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KIRKPATRICK

1. WE PROTECT YOU GROW www kirkpatrick eu ip kirkpatrick eu Belgium POWER RNEY The undersigned Amylin Pharmaceuticals inc 9360 Towne Centre Drive San Diego California 92121 USA hereby constitute s and appoint s to represent me us in all proceedings relating to National Validation of European Patent Application No EP0966297 97938261 1 In the execution of this Power the said Agents are hereby authorized to sign and file all documents to pay and withdrew all taxes including the maintenance taxes and do generally all that may be necessary or useful to complete the proceedings referred to above Signed at San Diego California USA 66 869 b8on da ads wil A DU ss rm et 9 40 P this fU dayof August 2008 ev fi trot REA Pa pii i 7e Amylin Ref No 221 063 BE FOR PATENTS TRADE MARKS OR DESIGNS IN BELGIUM POUVOIR SP CIAL soussign s constitue nt pour mandataires MM Guy PLUCKER Pierre pautbl PRENNET et Marie Paut VANDEBERG mandataires agr es conforem ment l article 60 de la loi belge sur les brevets et ayant tous leur adresse professionnelle l OFFICE KIRKPATRICK Avenue Wolfers 322 1310 La Hulpe l effet de me nous repr senter dans toutes proc dures relatives amp u brevet belge issu du brevet europ en 0966297 accord le 17 d cembre 2008 En cons quence lesdits mandataires sont autoris s signer et d poser toutes pi ces verser et r
2. His His TR s 20 124 Gly mr pe His His 28 xb s His ISEO 10 NO EIN EIE Emm 29 131 30 134 EIN
3. Xaas est Leu ou pentylglycine Xaajo est Phe ou naphtylalanine Xaa11 est Ile Val ou tert butylglycine Xaa 2 est Glu ou Asp Xaa13 est Trp ou Phe Xaa14 Xaa15 Xxaa16 et Xaa sont ind pendamment Pro homoproline thioproline ou N alkyl alanine Xaajg est Ser ou Tyr et Z4 est OH ou NH gt avec pour condition que le compos n a pas la formule de l exendine 3 SEQ ID NO 1 ou bien de 1 exendine 4 SEQ ID NO 2 ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui ci 20 Utilisation selon l une quelconque des revendications pr c dentes comprenant en outre une 58 quantit efficace d une amyline ou d un analogue agoniste d amyline 21 Utilisation selon la revendication 21 dans laquelle ledit analogue agoniste d amyline est Pro Pro Pro h amyline 22 Exendine ou analogue agoniste d exendine pour l utilisation dans le traitement d une maladie ou d un trouble qui pourrait tre am lior par une diminution de motilit gastro intestinale ou un retard de la vidange gastrique o ladite maladie ou ledit trouble est choisi parmi une diverticulite aigu un syndrome de chasse postprandiale une hyperglyc mie postprandiale associ e une tol rance au glucose d t rior e une hyperglyc mie postprandiale associ e un diab te de type 1 ou une hyperglyc mie postprandiale associ e un diab te de type 2 i ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine procurant la r duction de
4. 0 3553 SOLUTION SALINE TEMOIN t 0 ITT1 SOLUTION SALINE TEMOIN t 20 e EZZZ GLP 1 JOpg sc n 8 E GLP 1 IOu9 Isc ET EXENDINE 9 39 0 5mg liv n 3 15 20 10 koo A00 Xon Gly Thr Koo Xoo Xog Xaa Koo ser Lys Gin Koo Glu Glu Glu Alo Vol Arg Leu U 30 5 Q 100 Xao Xo0 Xon Leu Lys Asn Gly Gly Xoo Ser Ser Gly Alo Xoops Koope X00 7 Xoo Z 3 0 rJ 3 rJ aa J w r oy r La rs y O q gt da a E ua cC cr cC 0 NH er Ser Ser e O ce O har L ha O CAL a O gt lt A LN Ser AAE Pro Pro Pro Pro EN Pro FIG O c e o o o c C a a a a oa a LU hr Pro Ln Ser Pro Pro Pro Pro Ser DDAL CG CIO in i e CG m Lu cn y Ew c 2 Qo Qo a gt u De po Dm m m hw mee e D 9 U T perpe pep o ro pur w 8 m m 0 n e uc 9e e e e e 1 9 c2 cC Glu His w e e 6 m m m ro ss Occ A00 Asp Asp Ag Le sp Le sp Leu De Asp Glu Ds Asp Asp o t5 a a a e e c gt c gt lt gt 0 DOA m epe pre e pes Gy Gu Phe Ih EJE Ta D fe Ta lu Phe Ser EB Glu naph E o me His EE Cly Ly hr G Glu Clu Gly Cly AEI Asp EN Phe Thr ES Glu m wmm c d mp m C jo si Dia IC v nin X E gt qme A 15 l2 16 413 117 a uu 811 gl EI ub us USD l Ser
5. lectrospray M calcul e 4266 8 EXEMPLE 27 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 28 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 1 Des couplages doubles suppl mentaires sont requis aux positions de thioproline 38 37 et 36 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps 10 15 20 25 30 47 de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4246 8 EXEMPLE 28 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 29 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyi Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 1 Des couplages doubles suppl mentaires sont requis aux positions d homoproline 38 37 36 et 31 On utilise dans l ana
6. protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le 10 15 20 2 30 40 Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4186 6 EXEMPLE L3 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 14 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une fa on semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4200 7 EXEMPLE 14 Pr paration d un peptide ayant la SEO ID NO 15 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2
7. 1995 D Alessio et al y Clin Invest 97 133 138 1996 Les exendines et l exendine 9 39 se lient au r cepteur GLP 1 clon Fehmann HC et al Peptides 15 3 453 456 1994 Thorens B et al Diabetes 42 11 1678 1682 1993 Dans des cellules transfect es avec le r cepteur GLP 1 clon l exendine 4 est un agoniste savoir elle augmente l AMPc alors que l exendine 9 39 est un antagoniste savoir elle bloque les actions stimulatrices de l exendine 4 et de GLP 1 10 L5 20 25 30 L exendine 9 39 agirait aussi en tant qu antagoniste des exendines de longueur totale inhibant la stimulation des cellules acinaires pancr atiques par l exendine 3 et l exendine 4 Raufman et al J Biol Chem 266 2897 2902 1991 Raufman et al J Biol Chem 266 21432 21437 1992 L exendine 9 39 inhiberait la stimulation des taux d insuline plasmatique par l exendine 4 et inhibe les activit s de stimulation de la lib ration de somatostatine et d inhibition de lib ration de gastrine de l exendine 4 et GLP 1 Kolligs F et al Diabetes 44 16 19 1995 Eissele et al Life Sciences 55 629 634 1994 US A 5424286 d crit des compositions pharmaceutiques contenant de l exendine 3 de l exendine 4 ou des fragments de celles ci et leur utilisation dans le traitement d un diab te et la pr vention d une hyperglyc mie Les agents qui servent retarder la vidange gastrique ont trouv une place en m
8. 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une fa on semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e 10 15 20 29 30 41 pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4200 7 EXEMPLE 15 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 16 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems 1nc cliv de Ja r sine d prot ge et purifi d une facon semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4202 7 EXEMPLE 16
9. 55 dans laquelle Xaa est His Arg ou Tyr Xaa est Ser Gly Ala ou Thr Xaa3 est Asp ou Glu Xaa est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaas est Thr ou Ser Xaag est Ser ou Thr xaa est Asp ou Giu Xaag est Leu Ile Val pentylglycine ou Met Xaag est Leu Ile pentylglycine Val ou Met Xaazo est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaa est Ile Val Leu pentylgiycine tert butylglycine ou Met Xaa z est Glu ou Asp Xaa a est Trp Phe Tyr ou naphtylalanine Xaa1a4 Xad15 xaa16 et Xaa17 sont ind pendamment Pro homoproline 3Hyp 4Hyp thioproline N alkylglycine N alkylpentylglycine ou N alkylalanine Xaa g est Ser Thr ou Tyr et 4 est OH ou NH ou d un sel pharmaceutiquement acceptable de ceux ci 11 Utilisation selon l une quelconque des revendications pr c dentes dans laquelle l exendine ou l analogue agoniste d exendine est administr une dose d entre 0 001 mg 70 kg et 1 mg 70 kg par jour en doses uniques ou divis es 12 Utilisation selon l une quelconque des revendications pr c dentes dans laquelle 1 exendine ou l analogue agoniste d exendine est administr une dose d entre 0 001 mg 70 kg et 1 mg 70 kg une fois deux fois ou trois fois par jour 56 13 Utilisation selon la revendication 11 ou 12 dans laquelle l exendine ou l analogue agoniste d exendine est administr une dose d entre 0 001 mg 70 kg et 0 05 mg 70 kg 14 Utilisation selon la revendication 13 dans laq
10. Ser OA Pro Pro Pro Ser Pro Tala m 0 6 6 c NI NH DOE iPro tro Ser MI hPro D Ser hro ro tero pn Melo Ser MeAlo Dui pn NI Mi Ser S Ser Ser Ser Ty Ser ser Ser Pro Pro Pro iPro C3 IPro MeAlo MeAlo DL Pro DEC AAL IPro IPro Gu Trp LATE Glu lle Gv LK le pe Phe L3 T Phe net 0 e 9 8B Pro x Ta L T a GGG MeAla MeAlg Cw ne m ro mo 00 x Dim Pro Pro Pro Cu we i e G E e ce ce C C rr E o cC o o E 2 o CE L gt lt mz e a al o ala as e al al e oO LT um t ES e Len X Lt c LE O a Land a SSES a a gt C IE S Co cC C lt gt lt gt lt IS Bug e Em jeje ro Phe KEE Phe PID GG G K Phe GG hw wr e ia t fe GG ala GG FIG e n la Mel Asp Ce ie is fe ZEE Dp p Asp w G G ILS Ira ISI Ta ur Asp Ds e nr Ds te ur Ser GG Phe de Se Phe E s Ser Ser GG Asp GG G G Of EX Ser EJ EJ hr KE GG Pe Ty EX Iv Phe Em EB 3er EN Ser Phe ES DIEZ Phe TN The Phe mw Phe GG Glu Phe Clu Phe Glu G E Glu lu El Glu Gly a a Glu Gly Gly LIES oy ou Ws oy a a Gly Ez 21 129 Cas us Lan La Gly Ter e Gy la m X00 SESS koo His His
11. exprim en tant que fraction du contenu gastrique r cup r de rats t moins sacrifi s imm diatement apr s gavage dans la m me exp rience Le pourcentage de contenu gastrique restant absorbance 20 min absorbance O mm x 100 Dans des tudes de ligne de base sans traitement m dicamenteux la vidange gastrique sur 20 min a t d termin e Dans des tudes dose r ponse des rats ont t trav s aves O 00l Ol 0437 Xl 5 10 ou 100 9 d exendine 3 d exendine 4 ou de GLP 1 7 36 NH2 Les r sultats sont pr sent s la figure 2 La figure 2 montre que les exendines 3 et 4 ont inhib la vidange gastrique avec approximativement la m me DEso de 0 1 pg alors que GLP 1 7 36 NH2 a une DEso d approximativement S 10 indiquant que les exendines sont 90 fois plus puissantes que GLP 1 inhiber la vidange gastrique Comme le montre le tableau E l exendine 3 et l exendine 4 se sont r v l es tre de puissants inhibiteurs de la vidange gastrique L effet d amyline de rat sur la vidange gastrique est aussi fourni en tant que second 33 t moin positif et des fins comparatives TABLEAU I Mg 3 96 restant n SEM restant n SEM restant n SEM restant SEM n 48 00 16 3 50 46 760 15 2 360 46 000 17 2 000 48 00 17 3 5 salin pas de donn es de donn es D 58 240 3 3180 pasdedonn es 2 000 37 60 2 250 p 3 p E 42 00 7 6 50 70 770 3 5 600 72 000
12. l acide lactique l acide tartrique l acide malonique l acide m thane sulfonique l acide thanesulfonique l acide benz ne sulfonique l acide p tolu nesulfonique l acide cyclo hexylsulfamique et l acide quinique De tels sels peuvent tre pr par s par exemple en faisant r agir les formes acide ou base libres du produit avec un ou plusieurs quivalents de la base ou de l acide appropri s dans un 10 15 20 25 30 28 solvant ou un milieu dans lequel le sel est insoluble ou dans un solvant tel que l eau qui est ensuite enlev sous vide ou en O T ou en changeant les ions d un sel existant par un autre ion sur une r sine changeuse d ions appropri e Des v hicules ou des excipients peuvent aussi tre utilis s pour faciliter l administration du compos Des exemples de v hicules et d excipients inciuent le carbonate de calcium le phosphate de calcium divers sucres tels que le lactose le glucose ou le saccharose ou des sortes d amidons les d riv s de cellulose la g latine les huiles v g tales les poly thyl neglycols et les solvants physiologiquement compatibles Les compositions ou la composition pharmaceutique peuvent tre administr es par des voies diff rentes incluant intraveineuse intrap riton ale sous cutan e et intramusculaire orale topique ou transmuqueuse Si on le souhaite les solutions des compositions ci dessus peuvent tre paissies avec un agent paissis
