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I. Le cytosquelette d`actine

1. Figure 16 Dynamique du filament d actine Un filament d actine de longueur constante ne signifie pas qu il soit fig Les monom res ajout s au niveau de l extr mit sont renouvel s selon le principe du tapis roulant gt Adapt e de Molecular Cell Biology Lodish 5 me dition Recherche de partenaires de Bzz1p correspond l assemblage en t te queue de monom res d actine autour d un axe central formant une double h lice polaire d environ 7 8 nm de diam tre et 37 nm de p riodicit Holmes et al 1990 Lorenz et al 1993 Le processus de polym risation de l actine se d roule en trois tapes Carlier 1991 pr sent es dans la figure 15 la fixation d ions divalents induit un changement de conformation de l actine G cela permet d activer les complexes actine G ATP ion les rendant comp tents pour interagir entre eux la nucl ation est l tape permettant trois monom res d actine activ s de s assembler Ce trim re ou noyau de polym risation est la structure minimale n cessaire l longation d un filament l longation correspond a l ajout de monom res d actine sur les noyaux de polym risation Le filament d actine est en quilibre permanent entre la polym risation et la d polym risation et ces deux v nements ne se produisent pas de fa on gale a chaque extr mit du filament l assemblage des monom res pr domine l
2. O 9 w Les proteines PCH dans la dynamique membranaire c Les prot ines PCH dans la r gulation du cytosquelette OL Le cas de Bzz1p Ill OBJECTIFS CHAPITRE 2 RESULTATS RECHERCHE DES INTERACTIONS DES DOMAINES SH3 Il CRIBLE DE SURPRODUCTION DE BZZ1P Ill INTERACTIONS PROTEINE PROTEINES DE BZZ1P A Principe du ProtoArray gt 79 80 81 82 82 82 83 86 86 90 90 92 95 97 97 99 99 100 102 102 105 107 107 109 111 111 114 114 116 116 118 118 120 122 122 B Analyse de la liste des candidats potentiels obtenus 1 Aipip 2 Ast2p 3 Ypt32p 4 Prot ines non caract ris es C Etude ph notypique des souches d pourvues des g nes codants pour les candidats retenus 1 Croissance des mutants diff rentes temp ratures et sur diff rents milieux a Croissance diff rentes temp ratures b Croissance sur milieux hyper osmotiques c Croissance sur une source carbon e non fermentable d Croissance en pr sence de b nomyl 2 Recherche d un effet des diff rentes d l tions surle profil de bourgeonnement le cytosquelette d actine et l endocytose en phase fluide a Profil de bourgeonnement b Organisation du cytosquelette d actine c Observation de l endocytose en phase fluide 3 Localisation de Bzz1p GFP D Recherche d une interaction g n tique entre Bzz1p et certains de ses partenaires cellulaires potentiels IV INTERACTIONS DOMAINE SPECIFIQUE DE BZZ1P
3. 1 Le fluorophore La synth se du fluorophore a d j t pr c demment d crite Une chloration du 2 4 dihydroxybenzald hyde par la N chloropip ridine Bui et al 1990 puis une condensation avec l acide malonique conduit la formation du compos 7 Zhao et al 2004 Sch ma 8 Ox Ox ci cl 7 COOH On OH 6 7 Sch ma 8 Synth se du compos 7 a N chloropip ridine acide sulfurique aqueux p 77 b Acide malonique aniline pyridine p 80 2 Le motif NTA La synth se et le couplage du motif NTA se sont r v l s extr mement d licats du fait de l insolubilit d un produit comportant un triacide dans la plupart des solvants organiques Dans un premier temps nous avons tent de coupler le compos 7 sous forme d ester de succinimide avec l acide N 5 amino 1 carboxypentyl iminodiac tique ou NTA lysine donn par le Pr Horst Vogel de Lausanne selon un protocole pr c demment d crit Guignet et al 2004 Bri vement le NTA lysine ch lat des ions nickel Ni est couple par lamine primaire de la chaine lat rale de la lysine a un chromophore dont la fonction acide carboxylique est activ e par un ester de succinimide la r action se faisant en milieu aqueux pH basique Sch ma 9 ae O_O HO O_O a O_O g O coo III 2 O III par Cl Cl HN DE N GOO OH eut OH ates 7 COO 32 Sch ma 9 Tentative de synth se de la coumarine NTA adapt e de Guignet et a
4. Anax 260 nm 350nm faible ti2 ms 4 5 Dim thoxy 2 nitrobenzyle DMNB Faible a Carboxy 2 nitrobenzyle CNB 6 faible Amax 340 nm 6 tr s lev 350nm faible a Carboxy 4 5 dim thoxy 2 nitrobenzyle CDMNB 1 4 5 dim thoxy 2 nitrophenyl 2 2 2 trifluoroethyle DMNPT Faible 5 Carboxymethoxy 2 nitrobenzyle CMNB Ponne 6 faible 350nm faible Amax 360 nm 6 lev Amax 260 nm 350nm faible ti2 ms Tableau 1 Variations effectu es sur le groupement o nitrobenzyle d rendement quantique de la r action de photolyse t cin tique de la r action D veloppement d un fluorophore photoactivable IV Groupements photolabiles A Groupements o nitrobenzyles Les groupements ortho nitrobenzyles ont t introduits en 1970 par Patchornik et al 1970 et sont les groupements photolabiles les plus couramment utilis s ce sont les seuls avoir t utilis s a ce jour pour masquer la fluorescence d un fluorophore Historiquement la premi re fonction chimique masqu e par le groupement o nitrobenzyle est la fonction acide phosphorique de l ATP Engels et Schlaeger 1977 Ce groupement peut tre greff une biomol cule sur diverses fonctions chimiques et permet de r g n rer quantitativement ces fonctions apr s r action photochimique D un point de vue synth tique ce groupement a t greff avec succ s diverses fonctio
5. 7 Dans un ballon anhydre le compos 6 8 4 g 48 8 mmol et l acide malonique 10 16 g 97 7 mmol 2 qu sont dissous dans 44 mL de pyridine Sous argon et agitation 4 mL d aniline sont ajout s la r action est laiss e une nuit a temp rature ambiante Au matin il y a un pr cpit qui est dilu avec 70 mL d thanol pendant 1h a temp rature ambiante Puis la r action est filtr e et lav e avec de l acide chlorhydrique 0 1 M puis avec de l eau et enfin avec de l ther 9 37 g d un produit jaune sont obtenus p 80 HO A LO O CX ZA CIP db COOH RMN H CDCL 8 6 65 s 1H Hh 7 93 s 1H He 8 73 s 1H Hc 70 D veloppement d un fluorophore photoactivable RMN C DMSO D amp 103 7 s CH Ch 112 1 s C Cd 114 9 s C Cb 118 5 s C Cf 131 6 s CH Ce 149 2 s CH Cc 156 0 s C Ci 157 7 s C Cg 159 6 s Ca 164 9 s COOH H Na Na Bis carboxym thyl Ne carboxybenzyl L lysine 8 Dans un ballon l acide bromoac tique 11 1 g 80 25 mmol 2 5 qu est dissous dans 63 mL d hydroxyde de sodium NaOH 2 M et refroidit 0 C Une solution de Na benzyloxycarbonyl L lysine 9 g 32 1 mmol dans 49 mL d hydroxyde de sodium 2 M est ajout e goutte a goutte dans la solution d acide bromoac tique en m langeant dans un bain a 0 C Apres 2 h le bain refroidissant est enlev et la solution est m lang e sur la nuit a temp rature a
6. K Coumarine Lysine NTA SEM 11 Dans un ballon anhydre le compos 7 3 3 g 13 63 mmol 1 8 qu est dissous dans 28 mL de DMF anhydre et est refroidit 0 C Puis sous argon et agitation le N Hydroxysuccinimide 1 6 g 13 63 mmol 1 8 qu est ajout et la r action est laiss e 1 h 0 C Puis le DCC 3 1 g 15 00 mmol 2 qu est ajout et la r action est laiss e encore 30 min a 0 C puis 2 h temp rature ambiante Un m lange de NTA SEM 4 8 g 7 36 mmol et de DIEA 2 37 mL 13 63 mmol 1 8 qu dissous dans 18 5 mL de DMF anhydre est ajout la r action qui est encore laiss e 3 h temp rature ambiante Le brut est vapor sec puis neutralis avec de l eau et la phase aqueuse est extraite 3 fois avec du dichlorom thane Les phases organiques sont rassembl es s ch es par du sulfate de sodium anhydre filtr es et vapor es sec Le produit obtenu est purifi sur colonne de silice luant heptane ac tate d thyle 1 1 1 3 g d un solide jaune sont r cup r s p 20 i al oo HO 2 OO mo II irnNm lt ZA M lt 7 CI e b j 07 RMN H CDCL 5 0 02 s 27H Hl 0 96 t 6H Hk 1 26 1 75 m 6H He Hf et Hg 3 45 m 3H Hd et Hh 3 68 m 10H Hj et Hm 5 29 m 6H Hi 7 07 s 1H Ha 7 65 s 1H Hb 8 75 s 1H Hc L Ac Coumarine Lysine NTA SEM 12 Dans un ballon anhydre le compos 11 329 mg 0 38 mmol est dissous d
7. detection 30 min Figure 32 Principe du Protoarray Les prot ines d pos es sur la lame cercles ouverts bleus s hybrident avec la prot ine d int r t bleu clair tiqu t e avec l pitope V5 bleu fonc Ce dernier est reconnu par un anticorps anti V5 vert coupl l AlexaFluor 647 rouge Et la fluorescence correspondant une hybridation est lue par un scanner Figure 33 Constructions utilis es au cours de cette th se Les constructions avec les domaines SH3 ont t utilis es avec le Protoarray les autres avec les lipides sur membrane FCH Fes Cip Homology SH3 Src Homology 3 V5 pitope V5 His tiquette de 6 Histidines Les rectangles vert repr sentent le motif coiled coil 170 kDa 130 kDa ww 100 kDa 70 kDa u 55 kDa M 40 kDa sm 35 kDa 0 PM 1 2 3 4 Figure 34 Purification de Bzz1p fusionn e en C ou en N terminal par l tiquette V5 6xHis Lignes 1 Extrait prot ique de Bzz1p tiquet e en N terminal 2 Bzz1p tiquet e en N terminal purifi e 3 Extrait prot ique de Bzzip tiquet e en C terminal 4 Bzz1p tiquet e en N terminal purifi e Recherche de partenaires de Bzz1p prot ine de la puce et Bzzip sont ensuite r v l es par la fixation de l anticorps fluorescent anti V5 AlexaFluor647 et lues sur un scanner de lame Nous avons construit la prot ine Bzzip tiquet e en C e
8. 1996 The molecular structure of green fluorescent protein Nat Biotechnol 14 1246 1251 Yang S Cope M J and Drubin D G 1999 Sla2p is associated with the yeast cortical actin cytoskeleton via redundant localization signals Mol Biol Cell 10 2265 2283 Yeo D S Srinivasan R Uttamchandani M Chen G Y Zhu Q and Yao S Q 2003 Cell permeable small molecule probes for site specific labeling of proteins Chem Commun 2870 2871 Yin J Liu F Li X and Walsh C T 2004 Labeling proteins with small molecules by site specific posttranslational modification J Am Chem Soc 126 7754 7755 Young M E Cooper J A and Bridgman P C 2004 Yeast actin patches are networks of branched actin filaments J Cell Biol 166 629 635 Z Zhang J Campbell R E Ting A Y and Tsien R Y 2002 Creating New Fluorescent Probes for Cell Biology Nat Rev Mol Cell Biol 3 906 918 Zhang Z Smith B A Wang L Brock A Cho C and Schultz P G 2003 A new strategy for the site specific modification of proteins in vivo Biochemistry 42 6735 6746 Zhao Y Zheng Q Dakin K Xu K Martinez M L and Li W H 2004 New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications Am Chem Soc 126 4653 4663 Zhu H Bilgin M Bangham R Hall D Casamayor A Bertone P Lan N Jansen R Bidlingmaier S Houfek T et a
9. Ac Coumarine Lysine NTA tBuz 19 O P Q Cage Coumarine Lysine NTA tBu 17 R S T lt Ac Coumarine Lysine NTA 20 49 51 53 53 54 54 54 58 58 62 63 67 67 67 68 68 69 69 70 70 71 71 72 73 73 74 75 76 76 77 78 78 79 I CULTURE DES CELLULES HELA III INCUBATION AVEC LES DIFFERENTS DERIVES DE LA COUMARINE PARTIE 2 DYNAMIQUE ET RECHERCHE DE NOUVEAUX PARTENAIRES DE BZZ1P MEMBRE DE LA FAMILLE PCH CHAPITRE 1 INTRODUCTION LE CYTOSQUELETTE D ACTINE A Fonctions du cytosquelette d actine B Dynamique de la polym risation C Nucl ation de la polym risation de l actine 1 Le complexe Arp2 3 2 Les prot ines de la famille WASP Scar a Structure b R gulation D R gulation de la polym risation de l actine chez les mammif res I LE CYTOSQUELETTE D ACTINE CHEZ SACCHAROMYCES CEREVISIAE A Le cycle de vie de la levure B Organisation et fonctions du cytosquelette d actine chez la levure 1 Organisation du cytosquelette d actine au cours du cycle cellulaire 2 Fonctions de l actine chez la levure 3 Assemblage de l actine dans les diff rentes structures a Les taches corticales d actine le complexe Arp2 3 b Les c bles d actines les formines C Taches corticales d actine et endocytose 1 Ultrastructure N Mod le pour le d veloppement des taches corticales d actine et leur fonction La famille PCH G n ralit s
10. R ferences bibliographiques Moreau V Madania A Martin R P and Winson B 1996 The Saccharomyces cerevisiae actin related protein Arp2 is involved in the actin cytoskeleton J Cell Biol 134 117 132 Moseley J B and Goode B L 2005 Differential Activities and Regulation of Saccharomyces cerevisiae Formin Proteins Bni1 and Bnr1 by Bud J Biol Chem 280 28023 28033 Moseley J B and Goode B L 2006 The yeast actin cytoskeleton from cellular function to biochemical mechanism Microbiol Mol Biol Rev 70 605 645 Mulholland J Preuss D Moon A Wong A Drubin D and Botstein D 1994 Ultrastructure of the yeast actin cytoskeleton and its association with the plasma membrane J Cell Biol 125 381 391 Mulholland J Wesp A Riezman H and Botstein D 1997 Yeast actin cytoskeleton mutants accumulate a new class of Golgi derived secretary vesicle Mol Biol Cell 8 1481 1499 Mullins R D Heuser J A and Pollard T D 1998 The interaction of Arp2 3 complex with actin nucleation high affinity pointed end capping and formation of branching networks of filaments Proc Natl Acad Sci USA 95 6181 6186 Mullins R D Stafford W F and Pollard T D 1997 Structure subunit topology and actin binding activity of the Arp2 3 complex from Acanthamoeba J Cell Biol 136 331 343 Munn A L Stevenson B J Geli M I and Riezman H 1995 end5 end6 and end7 mutations that caus
11. tre un lien entre l assemblage de l actine et la courbure des membranes lll Objectifs Mon projet de these consistait a affiner la localisation et la dynamique de Bzz1p au sein du cytosquelette d actine En attendant de pouvoir utiliser notre nouvelle sonde photoactivable j ai voulu d terminer de nouveaux partenaires de Bzz1p afin de mieux appr hender son r le dans le d veloppement des taches corticales d actine et ventuellement dans d autres tapes du trafic intracellulaire Comme Bzz1p fait partie de la famille PCH ses partenaires potentiels peuvent tre des prot ines ou des lipides Nous avons cherch parmi ces deux types de partenaires possibles Dans le chapitre suivant je d cris les r sultats obtenus dans cette recherche de nouvelles interactions pour Bzz1p 116 Chapitre 2 R sultats 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 1 Cdc25 9 Lsb2 17 Myo5 25 Sla1 1 2 Lsb1 10 Bud14 18 Rvs167 26 Sla1 2 3 Hse1 11 Naf1 19 Nbp2 27 Sla1 3 4 Sho1 12 Bbc1 20 Abp1 28 Lsb4 5 Bzz1 1 13 Lsb3 21 Boi1 29 Myo5 Th2 6 Fus1 14 Sdc25 22 Boi2 30 vecteur vide 7 Bzz1 2 15 Hof1 23 Bem1 1 31 billes seules 8 Pex13 16 Myo3 24 Bem1 2 Figure 30 Interaction des diff rents domaines SH3 avec Las17 GFP Diff rents domaines SH3 en fusion avec la GST ont t produits dans E coli et fix s sur billes GST S pharose Un extrait prot ique de levure issu d une souche Las17 GFP a t incu
12. A Friant S Fitterer C Orange C Kaneva G Mirey G and Winsor B 2005 The WASP Las17p interacting protein Bzz1p functions with Myo5p in an early stage of endocytosis Protoplasma 226 89 101 Soulard A Lechler T Spiridonov V Shevchenko A Li R and Winsor B 2002 Saccharomyces cerevisiae Bzz1p is implicated with type myosins in actin patch polarization and is able to recruit actin polymerizing machinery in vitro Mol Cell Biol 22 7889 7906 Southern J A Young D F Heaney F Baumgartner W K and Randall R E 1991 Identification of an epitope on the P and V proteins of simian virus 5 that distinguishes between two isolates with different biological characteristics J Gen Virol 72 Pt 7 1551 1557 Specht A and Goeldner M 2004 1 o Nitrophenyl 2 2 2 trifluoroethyl ether derivatives as stable and efficient photoremovable alcohol protecting groups Angew Chem Int Ed Engl 43 2008 2012 Specht A Thomann J S Alarcon K Wittayanan W Ogden D Furuta T Kurakawa Y and Goeldner M 2006 New photoremovable protecting groups for carboxylic acids with high photolytic efficiencies at near UV irradiation Application to the photocontrolled release of L glutamate Chembiochem 7 1690 1695 Stewart F H C 1968 The p methoxybenzyl ester group in peptide synthesis Austr J Chem 21 2543 2550 Stossel T P 1993 On the crawling of animal cells Science 260 1086 1094
13. A 1 3 4 dim thoxyph nyl 2 2 2 trifluoro thanone 1 Dans un ballon anhydre le 4 bromo 1 2 dim thoxybenz ne 8 5 mL 59 mmol est dilu dans 100 mL de t trahydrofuranne THF anhydre A 78 C sous argon et agitation le butyllithium 40 6 mL 64 5 mmol 1 1 qu est ajout Apr s 1 ha 78 C formation d un pr cipit blanc le trifluoroac tate d thyle 7 1 mL 70 8 mmol 1 2 qu est ajout Apr s 1 h 78 C le milieu est neutralis par une solution d hydrog nocarbonate de sodium satur e et la phase aqueuse est extraite 3 fois par du dichlorom thane Les phases organiques sont rassembl es s ch es par du sulfate de sodium anhydre filtr es et vapor es a sec Le solide est cristallis avec de l heptane et filtr 10 0 g d un solide blanc sont r cup r s p 72 FC O e a do On C RMN H CDCL 5 3 96 et 4 00 2s 6H Hc et Hd 6 96 d J 8 4 Hz 1H Hb 7 58 s 1H He 7 74 d J 8 4 Hz 1H Ha 67 D veloppement d un fluorophore photoactivable B 1 2 nitro 4 5 dim thoxy ph nyl 2 2 2 trifluoro thanone 2 Dans un ballon anhydre le compos 1 2 72 g 11 6 mmol est dissous dans 14 mL d acide sulfurique 95 Puis 0 C sous argon et agitation on ajoute de l acide nitrique 68 538 uL 12 2 mmol 1 05 qu dissous dans 2 6 mL d acide sulfurique 95 Apr s 10 minutes 0 C le milieu est neutralis avec de l eau glac e puis la pha
14. Amplification enzymatique de l ADN par PCR Polymerase Chain Reaction MANIPULATIONS CONCERNANT LES PROTEINES Pr paration d extraits prot iques bruts Extraits prot iques de Saccharomyces cerevisiae Extraits prot iques d Escherichia coli Expression purification et utilisation d une prot ine fusionn e 6xHistidines La prot ine est soluble La prot ine est insoluble Conservation des extraits prot iques D termination de la concentration en prot ines S paration lectrophor tique des prot ines Coloration des prot ines dans un gel de polyacrylamide SDS Western blotting Protoarray Invitrogen 155 156 156 156 157 157 157 158 158 158 159 159 159 159 160 160 160 160 160 161 161 161 161 162 162 162 162 163 163 163 164 164 164 165 165 166 I PIP Strip Membrane 166 VI METHODES CYTOLOGIQUES APPLIQUEES A LA LEVURE 167 A Fixation des cellules 167 B Marquage par des colorants 167 1 Phalloidine coupl e au TRITC 167 2 Lucifer Yellow CH 167 3 Calcofluor White 168 C Microscopie acquisition et traitement des images 168 CONCLUSION 171 R F RENCES BIBLIOGRAPHIQUES 172 ANNEXES 191 Liste des illustrations Figure 1 Excitation mono et bi photonique Figure 2 Localisation de l excitation par excitation mono et bi photonique Sch ma 1 Structure de diff rents fluorophores photoactivables Tableau 1 Variations effectu es sur le groupement o nitrobenzyle Sch ma 2 Groupement
15. De plus les domaines SH3 de Bzz1p sont capables de recruter la machinerie de polym risation de l actine dans un test in vitro D autre part Bzz1p interagit avec Myo5p et ces deux prot ines agissent ensemble dans la repolarisation du cytosquelette d actine apres un stress salin Enfin la destination des cargos n est pas affect e dans les souches myo5A bzz1A Soulard et al 2005 A la fin de sa these il a d velopp un mod le du r le de Bzz1p dans le cytosquelette d actine Figure 29 Tres r cemment Sun et al 2006 ont apport des pr cisions sur le r le de Bzz1p dans le d veloppement des taches corticales d actine Bzz1p purifi e libere Las17p de son inhibition par les domaines SH3 de Slalp de fa on dose d pendante Cette lev e d inhibition requiert les domaines SH3 de Bzz1p Ceci r v le un nouveau m canisme pour l activation d une prot ine de la famille WASP dans laquelle l inhibition de l activit NPF par une prot ine contenant un domaine SH3 est lev e par une autre prot ine contenant un domaine SH3 De plus Bzz1 GFP reste associ e la membrane plasmique durant l internalisation endocytique comme Las17p Sun et al 2006 D autre part il semblerait que Bzz1p soit recrut e aux taches corticales imm diatement avant que la polym risation de l actine soit initi e ce qui est coh rent avec le fait que Bzz1p leve l inhibition de Las17p par Sla1p Ainsi Bzz1p est un composant endocytique qui pourrait
16. Kar9p Prot ine de liaison aux microtubules Myo2p Myosine de type V transport des cargos Myo1p chaine lourde de la myosine de type II S lection du site de bourgeonnement et polarit Bud1p GTPase de type Ras Bud2p GAP de Budip Bud5p GEF de Budip Cdc24p GEF de Cdc42p Cdc42p GTPase de type Rho Rgaip GAP de Cdc42p 12 Bemip Prot ine adaptatrice Bem2p GAP de Cdc42p Bem3p GAP de Cdc42p Prot ine de coiffe de l actine Sac p Fimbrine Tpm1 Tpm2p Tropomyosine Cap1 Cap2p prot ine de coiffe Crnip Coronine Iqg1p Cyk1p Homologue IQGAP Aip1p D polym risation de l actine Prot ines d chafaudage et adaptatrices de la clathrine Clc1p Clathrine Ede1p Homologue de Eps15R Entip Homologue des epsines Ent2p Homologue des epsines Sla2p Homologue HIP1R Scd5p Yap1801p Homologue AP180 Yap1802p Homologue AP180 Kinases intervenant dans le m tabolisme des phosphoinositides ab1p 1 phosphatidylinositol 3 phosphate 5 kinase Mss4p Phosphatidylinositol 4 phosphate 5 kinase Vps34p Phosphatidylinositol 3 kinase 13 Avant propos Avant Propos L actine est une prot ine essentielle et repr sente avec les prot ines qui s y associent 25 des prot ines totales d une cellule Les microfilaments d actine sont des polym res formant un cytosquelette une architecture interne la cellule Celui ci est hautement organis et assure la cellule sa forme et ses propri t s m caniques et dynamiques Sa d sorganisatio
17. Le motif NTA tant synth tis sur l amine primaire de la chaine principale il est n cessaire de prot ger l autre amine GP1 Pour la synth se du motif NTA le motif triacide est prot g sous forme d ester afin d obtenir un compos soluble dans un solvant organique Il faut donc choisir un groupement protecteur GP2 s enlevant proprement afin d obtenir un produit final facilement purifiable Pour finaliser cette synth se nous avons du essayer plusieurs couples de groupements protecteurs a Cbz SEM Pour le choix des groupes protecteurs des diff rentes fonctions dans le but d optimiser le nombre d tape de synth se nous avons opt pour le groupement 2 trim thylsilyl thoxy m thyl ou SEM GP2 pour la protection des acides carboxyliques du NTA il s enl ve en pr sence d ions fluorures Le carbamate de type carboxybenzyle ou Cbz GP1 a t choisi pour prot ger la fonction amine en position de la lysine ce groupement s enlevant par hydrog nolyse catalys e par le palladium La synthese est pr sent e dans le sch ma 11 Pour obtenir le motif NTA deux mol cules d acide bromoac tique ont t substitu es sur l amine primaire de la chaine principale de la lysine Ho et al 1998 Hochuli et al 1987 Ensuite les trois acides ont t est rifi s par le groupement SEM puis l amine a t d prot g e par hydrog nolyse Ce groupement a alors pu tre coupl en position 3 s
18. M Chin J W Anderson J C and Schultz P G 2003 Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae Am Chem Soc 125 11782 11783 Denk W Piston D W and Webb W W 1995 Two photon molecular excitation in laser scanning microscopy In Handbook of Biological Confocal Microscopy 2 edn J B Pawley ed Plenum Press New York pp 445 458 Denk W Strickler J H and Webb W W 1990 Two photon laser scanning fluorescence microscopy Science 248 73 76 Denk W and Svoboda K 1997 Photon upmanship why multiphoton imaging is more than a gimmick Neuron 18 351 357 Derry J M Ochs H D and Francke U 1994 Isolation of a novel gene mutated in Wiskott Aldrich syndrome Cell 79 following 922 Dorman G and Prestwich G D 2000 Using photolabile ligands in drug discovery and development Trends Biotechnol 18 64 77 Dorn T Neumaier K R and Tamp R 1998 Molecular Recognition of Histidine Tagged Molecules by Metal Chelating Lipids Monitored by Fluorescence Energy Transfer and Correlation Spectroscopy Am Chem Soc 120 2753 2763 Drubin D G Jones H D and Wertman K F 1993 Actin structure and function roles in mitochondrial organization and morphogenesis in budding yeast and identification of the phalloidin binding site Mol Biol Cell 4 1277 1294 Dulic V Egerton M Elguindi l Raths S Singer B and Riezman H 199
19. Slaip Sac p etc pour revue Ayscough 1998 Pruyne et Bretscher 2000a Ces prot ines sont troitement impliqu es dans l assemblage l organisation et ou la fonction des diff rentes structures d actine F qu elles constituent L anneau de cytocin se est constitu principalement d actine F et de Myo1p mais aussi de septines et de Iqgip et des formines pour revue Bi 2001 2 Fonctions de l actine chez la levure La production de mutants conditionnels du g ne ACTI a permis de mieux comprendre les fonctions du cytosquelette d actine chez la levure Ainsi Novick et Botstein 1985 ont mis en vidence que des mutations act1 1 et act1 2 provoquaient de nombreux phenotypes diff rents dans les cellules d polarisation du cytosquelette d actine accumulation de structures aberrantes d actine arr t de la croissance du bourgeon d fauts de cytocin se d p t al atoire de chitine dans la paroi d faut de s cr tion osmosensibilt des cellules bourgeonnement al atoire des cellules diplo des etc Ces d fauts impliquent le cytosquelette d actine dans de nombreux processus cellulaires tels que la croissance polaris e le trafic intracellulaire la cytocin se et la synth se de la paroi D autres tudes sur l actine et ces prot ines associ es ont galement d montr le r le du cytosquelette d actine lors de l tape d internalisation de 100 Las17 WH1 B pp PP PPPPPP 1 633 Abp1 al la
20. TEA CH2CI2 0 C puis 1 h TA r 87 g TFA CH2Cl2 5 h TA r quantitatif D veloppement d un fluorophore photoactivable C Cbz tBu Nous avons alors choisi de nouveau le groupement Cbz GP1 pour prot ger la fonction amine et le groupement tert butyle tBu GP2 pour les fonctions acides carboxyliques Celui ci peut tre facilement enlev par l acide trifluoroac tique TFA dans du dicholorom thane La construction du motif NTA a t faite comme d crit par Dorn et al 1998 et Lata et al 2005 Brievement le tert butyl Ne benzyloxycarbonyl L lysine est alkyl deux fois par le bromoac tate de tert butyle en position Na de la lysine Apr s hydrog nolyse le compos 15 est obtenu Il est alors coupl au compos 7 comme d crit pr c demment puis la cage par un couplage de Mistunobu Mitsunobu 1981 ou la coumarine est ac tyl e comme d crit pr c demment Puis les trois acides sont d prot g s avec de l acide trifluoroac tique Et cette fois ci la d protection tait propre Schema 13 3 Les cages Nous nous proposions d utiliser le groupement photolabile pr c demment d crit le compos 4 Sch ma 14 Specht et Goeldner 2004 cf section de ce chapitre Cependant apres bien des essais nous n avons pas pu obtenir le d riv diazo thane n cessaire pour r agir avec la fonction ph nol de la coumarine Par la suite cette nouvelle cage s est r v l e tre d un
21. Toshima et al 2005 Ceci permet de supposer que les NPFs liant les monom res d actine comme Las17p pr sentent leur sous unit d actine li e la surface du complexe Arp2 3 pour faciliter la nucl ation et les NPFs liant les filaments d actine permettent de recruter le complexe Arp2 3 sur le c t de filaments pr form s pour stimuler la nucl ation Les cinq NPFs colocalisent partiellement avec le complexe Arp2 3 et leur premi re fonction est d activer l assemblage de l actine m di par le complexe Arp2 3 Cependant chaque NPF arrive une tape diff rente dans le d veloppement des taches corticales 102 Recherche de partenaires de Bzz1p voir section suivante ceci sugg re qu ils agissent s quentiellement et ou des sites diff rents sur le complexe Arp2 3 Kaksonen et al 2003 Las17p Bee1p ne poss de pas de domaine GBD et ne se lie pas directement aux GTPases de type Rho Li 1997 In vitro Las17p purifi e est active suggerenat qu elle n est pas auto inhib e et peut promouvoir l assemblage de l actine m di e par le complexe Arp2 3 de mani re constitutive Rodal et al 2003 Deux ligands connus de Las17p Sla1p et Bbc1p Li 1997 Tong et al 2002 inhibent directement Las17p mais sans abolir son activit Rodal et al 2003 Las17p n tant pas autoinhib e comme les prot ines WASPs contenant un GBD son activit serait contr l e par transinhibition De plus Las17p a de no
22. Xu et Webb 1996 Xu et Webb 1997 Zipfel et al 2003 Ainsi en th orie en excitation a deux photons un chromophore absorbe deux photons non r sonants de la m me longueur d onde simultan ment dans la femtoseconde pour produire un tat excit lectroniquement lequel peut subir des proc d s photophysiques ou photochimiques tel que la fluorescence la phosphorescence ou une r action chimique Les deux photons exploitent l tat d excitation virtuel d livrant la m me nergie qu un seul photon d une longueur d onde deux fois plus faible Figure 1 Dans une photolyse m di e par une excitation bi photonique telle que la lib ration d une biomol cule partir d un pr curseur photolabile apr s excitation les tapes m canistiques sont identiques celles observ es apr s une excitation mono photonique conventionnelle La probabilit d absorption de deux photons simultan ment d pend du carr de l intensit de la lumi re c est pour cette raison qu il est n cessaire d utiliser des lasers puls s qui ont une forte intensit lumineuse Le r sultat est que l excitation se produit seulement au point focal du faisceau lumineux le volume focal pouvant tre d environ 1 um Les principaux avantages de l excitation deux photons sont que la zone excit e est tres petite intrins quement confocale Figure 2 la fluorescence hors plan focal n existe quasiment pas et elle permet une p n tratio
23. and Bretscher A 1995 Parallel secretory pathways to the cell surface in yeast J Cell Biol 131 297 310 Hatchard C G and Parker C A 1956 A new sensitive chemical actinometer Il Potassium ferrioxalate as a standard chemical actinometer Proc Roy Soc A235 518 536 177 R ferences bibliographiques Hauser C T and Tsien R Y 2007 A hexahistidine Zn2 dye label reveals STIM1 surface exposure Proc Natl Acad Sci USA 104 3693 3697 Helmchen F and Denk W 2002 New developments in multiphoton microscopy Curr Opin Neurobiol 12 593 601 Helmchen F and Denk W 2005 Deep tissue two photon microscopy Nat Methods 2 932 940 Henry K R D Hondt K Chang J S Nix D A Cope M J Chan C S Drubin D G and Lemmon S K 2003 The actin regulating kinase Prk1p negatively regulates Scd5p a suppressor of clathrin deficiency in actin organization and endocytosis Curr Biol 13 1564 1569 Hicke L 1999 Gettin down with ubiquitin turning off cell surface receptors transporters and channels Trends Cell Biol 9 107 112 Higgs H N and Pollard T D 2000 Activation by Cdc42 and PIP 2 of Wiskott Aldrich syndrome protein WASp stimulates actin nucleation by Arp2 3 complex J Cell Biol 150 1311 1320 Higgs H N and Pollard T D 2001 Regulation of actin filament network formation through ARP2 3 complex activation by a diverse array of proteins Annu Rev Biochem 70
24. est r v l e inefficace En effet il tait possible de prot ger seulement deux des trois fonctions acides du motif NTA Le troisi me acide ne doit pas tre accessible ceci peut s expliquer par une plus grande g ne st rique des trois groupements PMB par rapport au trois groupements SEM Nous tions de nouveau confront s au choix d un nouveau couple de groupements protecteurs oa COOH O oN NH a H if H b O da did Pee agar cabe doli H O r__ COOH Br O_N N O COOH O COOH m IN en O O ri OMe OMe Sch ma 12 Strat gie Alloc PMB a NaOH 2 M 2 h 0 C puis une nuit a TA puis 2 h 50 C addition de HCl 1 M p 50 b TEA DMF 0 C puis une nuit TA 51 o lt COOtBu N A ok R DA Ne HN O_N NH2 O ar rere a H OLN N A R OO Bn coou Y COOtBu Ea o O 14 15 oe HO OZO es a SNS N COOtBu we COOtBu 16 o NO 5 A ox d a MeO O OMe NO Z O ci f O O a LL eier Bowe N _ COOtBu Z O COOtBu A MeO al Ma ons HN B 19 COOtBu OMe 17 HN g COOtBu e O T O_O nes L O COOH H HN l COOH aan ALL no OMe HN N_COOH 20 COOH 18 COOH Est rases h cellulaires y HO O_O a 2 O COOH HN N _COOH ET gt COOH Sch ma 13 Strat gie Cbz tBu a DIEA DMF une nuit 55 C r 98 b H2 Pd C MeOH 24 h TA r 98 c NHS DCC DIEA DMF 2h a 0 C r 45 d PPh3 DIAD benz ne une nuit TA r 65 e TFA CH2Cl2 4h TA r 93 f
25. extr mit du bourgeon lors de sa croissance apicale puis se redistribuent al atoirement dans le bourgeon lors de la croissance isotropique Pendant ces phases les c bles d actine restent polaris s Le long de l axe cellule m re cellule fille En fin de phase M les taches corticales d actine et les c bles sont distribu s al atoirement entre la cellule m re et la cellule fille L anneau d acto myosine se forme au niveau de l tranglement de la cellule fille se contracte puis se d sassemble Apr s cette tape de cytocin se les taches corticale et les c bles des cellules m res et filles se repolarisent au niveau du site de division afin de permettre la synth se de la paroi entre les deux nouvelles cellules Lors de la conjugaison les taches corticales se concentrent l extr mit des projections et les c bles d actine convergent vers cette extr mit Figure 22 Apr s la formation du zygote les taches corticales et les c bles sont polaris s vers la nouvelle cellule diplo de qui se forme au centre entre les deux cellules haplo des Les trois diff rentes structures mentionn es sont constitu es d actine F en association avec un nombre important d autres prot ines Les c bles d actines contiennent entre autres de la tropomyosine Tpm1 et 2p et de la fimbrine Sac p Les taches corticales sont constitu es par de nombreuses prot ines telles que le complexe Arp2 3 Las17p Vrp1p Abp1p Panip
26. les n cessaires pour valider notre strat gie d tiquetage d une prot ine par un fluorophore photoactivable dans des cellules 65 D veloppement d un fluorophore photoactivable de mammif res HeLa et de levure Saccharomyces cerevisiae nous pourrons alors tudier la dynamique de prot ines r gulant l assemblage du cytosquelette d actine dans les taches corticales d actine dans des levures bourgeonnantes comme cela tait initialement pr vu 66 Chapitre 4 Partie exp rimentale D veloppement d un fluorophore photoactivable Chapitre 4 Partie exp rimentale Les r actifs sont obtenus aupr s des compagnies Lancaster Sigma Aldrich Fluka Acros ou Janssen et ils sont utilis s tel quels Les solvants anhydres ont t obtenus apr s distillation en utilisant comme dess chant le sodium et la benzoph none pour le THF Uhydrure de calcium pour l ther thylique l ac tonitrile et le dichlorom thane a partir de bouteilles commerciales neuves Ethanol M thanol DMF DMSO Pyridine Dioxanne Benz ne rendues herm tiques et stock es sur tamis mol culaire 3 pr alablement activ 24 heures par chauffage 250 C sous vide pouss 10 mm Hg Ces stocks ne sont utilis s qu apr s incubation sur la z olite pendant 24 heures Pour la caract risation des produits en RMN les d placements chimiques not s 8 sont en ppm Les constantes de couplage J sont en Hz I Syntheses
27. maintenir en culture Elles nous sont fournies par la plateforme de culture cellulaire l IGBMC Strasbourg Toutes les exp riences n cessitant un microscope ont t r alis es avec l aide de Pascal Kessler la plateforme d imagerie cellulaire de l IGBMC dirig e par Jean Luc Vonesch 1 Entr e cellulaire O O O ER T ES O Ja O O_O o O O_O al PS9 Po ALL o o Les HN N lt HN N D O HN N K o lt e 24 gt 19 K zou 07707 22ni2s O Sch ma 16 Structure des compos s 19 20 Ni et 22 Ni Pour la mise au point des conditions d entr e dans les cellules nous avons utilis le compos 19 Sch ma 16 En effet cette mol cule est facilement perm able la membrane cellulaire du fait de la pr sence des trois tBu bien qu elle soit plus difficile solubiliser dans un milieu aqueux que son d riv d prot g Les cellules sont pr alablement mises en culture sur des lamelles de verre d coup es en plusieurs puits ce qui permet d observer les cellules vivantes Les cellules sont incub es 37 C avec La mol cule dans du tampon HBSS pH 7 35 une concentration finale de 1 uM pendant 30 minutes Apr s plusieurs lavages celles ci sont alors observ es au microscope quip d un objectif X 63 et d une platine chauffante 37 C Une forte fluorescence est observ e dans pratiquement tout le cytoplasme cellulaire excitation 405 nm fen tre d mission de 410 510 nm ce qui signifie qu
28. ou une sensibilit diff rents produits ou des d fauts morphologiques ou cytologiques etc peuvent nous aider d terminer si un processus cellulaire connu est impliqu Ainsi une meilleure caract risation du g ne d int r t est alors possible Pour ces exp riences 130 WT Calcofluor White Tableau 10 Analyse ph notypique des effets des d l tions des diff rents candidats dans diff rentes conditions de croissance croissance normale Recherche de partenaires de Bzz1p nous avons utilis Les souches d l t es provenant de la banque du projet de d l tion du g nome de Saccharomyces cerevisiae http www sequence stanford edu group yeast_ deletion_project deletions3 html Cette d marche par la g n tique va de pair avec une confirmation de l interaction des deux prot ines in vitro et in vivo 1 Croissance des mutants diff rentes temp ratures et sur diff rents milieux a Croissance diff rentes temp ratures Nous avons recherch si les souches de levure d pourvues d une des prot ines candidates taient plus sensibles l augmentation de la temp rature de croissance Pour cela les souches haplo des de la banque de d l tion ainsi que la souche sauvage ont t cultiv es dans du milieu YPD une nuit 25 C Ensuite une m me quantit de cellules sont d pos es sous forme de goutte sur du milieu YPD ou SC que l on incube diff rentes temp ra
29. per sha 1 592 so DE EE 1 666 65 1480 Myo3 Myo5 MOTOR 1Q TH1 Er sus la 1 1271 Figure 23 Les cinq NPFs de levure Le domaine de liaison l actine propos pour chaque NPF est color en rouge les domaines acides sont en jaune Las17p lie l actine G tandis que Abp1p Pan1p et Myo3 5p lient sp cifiquement l actine F Pan1p contient plusieurs sites consensus de phosphorylation par Ark1 Prk1p dans LR1 et LR2 indiqu s par des P entour s acide B basique CC coiled coil EH Eps15 homology IQ liaison IQ LR longue r p tition PP ou PPP polyproline SH3 Src homology 3 TH1 2 tail homology 1 2 WH1 2 WASp homology 1 2 Adapt e de Moseley et Goode 2006 Recherche de partenaires de Bzz1p l endocytose Kubler et Riezman 1993 et le transport des organites tels que les mitochondries la vacuole et le noyau Symons et al 1996 ainsi que dans le transport polaris d ARNm vers le bourgeon et de la diff renciation des cellules lors de la conjugaison Cali et al 1998 De mani re g n rale le cytosquelette d actine assure la polarisation de la croissance chez Saccharomyces cerevisiae Chacune des trois structures d actine F semble exercer des fonctions diff rentes Ainsi les c bles d actines assembl s par les formines sont impliqu s principalement dans le transport polaris des cargos dans le bourgeon Ces cargos sont les v sicules de s cr tion les organites ou
30. risation de ce fluorophore se sont r v l es d licates Il semblerait que le compos ReAsH ne soit pas stable pendant les tapes de purification De plus malgr de nombreuses tentatives il ne m a pas t possible d obtenir une r sorufine coupl e a un groupement photolabile Dans la litt rature une r sorufine iodoac tate cag e a t d crite Theriot et Mitchison 1991 Le pr curseur du groupement photolabile tait le 1 2 nitroph nyl diazo thane or a ce moment du projet la cage que nous voulions greffer tait le 1 choro 1 2 nitro 4 5 dim thoxy ph nyl 2 2 2 trifluoro thyle compos 4 car la synth se du d riv diazo thane correspondant est tres difficile Malgr de nombreuses tentatives de couplage via des r actions de substitution nucl ophile entre la r sorufine et le compos 4 le produit d sir n a pas t obtenu Il semble donc qu une r action de substitution nucl ophile soit difficile mettre en place pour obtenir un d riv O alkyl de la r sorufine Ces essais infructueux m ont conduite a adopter une nouvelle strat gie qui s appuie sur des travaux r cents Guignet et al 2004 Zhao et al 2004 une coumarine photoactivable ayant un motif Ni NTA capable de lier des prot ines tiquet es avec des polyhistidines Apr s plusieurs tentatives de synth se en utilisant divers groupes protecteurs diff rentes cages du laboratoire nous avons finalement obtenu le compos 18
