Protocole complet
Contents
1. R Ra q M Des femmes et des hommes ZYME au service de vos recherches A Anh L KOFA L Mix M lange 2X color pr t l emploi pour la PCR et le d p t sur gel OZYA003 40 40 r actions OZYA003 200 200 r actions avec suppl ment de MgCl OZYA003 200XL 200 r actions avec suppl ment de MgCl OZYA003 1000 1000 r actions avec suppl ment de MgCl Stockage et stabilit un an 20 C ou 3 mois 4 C MANUEL D UTILISATION MU 0ZYA003 0912 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 1 Taq Ozyme Mix ZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches M lange 2X color pr t l emploi pour la PCR et le d p t sur gel SOMMAIRE a a a a nr nn one P 3 Pr cautions ssssssssssrurnnnnrerusrrrrrrrrrrrrurnunnrrrrrrrrnuunnunnena P 3 Liste des composants essnsosrussrrrrrrrrrrrrerrrrerrrsrrrerrrrne P 3 Compositions des solutions s sesreserrrerrrerrrrrrrrerrree P 3 D finition de l unit LS P 4 Protocole standard cossaise titine ni P 4 Protocole sp cifique scss ccnbcnccetendaniic niie isstpas nerenin P 5 Optimisations nes ses encens iaccugoesenncbanetebeenciaseecetete P 5 Optimisations suite 5102 ss dt emccanenmensenensebateic et tetan da P 6 R solution des probl mes sunurrurrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrne P 7 Produits aSSOC S D ET P 8 ANT es MR tete Le Lei A LPS P 82. ou Tm 5 C sur le Tm le plus bas des deux amorces si le Tm des amorces est diff rent de 60 C 1 min kb pour les amplicons gt 1 kb OPTI MI SATIONS Pr ambule tester un protocole valid pour un m lange similaire est possible et ne requiert g n ralement que peu d optimisation Nous recommandons de r aliser un gradient de temp rature d hybridation et de respecter le temps d longation du protocole standard Les conditions optimales diff rent d une r action l autre et d pendent des matrices et des amorces utilis es En premier lieu les variables cl s optimiser dans toutes PCR sont 1 la quantit de polym rase 2 la temp rature d hybridation des amorces et 3 la concentration en magn sium Les points 1 et 3 sont d j optimis s dans le MU 0ZYA003 0912 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 5 Taq Ozyme Mix sOZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches ETAR ETTE la PCR et le d p t sur gel m lange Taq Ozyme Purple Mix Un chapitre a toutefois t rajout concernant la concentration de magn sium pour les rares cas o un rajout de magn sium peut tre n cessaire M lange r actionnel Quantit d enzyme la quantit d enzyme est optimis e dans le m lange Taq Ozyme Purple Mix Magn sium MgCl la concentration en magn sium dans le m lange Taq Ozyme Purple Mix est de 1 5 mM Pour c
3. si la s quence cible optimales est longue riche en GC Augmenter le nombre de cycles Augmenter le temps de d naturation particuli rement pour les matrices complexes ADN g nomique MU 0ZYA003 0912 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 7 Taq Ozyme 2 Bandes multiples smear ou bandes non sp cifiques Causes possibles Remarques Solutions e Titrer la quantit d ADN Diminuer la concentration Quantit de matrice non optimale finale voir section Matrice du chapitre Optimisations e Augmenter la temp rature d hybridation accro t la stringence Conditions des cycles PCR non optimales Concentrations d amorces trop E E e Diminuer les concentrations des amorces lev es e Remplacer chaque composant afin de trouver la source s de contamination Contamination e R aliser les r actions de PCR dans un espace r serv et s par de celui d di l analyse des produits de PCR e D signer des nouvelles amorces voir section Amorces Conception d amorces non optimal PRODUITS ASSOCI S Taq Ozyme OZYA001 1000 Taq Ozyme HS OZYA002 250 Hot Start Emerald Amp MAX PCR Master Mix PCR gt 5 Kb s quences GC riches ExactLadder DNA PreMix 100 bp Plus OZYC001 100 ExactLadder DNA PreMix 2 Log OZYC002 100 dNTP PreMix 4x 10 mM OZYD001 500 SeaKem LE Agarose 500 g LON50