13. la maladie ou le trouble est une hyperglyc mie postprandiale associ e un diab te de type 1 5 Utilisation selon la revendication 1 dans laquelle la maladie ou le trouble est une hyperglyc mie postprandiale associ e un diab te de type 2 6 Utilisation selon la revendication 1 dans laquelle la maladie ou le trouble est une hyperglyc mie postprandiale associ e une tol rance au glucose 53 d t rior e 7 Utilisation selon l une quelconque des revendications 4 6 dans laquelle le m dicament comprend une quantit de l exendine ou de l analogue aqoniste d exendine de facon administrer une dose de l exendine ou de l analogue agoniste d exendine qui r duit les taux de glucose postprandiaux pas plus de 9 mM 8 Utilisation d une exendine ou d un analogue agoniste d exendine dans un mode op ratoire de diagnostic gastro intestinal dans laquelle ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine procure une r gulation b n fique de la motilit gastrointestinale dans laquelle ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine est un compos peptidique de formule I 5 10 Xaa Xaaz Xaa Gly Thr Xaa Xaas Xaas Xasay Xaas 15 20 Ser Lys Gln Xaas Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu 25 30 7 Xaa o Xaa Xa212 Xan Leu Lys Asn Gly Gly Xaa 35 x Ser Ser Gly Ala Xaa s Xaars Xaa Xass Z dans laquelle Xaa est His Arg ou Tyr Xaa2 est Ser Gly Ala ou Thr Xaas est Asp ou Glu Xaa4
14. s li es la motilit gastrique et la vidange gastrique de l exendine apparent e Par variante fonctionnelle il est entendu un analogue ou d riv qui a une activit qui peut remplacer une ou piusieurs activit s d une exendine particuli re Des variantes fonctionnelles pr f r es retiennent toutes les activit s d une exendine particuli re cependant la variante fonctionnelle peut avoir une activit quis lorsqu elle est mesur e quantitativement est plus forte ou plus faible telle que mesur e dans des essais fonctionnels d exendine par exemple tels que ceux d crits LED Des variantes fonctionnelles pr f r es ont des activit s qui sont dans les environ 1 environ 10 000 de l activit de l exendine apparent e de pr f rence encore d environ 10 environ 1000 et de pr f rence encore dans les environ 50 environ 500 Les d riv s ont au moins environ 15 de similitude de s quence de pr f rence environ 70 de pr f rence encore environ 90 et de pr f rence encore environ 95 de similitude de s quence avec l exendine apparent e Similitude de s quence d signe l homologie constat e entre les s quences des acides amin s dans deux polypeptides diff rents quelle que soit l origine des polypeptides L aptitude de l analogue ou du d riv retenir une certaine activit peut tre mesur e en utilisant les techniques d crites ici 10 15 20 25 30 Les d riv s inc
15. 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e R 5 EXEMPLE 22 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 23 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4188 6 EXEMPLE 23 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 24 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems
16. Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une fa on semblable l exemple 1 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le 10 13 20 25 30 45 Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4131 6 EXEMPLE 24 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 25 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 1 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4172 6 EXEMPLE 25 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 26 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl
17. NO 6 Le peptide identifi ci dessus a t assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 4 On a utilis dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 25 75 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis a donn le produit peptidique ayant un temps de s jour constat de 21 5 minutes Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4168 6 trouv e 4171 2 10 15 20 25 30 37 EXEMPLE 6 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 7 Le peptide identifi ci dessus a t assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une fa on semblable l exemple 4 On a utilis dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis a donn le produit peptidique ayant un temps de
18. d amyline tel que 25 28 2 Pv o amyline humaine L utilisation d agonistes d amyline pour traiter une hyperglyc mie postprandiale ainsi que pour r guler b n fiquement la motilit gastro intestinale est d crite dans WO 95 07098 10 15 20 25 30 Dans un autre aspect encore une quantit th rapeutiquement efficace d une insuline ou d un analogue d insuline doit tre administr e s par ment ou conjointement avec une exendine ou un analogue d exendine au sujet Dans un autre aspect l invention se rapporte l utilisation d une exendine ou d un analogue agoniste d exendine tels que d finis ci dessus dans la fabrication d un m dicament pour l utilisation dans le traitement d une ingestion de toxine dans laquelle ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine procure une r gulation b n fique de la motilit gastrointestinale La pr sente invention fournit plus encore une exendine ou un analogue agoniste d exendine tels que d finis Gye dessus pour l utilisation dans a le traitement d une maladie ou d un trouble qui pourrait tre am lior par une diminution de motilit gastro intestinale ou un retard de la vidange gastrique ou ladite maladie ou ledit trouble est choisi parmi une diverticulite aigu un syndrome de chasse postprandiale une hyperglyc mie postprandiale associ e une tol rance au glucose d t rior e une hyperglyc mie postprandiale associ e un diab te de type 1 ou une
19. d un gel de m thylcellulose acalorique contenant du rouge de ph nol d livr par gavage La teneur en colorant dans les estomacs enlev s apr s sacrifice 20 minutes plus tard a t d termin e spectroscopiquement et a LO LS 20 29 30 24 t compar e celle de rats sacrifi s imm diatement apr s gavage pour valuer la vidange Les exendines l exendine 3 et l exendine 4 ont inhib la vidange gastrique de fa on d pendante de la dose La DEso de la r ponse l exendine 3 et l exendine 4 tait de 0 1 et 0 08 ug respectivement d montrant que les exendines taient 170 290 fois plus puissantes que GLP 1 7 36 NH inhiber la vidange gastrique Comme le d crit l exemple 2 les effets de l exendine 4 et des analogues d exendine 4 de l exendine 4 acide et de MlIeu Phe exendine 4 sur l inhibition de la vidange gastrique ont t examin s L exendine 4 et les analogues d exendine 4 ont inhib la vidange gastrique de fa on d pendante de la dose La DEsg de l exendine 4 tait de 0 27 ug Les DEso de l exendine 4 acide et de em Phe exendine 4 taient 0 12 ug et 0 29 ug respectivement indiquant que la puissance des analogues tait comparable celle de l exendine 4 Comme le d crit l exemple 3 les effets de l exendine 4 et de l antagoniste du r cepteur GLP 1 clon exendine 9 39 sur la vidange gastrique ont t examin s Au bout de 20 minutes les animaux trait s avec l ex
20. du contenu gastrique 20 minutes apr s gavage chez des rats normaux n 3 17 pour chaque point Les symboles sont des moyennes SEM et les courbes d finissent les fonctions logistiques de meilleur ajustement Z ro indique la fraction du contenu gastrique retenu chez des rats normaux non trait s La figure 3 pr sente les effets dose r ponse d une injection pr alable d exendine 4 n 29 d exendine 4 acide n 36 et de mieu Phe exendine 4 n 36 sur la r tention du contenu gastrique 20 minutes apr s gavage chez des rats normaux Les symboles sont la moyenne plus ou moins l erreur type de la moyenne et les courbes d finissent les fonctions logistiques de meilleur ajustement Z ro indique la fraction du contenu gastrique retenue chez des rats normaux non trait s La figure 4 pr sente l effet de l injection pr alable de 1 0 ug d exendine 4 sc n 6 de 1 0 ug d exendine 4 sc plus 0 3 mg d exendine 9 39 sc d 6 et de 0 3 mg d exendine 9 39 sc n 6 sur la r tention du contenu gastrique 20 minutes apr s gavage Sont aussi pr sent s des t moins salins t 0 et t 20 min Les barres d erreur pr sentent l erreur type de la moyenne Comme le montre la figure 4 l exendine 4 seule a puissamment inhib la vidange gastrique L exendine 9 39 sc seule n a pas eu d effet sur la vidange gastrique Lorsqu elle est inject e conjointement avec de l exendine 4 l exendine 9 29 As pas antagonis l effe
21. est 10 ES 20 25 30 27 particuli rement pr f r pour les tampons contenant des ions sodium Les compositions peuvent aussi tre formul es sous la forme de sels pharmaceutiquement acceptables par exemple sels d addition avec un acide et ou de complexes de ceux ci Des sels pharmaceutiquement acceptables sont des sels non toxiques la concentration laquelle ils sont administr s La pr paration de tels sels peut faciliter l utilisation pharmacologique en modifiant les caract ristiques physico chimiques de la composition sans emp cher la composition d exercer son effet physiologique Des exemples d alt rations utiles des propri t s physiques incluent 1 abaissement du point de fusion pour faciliter l administration transmuqueuse et l augmentation de la solubilit pour faciliter l administration de concentrations plus lev es de la substance m dicamenteuse Des sels pharmaceutiquement acceptables incluent les sels d addition avec un acide tels que ceux contenant un sulfate un chlorhydrate un phosphate un sulfamate un ac tate un citrate un lactate un tartrate un m thane sulfonate un thanesulfonate un benz nesulfonate un p tolu nesulfonate un cyclohexylsulfamate et un quinate Des sels pharmaceutiquement acceptables peuvent tre obtenus partir d acides tels que l acide chlorhydrique l acide sulfurique l acide phosphorique l acide sulfamique l acide ac tique l acide citrique
22. est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaas est Thr ou Ser Xaag est Ser ou Thr xaa est Asp ou Glu Xaag est Leu Ile Val pentylglycine ou Met Xaas est Leu Ile pentylglycine Val ou 54 Met Xaazo est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaa 1 est Ile Val Leu pentylglycine tert butylglycine ou Met Xaa 2 est Glu ou Asp Xaa13 est Trp Phe Tyr ou naphtylalanine Xaa14 Xada5 Xaaie et Xaa sont ind pendamment Pro homoproline 3Hyp 4Hyp thioproline N alkylglycine N alkylpentylglycine ou N alkylalanine Xaa1s est Ser Thr ou Tyr et 4 est OH ou NHo ou d un sel pharmaceutiquement acceptable de ceux ci 9 Utilisation selon la revendication 8 dans laquelle ledit mode op ratoire de diagnostic gastro intestinal est un examen radiologique ou est une imagerie par r sonance magn tique 10 Utilisation d une exendine ou d un analogue agoniste d exendine dans la fabrication d un m dicament pour l utilisation dans le traitement d une ingestion de toxine dans laquelle ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine procure une r gulation b n fique de la motilit gastrointestinale dans laquelle ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine est un compos peptidique de formule 1 5 I 10 Xaa Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaas Xaas Xaa Xaag 15 20 Ser Lys Gin Xaa Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu 25 a 30 Xaa g Xaa Xaaj Xaa Leu Lys Asa Gly Gly Xaa1s 35 Ser Ser Gly Ala Xaais Xaa s Xaai Xaais Z
