmes et nos produits Votre contribution est extr mement pr cieuse pour nous Vos commentaires id es et suggestions seront les bienvenus L quipe Bio Education Bio Rad division Bio Recherche 3 bd Raymond Poincar 92430 Marnes la Coquette 1 Bulletin n 4006097FR Sommaire Guide de l enseignant temennnnsnensnnstee nennesn agente spa SEEeeE Page liese e la le ENEE 3 Le systeme POLO EE 3 Liste de contr le pour l inventaire du kit 4 D roulement ar TP eege ess at Eege AA A ame geed Ee che tan are AS 5 Points importants ee ege eech ege geheie ee Seene ee dee 5 beluet 5 Comp tences g n rales pour le TP sis 6 Points exp rimentaux s E 9 Vue d ensemble de la pr paration pour enseignant sssesssssssssertrrrersettttttnntnnsttrtnnnnnnsttnnnnn nenne rent 10 Liste de contr le des postes de travail 10 Guide de pr paration pour Tensegnant sssesssenssserttrttttstttttt ttrt nstt titt tn Ennn a EEEE EEEE En SEEE EE EEEn En annen Ennen 12 Mode op ratoire d taill du TP usines 17 2 Bulletin n 4006097FR Introduction la transgen se Dans ce TP vos l ves vont ex cuter une transformation bact rienne La transformation bact rienne se produit quand une cellule int gre un nouveau fragment de mat riel g n tique ADN Si elle est exprim e cette
7. en plus dilu es augmentant la probabilit de produire des colonies isol es Pour cela il ne faut plus replonger l ensemenceur dans la fiole et utiliser au maximum la surface de la bo te Tournez la bo te d environ 45 degr s de mani re ce que le mouvement de striation soit confortable et commencez le deuxi me quadrant Allez dans le quadrant pr c dant peu pr s deux fois et ensuite dans les deux sens comme montr sur le sch ma ceci une dizaine de fois c Tournez la bo te de nouveau et r p tez la striation d Tournez la bo te pour la derni re fois et faites les derni res stries R p tez les tapes a d avec les bo tes LB restantes Utilisez le m me ensemenceur pour toutes les bo tes Pour viter la contamination couvrez chaque bo te imm diatement apr s sa striation 15 Bulletin n 4006097FR e Placez les bo tes l envers dans l incubateur toute la nuit 37 C ou temp rature ambiante pendant 2 3 jours si vous ne disposez pas d incubateur Les utiliser pour la transgen se dans les 24 36 heures NE PAS REFRIGERER AVANT UTILISATION f Les E coli forment des colonies gris tres qui sont uniform ment circulaires avec des bords lisses Evitez d utiliser des bo tes avec des colonies contaminantes 3 Pr parer le plasmide pGLO En utilisant une nouvelle pipette st rile ajoutez 250 ul de solution de transformation dans la fiole d ADN plasmidique pGLO lyophilis Notez que la quantit d ADN est
8. nouvelle information g n tique peut conf rer l organisme un nouveau caract re identifiable Son ph notype est modifi La transgen se permet l insertion d un ou plusieurs g nes dans un organisme La transgen se est utilis e dans de nombreux domaines de la biotechnologie En agriculture avec des g nes intervenant dans la r sistance contre le gel les parasites ou la s cheresse Dans le domaine de la protection de l environnement o des bact ries transform es g n tiquement peuvent dig rer des nappes de p trole En m decine o des maladies caus es par des g nes d ficients commencent tre trait es par th rapie g nique les cellules d une personne malade tant transform es par la forme saine du g ne impliqu Des g nes peuvent tre isol s partir de l ADN humain animal ou v g tal et plac s dans des bact ries Par exemple un g ne sain humain codant pour une hormone l insuline peut tre int gr au g nome bact rien Dans des conditions adapt es ces bact ries peuvent produire de l insuline humaine Cette insuline peut tre ensuite utilis e pour traiter certains patients diab tiques Le syst me pGLO Avec le kit de transformation pGLO les l ves utilisent un proc d simple pour transformer des bact ries avec un g ne qui code la GFP Green Fluorescent Protein La source de ce g ne est la m duse bioluminescente Aequorea victoria La GFP rend la m duse fluorescente et l