31. se de la coumarine photoactivable Sch ma 11 Strat gie Cbz SEM 18 20 23 25 27 27 27 28 28 30 32 34 36 38 38 40 41 43 44 45 A7 A7 48 49 Sch ma 12 Strat gie Alloc PMB Sch ma 13 Strat gie Cbz tBu Sch ma 14 Groupements photolabiles du laboratoire Tableau 4 Propri t s photophysiques de la coumarine et ses d riv s dans un tampon phosphate pH 7 4 Sch ma 15 R action de photofragmentation Figure11 Suivie de la r action de photofragmentation Figure 12 Spectres d mission des d riv s de coumarine Sch ma 16 Structure des compos s 19 20 Ni et 22 Ni Figure 13 Imagerie par fluorescence de cellules HeLa charg es avec les compos s 19 20 Ni et 22 Ni Figure 14 Tests par imagerie de fluorescence de la toxicit du compos 22 charg dans les cellules HeLa Figure 15 Processus de polym risation de l actine Figure 16 Dynamique du filament d actine Tableau 5 Nomenclature des prot ines du complexe Arp2 3 Figure 17 Arp2 3 et le r seau d actine Figure 18 Les prot ines de la famille WASP Figure 19 Partenaires de WASP et WAVE Figure 20 Ensemble des prot ines interagissant avec l actine Figure 21 Le cycle de vie de la levure Saccharomyces cerevisiae Figure 22 Organisation du cytosquelette d actine durant le cycle cellulaire de S cerevisiae Figure 23 Les cinq NPFs de levure Figure 24 R gulation de la polari
32. t est remplac par une cassette KanMX4 qui conf re la r sistance la g n ticine G418 SLW571WK MATa myo5A TRP1 bzz14 kanMX4 his3 A200 ura3 52 FY1679 MATa MATa his3 A200 HIS3 leu2 A1 LEU2 trp1 A63 TRP1 ura3 52 ura3 52 Cette souche est un d riv cong nique de la souche S288C Winston et al 1995 SD100 MATa leu2 rme1 trp1 his3 ura3 GAL HMLa TOF3 mss4 HISMX6 Ycplac111 MSS4 Souche sauvage contr le de SD102 SD102 MATa leu2 rme1 trp1 his3 ura3 GAL HMLa TOF3 mss4 HISMX6 Ycplac111 mss4 2ts FY833 MATa leu2 lys2 trp1 his3 ura3 52 GAL2 Souche sauvage contr le de fab1A fab14 MATa leu2 lys2 trp1 his3 fab1 HIS3 ura3 52 GAL2 156 Recherche de partenaires de Bzz1p MH565 Mata leu2 3 112 ura3 52 his3 A200 trp1A901 lys2 801 suc2 A9 GAL Souche sauvage contr le de MH566 MH566 Mata leu2 3 112 ura3 52 his3 4200 trp14901 lys2 801 suc2 A9 GAL Avps34 TRP1 B Conditions et milieux de culture et conservation La culture de la levure Saccharomyces cerevisiae se fait soit en milieu liquide soit sur milieu solide La temp rature optimale de croissance des levures est de 30 C Milieu Complet YPG extrait de levure 1 P bactopeptone 1 glucose 2 P Milieu Complet Synth tique CSM ou Complete Synthetic Medium Yeast Nitrogen Base YNB 0 67 P glucose 2 avec addition de tous les acides amin s et les bases Milieu de s lection CSM moins un ou plusieurs acides am
33. tant un effecteur de Yptip qui r gule l arrimage et la fusion de v sicules entre le r ticulum endoplasmique et l appareil de Golgi tablissant ainsi une voie de signalisation dans l exocytose Wang et Ferro Novick 2002 4 Prot ines non caract ris es Nom prot ine Ykr018cp Yer128wp Ydr428cp Ycr076cp Taille en aa 730 203 261 250 Interactants Vps4p Ptacek et al Srpip lto et Es connus 2005 une ATPase al 2001 a Sec27p Ho et requise pour un transport al 2002 efficace des endosomes d tardifs la vacuole Remarques Fonction prot ine impliqu e dans Potentielle Fonction inconnue l endocytose et le tri des alpha beta inconnue vacuoles serine hydrolase C Etude ph notypique des souches d pourvues des g nes codants pour les candidats retenus La recherche de la fonction d un g ne non caract ris est un projet pouvant s av rer long et hasardeux IL est alors utile d appr hender cette tape de fa on syst matique en utilisant des tests pr d finis La premi re tape d une telle approche consiste g n ralement d terminer les ph notypes r sultants de la d l tion du g ne d int r t dans diff rentes conditions de croissance Ces prot ines de fonctions inconnues sont toutes cod es par des g nes non essentiels ce qui permet l analyse directe des souches d l t es pour chaque g ne Des d fauts de croissance diff rentes temp ratures
34. un bourgeonnement bipolaire dans les cellules haplo des La d termination du profil de bourgeonnement est r alis e gr ce la d tection de la chitine concentr e dans les cicatrices par la coloration au Calcofluor White Nous avons donc color des cellules haplo des sauvages et comportant la d l tion des diff rents candidats retenus au Calcofluor Comme le montre la figure 35 les cellules des diff rentes souches mutantes haplo des bourgeonnent comme les cellules sauvages de mani re axiale 25 C De plus aucun d faut dans la r partition de la chitine n est observ chez ces mutants Ceci sugg re que la s lection du site de bourgeonnement et la s cr tion polaris e des composants de la paroi cellulaire ne sont pas affect es par les diff rentes d l tions b Organisation du cytosquelette d actine Nous nous sommes galement int ress s l organisation du cytosquelette d actine dans les souches mutantes L actine polym ris e existe sous trois formes chez la levure de boulanger les c bles d actine les taches corticales d actine situ es sous la membrane plasmique et un anneau d actomyosine situ l tranglement entre la cellule m re et la cellule fille lors de la cytocin se Ainsi les cellules sauvages ou mutantes sont cultiv es une nuit 25 C puis fix es et color es avec de la phallo dine une drogue se fixant sp cifiquement l actine polym ris e coupl e un fluorophore af
35. y HE 9 FE EXT a N j 1 o o rs Green Green agains it cyan Red against green e Green fluorescence uorescence fuoresoence huorescence fluorescence Figure 4 Propri t s chimiques et spectrales de PAFPs Proc dures pour le marquage s lectif en utilisant des PAFPs irr versible et r versible Les cylindres repr sentent un objet tiquet avec une PAFP et les cylindres sont color s selon les couleurs d mission avant et apr s photoactivation La lumi re d excitation ou d activation est montr e au dessus des cylindres comme des trap zes color s ou des lignes respectivement Seule l activation r versible est montr e pour KFP1 par simplicit KFP1 est capable d une photoactivation r versible et irr versible d pendante de l intensit et de la dur e de la lumi re d activation KFP1 kindling fluorescent protein 1 PA GFP photoactivatable green fluorescent protein PS CFP photoswitchable cyan fluorescent protein Adapt e de Lukyanov et al 2005 D veloppement d un fluorophore photoactivable Certaines mutations peuvent cr er des photosensibilisateurs tels que le KillerRed max 585 nm d velopp par mutag nese d une chromoprot ine d hydrozoaire anm2CP Bulina et al 2006 Dans la technique CALI Chromophore assisted laser inactivation un fluorophore est irradi et produit des esp ces oxyg n es r actives qui peuvent inactiver une prot ine proche du fluorophore Pour une application biologique de ce
36. 000 g 5 min puis resuspendues dans 0 5 mL de tampon sorbitol 1 M Na2EDTA 0 1 M pH 7 5 Apr s ajout de 0 02 mL de Zymolyase 100 000 U a 2 5 mg mL les cellules sont incub es 1 heure 37 C Apr s v rification du pourcentage de sph roplastes elles sont s diment es par centrifugation 2 500 g 1 min et resuspendues dans 0 5 mL de tampon Tris Cl 50 mM pH 7 4 Na EDTA 20 mM Apr s ajout de 0 05 mL de SDS 10 les cellules sont incub es 30 min a 65 C pour permettre la lyse Apres centrifugation 13 000 g 5 min pour enlever le culot de membranes l ADN pr sent dans le surnageant est ensuite pr cipit avec 1 volume d isopropanol 100 5 min T ambiante Apr s une br ve centrifugation 10 s le culot d ADN est s ch l air libre puis repris dans 0 3 mL de TE pH 7 4 Apr s ajout de 15 uL d une solution de RNase A 1 mg mL l ADN est ajout et la r action est incub e 30 min 37 C A pr s ajout de 0 03 mL d ac tate de potassium 3 M et de 0 2 mL d isopropanol 100 et une br ve centrifugation le culot d ADN est s ch a l air libre Il est repris dans 0 1 0 3mL de TE pH 7 4 TE Tris HCl 10 mM pH 7 4 Na EDTA 1 mM 158 Recherche de partenaires de Bzz1p D Techniques g n tiques La levure Saccharomyces cerevisiae est un champignon unicellulaire se multipliant v g tativement par bourgeonnement l tat haplo de ou diplo de Le passage de l tat haplo de l tat diplo de se
37. 1 18 18 1 19 1 2 0 0 18 0 18 19 18 Etiquetage de YCRO76C en C terminal avec GFP fragment S2 ATGAGCGGAAATCTATCCTTAAAC Bzz1 S1 GCCAACTACTACATTACTTGCAAT Etiquetage de BZZ1 en N terminal avec AAAAATGCGTACGCTGCAGGTCG GFP fragment S1 AAAAAGTGGCGGCCAGGGAAAAT ATTTAATAGTTTCAGTTCATTCCT Etiquetage de BZZ1 en C terminal avec Bzz1 52 GFP fragment S3 ATCGATGAATTCGAGCTCG ACATATGGTGAATGTGACGGATT GAAAGGTCTATTTCCTACAAGTTA Etiquetage de BZZ1 en C terminal avec Bzz1 53 GFP fragment S2 CGTACGCTGCAGGTCGAC TATGGGTTTCCTTAAATGAATCTT TAATTTCATTACCAATCGATAAAT Etiquetage de BZZ1 en N terminal avec CTGCACTCATCGATGAATTCTCTG GFP fragment S4 CCACACACTTTAACGAGCAT CCCAAGCTTGGGTGCTGGAGCAG GCGCTGGAGCCGGCTGGGATTGT S quence codante pour la construction TGTCCAGGTTGTTGTAAGTAAGT d une tiquette t tracyst ine Bzz1 S4 TACGTACTTACTTACAACAACC Construction par PCR d une etiquette tetracysteine amorce en 3 17 CCCAAGCTTGGGTGCTG CCCAAGCTTGGGTGCTG Construction par PCR d une tiquette t tracyst ine amorce en 5 GAATGTGACGGATTGAAAGGTCT u bzz1_ccp GTTTCCTACAAGTTACTGTAAA unse e Tpar etiquette GGTGCTGGAGCAGGCGCTGGA y AAGTGGCGGCCAGGGAAAATATT Etiquetage BZZ1 par tiquette bzz1_trp TAATAGTTTCAGTTCATTCCTT t tracyst ine TRP1Insertion de TRP1 CCTCGAGGCCAGAAGACTAAG en 5 de BZZ1 GGATTAATTCCCTATAATTTCATT P hof1_ccp CAGCTACTGCATCAA Re CENE GGTGCTGGAGCAGGCGCTGGA y ACTTITITICIT
38. 3 fois avec du dichlorom thane Les phases organiques sont rassembl es s ch es par du sulfate de sodium anhydre filtr es et vapor es sec Le produit obtenu est purifi sur colonne de silice luant dichlorom thane 5 9 g d une huile jaune sont r cup r s p 87 o p dr or a no O N z f NAO k ar oN O b d j O es Ie o 9 m N o a poly RMN H CDCl 8 0 03 s 27H Si CH3 3 0 97 t 6H Hi Hm et Hq 1 52 1 71 m 6H Hc Hd et He 3 19 m 2H Hb 3 70 m 11H Hf Hh Hj Hl Hn et Hp 5 09 s 2H Ha 5 28 m 6H Hg Hk et Ho 7 35 m 5H Haromatiques J Trim thylsilyl thoxy m thyl Na No bis 2 trim thylsilyl thoxy m thoxy carbonyl L lysine ou Lysine NTA SEM 10 Dans un ballon anhydre le compos 7 5 9 g 7 50 mmol est dissous dans 59 mL d thanol Puis sous argon et agitation du Pd C 10 590 mg est ajout Le ballon est ensuite plac sous hydrog ne et la r action est laiss e 24 h a temp rature ambiante Le brut est filtr sur c lite puis le filtrat est vapor sec 4 8 g d une huile jaune sont r cup r s p 98 n Go op m O O HNancreN lt ey Ri P K g of ms h g Re poke RMN H CDCl amp 0 02 s 27H Si CH3 3 0 96 t 6H Hh Hl et Hp 1 26 1 75 m 6H Hb Hc et Hd 2 67 t 2H Ha 3 67 3 79 m 11H He Hg Hi Hk Hm et Ho 5 29 m 6H Hf Hj et Hn D veloppement d un fluorophore photoactivable
39. 649 676 Hino N Hayashi A Sakamoto K and Yokoyama S 2006 Site specific incorporation of non natural amino acids into proteins in mammalian cells with an expanded genetic code Nat Protoc 1 2957 2962 Ho C H Limberis L Caldwell K D and Stewart R J 1998 A Metal Chelating Pluronic for Immobilization of Histidine Tagged Proteins at Interfaces Immobilization of Firefly Luciferase on Polystyrene Beads Langmuir 14 3889 3894 Ho H Y Rohatgi R Lebensohn A M Le M Li J Gygi S P and Kirschner M W 2004 Toca 1 mediates Cdc42 dependent actin nucleation by activating the N WASP WIP complex Cell 118 203 216 Ho Y Gruhler A Hellbut A Bader G D Moore L Adams S U Millar A Taylor P Bennett K Boutiller K et al 2002 Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry Nature 415 180 183 Hochuli E Dobeli H and Schacher A 1987 New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues J Chromatogr 411 177 184 Holmes K C Popp D Gebhard W and Kabsch W 1990 Atomic model of the actin filament Nature 347 44 49 Holtzman D A Yang S and Drubin D G 1993 Synthetic lethal interactions identify two novel genes SLA1 and SLA2 that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae J Cell Biol 122 635 644 Howard J P H
40. 80 4922 4925 Welch M D 1999 The world according to Arp regulation of actin nucleation by the Arp2 3 complex Trends Cell Biol 9 423 427 Welch M D DePace A H Verma S Iwamatsu A and Mitchison T J 1997 The human Arp2 3 complex is composed of evolutionarily conserved subunits and is localized to cellular regions of dynamic actin filament assembly J Cell Biol 138 375 384 Wendland B and Emr S D 1998 Pan1p yeast eps15 functions as a multivalent adaptor that coordinates protein protein interactions essential for endocytosis J Cell Biol 141 71 84 Willner I Blonder R Katz E Stocker A and Buckmann A F 1996 Reconstitution of apo glucose oxidase with a nitrospiropyran modified FAD cofactor yields a photoswitchable biocatalyst for amperometric transduction of recorded optical signals j Am Chem Soc 118 5310 5311 Winder S J 2003 Structural insights into actin binding branching and bundling proteins Curr Opin Cell Biol 15 14 22 Winder S J and Ayscough K R 2005 Actin binding proteins J Cell Sci 118 651 654 Winsor B and Schiebel E 1997 Review an overview of the Saccharomyces cerevisiae microtubule and microfilament cytoskeleton Yeast 13 399 434 Winston F Dollard C and Ricupero Hovasse S L 1995 Construction of a set of convenient Saccharomyces cerevisiae strains that are isogenic to S288C Yeast 11 53 55 Winter D Lechler T and Li R 1999a
41. Activation of the yeast Arp2 3 complex by Bee1p a WASP family protein Curr Biol 9 501 504 Winter D Podtelejnikov A V Mann M and Li R 1997 The complex containing actin related proteins Arp2 and Arp3 is required for the motility and integrity of yeast actin patches Curr Biol 7 519 529 Winter D C Choe E Y and Li R 1999b Genetic dissection of the budding yeast Arp2 3 complex a comparison of the in vivo and structural roles of individual subunits Proc Natl Acad Sci U SA 96 7288 7293 Wise C A Gillum J D Seidman C E Lindor N M Veile R Bashiardes S and Lovett M 2002 Mutations in CD2BP1 disrupt binding to PTP PEST and are responsible for PAPA syndrome an autoinflammatory disorder Hum Mol Genet 11 961 969 Wu C Lee S F Furmaniak Kazmierczak E Cote G P Thomas D Y and Leberer E 1996 Activation of myosin by members of the Ste20p protein kinase family J Biol Chem 271 31787 31790 189 R ferences bibliographiques X Xu C and Webb W W 1996 Measurement of two photon excitation cross sections of molecular fluorophores with data from 690 to 1050 nm J Optical Soc Am B Optical Physics 13 481 491 Xu C and Webb W W 1997 Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy In Topics in Fluorescence Spectroscopy J Lakowicz ed Plenum Press New York pp 471 540 Y Yang F Moss L G and Phillips G N Jr
42. Adapt e de Takenawa et Suetsugu 2007 Recherche de partenaires de Bzz1p Un autre motif conserv pr sent dans chaque prot ine de la famille WASP est une r gion riche en proline dans la partie centrale des prot ines Figure 18 Cette r gion est capable d interagir avec les domaines SH3 Src Homology de toute une s rie de prot ines ainsi qu avec la profiline pour revue Higgs et Pollard 2001 Takenawa et Miki 2001 Tong et al 2002 Ces interactions constituent un des m canismes de r gulation de l activit des prot ines de la famille WASP Scar Les r gions N terminales des prot ines de cette famille sont assez divergentes Figure 18 Ainsi WASP et N WASP sont les seules repr sentantes de la famille contenir un domaine de liaison aux GTPases GBD qui leur permet d interagir directement avec la GTPase de type Rho Cdc42 Kolluri et al 1996 Miki et al 1998 Cette interaction permet la r gulation de WASP et N WASP Le domaine WH1 WASP Homology 1 pr sent dans WASP N WASP Las17p et Wsp1 est fonctionnellement important car c est ce niveau que se trouvent beaucoup de mutations responsables du syndrome de Wiskott Aldrich Imai et al 2003 Le domaine BR basic region des prot ines WASP N WASP Las17p et Scar WAVE est capable de lier le phosphatidylinositol 4 5 biphosphate PI 4 5 P2 Higgs et Pollard 2000 Rohatgi et al 2000 La fonction du domaine Scar Homology des prot ines Scar WAVE est
43. Avant d effectuer des tests de p n tration de ce compos dans le cytoplasme cellulaire nous avons utilis le compos 20 un d riv du compos 18 o la coumarine est ac tyl e et non cag e En effet le pKa du ph nol de la coumarine chlor e est d environ 5 5 ce qui signifie qu au pH physiologique pH 7 4 ce groupement est sous forme anionique donc il est n cessaire de masquer cette charge Zhao et al 2004 Le d riv ac tyl de la coumarine n est pas fluorescent mais une fois hydrolys par les est rases cellulaires il le devient C est le m me principe que lorsqu on ajoute une cage mais dans ce cas l la lib ration de la fluorescence n est pas contr l e Une fois ce compos 20 obtenu les tests sur les cellules ont pu commencer en effet il est plus facile de mettre au point des conditions d entr e d un compos s il est fluorescent Nous nous sommes alors rendus compte que ce compos pr alablement ch lat des ions Ni ne semblait pas p n trer dans les cellules aux doses test es 2 et 20 UM alors que le compos 19 63 D veloppement d un fluorophore photoactivable correspondant au compos 18 avec les trois acides du groupement NTA prot g s par des t butyles p n tre facilement dans les cellules En effet apr s 5 minutes d incubation avec des cellules HeLa a une concentration de 1 uM une forte fluorescence bleue avec un spectre d mission semblable celui de la
44. Hs 7 PSTPIP2 Mmi PSTPIP2 Hs Pt PACSINI Bi y Cdots PACSIN Gg JA RESINA Dr imp2 Sp ACSIN2 Hs PAC dan Mint BAES7730 Ao NA 4 4 CAF06117No PACS 2 Ge DE PACSIN2 XI Le PACSIN2 D NOSTRIN Bn NOSTRIN Mmi NOSTRIN1 Hs NOSTRINS Pt NOSTRIN Cf CIP4 FBP17 Toca 1 Figure 27 Dendrogramme de prot ines PCH connues s lectionn es par la pr sence de domaines FCH CC et 0 2 SH3 Cdc15 cell division cycle 15 CIP4 Cdc42 interacting protein 4 ou thyroid hormone interacting protein 10 TRIP10 ou human salt tolerant protein HSTP Cdc42 cell division cycle 42 Cyk2 cytokinesis 2 ou Hof 1 FAP52 focal adhesion protein 52 FBP formin binding protein FCHO FCH only FNBP formin binding protein Imp2 increased maximal permissive temperature for Pim1 NOSTRIN eNOS traffic inducer Nwk nervous wreck PACSIN protein kinase C and casein kinase 2 substrate in neurons PSTPIP proline serine threonine phosphatase interacting protein Rapostlin apostle of Rnd2 small GTPase related to Rho in the effector domain syndapin synaptic dynamin interacting protein Toca 1 transducer of Cdc42 dependent actin assembly Les abr viations des esp ces suivant le nom de la prot ine sont indiqu es comme suit Am Apis melifera abeille Ao Aspergillus oryzae champignon Bt Bos taurus Cf Canis familiaris Dd Dictyostelium discoideum Dm Drosophila melanogaster Dr Danio rerio perche Gg Gall
45. M K Feoktistova A McCollum D and Gould K L 1996 Fission yeast Sop2p a novel and evolutionarily conserved protein that interacts with Arp3p and modulates profilin function Embo J 15 6426 6437 172 R ferences bibliographiques Benedetti H Raths S Crausaz F and Riezman H 1994 The END3 gene encodes a protein that is required for the internalization step of endocytosis and for actin cytoskeleton organization in yeast Mol Biol Cell 5 1023 1037 Benli M Doring F Robinson D G Yang X and Gallwitz D 1996 Two GTPase isoforms Ypt31p and Ypt32p are essential for Golgi function in yeast Embo J 15 6460 6475 Berthelot T Talbot J C Lain G D leris G and Latxague L 2005 Synthesis of Ne 7 diethylaminocoumarin 3 carboxyl and Ne 7 methoxycoumarin 3 carboxyl L Fmoc lysine as tools for protease cleavage detection by fluorescence J Peptide Sci 11 153 160 Bi E 2001 Cytokinesis in budding yeast the relationship between actomyosin ring function and septum formation Cell Struct Funct 26 529 537 Bi E Maddox P Lew D J Salmon E D McMillan J N Yeh E and Pringle J R 1998 Involvement of an actomyosin contractile ring in Saccharomyces cerevisiae cytokinesis J Cell Biol 142 1301 1312 Bochet C G 2002 Photolabile protecting groups and linkers J Chem Soc Perkin Trans 1 125 142 Bompard G and Caron E 2004 Regulation of WASP WAVE proteins Ma
46. P Rac PI3K SH2 SRAYPIRIA woo A ee x HSPC300 Lsb Typell PIAK LsbS ArfGAP Cdc42 Slal A N Fe DE Miller lt gt x i Myo5 Nature Reviews Molecular Cell Biology Figure 19 Partenaires de WASP et WAVE a WASP N WASP et Las17p b WAVE 1 WAVE 2 et WAVE 3 Zones mauves proteines formant des complexes stables avec les a proteines de la famille WASP et les proteines de la famille WIP b proteines de la famille WAVE et les prot ines Abelson interacting protein ABl NAP1 SRA1 PIR121 et HSPC300 Zones bleues prot ines impliqu es dans la nucl ation de la polym risation de l actine Zones beiges prot ines interagissant via leur domaine SH3 Zones vert sombre et vert clair prot ines contenant des domaines EFC et BAR respectivement Zones jaunes prot ines interagissant avec la dynamine Cercle rose claire prot ines avec un domaine RCB Rac binding aussi connu comme IRSp53 Mim homology IMD En gras petites GTPases CIB calcium and integrin binding protein CR16 corticosteroid and regional expression 16 FBP formin binding protein GRB2 growth factor receptor bound protein 2 PI3K phosphatidylinositol 3 kinase PSTPIP proline serine threonine phosphatase interacting protein PKA protein kinase A Ptdins phosphatidylinositol srGAP slit roboGAP WICH WIP and CR16 homologous protein also known as WIP related WIRE WRP WAVE associated RacGAP protein
47. RMN S SDS PAGE SEM SH SH3 TA tBu TEA TEMED TFA TH1 2 THF Tris UV VCA WASP WAVE WH1 2 WIP Glutathione S Transf rase Guanosine 5 triphosphate Human O alkylguanine transferase Hanks Balanced Salt Solution N 2 Hydroxyethyl piperazine N 2 ethanesulfonic acid Lumiere High Perfomance Liquid Chromatography Isopropyl B D thiogalactopyranoside Constante de couplage constante de dissociation Kindling fluorescent protein 1 Lucifer yellow carbohydrazide multiplet Numeric aperture ouverture num rique o Nitrobenzyle Acide nitrilodiac tique N Hydrosuccinimide Nucleation Promoting Factor Acide nitrilotriac tique Open Reading Frame Photoactivable fluorescent protein Photoactivatable Green fluorescent protein paire de bases Phosphate buffer saline Pombe Cdc15 homology peptide carrier protein Polymerase chain reaction Protein Databank para m thoxybenzyle Polym thyl sulfonyl fluorure partie par million phosphopant th ine transf rase Photoswitchable Cyan fluorescent protein Resorufin Arsenical Helix binder R sonance magn tique nucl aire singulet sodium dodecyl sulphate poly acrylamide gel electrophoresis 2 trimethylsilyl ethoxy methyl Scar Homology Src homology 3 Temperature ambiante tert Butyle Triethylamine N N N N tetramethylethylenediamine Acide trifluoroacetique Tail homology 1 2 Tetrahydrofuranne tris hydroxymethylaminomethane Ultra violet WHR2 Co
48. acide tant lib r dans le cytoplasme gr ce aux est rases cellulaires et le motif Ni NTA g n r pouvant alors se fixer une prot ine avec une tiquette polyhistidine Nous avons alors observ que le compos 22 Ni est capable de p n trer dans des cellules HeLa ce qui cause une forte augmentation de la fluorescence dans le cytoplasme cellulaire Etrangement ce compos est aussi capable de rentrer dans les cellules sans ch lation au nickel Nous devons v rifier que le nickel est effectivement ch lat au motif NDA Pour faire cela il nous faudrait une prot ine intracellulaire de localisation connue fusionn e avec une polyhistidine pour v rifier que le marquage avec le compos 22 Ni est correct On pourrait par exemple utiliser l actine en effet celle ci a t tiquet e avec un SNAP tag et visualis e dans des cellules NIH3t3 http www covalys com applications other applications html et il serait alors possible de comparer les r sultats et confirmer que le Ni NDA est capable de se lier a une Actine His alors que le NDA seul ne devrait pas tre capable de le faire Il pourrait aussi tre judicieux d tudier le m canisme d entr e dans les cellules du NDA En effet s il entre par diffusion passive ou par endocytose les m canismes cellulaires mis en jeu ne sont pas les m mes et cela pourrait peut tre expliqu le fait qu il entre avec ou sans ch lation au nickel 64 D veloppement d un fluoropho
49. appartient la famille de prot ines contenant des r p titions WD ou r p titions WD40 Voegtli et al 2003 Ces derni res sont des s quences homologues d environ 40 acides amin s encadr s par la paire Gly His l extr mit N terminale et par la paire Trp Asp a l extr mit C terminale Pickles et al 2002 Ce candidat semble int ressant car c est celui qui s est hybrid avec la plus forte interaction 2 Ast2p C est une prot ine de 430 acides amin s cod e par le g ne YER101C Son r le biologique n a pas t d crit Il semblerait cependant que Ast2p ATPase stabilizing pourrait jouer un r le dans le ciblage de H ATPase Pma1p la membrane plasmique comme sugg r par l analyse des interactions g n tiques Saccharomyces Genome Database http www yeastgenome org Or Pma1p a t trouv au laboratoire comme interagissant avec Bzzip par le crible double hybride au laboratoire travaux non publi s 129 Recherche de partenaires de Bzz1p 3 Ypt32p C est une prot ine de 222 acides amin s cod e par le gene YGL210w une GTPase de la famille Ypt Rab family tr s similaire et redondant avec Ypt31p Elle est impliqu e dans la voie de l exocytose elle m die le trafic intra Golgi ou le bourgeonnement des v sicules vers le post Golgi partir du trans Golgi Benli et al 1996 Jedd et al 1997 Lazar et al 1997 Wang et Ferro Novick 2002 Une GEF de Ypt32p est sugg r comme
50. avoir de nombreux partenaires prot iques cellulaires certainement par une interaction via ses domaines SH3 Bzz1p est aussi capable via son domaine FCH de lier des phophoinositides Ce qui sugg re que Bzzip serait un connecteur entre le cytosquelette d actine et la membrane plasmique Une fois ces interactions confirm es la dynamique de Bzzip pourra tre visualis gr ce a la coumarine photoactivable nouvellement con ue 171 R f rences bibliographiques R f rences bibliographiques Adams S R Campbell R E Gross L A Martin B R Walkup G K Yao Y Llopis J and Tsien R Y 2002 New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo synthesis and biological applications Am Chem Soc 124 6063 6076 Adams S R and Tsien R Y 1993 Controlling cell chemistry with caged compounds Annu Rev Physiol 55 755 784 Agard N J Prescher J A and Bertozzi C R 2004 A strain promoted 3 2 azide alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems J Am Chem Soc 126 15046 15047 Aguilar R C Watson H A and Wendland B 2003 The yeast Epsin Ent is recruited to membranes through multiple independent interactions J Biol Chem 278 10737 10743 Amberg D C 1998 Three dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle Mol Biol Cell 9 3259 3262 Anderson B L Boldogh I Evange
51. chlorure de thionyle anhydre Apr s 16 h 50 C sous argon et agitation le milieu r actionnel est vapor sec Le produit obtenu est purifi sur colonne de silice luant dichlorom thane 330 mg d un solide jaune sont r cup r s p 85 FC Cl e d NO cMeO OMeb RMN H CDCL 5 3 97 et 4 00 2s 6H Hb et Hc 6 53 m 1H He 7 32 s 1H Ha 7 69 s 1H Hd E R sorufine 4 5 bis mercurique trifluoroac tate 5 Dans un ballon anhydre le sel de sodium de r sorufine 236 mg 1 0 mmol est ajout sous argon et agitation a une solution d oxyde mercurique 480 mg 2 0 mmol 2 qu en suspension dans de l acide trifluoroac tique 8 mL a temp rature ambiante Apr s une nuit de r action la solution rouge sombre est devenue en partie solide Le brut est vapor et dilu avec de l eau 80 mL et le pr cipit est r cup r par filtration et s ch sous vide 490 mg d une poudre rouge sombre sont r cup r s p 58 OCOCF OCOCFs RMN H DMSO D6 6 95 d J 9 0 Hz 2H 7 59 d J 8 8 Hz 2H Tentative de synth se du ReAsH EDT Dans un ballon anhydre le compos 5 est dissous dans la N M thylmorpholine anhydre Puis sous argon et agitation le chlorure d arsenic AsCl 23 qu l ac tate de palladium Pd OAc quantit catalytique et la DIEA 9 qu sont ajout s La r action est agit e dans le noir 2 h a 60 70 C Apr s refroidissement un m lan
52. corticales et il n y a pas de diff rence notable vis vis des souches sauvages correspondantes Figure 41 Ceci signifie que le PI 4 5 P le Pl 3 5 P et le PI 3 P ne sont pas n cessaires la localisation correcte de Bzzip au cortex cellulaire IL serait souhaitable de tester la localisation de Bzz1 GFP dans d autres souches portant des mutations pour d autres kinases impliqu es dans la synth se des phophoinositol phosphates comme une souche d ficiente en PI3Ks en Pik1p ou Stt4p 147 Chapitre 3 Discussion et perspectives Recherche de partenaires de Bzz1p Chapitre 3 Discussion et perspectives sur Bzzlp Dans ce travail nous voulions confirmer lesquels des nombreux partenaires potentiels retrouv s dans les grands cribles repr sentaient des interactions directes et identifier de nouveaux partenaires de Bzz1p afin de pr ciser son r le dans le cytosquelette d actine et ou dans le trafic intracellulaire I Crible de surproduction Pour la recherche de nouvelles interactions cibles de Bzz1p nous nous sommes bas s sur le fait que sa surexpression peut causer un retard de croissance voire une mort cellulaire a 37 C Soulard et al 2002 Un crible de surproduction d une banque d ADN g nomique associ e a une surproduction de Bzzip ne nous a pas permis d isoler de candidats qui compensaient les effets toxiques de la surproduction de Bzz1p Ceci peut tre du des crit res pas suffisamment s lectifs ou la
53. cule Ainsi un groupement photolabile doit tre li judicieusement la biomol cule afin de masquer la fonctionnalit de la biomol cule tudi e Dans le cas d un fluorophore photoactivable c est la fluorescence qui est masqu e et qui est lib r e sous l action de la lumi re En outre la cin tique de la r action de photolyse doit tre plus rapide que le ph nom ne biologique tudi Elle peut tre de l ordre de la nanoseconde dans le cas de l tude du repliement d une prot ine de la microseconde pour le relargage d un neurotransmetteur de la milliseconde pour l tude de r actions enzymatiques La cin tique de photoactivation d un fluorophore sera conditionn e par la nature du ph nom ne biologique tudi A Crit res d un fluorophore photoactivable efficace Les conditions n cessaires pour qu une sonde fluorescente cag e soit efficace ont t d crites par Mitchison 1989 1994 Le compos cag doit tre soluble et stable l abri de la lumi re en milieu aqueux tamponn au pH physiologique La fluorescence du fluorophore apr s photoactivation doit tre r g n r e avec une forte brillance de mani re s lective efficace et rapide L efficacit de la r action de photo fragmentation se traduit par le produit x o est le coefficient d extinction molaire la longueur d onde d irradiation et b le rendement quantique de la r action nom
54. d pos es en particulier un grand nombre de prot ines du cytosquelette d actine sont absentes et parmi les prot ines du complexe Arp2 3 seule Arp2p est pr sente De plus certaines prot ines sont pr sentes mais en concentration tr s faible comme Las17p d pos e environ 3 nM alors que certaines 148 Recherche de partenaires de Bzz1p prot ines ont une concentration sup rieure 1 UM sur la puce Il est possible que le fait que toutes les prot ines ne soient pas d pos es avec la m me concentration puisse induire des faux positifs ou au contraire des faux n gatifs Ainsi selon la prot ine que l on souhaite tudier comme Bzz1p un certain nombre d informations int ressantes peuvent tre perdues Cependant dans le cas de Bzz1p nous recherchions des interactions avec des prot ines de fonction inconnue Deuxieme inconv nient cette technique peut permettre de r v ler des interactions prot ine prot ine qui ne peuvent pas avoir lieu in vivo si les prot ines ne sont pas dans les m mes compartiments cellulaires Par cons quent cette methode est utile lorsqu on ne sait pas quelle est la fonction d une prot ine et que l on cherche des interactions directes Toutefois il est n cessaire de rechercher les interactions potentielles d une prot ine par d autres m thodes tel le double hybride ou un crible sur fonction Dans le cas de Bzz1p nous disposions d j de r sultats issus d un crible double hybride t
55. de la banque d l tion pyrF Or les souches MC1066 sont peu comp tentes et donc difficiles transformer directement avec de l ADN plasmidique isol de la levure Il a alors fallu passer par une premi re transformation dans des cellules ultra comp tentes les bact ries TOP10 pour isoler un ADN propre Puis cet ADN a pu tre transform dans les bact ries MC1066 puis les clones obtenus ont t analys s pas PCR et s quenc Parmi ces clones deux poss daient de longs fragments d ADN Un clone poss dait un fragment d environ 2 kbases du chromosome XIII ayant les genes FMS1 MAC1 et QRI8 Fragment 1 l autre clone poss dait un fragment d environ 8 kbases du chromosome Ill avec les g nes PGS1 YCLOO2C RER1 YCLOO1 YCROO1W CDC10 MRP32 et le centromere ARS308 Fragment 2 120 Milieu Glucose Galactose TEC Banque sans insert p424 GAL1 vide Banque sans insert p424 GAL1 Bzz1 Banque Fragment 1 p424 GAL1 vide Banque Fragment 2 p424 GAL1 vide Banque Fragment 1 p424 GAL1 Bzz1 Banque Fragment 2 p424 GAL1 Bzz1 Tableau 6 Analyse des effets de la surproduction sur galactose des fragments 1 et 2 lors d une surproduction de Bzz1p croissance normale pas de croissance Recherche de partenaires de Bzz1p Afin de reproduire le ph notype de s lection de d part l ADN plasmidique de ces deux clones obtenus a t transform dans la souche FY1679 poss dant le p424 GAL1 Bzz1
56. des souches portant une triple d l tion par comparaison avec la souche portant la double d l tion myo5A bzz1A Il semble qu aucune de ces d l tions n augmente les d fauts test s de la souche myo5A bzz1A IV Interactions domaine sp cifique de Bzzlp En collaboration avec G Ren doctorant du laboratoire et A Shevchenko Max Plank Dresde nous avons pu analyser les interactions prot ine prot ines sp cifiques aux domaines SH3 de Bzz1p Chaque domaine SH3 de Bzz1p a t fusionn une tiquette GST plasmides fournis par G Cesarini ces deux constructions ont t produites dans E coli puis purifi es sur des billes GSH S pharose Apr s incubation avec un extrait de levure sauvage FY1679 les prot ines fix es sur billes ont t s par es sur SDS PAGE et analys es par spectroscopie de masse MALDI TOF Les prot ines obtenues par cette analyse sont r pertori es dans le tableau 12 Les deux domaines SH3 de Bzzip interagissent avec des prot ines du cytosquelette d actine et parmi ces composants des prot ines domaine SH3 comme Bbc1p Myo5p Abp1p De plus Las17p est retrouv e ainsi que Vrp1p et Yir003Wp qui interagit avec Abp1p et Ybr108Wp qui est un partenaire de Rvs167p De nombreuses prot ines impliqu es dans le trafic membranaire semblent interagir avec les domaines SH3 de Bzz1p comme les Sec21 23 26 27 28 31p Il est a noter que les prot ines nucl aires retrouv es sont probablement des artefacts d au fa
57. difficult d analyse du crible Il pourrait tre int ressant de refaire ce crible en am liorant les crit res de s lection et surtout en augmentant la temp rature 40 C ou en mettant en place la surproduction de Bzz1p avant de faire la s lection pour les plasmides qui compensent le ph nom ne de toxicit On pourrait aussi changer le g ne codant pour la r sistance a l ampicilline par un g ne codant pour un autre antibiotique dans le plasmide p424 GAL1 BZZ1 afin de diminuer et de faciliter les tapes de r cup ration des plasmides de la banque et d analyse Il se pourrait aussi que cet effet soit d l effet de plus d une autre prot ine cible dans ce cas une r ponse du crible serait beaucoup plus difficile ll Interactions prot ine prot ines Par la suite j ai aussi lanc un crible par la technique du Protoarray afin de d couvrir de nouveaux interactants prot ine prot ine directs de Bzz1p Comme toute technique celle ci a des avantages et des inconv nients Son premier avantage est la rapidit du test En effet une fois la prot ine tiquet e produite et purifi e l hybridation de la prot ine tiquet e sur la puce contenant le prot ome et la lecture des r sultats prend une journ e Son plus grand avantage est certainement qu un grand nombre de prot ines sont ainsi test es Elle a deux inconv nients majeurs Premi rement toutes les prot ines du prot ome de levure n ont pas t
58. emp chent l assemblage des taches corticales mais n affectent pas la formation des c bles et de l anneau cytocin tique Winter et al 1999b Des tudes ont mis en vidence le r le important des formines lors de l assemblage des c bles d actine pour revue Faix et Grosse 2006 Figure 24 Les formines appartiennent une famille de prot ines tres bien conserv es chez toutes les cellules eucaryotes Chez la levure S cerevisiae ce sont Bni1p et Bnrip deux prot ines partiellement redondantes impliqu es dans la polarit cellulaire pour revue Sawin 2002 Toutefois des tudes r centes d montrent que les deux formines ne sont pas colocalis es et qu elles ont chacune une fonction propre Bnilp est localis e l extr mit du bourgeon et est responsable de la formation des filaments d actine sp cifiquement au bourgeon tandis que Bnr1p est plut t localis e la base du bourgeon et est responsable de la nucl ation des filaments d actine de la cellule m re Cependant les deux formines sont requises pour la division cellulaire Moseley et Goode 2005 Ces prot ines se localisent au niveau des sites de croissance polaris e et elles interagissent avec les GTPases de type Rho telle Cdc42p Evangelista et al 1997 Ozaki Kuroda et al 2001 Dans la portion C terminale des formines on retrouve des domaines tres conserv s FH1 et FH2 formin homology domain 1 et 2 Le domaine FH2 permet la nucl ation de l actine a
59. encore inconnue ce jour b R gulation Les membres de la famille WASP peuvent tre r gul s par un des deux m canismes de base l auto inhibition dans laquelle les extr mit s C et N terminales s associent directement pour inhiber son activit de NPF Nucleation promoting factor ou la transinhibition m di e par des interactions directes de prot ines additionnelles Bompard et Caron 2004 Dans les deux m canismes l inhibition est lev e par des signaux provenant des GTPases Rho activ es Par exemple Cdc42 se lie directement au GBD de N WASP pour lever l auto inhibition Rohatgi et al 2000 et Rac se lie directement un des composants du complexe transinhibiteur de WAVE1 pour lib rer WAVE1 active Eden et al 2002 bien que ce m canisme reste controvers pour revue Stradal et Scita 2006 Cette famille de prot ines est r gul e par de nombreux partenaires cellulaires qui sont r sum s dans la figure 19 WIP Wiskott Aldrich Interacting Protein ou Vrp1p chez la levure peut lier de fa on stable WASP et N WASP ou Las17p chez S cerevisiae gr ce leur domaine WH1 ce qui a pour effet de les inhiber Ce complexe WASP WIP est dissoci par Cdc42 sp cifiquement en pr sence de Toca 1 dont l homologue chez S cerevisiae est Bzz1p qui lie Cdc42 et N WASP Ho et al 2004 92 Recherche de partenaires de Bzz1p L activation de N WASP peut galement tre r gul e par la phosphorylation En ef
60. es sur du milieu de sporulation ac tate de potassium 10 agarose 1 et incub es a 25 ou 30 C pendant 4 5 jours L apparition des ascospores est suivie au microscope 3 Dissection des t trades Afin de faire une analyse g n tique de la s gr gation des g nes au cours de la m iose les asques peuvent tre rompus par digestion de leur paroi pour lib rer les 4 spores qu ils contiennent Les cellules mises a sporuler sont dig r es dans de l eau st rile contenant de la zymolyase 1 mg mL pendant 10 min a temp rature ambiante La suspension cellulaire est tal es sur boite YPD et les 4 spores de chaque t trade sont 159 Recherche de partenaires de Bzz1p s par es et d pos es des intervalles r guliers sur la surface de l agar l aide de l aiguille fine d un micromanipulateur Singer Les colonies issues de spores individuelles sont visibles apr s quelques jours d incubation 25 C lll Vecteurs de clonage A Plasmides sp cifiques E coli Tous les plasmides utilis s portent le g ne de r sistance l ampicilline S rie pET D TOPO pBR322 ori Lacl T7 promoter Invitrogen Ce vecteur permet de cloner un insert en phase avec la s quence codant pour les tiquettes 6xHistidine et V5 et d induire la production de la prot ine de fusion correspondante B Plasmides navettes E coli S cerevisiae Ils poss dent une origine de r plication bact rienne une origine de r plic