4. LISTE DES COMPOSANTS OZYA003 40 40 r actions 1 mi Taq Ozyme Purple Mix 2X 5 x 1 ml Taq Ozyme Purple Mix 2X OZYA003 200 200 r actions 1 ml MgCl 25 mM 1 x5 ml Taq Ozyme Purple Mix 2X OZYA003 200XL 200 r actions 1 mi MgCl 25 mM 5x5 ml Taq Ozyme Purple Mix 2X 1 mi MgCl 25 mM OZYA003 1000 1000 r actions MU OZYA003 0912 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 3 Taq Ozyme Mix sOZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches PAPER NME la PCR et le d p t sur gel COMPOSITIONS DES SOLUTIONS Composite duma O KCI Tris HCI NH4 2S0 Triton X 100 MgCl2 dNTP Taq ADN polym rase recombinante Colorants Traces de colorants rouge et bleu Stabilisateurs d enzymes et amplificateurs de PCR Autres D FI NITION DE L UNIT Une unit est d finie comme la quantit d enzyme qui incorpore 10 nmoles de dNTP dans un fragment d ADN en 30 min 74 C PROTOCOLE STANDARD Ce protocole est adapt pour une r action de 50 ul partir de matrices purifi es Les amorces ont pr f rentiellement une temp rature de fusion Tm proche de 60 C C est un point de d part pour les optimisations voir section Optimisations Apr s d cong lation compl te de chaque r actif bien homog n iser l aide d un vortex puis centrifuger bri vement tous les r actifs avant leur utilisation 1 Le
5. MU 0ZYA003 0912 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 2 Taq Ozyme Mix ZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches M lange 2X color pr t l emploi pour la PCR et le d p t sur gel DESCRIPTIF Taq Ozyme Purple Mix est un m lange 2X pr t l emploi II facilite l utilisation et diminue les erreurs de pipetage Le d p t des produits de PCR sur gel est direct Deux colorants inertes un rouge et un bleu sont ajout s au m lange permettant un contr le visuel de la distribution et le suivi de la migration en gel Ces colorants n interf rent pas avec les applications en aval 7 Zone de migration des colorants dans Gel 0 5 1 5 Gel 2 3 un gel d agarose 4 10 kb 200 750 pb 1 2 kb 125 200 pb PR CAUTIONS e viter les cong lations d cong lations r p t es e Conserver le m lange r actionnel sur la glace jusqu au d marrage des cycles de PCR Cette enzyme ne convient pas la pr paration du m lange r actionnel temp rature ambiante Le cas ch ant utiliser une ADN polymerase d marrage chaud automatique Hot Start ADN Polym rase dont l activit est inactive cette temp rature Nous recommandons la Taq Ozyme HS OZYA002 e Le Taq Ozyme Purple Mix n est pas adapt pour des amplicons de plus 3 kb 4 kb en plasmide ou contenant plus de 60 de GC Si besoin voir section Produits associ s
6. sur gel du fragment d int r t Au del d un certain nombre de cycles le bruit de fond provenant d amplifications non sp cifiques s accro t D naturation initiale la d naturation initiale est n cessaire pour activer l enzyme et d naturer efficacement la matrice Nous recommandons 2 minutes 95 C Cependant pour les matrices plus complexes comme l ADN g nomique eucaryote un temps de d naturation plus long pouvant aller jusqu 5 minutes peut tre n cessaire D naturation nous recommandons 30 secondes 95 C pour l tape de d naturation Cette condition convient aux matrices jusqu 60 de GC Temp rature et temps d hybridation la temp rature d hybridation optimale d pend des amorces utilis es et de la composition du tampon de r action Elle est g n ralement 2 5 C en dessous du Tm le plus bas des deux amorces Dans le protocole standard nous recommandons des amorces de Tm similaires et le plus proche possible de 60 C voir Amorces dans ce chapitre L hybridation se fait en premi re instance 55 C Si n cessaire r aliser un gradient de temp rature afin de d terminer la temp rature d hybridation optimale entre 45 et 68 C Le temps d hybridation recommand est de 30 secondes Temp rature et temps d longation l longation se fait 72 C Le temps d longation d pend de la longueur de l amplicon et de la complexit de la matrice En conditions standard nous recommandons 1 minu
7. 004 AccuGENE Molecular Biology Water 1 L LON51200 AVERTI SSEMENT Ce produit est usage de recherche uniquement MU OZYA003 0912 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 8 sOZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches ETA ETTE la PCR et le d p t sur gel
8. contenant de l EDTA ex tampon TE agent ch lateur des ions Mg libres Amorces la conception et la concentration des amorces sont essentielles au succ s de toutes PCR Des sites en ligne d aide la conception d amorces sont tr s utiles Citons Primer 3 Nous recommandons des amorces de 18 30 nucl otides contenant 40 60 de GC Dans la mesure du possible les temp ratures de fusion Tm des deux amorces doivent tre le plus proche possible et aux environs de 60 C La m thode la plus simple pour estimer le Tm est Tm 2 C x A T 4 C x G C Les amorces sens et anti sens sont g n ralement utilis es une concentration finale comprise entre 0 2 0 6 UM Nous recommandons de commencer avec 0 2 uM de chaque amorce 10 pmol de chaque dans 50 ul de m lange r actionnel Une concentration trop lev e en amorces peut diminuer la sp cificit d hybridation et induire en cons quence des amplifications non sp cifiques Programmation du thermocycleur Nombre de cycles le nombre de cycles est g n ralement compris entre 25 et 35 en fonction du nombre de copies de la s quence amplifier Augmenter le nombre de cycles ne conduit pas n cessairement am liorer le rendement MU 0ZYA003 0912 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 6 LE KoA u Mix OZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches EAI n A la PCR et le d p t