9. si petite que la fiole peut sembler vide Si possible conservez l ADN hydrat dans un r frig rateur La solution de transformation est utilis e ici parce que c est une solution st rile disponible sans nucl ase L eau st rile fonctionnerait aussi bien 250 ul QU GB Solution de transformation ADN plasmidique pGLO lyophilis Pr paration tape 3 avant le TP de transgen se 1 Distribuer les solutions Pour chaque quipe d l ves distribuez 1 ml de solution de transformation CaCl dans les microtubes de 2 ml cod s par couleur fournis dans le kit Distribuez galement 1 ml de milieu nutritif LB dans d autres tubes Si le milieu nutritif LB est distribu 1 jour avant le TP il devra tre r frig r Marquez les tubes 2 Installer les postes de travail pour le TP de transformation Voir page 10 pour fournir le mat riel chaque poste de travail 16 Bulletin n 4006097FR KIT DE TRANSGENESE MODE OPERATOIRE DU TP Marquez un microtube ferm pGLO et un autre pGLO Marquez les deux tubes avec le nom de votre groupe Placez les dans le portoir en mousse Ouvrez les tubes et en utilisant une pipette de transfert st rile transf rez 250 ul de solution de transformation CaCl Solution de transformation Placez les tubes sur la glace Glace Utilisez un ensemenceur st rile pour pr lever une seule colonie de bact ries de votre bo te Prenez le tube pGLO et immergez l ensemen
10. P aura besoin de sa propre bo te de bact ries comme source de cellules pour la transgen se Ce kit contient assez de mat riel pour quiper 8 postes de travail complets Les bo tes LB doivent tre stri es pour fournir des colonies issues d une seule bact rie et incub es 37 C pendant 24 36 heures avant que l activit de transgen se soit planifi e En utilisant les E coli r hydrat es que vous avez pr par es lors de la derni re tape et huit bo tes d agar LB pr par es dans l tape 1 striez une bo te pour chacun de vos groupes bin mes ou quadrin mes d l ves Le but de la striation est de g n rer des colonies isol es partir d une suspension concentr e de bact ries Dans des conditions favorables une cellule se multiplie pour produire des millions de cellules g n tiquement identiques En 24 heures Il y a des millions de bact ries individuelles dans une seule colonie d 1 mm a Ins rez un ensemenceur st rile dans la culture de bact ries r hydrat es Ins rez l ensemenceur directement dans la fiole sans incliner la fiole Enlevez l ensemenceur et striez les bo tes comme illustr sur la page suivante La striation se d roule successivement sur quatre quadrants La premi re strie permet d taler un peu les cellules Allez dans les deux sens avec l ensemenceur peu pr s une douzaine de fois comme indiqu sur le sch ma b Dans les quadrants suivants les cellules deviennent de plus
11. a fait briller dans l obscurit Suite au proc d de transgen se les bact ries expriment leur g ne GFP de la m duse nouvellement acquis et produisent la prot ine fluorescente qui les fait briller d un vert lumineux sous la lumi re UV Dans cette activit pratique les l ves vont apprendre transf rer des g nes d un organisme un autre avec l aide d un plasmide En plus d un grand chromosome les bact ries contiennent naturellement un ou plusieurs petits fragments circulaires d ADN appel s plasmides L ADN plasmidique contient g n ralement des g nes codant pour un ou plusieurs caract res qui peuvent tre b n fiques la survie des bact ries Dans la nature les bact ries peuvent changer des plasmides Ce m canisme naturel permet aux bact ries de s adapter de nouveaux environnements De nombreux cas de r sistance bact rienne aux antibiotiques sont dus la transmission de plasmides Le plasmide pGLO de Bio Rad contient le g ne codant pour la GFP et un g ne conf rant la r sistance un antibiotique l ampicilline Le pGLO comprend galement un syst me sp cial de r gulation de g nes qui peut tre utilis pour contr ler la synth se de la prot ine fluorescente dans les cellules transform es Le g ne codant pour la GFP peut tre activ dans les cellules transform es en ajoutant simplement le sucre arabinose au milieu de culture des cellules La s lection des cellules qui ont t transform