61. fait l honneur d accepter de juger ce travail de th se Je d sire galement remercier les diff rentes personnes qui ont particip ce travail Alexandre et Chantal qui m ont fait d couvrir l univers des levures et du cytosquelette d actine au tout d but de ma th se Karine qui m a initi aux joies de a synth se organique Alex qui gr ce ses judicieux conseils m a permis d obtenir ma mol cule tant d sir e et aussi un grand merci pour les corrections de ce manuscrit Jean Luc Vonesch Didier Hentsch et en particulier Pascal pour l initiation au monde de la microscopie confocale Pascale pour la spectrom trie de masse des mol cules chimiques et pour son aide pour la purification et aussi pour les moments de d tente les grandes discussions et la piscine Christelle pour les analyses de spectrom trie de masse des prot ines Je remercie et je souhaite aussi bon courage David et Adeline qui m ont aid pour les exp riences au cours de ma th se et continuent mon projet Je n oublie pas non plus les stagiaires que j ai encadr s et qui m ont permis d avancer plus sereinement dans ce projet Catherine C dric et Laurence Je voudrais bien sur remercier tous les nombreux membres de la Facult de Pharmacie et de l UMRy156 avec lesquels j ai eu des relations et des changes tr s enrichissants Je garderai toujours un excellent souvenir de ces moments pass s en particulier les discussions quotidiennes aut
62. fait par conjugaison entre deux cellules de signe oppos MATa et MATa Le passage inverse se fait par m iose et sporulation d une cellule diploide et formation d un asque qui contient 4 spores haplo des 2 MATa et 2 MAT a 1 Conjugaison Deux cellules haplo des de signe oppos arr tent leur cycle cellulaire en G1 en r ponse aux ph romones et forment une protub rance shmoo vers leur partenaire pour fusionner Le zygote ainsi form commence aussit t bourgeonner Il est reconnaissable au microscope par sa forme en feuille de tr fle Pour obtenir une efficacit maximale de croisement les cellules de signe a et a sont stri es s par ment sur milieu riche et incub es 25 ou 30 C pendant une nuit Les cellules sont ensuite m lang es sur le m me milieu et incub es pendant 6h 25 ou 30 C Le m lange du croisement est ensuite stri sur YPD pour isoler les zygotes l aide d un micromanipulateur Singer ou alors il est stri sur un milieu minimum ad quat ne permettant que la croissance des cellules diplo des contre s lection des souches haploides 2 Sporulation En conditions de croissance d favorables les cellules diploides entrent en m iose puis forment un asque ayant une paroi tres r sistante contenant 4 spores haploides La sporulation est induite en carencant les cellules en sources azot es et carbon es Les cellules sont mises a pousser sur milieu riche pendant 1 ou 2 jours puis repiqu
63. ferences bibliographiques Shaner N C Steinbach P A and Tsien R Y 2005 A guide to choosing fluorescent proteins Nat Methods 2 905 909 Sheterline P and Sparrow J C 1994 Actin Protein Profile 1 1 121 Shih S C Sloper Mould K E and Hicke L 2000 Monoubiquitin carries a novel internalization signal that is appended to activated receptors Embo J 19 187 198 Shimomura O Johnson F H and Saiga Y 1962 Extraction purification and properties of aequorin a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan Aequorea J Cell Comparative Physiol 59 223 239 Shortle D Haber J E and Botstein D 1982 Lethal disruption of the yeast actin gene by integrative DNA transformation Science 217 371 373 Shortle D Novick P and Botstein D 1984 Construction and genetic characterization of temperature sensitive mutant alleles of the yeast actin gene Proc Natl Acad Sci USA 81 4889 4893 Sikorski R S and Hieter P 1989 A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae Genetics 122 19 27 Simonsen A Wurmser A E Emr S D and Stenmark H 2001 The role of phosphoinositides in membrane transport Curr Opin Cell Biol 13 485 492 Smythe E and Ayscough K R 2003 The Ark1 Prk1 family of protein kinases Regulators of endocytosis and the actin cytoskeleton EMBO Reports 4 246 251 Soulard
64. forme un shmoo lors de la conjugaison les taches corticales se retrouvent l extr mit de l excroissance et les c bles y sont orient s Adapt e de Pruyne et Bretscher 2000b Recherche de partenaires de Bzz1p cellules de survivre en attendant que les conditions du milieu redeviennent favorables Lorsque les nutriments sont de nouveau disponibles les spores de chaque t trade germent pour former des cellules haplo des qui vont se multiplier Figure 21 Le mode de bourgeonnement est diff rent selon la plo die des cellules Les cellules haplo des bourgeonnent toujours au m me p le bourgeonnement axial tandis que les cellules diplo des bourgeonnent alternativement chaque pole de la cellule bourgeonnement bipolaire Les levures poss dent un syst me g nique dit sexuel compos de deux types diff rents MATa et MATa encore appel s signes sexuels Les cellules diplo des poss dent deux signes simultan ment Les cellules haplo des n en poss dent qu un seul leur permettant de s cr ter une ph romone diff rente selon qu elles sont MATa ou MATa Ainsi lorsque deux cellules haplo des de signe sexuel oppos sont stimul es par les ph romones elles forment chacune une projection shmoo vers le partenaire sexuel et fusionnent pour donner un zygote la formation du premier bourgeon Ensuite les noyaux fusionnent pour donner une cellule diplo de Ce processus s appelle la conjugaison Figure 21
65. genetically encoded fluorescent amino acid Proc Natl Acad Sci U S A 103 9785 9789 Sun Y Martin A C and Drubin D G 2006 Endocytic internalization in budding yeast requires coordinated actin nucleation and myosin motor activity Dev Cell 11 33 46 Svitkina T M and Borisy G G 1999 Arp2 3 complex and actin depolymerizing factor cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia J Cell Biol 145 1009 1026 Symons M Derry J M Karlak B Jiang S Lemahieu V McCormick F Francke U and Abo A 1996 Wiskott Aldrich syndrome protein a novel effector for the GTPase CDC42Hs is implicated in actin polymerization Cell 84 723 734 T Takenawa T and Miki H 2001 WASP and WAVE family proteins key molecules for rapid rearrangement of cortical actin filaments and cell movement J Cell Sci 114 1801 1809 Takenawa T and Suetsugu S 2007 The WASP WAVE protein network connecting the membrane to the cytoskeleton Nat Rev Mol Cell Biol 8 37 48 Tan P K Howard J P and Payne G S 1996 The sequence NPFXD defines a new class of endocytosis signal in Saccharomyces cerevisiae J Cell Biol 135 1789 1800 Tang H Y Munn A and Cai M 1997 EH domain proteins Pantp and End3p are components of a complex that plays a dual role in organization of the cortical actin cytoskeleton and endocytosis in Saccharomyces cerevisiae Mol Cell Biol 17 4294
66. gt v rifi es contenues dans le prot ome de la levure ont t tiquet es et produites dans S cerevisiae sous forme de fusion GST 6xHis puis purifi es et d pos es sur une lame en verre recouverte d une membrane de nitrocellulose Sur cette micropuce la prot ine d int r t purifi e dans notre cas Bzzip coupl a un pitope peut alors s hybrider directement avec des partenaires potentiels Ensuite l aide d un anticorps coupl un fluorophore les interactions potentielles sont r v l es par la lecture de la fluorescence de la lame une longueur d onde adapt e En pratique une tiquette prot ique de six histidines a t ajout e Bzzip ainsi que l pitope V5 L tiquette polyhistidine sert la purification de la prot ine l pitope V5 un pitope de 14 acides amin s GKPIPNPLLGLDST d riv des prot ines P et V du paramyxovirus SV5 Southern et al 1991 permet de r v ler l hybridation de la prot ine l aide de l anticorps anti V5 coupl l AlexaFluor647 La figure 32 pr sente le protocole d utilisation de la puce prot ine Brievement les sites de liaison non sp cifiques de la puce sont pr alablement bloqu s puis la puce est incub e avec la prot ine d inter t Bzz1p Les interactions entre une 122 Tl LR ARA gt Block 1 hr add Wash 10 min add Wash dry and Anti V5 Alexa Fluor 647 ecm 1 ke protein probe with V5 tag 90 min Antibody for
67. int r t limit tant donn la faible stabilit hydrolytique Nous avons alors choisi de coupler une nouvelle cage d velopp e et synth tis e au laboratoire par le Dr Alexandre Specht Sch ma 14 Specht et al 2006 Pour coupler cette nouvelle cage la coumarine un couplage de Mitsunobu Mitsunobu 1981 a t effectu On obtient alors le compos cag d sir avec un rendement acceptable de 65 Pour la synth se du compos 18 nous avons utilis l nantiom re thr o de la cage Specht et al 2006 F3C CR R NO MeO des en OMe Cage DMNPT Compos 4 Cage DMNPB Sch ma 14 Groupements photolabiles du laboratoire DMNPT 1 4 5 dim thoxy 2 nitroph nyl 2 2 2 trifluoro thyle DMNPB 3 4 5 dim thoxy 2 nitroph nyl 2 butyle 53 D veloppement d un fluorophore photoactivable C Propri t s photochimiques 1 Propri t s photophysiques Nous avons tudi les propri t s de fluorescence des compos s 16 21 et 18 Les r sultats sont r sum s dans le tableau 4 Compos 16 21 Compos 18 Ama excitation 408 nm 355 nm e mol cm 25 000 15 000 Amax Emission 450 nm Rendement quantique de fluorescence d 0 95 lt 0 009 Rendement quantique de photolyse 350 nm 0 0 26 Temps de demi vie de la r action de photolyse T4 4 us Section efficace en bi photon a 740 nm 0 21 GM Tableau 4 Propri t s photophysiques de la coumarine et ses d riv
68. la r sorufine photoactivable le fluorophore est sous une forme non ionisable et le d calage d absorption vers le bleu conduit a une extinction de la fluorescence Ces coumarines cag es ont l int r t d tre photoactivable sous l action d une lumi re mono ou bi photonique avec un rendement quantique deux photon de 0 37 0 68 GM 1 GM 10 cm s photons 740 nm ce qui est relativement lev Zhao et al 2004 De plus la coumarine est peu sensible au photoblanchiment Et elle agit comme une antenne pour la photolyse assist e par le substrat de la partie 2 nitroph nyl thyle c est dire que le rendement quantique de photolyse est augment en comparaison a un substrat classique Zhao et al 2004 De nombreuses revues sur les compos s cag s et les groupements photolabiles ont t publi es Adams et Tsien 1993 Bochet 2002 Corrie et Trentham 1993 Dorman et Prestwich 2000 Loudwig et al 2002 McCray et Trentham 1989 Pelliccioli et Wirz 2002 Willner et al 1996 Et un volume de Methods in Enzymolgy y est consacr Marriott 1998 ainsi qu un livre publi par Wiley VCH Eds Goeldner et Givens 2005 Dans la section suivante je d cris les groupements o nitrobenzyles les seuls groupements utilis s pour la synth se de fluorophores photoactivables ainsi que leurs propri t s 24 o Nitrobenzyle NB Solubilit aqueuse Faible Efficacit 350nm X
69. la s cr tion et dans la localisation de la chitine sugg rant que la principale fonction du cytosquelette d actine tait la croissance polaris e Dunn et Shortle 1990 Novick et Botstein 1985 Shortle et al 1984 D autres tudes ont r v l un r le de l actine dans la division nucl aire et la cytocin se Palmer et al 1992 l endocytose Benedetti et al 1994 Holtzman et al 1993 Kubler et Riezman 1993 la s lection du site de bourgeonnement Drubin et al 1993 et le mouvement des organelles et leur positionnement Drubin et al 1993 Lazzarino et al 1994 Pour assurer toutes ces fonctions biologiques l organisation du cytosquelette d actine doit tre finement r gul e temporellement et spatialement Ces r arrangements durant le cycle cellulaire doivent tre r alis s des moments pr cis et les signaux intracellulaires doivent pouvoir recruter la nucl ation et la polym risation de l actine des sites ponctuels de la cellule De nombreuses prot ines sont associ es au cytosquelette d actine et sont ainsi des cibles pour les voies de signalisation contr lant l assemblage de l actine B Dynamique de la polym risation L actine existe sous deux formes Une forme monom rique appel e actine globulaire actine G et l actine filamenteuse actine F correspondant la forme polym ris e des monom res d actine La r solution de la structure tridimensionnelle de l actine globulai
70. labor e pour ce complexe nommant les 7 prot ines Arp2 Arp3 et ARPC1 a 5 Arp2 3 Complex component Higgs et Pollard 2001 Nom Standard Humain Amibe S cerevisiae Arp3 Arp3 Arp3B Arp3 Arp3p Arp2 Arp2 Arp2 Arp2p ARPC1A B p41 Arc Sop2h p40 Arc40p ARPC2 p34 Arc p35 Arc35p ARPC3 p21 Arc p18 Arc18p ARPC4 p20 Arc p19 Arc19p ARPC5 p16 Arc p14 Arc15p Tableau 5 Nomenclature des prot ines du complexe Arp2 3 Le tableau indique le nom standardis de chaque sous unit du complexe suivi de l ancien nom correspondant chez l humain Acanthamoeba castellanii et la levure de boulanger repr sente des isoformes de ces sous unit s Adapt de Higgs et Pollard 2001 86 WASP Complexe arp2s3 actif Complexe Arp2s3 O inair e Cdc42 Figure 17 Arp2 3 et le r seau d actine A gauche mode de fonctionnement du complexe Arp2 3 dans la nucl ation des monom res d actine N WASP doit tre recrut e par la forme active de Cdc42 une GTPase pour pouvoir interagir avec Arp2 3 et stimuler l assemblage des monom res d actine Adapt e de Welch 1999 A droite R seau d actine observ au microscope lectronique Cytosquelette d actine dans un lamellipode d un fibroblaste de souris Les filaments d actine sont color s afin d observer des branchements ind pendants Les inserts circulaires montrent quelques exemples de marquage immunogold de la sous unit ARPC3 du co
71. les chambres de culture Lab Tek Nunc une densit de 71000 cellules cm Ces Lab Tek permettent d tudier des cellules vivantes 79 D veloppement d un fluorophore photoactivable lll Incubation avec les diff rents d riv s de la coumarine Le milieu de culture est aspir et les cellules sont lav es avec du tampon HBSS pH 7 35 puis incub es 30 min 37 C avec le compos dilu dans du tampon HBSS modifi Apres trois lavages avec du tampon HBSS les cellules sont visualis es au microscope confocal a la plateforme d imagerie de l IGBMC La lame est maintenue 37 C avec une platine chauffante Le microscope utilis est un Leica SP2 quip d une diode UV permettant une excitation a 405 nm les cellules sont observ es avec un objectif X63 a immersion a huile HBSS NaCl 8 g L Na2HPO 0 06 g L KCl 0 4 g L KH2PO 0 06 g L NaHCO 0 359 L HEPES 100 mM pH 7 35 Glucose 2 g L 80 Partie 2 Dynamique et recherche de nouveaux partenaires de Bzzlp membre de la famille PCH Chapitre 1 Introduction Recherche de partenaires de Bzz1p Chapitre 1 Introduction La cellule eucaryote est capable d adopter une vari t de formes se mouvoir se diviser ou se diff rencier gr ce un r seau interne tr s complexe et hautement dynamique Ce r seau est compos de longs filaments prot iques qui s etendent dans tout le cytoplasme Ce r seau tr s structur est appel cytosquelette bien qu il sub
72. les compos s au site de croissance cellulaire polaris e Ce syst me de transport bas sur les myosines de type V est aussi employ pour livrer les prot ines des extr mit s des microtubules Bimip et Kar9p et pour la stabilisation des microtubules polaris s au cortex cellulaire durant la division mitotique Adapt e de Faix et Grosse 2006 Recherche de partenaires de Bzz1p une affinit de l ordre du micromolaire Goode et Rodal 2001 Ces propri t s permettent a Abp1p de recruter le complexe Arp2 3 sur le c t de filaments pr existants avec une modeste activit de NPF La coronine une prot ine conserv e du cytosquelette d actine localise au niveau des sites d assemblage dynamique de l actine pour revue De Hostos 1999 La coronine est une des rares prot ines capables d interagir avec l actine F et les microtubules tablissant un lien entre ces deux structures De Hostos 1999 Chez S cerevisiae la coronine ou Crnip est capable de se lier directement au complexe Arp2 3 via des interactions entre un motif coiled coil de Crnip et la sous unit ARPC2 Cette interaction inhibe directement la nucl ation de l actine par le complexe Arp2 3 Humphries et al 2002 b Les c bles d actines les formines Les c bles d actine sont des structures dynamiques complexes form es de longs filaments d actine associ s parall lement Des mutations affectant diff rentes sous unit s du complexe Arp2 3
73. motif prot ique t tracyst ine CCXXCC ou X correspond a n importe quel acide amin La s quence ayant la meilleure affinit pour lier le ReAsH EDT est CCPGCC Adams et al 2002 L avantage de ce fluorophore est qu il devient fluorescent seulement une fois li au motif t tracyst ine Ainsi il y a une forte augmentation du rapport signal bruit Un des ses inconv nients majeurs est sa potentielle toxicit sur les cellules en effet pour limiter les effets secondaires dus a des liaisons non sp cifiques il faut toujours ajouter de l thanedithiol avec le fluorophore 43 D veloppement d un fluorophore photoactivable B Synth ses Une synth se totale convergente a t pr vue c est dire les synth ses respectives de la cage et du ReAsH EDT avant condensation Pour la cage nous souhaitions utiliser une cage nouvellement d crite au laboratoire Specht et Goeldner 2004 dont la synth se tait bien ma tris e le 1 choro 1 2 nitro 4 5 dim thoxy ph nyl 2 2 2 trifluoro thyle DMNPT compos 4 Bri vement le compos 1 est obtenu par r action d un aryllithium sur le trifluoroac tate de m thyle On obtient le compos 3 apr s une r action de nitration s lective en position ortho par l acide nitrique 0 C suivie d une r duction par NaBH Apr s une r action de chloration par le chlorure de thionyle on obtient le compos 4 Sch ma 5 Br FC O FC O0 F3C___OH FC CI Q a b NO2 c NO2 d NO MeO
74. par microscopie lectronique si les domaines FCH F BAR de Bzz1p ou la prot ine enti re sont capables de lier et d former ou tubuler les membranes comme le font les homologues mammif res de Bzz1p Itoh et al 2005 Tsujita et al 2006 En conclusion concernant les nouveaux r les ventuels de Bzz1p les indices les plus interessants que nous ayons obtenus proviennent des exp riences faites sur des domaines isol s Avec les GST pulldowns sur les domaines SH3 de Bzz1p nous avons 152 Recherche de partenaires de Bzz1p confirm l appartenance de Bzz1p au complexe prot ique Las17p Vrp1p Myo3 5p et nous avons pu identifier deux nouvelles prot ines Yir003Wp et Ybr108Wp qui pourraient relier Bzz1p d autres complexes du cytosquelette d actine De plus nous avons montr que le domaine FCH de Bzz1p est capable de lier les phosphoinositides phosphoryl s Donc Bzzip serait un connecteur permettant l accrochage des complexes activateurs de la polym risation de l actine aux membranes en particulier la membrane plasmique et certainement d autres sites 153 Chapitre 4 Mat riels et m thodes Recherche de partenaires de Bzz1p Chapitre 4 Mat riels et M thodes Le manuel de biologie mol culaire de Sambrook et Russel 2001 a t utilis comme guide pour la plupart des m thodes concernant la pr paration de l ADN plasmidique d E coli le traitement de l ADN par des enzymes de restriction et de modificati
75. partir des monom res d actine G et reste associ a l extr mit du filament d actine pour promouvoir l longation contrairement au complexe Arp2 3 et ce m me en pr sence de prot ines de coiffe Le domaine FH1 contient une r gion riche en proline qui s associe la profiline une prot ine de liaison aux monom res d actine et participe la 105 Cell wall A nar _ fatin cortex linke Plasma membrane Cortical patch Actin Actin filament filament Pa Arp2 3 complex Actin cable Figure 25 Ultrastructure des taches corticales d actine par microscopie lectronique A Des invaginations de la membrane sont enrichies en actine immunomarqu e avec des particules d or de 10 nm fl che et en Abpip immunomarqu e avec des particules d or de 20nm B Mod le d organisation des filaments d actine aux taches corticales bas sur l image A C Les filaments d actine au cortex cellulaire sont organis s en r seaux filamenteux ramifi s ayant une forme de c ne D Mod le d organisation des filaments d actine aux taches corticales bas sur l image C A et C de Mulholland et al 1997 C et D de Rodal et al 2005 Recherche de partenaires de Bzz1p nucl ation de l actine en collaboration avec le domaine FH2 En plus de la profiline il a t d montr que la prot ine Bud p interagissait avec la portion C terminale de Bniip pour favoriser la nucl ation par Bni1p mai
76. phase fluide ne sont pas non plus perturb es par les diff rentes d l tions simples cf figures 35 et 36 Les cellules bzz1A myo5A sont sensibles a une forte concentration de sel 1 M et pr sentent un retard de croissance 25 C voire une mort cellulaire 37 C Soulard et al 2002 nous avons donc test l effet d un stress salin sur les cellules ayant des d l tions simples des g nes codants pour les partenaires obtenus avec le Protoarray Le stress salin est connu pour provoquer un d lai de croissance au cours duquel le cytosquelette 149 Recherche de partenaires de Bzz1p d actine est rapidement d polaris Chowdhury et al 1992 Apr s une ou deux heures les cellules s adaptent au milieu et repolarisent progressivement et totalement leur cytosquelette d actine Dans les cellules sauvages de la souche BY4742 le temps n cessaire pour l adaptation et le retour une polarisation du cytosquelette d actine est de quatre ou cinq heures pour avoir une r cup ration totale Dans ces conditions le cytosquelette d actine est repolaris dans seulement deux tiers des cellules de la souche ycr076CA Ainsi la repolarisation du cytosquelette d actine apr s un stress salin serait affect e dans la souche mutante ycr076CA Nous avons souhait tester les interactions potentielles des prot ines X retenues avec le Protoarray dans un syst me g n tique ainsi nous avons test si la d l t
77. point PIP Strip Echelon Bioscience Ptdins 3 PI4K OB did PI3Ks class Il Y Si class 11 P P ai P P PI3Ks class 141 gt P P P P1 3 4 Pa PI 3 P PI 4 P D PI 4 P5K Synaptojanin PI3Ks class 11 PI 3 5 P PLC PI 4 5 P P1 3 4 5 P Figure 40 M tabolisme des phosphoinositides Adapt e de Simonsen et al 2001 Bzz1 GFP DIC Bzz1 GFP DIC FY833 fablA MH565 de Vps344 SD100 mss4 2ts Figure 41 Localisation de Bzz1 GFP dans des souches d fectueuses dans le m tabolisme de certains phosphoinositides Les souches FY833 MH565 et SD100 sont les souches sauvages contr les respectives des souches fab14 vps344 et mss4 2ts Recherche de partenaires de Bzz1p utilis une membrane de nitrocellulose o ont t d pos s plusieurs lipides en particulier les phosphoinositides PIP strip Echelon Bioscience La prot ine d int r t tiquet e s hybride avec ces partenaires lipidiques pendant une incubation d une heure 4 C puis l interaction est r v l e par l utilisation d un anticorps coupl la peroxydase qui peut alors r agir avec le luminol En pratique nous avons construit le domaine FCH les 110 premiers acides amin s de Bzz1p et le domaine F BAR c est dire le domaine FCH plus le coiled coil les 210 premiers acides amin s de Bzz1p fusionn s en C terminal avec une tiquette prot ique de six histidines ainsi que l pitope V5 Le domaine FCH
78. pour masquer la fluorescence d une coumarine pour la fluorescence et du syst me NTA Nickel polyhistidines pour la reconnaissance entre cette sonde et la prot ine Cette sonde comporte trois l ments le groupement photolabile le fluorophore masqu et finalement le motif NTA Ni Pour les tudes biologiques nous avions aussi besoin de mol cules contr les En effet pour les mises au point des conditions de p n tration cellulaire de notre sonde il tait n cessaire de disposer d une mol cule fluorescente dont la perm abilit la membrane cellulaire tait assur e une coumarine modifi e par un motif NTA dont les trois groupements acides sont prot g s par des esters Et pour la mise au point du protocole d entr e dans les cellules d une mol cule portant un groupement NTA nous avions aussi besoin d une coumarine greff e un motif NTA Pour ces deux mol cules il est indispensable de prot ger l hydroxyle de la coumarine car pH physiologique il est sous forme anionique et pourrait emp cher l entr e dans la cellule Cet hydroxyle a t prot g en ester ac tique car les est rases cellulaires sont capables d hydrolyser ces esters Zhao et al 2004 46 D veloppement d un fluorophore photoactivable B Synth ses Une synth se totale convergente a t r alis e c est dire les synth ses respectives de la cage du fluorophore et du groupement NTA avant les condensations successives
79. principe le fluorophore doit tre conjugu une entit biologique proche de la prot ine cible de la photoinactivation Enfin d autres mutations ont conduit au d veloppement de prot ines fluorescentes photoactivables elles sont d crites dans le paragraphe suivant 2 Prot ines fluorescentes photoactivables R cemment de nouvelles possibilit s d imagerie cellulaire sont arriv es avec le d veloppement de prot ines fluorescentes photoactivables ou PAFPs Ces prot ines fluorescentes sont capables de changements prononc s dans leurs propri t s spectrales en r ponse une irradiation lumineuse une longueur d onde et une intensit sp cifiques Certaines prot ines passent d un tat peu ou pas fluorescent un tat tr s fluorescent c est une photoactivation alors que d autres prot ines changent de couleur de fluorescence c est une photoconversion pour revue Chapman et al 2005 Lukyanov et al 2005 Parmi ces PAFPs il y a des prot ines t tram riques utiles pour le marquage de cellules enti res ou d organelles et des prot ines monom riques utilis es pour le suivi de la dynamique d une prot ine Les PAFPs peuvent tre class es en trois groupes selon leur m canisme de photoactivation Figure 4 Les prot ines fluorescentes pr sentent de nombreux avantages le large choix de couleurs disponibles et leur marquage tr s sp cifique permet une haute sensibilit de d tection s
80. prot ique Lie DHFR Dissociation prot ine 1 Aucune endog ne ligand 57 FKBP12 F36V 108 Excellente Aucune dd ligand Prot ines a la surface cellulaire Environnement i Marquage lent r ducteur Lie AGT hAGT SNAP tag endog ne ACP PCP PPtase Excellente ds eae Comp tition avec nemer ligation pi cysteine chimique endogene HaloTag Excellente Sonde utilisant une s quence peptidique Hise Ni NTA HiseZiFit Faible pour 6 His mais relativement bonne pour 10 His Excellente Prot ines la surface cellulaire Dissociation rapide Ni teint la fluorescence Peptide liant le Texas Red T tracyst ine bisarseni e Biotine Ligase hydrazide Excellente Bruit de fond dt a Vaffinit avec les monothiols Excellent Un substrat naturel dans E coli Seulement le Texas Red Environnement reducteur Prot ines la surface cellulaire Dissociation ligans Fluorog nique possibilit de toxicit r siduelle de l arsenic temps longs de marquage Deux tapes de marquage Incorporation d acides amin s non naturels Sonde utilisant une autre m thode Excellente Non d montr dans tous les types cellulaires Effet dominant n gatif du des prot ines tronqu es Tableau 3 Diff rentes m thodes pour tiqueter des prot ines avec de petites sondes chimiques Adapt de Chen et Ting 2005 40 tiquette
81. r 63 g BUANF THF une nuit TA D veloppement d un fluorophore photoactivable hydrolyse de l ac tate a t observ e lors de la r action de d protection des acides Comme la purification sur colonne de silice tait difficile du fait de la pr sence des trois acides nous avons voulu purifier le compos coumarine cag par chromatographie liquide haute performance HPLC sur colonne vydac C18 mais dans les conditions utilis es gradient ou mode isocratique les quatre formes proton es d proton es du NTA sont observ es ce qui rend difficile une purification En effet si Le produit correspondant un pic tait purifi lors de la chromatographie pour v rifier sa puret les m mes quatre pics taient de nouveau observ s Il a donc fallu concevoir une nouvelle strat gie de synth se dont l tape de d protection finale serait totale et ne lib rant pas de sous produits b Alloc PMB Nous avons alors choisi de prendre le couple allyloxycarbonyle Alloc GP1 para m thoxybenzyle PMB GP2 Le groupement Alloc permet de prot ger les fonctions amines et il peut tre enlev par le tetrakis triph nylphosphine palladium 0 Dangles et al 1987 Le para m thoxybenzyl ester lui prot ge les fonctions hydroxyles et nous voulions l utiliser pour prot ger les fonctions acides carboxyliques Il se d prot ge par une hydrolyse acide avec du TFA anisole Stewart 1968 Mais cette strat gie Sch ma 12 s
82. sistance a cet antibiotique Milieu LB Luria Broth bactotryptone 1 P NaCl 1 P extrait de levure 0 5 P Milieu M9 Na HPO 2H20 7 5 g L KH PO4 3 g L NaCl 0 5 g L NHACI 1 g L Apr s autoclavage ajout de 5 mL de glucose 40 1 mL de vitamine B1 0 2 g mL et 1 mL de MgSO 1M 154 Recherche de partenaires de Bzz1p Tous les milieux sont st rilis s par autoclavage a 120 C sous une pression de 1 2 bar pendant 20 min Ils peuvent tre solidifi s par l addition de 2 P d agar Les cellules sont conserv es dans du milieu glyc rol 15 80 C C Transformation et isolation de l ADN Plasmidique 1 Transformation a M thode chimique 10 mL de milieu LB sont inocul s a partir d une colonie stri e sur milieu solide de la souche que l on d sire rendre comp tente et incub s une nuit a 37 C Le lendemain l erlenmeyer contenant la souche est plac a 4 C pour la journ e 0 4 mL de cette pr culture sont ajout s 25 mL de milieu SOB Les bact ries cultiv es sur la nuit a 18 C a 220 g jusqu une absorbance de 0 4 sont refroidies 10 min dans la glace Apr s 15 min de centrifugation 2 500 g 4 C le culot est repris dans 4 mL de milieu TB froid Apr s 10 min sur la glace les cellules sont de nouveau centrifug es 2 500 g 4 C Elles sont resuspendues dans 1 mL de TB froid Du DMSO est ajout goutte goutte jusqu une concentration finale de 7 et les cellules sont incub es e
83. sondes sont fluorog niques Stroffekova et al 2001 De plus malgr l utilisation d antidotes dithiols la toxicit de l arsenic reste un probl me long terme La n cessit d un environnement r ducteur pour la fixation du peptide t tracyst ine a la sonde biarsenic ajoute des complications techniques pour le marquage 37 EAN gt J Figure 8 Marquage d une prot ine avec une sonde chimique en utilisant une enzyme pour cr er une liaison covalente avec tiquette peptidique La prot ine fusionn e une tiquette peptidique peptide accepteur bleu est exprim e Une enzyme biotine ligase cyan marque l tiquette peptidique avec la sonde chimique directement ou indirectement Adapt e de Chen et Ting 2005 Su gt ye ET er s VAG __ gt j Translation Ne PA Figure 9 Marquage d une prot ine avec une sonde chimique en utilisant l incorporation d un acide amin non naturel Un codon stop ambre UAG est introduit dans la s quence codante de la prot ine d int r t par mutag n se Pendant la traduction un ARNt portant l anticodon AUC qui a t aminoacyl avec un acide amin non naturel supprime le codon stop et permet la production d une prot ine complete contenant l acide amin non naturel Adapt e de Chen et Ting 2005 D veloppement d un fluorophore photoactivable Tr s r cemment l quipe de Tsien a d velopp une nouvelle m thodologie appel e His
84. tat fondamental partir du niveau de vibration le plus bas de l tat excit r gle de Kasha s Cette diff rence est appel e d placement de Stokes Ce d placement du spectre d mission vers des longueurs d onde plus lev es donc de moindre nergie d crit par la loi de Stokes est essentiel pour la s paration et la d tection de la lumi re de fluorescence signal sp cifique d livr par le fluorophore Il existe un grand choix de fluorochromes chacun pouvant tre caract ris par ses spectres d excitation et d mission Les diff rentes caract ristiques des fluorophores sont Longueurs d onde celles qui correspondent aux pics des spectres d excitation et d mission 17 photon AV fluo fluo NY AE N Excitation 1 photon Excitation 2 photon Figure 1 Excitation mono et bi photonique Les photons doivent arriver dans une fen tre de l ordre de 10 18 secondes une attoseconde Cette chelle de temps est compatible avec la dur e de vie de cet tat virtuel 10 17 secondes soit 0 01 femtoseconde Source http confocal medecine uhp nancy fr JST Amplitude pdf D veloppement d un fluorophore photoactivable Coefficient d extinction ou absorption molaire il relie la quantit de lumi re absorb e une longueur d onde donn e a la concentration du fluorophore en solution M cm Rendement quantique efficacit relative de la fluorescence compar e aux autres voies de d sex
85. 00 uL de billes Ni NTA pr lav es avec PBS 2X SDS 0 2 B mercapto thanol 0 5 mM pH 8 et incub s sur roue 1 2 h a T ambiante puis centrifug s 6 000 g 30 s Apr s 2 lavages avec du PBS 2X SDS 0 2 B mercapto thanol 0 5 mM pH 8 les billes sont lav e encore 2 fois avec du PBS 2X SDS 0 05 B mercapto thanol 0 5 mM pH 8 La prot ine d int r t est alors lu e par une incubation de 10 min avec 500 600 uL de PBS 1X SDS 0 05 B mercapto thanol 0 5 mM imidazole 100 mM ajuster selon la prot ine et ses contaminations inhibiteurs de prot ases pH 7 4 Apr s une breve centrifugation la prot ine purifi e est r cup r e 163 Recherche de partenaires de Bzz1p Tampon de solubilisation 40 mM bicarbonate de sodium pH 9 6 B mercapto thanol 20 mM SDS 1 Inhibiteurs de prot ases C Conservation des extraits prot iques Une fois r alis s les extraits prot iques peuvent tre aliquot s et conserv s 80 C pendant plusieurs mois Pour cela les extraits sont congel s en les immergeant dans un bain d azote liquide avant d tre plac s 80 C D D termination de la concentration en prot ines La concentration en prot ine des extraits est d termin e selon la m thode de Bradford 1976 Cette m thode utilise la propri t du bleu de Coomassie se fixer non sp cifiquement sur les acides amin s nucl ophiles le complexe colorant prot ine form montre un maximum d abso
86. 1 Yeast endocytosis assays Methods Enzymol 194 697 710 Dulic V and Riezman H 1989 Characterization of the END1 gene required for vacuole biogenesis and gluconeogenic growth of budding yeast Embo J 8 1349 1359 Duncan M C Cope M J T V Goode B L Wendland B and Drubin D G 2001 Yeast Eps15 like endocytic protein Pan1p activates the Arp2 3 complex Nat Cell Biol 3 687 690 Dunn T M and Shortle D 1990 Null alleles of SAC7 suppress temperature sensitive actin mutations in Saccharomyces cerevisiae Mol Cell Biol 10 2308 2314 Dupre S Urban Grimal D and Haguenauer Tsapis R 2004 Ubiquitin and endocytic internalization in yeast and animal cells Biochim Biophys Acta 1695 89 111 Eden S Rohatgi R Podtelejnikov A V Mann M and Kirschner M W 2002 Mechanism of regulation of WAVE1 induced actin nucleation by Rac1 and Nck Nature 418 790 793 Endris V Wogatzky B Leimer U Bartsch D Zatyka M Latif F Maher E R Tariverdian G Kirsch S Karch D and Rappold G A 2002 The novel Rho GTPase activating gene MEGAP srGAP3 has a putative role in severe mental retardation Proc Natl Acad Sci U SA 99 11754 11759 175 R ferences bibliographiques Engels J and Schlaeger E J 1977 Synthesis structure and reactivity of adenosine cyclic 3 5 phosphate benzyl triesters Med Chem 20 907 911 Engqvist Goldstein A E and Drubin D G 2003 Acti
87. 1 1 2 09 g d un solide jaune sont r cup r s p 45 O HOLA OO a H O Pl tex Nig ky k b c O oX h g o So en j j 76 D veloppement d un fluorophore photoactivable RMN H CDCU3 5 1 45 s 18H Hk 1 46 s 9H Hj 1 63 1 70 m 6H He Hf et Hg 3 33 t 1H Hh 3 40 m 2H Hd 3 48 2s 4H Hi 7 06 s 1H Ha 7 65 s 1H Hb 8 75 s 1H Hc Q Cage Coumarine Lysine NTA tBu 17 Dans un ballon anhydre sous argon et agitation le compos 16 938 mg 1 44 mmol et le 3 4 5 dim thoxy 2 nitroph nyl butan 2 ol 733 mg 2 88 mmol 2 qu sont dissous dans 10 mL de benz ne anhydre Dans un autre ballon anhydre sous argon et agitation la triphenylphosphine 1 13 g 4 32 mmol 3 qu et le DIAD 850 pL 4 32 mmol 3 qu sont dissous dans 5 mL de benzene distill le m lange est ensuite ajout goutte a goutte dans le ballon contenant la coumarine NTA tBuz et la cage Il est rinc avec 5 mL de benzene distill et le contenu est de nouveau ajout au premier ballon La r action est laiss e une nuit a temp rature ambiante Le brut est vapor a sec et chromatographi sur gel de silice luant heptane ac tate d thyle 7 3 Puis comme le produit n est pas pur il est ensuite purifi par HPLC en mode isocratique luant ac tonitrile TFA 0 1 75 25 Apr s le m lange obtenu est ensuite extrait 3 fois avec du dichlorom thane Les phases organiques sont rass
88. 1p Rodal et al 2003 Ainsi le test de polym risation peut permettre de tester si les domaines SH3 de prot ines impliqu es dans la r gulation du cytosquelette d actine sont capables d activer la polym risation ou 118 Transformation Culture a 37 Milieu Galactose Ura Trp Extraction ADN plasmidique et genomique Transformation dans E coli TOP10 amplification ADN plasmidique Extraction ADN plasmidique Transformation dans E coli pyrF Extraction d ADN Analyse par PCR puis plasmidique s quen age de lt __ chaque clone obtenu Milieu M9 S lection plasmide URA3 Figure 31 Principe du crible de surexpression Recherche de partenaires de Bzz1p au contraire de l inhiber Dans ce dernier cas il est n cessaire d utiliser des extraits prot iques de levure contenant un activateur connu de la polym risation de l actine fusionn e avec une prot ine fluorescente par exemple une GFP ce qui permet une visualisation directe de l interaction au microscope Mirey et al 2005 ou par un Western blot en utilisant un anticorps anti GFP ll Crible de surproduction de Bzz1p Au laboratoire il avait t mis en vidence qu une surproduction de Bzz1p dans des cellules de levure sauvages provoquait un ralentissement de la croissance 25 C et un arr t de croissance 37 C Soulard et al 2002 Afin de d terminer si ces d fauts de croissance
89. 2001 Photolabile protecting groups for nucleosides mechanistic studies of the 2 2 nitrophenyl ethyl group Helv Chim Acta 84 1601 1611 Walther T C Brickner J H Aguilar P S Bernales S Pantoja C and Walter P 2006 Eisosomes mark static sites of endocytosis Nature 439 998 1003 Wang J Xie J and Schultz P G 2006 A genetically encoded fluorescent amino acid J Am Chem Soc 128 8738 8739 Wang L and Schultz P G 2002 Expanding the genetic code Chem Commun 1 11 Wang Q Chan T R Hilgraf R Fokin V V Sharpless K B and Finn M G 2003 Bioconjugation by copper l catalyzed azide alkyne 3 2 cycloaddition Am Chem Soc 125 3192 3193 188 R ferences bibliographiques Wang W and Ferro Novick S 2002 A Ypt32p exchange factor is a putative effector of Ypt1p Mol Biol Cell 13 3336 3343 Weaver A M Heuser J E Karginov A V Lee W l Parsons J T and Cooper J A 2002 Interaction of Cortactin and N WASp with Arp2 3 Complex Curr Biol 12 1270 1278 Weaver A M Karginov A V Kinley A W Weed S A Li Y Parsons J T and Cooper J A 2001 Cortactin promotes and stabilizes Arp2 3 induced actin filament network formation Curr Biol 11 370 374 Wegner A and Isenberg G 1983 12 fold difference between the critical monomer concentrations of the two ends of actin filaments in physiological salt conditions Proc Natl Acad Sci U SA
90. 4 mmol est dissous dans 280 mL de m thanol Puis sous argon et agitation le Pd C 10 450 mg est ajout La r action est agit e vigoureusement sous H pendant 24 h a temp rature ambiante Le brut est filtr sur c lite puis le filtrat est vapor sec 5 3 g d une huile incolore sont r cup r s p 98 voll 2 ae RMN H CDCI3 3 1 45 s 18H Hh 1 47 s 9H Hg 1 49 1 65 m 6H Hb Hc et Hd 2 69 t 2H Ha 3 32 t 1H He 3 48 2s 4H Hf P Coumarine Lysine NTA tBu 16 Dans un ballon anhydre le compos 7 2 8 g 11 9 mmol 1 6 qu est dissous dans 35 mL de DMF anhydre et est refroidit a 0 C Puis sous argon et agitation le N Hydroxysuccinimide 1 5 g 13 09 mmol 1 8 equ est ajout et la r action est laiss e 1 h 0 C Puis le DCC 2 7 g 13 09 mmol 1 8 qu est ajout et la r action reste encore 30 min a 0 C puis 2 h temp rature ambiante Un m lange du compos 15 3 1 g 7 14 mmol et de DIEA 2 28 mL 13 09 mmol 1 8 qu dissous dans 15 mL de DMF anhydre est ajout a la r action qui est alors laiss e 3 h a temp rature ambiante Le brut est vapor a sec puis redissous avec de l eau et la phase aqueuse est extraite 3 fois avec du dichlorom thane Les phases organiques sont rassembl es s ch es par du sulfate de sodium anhydre filtr es et vapor es a sec Le produit obtenu est purifi sur colonne de silice luant heptane ac tate d thyle