23. gions de l exendine non n cessaires pour l activit d agoniste dtexendine des acides amin s peuvent tre d l t s ajout s ou substitu s avec moins de risque d affecter l activit Dans les r gions requises pour l activit d agoniste d exendine les alt rations d acides amin s sont moins pr f r es car il y a un plus grand risque d affecter l activit de l exendine De telles alt rations 10 15 20 23 20 doivent tre des alt rations conservatrices Par exemple un ou plusieurs r sidus d acides amin s l int rieur de la s quence peuvent tre substitu s par un autre acide amin d une polarit semblable qui agit en tant que variante fonctionnelle Les r gions conserv es tendent tre plus importantes pour l activit de prot ine que les r gions non conserv es Des modes op ratoires connus peuvent tre utilis s pour d terminer les r gions conserv es et non conserv es importantes l activit de r cepteur en utilisant des techniques de mutagen se in vitro ou des analyses de d l tion et en mesurant l activit des r cepteurs comme le d crit la pr sente description Les modifications un polypeptide sp cifique peuvent tre d lib r es comme par mutagen se dirig e un site et substitution d acide amin pendant la synth se en phase solide ou peuvent tre accidentelles comme par des mutations chez les h tes ou syst mes qui produisent Te polypeptide Des compos s utile
24. la lysine Lys la m thionine Met la ph nylalanine Phe la proline Pro la s rine Seriy la thr onine THEE le tryptophane TED la tyrosine Tyr et la valine Val Les acides amin s non naturels incluent de facon non limitative l acide az tidinecarboxylique l acide 2 aminoadipique l acide 3 aminoadipique la b ta alanine l acide aminopropionique l acide 2 aminobutyrique l acide 4 aminobutyrique l acide 6 aminocaproique l acide 2 aminoheptanoique l acide 2 aminoisobutyrique l acide 3 aminoisobutyrique l acide 2 aminopim lique la butylglycine tertiaire l acide 2 4 diaminoisobutyrique la desmosine l acide 2 2 diamino pim lique l acide 2 3 diaminopropionique la N thyl glycine la N thylasparagine l homoproline l hydroxy lysine 1 allo hydroxylysine la 3 hydroxyproline la 4 10 LS 20 29 30 hydroxyproline l isodesmosine 1 allo isoleucine la N m thylalanine la N m thylglycine la N m thylisoleucine la N m thylpentylglycine la N m thylvaline la naphtalanine la ott la norleucine l ornithine la pentylglycine l acide pip colique et la thioproline Les analogues d acides amin s incluent les acides amin s naturels et non naturels qui sont chimiquement bloqu s r versiblement o irr versiblement ou modifi s sur leur groupe amino N terminal ou leurs groupes de cha ne lat rale comme par exemple le sulfoxyde de m thionine la m thionine sulfone la S ca
25. maladie du tractus biliaire par rapport 22 patients trait s avec un placebo MJ Stower et aly Br J Surg 69 v 59L159925 LIBAN Des proc d s pour r guler la motilit gastro intestinale en utilisant des agonistes d amyline sont d crits dans WO 95 07098 publi le 16 mars 1995 RESUME DE L INVENTION La pr sente invention concerne la d couverte surprenante selon laquelle les exendines sont de puissants inhibiteurs de la vidange gastrique Les exendines et agonistes d exendines sont utiles en tant qu inhibiteurs de la vidange gastrique pour le traitement par exemple d un diab te d une ob sit d une ingestion de toxines ou des fins de diagnostic La pr sente invention procure des m dicaments qui peuvent tre utilis s pour r duire la motilit gastrique et ralentir la vidange gastrique comprenant une exendine par exemple l exendine 3 SEQ ID NO 1 1 exendine 4 SEQ ID NO 2 ou d autres compos s tels que pr sent s dans les revendications qui se lient efficacement au r cepteur auquel les exendines exercent leur action sur la motilit gastrique et la vidange gastrique Ils vont tre utiles dans le traitement par exemple d une hyperglyc mie postprandiale d une complication associ e un diab te de 10 19 20 23 type 1 insulino d pendant et de type 2 non insulino d pendant Dans un premier aspect l invention fournit l utilisation d une exendine ou d un analogue agoniste d
26. s jour constat de 17 9 minutes Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4147 6 trouv e 4150 2 EXEMPLE 7 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 8 Le peptide identifi ci dessus a t assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une fa on semblable l exemple 4 On a utilis dans l analyse le Solvant A TFA a 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 35 65 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis a donn le produit peptidique ayant un temps de s jour constat de 19 7 minutes Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4212 6 trouv e 4213 2 EXEMPLE 8 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 9 Le peptide identifi ci dessus a t assembl sur de la 10 15 20 fs 30 38 r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc ami nomet hv L ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 4 On a utilis dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dan
27. s avec des agents utiles dans le retardement et ou le ralentissement de la vidange gastrique CONTEXTE La description suivante inclut des informations qui peuvent tre utiles pour comprendre la pr sente invention Il n est pas reconnu que toute information fournie ici est une technique ant rieure de l invention revendiqu e ici ni que l une quelconque des publications r f renc es sp cifiquement ou implicitement sont une technique ant rieure de cette invention EXENDINE Les exendines sont des peptides qui se trouvent dans le venin du monstre de Gila l zard rencontr en Arizona L exendine 3 SEQ ID NO 1 est pr sente dans le venin de Heloderma horridum et 1 exendine 4 SEQ ID NO 2 est pr sente dans le venin de Heloderma suspectum Eng J et ale de BOL Chem 265 r 20259 20252 7 1900 Eng d et al J Biol Chem 267 7402 7405 1992 Les exendines ont une certaine similitude de s quence avec plusieurs membres de la famille des peptides de type glucagon la plus haute homologie 53 tant avec GLP 10 15 20 2 30 1 7 236 NH5 Coke et ales J Biol Cheles 269 19650 19655 1993 GLP 1 7 36 NH SEQ ID NO 3 est aussi connue sous le nom de proglucagon 78 107 ou simplement le raccourci GLP 1 qui est utilis de fa on interchangeable avec GLP 1 7 36 NH tout au long de cette demande Les s quences de l exendine 3 de l exendine 4 et de GLP 1 sont pr sent es la figure ds GL
28. s par hydrolyse acide en phase vapeur 115 C 20 24 h Les hydrolysats peuvent tre transform s et analys s par des proc d s standards Cohen S A Meys M et Tarrin T L 1989 The Pico Tag Method A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis pp 11 52 Millipore Corporation Milford MA Une analyse par bombardement d atomes rapides peut tre effectu e par M Scan Incorporated West Chester PA L talonnage de masse peut tre effectu en utilisant de l iodure de c sium ou de l iodure de c sium glyc rol L analyse par d sorption ionisation par plasma en utilisant une d tection de temps de vol peut tre effectu e sur un spectrom tre de masse Applied Biosystems Bio Ion 20 Des compos s peptidiques utiles dans l invention peuvent aussi tre pr par s en utilisant des techniques d ADN recombinant en utilisant des proc d s maintenant connus dans la technique Voir par exemple Sambrook et al Molecular Cloning A Laboratory Manual 2 d Cold Spring Harbor 1989 En variante de tels compos s peuvent 10 T3 20 29 30 18 tre pr par s par des proc d s de synth se peptidique en phase homog ne L utilisation de certains analogues agonistes d exendine ou d riv s est incluse dans la pr sente invention Les analogues ou d riv s d exendine sont des variantes fonctionnelles ayant une s quence d acides amin s semblable et retenant un certain degr au moins les activit
29. tre ajout la cha ne peptidique Des groupes N protecteurs appropri s sont bien connus dans la 10 15 20 29 30 technique t butyloxycarbonyle tBoc et fluor nylm thoxy carbonyle Fmoc tant pr f r s ici Les solvants les d riv s d acides amin s et la r sine 4 m thylbenzhydryl amine utilis s dans le synth tiseur peptidique peuvent tre acquis aupr s de Applied Biosystems Inc Foster City CA Les acides amin s cha ne lat rale prot g e tels que Boc Arg Mts Fmoc Arg Pmc Boc Thr Bzl Fmoc Thr t Bu Boc Ser Bzl Fmoc Ser t Bu Boc Tyr BrZ Fmoc Tyr t Bu Boc Lys Cl Z Fmoc Lys Boc Boc Glu Bzl Fmoc Glu t Bu Fmoc His Trt Fmoc Asn Trt et Fmoc Gln Trt peuvent tre acquis aupr s de Applied Biosystems Inc Boc His BOM peut tre acquis aupr s de Applied Biosystems Inc ou Bachem Inc Torrance CA L anisole le sulture de m thyle le ph nol 1 thanedithiol et le thioanisole peuvent tre obtenus aupr s de Aldrich Chemical Company Milwaukee WI Air Products and Chemicals Allentown PA fournit HF L ther thylique l acide ac tique et le m thanol peuvent tre acquis aupr s de Fisher Scientific Pittsburgh PA La synth se peptidique en phase solide peut tre effectu e avec un synth tiseur peptidique automatique mod le 430A Applied Biosystems Inc Foster City CA en utilisant le syst me NMP HOBt option 1 et un proc d chimique tBo
30. volaille et des animaux de sport et des animaux familiers tels que des chevaux des chiens et des chats Pour faciliter la compr hension de la pr sente invention les exemples suivants sont Inclus Les exp riences se rapportant cette invention ne doivent bien 10 ES 20 25 30 31 entendu pas tre interpr t es comme limitant sp cifiquement l invention et de telles variations de l invention connues maintenant ou d velopp es ult rieurement qui seraient du ressort de l homme du m tier sont consid r es comme entrant dans le cadre de l invention telle que d crite ici et revendiqu e ci apr s EXEMPLE 1 L tude suivante a t effectu e pour examiner les effets de l exendine 3 et de l exendine 4 sur la vidange gastrique et pour comparer les effets avec un traitement par GLP 1 7 36 NH2 chez le rat Cette exp rience a suivi une modification du proc d de Scarpignato et al Arch Int Pharmacodyn Ther 246 286 294 1980 Des rats Harlan Sprague Dawley HSD m les ont t utilis s Tous les animaux ont t log s 22 7 0 8 C dans un cycle de lumi re obscurit de 12 12 heures les exp riences tant r alis es pendant le cycle de lumi re et ont eu acc s des aliments et de l eau volont Diet LM 485 Teklad Madison WI L exendine 3 et l exendine 4 ont t synth tis es d apr s des proc d s de synth se peptidique standards La d termination de la vidange gastrique par