12. ant Objectifs Temps requis Quand Etape 1 Pr parer les bo tes d agar 1 heure 3 7 jours avant le TP Etape 2 R hydrater E Coli 2 minutes 24 36 heures avant le TP Strier les bo tes 15 minutes R hydrater l ADN plasmidique pGLO 2 minutes Etape 3 Distribuer les solutions 10 minutes Avant le TP Installer les postes de travail 10 minutes Pr paration tape 1 3 7 jours avant le TP de transgen se 1 Pr parer lagar nutritif pas besoin d autoclave Les bo tes d agar seront pr par es au moins trois jours avant la s ance de TP Elles doivent tre laiss es temp rature ambiante pendant deux jours et ensuite r frig r es jusqu ce qu elles soient utilis es Les deux jours permettent lagar de s cher suffisamment pour accepter correctement la solution liquide de transformation Pour pr parer l agar versez 500 ml d eau distill e dans un Erlenmeyer dau moins 1 L Ajoutez le contenu entier du sachet d agar nutritif LB Agitez l Erlenmeyer pour dissoudre lagar et chauffez jusqu bullition dans un micro ondes ou sur une plaque chauffante R p tez le chauffage et l agitation environ trois fois jusqu ce que l agar soit dissous Attention ne pas saisir l Erlenmeyer chaud directement avec la main afin de ne pas se br ler Quand il est dissous laissez lagar nutritif LB refroidir de mani re pouvoir saisir l Erlenmeyer la main 50 C Pendant qu il refroidit marquez les bo tes et pr parez l a
13. binose hydrat au reste d agar nutritif LB contenant l ampicilline Agitez bri vement pour m langer et coulez les 8 bo tes marqu es LB amp ara en utilisant la technique d crite ci dessus 5 Stockage des bo tes LB amp ara Apr s un s chage de deux jours temp rature ambiante les bo tes peuvent tre soit utilis es soit empil es par vingt en les enfilant dans le sac plastique La pile est ensuite invers e le sac ferm et les bo tes conserv es l envers dans un r frig rateur jusqu utilisation 14 Bulletin n 4006097FR Pr paration tape 2 24 36 heures avant le TP de transgen se 1 R hydrater les bact ries En utilisant une pipette st rile r hydratez les E coli HB101 K12 lyophilis es en ajoutant 250 ul de solution de transformation directement dans la fiole Refermez la fiole et laissez la suspension de cellules temp rature ambiante pendant 5 minutes Ensuite secouez pour m langer avant de strier les bo tes LB la solution de transformation est utilis e ici parce que c est une solution st rile disposition L eau st rile fonctionnerait galement Conservez les bact ries r hydrat es dans le r frig rateur jusqu utilisation dans les 24 heures pour les meilleurs r sultats pas plus de 3 jours 250 ul d Solution de transformation E coli lyophilis e 2 Strier les bo tes pour produire des colonies d une seule bact rie sur les bo tes d agar Chaque quipe de T