91. 4304 Tang H Y Xu J and Cai M 2000 Pan1p End3p and STalp three yeast proteins required for normal cortical actin cytoskeleton organization associate with each other and play essential roles in cell wall morphogenesis Mol Cell Biol 20 12 25 Theriot J A and Mitchison T J 1991 Actin microfilament dynamics in locomoting cells Nature 352 126 131 Tian L Nelson D L and Stewart D M 2000 Cdc42 interacting protein 4 mediates binding of the Wiskott Aldrich syndrome protein to microtubules J Biol Chem 275 7854 7861 Tong A H Y Drees B Nardelli G Bader G D Brannetti B Castagnoti L Evangelista M Ferracuti S Nelson B Paoluzi S et al 2002 A combined experimental and computational strategy to define protein interaction networks for peptide recognition modules Science 295 321 324 187 R ferences bibliographiques Toret C P and Drubin D G 2006 The budding yeast endocytic pathway J Cell Sci 119 4585 4587 Torres E and Rosen M K 2003 Contingent phosphorylation dephosphorylation provides a mechanism of molecular memory in WASP Mol Cell 11 1215 1227 Toshima J Toshima J Y Martin A C and Drubin D G 2005 Phosphoregulation of Arp2 3 dependent actin assembly during receptor mediated endocytosis Nature Cell Biology 7 246 254 Tsien R Y 1998 The green fluorescent protein Ann Rev Biochem 67 509 544 Tsujita K Suetsugu S Sas
92. 5 de Schizosaccharomyces pombe impliqu e dans la r gulation de la division cellulaire est le membre fondateur de cette famille Fankhauser et al 1995 Les 111 CIP4a CIP4b CIP4c CIP4V Fbp17A Fbp17B FCHO 1 FCHO 2 NOSTRIN PACSIN 1 PACSIN 2 I PACSIN 3 BrcH icc cc amp HRI SH3 PSTPIP1 NPF motifs PSTPIP2 Toca 1 Nwk Bzz1 100 AA Figure 28 Structure primaire des domaines des prot ines PCH Cette famille est bas e sur la structure de Cdc15 de S pombe Les lignes pointill es d limitent le domaine EFC ou F BAR Les ARNm provenant d un pissage alternatif du m me g ne sont indiqu s avec un ast risque les variants g n r s par mutation sont indiqu s par deux ast risques Abr viations CC coiled coil FCH Fes CIP4 homology domain HR1 protein kinase C related kinase homology region 1 NPF Asn Pro Phe motifs et SH3 Src Homology 3 Une sous classe des prot ines PCH constitu e de Bzzip et Nwk et leurs orthologues ont deux domaines SH3 Adapt e de Chitu et Stanley 2007 Recherche de partenaires de Bzz1p membres de cette famille ont peu de similarit de s quences mais partagent une architecture similaire de leurs domaines une r gion dite FCH Fes Cip4 Homology l extr mit N terminale suivie d une ou plusieurs r gions coiled coil CC souvent impliqu es dans la dim risation des prot ines et un ou deux domaines SH3 l extr mit C terminale Figure 28 Lippin
93. 61p et Rvs167p qui sont impliqu es dans la promotion de la scission membranaire Jonsdottir et Li 2004 Kaksonen et al 2005 Mouvement rapide Une fois que les taches corticales v sicules quittent le cortex cellulaire elles bougent rapidement vers l int rieur de la cellule le long des c bles polaris s d actine Le flux r trograde du bourgeon vers la cellule m re des c bles semblent porter les patches vers les compartiments de tri des endosomes Huckaba et al 2004 Il semblerait que ce transport soit passif ce qui sugg re qu il y ait un lien physique entre les patches et les c bles Huckaba et al 2004 Les facteurs connus pour tre associ s aux taches bougeant rapidement sont Abp1p le complexe Arp2 3 Capip Cap2p et Sac6p Huckaba et al 2004 Kaksonen et al 2003 Fusion et d mant lement Finalement il y a une tape de fusion de la v sicule nouvellement form e a un endosome et la tache est d mantel e 3 La famille PCH a G n ralit s Les membres de la famille Pombe Cdc15 homology PCH sont des prot ines multi domaines qui servent d adaptateur et ont des r les essentiels pour rapprocher physiquement le cytosquelette d actine et les membranes lors de l endocytose Kessels et Qualmann 2004 Lippincott et Li 2000 A l exception des plantes les g nes codant pour les prot ines PCH ont t identifi s dans la plupart des eucaryotes Figure 27 La prot ine Cdc1
94. Autres groupements photolabiles utilis s 27 Figure 3 Structure de la GFP a Forme g n rale de la GFP et son association en dim re Onze feuillets b forment le tonneau au centre duquel se trouve le fluorophore code pdb 1GFL Adapt e de Yang et al 1996 b Diagramme sch matique de l interaction entre le chromophore et ses environs dans le mutant S65T Les liaisons hydrog nes possibles sont montr es en tiret Adapt de Ormo et al 1996 Fluorescent proteins available Blue Cyan Green Photoactivatable Amaxa pmaxFP Green pmaxFP Yellow pmaxFP Red www amaxa com BD Biosciences Clontech AmCyan1 AcGFP1 ZsYellow1 DsRed2 www clontech com ZsGreen1 DsRed Express DsRed Monomer Timer AsRed2 HcRed1 Evrogen TurboGFP JRed www evrogen com Invitrogen EmGFP www invitrogen com Lux Biotechnology RmGFP www luxbiotech com PtGFP RrGFP MEL International Midoriishi Cyan Azami Green Kusabira Orange Dronpa Green www mblintl com Kaede KikGR NanoLight Technology RmGFP www nanolight com PtGFP RrGFP Promega Monster Green www promeg a com Stratagene hrGFP www stratagene co m pmaxFP Green pmaxFP Yellow and pmaxfP Red are other names of TurboGFP phiYFP and JRed proteins respectively Tableau 2 Grande vari t spectrale des prot ines fluorescentes disponibles commercialement Adapt de Chudakov et al 2005 D veloppement d un fluorophore photoactivable Les propri t s et caract ristiques de
95. B Une r cente tude de Rodal et al 2005a a fourni des informations tridimensionnelles compl mentaires de l ultrastructure des taches corticales La figure 25C et D montrent que les structures ont une forme de c ne avec le complexe Arp2 3 positionn l apex et il semblerait qu il y ait une relation entre ces monticules d actine et les invaginations en forme de doigt Young et al 2004 ont montr que les filaments d actine dans des taches corticales d actine partiellement purifi es forment un r seau ramifi o les filaments ont une polarit uniforme Ces observations et celles in vivo de Rodal et al 2005b sugg rant que le complexe Arp2 3 qui lie les extr mit s des filaments est l apex des taches corticales en forme de c ne il semblerait que la majorit des extr mit s des filaments d actine dans les taches corticales soit orient e vers le cortex cellulaire 107 2 Mouvements corticaux lents 3 Invagination d pendants de l actine et scission 1 Recrutement Clathrin and its adaptors Membrane binding protein Endocytic adaptor O NPF amp Arp2 3 complex Kinase D F actin bundling protein 5 Fusion et d mant lement Endosome Figure 26 Mod le pour le d veloppement des taches corticales d actine Etape 1 Les r cepteurs recrutent des composants pr coces des patches gt incluant la clathrine des adaptateurs et 2 NPFs Panip et Las17p au cortex c
96. B Organisation et fonctions du cytosquelette d actine chez la levure 1 Organisation du cytosquelette d actine au cours du cycle cellulaire La levure poss de trois structures contenant des microfilaments les c bles d actine l anneau contractile d acto myosine et les taches corticales d actine On peut les distinguer lors de la division cellulaire par bourgeonnement Adams and Pringle 1984 Les c bles sont constitu s de microfilaments r unis ensemble parall lement et les taches corticales d actine ou patches sont des petits foci form s d un r seau de microfilaments et de nombreuses autres prot ines associ s la membrane plasmique Les microfilaments sont galement retrouv s dans l anneau contractile lors de la cytocin se Amberg 1998 Bi et al 1998 Lippincott et Li 1998 Comme le montre la figure 23 ces structures ont une localisation polaris e au cours du cycle cellulaire pour revue Pruyne et Bretscher 2000a Lors de la croissance v g tative dans les cellules en phase G1 les taches corticales sont r parties dans toute la cellule et les c bles sont orient s au hasard Apr s s lection du site de bourgeonnement les taches corticales d actine entourent le site d mergence du bourgeon et les c bles 99 Recherche de partenaires de Bzz1p convergent vers ce site en s orientant parall lement l axe cellule m re bourgeon Figure 22 Les taches corticales d actines restent l
97. Bzzip et les complexes COPI et COPII ne seraient pas pertinentes in vivo soit qu une faible population de Bzz1p serait au niveau du Golgi En effet dans les cellules de mammif res le cytosquelette d actine est recrut au niveau des membranes du Golgi Cao et al 2005 Avec cette technique nous avons confirm que les domaines SH3 de Bzzip sont capables d interagir avec des prot ines du cytosquelette d actine comme Las17p Vrp1p Abp1p Myo5p et Bbcip Cette m thode permet de r v ler des interactions prot ine prot ine directe ou indirecte c est dire avec une ou plusieurs prot ines comme interm diaires au sein d un complexe prot ique En effet Las17p Vrp1p et Myo5p font partie du complexe prot ique Las17 Vrp1 Myo3 5 et Bzzip est un activateur de Las17p Sun et al 2006 La prot ine Yir003Wp semble interagir avec le deuxi me domaine SH3 de Bzz1p Yir003Wp interagit avec aussi avec Bbc1p Tong et al 2002 Abp1p et Rvs167p Landgraf et al 2004 ainsi qu avec des prot ines de coiffe des filaments d actine Cap1 Cap2p Collins et al 2007 Gavin et al 2006 Ybr108Wp quant elle interagirait avec les deux domaines SH3 de Bzz1p La prot ine Ybr108Wp parait interagir avec Rvs161p et Rvs167p Germann et al 2005 Krogan et al 2006 ainsi qu avec la kinase Prk1p Ptacek et al 2005 ainsi qu avec des prot ines liant Las17p Lsb3p et Ysc84 Lsb4p Landgraf et al 2004 et Lsbip Ito et al 2001 Si les intera
98. Chembiochem 4 803 810 Johnsson N and Johnsson K 2007 Chemical tools for biomolecular imaging ACS Chem Biol 2 31 38 Jonsdottir G A and Li R 2004 Dynamics of Yeast Myosin Evidence for a Possible Role in Scission of Endocytic Vesicles Curr Biol 14 1604 1609 Ju W Morishita W Tsui J Gaietta G Deerinck T J Adams S R Garner C C Tsien R Y Ellisman M H and Malenka R C 2004 Activity dependent regulation of dendritic synthesis and trafficking of AMPA receptors Nat Neurosci 7 244 253 Juillerat A Gronemeyer T Keppler A Gendreizig S Pick H Vogel H and Johnsson K 2003 Directed evolution of O6 alkylguanine DNA alkyltransferase for efficient labeling of fusion proteins with small molecules in vivo Chem Biol 10 313 317 Juliano R L and Haskill S 1993 Signal transduction from the extracellular matrix J Cell Biol 120 577 585 179 R ferences bibliographiques K Kabsch W and Holmes K C 1995 The actin fold Faseb J 9 167 174 Kabsch W Mannherz H G Suck D Pai E F and Holmes K C 1990 Atomic structure of the actin DNase complex Nature 347 37 44 Kaiser W and Garrett C G B 1961 Two photon excitation in CaF2 Eu Phys Rev Letters 7 229 231 Kaksonen M Sun Y and Drubin D G 2003 A pathway for association of receptors adaptors and actin during endocytic internalization Cell 115 475 487 Ka
99. E ul 0o yer128CA bzz1A myo5A myo5A myo5A ypi3zapzzta nyosa w o o sie t f J Pe fe fe Tableau 11 Analyse des effets des d l tions des diff rents candidats a diff rentes temp ratures sous l effet d un stress salin croissance normale pas de croissance Domaine 1 Domaine 2 Nombre Nombre Nom Fonction de pep sequence de pep S quence tides couverte tides couverte Nucl aire fonction ADN ARN NSR1 Nuclear localization sequence binding protein EGD1 Enhancer of Gal4p DNA binding activity 1 EGD2 Enhancer of Gal4p DNA binding activity 2 Epstein Barr nuclear antigen 1 binding pro EBP2 tein 2 nug1 Nucleolar GTPase 1 Cytosquelette BBC1 Myosin tail region interacting protein MTI1 23 28 34 41 MYO5 17 22 22 26 YIROO3W Prot ine qui interagit avec Abp1p via son do 16 30 maine SH3 ABP1 11 31 VRP1 8 19 6 12 LAS17 13 2 4 CMD1 calmodulin 4 38 YBR108W Interagit avec Rvs167p 4 3 4 YTM1 Prot ine associ e aux microtubules 5 Paroi cellulaire SVL3 prot ine membranaire probable 4 8 T
100. Elementarakte mit zwei Quantensprugen Annalen der Physik 9 273 294 G ppert M 1929 ber die Wahrscheinlichkeit des Zusammenwirkens zweier Lichtquanten in einem Elementarakt Naturwissenschaften 17 932 Gottlieb T A Ivanov I E Adesnik M and Sabatini D D 1993 Actin microfilaments play a critical role in endocytosis at the apical but not the basolateral surface of polarized epithelial cells J Cell Biol 120 695 710 Griffin B A Adams S R Jones J and Tsien R Y 2000 Fluorescent labeling of recombinant proteins in living cells with FIASH Methods Enzymol 327 565 578 Griffin B A Adams S R and Tsien R Y 1998 Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells Science 281 269 272 Guignet E G Hovius R and Vogel H 2004 Reversible site selective labeling of membrane proteins in live cells Nat Biotechnol 22 440 444 Guinamard R Aspenstrom P Fougereau M Chavrier P and Guillemot J C 1998 Tyrosine phosphorylation of the Wiskott Aldrich syndrome protein by Lyn and Btk is regulated by CDC42 FEBS Lett 434 431 436 Guthrie C and Fink G R 1991 Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology Vol 169 Academic Press San Diego H Harborth J Elbashir S M Bechert K Tuschl T and Weber K 2001 Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs J Cell Sci 114 4557 4565 Harsay E
101. ITATCAGAAAAC ra hof1_trp TAGTAAAATTGATATAGATCG enge OT par tiquette CCTCGAGGCCAGAAGACTAAG y AAAGTGGGAGCTCATGACGATAT 7 las17_ccp GGACAATGGTGATGATTGG o Rae AI GGTGCTGGAGCAGGCGCTGGA y AAATTACATATTTTCTATAACAGT las17_trp AGTTTCATCTTTGTTTGCATT CCTCGAGGCCAGAAGACTAAG Sequencage tiquette tetracysteine pym6 1 GGACATATTGTCGTTAGAACGC clon e dans plasmide DYM6 S quen age tiquette t tracyst ine pym6 2 25 eee clon e dans plasmide pYM6 et v rification insertion TRP1 Tableau 14 Oligonucl otides utilis s au cours de ce travail Etiquetage LAS17 par tiquette t tracyst ine TRP1 Conclusion Conclusion Mon travail de doctorat a permis de synth tiser et d velopper une coumarine photoactivable poss dant un motif Ni NTA ayant des propri t s photochimiques et photophysiques bonnes voire excellentes pas de fluorescence lib ration rapide et quasi totale du luorophore apr s une irradiation lumineuse De plus l entr e dans les cellules HeLa du d riv fluorescent laisse pr sager l entr e de la coumarine photoactivable Une fois Les derniers contr les effectu s liaison du motif Ni NTA une tiquette poly histidine et une confirmation de la non toxicit de la sonde il sera alors possible d tudier la dynamique de prot ines intervenant dans le cytosquelette d actine D autre part l tude des interactions prot ine prot ines et prot ine lipides de Bzz1p a permis de montrer que Bzz1p semblent
102. L167W YDR267C CIA1 YKL213C YDLO45C YDR398W Assemblage de prot ines fer soufre cytosoliques et nucl aires 6 00 DOA1 Liaison de l ubiquitine Cytoplasme noyau FAD1 FMN ad nylytransf rase Cytoplasme Liaison ARNsno FACTO RE Score 10 68 ERG20 Dim thylallyltransf rase Cytoplasme Cytoplasme noyau Nucl oles 4 58 UTP5 YBRO56W 4 54 aer EBEN EIRE YMRO41C YCLO43C YDLO86W YHRO74W YDR134C YBRO88C 3 YGR276C zZ 65 YMR140W YBR121C GRS1 Similaire aux Aldo k to r ductases Isom rase de prot ine disulfure Carboxym thyl nebut nolidase QNS1 Biosynth se NAD Cytoplasme noyau Paroi cellulaire de 81 ae chitine Facteur de processivite de ADN polym rase RNH70 3 5 exonucl ase Noyau Interaction avec Reg1 Glc7 phosp hatase and Snf1 kinase Ligase glycine ARNt Facteur d pissage de l ARN Enzyme activant l ubiquitine 3 5 exonucl ase Cytoplasme Yfr007W R ticulum Endoplas mique RE Cytoplasme Mito chondrie Noyau Cytoplasme cytoplasme Mito chondrie snRNPU6 Cytoplasme noyau Mitochondrie Cytoplasme noyau YMLO53C 3 32 YKRO97W voroosc 3 28 YLLO18C YOLO49W YKL117W 3 13 YELO47C Glycog ne synthase kinase 3 Phospho nolpyruvate carboxykinase Liaison ARN Glutathionne synthase Liaison chaperon Fumarate r ductase NADH Cytoplasme Cytosol Cytosol Intracellulair
103. La croissance des souches a t analys e par un test en goutte sur galactose 37 C pour induire la surproduction Tableau 6 Il s est alors r v l que ces deux clones taient des faux positifs puisque la mort cellulaire provoqu e par la surproduction de Bzz1p n tait pas alt r e par la surproduction de ces fragments d ADN En effet aucun g ne suppresseur de la toxicit due la surproduction de Bzz1p n a pu tre identifi par ce crible lll Interactions proteine proteines de Bzzlp Lors de travaux ant rieurs Alexandre Soulard avait utilis la m thode du double hybride un syst me g n tique permettant la d tection d interactions physiques entre deux prot ines in vivo D apr s ce crible Bzzip est capable d interagir avec les prot ines Myo5p Las17p App1p Ldb17p Mec1p Pma1p Ubp7p Ypl277Cp et Yor389Wp Depuis des cribles g nomiques double hybride a grande chelle ont propos un tellement grand nombre de partenaires potentiels que nous souhaitions utiliser une autre m thode pour trouver de nouveaux partenaires de Bzz1p afin de pr ciser ses partenaires les plus directs r le dans la cellule Nous avons d cid d utiliser une nouvelle m thode le ProtoArray Invitrogen une micropuce o a t d pos le prot ome quasi complet de S cerevisiae Zhu et al 2001 A Principe du ProtoArray 4088 prot ines sur les 4462 ORFs phase ouverte de lecture ou Open Reading Frame
104. Le fluorophore 47 2 Le motif NTA 49 a Cbz SEM b Alloc PMB c Cbz tBu 3 Les cages C Propri t s photochimiques 1 Propri t s photophysiques 2 R action de photofragmentation D Tests cellulaires 1 Entr e cellulaire 2 Toxicit cellulaire CHAPITRE 3 PERSPECTIVES CHAPITRE 4 PARTIE EXPERIMENTALE I SYNTHESES 1 3 4 dim thoxyph nyl 2 2 2 trifluoro thanone 1 1 2 nitro 4 5 dim thoxy ph nyl 2 2 2 trifluoro thanone 2 1 2 nitro 4 5 dim thoxy ph nyl 2 2 2 trifluoro thanol 3 A B C D 1 2 nitro 4 5 dim thoxy ph nyl 2 2 2 trifluoro chloro thane 4 E R sorufine 4 5 bis mercurique trifluoroac tate 5 F 2 4 Dihydroxy 5 chloro benzald hyde 6 G Acide 6 chloro 7 hydroxy coumarine 3 carboxylique ou coumarine 7 H N N Bis carboxym thyl N carboxybenzyl L lysine 8 Trim thylsilyl thoxy m thyl N N bisf 2 trim thyl silyl thoxy m thoxy carbonyl carboxybenzyl L lysine 9 J Trim thylsilyl thoxy m thyl N N bisf 2 trim thylsilyl thoxy m thoxy carbonyl L lysine ou Lysine NTA SEM 10 K Coumarine Lysine NTA SEM3 11 L Ac Coumarine Lysine NTA SEM 12 M Cage coumarine Lysine NTA SEM 13 tert Butoxy N N bis 2 tert butoxycarbonylm thy l Ne carboxybenzyl L lysine tert Butoxy N N bis 2 tert butoxycarbonylm thyl L lysine 15 Coumarine Lysine NTA tBuz 16 Cage Coumarine Lysine NTA 18
105. MeO MeO MeO MeO OMe OMe OMe OMe OMe 1 2 3 4 Sch ma 5 Synth se de la cage DMNPT a BuLi Trifluoroac tate d thyle THF 78 C p 72 b HNOs H250 0 C p 41 c NaBHa dioxanne p 86 d SOC 50 C p 79 Ensuite on voulait greffer ce compos 4 la r sorufine ou son d riv bis arseni par substitution nucl ophile En revanche bien que d j d crite la synth se du ReAsH EDT Adams et al 2002 s est r v l e tr s d licate Apr s mercuration de la r sorufine par le trifluoroac tate de mercure une transm tallation par du trichlorure d arsenic lll suivie par une addition d EDT le ReAsH EDT devait tre obtenu Schema 6 Mais le rendement de la r action relativement faible et des problemes de purification ne nous ont pas permis d obtenir le produit final La mol cule semblait relativement instable et le ReAsH EDT n a pas pu tre obtenu En parall le plusieurs tentatives pour greffer la cage directement sur la r sorufine ont t essay es sans succ s Il semblerait que la liaison envisag e ther ne puisse pas se former Devant cette impasse une nouvelle strat gie a du tre 1 I O O posos er Sch ma 6 Synth se du ReAsH cag d crite par Adams et al 2002 a HgO TFA b 1 AsCl DIEA Pd OAc 2 NMP 2 EDT aq KHPO NaO 44 OCH OAc O CO CHOAc Coumarine Sch ma 7 Strat gie de d veloppement
106. Polym risation Figure 29 Mod le th orique du r le de Bzzlp au sein du complexe Las17 Vrp1 Myo3 5p Bzzip est recrut e dans le complexe Las17 Vrp1 Myo3 5p qui est localis au niveau des taches corticales d actine Au sein du complexe Bzz1p et Myo5p permettent ensemble d tablir un lien entre la voie de r ponse au stress salin et la machinerie de polym risation de l actine fl ches vertes Ces deux prot ines interviennent galement dans un processus reliant l endocytose d pendante d un r cepteur et l assemblage de l actine fl ches bleues Le complexe Las17 Vrp1 Myo3 5p active le complexe Arp2 3 qui nucl e la polym risation de l actine Bzz1p active Las17p Adapt e de la th se de Soulard 2003 Recherche de partenaires de Bzz1p d Le cas de Bzz1p Bzz1p possede un domaine FCH N terminal aa 5 a 110 suivi de deux r gions coiled coil aa 130 210 et 305 355 et deux domaines SH3 C terminaux aa 500 a 554 et 583 a 633 Figure 28 Au laboratoire Alexandre Soulard Soulard et al 2005 Soulard et al 2002 a montr pendant sa these que la surproduction de Bzzip causait de s v res d fauts de croissance Las17p interagit directement avec Bzzip par l interaction des domaines SH3 de Bzzip et du motif riche en proline de Las17p La prot ine Bzz1p en fusion avec de la GFP se localise dans les taches corticales d actine d une mani re d pendante de Las17p mais ind pendante de l actine F
107. Prot ine ne d interet Fluorophore cag pas de fluorescence Complexe non fluorescent Proteine d int r t hv Flash laser UV ou bi photon Microscopie confocale en temps r el Figure 10 Utilisation d un fluorophore photoactivable pour suivre la dynamique de prot ines intracellulaires Le rond orang symbolise la cage le rectangle bleu le fluorophore et le triangle rose le motif de reconnaissance D veloppement d un fluorophore photoactivable Toutes les m thodologies pr c demment abord es pour tiqueter une prot ine avec un marqueur chimique dans cette partie sont r sum es dans le tableau 3 VI Objectifs L un des objectifs de ma these et en particulier au niveau de la partie chimie a t de d velopper et synth tiser un nouveau fluorophore photoactivable par UV et par bi photon capable de reconna tre et de se lier une tiquette peptidique Ensuite il tait n cessaire de confirmer l entr e de ce nouveau fluorophore dans des cellules et enfin de l utiliser pour suivre la dynamique de prot ines intracellulaires par microscopie confocale en temps r el Figure 10 Les diff rentes strat gies ayant t envisag es sont d velopp es dans les chapitres suivants ainsi que les r sultats obtenus 42 Chapitre 2 R sultats et discussion D veloppement d un fluorophore photoactivable Chapitre 2 R sultats et discussion Le cahier des charges de ces sondes chimiques phot
108. SH induces Arp2 3 complex activation independent of Cdc42 J Cell Biol 152 471 482 G Gagny B Wiederkehr A Dumoulin P Winsor B Riezman H and Haguenauer Tsapis R 2000 A novel EH domain protein of Saccharomyces cerevisiae Ede1p involved in endocytosis J Cell Sci 113 Pt 18 3309 3319 Gaietta G Deerinck T J Adams S R Bouwer J Tour O Laird D W Sosinsky G E Tsien R Y and Ellisman M H 2002 Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking Science 296 503 507 Gautreau A Ho H Y Li J Steen H Gygi S P and Kirschner M W 2004 Purification and architecture of the ubiquitous Wave complex Proc Natl Acad Sci U S 101 4379 4383 Gavin A C Aloy P Grandi P Krause R Boesche M Marzioch M Rau C Jensen L J Bastuck S Dumpelfeld B et al 2006 Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery Nature 440 631 636 Geli M I Lombardi R Schmelzl B and Riezman H 2000 An intact SH3 domain is required for myosin l induced actin polymerization EMBO J 19 4281 4291 Geli M l and Riezman H 1996 Role of type myosins in receptor mediated endocytosis in yeast Science 272 533 535 George N Pick H Vogel H Johnsson N and Johnsson K 2004 Specific labeling of cell surface proteins with chemically diverse compounds J Am Chem Soc 126 8896 8897 176 R ferences bibliographiques G
109. Stovold C F Millard T H and Machesky L M 2005 Inclusion of Scar WAVE3 in a similar complex to Scar WAVE1 and 2 BMC Cell Biol 6 11 Stradal T E B and Scita G 2006 Protein complexes regulating Arp2 3 mediated actin assembly Curr Opin Cell Biol 18 4 10 Stroffekova K Proenza C and Beam K G 2001 The protein labeling reagent FLASH EDT2 binds not only to CCXXCC motifs but also non specifically to endogenous cysteine rich proteins Pflugers Arch 442 859 866 186 R ferences bibliographiques Suetsugu S Hattori M Miki H Tezuka T Yamamoto T Mikoshiba K and Takenawa T 2002 Sustained activation of N WASP through phosphorylation is essential for neurite extension Dev Cell 3 645 658 Suetsugu S Kurisu S Oikawa T Yamazaki D Oda A and Takenawa T 2006 Optimization of WAVE2 complex induced actin polymerization by membrane bound IRSp53 PIP 3 and Rac J Cell Biol 173 571 585 Suetsugu S Miki H and Takenawa T 1999 Identification of two human WAVE SCAR homologues as general actin regulatory molecules which associate with the Arp2 3 complex Biochem Biophys Res Commun 260 296 302 Suetsugu S Yamazaki D Kurisu S and Takenawa T 2003 Differential roles of WAVE1 and WAVE2 in dorsal and peripheral ruffle formation for fibroblast cell migration Dev Cell 5 595 609 Summerer D Chen S Wu N Deiters A Chin J W and Schultz P G 2006 A
110. Th se pr sent e pour obtenir le grade de Docteur de l Universit Louis Pasteur Strasbourg Discipline Sciences de la Vie et de la Sant Sp cialit Aspects Mol culaires et Cellulaires de la Biologie par Cl lia Orange Un fluorophore photoactivable pour des tudes spatio temporelles de la dynamique du cytosquelette d actine les interactions des prot ines a domaine SH3 le cas de Bzz1p Soutenue publiquement le vendredi 6 juillet 2007 Devant les membres du jury Directrice de These Mme Barbara Winsor Directeur de Recherche Strasbourg Directeur de These M Maurice Goeldner Professeur Strasbourg Rapporteur Interne M Serge Potier Professeur Strasbourg Rapporteur Externe M Peter Philippsen Professeur B le Suisse Rapporteur Externe M Carsten Schultz Directeur de Recherche Heidelberg Allemagne Remerciements Le travail pr sent dans cette th se a t r alis au laboratoire de Chimie Bioorganique dirig par le Professeur Maurice Goeldner et au laboratoire de Cytosquelette d Actine et Trafic Intracellulaire dirig par le Docteur Barbara Winsor Je tiens les remercier pour m avoir accueilli dans leurs groupes et confi ce projet de th se innovant l interface de la chimie et de la biologie de m avoir soutenu tout au long de ce travail passionnant mais empli d emb ches Je tiens remercier Messieurs Peter Philippsen Serge Potier et Carsten Schultz pour m avoir
111. V INTERACTIONS PROTEINE LIPIDES DE BZZ1P A R le du domaine F BAR B Localisation de Bzz1 GFP et les phosphoinositides CHAPITRE 3 DISCUSSION ET PERSPECTIVES SUR BZZ1P IA IV CRIBLE DE SURPRODUCTION INTERACTIONS PROTEINE PROTEINES SPECTROMETRIE DE MASSE INTERACTIONS PROTEINE LIPIDES CHAPITRE 4 MATERIELS ET METHODES Ze OU w BACTERIES Souches utilis es et g notypes Conditions et milieux de culture et conservation Transformation et isolation de l ADN Plasmidique Transformation M thode chimique 125 129 129 130 130 130 132 132 132 134 134 134 134 136 138 140 140 143 143 143 147 148 148 148 151 152 154 154 154 154 155 155 155 WN 0 79 D N a AU gt Xu ee er eer rT o lt lt e A ee A ER E E e N common Electroporation Pr paration d ADN LEVURES Souches utilis es et g notype Conditions et milieux de culture et conservation Transformation et isolement de l ADN G nomique Transformation Pr paration d ADN partir de cellules de levure M thode m canique M thode enzymatique Techniques g n tiques Conjugaison Sporulation Dissection des t trades VECTEURS DE CLONAGE Plasmides sp cifiques E coli Plasmides navettes E coli S cerevisiae MANIPULATIONS CONCERNANT L ADN D termination de la concentration en ADN Digestion par les enzymes de restriction S paration lectrophor tique des fragments d ADN S quen age de l ADN
112. ZiFit pour Histidine Zinc in vivo Tag Hauser et Tsien 2007 Une fluoresc ine modifi e pour ch later deux ions zinc est capable de se lier une tiquette peptidique de six histidines avec un Kd d environ 40 nM Pour le moment cette sonde permet de marquer seulement les prot ines la surface cellulaire L quipe de Ting a d velopp une m thodologie pour marquer une s quence peptidique de 15 acides amin s peptide accepteur ou AP avec des sondes en utilisant l enzyme biotine ligase d E coli BirA Figure 8 Chen et al 2005 BirA catalyse la ligation de la biotine au peptide accepteur mais des analogues c tones de la biotine peuvent tre substitu s efficacement la biotine Les c tones tant absentes de la surface cellulaire leurs analogues peuvent tre s lectivement fonctionnalis s avec diverses fonctions chimiques Cette technique combine une liaison covalente une petite tiquette et une sp cificit de marquage mais elle est limit e au marquage a la surface cellulaire et le temps de marquage est de 20 minutes 3 Incorporation d acides amin s non naturels L utilisation de la mutag nese pour supprimer le codon ambre afin d introduire des acides amin s non naturels dans un site d une mani re sp cifique a aussi t utilis pour marquer des prot ines dans les cellules vivantes Figure 9 Wang et Schultz 2002 Pour le moment des acides amin s non naturels portant des c tones Zhang et a
113. accharomyces cerevisiae respectivement Lee et al 2000 Li 1997 Ces prot ines appartiennent aux nombreuses cascades de signalisation responsables de la formation de filopodes lamellipodes et autres structures d actine impliqu es dans la mobilit cellulaire a Structure Toutes les prot ines de cette famille pr sentent une organisation tres similaire avec une r gion C terminale conserv e et une r gion N terminale plus variable qui r gule l activit de la partie C terminale Figure 18 En effet c est en C terminal que se trouvent les domaines capables de lier les monom res d actine et de les mettre en contact avec le complexe Arp2 3 afin de promouvoir la nucl ation de l actine Ces domaines constituent le module VCA compos d un domaine V aussi appel WH2 pour WASP Homology 2 qui lie l actine G du domaine C cofiline homology domain et enfin d une r gion C terminale A sur laquelle se fixe le complexe Arp2 3 Les domaines C et V agissent en synergie afin de permettre les changements conformationnels d Arp2 3 n cessaires a la nucl ation Panchal et al 2003b 90 CB Ptdins 4 5 P coc42 Stable complex formation on Cop Nucleation 5 MM L 1 SH3 interactor Nek a x A Ea Dynamin interactor L BAR domain i EB Erc domain Vinexinfs y WAVE ABI U RCB IMD domain gt CE De HSPC300 p47phox N PKA WISH Sre DIP SPINSO Fyn FBPN HSP90 DABI Prdins 4 5
114. age Filtre Excitation maximale nm Emission maximale nm LY GFP 490 520 GFP GFP 490 511 Calcofluor White DAPI 360 440 Phalloidine TRITC TRITC 541 572 Tableau 13 Filtres utilis s pour observer les cellules en fonction des fluorophores 168 nom Base S quence wen 0C01 CACCATGAGTGCAGATTTATCGA Clonage de BZZ1 dans vecteur TT pET101 151 D TOPO Clonage de BZZ1 dans vecteur OCO2 TTTACAGTAACTTGTAGGAAA pET101 D TOPO OCO3 TCATTTACAGTAACTTGTAGG A OCO4 pET151D TOPO OCO5 TTGTTAGGGGCAGAGCCT S quencage de BZZ1 Pie TCATCATCATGCCATACT S quencage de BZZ1 0CO6 ATCGCCAGTCACTATGGCGTG S quencage des inserts de YEp24 0C07 EN AACAGTCCCCCGGCCACGG S quencage des inserts de YEp24 Clonage du domaine FCH de Bzzip OCO8 AAAGTCGGTTGATAACTGATC dans pET101 D TOPO Clonage du domaine F BAR dans OCO9 TTTATCCTTAGTTCTATTTGCC pET101 D TOPO 2 2 CCAGAACTACCTGTGAAATT V rification insertion de TRP1 ATTCTACCAAATCGGTAGTC V rification d l tion de MYO5 TGGGTAATCCTGTGTTGA V rification d l tion de BZZ1 OA TN Cou rouen mme 17 63 Te Etiquetage de YCRO76C en C terminal GTACGCTGCAGGTCGAC avec GPP Wiragment s2 ACTAAATATCACAATAAACAAAGT 64 ACTAAAATAAACACCCATTTAATC GATGAATTCGAGCTCG TAAGAACAGTGGCCAATACGAAT TTAACCGCTTTATAGAACGGATCC Remplacement de MYO5 par HIS3MX6 CCGGGTTAATTAA TTTGCTCGTATAGAGTATATACTC OCO22 60 GCTAAATACATTTTGAGAATTCGA Remplacement de MYO5 par HIS3MX6 GCTCGTTTAAAC 0C013 5 1
115. aki N Furutani M Oikawa T and Takenawa T 2006 Coordination between the actin cytoskeleton and membrane deformation by a novel membrane tubulation domain of PCH proteins is involved in endocytosis J Cell Biol 172 269 279 U Uruno T Liu J Zhang P Fan Y X Egile C Li R Mueller S C and Zhan X 2001 Activation of Arp2 3 complex mediated actin polymerization by cortactin Nat Cell Biol 3 259 266 V Vaduva G Martin N C and Hopper A K 1997 Actin binding verprolin is a polarity development protein required for the morphogenesis and function of the yeast actin cytoskeleton J Cell Biol 139 1821 1833 Verkhusha V V and Lukyanov K A 2004 The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins Nat Biotechnol 22 289 296 Vida T A and Emr S D 1995 A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast J Cell Biol 128 779 792 Voegtli W C Madrona A Y and Wilson D K 2003 The structure of Aip1p a WD repeat protein that regulates Cofilin mediated actin depolymerization J Biol Chem 278 34373 34379 Volland C Galan J M Urban Grimal D Devilliers G and Haguenauer Tsapis R 1994 Endocytose and degradation of the uracil permease of S cerevisiae under stress conditions possible role of ubiquitin Folia Microbiol 39 554 557 W Walbert S Pfleiderer W and Steiner U E
116. ans 3 mL de dichlorom thane anhydre Sous argon et agitation l anhydride ac tique 39 uL 0 41 mmol 1 1 qu et la pyridine 3 uL 38 mol 0 1 qu sont ajout s et la r action est laiss e une nuit a temp rature ambiante Le brut est vapor a sec puis redissous dans l eau et la phase aqueuse est extraite 3 fois avec du dichlorom thane Les phases organiques sont rassembl es lav es par du chlorure de sodium s ch es par du sulfate de sodium anhydre filtr es et vapor es sec 278 mg d un solide jaune sont r cup r s p 80 73 D veloppement d un fluorophore photoactivable Hu m e or ro 0 0 no H h O O oo No Cl c d o e lg n o ne l O7 es PL m Sim m rm ON m m RMN H CDCL 3 0 02 s 27H Hm 0 96 t 6H Hl 1 67 m 6H Hf Hg et Hh 2 4 s 3H Ha 3 45 m 3H He et Hi 3 68 m 10H Hk et Hn 5 29 m 6H Hj 7 25 s 1H Hb 7 77 s 1H Hc 8 72 s 1H Hd La d protection s est faite par ajout de 4 quivalents de Bu NF en solution dans le THF apr s 2 ha 0 C la r action est laiss e une nuit a temp rature ambiante Le brut est vapor sec Ensuite la purification par HPLC n a pas permis d obtenir le produit d sir En effet toutes les formes proton es ou d proton e sont visibles sur le chromatogramme en plus d autres impuret s ce qui rend difficile la purification De plus l ac tyle s hydrolyse dans les conditions de purifica
117. ans bruit de fond hormis l autofluorescence des cellules Cependant ce sont des prot ines d au moins 220 acides amin s et elles peuvent perturber fortement le repliement le trafic et la fonction de certaines prot ines auxquelles elles sont fusionn es De plus les prot ines autofluorescentes n cessitent plusieurs heures pour d velopper leur fluorescence ce qui est trop lent pour certaines applications Pour ces diff rentes raisons il est parfois judicieux d utiliser un marqueur chimique fluorescent la place d une prot ine fluorescente 31 Figure 5 Marquage d une prot ine avec une sonde chimique en utilisant une tiquette prot ique La prot ine d int r t ovale blanc en fusion avec une prot ine tiquette DHFR hAGT prot ine Halotag bleue est exprim e et est capable de lier de fa on covalente ou non une petite mol cule m thotrexate conjugu O6 benzylguanine ou ligand HaloTag losange rouge Adapt e de Chen et Ting 2005 D veloppement d un fluorophore photoactivable B Marqueurs chimiques Diff rentes strategies sont envisageables pour tiqueter une prot ine sp cifiquement avec une sonde chimique Il est possible d utiliser une combinaison unique d acides amin s fusionn e a la prot ine d inter amp t qui recrute la petite mol cule sonde Pour certaines m thodes l information contenue dans la s quence d adressage seule est suffisante pour la sp cificit dans d aut
118. aromyces pombe ne poss dent qu un seul gene ACT1 codant pour l actine Actip Les eucaryotes sup rieurs poss dent plusieurs isoformes de l actine cod es par une famille multig nique Ainsi chez les mammif res il existe sept isoformes de l actine quatre a actines exprim es dans diff rents types de cellules musculaires une f et deux y actines exprim es dans les cellules non musculaires Sheterline et Sparrow 1994 A Fonctions du cytosquelette d actine Dans les cellules de mammif res le cytosquelette d actine est requis pour la motilit cellulaire et le remodelage la surface IL joue un r le dans les changements de forme cellulaire durant la mitose il est essentiel pour des activit s contractiles telles que 82 Recherche de partenaires de Bzz1p la contraction des muscles ou la s paration des cellules filles par l anneau contractile durant la cytocin se il contr le des interactions cellule cellule et cellule substrat gr ce des mol cules d adh sion et il participe la signalisation transmembranaire l endocytose et la s cr tion Bretscher 1993 Gottlieb et al 1993 Juliano et Haskill 1993 Luna et Hitt 1992 Nobes et Hall 1995 Salmon 1989 Stossel 1993 Chez la levure Saccharomyces cerevisiae des mutants act1 pr sentent de s rieux d fauts dans la formation du bourgeon la distribution asym trique de l actine pendant le cycle cellulaire le mouvement des v sicules
119. as synthesized with the third acidic function acetylated This molecule is able to penetrate into cells and no toxicity was detected In parallel to the chemical development of the probes my studies also concerned the dynamics and functional interactions of a new protein Bzz1p This protein contains two SH3 domains as well as a FCH domain and is a member of the PCH family Pombe Cdc15 Homology which includes proteins playing a role in cytokinesis and endocytosis Protein protein interactions of the full length Bzzip were analysed by overexpression screening and by the use of yeast proteome array while those of the SH3 domains were studied by GST pulldown assays followed by mass spectrometry analysis Lipid partners of the FCH domain of Bzz1p were identified by lipid blotting their confirmation in vivo is in progress The partners identified suggest that Bzz1p could act at several different membrane sites in the cell Key words caged fluorophore protein tag NTA Saccharomyces cerevisiae cortical actin cytoskeleton Bzz1p
120. ation and migration in the budding veast Saccharomyces cerevisiae J Cell Biol 119 583 593 Pan F Egile C Lipkin T and Li R 2004 ARPC1 Arc40 Mediates the Interaction of the Actin related Protein 2 and 3 Complex with Wiskott Aldrich Syndrome Protein Family Activators J Biol Chem 279 54629 54636 Panchal R G Ruthel G Kenny T A Kallstrom G H Lane D Badie S S Li L Bavari S and Aman M J 2003a In vivo oligomerization and raft localization of Ebola virus protein VP40 during vesicular budding Proc Natl Acad Sci U S A 100 15936 15941 Panchal S C Kaiser D A Torres E Pollard T D and Rosen M K 2003b A conserved amphipathic helix in WASP Scar proteins is essential for activation of Arp2 3 complex Nat Struct Biol 10 591 598 Patchornik A Amit B and Woodward R B 1970 Photosensitive protecting groups J Am Chem Soc 92 6333 6335 Pedelacq J D Cabantous S Tran T Terwilliger T C and Waldo G S 2006 Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein Nat Biotechnol 24 79 88 Pelliccioli A P and Wirz J 2002 Photoremovable protecting groups reaction mechanisms and applications Photochem Photobiol Sci 1 441 458 Peter B J Kent H M Mills I G Vallis Y Butler P J Evans P R and McMahon H T 2004 BAR domains as sensors of membrane curvature the amphiphysin BAR structure Science 303 495 499 Pickle