31. 10 Xaa Xam Xaa Gly Thr Xaa Xaas Xaas Xaa Xaas 5 7 20 Ser Lys Gln Xaag Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu 25 _ 30 Xaa o Xaa Xaa Xaar Leu Lys Asn Gly Gly Xaa 60 35 Ser Ser Gly Ala Xaa s Xaai Xaa 7 Xaarg Z dans laquelle Xaa est His Arg ou Tyr Xaa est Ser Gly Ala ou Thr Xaas est Asp ou Glu Xaa4 est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaas est Thr ou Ser Xaag est Ser ou Thr Xaa est Asp ou Glu Xaag est Leu lle Val pentylglycine ou Met Xaag est Leu Ile pentylglycine Val ou Met Xaazo est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaa11 est Ile Val Leu pentylglycine tert butylgiycine ou Met Xaa12 est Glu ou Asp Xaa13 est Trp Phe Tyr ou naphtylalanine Xaa814 Xaai15 xaa16 et xaa17 sont ind pendamment Pro homoproline 3Hyp 4Hyp thioproline N alkylglycine N alkylpentylglycine ou N alkylalanine Addjg est ser Ihr ou Tyr et Z est OH ou NH ou un sel pharmaceutiquement acceptable de ceux ci 24 Exendine ou analogue agoniste d exendine selon la revendication 22 ou 23 l exendine tant 1 exendine 3 ou l exendine 4 25 Exendine ou analogue agoniste d exendine selon la revendication 22 ou 23 ledit analogue agoniste d exendine tant un compos peptidique de formule 5 10 61 Xaa Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaas Xaas X887 Xaag 15 20 Ser Lys Gln Xaas Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu 30 Xaajo Xaa X282 Xaa Leu Lys Asn Gly Gly Xaa 25 35 Ser Ser Gly Ala Xaa s Xaas a
32. 3 12 0 6 30 wm xm mo sa nmo nm ano ex 0 300 29 60 7 86 420 3 6 160 98 000 2 88 20 4 3 00 1 000 37 20 9 2 70 95 330 3 0 790 105 000 1 0 000 96 80 9 wm suom LC VE DLL ns 10 000 87 90 11 270 101 760 3 3 390 112 000 3 2 000 101 10 6 3 60 Le 379601 379 11700 3390 12000 200 01000 55 100 000 103 60 7 103 640 3 2 260 103 000 3 3 000 101 20 2 pourcentage de contenu gastrique restant 20 minutes apr s gavage 5 EXEMPLE 2 Les effets d analogues d exendine 4 sur l inhibition de la vidange gastrique ont t examin s et compar s aux effets de l exendine 4 d apr s les proc d s d crits dans l exemple 1 Des rats HSD m les ont t trait s avec 0 01 10 0 1 0 3 1 10 et 100 ug d exendine 4 0 01 0 03 0 1 1 10 et 100 ug d exendine 4 acide et 0 1 0 3 1 10 et 100 ug de l Leu Phe exendine 4 L exendine 3 l exendine 4 acide et Leu Phe ont t synth tis s d apr s des proc d s de synth se peptidique standards Les r sultats 13 pr sent s la figure 3 et au tableau II montrent que les agonistes d exendine l exendine 4 acide et Leu Phe exendine 4 sont de puissants inhibiteurs de la vidange gastrique La CEso de l exendine 4 tait de 0 27 pg Les CEso de l exendine 4 acide et de Meu Phe exendine 4 20 taient comparables 0 12 ug et 0 29 ug respectivement 10 LS 20 2 34 TABLEAU II EXEMPLE 3 L apt
33. AR dd KIRKPATRICK INTELLECTUAL PROPERTY BC AA TE SERVICE PUBLIC FEDERAL ECONOMIE PME CLASSES MOYENNES ET ENERGIE OFFICE DE LA PROPRIETE INTELLECTUELLE TOY ye BOULEVARD ROI ALBERT II 16 aM NY ON 1000 BRUXELLES NE Q Des y m n o PAT55748BEEP PGE 03 mars 2009 Messieurs Re Brevet europ en no 0966297 97938261 1 Au nom de AMYLIN PHARMACEUTICALS INC Date de d p t de la demande 08 ao t 1997 La mention de la d livrance de ce brevet europ en a t publi e au Bulletin Europ en des Brevets du 17 d cembre 2008 Afin d assurer la protection en Belgique et conform ment l article 65 de la Convention de Munich je vous remets une traduction du fascicule du brevet europ en Type de pouvoir Pouvoir Sp cial Je vous remercie de bien vouloir me confirmer la publication de cette traduction et vous prie d agr er Messieurs l expression de mes sentiments distingu s OFFICE KIRKPATRICK y Quy PLUCKER Ul QUO OPRI 03032009 ENTREE o INGEKOMEN mms Kirkpatrick SA NV Intellectual Property LA HULPE Avenue Wolfers 32 BE 1310 La Hulpe Tel 32 2 652 16 00 Fax 32 2 652 19 OO DIEGEM Twin Squares Culliigantaan 18 BE 1831 Diegem Tel 32 2 403 11 34 Fax 432 2 403 11 38 VAT BE426 603 921 RPM NIVELLES 0426 603 921 ING Bank 310 0115119 66 IBAN BEO7 3100 1151 1966 SWIFT BIC BBRUBEBB100 FORTIS Bank 210 0717846 01 IBAN BE43 2100 7178 4601 SWIFT BIC GEBABEBB
34. NE 4 ACIDE AME cw Meu PHE EXENDINE 4 I n L r Y ZERO 0C 0 1 10 400 1000 FIG 3 P DOSE yg 3 6 ANTAGONISE L EFFET DE L EXENDINE 4 SUR L EXENDINE 9 39 ADMINISTREE SC N A PAS LA VIDANGE GASTRIQUE 9 0 CD SOLUTION SALINE TEMOIN t 20 39 0 3mg sc 39 0 5mg iv EXENDINE 4 l 0yg sc n SOLUTION SALINE TEMOIN t 0 MIN E EXENDINE 4 0yg sc ET EXENDINE 9 EXENDINE 9 h gt 3 a XA e N II A e UU LLI lt un o v E EXENDINE 4 0 3yg fsc ET EXENDINE 9 39 0 3mg sc n 5 529 SOLUTION SALINE TEMOIN t EXENDINE 4 0 3pg sc n 5 L EXENDINE 9 39 ADMINISTREE IV N A PAS ANTAGONISE L EFFET DE L EXENDINE 4 SUR NH Lui 5 e cc C un O 3 D a LL 9 lt lt a 2 0 9 RRR RRR RRR RRR GN OR CSA OR OOO CRIS lt OR S6 SS RS oS SS ae a te ete te a a a aa a a ea o e o E e R e A c 1NV S3Y 39VAV9 30 359V1N32ufl0d 1NV1S3Y 35VAV5 30 39V1N334N0d POURCENTAGE DE GAVAGE RESTANT POURCENTAGE DE GAVAGE RESTANT 100 50 0 0 100 50 4 6 L EXENDINE 9 39 ADMINISTREE SC N A PAS ANTAGONISE L EFFET DE GLP 1 SUR LA VIDANGE GASTRIQUE L EXENDINE 9 39 ADMINISTREE IV N A PAS ANTAGONISE L EFFET DE GLP 1 SUR LA VIDANGE GASTRIQUE SOLUTION SALINE TEMOIN t O MIN SOLUTION SALINE TEMOIN t 20 MIN GLP 1 10pg isc n 8 GLP 1 10ug sc ET EXENDINE9 39 3mg sc n EXENDINE 9 39 0 3mg tsc n
35. P 1 a un effet insulinotropique stimulant la s cr tion d insuline par les cellules B pancr atiques GLP 1 inhibe aussi la s cr tion de glucagon par les cellules o pancr atiques rskov et al Diabetes 42 658 661 1993 D Alessio et al J Clin Invest 97 133 138 1996 GLP 1 inhiberait aussi la vidange gastrique Willms B et al J Clin Endocrinol Metab 81 1 327 332 1996 Wettergren A et al Dig Dis Sci 38 4 665 673 1993 et la s cr tion d acide gastrique Schjoldager BT et al Dig Dis Sci 34 5 703 708 1989 O Halloran DJ et al J Endocrinol 1126 1 169 173 1990 Wettergren A et al Dig Dis Sci 3814 665 673 1993 GLP 1 7 37 qui a un r sidu glycine suppl mentaire son extr mit carboxy stimule aussi la s cr tion d insuline chez les humains rskov et al Diabetes 42 659 661 1993 Un r cepteur transmembranaire coupl aux prot ines G ad nylate cyclase qui serait responsable de l effet insulinotropique de GLP 1 a t clon partir d une lign e de cellules f Thorens Proc Natl Acad Sci USA 89 8641 8645 1992 ci apr s d nomm r cepteur GLP 1 clon L exendine 4 serait un agoniste puissant aux r cepteurs GBP I sur les cellules pBTCT secretane de l insuline a des cellules acinaires dispers es de pancr as de cochon d Inde et des cellules pari tales de l estomac le peptide stimulerait aussi la lib ration de somatostatine et inhibe
36. Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 17 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc ciiv de la r sine d prot g et purifi d une fa on semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4145 6 10 LS 20 29 30 42 EXEMPLE 17 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 18 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d term
37. c ou Fmoc voir le manuel d utilisateur de Applied Biosystems pour le synth tiseur peptidique ABI 430A version 1 3B 1 juillet 1988 section 6 pp 49 70 Applied Biosystems Inc Foster City CA avec coiffage Les r sines Boc peptide peuvent tre cliv es avec HF 5 E O C 1 heure Le peptide peut tre extrait de la r sine avec une alternance d eau et d acide ac tique et les filtrats lyophilis s Les r sines Fmoc peptide peuvent tre cliv es d apr s des proc d s standards Introduction to Cleavage Techniques Applied Biosystems Inc 1990 pp 6 10 L3 20 2 30 12 Les peptides peuvent aussi tre assembl s en utilisant un synth tiseur Advanced Chem Tech mod le MPS 350 Louisville Kentucky Les peptides peuvent tre purifi s par RP CLHP pr parative et analytique en utilisant un syst me Waters Delta Prep 3000 Une colonne pr parative C4 CS o C18 110 m 2 2 x 25 cm y Vydac Hesperia CA peut tre utilis e pour isoler les peptides et la puret peut tre d termin e en utilisant une colonne analytique C4 C8 o C18 5 um 0 46 x 25 cm Vydac Les solvants A 0 1 TFA eau et B 0 1 TFA CH3CN peuvent tre d livr s a la colonne analytique un d bit de 1 0 ml min et la colonne pr parative 15 ml min Les analyses des acides amin s peuvent tre r alis es sur le syst me Waters Pico Tag et Pass as en utilisant le programme Maxima Les peptides peuvent tre hydrolys
38. conditions dans lesquelles la vidange gastrique est b n fiquement ralentie ou r gul e sont celles qui diminuent les taux de glyc mie postprandiale de pr f rence pas plus d environ 8 ou 9 mM ou de sorte que les taux de glyc mie sont r duits selon les besoins Chez les personnes diab tiques ou intol rantes au glucose les taux de glucose plasmatique sont plus lev s que chez les personnes normales Chez de telles personnes une r duction b n fique ou r gularisation des taux de glyc mie postprandiale peut tre obtenue Comme le reconna tra l homme du m tier une quantit efficace d agent th rapeutique va varier avec de nombreux facteurs incluant l ge et le poids du patient l tat physique du patient le taux de glyc mie ou le degr d inhibition de la vidange re devant tre obtenu et d autres facteurs De telles compositions pharmaceutiques sont utiles pour provoquer une hypomotilit gastrique chez un sujet et peuvent tre utilis es galement dans d autres troubles o une motilit gastrique est b n fiquement r duite La dose anti vidange quotidienne efficace des compos s va g n ralement tre dans la gamme de 0 001 ou 0 003 environ 5 mg jour de pr f rence environ 0 001 ou 0 05 10 15 20 25 30 30 2 mg jour et de pr f rence encore environ 0 001 ou 0 01 1 ma our pour un patient de 70 kg administr e en une dose unique ou en des doses divis es La dose exacte admi
39. ction finale de la r sine peptidique achev e a t obtenue en utilisant un m lange de tri thylsilane 02 1n 19 d thanedithiol 05 2 mi d anisole 0 2 ml d eau 0 2 ml et d acide trifluoro ac tique 15 ml d apres des proc d s standards Introduction to Cleavage Techniques Applied Biosystems Inc Le peptide a t pr cipit dans de 1 ther eau 10 1 5 20 2 30 36 50 ml et centrifug Le pr cipit a t reconstitu dans de l acide ac tique glacial et lyophilis Le peptide lyophilis a t dissous dans de l eau La puret du produit brut tait d environ 55 On a utilis dans les tapes de purification et l analyse le solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le solvant B TFA 0 1 dans ACN La solution contenant le peptide a t appliqu e une oo colonne C 18 pr parative et purifi e solvant B 10 40 dans le solvant A sur 40 minutes La puret des fractions a t d termin e isocratiquement en utilisant une colonne analytique C 18 Les fractions pures ont t regroup es fournissant le peptide identifi ci dessus Une RP CLHP analytique gradient solvant B 30 60 dans le solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis a donn un produit peptidique ayant un temps de s jour constat de 14 5 minutes Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4131 7 trouv e 4129 3 EXEMPLE 5 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID
40. de formule I dans laquelle Xaa est His ou Arg Xaa2z est Gly Xaas est Asp ou Glu Xaa est Phe ou naphtylalanine Xaas est Thr ou Ser Xaag est Ser ou Thr Xaa est Asp ou Giu Xaag est Leu ou pentylglycine Xaas est Leu ou pentylglycine Xaaio est Phe ou naphtylalanine Xaa est Ile Val ou t butyl glycine Xaa est Glu ou Asp Xaa est Trp ou Phe Xaaia Xaa15 Xaaie et Xaa sont ind pendamment Pro liomoproline thioproline ou N m thylalanine Xaa s4 est Ser ou Tyr et Z est OH ou NH avec pour condition que le compos n ait pas la formule des SEQ ID NOS 1 ou bien 2 De pr f rence encore Z est NH2 Des compos s sp cialement pr f r s incluent ceux ayant la s quence d acides amin s des SEO ID NOS 5 6 17 18 19 22 24 3l 32 et 35 Selon un aspect sp cialement pr f r sont fournis des compos s o Xaas est Leu Ile Val ou pentylglycine de pr f rence encore Leu ou pentylglycine et Xaa3z est Phe Tyr ou naphtylalanine de pr f rence encore Phe ou naphtyl alanine Ces compos s pr senteraient une dur e d action avantageuse et seraient moins sujets une d gradation oxydative tant in vitro qu in vivo ainsi que pendant la synth se du compos Les compos s r f renc s ci dessus forment des sels avec 10 15 20 2 30 23 divers acides et bases inorganiques et organiques De tels sels incluent les sels pr par s avec des acides organiques et inorganiques pa