14. ceur dans la solution de transformation au fond du tube Tournez l ensemenceur entre votre index et pouce jusqu ce que la colonie enti re soit dispers e dans la solution de transformation sans morceaux flottants Replacez le tube dans le portoir dans la glace En utilisant un nouvel ensemenceur st rile r p tez l op ration pour le tube pGLO Examinez la solution d ADN plasmidique pGLO avec la lampe UV Notez vos observations Immergez un nouvel ensemenceur st rile dans le tube contenant l ADN plasmidique Retirez un ensemenceur plein II devrait y avoir un film de solution plasmidique dans l anneau Ceci revient observer un film savonneux dans un anneau pour souffler des bulles de savon M langez le contenu de l anneau dans la suspension de cellules du tube pGLO Fermez le tube et remettez le dans le Dortoir sur la glace Fermez aussi le tube pGLO N ajoutez pas d ADN plasmidique dans le tube pGLO pGLO ADN plasmidique pGLO Incubez les tubes sur la glace pendant 10 minutes Assurez vous dentoncer les tubes dans le Dortoir de mani re ce que le bas des tubes d passe et fasse contact avec la glace on CT 17 Portoir __ Glace 7 10 11 12 Pendant que les tubes sont sur la glace marquez vos quatre bo tes d agar sur le fond pas sur le couvercle comme suivant marquez une bo te LB amp pGLO marquez la bo te LB amp ara pGLO marquez l autre bo te LB amp pGLO
15. d viter 6 Bulletin n 4006097FR ces surfaces qui contaminent Quand les l ves travaillent avec les ensemenceurs pipettes et bo tes dagar l enseignant doit insister sur le fait que l anneau du bout de l ensemenceur l extr mit de la pipette et la surface de la bo te d agar ne doivent pas tre touch s ou plac s sur des surfaces contaminantes M me si la contamination n emp che pas syst matiquement l obtention de r sultats exp rimentaux l l ve doit comprendre que le respect scrupuleux des conditions d aseptie est une contrainte fondamentale d s l instant qu on effectue une manipulation de microbiologie Utilisation de la pipette Avant de commencer les sessions de TP pr cisez aux l ves les graduations sur la pipette Les graduations 100 pl 250 ul et 1 ml seront utilis es comme unit s de mesure tout au long du TP Travailler avec E coli L organisme h te dans ce kit est une souche E coli HB 101 K 12 Le vecteur contenant la prot ine recombinante GFP et les organismes transform s cr s par leur combinaison ne sont pas des organismes pathog nes comme TE coli 0157 H7 par exemple Cependant la manipulation des entit s E coli HB 101 K 12 du kit de transgen se exige l utilisation de bonnes pratiques de laboratoire de microbiologie Ces pratiques comprennent notamment les pr cautions suivantes Les surfaces de travail sont d contamin es une fois par jour et apr s chaque claboussure de mat ri
16. e carbone pour les bact ries Les g nes bact riens qui codent pour la synth se des enzymes permettant l utilisation de l arabinose ne sont pas exprim s quand l arabinose n est pas dans l environnement Mais quand l arabinose est pr sent les g nes sont activ s Quand l arabinose dispara t les g nes sont de nouveau inactiv s L arabinose initie la transcription de ces g nes en permettant la fixation de PARN polym rase Dans l ADN plasmidique pGLO g n tiquement modifi certains des g nes impliqu s dans l utilisation de l arabinose ont t remplac s par le g ne de la m duse qui code pour la GFP Quand les bact ries transform es avec l ADN plasmidique pGLO sont cultiv es en pr sence d arabinose le g ne GFP est activ et les bact ries brillent d un vert brillant quand elles sont expos es la lumi re UV C est un excellent exemple d une r gulation g nique G ne de la GFP ARN gt GFPcaract re ph notypique fluorescence arabinose Quand larabinose est absent du milieu de culture le g ne GFP reste inactif et les colonies apparaissent blanches Comp tences g n rales pour le TP Technique st rile Pour toute technique de microbiologie manipulation de bact ries il est important de ne pas introduire de bact ries contaminantes dans l exp rience En effet les bact ries contaminantes sont ubiquitaires elles se trouvent sur le bout des doigts les paillasses II est donc important