121. ation de levure centrom rique ou 2um le gene de r sistance a l ampicilline et un gene marqueur pour la levure S rie pRS plasmides centrom riques ou 2 um contenant diff rents genes marqueurs de levure Sikorski et Hieter 1989 Banque de surproduction banque de fragments g nomiques de levure port s par le vecteur 2 micron YEp24 avec le site BamHI YCplac111 MSS4 pSH23 plasmide centrom rique LEU2 YCplac111 mss4 2ts pSH23 plasmide centrom rique LEU2 porte l all le mss4 2 thermosensible IV Manipulations concernant l ADN A D termination de la concentration en ADN La concentration d une solution d ADN est mesur e par spectrophotom trie l aide du BioPhotometer Eppendorf L absorption est lue 260 nm Pour un trajet optique de 1 cm une unit d absorbance correspond 50 ug mL d ADN double brin Le rapport entre l absorbance 280 nm et a 260 nm permet d estimer la puret de la solution IL est th oriquement gt 1 8 pour une solution d ADN bicat naire propre 160 Recherche de partenaires de Bzz1p B Digestion par les enzymes de restriction Les enzymes de restriction g n rent des coupures double brin des sites sp cifiques de l ADN Les extr mit s 5 et 3 franches ou coh sives engendr es sont utilis es pour cloner des fragments d ADN dans des vecteurs Chaque enzyme est utilis e dans des conditions tampon et temp rature d finies par le fournisseur C S pa
122. avaient un effet sur la repolarisation du cytosquelette d actine apr s un stress salin Figure 36 La premi re constatation int ressante est que la souche BY4742 souche sauvage de la banque de d l tion est compl tement repolaris e apr s 5 h de stress salin NaCl 1 M ce qui est relativement long En effet la souche SLWOO1 construite par A Soulard qui est la souche sauvage de la souche SLW571 bzz1A myo54 le cytosquelette d actine est repolaris apr s seulement 3 h de stress salin Parmi les diff rents mutants le mutant ycrO76cA montre un retard de repolarisation du cytosquelette d actine lors d un stress salin En effet apr s 5h de stress osmotique environ un tiers des cellules bourgeonnantes ne sont pas repolaris es Ceci sugg re que Ycr076Cp pourrait tre impliqu e dans la m me voie de signalisation d adaptation au stress salin que Bzz1p et Myo5p Il faut utiliser d autres m thodes pour confirmer ou infirmer cette hypoth se C Observation de l endocytose en phase fluide L endocytose est un processus biologique permettant aux cellules eucaryotes d internaliser du mat riel extracellulaire nutriments hormones etc ainsi que certaines parties de leur propre membrane plasmique Ceci leur permet d incorporer tous les l ments essentiels a leur croissance mais galement de recycler ou d liminer certaines prot ines membranaires Lors de l endocytose il y a invagination de la membrane plasmique p
123. b avec ces billes et les prot ines ayant interagit avec les domaines fix s GST pulldown gt sont analys es par Western blot avec un anticorps anti GFP Recherche de partenaires de Bzz1p Chapitre 2 R sultats l Recherche des interactions des domaines SH3 Lors de mes tudes de doctorat j ai pu participer des travaux pour rechercher l implication de Bzz1p dans le trafic intracellulaire ces r sultats ont t publi s Soulard et al 2005 et sont pr sent s en annexe 1 Dans ce travail nous avons montr que Bzz1p en association avec Myo5p joue un r le dans l tape d internalisation lors de l endocytose mais ces deux prot ines ne paraissent pas tre requises ni pour le transport des cargos jusqu aux vacuoles ni pour le tri de la voie de signalisation du MVB Multi Vesicular Body La cin tique du transport n a pas t examin e Dans des travaux du laboratoire nous nous int ressons tester la capacit des 28 domaines SH3 de levure contenus dans 24 prot ines a induire ou non la polym risation de l actine dans ce test in vitro Quelques r sultats sont pr sent s dans une publication suite a un pr sentation dans un congr s Mirey et al 2005 annexe 2 Dans ce test d velopp par le laboratoire de Kirchner et utilis par Geli et al 2000 et par A Soulard au laboratoire un domaine prot ique en fusion avec la GST produit dans E coli est fix sur billes de GSH s pharose auquel on ajoute un extra
124. bre de photons qui conduisent la fragmentation de la mol cule nombre de photons absorb s Le groupement photolabile doit absorber dans l UV visible afin de limiter Vabsorption et les d gradations possibles de la lumi re par le syst me biologique tudi Les produits issus de la photolyse c est dire le fluorophore et le groupement r siduel de la cage doivent tre inertes photochimiquement Cela signifie que ces mol cules doivent avoir une absorption la plus faible possible la longueur d onde d irradiation afin d viter d entrer en comp tition avec l volution de la photolyse effet de filtre De plus le groupement lib r doit tre inerte biologiquement il ne doit pas r agir ou interf rer avec le syst me biologique tudi Si l on veut tudier des prot ines intracellulaires il est n cessaire que le fluorophore photoactivable puisse traverser les membranes biologiques De plus il faut aussi que la synth se soit facilement r alisable et que le fluorophore photoactivable s attache facilement et surtout sp cifiquement une prot ine Ce dernier crit re est le plus difficile pr voir partir de la structure mol culaire Empiriquement il 22 9 O yw A a cor B R sorufines cag es A caine O CO CHOAc C Rhodamine cag e D Coumarine cag e Sch ma 1 Structure de diff rents fluorophores photoactivables D veloppement d un fluor
125. calisation dans la souche sauvage et dans une souche d l t e du g ne BZZ1 Ceci sugg re que Aipip et Ycr076Cp ne sont pas n cessaires pour que Bzzip se localise correctement dans les taches corticales L tude de ces interactions sera poursuivie en utilisant des techniques de biochimie classique comme l immunopr cipitation D Recherche d une interaction g n tique entre Bzz1p et certains de ses partenaires cellulaires potentiels Les souches deletees ont t crois es avec une souche myo5A bzz1A SLW571 construite par Alexandre Soulard Soulard et al 2002 afin d obtenir des souches bzz1A myo5A d l t es du g ne d un des candidats ou bzz1A d l t es du g ne d un des candidats Apr s croisement les asques ont t diss qu s et les spores analys s par s lection sur des milieux de s lection ad quats et par PCR afin d isoler les g notypes attendus La PCR tait n cessaire pour diff rencier les souches contenant TRP1 provenant de la souche haploide de la banque de d l tion et TRP1 utilis pour s lectionner la d l tion de MYO5 Une fois s lectionn es les spores ont t test es par un test en goutte sur un milieu contenant du NaCl 0 3 M 0 6 M et 0 9 M afin de d terminer si la troisi me 140 Milieux YPG YPG NaCl 05 N N Ul o os w oO N Ul T C 25 eee ast2A bzz1A myo5A yer128CA yer128CA bzz1A 05 N B
126. cally selected peptides Chem Biol 11 347 356 Marriott G ed 1998 Caged Compounds In Methods in Enzymology Matz M V Labas Y A and Ugalde J 2006 Evolution of function and color in GFP like proteins Methods Biochem Anal 47 139 161 May R C 2001 The Arp2 3 complex a central regulator of the actin cytoskeleton Cell Mol Life Sci 58 1607 1626 McCray J A and Trentham D R 1989 Properties and uses of photoreactive caged compounds Annu Rev Biophys Biophys Chem 18 239 270 McDermott M F 2004 A common pathway in periodic fever syndromes Trends Immunol 25 457 460 Megonigal M D Cheung N K Rappaport E F Nowell P C Wilson R B Jones D H Addya K Leonard D G Kushner B H Williams T M et al 2000 Detection of leukemia associated MLL GAS7 translocation early during chemotherapy with DNA topoisomerase II inhibitors Proc Natl Acad Sci USA 97 2814 2819 Miki H Miura K and Takenawa T 1996 N WASP a novel actin depolymerizing protein regulates the cortical cytoskeletal rearrangement in a PIP2 dependent manner downstream of tyrosine kinases Embo J 15 5326 5335 Miki H Sasaki T Takai Y and Takenawa T 1998 Induction of filopodium formation by a WASP related actin depolymerizing protein N WASP Nature 391 93 96 Milburn T Matsubara N Billington A P Udgaonkar J B Walker J W Carpenter B K Webb W W Marque J Denk W McCra
127. certains ARNm Les taches corticales d actine semblent tre impliqu es sp cifiquement dans l endocytose ainsi que dans la synth se de la paroi cellulaire Je d crirais plus en detail les fonctions des taches corticales d actine dans l endocytose dans la section suivante Quant a l anneau d acto myosine localis au col du bourgeon il assure la contraction n cessaire la cytocin se menant la s paration de la cellule m re et de la cellule fille Bi et al 1998 Lippincott et Li 1998 3 Assemblage de l actine dans les diff rentes structures a Les taches corticales d actine le complexe Arp2 3 L assemblage des filaments d actine dans les taches corticales est d pendant du complexe Arp2 3 cf section 1 C 1 qui peut tre r gul par au moins cinq facteurs stimulant la nucl ation les NPFs Las17p Pan1p Myo3p Myo5p et Abp1p Duncan et al 2001 Evangelista et al 2000 Goode et al 2001 Lechler et al 2000 Winter et al 1999a Chaque NPF poss de un domaine acide qui facilite la liaison avec le complexe Arp2 3 probablement avec les sous unit s Arp3p et ARPC1 Figure 23 Kelly et al 2006 Kreishman Deitrick et al 2005 Pan et al 2004 Weaver et al 2002 De plus Las17p lie l actine G alors que Myo3 Myo5p Pan1p et Abp1p lient l actine F Pour Las17p Panip et Abpip la liaison l actine est critique pour leur activit en tant que NPF Quintero Monzon et al 2005 Rodal et al 2003
128. ces diff rents groupements sont int ressantes et ils peuvent tre de tr s bonnes alternatives au groupement o nitrobenzyle Cependant comme ils n ont pas encore t utilis s pour masquer des fluorophores ils ne sont pas abord s dans cette these V Marquage sp cifique de prot ines Pour visualiser une prot ine et suivre sa dynamique l aide d un microscope fluorescence il est n cessaire que cette prot ine soit tiquet e l aide d un fluorophore Le fluorophore peut tre d origine biologique comme les prot ines fluorescentes fusionn e la prot ine d int r t ou il peut tre d origine chimique Dans ce cas la le fluorophore est alors capable de reconna tre puis de se lier une prot ine d int r t par une interaction entre le motif de reconnaissance de la sonde chimique et une tiquette prot ique ou peptidique A Marqueurs prot iques 1 Prot ines fluorescentes En imagerie cellulaire la d couverte Shimomura et al 1962 le clonage Prasher et al 1992 et l expression h t rologue de la green fluorescent protein gt ou GFP issue de la m duse Aequorea victoria a t une r volution dans le domaine de l imagerie cellulaire pour revue Tsien 1998 Zimmer 2002 L expression de la GFP seule ou en fusion avec d autres prot ines mene a sa fluorescence dans le visible sans n cessiter de cofacteurs autre que le dioxygene En effet le chromophore un p hydroxybenzyli
129. choisies sont not es Recherche de partenaires de Bzz1p d actine n a pas t d pos sur la puce actine Myo3p et Myo5p Panip Abp1p Vrp1p Rvs167p Slalp ou Bbc1p et parmi les prot ines du complexe Arp2 3 seule Arp2p est pr sente Les r sultats obtenus vont peut tre nous permettre d identifier d autres processus biologiques qui pourraient impliquer Bzzip Parmi les 113 interactants r pertori s dans SGD nous en avons retrouv seulement 2 avec le ProtoArray Ubp7p une prot ase ubiquitine sp cifique et Erg24p une C H st rol r ductase 25 prot ines s hybrident avec Bzzip tiquet e l extr mit N terminale et Bzzip tiquet e l extr mit C terminale Il est noter que quatre prot ines trouv es sur les puces ont un lien avec l ubiquitine Ubp15p Ubp7p Uba1p et Doalp Apr s analyse des r sultats obtenus pour les deux tiquetages j ai choisi de travailler sur Aip1p et sur 6 prot ines de fonction inconnue afin de chercher s il y a un lien fonctionnel avec Bzz1p 1 Aip1p C est une prot ine de 615 acides amin s cod e par le gene YMRO92c Aipip interagit avec la cofiline et ensemble elles r gulent la d polym risation des filaments d actine lida et Yahara 1999 Rodal et al 1999 Aip1p r gule le cytosquelette d actine et est requise pour la localisation correcte des taches corticales d actine chez S cerevisiae Rodal et al 1999 Aiptp Actin interacting protein 1
130. citation nombre de photons mis nombre de photons absorb s Dur e de vie l tat excit c est la dur e caract ristique pendant laquelle la mol cule reste l tat excit avant de retourner son tat basal ordre de la picoseconde Cette dur e est assimilable la demi vie de l tat excit Photoblanchiment photobleaching lorsque la mol cule est l tat excit il existe une certaine probabilit pour qu elle participe des r actions chimiques on parle alors de r actions photochimiques en particulier avec l oxyg ne sous forme de radicaux libres Le fluorochrome perd alors ses propri t s de fluorescence Autrement dit quand on excite une solution de mol cules fluorescentes une certaine proportion d entre elles est d truite chaque instant et par cons quent l intensit de fluorescence d cro t au cours du temps Ce ph nom ne peut tre g nant notamment en microscopie de fluorescence mais il peut galement tre mis a profit pour mesurer la mobilit mol culaire par la m thode de redistribution de fluorescence apr s photoblanchiment FRAP ou de FLIP Perte de fluorescence au cours d un photoblanchiment local ll Excitation deux photons Les sondes fluorescentes peuvent tre excit es par une source de lumi re monophotonique ainsi que par une source multiphotonique En effet le d veloppement r cent de l utilisation d un proc d optique non lin aire appel excitation
131. cott et Li 2000 R cemment Itoh et al 2005 et Tsujita et al 2006 ont montr que les domaines FCH et coiled coil sont probablement une seule unit qui poss de des similarit s structurales et fonctionnelles avec le domaine BAR Bin Amphiphysin Rvs pr sent par exemple dans des prot ines endocytiques telles que Vendophiline l amphiphysine et qui est impliqu dans la d formation des bicouches lipidiques Peter et al 2004 Ce domaine FCH tendu est d fini soit comme un domaine FCH et BAR F BAR Itoh et al 2005 soit comme un domaine EFC extended FER CIP4 Tsujita et al 2006 appel par la suite F BAR Le domaine F BAR chez les eucaryotes sup rieurs m die l oligom risation des prot ines PCH et les interactions avec les phopholipides de la membrane Itoh et al 2005 Tsujita et al 2006 Le s domaine s SH3 m dient l interaction avec des motifs riches en proline trouv s dans de nombreuses prot ines comme la famille WASP et la dynamine Cote et al 2002 Ho et al 2004 Icking et al 2005 Itoh et al 2005 Kamioka et al 2004 Kessels et Qualmann 2004 Tian et al 2000 Chez certains membres de la famille le domaine SH3 est absent FCHO1 FCHO2 and PSTPIP2 ou certains isoformes sp cifiques d un tissu provenant d un pissage alternatif sont avec ou sans le domaine SH3 CIP4b ClP4c CIP4V Fbp17b Figure 28 Le domaine SH3 conf re aux prot ines PCH leur sp cificit fonctionnelle d o
132. coumarine en solution est observ e dans le cytoplasme Ceci signifie donc que le probl me d entr e dans les cellules provient de la charge restante sur le groupement NTA les deux autres charges tant masqu es par ch lation avec le nickel Ces r sultats sont en d saccord avec les travaux de Guignet et al 2004 dans lesquels un quencher gt de fluorescence li au NTA ch lat au nickel serait capable de marquer un r cepteur membranaire le r cepteur 5HT3 dont une des boucles intracellulaires poss de une s quence polyhistidine ce qui signifie que le fluorophore Ni NTA est capable de passer la membrane cellulaire En fait peu de travaux sur l utilisation du Ni NTA pour marquer des prot ines sur des cellules vivantes sont connus Ceux de Goldsmith et al 2006 d crivent la fixation d un fluorophore la fluoresc ine poss dant un motif NTA ch lat au nickel sur des s quences polyhistidines de prot ines extracellulaires Comme nous voulions v rifier que le probl me d entr e dans les cellules du compos 20 Ni provenait de la charge restante David Puliti a synth tis le compos 22 Ni o l acide provenant du pr curseur lysine est m thyl ainsi les deux acides restant sont ch lat s par le nickel et les charges sont neutralis es Nous partions du postulat que le motif acide nitrilodiac tique NDA fixerait le nickel avec une affinit suffisamment forte pour passer la membrane cellulaire le troisi me
133. ctions de Yir003Wp et Ybr108Wp se confirment avec Bzz1p entiere il serait envisageable de d terminer plus pr cis ment le r le de Bzz1p au sein des complexes prot iques r gulant le cytosquelette d actine Dans une approche de prot omique sur les domaines SH3 et leur r le dans la r gulation du cytosquelette d actine nous avons montr que certains domaines SH3 sont capables de lier Las17 GFP Certaines de ses prot ines taient d j connues comme 151 Recherche de partenaires de Bzz1p interagissant avec lasi7p Bzzip ou Myo5p Soulard et al 2002 ou encore les Lsb1 2 3 4p Madania et al 1999 Pour d autres une inhibition de Las17p tait connue comme Bbcip Rodal et al 2003 Aucun des trois domaines SH3 de Slaip ind pendamment ne lie Las17p cependant Rodal et al 2003 ont montr que lorsque les trois domaines SH3 de Sla1p sont r unis ils inhibent Las17p Afin de mieux comprendre le r le des domaines SH3 dans la r gulation de l actine il serait int ressant de faire des GST pulldowns avec des extraits de levure dont d autres prot ines du cytosquelette d actine soient fusionn es avec la GFP Par la suite il faut confirmer les r sultats obtenus pour le domaine SH3 avec la prot ine enti re notamment quand la prot ine poss de plusieurs domaines SH3 Ces exp riences sont en cours de d veloppement au laboratoire IV Interactions prot ine lipides Nous avons pu mettre en vidence que le
134. d neimidazolinone Cody et al 1993 Prasher et al 1992 est g n r par une cyclisation et une oxydation spontan es de trois acides amin s adjacents Ser Tyr Gly enferm s au c ur d un tonneau Figure 3 La GFP est un membre de la grande famille des prot ines homologues fluorescentes FPs Chudakov et al 2005 Matz et al 2006 Verkhusha et Lukyanov 2004 provenant pour la plupart de c lent r s marins avec diff rentes couleurs provenant de variations dans la structure et l environnement du chromophore Shaner et al 2005 Plusieurs laboratoires ont par mutag n se encore augment la diversit spectrale des FPs am lior leur brillance et l efficacit de repliement Pedelacq et al 2006 et diminu leur oligom risation pour revue Shaner et al 2005 De nombreuses prot ines fluorescentes sont maintenant commercialis es comme on peut le voir dans le Tableau 2 29 Irreversible Reversible PA GFP PS CFP Kaede KFP1 Dronpa UV violet UV violet Blue Green Biue 22 5 sam 390 10 40 i bA DAR 3 UG g o FLI i Green Cyan Green Transient red Green Nuorescence fluorescence fluorescence mOrescence fluorescence Blue Strong blue gt A Es 4 La Lefts g j g j UV violet UV violet UV wolet Green UV violet 3 8 laser aser laser laser laser Alsa af alada lt lt Yana a 363 1009 o o A Bive Violet and blue Blue and green A Weak green Blue eb m Jg
135. de la sonde D veloppement d un fluorophore photoactivable ll Strat gie Coumarine NTA cag e A Principe A cette p riode de ma th se deux publications nous ont guid s dans le choix de notre nouvelle strat gie D une part la synth se d une coumarine photoactivable permettant une lib ration efficace de la fluorescence apr s excitation par la lumi re UV et en bi photons a t d crite Cette coumarine cag e est capable de p n trer facilement dans des cellules HeLa et poss de de bonnes propri t s photochimiques r sultant d une propri t de la coumarine qui peut servir d antenne ce qui augmente l efficacit de la r action de photolyse Zhao et al 2004 D autre part une tude a montr que l acide nitrilotriac tique NTA connu en biochimie pour son interaction en pr sence de nickel avec une tiquette prot ique compos e de polyhistidines peut p n trer dans les cellules HEK293 lorsqu il est li covalemment un fluorophore Guignet et al 2004 Cette interaction histidines nickel NTA bien que non covalente tait suffisamment forte pour faire de l imagerie sur les cellules De plus la sp cificit pouvait tre augment e quand l tiquette prot ique tait non plus compos e de six mais de dix histidines Nous nous proposions alors de combiner ces deux id es pour notre nouvelle sonde Sch ma 7 Elle serait compos e d une nouvelle cage mise au point au laboratoire
136. de nos services http www sicd u strasbg fr services peb URS Universit Robert Schuman WM ul UNIVERSIT ff LOUIS PASTEUR STRASBOURG su E a w gt z 3 Signalement bibliographique ajout par SICD Strasbourg D partement de la Documentation lectronique Service des th ses lectroniques SH3 domain containing proteins and the actin cytoskeleton in yeast G MIREY A SOULARD C ORANGE S FRIANT and B WINSOR Biochemical society transactions 2005 Vol 33 Pages 1247 1249 Pages 256 258 La publication pr sent e ici dans la th se est soumise des droits d tenus par un diteur commercial La version imprim e de cette th se peut tre consult e la biblioth que ou dans un autre tablissement via une demande de pr t entre biblioth ques PEB aupr s de nos services http www sicd u strasbg fr services peb URS Universit Robert Schuman WM ul UNIVERSIT ff LOUIS PASTEUR STRASBOURG su E v 7 w gt z 3 RESUME Le cytosquelette d une cellule est constitu entre autres d un r seau complexe de filaments prot iques comprenant les filaments d actine La polym risation de l actine est un processus crucial extr mement conserv Mon objectif de th se consistait d velopper une nouvelle sonde fluorescente photoactivable afin d tudier dans le temps et l espace les prot ines domaine SH3 affectant le complexe d activation de la p
137. domaine FCH de Bzz1p est capable de se lier a des lipides et en particulier aux phosphatidylinositols phosphoryl s et a l acide phosphatidique et la phosphatidylcholine Nous voulions tester ces interactions potentielles in vivo par l observation de la localisation de Bzz1 GFP dans des souches d ficientes d une kinase conduisant l obtention de certains phosphoinositides Aucun d faut de localisation n a pu tre observ dans des souches d ficientes en Mss4p Fab1p ou Vps34p Il faut maintenant continuer ces observations avec des souches alt r es pour d autres kinases intervenant dans le m tabolisme des phosphoinositides ou de la phosphatidylcholine ou de l acide phosphatidique Il sera int ressant de r aliser une construction du domaine F BAR de Bzz1p qui puisse tre produite purifi e et hybrid e sur une membrane de nitrocellulose o sont d pos s des lipides ceci permettrait de d terminer s il y a une sp cificit pour un phosphoinositide donn Cette m me exp rience avec la prot ine Bzz1p enti re pourrait nous renseigner si le domaine FCH F BAR de Bzz1p se lie de fa on peu sp cifique aux phosphoinositides phosphoryl s ou au contraire poss de une sp cificit de liaison seulement certains phosphoinositides phosphoryl s Par la suite il faudrait produire une s rie de liposomes contenant diff rents phosphoinositides phosphoryl s ou la phosphatidyls rine ou enfin l acide phosphatidique afin d tudier
138. e Cytoplasme noyau Cytosol Mitochon drie YBRO53C 3 10 Tableau 7 Partenaires potentiels de Bzz1p tiquet e en N terminal obtenus avec le Protoarray Seules les interactions des prot ines choisies sont not es Nom Z Score Fonction Localisation Interaction Sonde YLR208W 13 80 SEC13 Mol cule structurale Cytoplasme YNL219C 10 01 ALG9 Mannosyltransf rase YILO91C 9 33 RNA h licase Noyau YKRO79C 7 54 TRZ1 Liaison des nucl otides puriques cena i YGLO62W 7 11 PYC1 pyruvate d carboxylase Cytoplasme Ribonucl oside biphosphate r ductase YNL220W ADE12 Ad nylsuccinate synthase Cytoplasme YHR112C se Cystathionine b lycase Cytoplasme YPRO35W GLN1 Glutamate ammonia ligase Cytoplasme YLR134W PDC5 Pyruvate d carboxylase RATE YMLO48W 5 06 GSF2 Repliement prot ine Membrane RE cytoplasme YPR160W 4 76 GPH1 Glycog ne phosphorylase Cytoplasme YHR183W 4 71 GND1 Phosphogluconate d hydrog nase Cytoplasme 4 Mi tochondrie YLRO69C MEF1 Facteur d longation de la traduction YNLO45W E Aminopeptidase Rte YLR274W CDC46 ATP dependent DNA helicase noyau YJRO96W Ald hyde r ductase Re d YMR120C ADE17 Inosine monophosphate cyclohydrolase Cytoplasme YGR256W GND2 Phosphogluconate d hydrog nase Cytoplasme YOLO38W 3 66 PRE6 endopeptidase Cytoplasme Mi tochondrie YJRO39W 3 63 Mitochondrie YLRO34C 3 60 SMF3 Transporteur des ions fer Membrane voz cuolaire Prk1p Ph
139. e prot ines intracellulaires 56 es 7000000 6000000 4 o 5000000 4000000 4 3000000 2000000 4 1000000 0 Fluorescen Intensit de fluorescence Inm 400 450 500 550 600 445 465 485 505 525 545 565 585 605 Longueur d onde nm Longueur d onde nm Figure 12 Spectres d mission des d riv s de coumarine A Spectre d mission mesur e par fluorim trie excitation 410 nm du compos 18 en solution B Spectres d mission mesur s par microscopie confocale excitation a 405 nm des compos s 19 et 22 apr s leur entr e dans le cytoplasme de cellules Les courbes sont repr sentatives de l mission de fluorescence observ e dans diff rentes zones d une cellule et sont similaires pour les compos s 19 et 22 D veloppement d un fluorophore photoactivable D Tests cellulaires Avant d tudier le probl me de reconnaissance et de dynamique de prot ines intracellulaires il nous fallait tablir un certain nombre de contr les l entr e du compos 20 Ni dans les cellules puis sa liaison une prot ine poss dant une tiquette polyhistidines la non toxicit des compos s 18 20 Ni et du sous produit lib r d riv de la coumarine la photofragmentation du compos 18 et la non toxicit des sous produits Pour faire nos tests sur des cellules nous avons choisi les cellules HeLa car elles sont relativement r sistantes et faciles transfecter et
140. e l expression de 4 h 37 C avec 0 5 mM d IPTG La pr paration de l extrait prot ique s est faite par sonication Bzz1p ne se retrouve pas dans la partie cellulaire soluble donc une tape de solubilisation tait n cessaire avant sa purification sur billes d agarose Ni NTA Une fois la prot ine chim re purifi e Figure 34 elle a t hybrid e sur le ProtoArray Pour la poursuite de nos recherches nous avons choisis de s lectionner les prot ines int ressantes sur les criteres suivants soit la prot ine est connue par ailleurs pour faire partie de la machinerie de r gulation du cytosquelette d actine ou du trafic intracellulaire soit la prot ine cible est inconnue et pourra nous r v ler un nouveau r le B Analyse de la liste des candidats potentiels obtenus Les prot ines ayant interagit avec Bzz1p sont list es dans les tableaux 7 8 et 9 Le Z score correspond l intensit de fluorescence du point de d p t de la prot ine corrig e par le bruit de fond adjacent ce point 91 prot ines ont t trouv es seule Aip1p est connue pour avoir un r le dans le cytosquelette d actine Bzzip a t identifi e auparavant gr ce son interaction avec Las17p or celle ci ne ressort pas de cette analyse car bien que pr sente sur la puce elle l est en quantit tr s faible ce qui peut fausser le traitement des donn es De plus un certain nombre de prot ines du cytosquelette 125 Sonde YJ
141. e actin delocalization and block the internalization step of endocytosis in Saccharomyces cerevisiae Mol Biol Cell 6 1721 1742 Newpher T M Smith R P Lemmon V and Lemmon S K 2005 In vivo dynamics of clathrin and its adaptor dependent recruitment to the actin based endocytic machinery in yeast Dev Cell 9 87 98 Nobes C D and Hall A 1995 Rho rac and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers lamellipodia and filopodia Cell 81 53 62 Novick P and Botstein D 1985 Phenotypic analysis of temperature sensitive yeast actin mutants Cell 40 405 416 0 Oikawa T Yamaguchi H Itoh T Kato M ljuin T Yamazaki D Suetsugu S and Takenawa T 2004 Ptdins 3 4 5 P3 binding is necessary for WAVE2 induced formation of lamellipodia Nat Cell Biol 6 420 426 Ormo M Cubitt A B Kallio K Gross L A Tsien R Y and Remington S J 1996 Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein Science 273 1392 1395 Ozaki Kuroda K Yamamoto Y Nohara H Kinoshita M Fujiwara T Irie K and Takai Y 2001 Dynamic localization and function of Bni1p at the sites of directed growth in Saccharomyces cerevisiae Mol Cell Biol 21 827 839 183 R ferences bibliographiques Palmer R E Sullivan D S Huffaker T and Koshland D 1992 Role of astral microtubules and actin in spindle orient
142. e extr mit l autre c est le processus de tapis roulant ou treadmilling sch matis dans la figure 16 85 Recherche de partenaires de Bzz1p C Nucl ation de la polym risation de l actine Trois grands syst mes de nucl ation sont connus le complexe Arp2 3 pour revue Goley et Welch 2006 et les formines pour revue Faix et Grosse 2006 qui sont relativement bien conserv s chez les eucaryotes R cemment les prot ines Spir ont t d couvertes chez la drosophile et sont aussi capables de nucl er la polym risation de l actine Quinlan et al 2005 Je n aborde dans cette section que la nucl ation par le complexe Arp2 3 la nucl ation par les formines chez la levure est abord e dans la section 11 B 3 b 1 Le complexe Arp2 3 En r ponse a un signal interne ou externe la polym risation s initie en recrutant le complexe prot ique appel Arp2 3 actin related protein 2 3 qui est tres bien conserv chez les cellules eucaryotes v g tales et animales Ce complexe est compos de sept sous unit s dont Arp2 Arp3 et cinq autres prot ines dont les noms varient en fonction de l espece Welch et al 1997 Winter et al 1997 Les prot ines Arp2 et Arp3 ont une structure proche de celle d un monom re d actine et pr sentent 40 50 et 30 40 d identit de s quence avec l actine respectivement Mullins et al 1997 Poch et Winsor 1997 Le tableau 5 donne la nomenclature ayant t
143. e la mol cule a p n tr e dans la cellule Figure 13 A Sur le microscope confocal utilis il est possible de faire un spectre d mission ce qui nous permet de v rifier que le spectre obtenu avec un pic a 456 nm correspond bien a celui 58 exc 405 nm Aem 410 510 nm Lumi re transmise 19 1uM 22 Ni2 20M 22 20uM HBSS 20 Ni2 20uM Figure 13 Imagerie par fluorescence de cellules HeLa charg es avec les compos s 19 20 Ni2 22 et 22 Ni2 Les cellules sont charg es avec 1 uM du compos 19 20 uM des compos s 20 22 et 22 Ni2 pendant 30 minutes dans du tampon HBSS pH 7 35 37 C Apr s lavages la fluorescence des cellules est observ e au microscope avec une excitation a 405 nm D veloppement d un fluorophore photoactivable d un d riv de la coumarine Figure 12 Ceci montre aussi que le compos 20 Ni Sch ma 16 non fluorescent est rapidement hydrolys par les est rases cellulaires Il est a noter que le noyau n est pas fluorescent ce qui suggere que l ac tate ayant t hydrolys une charge n gative est apparue sur le compos 18 lib r par l action des est rases cellulaires sur le compos 19 ce qui l emp cherait alors de traverser la membrane nucl aire Une fois les conditions d entr e ayant t mises au point avec le compos triester cellules incub es 30 minutes 37 C avec le compos dilu dans du tampon HBSS nous avons fait les m mes exp rience
144. e permet d augmenter le rendement quantique de la r action de photofragmentation Specht et Goeldner 2004 26 D veloppement d un fluorophore photoactivable B Groupements o nitroph n thyles Un nouveau groupement d rivant du groupement o nitrobenzyle a t utilis pour cager la fonction phosphate des nucl otides il s agit du groupement o nitroph n thyle Sch ma 2 Walbert et al 2001 hv OR NO Sch ma 2 Groupement o nitroph n thyle Au laboratoire un d riv de type o nitroph n thyle le 3 4 5 dim thoxy 2 nitroph nyl 2 butyle DMNPB Sch ma 3 a t utilis pour cager le glutamate Specht et al 2006 Sa longueur d onde d excitation est proche de 360 nm la cin tique de la r action de photofragmentation est de l ordre de la milliseconde et le rendement quantique de la r action de photolyse est lev 0 3 De plus la qualit de la r action de photolyse est bonne car 96 de glutamate est lib r X NO O Sch ma 3 Le 3 4 5 dim thoxy 2 nitroph nyl 2 butyle DMNPB D autres groupements photolabiles Sch ma 4 tels que les d riv s de benzo ne de 1 acyl 7 nitroindolines de p hydroxyph nacyle et de coumarine sont utilis s pour cager diverses fonctions chimiques X Ro O_O R O x hv O Pe OMe hv Ri N pr x NO O 9 E hv X OMe OH Type coumarine Type 7 nitroindoline Type benzo ne Type p hydroxyph nacyle Sch ma 4
145. eault J W Lappalainen P Drubin D G and Amberg D C 1999 Aip1p interacts with cofilin to disassemble actin filaments J Cell Biol 145 1251 1264 Rohatgi R Ho H Y and Kirschner M W 2000 Mechanism of N WASP activation by CDC42 and phosphatidylinositol 4 5 bisphosphate J Cell Biol 150 1299 1310 Roth A F and Davis N G 2000 Ubiquitination of the PEST like endocytosis signal of the yeast a factor receptor J Biol Chem 275 8143 8153 S Saito H and Tatebayashi K 2004 Regulation of the osmoregulatory HOG MAPK cascade in yeast Biochem 136 267 272 Salmon E D 1989 Cytokinesis in animal cells Curr Opin Cell Biol 1 541 547 Sambrook J and Russel D 2001 Molecular Cloning A Laboratory Manual Third edn Cold Spring Harbor Laboratory Press New York Sasso S P Gilli R M Sari J C Rimet O S and Briand C M 1994 Thermodynamic study of dihydrofolate reductase inhibitor selectivity Biochim Biophys Acta 1207 74 79 Sawin K E 2002 Cell polarity following formin function Curr Biol 12 R6 8 Sawin K E and Mitchison T J 1991 Poleward microtubule flux mitotic spindles assembled in vitro J Cell Biol 112 941 954 Saxon E and Bertozzi C R 2000 Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction Science 287 2007 2010 Schafer D A 2004 Regulating actin dynamics at membranes a focus on dynamin Traffic 5 463 469 185 R
146. ec les ligands HaloTag Cette prot ine monom rique de 33 kDa est d origine procaryote et est efficacement exprim e dans diff rents types cellulaires Le temps de marquage est relativement court d environ 3 5 minutes Los et al 2005 Avec toutes les m thodes pr c demment d crites le marquage est hautement sp cifique De plus il est ais d adapter la structure des sondes Par exemple la nature du fluorophore peut varier ce qui permet d avoir avec une seule tiquette prot ique un large choix de fluorophore en fonction de l utilisation souhait e D autres ligands non fluorescents comme la biotine peuvent aussi tre ajout s Le principal inconv nient de ces sondes est leur taille en effet l tiquette prot ique est parfois presque aussi grande que celle d une prot ine autofluorescente Derni rement l utilisation d int ine et de l ubiquitine a t envisag e comme s quences d tiquetage prot ique Figure 6 En effet les int ines et l ubiquitine peuvent tre cliv e sans trace depuis la prot ine d int r t en utilisant l pissage de prot ine ou la d ubiquitination pour produire une prot ine avec une cyst ine en N terminal La cyst ine N terminale est ensuite ligu e de mani re chimios lective via une ligation chimique native une sonde fonctionnalis e avec un thioester Yeo et al 2003 Cette m thode est versatile et devrait tre possible dans tous les types cellulaires
147. ege F C Weissman J S and Krogan N J 2007 Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae Mol Cell Proteomics 6 439 450 Corrie J E T and Trentham D R 1993 Caged nucleotides and neurotransmitters Vol 2 Ed Wiley New York Cory G O Cramer R Blanchoin L and Ridley A J 2003 Phosphorylation of the WASP VCA domain increases its affinity for the Arp2 3 complex and enhances actin polymerization by WASP Mol Cell 11 1229 1239 Cote J F Chung P L Theberge J F Halle M Spencer S Lasky L A and Tremblay M L 2002 PSTPIP is a substrate of PTP PEST and serves as a scaffold guiding PTP PEST toward a specific dephosphorylation of WASP J Biol Chem 277 2973 2986 D Dangles O Guibe F Balavoine G Lavielle S and Marquet A 1987 Selective cleavage of the allyl and allyloxy carbonyl groups through palladium catalyzed hydrostannolysis with tributyltin hydride Application to the selective protection 174 R ferences bibliographiques deprotection of amino acid derivatives and in peptide synthesis J Org Chem 52 4984 4993 Dayel M J Holleran E A and Mullins R D 2001 Arp2 3 complex requires hydrolyzable ATP for nucleation of new actin filaments Proc Natl Acad Sci USA 98 14871 14876 De Hostos E L 1999 The coronin family of actin associated proteins Trends Cell Biol 9 345 350 Deiters A Cropp T A Mukherji
148. ellulaire Ainsi la capacit des diff rentes souches mutantes a croitre sur du YP Glyc rol a t analys e par des tests en goutte a 25 30 et 37 C Comme le montre le tableau 10 les diff rentes d l tions n alt rent pas la capacit des cellules a se diviser en pr sence de glyc rol comme seule source de carbone d Croissance en pr sence de b nomyl Nous avons r alis le m me type de tests en goutte avec les diff rentes souches mutantes et sauvage sur un milieu contenant 50 uM de benomyl un agent d polym risateur des microtubules La d polymarisation des microtubules peut conduire a des d fauts de la division cellulaire Le test r alis a 25 30 et 37 C montre que la croissance d aucune des souches mutantes n est affect e par la pr sence de b nomyl Tableau 10 2 Recherche d un effet des diff rentes d l tions surle profil de bourgeonnement le cytosquelette d actine et l endocytose en phase fluide a Profil de bourgeonnement Chez S cerevisiae mergence du bourgeon est un processus hautement polaris La s lection du site de bourgeonnement a lieu diff rents sites cellulaires en fonction de la plo die Chez les cellules diplo des l mergence du bourgeon se fait successivement chacun des de ses p les bourgeonnement bipolaire alors que pour les cellules haplo des le bourgeon appara t pr s du site de bourgeonnement pr c dent bourgeonnement axial Casamayor et Snyder 2002 C
149. ellulaire pour former des complexes relativement immobiles Etape 2 Pan1p et Las17p recrutent et activent le complexe Arp2 3 pour nucl er l assemblage de l actine menant un mouvement lent des patches au cortex Pendant cette tape 3 NPFs additionnels sont recrut s Abp1p et Myo3 5p Abp1p son tour recrute les kinases r gulant l actine Ark1p et Prk1p qui phosphorylent Panip La phosphorylation inhibe l activation du complexe Arp2 3 par Panip et provoque une dissociation du complexe Pani Panip End3p et Sla1p Etape3 La phosphorylation de Pan1p et ou les activit s de Rvs161p Rvs167p et des myosines de type Myo3p et Myo5p provoquent la scission des v sicules et leur internalisation Le complexe Arp2 3 Abpip Sac6p Cap1 Cap2p maintiennent l association avec les v sicules internalis es Certains composants pr coces des patches restent au cortex cellulaire Las17p Pan1p Sla1p Sla2p Myo3p et Myo5p Etape 4 Les v sicules endocytiques s associent avec des c bles d actine par un m canisme inconnu et bougent passivement avec le flux r trograde des c bles d actine Etape 5 Les v sicules associ es aux c bles fusionnent avec les compartiments endosomaux avec un d sassemblage concomitant du manteau d actine Adapt e de Moseley et Goode 2006 Recherche de partenaires de Bzz1p 2 Mod le pour le d veloppement des taches corticales d actine et leur fonction Un mod le r cent de d vel
150. embl es s ch es par du sulfate de sodium anhydre filtr es et vapor es sec 832 mg d un solide jaune sont r cup r s p 65 f Le NO O r O 0 40 PNA lt O q wen o So q O r S s RMN H CDCL 5 1 45 s 18H Hr 1 46 s 9H Hs 1 52 1 70 m 12H Hf Hh Hm Hn et Ho 3 33 t 1H Hp 3 40 m 2H Hl 3 48 2s 4H Hq 3 78 q 1H He 3 89 et 3 92 s 6H Ha et Hb 4 84 q 1H Hg 6 76 s 1H Hd 7 07 s 1H Hi 7 44 s 1H Hc 7 65 s 1H Hj 8 74 s 1H Hk API ES MS 912 4 M Na 890 4 M H 77 D veloppement d un fluorophore photoactivable R Cage Coumarine Lysine NTA 18 Sous argon et agitation 65 mg du compos 17 0 073 mmol sont dissous dans 2 mL de dichlorom thane distill puis 2 mL de TFA sont ajout s La r action est laiss e 4 ha temp rature ambiante Le brut est vapor sec Et il est pr cipit par de l ther froid et lav plusieurs fois l ther froid 49 1 mg d un solide jaune sont r cup r s p 93 NO OH I O 0 o pn a lt O O o MT AR AT l o j ok 6 a Ho So RMN H CDCl3 3 1 52 1 70 m 12H Hf Hh Hm Hn et Ho 3 33 t 1H Hp 3 40 m 2H Hl 3 48 2s 4H Hq 3 78 q 1H He 3 89 et 3 92 s 6H Ha et Hb 4 84 q 1H Hg 6 76 s 1H Hd 7 07 s 1H Hi 7 44 s 1H Hc 7 65 s 1H Hj 8 74 s 1H Hk API ESI MS 720 1 M HT S Ac Coumarine Lysine NTA tB