9. ertaines amorces une augmentation de la concentration en magn sium peut tre utile jusqu 2 5 mM C est particuli rement le cas en pr sence importante d EDTA un ch lateur des ions Mg Concentration finale en M Volume de MgCl solution de 25 mM dans 50 pl 2 5 mM 2 0 pl MgCl 25 mM fourni avec le conditionnement de 200 r actions r f OZYA003 200 D une mani re g n rale il est recommand d utiliser la concentration la moins lev e possible En effet une surconcentration de magn sium conduit des hybridations non sp cifiques pouvant g n rer des produits de PCR non souhait s dNTP la concentration en dNTP est optimis e dans le m lange Taq Ozyme Purple Mix Matrice la quantit optimale de matrice pour une PCR d pend essentiellement du type d ADN Nous recommandons pour une r action de 50 l Plasmide ou complexit ADN g nomique ou complexit quivalente e ALG Taq Ozyme 1 10 ng commencer avec 10 ng 50 500 ng commencer avec 200 ng Taq Ozyme HS 50 pg 10 ng commencer avec 10 ng 5 500 ng commencer avec 200 ng Taq Ozyme Purple Mix 1 10 ng commencer avec 10 ng 50 500 ng commencer avec 200 ng ADNc pr lever un aliquot du m lange r actionnel de transcription inverse Le volume de celui ci ne doit pas d passer 10 du volume r actionnel de la PCR 5 ul pour une r action de 50 pl IMPORTANT ne pas utiliser de l ADN solubilis dans une solution
10. s r actifs sont m lang s dans un micro tube st rile dans l ordre suivant Concentration R actif Volume finale Plasmide 10 ng ADNg 200 ng ADNc non dilu lt 5 pl q s p quantit suffisante pour 8 aliquot d un m lange r actionnel de transcription inverse 2 Le m lange r actionnel est vortex doucement puis centrifug bri vement pour rassembler l chantillon au fond du tube MU 0ZYA003 0912 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 4 Taq Ozyme Mix sOZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches PAPER a la PCR et le d p t sur gel 3 Programmation du thermocycleur Temp rature D naturation Initiale 95 C 2 min 1 Hybridation 55 C 30 sec 25 35 longation Extension finale ou Tm 5 C sur le Tm le plus bas des deux amorces si le Tm des amorces est diff rent de 60 C 1 min kb pour les amplicons gt 1 kb PROTOCOLE SPECI FI QUE PCR sur colonies La Taq Ozyme Purple Mix a t utilis e avec succ s pour l amplification d ADN plasmidique partir de colonies bact riennes sur milieu solide Nous recommandons de piquer une colonie fra che bien isol e de 1 2 mm avec un cure dent st rile et de resuspendre directement dans un m lange r actionnel de 50 ul final cf Protocole standard Programmation du thermocycleur pour PCR sur colonie tape Temp rature Temps
11. te ou 1 min kb pour les amplicons de plus de 1 kb Ce temps d longation est g n ralement suffisant pour toutes les matrices Pour les matrices de faible complexit ex plasmide il peut tre r duit 30 sec kb R SOLUTION DES PROBL MES 1 Absence de produits de PCR ou rendement faible Causes possibles Remarques Solutions Omission des composants non e V rifier la pr paration du m lange r actionnel et les volumes inclus dans le m lange Taq Ozyme utilis s Purple Mix Erreurs de pipetage e V rifier les concentrations dilutions de tous les composants e V rifier les conditions de stockage de tous les composants Si n cessaire tester chaque composant individuellement Composants d fectueux e Utiliser de l ADN purifi V rifier si l ADN est d grad ou endommag e V rifier la puret des amorces e Titrer la quantit de la matrice d ADN Augmenter la Quantit d ADN non optimale concentration finale voir section Matrice du chapitre Optimisations Concentration insuffisante de e Augmenter la concentration de MgCl fourni avec le MgCl ex pr sence d EDTA conditionnement 200 200XL et 1000 rxns par paliers de 0 5 mM Diminuer la temp rature d hybridation Id alement r aliser un gradient pour d terminer la temp rature d hybridation optimale Augmenter le temps d longation ou utiliser une enzyme mieux Conditions des cycles PCR non adapt e voir section Produits associ s
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