17. e sont tr s importants Pour des r sultats optimaux les tubes contenant les suspensions de cellules doivent tre directement pris de la glace plac s dans le bain marie 42 C pendant 50 secondes et remis imm diatement dans la glace En effet en l absence de choc thermique la production d organismes transform s sera 10 fois moindre et avec un choc thermique de 90 secondes elle sera diminu e de moiti Dans tous les cas cependant l exp rience donnera des r sultats Etalement des bact ries transform es et contr les Mettre plus de culture transform e dans les bo tes avec le dispositif de pipette de transfert est contre productif puisque les bo tes ne pourront pas absorber le surplus de liquide et l talement sera in gal Transf rer les suspensions de bact ries des microtubes aux bo tes de P tri exige quelques pr cautions Les bact ries s accumulent au fond les l ves peuvent donc prendre l extr mit sup rieure d un tube ferm entre l index et le pouce d une main et tapoter le bas du tube avec l index de l autre main Ils peuvent galement remuer la suspension avec la pipette avant de l extraire Ils doivent imp rativement recouvrir les bo tes de P tri avec le couvercle imm diatement apr s avoir tal les cellules Kit de chromatographie de la GFP Green Fluorescent Protein Si vous envisagez de poursuivre l exp rience de transgen se bact rienne pGLO avec le kit de purification de la GFP 166 0005EDU
18. el vivant Tout liquide contaminant ou d chets solides sont d contamin s avant d tre jet s Le lavage des mains est indispensable 1 apr s avoir manipul des mat riels impliquant des organismes contenant des mol cules d ADN recombinant et 2 avant de quitter le TP Les l ves doivent manipuler calmement sans parler pour viter les courants d air contamin Des dispositifs de pipetage m canique sont utilis s le pipetage la bouche est interdit Manger boire fumer et utiliser des produits cosm tiques est interdit dans la zone de travail Porter des lunettes de protection et des gants est fortement recommand Pour viter les contaminations le travail pourra tre effectu dans le champ st rile entourant un bec bunsen allum ou une hotte adapt e la microbiologie D contamination et rejet des d chets Si vous ne disposez pas d un autoclave toutes les solutions et composants ensemenceurs et pipettes qui ont t en contact avec les bact ries peuvent tre plac s dans une solution d eau de javel 10 pendant au moins 20 minutes pour st rilisation Une petite cuvette contenant cette solution devrait tre plac e sur chaque poste de travail Quelque soit la solution choisie tous les ensemenceurs et pipettes utilis s doivent tre rassembl s pour st rilisation St rilisez les bo tes de P tri en couvrant lagar avec une solution d eau de javel 10 Laissez au moins une heure et ensui
19. he concr te de la transg n se le programme Biotechnology Explorer de la soci t Bio rad apporte une solution notamment par l utilisation d un g ne de m duse bioluminescente Cette bioluminescence est due la GFP Green Fluorescent Protein prot ine qui met une fluorescence d un vert brillant lorsqu elle est clair e par une lumi re UV de grande longueur d onde Le g ne de la GFP a t originellement isol chez la m duse Aequorea victoria Le g ne sauvage de la m duse a t modifi par Maxygen Inc une soci t de biotechnologie bas e Santa Clara en Californie Des mutations sp cifiques ont t introduites dans la s quence d ADN ce qui a augment consid rablement la fluorescence de la prot ine Cette forme modifi e du g ne de la GFP a t ins r e dans le plasmide pGLO de Bio Rad et est maintenant exclusivement fournie par Bio Rad pour des applications ducatives La GFP est particuli rement lumineuse Avec le kit de transgen se de Bio Rad les l ves utilisent le pGLO pour transformer les bact ries et peuvent d s le lendemain observer l expression du g ne en temps r el l aide d une simple lampe UV De plus un prolongement de l exp rience de transgen se est rendu possible par le kit de purification de la GPF Suite la transgen se les l ves purifient la GFP partir de leurs bact ries transform es ceci en utilisant un simple proc d de chromatographie avec le kit de purification