151. ermann M Swain E Bergman L and Nickels J T Jr 2005 Characterizing the sphingolipid signaling pathway that remediates defects associated with loss of the yeast amphiphysin like orthologs Rvs161p and Rvs167p J Biol Chem 280 4270 4278 Giepmans B N Adams S R Ellisman M H and Tsien R Y 2006 The fluorescent toolbox for assessing protein location and function Science 312 217 224 Goeldner M 2005 Caging of ATP and Glutamate a Comparative Analysis In Dynamics Studies in Biology Phototriggers Photoswitches and Caged Biomolecules M Goeldner and R S Givens eds Wiley VCH pp 76 94 Goeldner M and Givens R S eds 2005 Dynamics Studies in Biology Phototriggers Photoswitches and Caged Biomolecules In Wiley VCH Goldsmith C R Jaworski J Sheng M and Lippard S J 2006 Selective labeling of extracellular proteins containing polyhistidine sequences by a fluorescein nitrilotriacetic acid conjugate Am Chem Soc 128 418 419 Goley E D and Welch M D 2006 The ARP2 3 complex an actin nucleator comes of age Nat Rev Mol Cell Biol 7 713 726 Goode B L and Rodal A A 2001 Modular complexes that regulate actin assembly in budding yeast Curr Opin Microbiol 4 703 712 Goode B L Rodal A A Barnes G and Drubin D G 2001 Activation of the Arp2 3 complex by the actin filament binding protein Abp1p J Cell Biol 153 627 634 Goppert Mayer M 1931 Uber
152. es apr s 2 3 jours d incubation 30 C Tampon PEG Li 40 de poly thyl ne glycol PEG 4000 ac tate de lithium 0 1 M Tris Cl 10 mM pH 7 5 EDTA 1 mM 157 Recherche de partenaires de Bzz1p 2 Pr paration d ADN partir de cellules de levure a M thode m canique Cette m thode est adapt e de Hoffman et Winston 1987 2 mL d une culture de levure sont centrifug s et les cellules sont resuspendues dans 500 uL de tampon Hoffman dans un microtube Environ 500 uL de billes de verre 0 5 mm de diam tre et 500 uL de ph nol chloroforme 1 1 sont ajout s cette suspension Les cellules sont vortex es pendant 2 min Apr s centrifugation 5 min 12 000 g le surnageant est m lang avec 1 volume de ph nol chloroforme 1 1 Les cellules sont vortex es pendant 20 s Apr s centrifugation 5 min 12 000 g le surnageant est m lang avec 0 1 volume d ac tate d ammonium 7 5 M et 2 5 volumes d thanol 100 et plac 20 min 20 C L ADN pr cipit est centrifug 5 min 12 000 g lav 2 fois avec 1 mL d thanol 75 s ch bri vement temp rature ambiante et enfin resuspendu dans 50 uL d eau Tampon Hoffman NaCl 100 mM Tris HCl 10 mM pH8 EDTA 1 mM SDS 0 1 et Triton X 100 2 b M thode enzymatique Un volume de 5 mL d YPD est inocul avec la souche de levure d int r t Les cellules sont cultiv es a 30 C jusqu saturation une nuit Les cellules sont s diment es par centrifugation 2
153. es travaux ont utilis une sequence prot ique d environ 80 acides amin s d riv e du PCP peptide carrier protein Yin et al 2004 ou de l ACP acyl carrier protein George et al 2004 qui a t tiquet e en utilisant une enzyme la phosphopant th ine transf rase PPtase La PPtase transfert des sondes li es au 4 phosphopantetheine depuis le coenzyme A CoA une s rine de la chaine lat rale de l ACP ou de la PCP pour former un attachement sp cifique et covalent Ces deux m thodes ont l avantage d avoir des temps de marquages relativement courts environ 5 10 min de marquage et 5 10 de lavages Le d veloppement de sondes fluorog niques qui deviennent fluorescentes seulement apr s la ligation la s quence cible pourrait encore r duire ces temps de marquages car les tapes de lavages deviendraient inutiles L enzyme AGT est trouv naturellement dans les cellules de mammif res aussi des enzymes mutantes hAGt ont t g n r es mais il existe toujours un l ger bruit de fond Juillerat et al 2003 La m thode PPtase n a pas ce genre de probl mes mais elle ne peut tre utilis e que pour des marquages de prot ines la surface cellulaire car les sondes utilis es ne sont pas perm ables la membrane R cemment un nouveau syst me est apparu La prot ine HaloTag est catalytiquement inactive c est une hydrolase g n tiquement modifi e qui forme efficacement une liaison covalente av
154. et en g n tique En 1996 ce fut le premier eucaryote dont le g nome ait t s quenc Son g nome de 16 chromosomes est compos de 13 millions de paires de bases et de 4462 genes On estime qu elle partage 23 de son g nome avec l Homme Botstein et al 1997 Chez ce microorganisme le cytosquelette est form de microtubules de microfilaments et des septines La levure possede un seul gene codant pour l actine ACT1 Shortle et al 1982 et la d l tion de ce gene est l tale Elle poss de aussi une dizaine de prot ines apparent es a l actine les ARPs Actin related protein Poch et Winsor 1997 A Le cycle de vie de la levure Dans les conditions normales de croissance la multiplication v g tative des cellules de Saccharomyces cerevisiae se fait par bourgeonnement Le bourgeonnement correspond une polarisation de la croissance cellulaire et un partage des organites entre les deux compartiments cellulaires Cette polarisation est li e une r organisation du cytosquelette d actine La mise en place du bourgeon est sous la d pendance d une petite prot ine G de la famille Rho Cdc42p Celle ci fluctue entre deux formes une li e au GDP inactive et une li e au GTP active Cdc42p est activ e par Cdc24p une prot ine GEF Guanosine Exchange Factor et inactiv e par des GAPs GTPase Activating Protein Rgalp Bem3p et Bem2p pour revue Pruyne et Bretscher 2000b Le bourgeon se d veloppe d abord ap
155. extr mit barbel e alors que leur dissociation pr domine l extr mit pointue L longation peut tre r gul e par deux facteurs la concentration critique en actine G et l hydrolyse de l ATP Ainsi l longation se poursuit chaque extr mit jusqu ce que la concentration en actine G atteigne une concentration critique en dessous de laquelle l incorporation aux filaments est impossible et la concentration critique est diff rente pour chaque extr mit Wegner et Isenberg 1983 La concentration critique inhibant l longation l extr mit tant plus basse que celle de l extr mit l extr mit favorise donc l incorporation de monom res Des tudes in vitro ont montr que le monom re d actine hydrolyse son ATP d s son incorporation dans le filament pour revue Carlier et al 2003 et lib re un phosphate inorganique Pi dans le milieu cellulaire Le long du filament chaque monom re passe par trois tats diff rents l actine ATP fix e l extr mit l actine ADP Pi forme transitoire et l actine ADP qui s accumule l extr mit avant d tre dissoci e du filament A l quilibre la dissociation l extr mit est compens e par l ajout de monom res l extr mit Gr ce cet quilibre dynamique ou pseudo tat stationnaire la longueur du filament d actine ne varie pas alors que l actine se d place d un
156. fet il a t montr in vitro que la tyrosine 291 situ e pr s du domaine GBD est un substrat pour les kinases des familles Abl Btk et Src Cette modification a pour effet d augmenter l activit basale de WASP Cory et al 2003 Torres et Rosen 2003 Toutefois cette phosphorylation ne peut avoir lieu que si Cdc42 est li e au domaine GBD et qu elle active WASP Guinamard et al 1998 Torres et Rosen 2003 Les auteurs proposent un mod le ou WASP serait activ e par Cdc42 permettant ainsi la phosphorylation de la tyrosine 291 Une fois WASP activ e Cdc42 s en d tache mais la phosphorylation persiste permettant ainsi WASP de conserver son activit m me en absence de stimulus Ce cas d activation par phosphorylation sur une tyrosine quivalente t d montr chez N WASP Il semblerait que les tyrosines kinases de la famille Src soient impliqu es in vivo et que cette phosphorylation aurait pour r le dans un premier temps d activer N WASP puis d en initier la d gradation par le prot asome Suetsugu et al 2002 WASP est aussi activ par le Pl 4 5 P Higgs et Pollard 2000 L activit des prot ines WASP et N WASP peut aussi tre r gul e via une interaction avec des prot ines poss dant des domaines SH3 Src Homology 3 Takenawa et Miki 2001 G n ralement la liaison de ces prot ines agit en synergie avec un autre activateur c est le cas par exemple de Grb2 qui en se liant a N WASP augmente l activ
157. ffisant pour former la queue d actine et g n rer la motilit du pathogene Listeria monocytogenes La pr sence du complexe Arp2 3 dans son int gralit semble tre cruciale pour la survie cellulaire et son organisation En effet des exp riences de d l tion de genes ont montr une l talit dans la quasi totalit des esp ces sur lesquelles les exp riences ont t faites tant chez les levures S cerevisiae Moreau et al 1996 S pombe Balasubramanian et al 1996 l amibe D discoideum Insall et al 2001 que dans les cellules humaines Harborth et al 2001 Le complexe Arp2 3 a une pr f rence pour le c t des filaments d actine in vitro et est capable d y initier la polym risation d un nouveau filament Mullins et al 1997 Ceci conduit a la formation d un r seau de filaments d actine branch s en Y a un angle de 70 Mullins et al 1998 Figure 17 gauche Cette fonction explique l observation en microscopie lectronique du r seau d actine pr sentant une organisation sous forme de branches aussi nomm es r seau dendritique Figure 17 droite L activit du complexe Arp2 3 est r gul e par plusieurs facteurs Par exemple les prot ines de coiffe sont en comp tition avec Arp2 3 et r duisent donc sa capacit promouvoir la nucl ation de l actine Falet et al 2002 L hydrolyse de l ATP par Arp2 3 est essentielle a l activit de nucl ation du complexe Dayel et al 2001 To
158. filine homology Acid Wiskott Aldrich syndrome protein WASP Verprolin homologous protein WASP Homology 1 2 Wiskott Aldrich Interacting Protein 11 Liste des prot ines de levure et de leurs fonctions mentionn es au cours de ce travail Act1p Actine Complexe Arp2 3 centre de nucl ation de l actine Arp2p Actin related protein Arp3p Actin related protein Arc40p ARPC1 Arp2 3 Complex subunit Arc35p ARPC2 Arp2 3 Complex subunit Arc18p ARPC3 Arp2 3 Complex subunit Arc19p ARPCA Arp2 3 Complex subunit Arc15p ARPC5 Arp2 3 Complex subunit Assemblage des taches corticales d actine Las17 Bee1p Homologue de WASP Abp1p Actin binding protein Panip Homologue de Eps15 Myo3p Myosine de type Myo5p Myosine de type Ark1p Actin regulating kinase Kinase de Pan1p Prk1p Kinase de Pan1p Bbc1p Inhibe Las17p Slaip Inhibe Las17p Lsb1p Las seventeen binding protein Lsb3p Las seventeen binding protein Lsb4p Ysc84p Las seventeen binding protein Bzz1p Active Las17p App1p Actin patch protein Rvs167p Reduced Viability on Starvation Homologue amphiphysine Rvs161p Reduced Viability on Starvation Homologue amphiphysine Lsp1p Composant de l eisosome Pilip Composant de l eisosome Sur7p Prot ine membranaire Assemblage des cables d actine Bnitp Formine Bnrip Formine Bud6p Activation Bni1p Cyk2p Hof1p Alt ration fonction des formines Vrp1p Verproline Homologue de WIP Bim1p Prot ine de liaison aux microtubules
159. g 15 min 4 C le surnageant est r cup r Tampon XB KCl 100 mM MgCl 2 mM CaCl 0 1 mM EGTA 5 mM DTT 1 mM ATP 1 mM HEPES 10 mM pH 7 7 Saccharose 50 mM 2 Extraits prot iques d Escherichia coli La surproduction de la prot ine d int r t est induite par ajout d IPTG 0 1 1 mM final 37 C optimiser selon les cas pendant 2 4 h dans une culture bact rienne en phase exponentielle de croissance Les bact ries issues d une culture de 50 mL sont s diment es par centrifugation puis resuspendues dans 2 mL de PBS contenant des inhibiteurs de prot ases et du PMSF 1mM Les cellules sont ensuite lys es en r alisant 4 cycles de sonication de 30 s 28 d amplitude Vibracell Bioblock Entre chaque cycle les cellules sont refroidies 30 s dans la glace Chaque extrait est centrifug 13 000 g 15 min 4 C et le surnageant est r cup r Selon les cas le culot contenant les d bris cellulaires ainsi que les corps d inclusion est conserv 162 Recherche de partenaires de Bzz1p B Expression purification et utilisation d une prot ine fusionn e 6xHistidines 1 La prot ine est soluble L extrait prot ique pr par par sonication Section C 1 b est quilibr a 186 uL extrait prot ique E coli sont ajout s 2 uL d imidazole 1 M Cs 10 mM et 12 uL de NaCl 5 M C 300 mM pour obtenir un volume final de 200 pL Les billes de Ni NTA agarose sont quilibr es dans le tampon de fixat
160. ge d ac tone tampon phosphate pH7 0 25 M est ajout ainsi de que l thanedithiol La phase aqueuse 69 D veloppement d un fluorophore photoactivable est extraite 3 fois avec du dichlorom thane Les phases organiques sont rassembl es lav es par une solution satur e en chlorure de sodium s ch es par du sulfate de sodium anhydre filtr es et vapor es sec Le produit obtenu est purifi sur colonne de silice luant dichlorom thane Le produit est peu stable et le rendement de la r action semble quasi nul F 2 4 Dihydroxy 5 chloro benzald hyde 6 Dans un ballon sous argon et agitation le 2 4 dihydroxybenzald hyde 8 75 g 63 mmoles est dissous dans 200 mL d une solution d acide sulfurique dilu e H20 H SO 50 50 v v puis la N chloropip ridine 8 3 g 70 mmoles 1 1 qu est ajout e goutte goutte Un pr cipit se forme la r action est laiss e une nuit temp rature ambiante Le brut de r action est filtr lav e l eau distill e Ensuite le produit est recristallis avec du t trachlorure de carbone chaud et filtr chaud 8 4 g d un solide blanc sont obtenus p 77 RMN H CDCL 8 6 62 s 1H Hd 7 53 s 1H Hg 9 70 s 1H Ha RMN C DMSO D 5 103 5 s CH Cd 112 2 s C Cb 116 0 s C Cf 130 3 s CH Cg 159 9 s C Ce 161 4 s C Cc 188 8 s CHO Ca G Acide 6 chloro 7 hydroxy coumarine 3 carboxylique ou coumarine
161. h d velopper une solution nouvelle cette probl matique Ainsi mon but a t de d velopper et synth tiser un nouveau fluorophore photoactivable dont la fluorescence est masqu e capable de se lier une prot ine d int r t par exemple Bzz1p ou une autre prot ine du cytosquelette d actine par un motif de reconnaissance sp cifique Une fois ce fluorophore irradi dans une zone choisie de la cellule les quelques prot ines devenues fluorescentes pourraient alors tre suivies par microscopie La synth se de la sonde photoactivable s est r v l e plus difficile et plus longue que pr vue En parall le au d veloppement de la sonde photoactivable qui s est effectu dans le laboratoire de Chimie Bioorganique dirig par le Pr Maurice Goeldner j ai commenc un travail de recherche sur la prot ine Bzzip impliqu e dans la r gulation du cytosquelette d actine dans la levure Ce travail s est effectu au laboratoire 14 Cytosquelette d Actine et Trafic Intracellulaire dirig par le Dr Barbara Winsor Dans un souci de clart j ai s par les deux aspects diff rents de ce travail de these en deux parties distinctes de ce manuscrit Ainsi dans un premier temps j aborde des notions g n rales de fluorescence et de lumi re mono ou bi photon qui sont suivies par un bref expos sur les fluorophores photoactivables et les groupements photolabiles d j d crits dans la litt rature Ensuite je pr sen
162. hant et Herskowitz 1991 Cette s lection du site de bourgeonnement axial ou bipolaire n cessite la mise en place des prot ines Bud1p Bud2p Bud5p qui recrutent le cytosquelette d actine qui assure l acheminement des 134 to NaCl Phallo dine TRITC DIC Phallo dine TRITC DIC ast2A ykr018CA yer128WA ydr428CA ycr076CA ypt324 Figure 36 Effets des d l tions des diff rents candidats sur l organisation du cytosquelette d actine et sur sa repolarisation apr s un stress salin NaCl 1M Les cellules sont cultiv es 25 C avant de subir le stress salin pendant 5 h et color es avec de la phalloidine TRITC comme d crit dans Mat riel et M thodes La souche sauvage est BY4742 Recherche de partenaires de Bzz1p composants indispensables la croissance du bourgeon Cabib et al 1998 Chaque bourgeonnement laisse une cicatrice sur les cellules m re et fille Cette cicatrice en forme d anneau correspond l accumulation de chitine un constituant de la couche interne de la paroi cellulaire qui est responsable de la forme et de la rigidit de cette derni re Zlotnik et al 1984 Lorsque certaines prot ines importantes pour la polarit la s lection du site de bourgeonnement ou le cytosquelette d actine sont absentes ou mut es il peut en r sulter une d localisation totale de la chitine diffuse ou agr gats un bourgeonnement al atoire ou encore le passage d un bourgeonnement axial
163. hese d Alexandre Soulard et nous recherchions d autres partenaires potentiels pour Bzzip Il s est av r que tous les partenaires double hybride trouv s pour Bzz1p Myo5p Las17p Appip Ldb17p Mecip Pmaip Ubp7p Ypl277Cp et Yor389Wp sont absents de la puce sauf Las17p qui comme je l ai d ja mentionn est en quantit tres faible Il ne nous tait donc pas possible de recouper ces r sultats Nous avons alors plut t orient nos recherches vers l identification de prot ines peu ou pas connues Ce sont pour ces raisons que j ai choisi de travailler avec les prot ines Ykr018Cp Yer128Wp Ydr428Cp et Ycr076Cp dont la fonction est inconnue De plus j ai choisi de travailler avec Ast2p qui pourrait jouer un r le avec Pmalp prot ine trouv e dans le crible double hybride avec Ypt32p qui est impliqu e dans l exocytose et avec Aip1p qui intervient dans la r gulation du cytosquelette d actine Rodal et al 1999 Aucune de ces prot ines n est essentielle car leur seule d l tion n entraine ni l talit ni m me de d faut de croissance de thermosensibilit de d fauts de bourgeonnement d osmosensibilit ou de d faut de la paroi cellulaire cf tableau 10 et figure 34 Des observations cytologiques dans les diff rents mutants ont permis de mettre en vidence que ces mutations n affectaient pas le profil de bourgeonnement au cours du cycle cellulaire L organisation du cytosquelette d actine et l endocytose en
164. icalement dans une seule direction puis de maniere isotropique c est dire dans toutes les directions Lorsque le bourgeon atteint une taille critique il y a cytocinese et d tachement du bourgeon donnant naissance a une nouvelle cellule Figure 21 La levure est un organisme unicellulaire que l on trouve l tat naturel sous forme haploide n chromosomes ou diploide 2n chromosomes ou polyplo de Cependant lorsque les conditions environnementales sont d favorables la croissance carence en nutriments les cellules diplo des entrent en m iose et forment un asque contenant quatre spores haplo des t trade Cette forme extr mement r sistante permet aux 97 Figure 22 Organisation du cytosquelette d actine durant le cycle cellulaire de S cerevisiae Les points rouges repr sentent les taches corticales et les lignes les c bles d actine a La cellule choisit son site de bourgeonnement b Il y a polarisation du cytosquelette d actine vers le bourgeon pour qu il y ait s cr tion de tous les l ments essentiels a sa croissance apicale c Le bourgeon peut ensuite cro tre d une mani re isotropique d Lorsque la taille ad quate est atteinte les taches corticales se r partissent dans la cellule m re et la cellule fille e Ils se retrouvent ensuite dans la plaque quatoriale et les c bles sont dirig s au travers f La nouvelle cellule peut alors cro tre d une mani re isotropique h Lorsque la cellule
165. ien avec l endocytose a d abord t sugg r dans des tudes montrant que la dynamine lie les domaines SH3 de membres de la famille PCH e g Syndapine et CIP4 Itoh et al 2005 Kessels et Qualmann 2004 Tsujita et al 2006 Chez les mammif res la dynamine est une GTPase qui a une fonction importante dans Vendocytose m di e par la clathrine Schafer 2004 elle catalyse l excision de la bicouche lipidique invagin e et le bourgeonnement des v sicules depuis des membranes intracellulaires telles que la membrane de l appareil de Golgi Il a t montr que FBP17 induit la formation d invaginations tubulaires depuis la membrane plasmique Kamioka et al 2004 Le domaine F BAR est requis pour la formation des tubules mais pas le domaine SH3 de FBP17 De plus Itoh et al 2005 et Tsujita et al 2006 ont montr que le domaine F BAR de prot ines comme CIP4 montrent une affinit pour les liposomes contenant de la phosphatidyls rine et des phosphoinositides Le domaine FCH semble tre important pour le ciblage des prot ines PCH aux liposomes mais la capacit de ces prot ines s oligom riser d une mani re d pendante de la r gion coiled coil est certainement la force motrice qui d forme les liposomes en structures tubulaires Cependant la fonction pr cise du domaine F BAR reste tablir et il est possible que les diff rents domaines F BAR aient diff rentes fonctions C Les prot ines PCH dan
166. in s ou bases Tous les milieux sont st rilis s par autoclavage 120 C sous une pression de 1 2 bar pendant 20 min Ils peuvent tre solidifi s par l addition de 2 P d agar Les cellules sont conserv es dans du milieu glyc rol 15 80 C C Transformation et isolement de l ADN G nomique 1 Transformation Pour faire p n trer de l ADN plasmidique ou des fragments d ADN lin aires dans les cellules de levure un traitement l ac tate de lithium en pr sence de DMSO a t utilis Hill et al 1991 Pour int grer un fragment d ADN au chromosome insertion d l tion remplacement un plasmide coup ou un fragment d ADN amplifi par PCR et pr sentant des bouts francs sont utilis s pour subir une recombinaison La souche de levure transformer est cultiv e dans 1 5 mL d YPG 25 30 C durant une nuit sous agitation Les cellules sont s diment es par centrifugation 10 000 g 30 s T ambiante Elles sont resuspendues avec 10 uL d une solution d ADN de sperme de saumon 10 ug uL et 100 ng d ADN transformant la suspension cellulaire est vortex e puis 500 ul d un tampon PEG Li sont ajout s ainsi que du DMSO une concentration finale de 10 La suspension cellulaire est incub e 15 min T ambiante avant de subir un choc thermique 42 C pendant 15 min Les cellules sont lav es avec du tampon TE avant d tre tal es sur un milieu s lectif ad quat Les transformants sont visibl
167. in de visualiser les filaments d actine La figure 36 montre que le cytosquelette d actine est correctement polaris au cours du cycle cellulaire dans les souches mutantes Les c bles sont orient s le long de l axe de croissance cellulaire et les taches corticales d actines sont capables de polariser au niveau du site d mergence du bourgeon dans les bourgeons en croissance et a l etranglement entre la cellule m re et la cellule fille avant la cytocinese Une d l tion de BZZ1 n a pas de cons quence sur l organisation du cytosquelette d actine mais une double d l tion de BZZ1 et MYO5 souche SLW571 affecte la repolarisation du cytosquelette d actine apres un choc osmotique Soulard et al 2002 En effet apr s un stress salin le cytosquelette d actine se d polarise tr s rapidement et peut causer un retard de croissance des cellules de levure Apres 1 ou 2 h S cerevisiae 136 ast2A ykr018CA yer128WA ycr076CA Figure 37 Analyse de l endocytose en phase fluide par l internalisation du Lucifer Yellow a 25 C dans les cellules sauvages BY4742 et mut es pour bzz14 et pour les differents candidats La souche sauvage est BY4742 u cd Recherche de partenaires de Bzz1p s adapte la forte concentration en sel et son cytosquelette d actine se repolarise progressivement et completement Chowdhury et al 1992 Nous avons voulu tester si les d l tions des diff rents partenaires potentiels de Bzzip
168. ion 50 uL de billes 50 pour 200 uL d extrait prot ique 60 uL de billes Ni NTA agarose 50 dans l thanol sont ajout s 200 uL de tampon de fixation elles sont alors m lang es et centrifug es 6 000 g 30 s 4 C Le surnageant est aspir et les billes sont reprises dans 50 uL de tampon de fixation 200 uL d extrait prot ique quilibr sont alors fix s pendant 30 60 min 4 C sur 50 uL de billes lav es avec une agitation douce Elles sont ensuite centrifug es et lav es 4 fois avec 400 uL de tampon de fixation Ensuite les billes sont lu es avec 50 uL de tampon d lution pendant 10 min temp rature ambiante Apr s centrifugation la surnageant est r cup r et le degr de puret est estim sur SDS PAGE Tampon de fixation Imidazole 10 mM NaCl 300 mM PMSF 1 mM PBS 1X Inhibiteurs de prot ases Complete EDTA free Roche Tampon d lution Imidazole 450 mM NaCl 300 mM PMSF 1 mM PBS 1X Inhibiteurs de prot ases 2 La prot ine est insoluble Le culot obtenu apr s sonication dans la section C 1 b est repris dans 5 mL de tampon de solubilisation et est incub 1 nuit T ambiante Il est ensuite centrifug 10 000 g 30 min et le surnageant est dilu au Y avec du PBS 2X et ajust pH8 si n cessaire La concentration finale en SDS est de 0 25 et en B mercapto thanol de 5 mM ce qui permet la fixation sur billes Ni NTA Les 20 mL de surnageant dilu sont m lang s avec 500 6
169. ion de BZZ1 ou la double d l tion de BZZ1 et MYO5 est synth tique l tale avec les diff rents mutants des g nes codants pour les prot ines X Nous avons alors construits diff rentes souches contenant des triples d l tions bzz14 myo5 4 X A ou des doubles d l tions bzz1A X A par croisement des parents bzz14 myo5 A SLW571 et X A provenant de la banque de d l tions Ces diff rentes d l tions n entrainent pas de l talit synth tique ni de thermosensibilit De plus la d l tion du gene X dans les souches avec une double ou une triple d l tion n altere pas la sensibilit au NaCl observ e pour la souche bzz1A myo5 A ceci semble indiquer que les candidats retenus avec le Protoarray ne sont pas ou peu impliqu s dans ce ph nom ne d osmosensibilit Ces r sultats ne nous ont pas permis de v rifier que Bzz1p interagissaient avec les diff rentes prot ines X Nous nous sommes engag s alors dans des exp riences de biochimie pour confirmer ces interactions par des exp riences d interactions d affinit de GST pulldown ou de His pulldown gt Apres fixation de Bzz1p tiquet e avec des polyhistidines ou de la GST sur des billes Ni NTA Agarose ou Glutathion S pharose respectivement suivie d une incubation avec un extrait de levure contenant la prot ine X fusionn e avec la GFP puis une r v lation par Western blot il est possible de confirmer l interaction potentielle entre la prot ine X et Bz
170. ique et glutamique Adapt e de Badour et al 2003 Recherche de partenaires de Bzz1p les filaments n osynth tis s par Arp2 3 Millard et al 2004 Weaver et al 2001 Des activateurs importants et les mieux connus sont les prot ines de la famille WASP d taill e dans la section suivante 2 Les prot ines de la famille WASP Scar WASP pour Wiskott Aldrich Syndrome Protein le premier membre de cette famille de prot ines a t identifi comme la prot ine r sultant de l expression d un gene mut chez les patients atteints du syndrome de Wiskott Aldrich Derry et al 1994 une maladie g n tique li e au chromosome X Les patients souffrant de ce syndrome pr sentent des probl mes immunitaires et de coagulation dus a un d faut du cytosquelette d actine dans les globules blancs et les plaquettes Imai et al 2003 La prot ine WASP est exclusivement exprim e dans les cellules h matopoi tiques or les organismes eucaryotes contiennent au moins une prot ine pr sentant d importantes similarit s de s quence avec WASP elles ont t class es dans une famille de prot ines appel es WASP Scar Cette famille contient l isoforme N WASP Neural WASP exprim plus ubiquitairement que WASP Miki et al 1996 les isoformes de Scar WAVE WASP Verprolin homologous protein identifi s chez Dictyostelium discoideum et chez l homme Suetsugu et al 1999 et les prot ines Wsp1 et Las17p de Schizosaccharomyces pombe et S
171. irchhausen T 1996 Direct interaction of the Wiskott Aldrich syndrome protein with the GTPase Cdc42 Proc Natl Acad Sci U S A 93 5615 5618 Konig K 2000 Multiphoton microscopy in life sciences J Microsc 200 83 104 Kovar D R 2006 Arp2 3 ATP hydrolysis to branch or to debranch Nat Cell Biol 8 783 785 Kreishman Deitrick M Goley E D Burdine L Denison C Egile C Li R Murali N Kodadek T J Welch M D and Rosen M K 2005 NMR Analyses of the Activation of the Arp2 3 Complex by Neuronal Wiskott Aldrich Syndrome Protein Biochemistry 44 15247 15256 Krogan N J Cagney G Yu H Zhong G Guo X Ignatchenko A Li J Pu S Datta N Tikuisis A P et al 2006 Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae Nature 440 637 643 Kubler E and Riezman H 1993 Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast Embo J 12 2855 2862 180 R ferences bibliographiques Landgraf C Panni S Montecchi Palazzi L Castagnoli L Schneider Mergener J Volkmer Engert R and Cesareni G 2004 Protein interaction networks by proteome peptide scanning PLoS Biol 2 E14 Lata S Reichel A Brock R Tampe R and Piehler J 2005 High affinity adaptors for switchable recognition of histidine tagged proteins Am Chem Soc 127 10205 10215 Lazar T Gotte M and Gallwitz D 1997 Vesicular t
172. isse une r organisation continuelle en r ponse de nombreux stimuli intra ou extra cellulaires Le cytosquelette est compos de trois types de fibres les microfilaments les microtubules et les filaments d interm diaires Chaque type de filament est constitu partir d un monom re prot ique l actine pour les microfilaments la tubuline pour les microtubules et une famille de prot ines fibreuses chez les mammif res telles que la vimentine ou la lamine pour les filaments interm diaires Bien que ces diff rents types de filaments soient impliqu s dans des fonctions diff rentes ils sont capables de coop rer dans certains processus biologiques I Le cytosquelette d actine Toutes les cellules eucaryotes levures champignons ou fungi plantes invert br s ou vert br s contiennent de l actine Cette prot ine est tr s abondante elle repr sente en moyenne 5 des prot ines totales de la cellule et cette proportion peut atteindre 20 dans les cellules musculaires L actine est hautement conserv e au cours de l volution des comparaisons de s quences ont montr en moyenne 80 90 d identit entre les actines et ceci quelle que soit leur origine Sheterline et Sparrow 1994 Cette importante conservation de s quence refl te les contraintes impos es par les fonctions cellulaires essentielles de cette prot ine Certains eucaryotes inf rieurs comme les levures Saccharomyces cerevisiae ou Schizosacch
173. it 4 C avec la prot ine d int r t fusionn e avec des tiquettes 6xHis et V5 1 ug mL Apres 3 lavages dans du tampon de blocage elle est incub e 1 h avec l anticorps primaire de souris anti V5 MCA1360 AbD Serotec dilu au 1 1000 dans du tampon de blocage Apr s 3 lavages dans du PBS T la membrane est incub e 1 h avec l anticorps secondaire anti souris IgG HRP dilu au 1 5000 dans du PBS T La membrane est alors lav e avec du PBS T et la r v lation des interactions lipides prot ines se fait en utilisant le kit de d tection ECL Enhanced Chemiluminescence Amersham Pharmacia et en exposant ensuite un film autoradiographique PBS T PBS 1X Tween 20 0 1 v v Tampon de blocage PBS T BSA sans acide gras 1 m v bien dissoudre sous agitation pendant 30 60 minutes 166 Recherche de partenaires de Bzz1p VI M thodes cytologiques appliqu es la levure A Fixation des cellules Les cellules en phase exponentielle de croissance Absgoonm 0 3 sont fix es et perm abilis es dans le milieu de culture par ajout de formald hyde 3 7 final et de Triton X 100 0 04 final Les cellules sont ensuite incub es sous agitation pendant 30 min la T de croissance Apr s centrifugation 1 500 g 2 min elles sont resuspendues avec 1 mL de tampon de fixation puis incub es 2 h T ambiante Elles sont ensuite lav es 3 fois avec du PBS Les cellules ainsi fix es peuvent tre conserv e
174. it de nucl ation d Arp2 3 et potentialise l effet activateur de Cdc42 Carlier et al 2000 D autres prot ines domaines SH3 sont connues pour interagir avec WASP telles que WISH Fukuoka et al 2001 l intersectine Hussain et al 2001 la syndapine Qualmann et al 1999 faisant ainsi de N WASP une prot ine potentiellement impliqu e dans de nombreux processus Les prot ines de la famille WAVE interagissent avec les prot ines Abelson interacting protein ABI NAP1 SRA1 PIR121 et HSPC300 pour former des complexes stables Eden et al 2002 Gautreau et al 2004 Innocenti et al 2004 Stovold et al 2005 Suetsugu et al 2006 Figure 19 La localisation de WAVE2 n cessite une liaison au PI 3 4 5 P Oikawa et al 2004 alors que WASP lie le PI 4 5 P Higgs et Pollard 2000 WAVE2 est cruciale pour la formation des lamellipodes et WAVE1 r gule la formation de vagues dorsales dorsal ruffle des filaments d actine assembl s de fa on circulaire la surface dorsale des cellules Suetsugu et al 2003 93 proftine thymosines D twinfitin profiline Srv2 CAP WASP Figure 20 Ensemble des prot ines interagissant avec l actine Adapt e de Winder et Ayscough 2005 Recherche de partenaires de Bzz1p D R gulation de la polym risation de l actine chez les mammif res L instabilite des filaments permet de r guler et d adapter leur quantit en fonction des besoins cellulaire
175. it que dans un extrait prot ique on retrouve des prot ines de tous les compartiments ce qui n est pas le cas in vivo V Interactions prot ine lipides de Bzz1p A R le du domaine F BAR Comme d crit pr c demment Bzz1p un homologue de Toca 1 humaine se compose de plusieurs domaines prot iques un domaine F BAR FCH et coiled coil et deux domaines SH3 R cemment il a t montr que certaines prot ines de mammif res contenant un domaine BAR Bin Amphiphysin Rvs ou F BAR et un ou des domaine s SH3 se lient aux phospholipides notamment le phosphatidyls rine et le Pl 4 5 P de la membrane plasmique par leur domaine BAR F BAR et r gulent le cytosquelette d actine par leur s domaine s SH3 Itoh et al 2005 Tsujita et al 2006 Nous avons voulu d terminer si le domaine F BAR de Bzz1p tait capable de lier des lipides et si oui lesquels Pour cette recherche d interactions entre Bzz1p et les lipides de la membrane plasmique nous avons 143 Acide Lysophosphatidique LPA Sphingosine 1 phosphate S1P Lysophosphocholine LPC Ptdins 3 4 P Ptdins PtdIns 3 5 P Ptdins 3 P Ptdins 4 5 P Ptdins 4 P Ptdins 3 4 5 P Ptdins 5 P Acide Phosphatidique PA Phosphatidyl thanolamine PE Phosphatidyls rine PS Phosphatidylcholine PC Blanc Figure 39 Interaction du domaine FCH de Bzz1p tiquet e en N terminal 6His V5 avec des phospholipides immobilis s sur membrane de nitrocellulose 100 pmoles par
176. it cellulaire de levure capable de fournir les l ments n cessaires la polym risation Une source de renouvellement de l nergie est ajout e L actine coupl e un fluorophore est additionn e ce qui permet de visualiser la polym risation au microscope pifluorescence Comme le test de fluorescence est variable selon la source de l actine ajout e et la mani re de r aliser les extraits prot iques une confirmation des interactions par une m thode biochimique ind pendante a t utilis e De plus une fois que les domaines SH3 en fusion avec la GST sont fix s sur les billes il est possible d incuber les billes avec les diff rents domaines en pr sence d un extrait de levure GST pulldown et ensuite d analyser les prot ines qui ont interagit avec le domaine fix par transfert sur membrane ou Western blot Nous avons utilis un extrait prot ique de levure d une souche o la seule source de Las17 tait fusionn e la GFP FY1679 ainsi il est ais de r v ler par western blot si Las17 GFP a interagi avec le domaine fix sur les billes en utilisant un anticorps primaire anti GFP La Figure 30 montre que les domaines SH3 de Lsb1p Sho1p les deux domaines de Bzz1p Fus1p Pex13p Lsb2p Bbc1p Lsb3p Myo3p Myo5p Rvs167p Abp1p et Lsb4p sont capables de lier Las17 GFP Parmi ces prot ines il ya des activateurs connus de Las17p comme Bzz1p Soulard et al 2002 mais aussi des inhibiteurs de Las17p comme Bbc
177. king a long story short J Cell Biol 166 957 962 Botstein D Chervitz S A and Cherry J M 1997 Yeast as a model organism Science 277 1259 1260 Bradford M M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding Anal Biochem 72 248 254 Bretscher A 1993 Microfilaments and membranes Curr Opin Cell Biol 5 653 660 Bui E Bayle J P Perez F Liebert L and Courtieu J 1990 Syntheses of nematogen copper complexes using halogen substituted ligands Liquid Crystals 8 513 526 Bulina M E Chudakov D M Britanova O V Yanushevich Y G Staroverov D B Chepurnykh T V Merzlyak E M Shkrob M A Lukyanov S and Lukyanov K A 2006 A genetically encoded photosensitizer Nat Biotechnol 24 95 99 C Cabib E Drgonova J and Drgon T 1998 Role of small G proteins in yeast cell polarization and wall biosynthesis Annu Rev Biochem 67 307 333 Cali B M Doyle T C Botstein D and Fink G R 1998 Multiple functions for actin during filamentous growth of Saccharomyces cerevisiae Mol Biol Cell 9 1873 1889 Cao H Weller S Orth J D Chen J Huang B Chen J L Stamnes M and McNiven M A 2005 Actin and Arf1 dependent recruitment of a cortactin dynamin complex to the Golgi regulates post Golgi transport Nat Cell Biol 7 483 492 Carlier M F 1991 Actin protein s
178. ksonen M Toret C P and Drubin D G 2005 A modular design for the clathrin and actin mediated endocytosis machinery Cell 123 305 320 Kamioka Y Fukuhara S Sawa H Nagashima K Masuda M Matsuda M and Mochizuki N 2004 A novel dynamin associating molecule formin binding protein 17 induces tubular membrane invaginations and participates in endocytosis Biol Chem 279 40091 40099 Kelly A E Kranitz H Doetsch V and Mullins R D 2006 Actin Binding to the Central Domain of WASP Scar Proteins Plays a Critical Role in the Activation of the Arp2 3 Complex J Biol Chem 281 10589 10597 Keppler A Gendreizig S Gronemeyer T Pick H Vogel H and Johnsson K 2003 A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo Nat Biotechnol 21 86 89 Keppler A Kindermann M Gendreizig S Pick H Vogel H and Johnsson K 2004a Labeling of fusion proteins of O6 alkylguanine DNA alkyltransferase with small molecules in vivo and in vitro Methods 32 437 444 Keppler A Pick H Arrivoli C Vogel H and Johnsson K 2004b Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells Proc Natl Acad Sci U S A 101 9955 9959 Kessels M M and Qualmann B 2004 The syndapin protein family linking membrane trafficking with the cytoskeleton J Cell Sci 117 3077 3086 Kolluri R Tolias K F Carpenter C L Rosen F S and K
179. l 2004 a anhydride ac tique 1 1 qu pyridine 0 1 qu dichlorom thane p 78 b 1 NHS 1 3 qu DCC 1 3 qu THF 2 Lysine NTA 5 qu Ac tonitrile tampon NaHCO 50 mM pH 9 0 47 H Formation UN NH2 A GP 2m C00GP motif NTA H GP Br N Oo GP HO O_O Door HN Protection ph nol COOGP HN N _ COOGP COOGP D protection y O O 0 a Le COOH De COOH COOGP _ COOGP2 D protection Ne N __COOGP H2N N __COOGP COOGP COOGP HO O_O COOGP Couplage r al ZA O N __COOGP OH COOGP Cage Cage O_O cl 2 O COOGP HN N __COOGP gt COOGP D protection O Cage 2 a 2 O COOH r HA NN COOH Sch ma 10 Strat gie generale de synth se de la coumarine photoactivable GP1 ou 2 groupe protecteur 1 ou 2 D veloppement d un fluorophore photoactivable Malheureusement la purification et la caract risation du produit final tant difficile je n ai pas pu confirmer l obtention du produit d sir Pour pallier ces probl mes de purification il fallait prot ger le motif triacide par des esters pour pouvoir travailler dans des solvants organiques L est rification du motif triacide sur le NTA lysine n tant pas ais vu l insolubilit du produit il a fallu imaginer une nouvelle strat gie de synth se Sch ma 10 Nous sommes alors partis de la lysine un acide amin comportant une amine primaire en position de sa chaine lat rale