41. decine en tant qu outils de diagnostic J dans des examens gastro intestinaux radiologiques Par exemple le glucagon est une hormone polypeptidique qui est produite par les cellules a des ilots pancr atiques de Langerhans C est un agent hyperglyc mique qui mobilise le glucose en activant la glycog nolyse h patique IL peut un moindre degr stimuler la s cr tion d insuline pancr atique Le glucagon est utilis dans le traitement d une hypoglyc mie induite par insuline lorsque l administration intraveineuse de glucose n est pas possible Cependant comme le glucagon r duit la motilit du tube digestif il est aussi utilis en tant qu outil de diagnostic dans des examens gastro intestinaux radiologiques Le glucagon a aussi t utilis dans plusieurs tudes pour traiter divers troubies gastro intestinaux douloureux associ s un spasme Daniel et al 10 15 20 25 20 Br Med J 1974 3 720 ont rapport un soulagement des sympt mes plus rapide d une diverticulite aigu chez des patients trait s avec du glucagon par rapport ceux qui avaient t trait s avec des analg siques ou des antispasmodiques Une tude de Glauser et al J Am Coll Emergency Physns O LAOS 1979 d crit le soulagement d une obstruction oesophagienne alimentaire aigu apr s th rapie par glucagon Dans une autre tude le glucagon a significativement soulag une douleur et une sensibilit chez 21 patients ayant une
42. e de compositions parent rales pour injection ou perfusion Ils peuvent par exemple tre mis en suspension dans une huile inerte de pr f rence une huile v g tale telle que l huile de s same d arachide d olive ou un autre v hicule acceptable De pr f rence ils sont mis en suspension dans un v hicule aqueux par exemple dans une solution de tampon isotonique un pH d environ 5 6 7 4 Ces compositions peuvent tre st rilis es par des techniques de st rilisation classiques ou peuvent tre st rilis es par filtration Les compositions peuvent contenir des substances auxiliaires pharmaceutiquement acceptables selon les besoins pour s approcher des conditions physiologiques comme des agents tamponnant le pH Des tampons utiles incluent par exemple les tampons ac tate de sodium acide ac tique Une forme de pr paration lente ou lib ration lente d p t peut tre utilis e de sorte que des quantit s th rapeutiquement efficaces de la pr paration sont d livr es dans la circulation sanguine sur de nombreuses heures ou de nombreux jours apr s l injection ou la d livrance transdermique L isotonicit souhait e peut tre obtenue en utilisant du chlorure de sodium ou d autres agents pharmaceutiquement acceptables tels que le dextrose l acide borique le tartrate de sodium le propyl neglycol les polyols teis que le mannitol et le sorbitol ou d autres solut s inorganiques ou organiques Le chlorure de sodium
43. endine 4 ont pr sent une inhibition puissante de la vidange gastrique qui n a pas t invers e par l exendine 9 39 Cela s est produit que l exendine 9 39 soit administr e sc ou iv L exendine 9 39 seule n a pas eu d effet sur la vidange gastrique Comme not ci dessus l exendine 9 39 est un antagoniste puissant de GLP 1 qui se lie au r cepteur GLP 1 clon Fehmann HC et al Peptides 15 3 453 456 1994 Thorens B et al Diabetes 42 11 1678 1682 1993 Curieusement cependant 1 exendine 9 39 n a pas ploqu l effet de l exendine 4 sur la vidange gastrique voir 10 LS 20 2 30 25 figures 4 et 5 Ces r sultats indiquent que les effets des exendines et des agonistes d exendine sur la vidange gastrique ne sont pas dus la liaison des exendines au r cepteur GLP 1 clon mais en fait que les effets sur la vidange gastrique des exendines et des agonistes d exendines sont dus leur action sur un r cepteur s par Le fait que les exendines peuvent agir par des m canismes autres que ceux attribuables au r cepteur GLP 1 clon est plus encore d montr par l absence rapport e d effet de l exendine 4 sur 1 inhibition de la s cr tion d acide gastrique induite par pentagastrine en d pit de l effet inhibiteur de GLP 1 sur une telle s cr tion Gedulin et al Diabetologia 40 Suppl 1 A300 abr g 1181 1997 De plus comme le d crit WO 98 80231 intitul Use of Exendins and Agonists Th
44. erefor for the Reduction of Food Intake de l exendine inject e p riph riquement a inhib l absorption d aliment chez des souris action non constat e avec GLP 1 Des compositions utiles dans l invention peuvent commod ment tre fournies sous la forme de formulations convenant l administration parent rale incluant intraveineuse intramusculaire et sous cutan e ou nasale ou orale Dans certains cas il va tre commode de fournir une exendine ou un agoniste d exendine et un autre agent anti vidange comme le glucagon ou de l amyline ou un agoniste d amyline dans une seule composition ou solution pour l administration conjointe Dans d autres cas il peut tre plus avantageux d administrer un autre agent anti vidange s par ment de ladite exendine ou dudit agoniste d exendine Une forme d administration appropri e peut tre la mieux d termin e par un praticien m dical pour chaque patient individuellement Des v hicules pharmaceutiquement acceptables appropri s et leur formulation sont d crits 10 LS 20 25 30 26 dans des trait s de formulation standard par exemple Remington s Pharmaceutical Sciences par E W Martin Voir aussi Wang Y J et Hanson M A Parenteral Formulations of Proteins and Peptides Stability and Stabilizers Journal of Parenteral Science and Technology Rapport technique n 10 supp 42 2S 1988 Des compos s utiles dans l invention peuvent tre fournis sous la form
45. es d exendine pr f r s incluent ceux dans lesquels Xaa est His ou Tyr De pr f rence encore Xaa est His Sont pr f r s les compos s dans lesquels Xaa2 est Gly Sont pr f r s les compos s dans lesquels Xaa est Leu pentylglycine ou Met Sont pr f r s les compos s dans lesquels Xaa 3 est Trp ou Phe Sont aussi pr f r s les compos s dans lesquels Xaa est Phe ou naphtalanine Xaaj est Ile ou Val et Xaa Xaais Xaaig et Xaaiy sont ind pendamment choisis parmi Pro homoproline thioproline ou N alkylalanine De pr f rence la N alkylalanine a un groupe N alkyle de 1 environ 6 atomes de carbone D apr s un aspect sp cialement pr f r Xaais Xaa et Xaa17 sont le m me r sidu d acide amine Sont pr f r s les compos s dans lesquels Xaa g est Ser ou Tyr de pr f rence encore Ser 10 T3 20 29 30 22 De pr f rence Z est NH Selon un aspect sont pr f r s les compos s de formule I dans lesquels Xaa est His ou Tyr de pr f rence encore His Xaa gt est Gly Xaa est Phe ou naphtalanine Xaa est Leu pentylglycine ou Met Xaa est Phe ou naphtalanine Xaa est Ile ou Val Xaau Xaais Xaae et Xaa sont ind pendamment choisis parmi Pro homoproline thioproline ou N alkylalanine et Xaaig est Ser ou Tyr de pr f rence encore Ser De pr f rence encore 2 est NH Selon un aspect sp cialement pr f r des compos s sp cialement pr f r s incluent ceux
46. et de l injection pr alable de 10 ng de GLP 1 7 36 NH sc n 8 et de 10 ug de GLP 1 7 36 NH2 sc plus 0 5 mg d exendine 9 39 iv n 3 sur la r tention du contenu gastrique 20 minutes apr s gavage Sont aussi pr sent s des t moins salins t 0 et t 20 min Les barres d erreur pr sentent l erreur type de la moyenne Comme le montre la figure 7 GLP 1 7 36 NH seul a puissamment inhib la vidange gastrique Lorsqu elle est inject e conjointement avec GLP 1 7 36 NH 1 exendine 9 39 iv n a pas antagonis l effet de GLP 1 7 36 NH gt sur l inhibition de la vidange gastrique Les figures 8 1 et 8 2 d crivent les s quences des acides amin s pour certains agonistes d exendine SEQ ID 10 I 20 25 30 NOS 9 m 3512 DESCRIPTION DETAILLEE DE L INVENTION Les exendines et les agonistes d exendine incluant les analogues d exendine et les d riv s d exendine sont utiles dans cette invention compte tenu de leurs propri t s pharmacologiques L activit en tant qu agonistes d exendine peut tre indiqu e par l activit dans les essais d crits ci apr s Les effets des exendines ou des agonistes d exendine sur la motilit gastrique et la vidange gastrique peuvent tre identifi s valu s ou recherch s en utilisant les proc d s d crits dans les exemples 1 3 ci apr s ou d autres proc d s connus dans la technique ou quivalents pour d terminer la motilit gastrique Les essais de r cepteurs n gatif
47. etirer toutes taxes y compris les taxes de maintien en vigueur et faire en g n ral tout ce qui sera n cessaire et utile la bonne ex cution des proc dures pr cit es Signature By Capacity Vice President Chief Intellectual Property Counse 99 90 wp c v9 07 0 0 FU E Fait X FAT comam wb 4 0 Suo Arc EFE ee ORA Po p p dar dO aO d oi o AR tte LI 959969690249 Bd A 8409 le wr A 8907509409 404 9 7 59 9n 44 PUDV VC UTR 9290 POVVO 9 90 0094 P2 un 49 F0 o vbi 0469594250099 9 92 11 Num ro de publication europ en 0966297 12 TRADUCTION DU BREVET EUROPEEN B1 21 Num ro de d p t de la demande de brevet europ en 97938261 1 22 Date de d p t de la demande de brevet europ en 08 ao t 1997 45 Num ro et date du Bulletin Europ en o la mention de la d livrance a t publi e 08 51 du 17 d cembre 2008 73 Titulaire du brevet AMYLIN PHARMACEUTICALS INC 51 Int CI A61K38 00 74 Mandataire OFFICE KIRKPATRICK Avenue Wolfers 32 B 1310 LA HULPE 10 15 20 25 30 REGULATION DE LA MOTILITE GASTRO INTESTINALE DOMAINE DE L INVENTION La pr sente invention se rapporte la fabrication de m dicaments pour r guler la motilit gastro intestinale Plus particuli rement l invention se rapporte l utilisation d exendines et de certains analogues agonistes de celles ci dans la fabrication de m dicaments pour le traitement de troubles qui pourraient tre am lior
48. exendine dans la fabrication d un m dicament pour l utilisation dans le traitement d une maladie ou d un trouble qui pourrait tre am lior par une diminution de motilit gastro intestinale ou un retard de la vidange gastrique dans laquelle ladite maladie ou ledit trouble est choisi parmi une diverticulite aigu un syndrome de chasse postprandiale une hyperglyc mie postprandiale associ e une tol rance au glucose d t rior e une hyperglyc mie postprandiale associ e un diab te de type 1 ou une hyperglyc mie postprandiale associ e un diab te de type 2 dans laquelle ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine procure la r duction de motilit gastrique ou le retard de vidange gastrique et dans laquelle ladite xendine ou ledit analogue agoniste d exendine est un compos de formule I 5 10 Xaa Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaas Xass Xaa7 Xaas 15 20 Ser Lys Gin Xaao Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu 25 30 Xaajo Xaar Xasi2 Xaar Leu Lys Asn Giy Gly Xaais Pee Ser Ser Gly Ala Xaais Xaaie Xaa17 Xaau Z dans laquelle Xaa est His Arg ou Tyr Xaa2 est Ser Gly Ala ou Thr Xaa3 est Asp ou Glu Xaa est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaas est Thr ou Ser Xaa est Ser ou Thr Xaa est Asp ou Glu Xaag est Leu Ile Val pentylglycine ou Met Xaag est Leu Ile pentylglycine 10 L5 20 25 30 Val ou Met Xaazo est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaa est Ile Val Leu pentylglycine tert butylgl