20. ir une eau 42 C une fiole une fiole une fiole une fiole une bouteille une bouteille un sachet 50 8 paquets 2 paquets 60 8 1 1 requise 1 requise 1 requis 1 optionnel 1 requis 1 requis 1 requis 1 requis 1 requise 1 8 100 ml 4 8 CoccooooooS LULU LULU L UULULOU Bulletin n 4006097FR D roulement du TP Chacune des trois sessions de TP est pr vue pour tre effectu e en p riodes cons cutives de 50 minutes Suggestion de programmation S ance pr c dant le TP Pr sentation de la transgen se TP de transgen se Transformation des bact ries et talement sur les bo tes S ance suivant le TP Observation et tude des r sultats S ance de TP suivante ventuellement Isolement par chromatographie de la GPF l aide du kit de chromatographie GFP ref 166 0005EDU Points importants Cette partie d crit les points conceptuels ou exp rimentaux qui peuvent para tre les plus difficiles aux l ves Ces points sont extr mement importants pour assurer la r ussite de l exp rimentation Les enseignants doivent insister sur les points num r s ci dessous en effectuant si possible les d monstrations des techniques Afin que les l ves mettent les bons produits dans les bons tubes et sur les bonnes bo tes le marquage des diff rents r cipients devra tre effectu avec soin La fiche mode op ratoire est fournie pour organiser l activit Elle fournit des descriptions
21. marquez la bo te LB pGLO Choc thermique En utilisant le portoir en mousse comme support transf rez les deux tubes pGLO et pGLO dans le bain marie r gl 42 C pendant exactement 50 secondes Assurez vous d enfoncer les tubes dans le portoir de mani re ce que le bas des tubes d passe et fasse contact avec l eau chaude Quand les 50 secondes sont coul es replacez les deux tubes sur la glace Pour les meilleurs r sultats de transgen se le changement de la glace 0 C 42 C et ensuite le retour dans la glace doivent tre rapides Incubez les tubes sur la glace pendant 2 minutes Enlevez le portoir contenant les tubes de la glace et placezle surla paillasse Ouvrez un tube et en utilisant une nouvelle pipette st rile ajoutez 250 Hi du milieu nutritif LB dans le tube et refermez le R p tez avec une nouvelle pipette st rile pour l autre tube Incubez les tubes pendant 10 minutes temp rature ambiante Tapotez les tubes ferm s avec votre doigt pour m langer En utilisant une nouvelle pipette pour chaque tube pipetez 100 ul des suspensions de transformation et de contr le sur les bo tes appropri es Utilisez un nouvel ensemenceur st rile pour chaque bo te Etalez les suspensions galement sur la surface dagar enbalayant rapidement la surface plate d un nouvel ensemenceur st rile dans les deux sens sur la surface de la bo te Empilez vos bo tes et rassemblez les Mettez
22. mposants du kit peuvent tre stock s temp rature ambiante jusqu utilisation Composants du kit 1 2 3 4 5 6 7 8 9 E Coli HB101 K 12 lyophilis e Plasmide pGLO lyophilis 20 ug Ampicilline lyophilis e 30 mg L arabinose lyophilis 600 mg Solution de transformation 50 mM CaCl pH 6 1 st rile 15 ml Milieu nutritif LB st rile 10 ml Poudre d agar LB nutritive st rile pour faire 500 ml Pipettes st riles emball es s par ment Ensemenceurs st riles 10 ul paquets de 10 10 Bo tes de P tri 60 mm paquets st riles de 20 1 1 Microtubes 2 ml 10 de chaque jaune vert bleu orange lavande rose 12 Portoir en mousse 13 Manuel d instructions Accessoires requis non inclus dans ce kit O SS ND A MN On 9 Lampe UV de grande longueur d onde ref 166 0500EDU Horloge ou montre pour chronom trer 50 secondes Four micro ondes ou plaque chauffante Four incubateur 37 C ref 166 0521EDU Bain marie temp rature contr l e 1 6 litres ref 166 0524EDU Thermom tre qui indique 42 C Flacon d un L Cylindre gradu de 500 ml Eau distill e 500 ml 10 Glace pill e et r cipients 1 1 Eau de javel pour dilution 10 12 Marqueurs ind l biles Si un bain marie temp rature contr l e n est pas disponible prenez un r cipient pour l eau chaude et utilisez de l eau chaude du robinet pour obten