180. l 2001 Global analysis of protein activities using proteome chips Science 293 2101 2105 Zimmer M 2002 Green fluorescent protein GFP applications structure and related photophysical behavior Chem Rev 102 759 781 Zipfel W R Williams R M and Webb W W 2003 Nonlinear magic multiphoton microscopy in the biosciences Nat Biotechnol 21 1369 1377 Zlotnik H Fernandez M P Bowers B and Cabib E 1984 Saccharomyces cerevisiae mannoproteins form an external cell wall layer that determines wall porosity J Bacteriol 159 1018 1026 190 Annexes Signalement bibliographique ajout par SI CD Strasbourg D partement de la Documentation lectronique Service des th ses lectroniques The WASP Las17p interacting protein Bzz1p functions with Myo5p in an early stage of endocytosis A SOULARD S FRIANT C FITTERER C ORANGE G KANEVA G MIREY et B WINSOR Protoplasma 2005 Vol 226 Pages 89 101 Pages 243 255 La publication pr sent e ici dans la these est soumise des droits d tenus par un diteur commercial Pour les utilisateurs ULP il est possible de consulter cette publication sur le site de l diteur http www springerlink com content 3262146n2gk7n413 fulltext pdf DOI 10 1007 s00709 005 0108 4 La version imprim e de cette th se peut tre consult e la biblioth que ou dans un autre tablissement via une demande de pr t entre biblioth ques PEB aupr s
181. l 2003 des azides Chin et al 2002 o des alcynes Deiters et al 2003 ont t incorpor s permettant la d rivatisation en utilisant la formation d hydrazone des ligations de Staudinger Saxon et Bertozzi 2000 ou des r actions de cycloaddition d azide alcyne Agard et al 2004 Wang et al 2003 R cemment des acides amin s non naturels portant des fluorophores tels qu un d riv du Dansyl Summerer et al 2006 et de la coumarine Wang et al 2006 ont t incorpor s Le principal avantage du marquage avec des acides amin s non naturels sont une sp cificit excellente une versatilit de la sonde chimique et une perturbation structurale minimale de la prot ine d int r t Cependant la mutag n se d acides amin s non naturels n est pas applicable tous les types cellulaires la plupart des exp riences ont t faites dans des bact ries et des levures R cemment des exp riences ont t faites des cellules de mammif res Hino et al 2006 Un autre probl me est que les ribosomes supportent mal des acides amin s tr s polaires ou plus gros que le tryptophane ce qui limite donc la structure des sondes introduire De plus de nombreuses prot ines tronqu es sont g n r es lors de telles exp riences ce qui peut conduire des artefacts 39 D veloppement d un fluorophore photoactivable M thodes A Taille Specificite Restrictions Autres commentaires etiquette Sonde utilisant une s quence
182. l int r t de conna tre ses partenaires cellulaires De plus dans certaines prot ines de la famille des domaines de liaisons aux petites GTPases HR1 sont pr sents ces domaines interagissent avec les GTPases de type Rho telles que Cdc42 TC10 et Rnd2 Aspenstrom 1997 Chang et al 2002 Fujita et al 2002 Figure 29 Les prot ines de la famille PCH interagissent avec de nombreuses autres prot ines incluant des r cepteurs des adaptateurs des enzymes et des prot ines de structure pour r guler leur distribution cellulaire leur organisation et leur activit pour revue Aspenstrom et al 2006 Chitu et Stanley 2007 Lippincott et Li 2000 A travers ces interactions les prot ines PCH r gulent la morphologie cellulaire et la motilit l int grit des organites le trafic des prot ines et l organisation du cytosquelette d actine L importance des prot ines PCH a aussi t d montr par la d couverte de mutations dans les genes codant pour certains membres de cette famille tels que dans des syndromes neurod g n ratifs dans le cancer et dans la maladie auto inflammatoire pyogenic sterile arthritis pyoderma gangrenosum and acne PAPA Endris et al 2002 McDermott 2004 Megonigal et al 2000 Wise et al 2002 113 Recherche de partenaires de Bzz1p b Les prot ines PCH dans la dynamique membranaire De nombreux travaux impliquent les prot ines PCH dans l endocytose Kessels et Qualmann 2004 Le l
183. le de ma vie m ont permis de rester optimiste Merci pour tout Je remercie finalement le programme ACI Dynamique et R activit des assemblages biologiques du Minist re de la Recherche la Ligue contre le Cancer l Universit Louis Pasteur et le CNRS qui ont financ ces travaux Table des mati res LISTE DES ILLUSTRATIONS 7 ABREVIATIONS 10 LISTE DES PROTEINES DE LEVURE ET DE LEURS FONCTIONS MENTIONNEES AU COURS DE CE TRAVAIL 12 AVANT PROPOS 14 PARTIE 1 DEVELOPPEMENT D UN FLUOROPHORE PHOTOACTIVABLE 16 CHAPITRE 1 FLUOROPHORES PHOTOACTIVABLES ET ETIQUETTES CHIMIQUES DE PROTEINES 17 l PRINCIPE DE LA FLUORESCENCE 17 Il EXCITATION A DEUX PHOTONS 19 Ill FLUOROPHORES PHOTOACTIVABLES 21 A Crit res d un fluorophore photoactivable efficace 22 B Strat gie g n rale 24 IV GROUPEMENTS PHOTOLABILES 26 A Groupements o nitrobenzyles 26 B Groupements o nitroph n thyles 27 V MARQUAGE SPECIFIQUE DE PROTEINES 29 A Marqueurs prot iques 29 1 Prot ines fluorescentes 29 2 Prot ines fluorescentes photoactivables 31 B Marqueurs chimiques 33 1 Petites sondes utilisant le ciblage d une s quence prot ique 33 2 Petites sondes utilisant le ciblage d une s quence peptidique 37 3 Incorporation d acides amin s non naturels 39 VI OBJECTIFS 42 CHAPITRE 2 RESULTATS ET DISCUSSION 43 l STRATEGIE REASH EDT CAGE 43 A Principe 43 B Synth ses 44 Il STRATEGIE COUMARINE NTA CAGEE 46 A Principe 46 B Synth ses 47 1
184. lista M Boone C Greene L A and Pon L A 1998 The Src homology domain 3 SH3 of a yeast type myosin Myo5p binds to verprolin and is required for targeting to sites of actin polarization J Cell Biol 141 1357 1370 Aspenstrom P 1997 A Cdc42 target protein with homology to the non kinase domain of FER has a potential role in regulating the actin cytoskeleton Curr Biol 7 479 487 Aspenstrom P Fransson A and Richnau N 2006 Pombe Cdc15 homology proteins regulators of membrane dynamics and the actin cytoskeleton Trends Biochem Sci 31 670 679 Ayscough K R 1998 In vivo functions of actin binding proteins Curr Opin Cell Biol 10 102 111 Ayscough K R Eby J J Lila T Dewar H Kozminski K G and Drubin D G 1999 Slatp is a functionally modular component of the yeast cortical actin cytoskeleton required for correct localization of both Rho1p GTPase and Sla2p a protein with talin homology Mol Biol Cell 10 1061 1075 Ayscough K R Stryker J Pokala N Sanders M Crews P and Drubin D G 1997 High rates of actin filament turnover in budding yeast and roles for actin in establishment and maintenance of cell polarity revealed using the actin inhibitor latrunculin A J Cell Biol 137 399 416 Badour K Zhang J and Siminovitch K A 2003 The Wiskott Aldrich syndrome protein forging the link between actin and cell activation Immunol Rev 192 98 112 Balasubramanian
185. ll es avec de l agarose 1 6 et observ es au microscope a fluorescences avec le filtre FITC Dans les cellules sauvages la fluorescence s accumule dans les vacuoles visible en optique DIC 167 Recherche de partenaires de Bzz1p Tampon Phosphate de Potassium 50 mM de tampon phosphate de potassium pH 7 5 10 mM NaF 10 mM NaN 3 Calcofluor White Ce colorant Fluorescent Brightener 28 Sigma se lie sp cifiquement a la chitine qui est un composant de la paroi cellulaire chez S cerevisiae Il est utilis pour visualiser les anneaux de chitine laiss s sur la paroi cellulaire de la cellule m re apr s s paration du bourgeon Les cellules fix es sont resuspendues dans 100 uL de PBS contenant 200 pg mL de Calcofluor White et incub es 5 min l abri de la lumi re Apr s 5 lavages dans du PBS elles sont mont es entre lame et lamelle et observ es au microscope fluorescence avec le filtre DAPI C Microscopie acquisition et traitement des images L observation des cellules se fait avec un microscope pifluorescence Zeiss AxioVert 200 quip des objectifs Zeiss ApoFluo Neofluar X20 et a Plan Fluar x100 Diff rents filtres on t utilis s en fonction du fluorophore observ Les prises de vues sont r alis es avec une cam ra Hammamatsu CoolSnap HSQ2 pilot par le logiciel du microscope Le traitement des images a t fait l aide du logiciel Image J Abramoff et al 2004 Marqu
186. mais les 35 Figure 7 Marquage d une prot ine avec une sonde chimique en utilisant une tiquette peptidique La prot ine d int r t est exprim e fusionn e une tiquette peptidique His motif t tracyst ine bleue qui est capable de se lier une petite mol cule fluorophore Ni NTA HisZiFiT ou compos biarsenic fluorog nique losange rouge Adapt e de Chen et Ting 2005 D veloppement d un fluorophore photoactivable pr curseurs des fusions int ine et ubiquitine sont encore gros m me s ils sont temporaires De plus les taux de l pissage ou de la ligation thioester sont lents restreignant la m thodologie l tude de processus biologiques s effectuant sur plusieurs heures Enfin les cyst ines intracellulaires et les cyst amines sont en comp tition avec la prot ine cible pour la r action avec le thioester r duisant l efficacit du marquage et n cessitant de nombreux lavages pour r duire le bruit de fond 2 Petites sondes utilisant le ciblage d une s quence peptidique La fusion de s quence peptidique une prot ine d int r t pr sente une option beaucoup moins invasive que la fusion d une s quence prot ique Comme avec les prot ines de petites mol cules peuvent cibler les peptides pour interagir avec une liaison de forte affinit Figure 7 Par exemple l quipe de Nolan a d montr qu un peptide de 38 acides amin s peut lier le fluorophore Texas Red avec
187. mall molecules in live cells Curr Opin Biotechnol 16 35 40 Chin J W Santoro S W Martin A B King D S Wang L and Schultz P G 2002 Addition of p azido L phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli J Am Chem Soc 124 9026 9027 Chitu V and Stanley E R 2007 Pombe Cdc15 homology PCH proteins coordinators of membrane cytoskeletal interactions Trends Cell Biol 17 145 156 Chowdhury S Smith K W and Gustin M C 1992 Osmotic stress and the yeast cytoskeleton phenotype specific suppression of an actin mutation J Cell Biol 118 561 571 Chudakov D M Lukyanov S and Lukyanov K A 2005 Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging Trends Biotechnol 23 605 613 Chvatchko Y Howald l and Riezman H 1986 Two yeast mutants defective in endocytosis are defective in pheromone response Cell 46 355 364 Clackson T Yang W Rozamus L W Hatada M Amara J F Rollins C T Stevenson L F Magari S R Wood S A Courage N L et al 1998 Redesigning an FKBP ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity Proc Natl Acad Sci U SA 95 10437 10442 Cody C W Prasher D C Westler W M Prendergast F G and Ward W W 1993 Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green fluorescent protein Biochem 32 1212 1218 Collins S R Kemmeren P Zhao X C Greenblatt J F Spencer F Holst
188. mbiante La solution est alors chauff e pendant 2 h a 50 C et 71 mL d acide hydrochlorique HCl 1 M sont ajout s goutte goutte Le m lange est ensuite refroidi temp rature ambiante pour permettre l acide N benzyloxycarbonyl nitrilotriac tique Z NTA de pr cipiter Le Z NTA est collect par filtration et ensuite purifi en le dissolvant avec 1 M de NaOH et le repr cipitant avec la m me quantit de HCl 1 Met en filtrant Le cycle dissolution repr cipitation est r p t deux fois 6 4 g d un solide blanc sont r cup r s p 50 COOH g o N E tN _cooH a ee ed a COOH RMN H DMSO D 5 1 37 m 4H Hc et Hd 1 58 m 1H He 2 96 m 2H Hb 3 32 t 1H Hf 3 46 s 4H Hg et Hh 5 00 s 2H Ha 7 34 m 5H Haromatiques I Trim thylsilyl thoxy m thyl No Na bis 2 trim thyl silyl thoxy m thoxy carbonyl carboxybenzyl L lysine 9 Dans un ballon anhydre le compos 6 3 4 g 8 58 mmol est dissous dans 40 mL de DMF anhydre et refroidit a 0 C Puis sous argon et agitation du chlorure de trim thylsilyl thoxy m thyle 6 1 mL 34 34 mmol 4 qu et de la DIEA 6 mL 34 34 mmol 4 qu sont ajout s Apres 1 h a 0 C la reaction est laiss e 1 h temp rature ambiante Le brut est vapor sec puis redissous avec de l hydrog nocarbonate de sodium satur e et la 71 D veloppement d un fluorophore photoactivable phase aqueuse est extraite
189. mbreux ligands qui peuvent contribuer a sa transinhibtion et a la lev e de celle ci Goode et Rodal 2001 Vrp1p homologue de WIP Evangelista et al 2000 Lechler et al 2000 Madania et al 1999 Vaduva et al 1997 et Rvs167p Lsb1p Lsb2p Pin3p Lsb3p Ysc84p Lsb4p et Bzz1p Madania et al 1999 Tong et al 2002 Bzz1p recrute Las17p et la machinerie n cessaire la polym risation de l actine Soulard et al 2002 R cemment il a t montr que Bzzip est capable d activer Las17p via ses domaines SH3 en levant l inhibition due Slaip via ses domaines SH3 Sun et al 2006 Cependant il reste d terminer comment ces diff rents facteurs contr lent temporellement l activit de Las17p aux diff rentes tapes de la formation des taches corticales d actine et ailleurs dans d autres tapes du trafic intracellulaire Panip est recrut aux taches corticales pr coces avec Las17p avant l arriv e du complexe Arp2 3 et la d tection d actine filamenteuse Il serait recrut par ses interactions avec End3p Slaip et ou les adaptateurs de la clathrine Tang et al 1997 Tang et al 2000 Wendland et Emr 1998 Myo3p et Myo5p sont des myosines redondantes de type I Ces prot ines contiennent un domaine N terminal moteur un domaine TH1 Tail homology de liaison aux lipides un domaine de liaison l actine F un domaine SH3 et un motif A de liaison au complexe Arp2 3 Figure 23 Leur activit NPF n cessi
190. me 4 C pendant 15 min elle est incub e avec du tampon de blocage PBS T 1 h avec une l g re agitation 50 g Ensuite la prot ine contr le calmoduline kinase Cmk1p tiquet e V5 en N terminal 5 pg mL ou la prot ine tiquet e V5 dilu e dans du tampon d hybridation 50 pg mL est ajout e sur la membrane de nitrocellulose la lame est incub e 90 min Apr s 3 lavages de 10 minutes avec du tampon d hybridation et une l g re agitation la lame est incub e 30 min avec l anticorps Anti V5 Alexa Fluor 647 160 g mL sous une l g re agitation Apr s 3 lavages de 10 minutes avec du tampon d hybridation et une l g re agitation la lame est centrifug e 800 g 5 min T ambiante et s ch e l obscurit 30 60 min T ambiante La fluorescence des points d hybridation est lue a 635 nm grace a un scanner GenePix Personal 4100A et analys e par le logiciel GenePix Pro 6 0 Puis les donn es sont trait es grace au logiciel Prospector Analyser Invitrogen Tampon de blocage PBST PBS 1X BSA1 Tween 20 0 1 Tampon d hybridation PBS 1X MgCl 5 mM DTT 0 5 mM Triton X 100 0 05 Glyc rol 5 BSA 1 l PIP Strip Membrane Le PIP Strip est une membrane de nitrocellulose sur laquelle diff rents lipides ont t d pos s Apr s blocage des sites de fixation non sp cifiques 1 h dans du tampon de blocage la membrane PIP Strip P 6001 Echelon Biosciences est incub e 1 h T ambiante ou une nu
191. mp Schuell BA 83 0 22 pm Le transfert liquide s effectue pendant 1 h 4 C une intensit de 85 V avec le syst me BioRad Le transfert des prot ines sur la membrane peut tre v rifi par une coloration r versible au rouge Ponceau Apr s blocage des sites de fixation non sp cifiques 1 h a T ambiante dans du tampon de blocage la membrane est incub e 1 h T ambiante ou une nuit 4 C avec l anticorps primaire dilu dans du tampon de blocage Apr s 3 lavages dans du tampon de blocage elle est incub e 1 h avec l anticorps secondaire dilu dans du TBS T Ce deuxi me anticorps est coupl la peroxydase HRP Horseradish Peroxidase La membrane est alors lav e avec du TBS T et la r v lation des bandes prot iques se fait en utilisant le kit de d tection ECL Enhanced Chemiluminescence Amersham Pharmacia bas sur l mission de lumi re apr s oxydation du luminol par la peroxydase et en exposant ensuite un film autoradiographique Tampon de transfert Tris HCl 25 mM glycine 190 mM SDS 0 1 thanol 20 pH8 3 TBS T Tris HCl 50 mM pH8 NaCl 150 mM Tween 20 0 1 Tampon de blocage TBS T lait cr m en poudre 5 165 Recherche de partenaires de Bzz1p H Protoarray Invitrogen C est une lame de verre surmont e par une membrane de nitrocellulose o ont t d pos es en duplicate 4088 prot ines de S cerevisiae Apres avoir quilibr la temp rature de la la
192. mplexe Arp2 3 Cette figure provenant du travail de Svitkina et Borisy 1999 est l image de couverture de l dition du 31 mai 1999 du Journal of Cell Biology V145 n 5 Recherche de partenaires de Bzz1p Les prot ines Arp2 et Arp3 plac es c te a c te miment l extr mit d un dim re d actine Un monom re d actine pourrait alors venir s associer cette pseudo extr mit dans le complexe Arp2 3 Ce complexe trimol culaire Arp2 Arp3 actine serait quivalent un trim re d actine et servirait de noyau l longation de la polym risation de l actine Ce processus permettrait d outrepasser l tape cin tiquement non favorable de dim risation de l actine pour revues May 2001 Winder 2003 Le complexe resterait donc attach l extr mit qui devient coiff e et l extr mit peut cro tre Lorsqu il est activ le complexe Arp2 3 permet l assemblage de l actine a l extr mit du filament Les tudes men es chez Saccharomyces cerevisiae ont montr que Arp2 3 tait n cessaire la mobilit et l int grit des taches corticales d actine Winter et al 1997 ainsi qu l endocytose Moreau et al 1996 et qu il est aussi capable d interagir avec Las17p l homologue de WASP chez la levure cf section 1 C 2 Madania et al 1999 L importance de ce complexe a aussi t mise en vidence par Welch et al 1997 qui ont montr qu il tait su
193. multiphotonique permet de concentrer le flux de photons incident temporellement et spatialement par exemple dans un volume aussi petit que des structures intracellulaires ou qu une seule synapse d un neurone En 1931 Maria G ppert Mayer a pr dit qu un atome peut tre excit apr s l absorption simultan e de deux quanta de lumi re dont la somme des fr quences est gale la fr quence requise pour l excitation de l atome G ppert Mayer 1931 G ppert 1929 L invention du laser a permis a Kaiser et Garrett de d montrer que l excitation en bi photon induit la fluorescence de CaF Eu en 1961 Kaiser et Garrett 1961 Denk a d montr le relargage d un effecteur biologique par excitation bi photonique dans des cellules en culture en utilisant une version cag e d un neurotransmetteur Denk et al 1990 D excellentes revues ont t publi es sur l utilisation de l excitation multiphoton en microscopie biologique Denk et al 1995 Denk 19 Figure 2 Localisation de l excitation par excitation mono et bi photonique a Excitation mono photonique d une solution de fluoresc ine excit e par une lumi re focalis e 0 16 NA de 488 nm b Excitation bi photonique en utilisant une lumi re focalis e 0 16 NA et puls e en femtosecondes de 960 nm Adapt e de Zipfel et al 2003 D veloppement d un fluorophore photoactivable et Svoboda 1997 Helmchen et Denk 2005 Helmchen et Denk 2002 Konig 2000
194. n observ e dans de multiples cancers est importante dans la transformation d une cellule canc reuse sa motilit et sa capacit d invasion Des travaux au laboratoire ont permis d isoler des prot ines importantes pour la formation des filaments d actine Ces r sultats montrent que certains modules prot iques appel s domaines SH3 Src Homology 3 interagissent directement avec ces effecteurs de la polym risation et participent au remodelage de l actine Nous souhaitons tudier la dynamique de ces prot ines au sein de la cellule afin de mieux appr hender leurs r les Bzz1p est une des ces prot ines chez la levure et son homologue humain serait un lien entre la membrane cellulaire et le cytosquelette d actine Lors de ma th se je souhaitais d terminer si Bzz1p interagit directement sur la polym risation et ou sert de prot ine adaptatrice entre la machinerie de polym risation et la membrane cellulaire Une meilleure compr hension des fonctions et interactions d une prot ine dans son environnement naturel c est dire dans la cellule n cessite de conna tre sa localisation et sa dynamique au sein de cette cellule Pour cela on utilise le plus souvent des techniques de microscopie fluorescence A ce jour de nombreuses m thodes biologiques ou chimiques ont t d velopp es Chacune pr sente des avantages et des inconv nients mais pour le moment aucune n est id ale Au cours de mes ann es de these j ai cherc
195. n assembly and endocytosis from yeast to mammals Annu Rev Cell Dev Biol 19 287 332 Evangelista M Blundell K Longtine M S Chow C J Adames N Pringle J R Peter M and Boone C 1997 Bni1p a yeast formin linking Cdc42p and the actin cytoskeleton during polarized morphogenesis Science 276 118 122 Evangelista M Klebl B M Tong A H Webb B A Leeuw T Leberer E Whiteway M Thomas D Y and Boone C 2000 A role for myosin I in actin assembly through interactions with Vrp1p Bee1p and the Arp2 3 complex J Cell Biol 148 353 362 Faix J and Grosse R 2006 Staying in shape with formins Dev Cell 10 693 706 Falet H Hoffmeister K M Neujahr R Italiano J E Jr Stossel T P Southwick F S and Hartwig J H 2002 Importance of free actin filament barbed ends for Arp2 3 complex function in platelets and fibroblasts Proc Natl Acad Sci USA 99 16782 16787 Fankhauser C Reymond A Cerutti L Utzig S Hofmann K and Simanis V 1995 The S pombe cdc15 gene is a key element in the reorganization of F actin at mitosis Cell 82 435 444 Fujita H Katoh H Ishikawa Y Mori K and Negishi M 2002 Rapostlin is a novel effector of Rnd2 GTPase inducing neurite branching J Biol Chem 277 45428 45434 Fukuoka M Suetsugu S Miki H Fukami K Endo T and Takenawa T 2001 A novel neural Wiskott Aldrich syndrome protein N WASP binding protein WI
196. n plus grande des tissus Il y a aussi un photo blanchiment g n ral et photo toxicit plus faible Par contre au point focal le photo blanchiment est plus rapide Un important flux de photons est n cessaire d o une balance d licate entre puissance et blanchiment La photoactivation des compos s photoactivables se fait g n ralement sous l action d une lumi re ultra violette UV de haute nergie qui peut causer des dommages sur les chantillons cellulaires et g n rer de l autofluorescence De plus la lumi re UV manque de s lectivit spatiale en trois dimensions lors de l excitation c est pour ces raisons qu il est important de d velopper des sondes photoactivables par une lumi re multiphotonique Maintenant la notion de fluorophore photoactivable va tre pr cis e et les exemples pr sents dans la litt rature seront d taill s lll Fluorophores photoactivables Le concept de pr curseur photoactivable de biomol cules est apparu a la fin des ann es 70 Engels et Schlaeger 1977 Les pr curseurs photoactivables de biomol cules sont appel s ligands cag s par les biologistes Ils permettent de transformer un compos biologiquement inerte en compos actif de fa on tr s rapide et efficace de 21 D veloppement d un fluorophore photoactivable quelques nanosecondes quelques millisecondes sous l action de la lumi re assurant un contr le spatio temporel de la lib ration de la biomol
197. naires de Bzz1p Vactine Kubler et Riezman 1993 les composants du complexe Arp2 3 Moreau et al 1997 Moreau et al 1996 Slalp Ayscough et al 1999 et Sla2p Yang et al 1999 la verproline Vrp1p Munn et al 1995 Myo5p une des myosines de type Geli et Riezman 1996 Las17p Li 1997 Madania et al 1999 et Bzz1p Soulard et al 2005 Sun et al 2006 les plus proches de notre int r t actuel Comme les diff rents candidats issus du Protoarray sont des partenaires potentiels de Bzz1p ils pourraient tre eux aussi impliqu s dans l endocytose Nous avons alors analys l endocytose en phase fluide dans les diff rentes souches mutantes en suivant l internalisation du Lucifer Yellow LY cf Mat et M th La figure 37 montre que ces diff rentes d l tions ne bloquent pas l internalisation de ce colorant 30 C Le LY s accumule autant dans la vacuole des cellules mutantes que dans les cellules sauvages 3 Localisation de Bzz1p GFP Pour d terminer si l interaction potentielle de Bzz1p avec ces nouvelles prot ines affectent la localisation cellulaire de Bzz1 GFP dans les souches l t es pour le gene YCRO76C et pour celui de AIP1 Figure 38 Le plasmide portant la construction Bzz1 GFP construit par Alexandre Soulard a t transform dans les souches d l t es et la souche sauvage Ces diff rentes d l tions n alt rent pas la localisation de Bzz1 GFP par rapport sa lo
198. ncore 10 min sur la glace A cette tape les bact ries peuvent tre aliquot es et stock es a 80 C A 50 ul de bact ries chimio comp tentes est ajout l ADN transformer lt 100 ng et les cellules sont incub es sur la glace pendant 20 min Puis elles subissent un choc thermique 42 C pendant 45 s puis sont imm diatement remises dans la glace pendant 2 5 min 450 uL de milieu SOB sont ajout s et la suspension est tal e sur un milieu solide de s lection Les bo tes de P tri sont incub es une nuit 37 C Milieu SOB Bacto tryptone 2 m v Yeast extract 0 5 m v NaCl 10 mM KCl 2 5 mM MgCl 10 mM MgSO 10 mM Milieu TB Pipes 10 M pH 7 MnCl 55 mM CaCl 15 mM KCl 250 mM Si n cessaire ajuster le pH 6 7 avec 5 M de soude avant d ajouter le chlorure de mangan se b Electroporation Les bact ries cultiv es 37 C dans du milieu LB jusqu une absorbance comprise entre 0 5 et 1 sont refroidies 20 min dans la glace Apres 5 min de centrifugation 2 000 g 4 C le culot est repris dans le m me volume d eau froide Les cellules sont nouveau centrifug es et lav es dans 1 2 volume d eau froide puis reprises dans 1 25 volume de elyc rol 10 froid Une derni re centrifugation est faite pour reprendre les cellules dans 155 Recherche de partenaires de Bzz1p 1 200 volume de glyc rol 10 froid A cette tape les bact ries peuvent tre aliquot es et stock es 80 C La
199. ndement quantique de photolyse a t d termin sur un glutamate cag et non directement sur la coumarine cag e Ce rendement quantique de photolyse devra tre d termin par actinom trie au ferrioxalate de potassium Hatchard et Parker 1956 et il pourrait m me tre meilleur que dans le cas du glutamate cag en effet la coumarine agit comme une antenne pour une photolyse assist e par le substrat ce qui augmente le rendement quantique de photolyse en comparaison un substrat classique Zhao et al 2004 De plus une sonde de type fluor nyle est en cours de d veloppement avec une quipe avec qui nous collaborons J F Nicoud Strasbourg et qui pr sente des propri t s biphotoniques exceptionnelles Une fois un fluorophore type r sorufine cag avec ce nouveau groupement photolabile ce nouveau fluorophore photoactivable pourrait avoir des propri t s tr s int ressantes Tous ces crit res se sont r v l s bons voire excellents et nous permettent de pr sager de r sultats int ressants pour les tests cellulaires une fois que la fixation du compos 22 Ni sur des prot ines ayant une s quence polyhistidine aura t confirm e Il faudra aussi confirmer la non toxicit de la mol cule sur des temps plus longs 6 h 24 h et v rifier que les mises au point pour les cellules HeLa sont g n ralisables d autres types cellulaires Une fois que nous aurons effectu tous les contr
200. ns chimiques pr sentes sur la biomol cule cager Divers substituants ont t introduits en position benzylique et sur le noyau benzylique afin d ameliorer les propri t s photochimiques de ce groupement rendement quantique cin tique et ou coefficient d extinction molaire la longueur d onde d irradiation Le Tableau 1 r sume ces modifications pour revue Goeldner 2005 L introduction d un groupement m thyle en position benzylique a permis d am liorer les cinetiques de 3 ordres de grandeur des millisecondes aux microsecondes De plus l introduction d un groupement carboxylate en position benzylique a permis d augmenter le rendement quantique de la r action de photofragmentation Milburn et al 1989 L ajout d un groupement carboxylate en position benzylique ou sur le cycle aromatique a aussi l avantage d augmenter la solubilit des compos s dans des milieux tamponn e au pH physiologique Enfin des groupements m thoxy ont galement t introduits sur le noyau aromatique de l o nitrobenzyle afin de d placer la longueur d onde d absorption de ces d riv s de 260 nm vers 340 nm ce qui permet de moins d grader les systemes biologiques lors de la photolyse Mais dans ce cas les modifications peuvent entra ner une diminution des rendements quantiques et ou des cin tiques suivant la nature de la fonction qui a t masqu e L introduction en position benzylique d un groupement trifluorom thyl
201. ns des diff rents candidats dans diff rentes conditions de croissance Figure 35 Effets des diff rentes d l tions sur le profil de bourgeonnement dans des souches haploides Figure 36 Effets des d l tions des diff rents candidats sur l organisation du cytosquelette d actine et sur sa repolarisation apr s un stress salin NaCl 1M Figure 37 Analyse de l endocytose en phase fluide par l internalisation du Lucifer Yellow 25 C dans les cellules sauvages BY4742 et mut es pour bzzlAet pour les diff rents candidats Figure 38 Localisation de Bzz1 GFP dans diff rentes souches mutantes et sauvage Tableau 11 Analyse des effets ph notypiques des diff rents candidats diff rentes temp ratures sous l effet d un stress salin Tableau 12 Prot ines interagissant avec les domaines SH3 de Bzz1p Figure 39 Interaction du domaine FCH de Bzzip tiquet e en N terminal 6xHis V5 avec des phospholipides immobilis s sur membrane de nitrocellulose 100 pmoles par point Figure 40 M tabolisme des phosphoinositides Figure 41 Localisation de Bzz1 GFP dans des souches d fectueuses dans le m tabolisme de certains phosphoinositides Tableau13 Filtres utilis s pour observer les cellules en fonction des fluorophores Tableau 14 Oligonucl otides utilis s au cours de ce travail 123 123 124 126 127 128 131 133 135 137 139 141 142 144 145 146 171 172 3 GFP Ab
202. nt d un fluorophore photoactivable 2 Toxicit cellulaire Le compos 22 Ni est donc capable de rentrer dans les cellules il faut maintenant tablir si cette mol cule est cytotoxique Nous avons fait un test par microscopie les cellules charg es ou non avec le compos 22 Ni ont subi de nombreuses irradiations sur un temps court 10 min 200 irradiations 405 nm ou plus long 1 h 370 irradiations 405 nm et nous avons pu observer qu elles r sistent bien ces nombreux flashs en effet aucune diff rence notable de fluorescence n est visible avant et apr s irradiation figure 14 Donc le compos dans des conditions optimales pour faire de l imagerie ne semble pas toxique pour les cellules sur des temps largement suffisants pour observer le mouvement du cytosquelette d actine 62 Chapitre 3 Perspectives D veloppement d un fluorophore photoactivable Chapitre 3 Perspectives Ce projet de th se tait de r aliser le d veloppement d un nouveau fluorophore photoactivable capable de se lier de fa on sp cifique toute prot ine d int r t dans le cas de ce projet les prot ines r gulant le cytosquelette d actine Afin d atteindre ce but plusieurs strat gies de synthese ont t envisag es Une premiere strat gie bas e sur le fluorophore ReAsH capable de lier des prot ines tiquet es avec un motif CCPGCC Adams et al 2002 a t tent e sans succes En effet la synthese et la caract
203. nt sur le m me gel Gel de s paration 5 15 Acrylamide bisacrylamide 30 0 8 5 15 Tris HCl 375 mM pH 8 8 SDS 0 1 persulfate d ammonium 0 1 TEMED 0 1 Gel de concentration 4 Acrylamide bisacrylamide 30 0 8 4 Tris HCl 125 mM pH 6 8 SDS 0 1 persulfate d ammonium 0 1 TEMED 0 1 164 Recherche de partenaires de Bzz1p Tampon de charge 1X Tris HCl 62 5 mM pH 6 8 SDS 2 glyc rol 10 B mercaptoethanol 2 bleu de bromoph nol 0 1 Tampon de migration Tris HCl 20 mM Glycine 192 mM SDS 1 g L F Coloration des prot ines dans un gel de polyacrylamide SDS Apr s migration sur gel SDS PAGE les prot ines peuvent tre r v l es par une coloration au bleu de Coomassie Apr s d moulage le gel est incub temp rature ambiante sous agitation pendant 5 min dans une solution de fixation puis 1 h dans une solution de coloration Il est alors baign dans une solution de d coloration jusqu a ce que les bandes soient bien visibles La limite de d tection de cette m thode de coloration est d environ 0 4 ug de prot ines Solution de fixation Ethanol 50 acide ac tique 10 Solution de coloration Ethanol 45 acide ac tique 10 Coomassie Blue R250 0 25 Solution de d coloration Ethanol 45 acide ac tique 0 7 G Western blotting Les prot ines s par es sur gel SDS PAGE sont ensuite transf r es sur une membrane de nitrocellulose renforc e Schleicher a
204. o nitrophenethyle Sch ma 3 Le 3 4 5 dim thoxy 2 nitroph nyl 2 butyle DMNPB Sch ma 4 Autres groupements photolabiles utilis s Figure 3 Structure de la GFP Tableau 2 Grande vari t spectrale des prot ines fluorescentes disponibles commercialement Figure 4 Propri t s chimiques et spectrales de PAFPs Figure 5 Marquage d une prot ine avec une sonde chimique en utilisant une tiquette prot ique Figure 6 Marquage d une prot ine avec une sonde chimique en utilisant une tiquette prot ique excisable Figure 7 Marquage d une prot ine avec une sonde chimique en utilisant une tiquette peptidique Figure 8 Marquage d une prot ine avec une sonde chimique en utilisant une enzyme pour cr er une liaison covalente avec tiquette peptidique Figure 9 Marquage d une prot ine avec une sonde chimique en utilisant l incorporation d un acide amin non naturel Tableau 3 Diff rentes m thodes pour tiqueter des prot ines avec de petites sondes chimiques Figure 10 Utilisation d un fluorophore photoactivable pour suivre la dynamique de prot ines intracellulaires Sch ma 5 Synth se de la cage DMNPT Sch ma 6 Synth se du ReAsH cag d crite par Adams et al 2002 Sch ma 7 Strat gie de d veloppement de la sonde Sch ma 8 Synth se du compos 7 Sch ma 9 Tentative de synth se de la coumarine NTA adapt e de Guignet et al 2004 Sch ma 10 Strat gie g n rale de synth
205. o80p YBL055C 3 40 3 5 exodeoxyribonucl ase Cytoplasme YKL211C TRP3 anthranilate synthase Cytoplasme Pex30p YBR175W 3 05 SWD3 Histone lysine N m thyltransf rase Noyau d14 st rol r ductase Tableau 8 Partenaires potentiels de Bzz1p tiquet e en C terminal obtenus avec le Protoarray Seules les interactions des prot ines choisies sont not es YNLOO9W IDP3 Isocitrate d hydrog nase NADP Re Mi Nom Z Score Z Score Bzz1 Bzz1 Fonction Localisation Interaction Sonde Cter Nter YNRO33W 13 22 ABz1 2mino 4 d oxychorismate Cytoplasme synthase YGR200C ELP2 RNA polymerase II Elongator Cytoplasme subunit noyau YMRO99C powers de ve _ Glucose 6 phosphate 1 pi Cytoplasme m rase noyau YNL117W HET MLS1 Malate synthase Cytoplasme Peroxysome Peroxysome YOLOS6W we Cytoplasme YDR516C 14 04 EM2 a m iose Induction m iose pr coce Cytoplasme YMR304W usp15 Protease pee de Vubi Cytoptasme YMR205C PFK2 6 phospho fructokinase Cytoplasme cea 11 70 A ae synthase Cytoplasme YLLO26W Das Pe Da HSP104 ATPase liaison u a ma M tabolisme m thionine m thionine Cytoplasme YGR292W MAL12 Alpha glucosidase Alpha glucosidase YBR299W 11 03 6 28 MAL32 Alpha glucosidase Tableau 9 Partenaires potentiels obtenus sur deux lames du Protoarray avec Bzz1p tiquet e en N et en C terminal Seules les interactions des prot ines
206. oactivables tait particuli rement fourni En effet nous voulions d velopper et synth tiser des fluorophores cag s originaux De plus la photochimie associ e a ces cages devait tre rapide et efficace des longueurs d ondes appropri es proche UV visible La photolyse devait tre efficace en bi photons afin de pouvoir choisir plus pr cis ment quelle zone de la cellule serait illumin e Et bien sur ces sondes devaient p n trer efficacement dans les cellules tre non toxiques pour la cellule et finalement devraient tre reconnues sp cifiquement par une prot ine cellulaire Une fois satisfait les diff rents crit res requis ces mol cules devraient effectivement permettre de suivre en temps r el et de mani re contr l e la dynamique d une prot ine dans une cellule par microscopie en temps r el I Strategie ReAsH EDT cag A Principe Au d but de ce travail la strat gie adopt e tait la suivante un groupement photolabile nouvellement con u au laboratoire Le 1 4 5 dim thoxy 2 nitroph nyl 2 2 2 trifluoro thyle DMNPT Specht et Goeldner 2004 li a un nouveau fluorophore le ReAsH EDT pour Resorufin Arsenical Helix binder bis EDT adduct Adams et al 2002 Ce dernier est en fait un d riv de la r sorufine un analogue ph noxazine de la fluoresc ine modifi par l addition de deux atomes d arsenic et d thanedithiol EDT ce motif est alors capable de se lier a un
207. olym risation de l actine La premi re tape tait de d velopper un fluorophore photoactivable non fluorescent comportant un motif de reconnaissance capable de reconna tre une tiquette prot ique Une strat gie de synth se utilisant un d riv bis arseni de la r sorufine a t tent e sans succ s Une nouvelle strat gie a t d velopp e la synth se d une coumarine photoactivable portant un motif Ni NTA acide nitrilotriac tique capable de se lier une tiquette prot ique polyhistidine La synth se totale a t r alis e et les propri t s photochimiques ont t d termin es L entr e de cette mol cule dans des cellules HeLa n tant pas concluante une nouvelle mol cule ne comportant que deux acides a t synth tis e le troisi me acide tant ac tyl Cette mol cule est capable de p n trer dans les cellules et ne semble pas tre toxique En parall le au d veloppement chimique des sondes mes tudes ont port sur la dynamique et les interactions fonctionnelles d une nouvelle prot ine Bzz1p Cette derni re est une prot ine avec deux domaines SH3 et un domaine FCH membre de la famille PCH Pombe Cdc15 Homology dont d autres membres sont connus pour tre impliqu s dans la cytodi r se et l endocytose Des interactions prot ine prot ines ont t recherch es sur la prot ine enti re par un crible de surproduction de Bzz1p par l utilisation d une puce du prot ome de levure et su
208. on et la s paration lectrophor tique La plupart des m thodes concernant la manipulation g n tique de la levure a t effectu e selon Guthrie et Fink 1991 l Bact ries A Souches utilis es et g notypes La bact rie Escherichia coli a t utilis e comme cellule h te lors des clonages et lors de la production de prot ines TOP10 F mcrA A mrr hsdRMS mcrBC 80lacZAM15 AlacX74 recA1 araD139 A ara leu 7697 galU galK rpsL Str endA1 nupG Cette souche a servi pour l amplification de ADN plasmidique XL1 Blue recA endA1 gyrA96 thi 1 hsdR17 supE44 rel A1 lac FproAB laclq ZDM Tn10 Tet Cette souche a servi pour l amplification de l ADN plasmidique BL21 Star DE3 F ompT hsdSs rg mg gal dem rne131 DE3 Cette souche a t utilis e pour induire la production de prot ines en fusion avec des tiquettes 6xHistidines et V5 partir du syst me de vecteurs pET D TOPO Invitrogen MC1066 F D lac X74 hsdR hsdM rpsL galU galK trpC9830 leuB600 pyrF Tn5 Cette souche a t utilis e pour s lectionner des plasmides portant les marqueurs d auxotrophie URA3 de levure B Conditions et milieux de culture et conservation La temp rature optimale de croissance de la bact rie Escherichia coli est de 37 C La culture se fait en milieu liquide ou sur milieu solide De l ampicilline concentration finale 100 pg mL est ajout e pour s lectionner les plasmides portant le g ne Amp conf rant la r
209. ophore photoactivable est n cessaire que les sondes ne soient ni trop hydrophobes ni trop fortement charg es et que la liaison avec une prot ine soit forte voire covalente B Strat gie g n rale Pour cager des fluorophores la structure lectronique est perturb e par l ajout d un groupement photolabile qui rend alors la mol cule non fluorescente ou faiblement fluorescente La r action de photolyse permet la lib ration du fluorophore et le retour sa structure lectronique initiale et donc il redevient fluorescent La plupart des applications biologiques et chimiques ont t faites par le groupe de Mitchison Par exemple la fluoresc ine cag e Sch ma 1A pour l tude de la tubuline Mitchison 1989 Sawin et Mitchison 1991 la r sorufine photoactivable Sch ma 1B pour marquer le cytosquelette d actine Theriot et Mitchison 1991 ou encore la rhodamine cag e Sch ma 1C Pour la fluoresc ine et les rhodamines photoactivables deux groupements photolabiles sont ajout s afin de bloquer le compos sous une forme lactone non fluorescente Pour la r sorufine cag e le fluorophore est sous une forme non ionisable ayant pour r sultat un d calage de l absorption vers le bleu et une extinction de la fluorescence Pour revue Mitchison et al 1998 R cemment une 7 hydroxycoumarine cag e Sch ma 1D par un groupement 1 2 nitro ph nyl thyle a t d crite Dans ce cas comme pour