49. fs et ou n gatifs peuvent tre utilis s galement Les exendines et les compos s agonistes d exendine tels que les analogues d exendine et les d riv s d exendine d crits ci peuvent tre pr par s par purification peptidique comme d crit par exemple dans Eng et al J Biol Chem 265 20259 20262 1990 et Eng et al J Biol Chem 267 7402 7405 1992 En variante les exendines et les peptides agonistes d exendine peuvent tre pr par s par des proc d s connus de l homme du m tier par exemple comme d crit dans Raufman et al J Biol Chem 267 21432 21437 1992 en utilisant des techniques de synth se peptidique en phase solide standards et de pr f rence un synth tiseur peptidique automatis ou semi automatis G n ralement un acide amin protection a N carbamoyle et un acide amin attach la cha ne peptidique en croissance sur une r sine sont coupl s temp rature ambiante dans un solvant inerte tel que le dim thyl formamide la N m thylpyrrolidinone ou le chlorure de m thyl ne en pr sence d agents de couplage tels que le dicyclohexylcarbodiimide et le 1 hydroxybenzotriazole en pr sence d une base telle que la diisopropyl thylamine Le groupe protecteur o N carbamoyle est enlev du peptide r sine obtenu en utilisant un r actif tel que l acide trifluoroac tique ou la pip ridine et la r action de couplage r p t e avec l acide amin N prot g souhait suivant devant
50. hyperglyc mie postprandiale associ e un diab te de type 2 ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine procurant la r duction de motilit gastrique ou le retard de vidange gastrique ou b l utilisation dans le traitement d une ingestion de toxine ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine procurant une r gulation b n fique de la motilit gastro intestinale DEFINITIONS Selon la pr sente invention et tels qu utilis s ici 10 L5 20 25 30 les termes suivants sont d finis pour avoir les significations suivantes sauf indication contraire explicite L expression agoniste d exendine se rapporte un compos qui imite les effets des exendines sur la motilit gastrique et la vidange gastrique savoir un compos qui se lie efficacement au r cepteur auquel les exendines exercent leur action sur la motilit gastrique et la vidange gastrique de pr f rence un analogue ou d riv d une exendine L expression acide amin d signe des acides amin s naturels des acides amin s non naturels et des analogues d acides amin s tous en leurs st r o isom res D et L si leur structure permet de telles formes st r o isom res Les acides amin s naturels incluent l alanine Ala l arginine Arg l asparagine Asn l acide opos Asp la cyst ine Cys la glutamine Gin l acide glutamique Glu la giycine Gly l histidine His 1 isoleucine Ile la leucine Leu
51. i d une facon semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 2222051 EXEMPLE 11 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 12 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4172 9 EXEMPLE 12 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 13 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s
52. iner le temps de s jour du produit peptidiqu Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4184 6 EXEMPLE 18 Pr paration d un peptide ayant la SEQ IDe NO 19 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une fa on semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4145 96 EXEMPLE 19 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 20 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la 10 15 20 29 30 43 r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems In6 cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analy
53. itude de 1 exendine 9 39 un antagoniste des effets de l exendine au r cepteur GLP 1 clon antagoniser l effet d inhibition de la vidange gastrique de l exendine 4 et de GLP 1 7 36 NH2 a t examin e d apr s les proc d s d crits dans l exemple 1 Des rats ont t trait s avec 1 0 ug d exendine 4 1 0 yug d exendine 4 avec 0 3 mg d exendine 9 39 10 ug de GLP 1 7 36 NH 10 ug de GLP 1 7 36 NH avec 0 3 mg d exendine 9 39 ou avec 0 3 mg d exendine 9 39 seule Dans ces tudes l exendine 9 39 a t administr e la fois par voie sous cutan e sc et par voie intraveineuse iv Les r sultats de ces exp riences sont pr sent s aux figures 4 7 Comme le montrent les figures 4 et 5 apr s 20 minutes les animaux trait s avec l exendine 4 ont pr sent une inhibition extr mement puissante de la vidange gastrique qui n a pas t invers e par l exendine 9 39 Cela s est produit que 1 exendine 9 39 soit administr e sc ou iv L exendine 9 39 seule n a pas eu d effet sur la vidange gastrique Comme d crit ci dessus l exendine 9 39 est un antagoniste puissant de GLP 1 qui se lie au r cepteur GLP 1 clon Fehmann HC et al Peptides 15 3 453 456 1994 Thorens B et al Diabetes 42 11 1678 1682 1993 Curieusement cependant 1 exendine 9 39 n a pas bloqu l effet de l exendine 4 sur la vidange gastrique voir figures 4 et 5 Ces r sultats indiquent que les effets des exendines sur la vida
54. le proc d d crit ci apr s a t effectu e apr s un je ne de 20 heures pour assurer que l estomac ne contenait pas de chyme qui g nerait les mesures d absorbance spectro photom triques Des rats conscients ont re u par gavage 1 5 ml d un gel acalorique contenant 1 5 de m thylcellulose M 0262 Sigma Chemical Co St Louis MO et 0 05 d indicateur au rouge de ph nol Vingt minutes apr s le gavage les rats ont t anesth si s en utilisant du halothane 5 l estomac expos et pinc aux sphincters pylorique et inf rieur de l oesophage en utilisant des pinces artere 10 Lo 20 29 30 32 enlev et d vers dans une solution alcaline qui tait compl t e un volume fixe Le contenu stomacal a t d duit de l intensit du rouge de ph nol dans la solution alcaline mesur e par absorbance une longueur d onde de 560 nm Dans des exp riences s par es sur 7 rats l estomac et l intestin gr le ont t tous les deux excis s et d vers s dans une solution alcaline La quantit de rouge de ph nol qui a pu tre r cup r e du tube digestif sup rieur en l espace de 20 minutes apr s le gavage tait de 89 24 le colorant qui paraissait li de fa on non recouvrable la surface de la lumi re intestinale pourrait repr senter le reste Pour expliquer une r cup ration maximale de colorant inf rieure 100 le pourcentage de contenu stomacal restant apr s 20 min a t
55. leucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 1 Des couplages doubles suppl mentaires sont requis aux positions de thioproline 38 37 36 et 31 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 Des du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4209 8 EXEMPLE 31 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 22 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 1 Des couplages doubles suppl mentaires sont requis aux positions d homoproline 38 37 36 et 31 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidiq
56. luent une modification se produisant pendant ou apres la traduction par exemple par phosphorylation glycosylation r ticulation acylation clivage prot olytique liaison une mol cule d anticorps une mol cule membranaire ou un autre ligand voir Ferguson et al Annu Rev Biochem 57 285 320 1988 Des sortes sp cifiques d analogues incluent les alt rations d acides amin s telles que les d l tions les substitutions les additions et les modifications d acides amin s Une d l tion se rapporte l absence d un ou plusieurs r sidu s d acides amin s dans le polypeptide apparent Une addition d signe la pr sence d un ou plusieurs r sidu s d acides amin s dans le polypeptide apparent Les additions et d l tions d un polypeptide peuvent tre l extr mit amino l extr mit carboxy et ou internes Une modification d acide amin d signe l alt ration d un acide amin naturel pour produire un acide amin non naturel Une substitution d signe 1e remplacement d un ou plusieurs r sidu s d acide s amin s par un autre d autres r sidu s d acide s amin s dans le polypeptide Les analogues peuvent contenir diff rentes combinaisons ou alt rations incluant plus d une alt ration et diff rentes sortes d alt rations Des analogues pr f r s ont une ou plusieurs alt ration s d acide s amin s qui n afrectent pas significativement l activit d agoniste d exendine Dans les r
57. lyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4250 8 EXEMPLE 29 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 30 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 1 Des couplages doubles suppl mentaires sont requis aux positions d homoproline 38 37 et 36 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse 10 LS 20 29 30 48 lectrospray M calcul e 4234 8 EXEMPLE 30 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 31 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide nor
58. motilit gastrique ou le retard de vidange gastrique et ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine tant un compos peptidique de formule 5 10 Xaa Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaas Xaas Xaa Xaas 15 20 Ser Lys Gin Xaas Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu 25 30 Xan Xaaj Xaa Xaa Leu Lys Asn Gly Gly Xaaji 2035 Ser Ser Gly Ala Xaa s Xaas Xaa 7 Xa218 Z dans laquelle Xaa est His Arg ou Tyr Xaa2z est Ser Gly Ala ou Thr Xaa3 est Asp ou Glu 59 Xaa est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaas est Thr ou Ser Xaag est Ser ou Thr Xaa est Asp ou Glu Xaag est Leu Ile Val pentylglycine ou Met Xaag est Leu Ile pentylglycine Val ou Met Xaa o est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaa est Ile Val Leu pentylglycine tert butylglycine ou Met Xaa est Glu ou Asp Xaa 3 est Trp Phe Tyr ou naphtylalanine Xadai14 Xada15 Xaaie et Xaa17 sont ind pendamment Pro homoproline 3Hyp 4Hyp thioproline N alkylglycine N alkylpentylglycine ou N alkylalanine Xaajg est Ser Thr ou Tyr et 4 est OH ou NE ou un sel pharmaceutiquement acceptable de ceux ci 23 Exendine ou analogue agoniste d exendine pour l utilisation dans le traitement d une ingestion de toxine ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine procurant une r gulation b n fique de la motilit gastro intestinale ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine tant un compos peptidique de formule 5
59. nge gastrique ne sont pas dus la 10 To 20 2 30 35 liaison des exendines au r cepteur GLP 1 clon mais en fait que les effets des exendines sur la vidange gastrique sont dus un r cepteur diff rent Le fait que l exendine 9 39 n a pas bloqu l effet de GLP 1 7 36 NH2 sur la vidange gastrique voir figures 6 et 7 indique que dans ses effets sur la vidange gastrique GLP 1 agit aussi un r cepteur autre que le r cepteur GLP 1 clon auquel l exendine 9 39 est un antagoniste puissant EXEMPLE 4 Pr paration d un peptide amid ayant la SEQ ID NO 5 Le peptide identifi ci dessus a t assembl sur une r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc En g n ral des cycles de couplage unique ont t utilis s tout au long de la synth se et un proc d chimique Fast Moc activation HBTU a t employ Cependant certaines positions le couplage tait moins efficace que pr vu et des couplages doubles ont t requis En particulier les r sidus Asp Thr et Pheg ont tous n cessit un couplage double Une d protection enl vement du groupe Fmoc de la cha ne peptidique en croissance en utilisant de la pip ridine n tait pas toujours efficace Une d protection double a t requise aux positions Argoo Vali et Leu Une d prote