23. oit tre pr sent sur chaque poste de travail Les composants fournis dans ce kit sont suffisants pour 8 l ves ou 8 bin mes soit 16 l ves ou 8 quadrin mes soit 32 l ves Poste de travail commun de l enseignant La liste indique le mat riel qui doit tre pr sent un endroit commun accessible tous les l ves C est au professeur de d cider si les l ves peuvent acc der aux solutions et quipements ou si le professeur distribue les solutions dans les microtubes fournis TP de transformation Poste de travail des l ves Nombre requis Bo te dE coli LB 1 Bo tes coul es d agar 1 LB 2 LB amp 1 LB amp ara Solution de transformation Milieu nutritif LB Ensemenceurs Pipettes Portoir en mousse R cipient rempli de glace pil e Marqueur R cipient contenant de l eau de Javel 10 Poste de travail commun de l enseignant ADN plasmidique pGLO r hydrat 1 fiole Bain marie 42 C et un thermom tre 1 Incubateur 37 C optionnel voir comp tences g n rales de TP Incubation 1 LI S 1 paquet de10 _ 1 d UOUUUOUU0OUUU LU OU 10 Bulletin n 4006097FR Collecte des donn es et analyses Poste de travail des l ves Nombre requis v Bo tes incub es de transformation et contr les 4 LI LB amp ara 1 D LB amp 2 D LB 1 LI Poste de travail commun de l enseignant Lampe UV 1 8 D 11 Bulletin n 4006097FR Guide de pr paration pour l enseign
24. rabinose et l ampicilline comme indiqu ci apr s N B Le refroidissement de l agar doit tre limit sinon il se solidifie gt Portez bullition Ajoutez l eau Ajoutez le Agitez sachet d agar 12 Bulletin n 4006097FR 2 Pr parer l arabinose et l ampicilline Note L arabinose met au moins 10 minutes pour se dissoudre soyez patient L arabinose est conserv au sec dans une petite fiole Avec une nouvelle pipette st rile ajoutez 3 ml de la solution de transformation directement dans la fiole pour r hydrater le sucre M langez la fiole un vortex peut tre utilis La solution de transformation est utilis e ici parce que c est une solution st rile disposition L eau st rile fonctionnerait aussi bien L ampicilline est aussi conserv e au sec dans une petite fiole Avec une nouvelle pipette st rile ajoutez 3 ml de la solution de transformation directement dans la fiole pour r hydrater l antibiotique La solution de transformation est utilis e ici parce que c est une solution st rile disposition L eau st rile fonctionnerait aussi bien iml 3 ml 3 ml z KeA m Ampicilline Arabinose Solution de transformation Note une temp rature excessive gt 50 C d truira l ampicilline et l arabinose mais lagar nutritif se solidifie 27 C vous devez donc surveiller soigneusement le refroidissement de l agar et ensuite couler les bo tes de la premi re
25. re temp rature d incubation 8 Bulletin n 4006097FR Points exp rimentaux Pratique de techniques L enseignant peut juger utile d entra ner ses l ves au travail en conditions st rile l utilisation des pipettes et des ensemenceurs la pratique de la striation et de l talement des bact ries sur la surface d agar Ceci peut tre effectivement n cessaire si les l ves effectuent ce type de manipulation pour la premi re fois Transfert des colonies bact riennes des bo tes d agar aux microtubes Le fait de pr lever une colonie unique sur la bo te peut conduire la tentation de prendre plus de cellules que n cessaire On peut rappeler aux l ves qu une seule colonie qui mesure approximativement 