60. nistrer est d termin e par le m decin traitant et d pend de la place que le compos particulier occupe dans la gamme pr cit e ainsi que de l ge du poids et de l tat de la personne L administration devrait commencer au premier signe de sympt mes ou peu apr s un diagnostic de diab te L administration peut tre par injection de pr f rence sous cutan e ou intramusculaire Les compos s actifs oralement peuvent tre pris oralement cependant les posologies devraient tre augment es de 5 10 fois G n ralement lors du traitement ou de la pr vention de taux de glyc mie postprandiale lev s inappropri s ou ind sirables les compos s de cette invention peuvent tre administr s des patients ayant besoin d un tel traitement en des gammes posologiques semblables celles pr sent es ci dessus cependant les compos s sont administr s plus fr quemment par exemple une deux ou trois fois par jour La formulation optimale et le mode d administration des compos s de la pr sente demande un patient d pendent de facteurs connus dans la technique comme la maladie ou l affection particuli re l effet souhait et ia sorte de patient Bien que les compos s soient g n ralement utilis s pour traiter des patients humains ils peuvent aussi tre utilis s pour traiter des maladies semblables ou identiques chez d autres vert br s comme d autres primates des animaux de ferme tels que les porcs les bovins et la
61. nus Xaa18 Z dans laquelle Xaa est His ou Arg Xaa2 est Ser ou Gly Xaas est Asp ou Glu Xaa est Phe ou naphtylalanine Xaas est Thr ou Ser Xaag est Ser ou Thr Xaa est Asp ou Glu Xaag est Leu ou pentylglycine Xaag est Leu ou pentylglycine Xaazo est Phe ou naphtylalanine Xaa11 est Ile Val ou tert butylglycine Xaa est Glu ou Asp Xaa13 est Trp ou Phe Xaa14 Xaa5 Xaai1sg et Xaa ind pendamment Pro homoproline thioproline alanine Xaais est Ser ou Tyr 2 est et OH ou NH 3 r sont ou N alkyl avec pour condition que le compos n a pas la formule de l exendine 3 SEQ SEQ ID NO 2 ID NO 1 ou bien de ou un sel pharmaceutiquement acceptable de ceux ci l exendine 4 1 0 I DIA SdddV9SSd DINMTMATAT JAVITINDAS 10 6 ea HN SdddV9SSd DONATMTLAT IA VII3NDYS 1dS141539H pINIONIAT N SdddV5SSd DINATMALAT JAVIJINOAS TASLALIASH EINIONTXF HN 0 YIMA TMV LAA AVVOITTASS AMSLALDAVH 4 id d 19 6 VIDANGE GASTRIQUE AVEC EXENDINES 125 100 cc o 5 t Z 75 lt 0 8 amp z PH z 50 LU gt zo E O EXENDINE 4 X ee V EXENDINE 3 r E A AE QE EE 5 Y TYT CY DE WT CTI TYT CUm ZERO o XXe d 10 100 1000 VIDANGE GASTRIQUE EXENDINE 4 ET ANALOGUES LLI a E 100 lt C gt lt HI 15 S SE 50 LL Lee lt S gB NM GE 25 RS ES O EXENDINE 4 e A LJ EXENDI
62. on de tels compos s et d un acide organique ou inorganique Dans la pratique l utilisation de la forme saline quivaut l utilisation de la forme basique Les compos s de la pr sente invention sont utiles la fois sous forme de base libre et de sel les deux formes tant consid r es comme tant dans le cadre de la pr sente invention De plus les abr viations suivantes repr sentent ce qui suit ACN ou CH3CN d signe l ac tonitrile Boc tBoc ou Tboc d signe un t butoxycarbonyle DCC d signe le N N dicyclohexylcarbodiimide Fmoc d signe un fluor nylm thoxycarbonyle HE PU d signe l hexafluorophosphate de 2c LN benzotriazol 1 yl 1 1 3 3 t tram thyluronium HOBt d signe le 1 hydroxybenzotriazole monohydrat homoP ou hPro d signe l homoproline MeAla ou Nme d signe la N m thylalanine naph d signe la naphtylalanine pG ou pGl y d signe la pentylglycine tBuG d signe la butylglycine pertisire ThioP ou tPro d signe la thioproline DESCRIPTION SUCCINCTE DES DESSINS La figure 1 pr sente une comparaison des s quences des acides amin s de l exendine 3 de l exendine 4 et de l exendine 9 39 en utilisant des codes d acides amin s une lettre plut t qu trois lettres La figure 2 pr sente les effets dose r ponse de 10 LS 20 25 30 12 l injection sous cutan e pr alable de GLP 1 7 36 NH2 de l exendine 3 et de l exendine 4 sur la r tention
63. ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 1 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Soivant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e 10 LS 20 25 30 46 pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4145 6 EXEMPLE 26 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 27 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 1 Des coupiages doubles suppl mentaires sont requis aux positions de thioproline 38 37 36 et 31 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 3 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse
64. procure la r duction de motilit gastrique ou le retard de vidange gastrique et dans laquelle ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine est un compos peptidique de formule l S 10 Xaa Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaas Xaas Xaa Xaag L 20 Ser Lys Gin Xaas Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu 25 30 Xaajo Xaar Xaa i2 Xaan Leu Lys Asn Gly Gly Xaas 35 Ser Ser Gly Ala Xaa 5s Xaaie X887 Xaa15 Z dans laquelle Xaa est His Arg ou Tyr Xaaz est Ser Gly Ala ou Thr Xaas est Asp ou Glu Xaa 4 est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaas est Thr ou Ser 22 Xaag est Ser ou Thr Xaa est Asp ou Glu Xaag est Leu Ile Val pentylglycine ou Met Xaag est Leu Ile pentylglycine Val ou Met Xaa io est Phe Tyr ou naphtylalanine Xaa11 est Ile Val Leu pentylglycine tert butylglycine ou Met Xaa12 est Glu ou Asp Xaa13 est Trp Phe Tyr ou naphtylalanine Xaa14 Xaa15 Xadai6 et Xaa sont ind pendamment Pro homoproline 3Hyp 4Hyp thioproline N alkylglycine N alkylpentylglycine ou N alkylalanine Addig est Ser Thr ou Tyr et Z est OH ou NH ou d un sel pharmaceutiquement acceptable de ceux ci 2 Utilisation selon la revendication 1 dans laquelle ladite maladie ou ledit trouble est une diverticulite aigu 3 Utilisation selon la revendication 1 dans laquelle ladite maladie ou ledit trouble est un syndrome de chasse postprandiale 4 Utilisation selon la revendication 1 dans laquelle
65. ptides identifi s ci dessus sont assembl s sur la r sine d nomm e Wang r sine alcool p alcoxybenzylique Bachem 0 54 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv s de la r sine d prot g s et purifi s d une facon semblable l exemple 1 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA a 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique La spectrom trie de masse lectrospray procure un M d termin exp rimentalement 51 REVENDICATIONS 1 Utilisation d une exendine ou d un analogue agoniste d exendine dans la fabrication d un m dicament pour l utilisation dans le traitement d une maladie ou d un trouble qui pourrait tre am lior par une diminution de motilit gastro intestinale ou un retard de la vidange gastrique chez un sujet en ayant besoin dans laquelle ladite maladie ou ledit trouble est choisi parmi une diverticulite aigu un syndrome de chasse postprandiale une hyperglyc mie postprandiale associ e une tol rance au glucose d t rior e une hyperglyc mie postprandiale associ e un diab te de type 1 ou une hyperglyc mie postprandiale associ e un diab te de type 2 dans laquelle ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine
66. r exemple HCl HBr H2S04 H3PO l acide trifluoroac tique l acide ac tique l acide formique l acrude m thanesulfonique l acide tolu nesulfonique l acide mal ique l acide fumarique et l acide camphre sulfonique Les sels pr par s avec des bases incluent les sels d ammonium les sels de m taux alcalins par exemple les sels de sodium et de potassium et les sels alcalino terreux par exemple les sels de calcium et de magn sium Les sels ac tates chlorhydrates et trifluoroac tates sont pr f r s Les sels peuvent tre form s par des moyens classiques comme en faisant r agir les formes acide ou base libres du produit avec un ou plusieurs quivalents de la base ou de l acide appropri dans un solvant ou un milieu dans lequel le sel est insoluble ou dans un solvant tel que l eau qui est ensuite enlev sous vide ou en lyophilisant ou en changeant les ions d un sel existant par un autre ion sur une r sine changeuse d ions appropri e Les compos s d crits ci dessus sont utiles compte tenu de leurs propri t s pharmacologiques En particulier les compos s de l invention poss dent une activit en tant qu agents pour r guler la motilit gastrique et pour ralentir la vidange gastrique comme le montre l aptitude inhiber les degr s de vidange gastrique chez des mammif res Comme le d crit l exemple 1 la vidange gastrique a t mesur e chez des rats Sprague Dawley normaux en utilisant la r tention
67. rait la lib ration de gastrine dans des estomacs 10 LS 20 25 30 isol s Goke et al J Biol Chem 268 19650 19655 1993 Schepp et al Eur J Pharmacol 69 183 191 1994 Eissele et al Life Sci 55 629 634 1994 L exendine 3 et 1 exendine 4 se sont r v l es tre des agonistes de GLP 1 lors de la stimulation de production d AMPC dans des cellules acinaires pancr atiques et la lib ration d amylase partir de celles ci Malhotra R et al Regulatory Peptides 41 149 156 1992 Raufman et ali We Gode Enemy 2604 w 14092921457 LIZ 7 Singh et al Regul Pept 53 47 259 1994 Sur la base qes activit s insulinotropiques de l exendine 3 et de lexendine 4 deur utilisation a Gre proposes pour 1e traitement d un diab te et _ la pr vention d une hyperglyc mie Eng brevet U S n 5424286 A la diff rence des exendines de longueur totale les peptides exendines tronqu s tels que l exendine 9 39 mol cule carboxyamid e et les fragments 3 39 9 39 de l exendine seraient des antagonistes puissants et s lectifs de GLP l Goke et al J Biol Chem 268 19650 19655 1999 7 Oohepp Wa C ulis dure wu Pharma 209 x Lbs 13L 1994 Montrose Rafizadeh et al Diabetes 45 Suppl 2 152A 1996 L exendine 9 39 dont la s quence est pr sent e la figure 1 bloquerait GLP 1 endog ne in vivo conduisant une s cr tion d insuline r duite Wang et al J Clin Invest 95 417 421
68. rboxym thyl cyst ine le sulfoxyde de S carboxym thyl cyst ine et la S carboxy m thyl cyst ine sulfone L expression analogue d acide amin se rapporte a un acide amin dans lequel soit le groupe carboxy C terminal le groupe amino N terminal soit le groupe fonctionnel de chaine lat rale a t modifi chimiquement en un autre groupe fonctionnel Par exemple un ester b ta m thylique d acide aspartique est un acide amin analogue de l acide aspartique la N thylglycine est un acide amin analogue de la glycine ou l alanine carboxamide est un acide amin analogue de l alanine L expression r sidu d acide amin d signe des radicaux avant la Structure 1 C O RSNH O R est g n ralement CH R o R est une cha ne lat rale d acide amin g n ralement H ou un substituant contenant du carbone ou ou p est 1 2 lt repr sentant les r sidus acide az tidinecarboxylique proline ou acide pip colique respectivement Le terme inf rieur cit ici en rapport avec des radicaux organiques tels que des groupes alkyles d finit de 10 1 20 22 30 tels groupes ayant jusqu et incluant environ 6 de pr f rence jusqu et incluant 4 et avantageusement un ou deux atomes de carbone De tels groupes peuvent tre une chaine lin aire ou une cha ne ramifi e Sel pharmaceutiquement acceptable inclut les sels des compos s de la pr sente invention issus de la combinais
69. s ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 50 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis a donn le produit peptidique ayant un temps de s jour constat de 16 3 minutes Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4262 7 trouv e 4262 4 EXEMPLE 9 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 10 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4172 6 EXEMPLE 10 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 11 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied 10 15 20 25 30 39 Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purif
70. s ou des recherches de compos s agonistes d exendine ou de compos s agonistes d exendine candidats tels qu une pr paration de r cepteur GLP 1 un essai triage de r cepteur d amyline en utilisant une pr paration de r cepteur d amyline telle que d crite dans le brevet U S n 5264372 d livr le 23 novembre 1993 un ou plusieurs essais triages de r cepteur de calcitonine en utilisant par exemple des cellules de carcinome du sein T47D et MCF7 qui contiennent des r cepteurs de calcium coupl s la stimulation de l activit d ad nyl cyclase et ou un essai triage de r cepteur CGRP en utilisant par exemple des cellules SK N MC peuvent tre utilis s pour valuer et ou confirmer l activit d agoniste d exendine Un tel proc d pour l utilisation dans l identification ou l valuation de l aptitude d un compos ralentir la motilit gastrique comprend a la r union d un chantillon d essai et d un syst me d essai ledit chantillon d essai comprenant un ou plusieurs compos s d essai ledit syst me d essai comprenant un syst me pour 10 bS 20 29 30 15 valuer la motilit gastrique ledit syst me tant caract ris en ce qu il pr sente par exemple un glucose plasmatique lev en r ponse l introduction dans ledit syst me de glucose ou d un repas et b la d termination de la pr sence ou du degr d l vation du glucose plasmatique dans ledit syst me Des t moins positi
71. s selon la pr sente invention sont des compos s agonistes d exendine de formule I SEQ ID NO 4 10 l 5 Xaa Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaag 15 20 Ser Lys Gln Xaa Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Lys Asn Gly Gly Xaa 35 Ser Ser Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa 2 o Xaa est His Arg ou Tyr Xaa est Ser Gly Ala ou Thr Xaa3 est Asp ou Glu Xaa est Phe Tyr ou naphtalanine Xaas est Thr ou Ser Xaas est Ser ou Thr Xaa est Asp ou Glu Xaag est Leu Ile Val pentylglycine 10 b 20 25 30 2 ou Met Xaag est Leu Ile pentylglycine Val ou Met Xaa est Phe Tyr ou naphtalanine Xaa est Ile Val Leu pentylglycine tert butylglycine ou Met Xaa est Glu ou Asp Xaaj est Trp Phe Tyr ou naphtylalanine Xaa Xaaji Xaa et Xaa sont ind pendamment Pro homoproline 3Hyp 4Hyp thioproline N alkylglycine N alkylpentylglycine ou N alkylalanine Xaa est Ser Thr ou Tyr et Z est OH ou NH2 avec pour condition que le compos n ait pas la formule des SEQ ID NOS 1 ou bien 2 Des groupes N alkyles pr f r s pour la N alkylglycine la N alkylpentylglycine et la N alkylalanine incluent les groupes alkyles inf rieurs de pr f rence 1 environ 6 atomes de carbone de pr f rence encore de 1 4 atomes de carbone Des compos s appropri s incluent ceux ayant les s quences d acides amin s des SEQ ID NOS 5 35 Des compos s agonist
72. sant tel que la m thylcellulose Elles peuvent tre pr par es sous forme mulsifi e soit eau dans huile soit huile dans eau L un quelconque d une large vari t d agents mulsifiants pharmaceutiquement acceptables peut tre employ incluant par exemple la poudre de gomme arabique un agent tensioactif non ionique tel qu un Tween ou un agent tensioactif ionique comme les sulfates ou sulfonates alcalins de poly ther alcool par exemple un Triton Des compositions utiles dans l invention sont pr par es en m langeant les ingr dients en suivant des modes op ratoires g n ralement accept s Par exemple les constituants choisis peuvent tre simplement m lang s dans un m langeur ou un autre dispositif standard pour produire un m lange concentr qui peut ensuite tre ajust la 10 les 20 25 30 29 concentration et la viscosit finales par l addition d eau ou d agent paississant et ventuellement d un tampon pour r guler le pH ou d un solut suppl mentaire pour contr ler la tonicit Pour l utilisation par un m decin les compositions vont tre fournies sous forme posologique unitaire contenant une quantit d une exendine ou d un agoniste d exendine par exemple l exendine 3 l exendine 4 avec ou sans un autre agent anti vidange Des quantit s th rapeutiquement efficaces d une exendine ou d un agoniste d exendine pour l utilisation dans le contr le de la vidange gastrique et dans des
73. t de l exendine 4 sur l inhibition de ia vidange gastrique La figure 5 pr sente l effet de l injection pr alable de 0 3 ug d exendine 4 sc n 5 et de 0 3 pg d exendine 4 sc plus 0 5 mg d exendine 9 39 iv n 5 Sur L r tention du contenu gastrique 20 minutes apr s gavage 10 LS 20 29 30 13 Sont aussi pr sent s des t moins salins t 0 et t 20 min Les barres d erreur pr sentent l erreur type de la moyenne Comme le montre la figure 5 l exendine 4 seule a puissamment inhib la vidange gastrique Lorsqu elle est inject e conjointement avec de l exendine 4 l exendine 9 39 iv n a pas antagonis l effet de l exendine 4 sur l inhibition de la vidange gastrique La figure 6 pr sente l effet de l injection pr alable de 10 ng de GLP 1 7 36 NH sc n 8 de 10 ug de GLP 1 7 36 NH2 sc pius 3 mg d exendine 9 39 sc n6 et de 0 3 mg d exendine 9 39 SC n 6 sur la r tention du contenu gastrique 20 minutes apr s gavage Sont aussi pr sent s des t moins salins t 0 et t 20 min Les barres d erreur pr sentent l erreur type de la moyenne Comme le montre la figure 6 GLP 1 7 36 NH gt a puissamment inhib la vidange gastrique L exendine 9 39 sc seule n a pas eu d effet sur la vidange gastrique Lorsqu elle est inject e conjointement avec GLP 1 7 36 NH l exendine 9 39 n a pas antagonis l effet de GLP 1 7 36 NH gt sur l inhibition de la vidange gastrique La figure 7 pr sente l eff
74. tique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4224 7 EXEMPLE 20 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 21 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 4 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TEA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 2126 EXEMPLE 21 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 22 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied 1 0 15 20 25 30 44 Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple
75. ue Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 4193 7 10 LS 20 25 30 49 EXEMPLE 32 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 33 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une facon semblable l exemple 1 Des couplages doubles suppl mentaires sont requis aux positions de N m thyl alanine 38 37 36 et 31 On utilise dans l analyse le Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 3858 2 EXEMPLE 33 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 34 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une fagon semblable l exemple 1 Des couplages doubles suppl mentaires sont requis aux positions de N m th
76. uelle l exendine ou l analogue agoniste d exendine est administr une dose d entre 0 001 mg 70 kg et 0 01 mg 70 kg 15 Utilisation selon l une quelconque des revendications pr c dentes dans laquelle l exendine ou l analogue agoniste d exendine est administr sous la forme d une composition pharmaceutique comprenant une solution tampon isotonique un pH de 5 6 7 4 16 Utilisation selon l une quelconque des revendications 1 14 dans laquelle l exendine ou l analogue agoniste d exendine est administr sous la forme d une composition pharmaceutique comprenant un tampon ac tate de sodium acide ac tique 17 Utilisation selon l une quelconque des revendications pr c dentes dans laquelle ladite exendine est l exendine 4 18 Utilisation selon l une quelconque des revendications 1 16 dans laquelle ladite exendine est l exendine 3 19 Utilisation selon l une quelconque des revendications 1 16 dans laquelle ledit analogue agoniste d exendine est un compos peptidique de formule 57 l 5 10 Xaa Xaa Xaa Gly Thr Xaa Xaas Xaas Xaa Xa g 15 20 Ser Lys Gin Xaas Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu 25 30 Xaa Xaaj Xaai2 Xaan Leu Lys Asn Gly Gly Xaa 35 Ser Ser Giy Ala Xaa s Xe Xaa17 Xaas Z dans laquelle Xaa est His ou Arg Xaa est Ser ou Gly Xaas est Asp ou Glu Xaa est Phe ou naphtylalanine Xaas est Thr ou Ser Xaag est Ser ou Thr Xaa est Asp ou Glu Xaag est Leu ou pentylglycine
77. ycine ou Met Xaa est Glu ou Asp Xaa 3 est Trp Phe Tyr ou naphtylalanine Xaaza xXaa15 xXaajz6 et Xaa sont ind pendamment Pro homoproline 3Hyp 4Hyp thyuoproline N alkylglycine N alkylpentylglycine ou N alkylalanine Xadis est Ser Thr ou Tyr z et 4 est OH ou NH ou un sel pharmaceutiquement acceptable de ceux ci Dans un mode de mise en oeuvre la pr sente invention peut tre utilis e pour r duire la motilit gastrique Dans un autre mode de mise en oeuvre l invention peut tre utilis e pour retarder la vidange gastrique L invention peut tre utilis e pour r duire la motilit gastrique chez un sujet souffrant d un trouble gastro intestinal par exemple un spasme qui peut tre associ une diverticulite aigu un trouble du tractus biliaire ou un trouble du sphincter d Oddi Dans un autre aspect l invention se rapporte l utilisation d une exendine ou d un analogue agoniste d exendine tels que d finis ci dessus dans un mode op ratoire de diagnostic gastro intestinal dans laquelle ladite exendine ou ledit analogue agoniste d exendine procure une r gulation b n fique de la motilit gastrointestinale par exemple dans un examen radiologique ou une imagerie par r sonance magn tique Dans un autre aspect une quantit th rapeutiquement efficace d un agoniste d amyline doit aussi tre administr e au sujet Dans un aspect pr f r l agoniste d amyline est une amyline ou un analogue agoniste
78. yl alanine 38 37 et 36 On utilise dans l analyse le Solvant A TEA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 3940 3 10 LS 20 25 30 50 EXEMPLE 34 Pr paration d un peptide ayant la SEQ ID NO 35 Le peptide identifi ci dessus est assembl sur de la r sine MBHA 4 2 4 dim thoxyph nyl Fmoc aminom thyl ph noxy ac tamide norleucine Novabiochem 0 55 mmole g en utilisant des acides amin s protection Fmoc Applied Biosystems Inc cliv de la r sine d prot g et purifi d une fa on semblable l exempie 1 Des couplages doubles suppl mentaires sont requis aux positions de N m thyl alanine 38 37 36 et 3l On utilise dans l analyse e Solvant A TFA 0 1 dans de l eau et le Solvant B TFA 0 1 dans ACN Une RP CLHP analytique gradient 30 60 de Solvant B dans le Solvant A sur 30 minutes du peptide lyophilis est ensuite effectu e pour d terminer le temps de s jour du produit peptidique Spectrom trie de masse lectrospray M calcul e 3801 1 EXEMPLE 35 Pr paration de peptides acides carboxyligues C terminaux correspondant aux s quences amides C terminales ci dessus Les pe

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