1 mm de diam tre contient des millions de cellules bact riennes Transfert d ADN Le transfert de l ADN plasmidique de son tube de stockage la suspension de transformation est une tape primordiale Les l ves doivent regarder attentivement l anneau de l ensemenceur pour voir s il porte un film de solution plasmidique Celui ci est comparable au film savonneux qui se forme dans un anneau permettant de former des bulles de savon Choc thermique Le proc d utilis pour augmenter l introduction de l ADN tranger dans les bact ries est appel choc thermique Il est important que les l ves suivent les instructions relatives la chronologie Le changement rapide de temp rature et la dur e du choc thermiqu
26. te jetez le surplus de liquide Une fois st rilis es les bo tes d agar doivent tre doublement emball es et trait es comme des d tritus normaux Des lunettes de protection sont recommand es pour l utilisation de l eau de javel 7 Bulletin n 4006097FR Lampes ultraviolet UV Le rayonnement ultraviolet peut causer des dommages aux yeux et la peau Les UV de petite longueur d onde sont plus pr judiciables que la lumi re UV de grande longueur d onde La lampe UV de Bio Rad recommand e pour ce module est de grande longueur d onde Si possible utilisez des lunettes de protection Incubation L utilisation d un incubateur 37 C est recommand e Cependant l exp rience de transgen se peut tre conduite sans l utilisation d un incubateur Dans ce cas le nombre de jours requis pour obtenir des colonies de taille optimale d pend de la temp rature ambiante Les meilleurs r sultats sont obtenus si les premi res colonies sont jeunes 24 48 heures et mesurent 1 1 5 mm de diam tre La r frig ration des bo tes cultiv es va baisser significativement l efficacit de la transgen se La temp rature optimale pour la croissance d E coli est 37 C Des temp ratures plus basses vont diminuer le taux de croissance A 28 C deux jours d incubation sont requis pour obtenir la taille optimale 21 C trois jours d incubation sont n cessaires Ajustez les d lais de pr paration et le programme du TP en fonction de vot
27. visuelles de toutes les tapes du TP utilis es dans le proc d de transgen se Points conceptuels Milieux Les milieux nutritifs liquides et solides c est dire le milieu nutritif LB du nom de Luria et Bertani et la poudre d agar nutritif sont compos s d un extrait de levures et du r sultat d une digestion enzymatique d abats de viande lesquels fournissent un m lange de glucides d acides amin s de nucl otides de sels et de vitamines qui sont tous des nutriments pour la croissance bact rienne L agar qui est d riv des algues fond lorsqu il est chauff et forme un gel solide lorsqu il est refroidi Il sert fournir un support solide sur lequel les bact ries sont cultiv es S lection antibiotique Le plasmide pGLO out contient le g ne GFP contient aussi le g ne pour la lactamase qui fournit la r sistance l antibiotique ampicilline La prot ine B lactamase est produite et s cr t e par les bact ries qui contiennent le plasmide La f lactamase inactive l ampicilline pr sente dans l agar LB nutritif permettant la croissance bact rienne Seules les bact ries transform es qui contiennent le plasmide et expriment la B lactamase peuvent survivre sur les bo tes qui contiennent l ampicilline Seulement un tr s faible pourcentage des cellules accepte l ADN plasmidique et est donc transform Les cellules non transform es ne peuvent pas cro tre sur les bo tes de s lection l ampicilline 5
28. votre nom de groupe et classe sur le fond de la pile et placez la pile l envers dans l incubateur 37 C jusqu au lendemain eg Bain marie CES 42 C pendant Glace 50 secondes 250 yl S 7 Milieu LB PGLO DG PGLO Bang w di am i LB
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