210. oppement des taches corticales d actine et d endocytose provient des excellentes revues de Moseley et Goode 2006 et Toret et Drubin 2006 il est pr sent dans la figure 26 Ce mod le est bas en particulier sur les r sultats obtenus par Kaksonen et al 2003 2005 et par Huckaba et al 2004 Ce mod le est constitu de cinq tapes 1 Recrutement pr coce IL y a deux possibilit s pour cette tape soit des regions cytosoliques de r cepteurs membranaires modifi es par des kinases ou des ubiquitine ligases s associent la machinerie endocytique Hicke 1999 Howard et al 2002 Roth et Davis 2000 Shih et al 2000 Tan et al 1996 soit un complexe statique appel isosome contenant Pilip Lspip et Sur7p marque le futur site de la formation de taches corticales d actine Walther et al 2006 La machinerie endocytique initialement recrut e aux patches inclut la clathrine et de nombreuses prot ines d chafaudage et adaptateurs de la clathrine Yap1801p et Yap1802p homologues de AP180 Ent1p et Ent2p homologues des epsines Ede1p homologue de Eps15R Scd5p Slalp et Sla2p Aguilar et al 2003 Gagny et al 2000 Henry et al 2003 Howard et al 2002 Newpher et al 2005 Ces prot ines recrutent d autres composants qui promeuvent l assemblage de l actine Panip End3p et Las17p qui forment un r seau complexe de facteurs interagissant Panip et Las17p deux NPFs peuvent recruter di
211. oumarine Lysine NTA 20 Sous argon et agitation 19 1 mg du compos 19 0 027 mmol sont dissous dans 0 5 mL de dichlorom thane distill puis 0 5 mL de TFA sont ajout s La r action est laiss e 5 h temp rature ambiante Le brut est vapor sec Et il est pr cipit par de l ther froid et lav plusieurs fois a l ther froid 14 8 mg d un solide jaune sont r cup r s p quantitatif OH O gt 4 O 0 o Z N NAO Cl HO O API ESI MS 525 1 M HT Le temps de r tention HPLC sur une colonne analytique C18 Acclaim 4 6J 250 mm en utilisant un gradient lin aire de 30 min de 0 a 100 d ac tonitrile dans une solution aqueuse avec 0 1 de TFA a 1 mL min puis d un mode isocratique de 10 min a 100 d ac tonitrile est de 32 76 min Puret gt 97 Temps de demi vie de 4 h dans du tampon phosphate pH 7 2 Il Culture des cellules HeLa Les cellules HeLa proviennent de la plateforme de culture cellulaire de l IGBMC Strasbourg La mise en culture se fait a 37 C 5 CO dans des bo tes de 75 cm contenant 20 mL de milieu de culture DMEM contenant 1 g L de D glucose et L Glutamine Gibco BRL suppl ment en s rum de veau foetal 5 et 40 pg L de gentamycine A confluence les cellules sont d tach es par ajout de trypsine 5 min T ambiante et sont compt es avec une cellule de num ration B rker apr s coloration vitale au bleu de Trypan Elles sont ensuite ensemenc es sur lamelle de verre dans
212. our d une tasse de th avec les personnes du laboratoire de Chimie Bioorganique Bernard Flo Elias Jean Seb Tic Portia Alexandre et Anne Merci Elias pour ces merveilleux repas libanais me tage de l IPCB en particulier Gladys et Johan pour leurs conseils et pour les corrections du manuscrit Sylvie pour son enthousiasme et Vincent Albert Lydia pour les discussions scientifiques ou non autour de la table du midi Je tiens aussi remercier les membres du 4 Un grand merci Cathy pour son aide dans tous les petits tracas de la vie administrative et l organisation des pots Toutes les sorties culturelles les randonn es dans les Vosges et les piques niques gargantuesques m ont permis de souffler et me laissent des soucvenirs imp rissables Sans ma famille et mes amis ce travail n aurait pas pu aboutir Merci mes parents et mes deux s urs Elodie et Marjorie d avoir t l et de m avoir soutenu dans les moments de doute et qui m ont permis de revoir r guli rement mes montagnes Merci aussi mes amis du Magistere Christelle J r my Christophe et Julien et tous les amis de Strasbourg pour avoir t mes c t s et avoir partag ses ann es de th se Et bien sur je n oublie pas non plus mes amis de Grenoble et d ailleurs Samantha tu m as fait r ver avec tes photos de plong e Nad ge Olivier Guillaume ton soutien et ta patience tout au long de cette th se qui fut un moment diffici
213. outes les formes proton es ou d proton e sont visibles sur le chromatogramme en plus d autres impuret s ce qui rend difficile la purification N tert Butoxy Na Na bis 2 tert butoxycarbonylm thy I Ne carboxybenzyl L lysine 14 Dans un ballon anhydre le bromoac tate de tert butyle 8 mL 54 mmol 4 qu et la DIEA 1 5 mL 67 5 mmol 5 qu sont ajout s s quentiellement sous argon et agitation a une solution de Ne benzyloxycarbonyl L lysine tert butyl ester 5 g 13 4 mmol dans 100 mL de DMF anhydre La r action est laiss e pour la nuit a 55 C Le brut est vapor sec Une solution de cyclohexane ac tate d thyle 3 1 est ajout e au brut de r action partiellement solidifi Le m lange ainsi obtenu est filtr sur un fritt en verre et le pr cipit est lav trois fois avec ce m me m lange de solvants Le filtrat est vapor sous vide et chromatographi sur gel de silice eluant cyclohexane ac tate d thyle 3 1 7 5 g d une huile incolore sont r cup r s p 98 Y O h 6 H O UN b d f NO A w Ap SA h 0 09 h i i i RMN H CDCl3 5 1 44 s 18H Hh 1 47 s 9H Hi 1 49 1 65 m 6H Hc Hd et He 3 21 m 2H Hb 3 31 t 1H Hf 3 46 2s 4H Hg 5 10 s 2H Ha 7 3 m 5H Haromatiques 75 D veloppement d un fluorophore photoactivable O tert Butoxy Na No bis 2 tert butoxycarbonylmethyl L Iysine 15 Dans un ballon anhydre le compos 14 7 g 12
214. pable de se lier une prot ine d int r t je pr cise les concepts importants Dans cette partie j aborde les notions de fluorescence puis de Vexcitation multi photonique qui permettent de visualiser des fluorophores Ensuite je d finis le concept de fluorophore photoactivable ainsi que les groupements photolabiles utilis s jusqu pr sent Enfin je pr sente les diff rentes fa ons d tiqueter une prot ine afin de pouvoir la visualiser par microscopie fluorescence En effet il est possible d utiliser des prot ines fluorescentes ou des marqueurs chimiques I Principe de la fluorescence Une mol cule fluorescente fluorophore poss de la propri t d absorber de l nergie lumineuse lumi re d excitation et de la restituer rapidement sous forme de lumi re fluorescente lumi re d mission Une fois l nergie du photon absorb e la mol cule se trouve alors dans un tat lectroniquement excit g n ralement un tat singulet que l on note S1 Figure 1 Le retour l tat fondamental peut alors se faire de diff rentes mani res L une d elles est l mission d un photon c est le ph nom ne de fluorescence La longueur d onde r mise par la mol cule excit e peut tre de m me longueur d onde fluorescence de r sonance ou de longueur d onde plus grande Le fait que la longueur d onde d mission soit plus grande provient du fait que dans les milieux liquides en particulier la mol cule retourne l
215. phiques Quinlan M E Heuser J E Kerkhoff E and Mullins R D 2005 Drosophila Spire is an actin nucleation factor Nature 433 382 388 Quintero Monzon O Rodal A A Strokopytov B Almo S C and Goode B L 2005 Structural and functional dissection of the Abp1 ADFH actin binding domain reveals versatile in vivo adapter functions Mol Biol Cell 16 3128 3139 R Raths S Rohrer J Crausaz F and Riezman H 1993 end3 and end4 two mutants defective in receptor mediated and fluid phase endocytosis in Saccharomyces cerevisiae J Cell Biol 120 55 65 Rice M C Czymmek K and Kmiec E B 2001 The potential of nucleic acid repair in functional genomics Nat Biotechnol 19 321 326 Riezman H 1985 Endocytosis in yeast several of the yeast secretory mutants are defective in endocytosis Cell 40 1001 1009 Rodal A A Kozubowski L Goode B L Drubin D G and Hartwig J H 2005a Actin and septin ultrastructures at the budding yeast cell cortex Mol Biol Cell 16 372 384 Rodal A A Manning A L Goode B L and Drubin D G 2003 Negative regulation of yeast WASp by two SH3 domain containing proteins Curr Biol 13 1000 1008 Rodal A A Sokolova O Robins D B Daugherty K M Hippenmeyer S Riezman H Grigorieff N and Goode B L 2005b Conformational changes in the Arp2 3 complex leading to actin nucleation Nat Struct Mol Biol 12 26 31 Rodal A A Tetr
216. pouvaient tre compens s par la surproduction d une autre prot ine le plasmide de surexpression p424 GAL1 Bzz1 construit par Alexandre Soulard a t transform dans la souche FY1679 Puis une banque d ADN g nomique clon e dans le site BamHI du vecteur 2 micron YEp24 permettant une forte production a t transform e dans la souche FY1679 contenant p424 GAL1 Bzz1 Les cellules ont t tal es sur du milieu contenant du galactose pour surproduire Bzz1p et ont t mises en culture 37 C afin de s lectionner les clones capables de pousser dans ces conditions de s lection Figure 31 28 clones ont ainsi t obtenus leur ADN plasmidique a t isol par un jeu de s lection dans diff rentes souches de bact ries En effet les deux plasmides celui de Bzzip et celui de la banque codent pour des marqueurs auxotrophes diff rents pour la levure TRP1 pour p424 GAL1 Bzz1 et URA3 pour le vecteur de la banque ce qui permet de s lectionner les levures contenant les deux plasmides Ensuite pour d terminer quel plasmide de la banque compensait la mort cellulaire provoqu e par la surexpression de Bzz1p il fallait isoler le plasmide de la banque en vitant le plasmide p424 GAL1 Bzz1 Comme ces deux plasmides codent pour le g ne de r sistance l ampicilline nous avons transform l ADN plasmidique de chaque levure dans des souches bact riennes MC1066 ne m tabolisant pas l uracile afin de ne s lectionner que le plasmide
217. quaticus Taq polym rase 2 U mL et de son tampon Le volume r actionnel final est de 50 pL Un cycle de PCR est constitu d une d naturation de VADN 30 s 95 C d une hybridation des amorces 30 s selon la T de fusion des amorces et d une longation temps variable selon la taille du fragment a amplifier 72 C L amplification est r alis e pendant 25 30 cycles Un dixi me de la r action est d pos sur gel d agarose pour v rifier l efficacit et la sp cificit de l amplification 161 Recherche de partenaires de Bzz1p Pour un clonage n cessitant des extr mit s franches et pas d erreur la Pfu DNA Polymerase peut remplacer la Taq polymerase car elle corrige les erreurs par son activit 3 5 exonuclease et g n re des extr mit s franches dues a l absence d activit terminal transferase V Manipulations concernant les prot ines A Pr paration d extraits prot iques bruts 1 Extraits prot iques de Saccharomyces cerevisiae Les levures provenant d une culture de 100 mL AbS oonm 0 6 0 8 sont s diment es par centrifugation 1 500 g 10 min et lav es avec 5 mL de tampon XB Le culot est alors repris dans Y volume du culot de tampon de broyage puis Y volume de billes de verre 0 4 mm de diam tre est ajout Cette suspension est fortement agit e au vortex pendant 30 s puis refroidie une minute dans la glace Cette agitation est r p t e 6 10 fois Apr s centrifugation 15 000
218. r viations D placement chimique Coefficient d extinction molaire Longueur d onde Rendement quantique Rendement de la r action chimique acide amin Actin depolymerising factor Acide d soxyribonucl ique Ad nosine 5 diphosphate Alloxycarbonyl Acide ribonucl ique Ad nosine 5 triphosphate Bin Amphiphysin Rvs Bovine serum albumine Basic region Carboxybenzyle Z Coiled coil a Carboxy 4 5 dim thoxy 2 nitrobenzyle 5 Carboxym thoxy 2 nitrobenzyle a Carboxy 2 nitrobenzyle Coenzyme doublet Dicyclohexylcarboxydiimide dihydrofolate r ductase Diisopropylazodicarboxylate Differential interference contrast Diisopropyl thylamine Dulbecco s Modified Eagle s Medium Dim thylformamide 4 5 Dim thoxy 2 nitrobenzyle 1 4 5 Dim thoxy 2 nitroph nyl 2 2 2 trifluoro thyle Dim thylsulfoxyde Dithiotr itol Ethanedithiol Acide thylene diamine t trac tique Extended FER CIP4 quivalent FCH BAR Fes Cip4 homology Formin homology domain 1 2 Fluorescein Arsenical Helix binder Fluorescence Loss In Photobleaching Fluorescent Protein Fluorescence Recovery After Photobleaching GTPase Activating Protein GTPases Binding Domain Guanosine Exchange Factor Green Fluorescent Protein Goeppert Mayer groupe protecteur 10 GST GTP hAGT HBSS HEPES hv HPLC IPTG J Kd KFP1 LY m NA NB NDA NHS NPF NTA ORF PAFP PA GFP pb PBS PCH PCP PCR PDB PMB PMSF ppm PPtase PS CFP ReAsH
219. r les deux domaines SH3 de Bzz1p par GST pulldown analys par spectrom trie de masse Des partenaires lipidiques du domaine FCH de Bzz1p ont t identifi s par la technique du lipid blot Ceux ci restent tre confirm s in vivo De nouveaux partenaires sugg rent que Bzz1p pourrait agir au niveau de diff rentes membranes de la cellule Mots cl s fluorophore photoactivable tiquette prot ique NTA Saccharomyces cerevisiae cytosquelette d actine corticale Bzz1p ABSTRACT The cell cytoskeleton consists of a complex proteinaceous filaments network including actin filaments The actin polymerization is a highly conserved and crucial process The aim of my thesis was the development of a new fluorescent photoactivable probe allowing the spatial and temporal study of SH3 domain proteins that affect the actin polymerization activation complex The first step was to develop a photoactivable fluorophore bearing a recognition motif able to recognize a protein tag A synthesis strategy based on a bis arsenic resorufin derivative was tested but failed A new strategy was then developed the synthesis of a photoactivable coumarin bearing a Ni NTA nitrilotriacetic acid recognition motif able to bind a polyhistidine tag The total synthesis was realized and photochemical properties were determined Since the tests of the penetration of this molecule into HeLa cells remained inconclusive a new molecule bearing only two acidic functions w
220. ransduction du signal DIG1 MAP kinase associated protein 4 13 INP53 Inositol polyphosphate 5 phosphatase 53 4 4 Trafic Membranaire CDC68 cell division control protein CDC68 43 45 SEC21 N 21 coatomer COPI complex gam 19 28 SEC26 coatomer complex beta chain 17 21 SEC31 Component p150 of the COPII coat of secre 11 13 WEB1 tory pathway vesicles SEC27 coatomer complex beta chain 10 17 RET2 Coatomer COPI complex delta chain 5 15 RET1 coatomer complex alpha chain RET1 5 6 SRP72 signal recognition particle protein SRP72 4 7 SRP68 signal recognition particle protein SRP68 3 6 SEC23 protein transport protein SEC23 3 4 SEC28 Coatomer COPI complex epsilon chain 2 8 Autres Inconnus POB3 Component of the CP yeast FACT complex 9 Protein that suppresses brefeldin A induced BERI lethality ZUO1 zuotin 7 SIK1 Nucleolar protein component of box C D 7 snoRNPs arx1 Protein of unknown function 5 NAP1 nucleosome assembly protein 4 KRE35 Large subunit GTPase 1 4 HCR1 High copy suppressor of Rpg1 3 svf1 Survival factor 1 3 YGL242c Protein containing two ankyrin repeats 2 2 22 RHR2 RHR2 protein 2 9 Tableau 12 Prot ines interagissant avec les domaines SH3 de Bzzip apr s GST pulldown et analyse par spectrom trie de masse Recherche de partenaires de Bzz1p d l tion affectait le retard de croissance observ avec la souche myo5A bzz1A Tableau 11 Nous n avons pu observer aucun changement de croissance et ce pour aucune
221. ransport how many Ypt Rab GTPases make a eukaryotic cell Trends Biochem Sci 22 468 472 Lazzarino D A Boldogh l Smith M G Rosand J and Pon L A 1994 Yeast mitochondria contain ATP sensitive reversible actin binding activity Mol Biol Cell 5 807 818 Lechler T Shevchenko A and Li R 2000 Direct involvement of yeast type myosins in Cdc42 dependent actin polymerization J Cell Biol 148 363 373 Lee W L Bezanilla M and Pollard T D 2000 Fission yeast myosin Myo1p stimulates actin assembly by Arp2 3 complex and shares functions with WASp J Cell Biol 151 789 800 Li R 1997 Bee a yeast protein with homology to Wiscott Aldrich syndrome protein is critical for the assembly of cortical actin cytoskeleton J Cell Biol 136 649 658 Lippincott J and Li R 1998 Sequential assembly of myosin II an IQGAP like protein and filamentous actin to a ring structure involved in budding yeast cytokinesis J Cell Biol 140 355 366 Lippincott J and Li R 2000 Involvement of PCH family proteins in cytokinesis and actin distribution Microsc Res Techn 49 168 172 Lodish H F Berk A Matsudaira P Kaiser C A Krieger M Scott M Zipursky S L and Darnell J 2003 Molecular cell biology 5th edn W H Freeman and Company New York Lorenz M Popp D and Holmes K C 1993 Refinement of the F actin model against X ray fiber diffraction data by the use of a directed mu
222. ration lectrophor tique des fragments d ADN Les acides nucl iques sont s par s sur gel d agarose L agarose est dissout dans du tampon TAE qui sert aussi de tampon de migration L lectrophor se se fait dans le tampon TAE 100 V jusqu ce que le front de migration atteigne le bas du gel rep r par le bleu de bromoph nol pr sent dans le tampon de charge Le gel est ensuite incub pendant 5 minutes dans un bain de TAE additionn de 0 5 ug mL de bromure d ethidium un agent intercalant de l ADN permettant de visualiser les bandes d acides nucl iques sous lumi re UV Le poids mol culaire d un fragment d ADN peut tre valu par comparaison a une chelle constitu e de fragment d ADN de poids mol culaires connus migrant sur le m me gel Tampon TAE Tris base 0 2 M acide ac tique 0 2 M Na EDTA 5 mM pH 8 Tampon de charge 5 X Saccharose 25 g NazEDTA 0 5 M pH 8 10 uL 1 pointe de spatule de bleu de bromoph nol qsp 50 mL d eau distill e D S quencage de l ADN Le s quencage a t effectu avec le s quenceur APE Biosystems mod le 373 VIBMP Institut de Biologie Mol culaire des Plantes Strasbourg E Amplification enzymatique de l ADN par PCR Polymerase Chain Reaction L ADN a amplifier 100 ng est d natur a 95 C pendant 5 min avant amplification en pr sence des amorces sp cifiques sens et antisens 50 pmol de dNTPs 0 2 mM d ADN polym rase de Thermophilus a
223. re complex e avec la DNasel polypeptide de 375 acides amin s a permis de mettre en vidence que cette prot ine est repli e en deux domaines globulaires flexibles I et Il Kabsch et al 1990 La cavit centrale entre ces deux domaines renferme le site de liaison et d hydrolyse de l ATP ainsi qu un site de liaison a un cation divalent Les ions Mg ou Ca li s ce site interagissent avec les phosphates et y de VATP La stabilit du complexe actine G ATP ion est assur e par la formation de liaisons hydrogenes et de ponts salins entre certains r sidus et les phosphates de l ATP ou lion divalent Kabsch et Holmes 1995 Dans les conditions physiologiques l actine G pure est capable de polym riser formant ainsi des filaments appel s microfilaments ou actine F Un microfilament 83 9 Q i Noyau G Noyau O Noyau 9 O O x J un J D Yo gt oi TEEN ELLE G G O F actine F actine y G 0 actine Nucl ation Elongation Etat stationnaire Figure 15 Processus de polym risation de l actine Au cours de la nucl ation il y a assemblage d un noyau de trois monom res d actine qui formeront la structure de d part n cessaire l longation d un nouveau filament L tat stationnaire correspond l quilibre dynamique du filament Adapt e de Molecular Cell Biology Lodish 5 me dition Cc gt Concentration G actine gt Co ass Fur OEP 0 CD 2233522238 mn
224. re photoactivable IL faut noter que l inconv nient majeur de la coumarine ce sont ses longueurs d ondes de fluorescence excitation Amax 410 nm et mission Amax 450 nm En effet a ces longueurs d onde tr s proches de l UV une forte autofluorescence cellulaire est parfois observ e pouvant emp cher la d tection des signaux les plus faibles C est pourquoi de nouveaux fluorophores bas s sur la coumarine mais ayant des longueurs d excitation et d mission d plac es vers le vert sont en cours de d veloppement au laboratoire Une autre solution serait d utiliser la r sorufine qui a l avantage d mettre de la fluorescence dans le rouge excitation Amax 570 nm et mission Amax 585 nm pH 9 et qui devrait pouvoir tre cag e plus facilement avec le groupement DMNPB en utilisant un couplage de Mitsunobu Specht et al 2006 D autre part nous avons test les propri t s photochimiques du compos 18 Premi rement nous avons v rifi que l ajout de la cage gt sur le ph nol masque efficacement la fluorescence de la coumarine par la d termination du rapport des rendements quantiques de fluorescence avant et apr s photolyse environ 100 fois sup rieur apr s photolyse Puis nous avons tudi la r action de photolyse pour sa qualit son efficacit ainsi que du point de vue cin tique et nous avons d termin la section efficace du compos 18 en bi photon Il est noter que le re
225. rectement et activer le complexe Arp2 3 pour activer la nucl ation de l actine Etape interm diaire dans le d veloppement des taches corticales motilit faible Cette tape commence quand les taches corticales pr coces marqu es par Las17p Panip Sla1p et Sla2p sont rejointes par la machinerie de nucl ation de l actine c est dire le complexe Arp2 3 et trois nouveaux NPFs Myo3p Myo5p myosines de type et Abp1p A ce moment la les patches subissent des mouvements lents et non directionnels dans le plan du cortex cellulaire La cin tique de la polym risation de l actine ce stade est de 0 05 0 1 m s Kaksonen et al 2003 Kaksonen et al 2005 ce qui est plus lent que les mouvements rapides des taches corticales d pendants des cables 0 3 m sec Huckaba et al 2004 Invagination et scission La transition vers cette troisi me phase dans laquelle les patches v sicules bougent vers l int rieur de la cellule est corr l e avec le d but d une motilit rapide et directionnelle des taches corticales Kaksonen et al 2003 qui simultan ment perdent de nombreux composants pr coces Sla1p Sla2p Las17p 109 ES FCHO2 Dr amp ee FCHO1 Xt FCHON Hs Mm1 Cyk Sc IN Syndapin men AE Syndapin li Ta PSTI A PACSIN2 Dd RO A PSTPIP1 Dr hens ES AR AR ot pren Am RER Syndapin Dm y ye FAR Syndapin Sp in Ill An PSTPIP2 Om PRES 3 Mmi 10 PSTPIP2a
226. res cas une enzyme est n cessaire pour l attachement de la sonde la s quence cible Une autre approche tr s diff rente est d incorporer des acides amin s non naturels dans la prot ine d int r t D autres consid rations importantes sont prendre en compte lors d un marquage in vivo d une prot ine La sonde doit tre perm able la membrane cellulaire et elle ne doit pas tre toxique pour la cellule Le marquage de la prot ine doit se faire plus rapidement que les processus biologiques que l on souhaite tudier et le complexe sonde prot ine doit tre suffisamment stable au cours du temps Dans les paragraphes suivants les diff rentes m thodes de marquage d une prot ine avec une sonde chimique sont discut es De nombreuses revues d crivent les diff rentes m thodes et les comparent aux tiquettes prot iques Chen et Ting 2005 Giepmans et al 2006 Johnsson et Johnsson 2007 Johnsson et Johnsson 2003 Marks et al 2004a Marks et Nolan 2006 Miller et Cornish 2005 Zhang et al 2002 1 Petites sondes utilisant le ciblage d une s quence prot ique Dans cette approche la prot ine d int r t est exprim e en fusion avec une tiquette prot ique qui est capable de lier une petite mol cule Figure 5 Par exemple la dihydrofolate r ductase DHFR et le mutant Phe36Val de la prot ine 12 de liaison a FK506 FKBP12 F36V se lient respectivement a des petites mol cules ligands le m
227. rption 595 nm lue sur BioPhotometer Eppendorf Selon la gamme talon tablie avec de la BSA la concentration de l extrait prot ique est d termin e par ajout du colorant de Bradford BioRad 800 ul H20 200 ul de Bradford 2 5 uL d extrait E S paration lectrophor tique des prot ines Les prot ines peuvent tre s par es sur gel d naturant de polyacrylamide en pr sence de SDS par migration dans un champ lectrique Le gel comprend 2 parties de composition et de pH diff rents Dans la partie sup rieure un gel de concentration faiblement r ticul concentre les prot ines et permet une r solution plus fine des bandes Le gel de s paration dans la partie inf rieure fractionne les prot ines selon leur taille Le gel de s paration est coul au de la hauteur des plaques 1 mL d isopropanol ou d eau est d pos pour aplanir la surface du gel et ainsi obtenir une s paration bien nette des prot ines Apr s polym risation le gel de concentration est coul et un peigne y est imm diatement ins r L chantillon prot ique analyser est d natur 5 min 95 C dans le tampon de charge puis d pos dans les puits L lectrophor se se fait dans le tampon de migration 100 150 V jusqu ce que le front de migration atteigne le bas du gel Le poids mol culaire d une prot ine peut tre valu par comparaison une chelle constitu e de prot ines de poids mol culaires connus migra
228. s En effet ces filaments se pr sentent sous diff rentes formes selon leur fonction filaments courts faisceau de filaments parall les ou r seau dense de filaments interconnect s Cette diversit dans l organisation de l actine suppose une grande vari t dans les mol cules r gulant sa dynamique pour revue Winder et Ayscough 2005 Certaines prot ines lient les monom res d actine ces prot ines travaillent de concert afin de contr ler le pool d actine non polym ris e dans les cellules ainsi que le nucl otide li l actine Les thymosines lient les monom res d actine ATP et inhibent la polym risation de l actine et l change de nucl otides Les membres de la famille ADF cofiline lient les monom res d actine ADP et inhibent l change de nucl otides Les profilines lient pr f rentiellement les monomeres d actine d pourvus de nucl otides et elles acc lerent l change de nucl otides Les prot ines de coiffe des filaments d actine se lient a l une ou l autre des extr mit s o elles bloquent l adjonction ou la dissociation des sous unit s et donc r gulent la croissance du filament d actine A l extr mit on retrouve par exemple la gelsoline qui pi ge le Ca et bloque la dissociation et l association des sous unit s d actine la fragmine et la s verine Le complexe Arp2 3 et la tropomoduline en association avec la tropomyosine coiffent l extr mit Les prot ine
229. s L M Roe S M Hemingway E J Stifani S and Pearl L H 2002 Crystal structure of the C terminal WD40 repeat domain of the human Groucho TLE1 transcriptional corepressor Structure 10 751 761 Poch O and Winsor B 1997 Who s who among the Saccharomyces cerevisiae actin related proteins A classification and nomenclature proposal for a large family Yeast 13 1053 1058 Poskanzer K E Marek K W Sweeney S T and Davis G W 2003 Synaptotagmin I is necessary for compensatory synaptic vesicle endocytosis in vivo Nature 426 559 563 Prasher D C Eckenrode V K Ward W W Prendergast F G and Cormier M J 1992 Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein Gene 111 229 233 Pruyne D and Bretscher A 2000a Polarization of cell growth in yeast J Cell Sci 113 Pt 4 571 585 Pruyne D and Bretscher A 2000b Polarization of cell growth in yeast l Establishment and maintenance of polarity states J Cell Sci 113 365 375 Ptacek J Devgan G Michaud G Zhu H Zhu X Fasolo J Guo H Jona G Breitkreutz A Sopko R et al 2005 Global analysis of protein phosphorylation in yeast Nature 438 679 684 Q Qualmann B Roos J DiGregorio P J and Kelly R B 1999 Syndapin I a synaptic dynamin binding protein that associates with the neural Wiskott Aldrich syndrome protein Mol Biol Cell 10 501 513 184 R ferences bibliogra
230. s avec le compos 20 Ni La figure 13 E montre une absence de fluorescence dans le cytoplasme ce qui signifie que le compos n a donc pas r ussi a traverser la membrane plasmique Ceci ne correspond pas a ce qui a t montr dans la litt rature Guignet et al 2004 Le nickel Ni est indispensable pour la liaison entre une tiquette polyhistidines et le NTA or il porte deux charges positives et le motif NTA peut poss der jusqu trois charges n gatives selon le pH Le fait que le compos 20 Ni ne rentre pas dans les cellules suggere qu une charge n gative serait encore libre Pour v rifier cette hypothese David Puliti un doctorant du laboratoire a synth tis un nouveau ch latant du Ni la coumarine NDA compos 22 Ni Sch ma 16 dont un des acides est prot g sous forme d ester m thylique Pour obtenir cette mol cule il est parti de la m thyl Ne benzyloxycarbonyl L lysine et a proc d comme pr c demment d crit en utilisant le tBu comme deuxi me groupe protecteur Nous avons choisi l ester m thylique comme groupe protecteur car il devrait tre plus r sistant que les esters tert butyliques et ne pas s enlever lors de l tape de d protection de ces derniers De plus Vester m thylique pourrait tre hydrolys par les est rases cellulaires ainsi une fois entr dans le cytoplasme cellulaire le NTA serait g n r Une fois cette mol cule obtenue et ch lat e avec du nickel nous avons tes
231. s dans un tampon phosphate pH 7 4 Ainsi comme nous l attendions le compos 18 n est pas fluorescent La r action de photofragmentation peut se faire dans le proche UV 355 nm et des longueurs d onde o l on n excite pas ou peu le compos 21 De plus le compos 20 n est pas fluorescent et ne devrait donc pas g ner l observation dans les cellules 2 R action de photofragmentation La r action de photolyse Sch ma 15 a t analys e pour sa qualit son efficacit ainsi que du point de vue cin tique NO P hv UV 350 nm xe O_O o O_O ou MeO O bi photon gt 700 nm al IND ron OMe 2 O Po gt Non Fluorescent Fluorescent Sch ma 15 R action de photofragmentation 54 0 min 1 6 4 2 min 4 min 6 min Compose 21 8 min 1 2 7A 10 min Compose 18 m 2 20 2 007 B Compose 18 t0 1 807 1 607 1 407 1 207 AU an Compose 21 on t35 min 0 607 0 407 0 20 0 001 AA A A pl an ae Zr Poe O CO E Poi O a Oe STR OE ee Te ae as RE LS O en 0 00 5 00 10 00 15 00 20 00 25 00 30 00 35 00 40 00 Minutes Figure 11 Suivie de la r action de photofragmentation L irradiation du compos 18 a t faite pendant 35 minutes une longueur d onde de 364 nm A Suivi de la r action de photofragmentation par spectrom trie B Analyse du compos 18 a t0 et apr s 35 minutes d irradiation par HPLC Gradien
232. s de fragmentation des filaments d actine coupent les filaments d actine en courts fragments comme la gelsoline la fragmine s verine et l ADF cofiline Par leurs deux sites de liaison a l actine les prot ines de r ticulation permettent d associer des filaments entre eux afin de former des r seaux ou de les ancrer aux membranes Elles sont class es en trois classes en fonction de leur structure Fimbrine plastine a actinine spectrine fodrine dystrophine ABP 120 filamine Il y a aussi des prot ines de stabilisation des filaments d actine comme la tropomyosine la n buline et la caldesmone La figure 20 illustre de mani re non exhaustive la diversit des prot ines capables de r guler la dynamique de l actine 95 TT R y a o ss a a pl sor diploid spore aa budding haploid _ Figure 21 Le cycle de vie de la levure Saccharomyces cerevisiae http commons wikimedia org wiki Image Budding_yeast_Lifecycle png filehistory Recherche de partenaires de Bzz1p ll Le cytosquelette d actine chez Saccharomyces cerevisiae La levure S cerevisiae est un champignon unicellulaire capable de fermenter des mati res organiques animales ou v g tales Les levures sont employ es pour la fabrication du vin de la bi re des spiritueux des alcools industriels du pain et d antibiotiques La levure Saccharomyces cerevisiae est aussi tr s utilis e comme organisme mod le en biologie cellulaire
233. s la r gulation du cytosquelette Les prot ines PCH sont capables de communiquer avec les deux modules de polym risation de l actine le complexe Arp2 3 WASP et les formines Je ne d crirai que les interactions avec le complexe Arp2 3 WASP Les prot ines PCH doivent probablement fonctionner comme des prot ines adaptatrices qui recrutent des prot ines avec diverses unit s catalytiques dans des grands complexes prot iques Par exemple des prot ines PCH comme CIP4 et Toca 1 sont des effecteurs de Cdc42 Aspenstrom 1997 Ho et al 2004 Le meilleur lien tabli avec la dynamique de l actine est l association des prot ines PCH et WASP ou N WASP Soulard et al 2002 Le r le de Toca 1 dans l activation de WASP a t tabli en d tail Ho et al 2004 Apr s stimulation des cellules le complexe WIP N WASP se dissocie et Toca 1 est n cessaire cette dissociation Ho et al 2004 N WASP lib r active alors la polym risation nucl e par le complexe Arp2 3 Des GTPases de type Rho telles que Cdc42 peuvent alt rer l affinit de Toca 1 pour N WASP et ou pour WIP Ho et al 2004 Le ciblage de Toca 1 la membrane plasmique ou des membranes internes par le biais du domaine F BAR pourrait aussi alt rer l affinit de Toca 1 pour le complexe WIP N WASP 114 Stress salin Sites de y ne ai d pendante d un r cepteur polarisation GEN off recrutement Machinerie e d endocytose
234. s pas par Bnrip Bud p change de l ADP pour de LATP sur les monom res d actine tout comme la profiline Moseley et Goode 2005 C Taches corticales d actine et endocytose Une excellente revue de Moseley et Goode 2006 pr sentent le cytosquelette d actine dans la levure bourgeonnante De multiples composants des taches corticales d actine on t identifi s dans des cribles al atoires de mutants d fectueux dans l endocytose Actip ARPC2 Rvs167p Sac6p Sla2p et Vrp1p Chvatchko et al 1986 Dulic et Riezman 1989 Engqvist Goldstein et Drubin 2003 Kubler et Riezman 1993 Munn et al 1995 Raths et al 1993 Riezman 1985 Des d fauts dans l endocytose en phase fluide de Lucifer Yellow apr s traitement des cellules avec la latrunculine A Lat A un agent s questrant les monom res d actine montre que l actine est impliqu e dans l endocytose Ayscough et al 1997 De plus des mutants affectant de nombreux composants des taches corticales montrent une accumulation dans les v sicules post Golgi Harsay et Bretscher 1995 Li 1997 Mulholland et al 1997 Cela sugg re un lien temporel et spatial entre l endocytose et l exocytose 1 Ultrastructure Des observations en microscopie lectronique ont r v l que les taches corticales d actine s associent avec des invaginations comme des doigts des sites potentiels d endocytose a la membrane plasmique Mulholland et al 1994 Figure 25A et
235. s pendant quelques jours 4 C Tampon de fixation K HPO 35 mM KH PO 35 mM 4 formald hyde MgCl 0 5 mM B Marquage par des colorants 1 Phallo dine coupl e au TRITC La phallo dine une toxine issue de l amanite phallo de a la propri t de se fixer sp cifiquement sur les polym res d actine Cette toxine coupl e un fluorochrome permet la visualisation du cytosquelette d actine dans les cellules Les cellules fix es sont centrifug es et resuspendues dans 15 pL de PBS contenant 1 uM de phallo dine TRITC Sigma Apr s 90 min d incubation T ambiante dans l obscurit les cellules sont lav es avec du PBS mont es entre lame et lamelle et observ es au microcope a pifluorescence 2 Lucifer Yellow CH Le Lucifer Yellow carbohydrazide LY est une petite mol cule fluorescente utilis e pour l tude de l endocytose en phase fluide Ce marqueur est internalis dans les cellules au niveau de la membrane plasmique et accumul dans les vacuoles Les cellules de levure sont cultiv es dans du milieu minimum 30 C jusqu AbS600nm 0 3 Un mL de la culture est centrifug 4000 g 1 min et les cellules sont resuspendues dans 90 uL de milieu minimum et 10 pL du stock de LY concentration finale de 4 mg mL Un trou dans le couvercle permet un change gazeux pendant l incubation de 1 5 a 2 h Apres 3 lavage avec du Tampon Phosphate de Potassium les cellules sont mont es entre lame et lamelle sce
236. se aqueuse est extraite 3 fois avec du dichlorom thane Les phases organiques sont rassembl es s ch es par du sulfate de sodium anhydre filtr es et vapor es sec Le solide est chromatographi sur colonne de silice avec heptane ac tate d thyle 8 2 1 5 g d un solide jaune sont r cup r s p 46 F3C O d NOs a cMeO OMa RMN H CDCL 8 4 03 et 4 04 2s 6H Hb et Hc 6 85 s 1H Hd 7 74 s 1H Ha C 1 2 nitro 4 5 dim thoxy ph nyl 2 2 2 trifluoro thanol 3 Dans un ballon anhydre le compos 2 2 64 g 9 46 mmol est dissous dans 35 mL de dioxane anhydre Puis a 10 C sous argon et agitation du borohydrure de sodium 431 mg 11 35 mmol 1 2 qu est ajout Apr s 2 h temp rature ambiante le milieu est neutralis avec de l eau puis la phase aqueuse est extraite 3 fois avec de l ac tate d thyle Les phases organiques sont rassembl es lav es avec une solution de chlorure de sodium satur e s ch es par du sulfate de sodium anhydre filtr es et vapor es sec 2 3 g d un solide jaune sont r cup r s p 86 F3C_ OH e d NO cMeO OMeb RMN H CDCL amp 3 97 et 4 00 2s 6H Hb et Hc 6 35 m 1H He 7 32 s 1H Ha 7 69 s 1H Hd 68 D veloppement d un fluorophore photoactivable D 1 2 nitro 4 5 dim thoxy ph nyl 2 2 2 trifluoro chloro thane 4 Dans un ballon anhydre le compos 3 365 mg 1 3 mmol est dissous dans 5 mL de
237. st es aucune osmo sensibilit n a t d tect e chez les mutants quelle que soit la temp rature de croissance Tableau 10 Parall lement la croissance des mutants haploides a t test e sur YPD ou SC contenant du Calcofluor White CW 50 uM Cette drogue est capable d alt rer la paroi 132 ast2A ykr018CA yer128WA ydr428CA ycr076CA ypt324 2 Figure 35 Effets des diff rentes d l tions sur le profil de bourgeonnement dans des souches haploides Les cicatrices de chitine sont marqu es avec du Calcofluor White CW La souche sauvage est BY4742 Recherche de partenaires de Bzz1p cellulaire de la levure et sa pr sence peut amplifier des d fauts de paroi pr existants chez certains mutants Dans toutes les conditions de temp rature test e la pr sence de Calcofluor White n affecte pas la croissance des diff rents mutants examin s Tableau 10 Cc Croissance sur une source carbon e non fermentable La croissance des diff rentes souches mutantes n est pas ralentie sur un milieu contenant une source de carbone fermentable telle que le glucose ou dextrose Nous avons test si ces diff rentes souches mutantes taient capables de m taboliser correctement une source de carbone non fermentable telle que le glyc rol Une d ficience de croissance sur un milieu contenant du glyc rol est souvent le premier indice d un d ficit dans le processus de la respiration c
238. t cellulaire par les formines Figure 25 Ultrastructure des taches corticales d actine par microscopie lectronique Figure 26 Mod le pour le d veloppement des taches corticales d actine Figure 27 Dendrogramme de prot ines PCH connues s lectionn es par la pr sence de domaines FCH CC et 0 2 SH3 Figure 28 Structure primaire des domaines des prot ines PCH Figure 29 Mod le th orique du r le de Bzz1p au sein du complexe Las17 Vrp1 Myo3 5p Figure 30 Interaction des diff rents domaines SH3 avec Las17 GFP Figure 31 Principe du crible de surexpression Tableau 6 Analyse des effets de la surproduction sur galactose des fragments 1 et 2 lors d une surproduction de Bzz1p 51 52 53 54 54 55 57 58 59 61 84 84 86 87 89 91 94 96 98 101 104 106 108 110 112 115 117 119 121 Figure 32 Principe du ProtoarrayTM Figure 33 Constructions utilis es au cours de cette th se Figure 34 Purification de Bzz1p fusionn e en C ou en N terminal par l tiquette V5 6xHis Tableau 7 Partenaires potentiels de Bzz1p tiquet e en N terminal obtenus avec le Protoarray Tableau 8 Partenaires potentiels de Bzz1p tiquet e en C terminal obtenus avec le Protoarray Tableau 9 Partenaires potentiels obtenus sur deux lames du Protoarray avec Bzzip tiquet e en N terminal et en C terminal Tableau 10 Analyse ph notypique des effets des d l tio
239. t son entr e dans les cellules Apr s une incubation de 30 minutes avec les cellules celles ci deviennent fluorescentes lorsqu on les excite 405 nm Figure 13 B et le spectre d mission correspond celui de la coumarine Alors que la concentration finale du compos 22 Ni est de 20 uM l intensit de fluorescence observ e dans le cytoplasme cellulaire est moindre que celle observ e avec le compos 19 une concentration de 1 uM avec des param tres d observation identiques Ceci suggere que les conditions d entr e dans les cellules sont encore a am liorer mais elles sont toutefois suffisamment importantes pour faire de l imagerie cellulaire dans de bonnes conditions d observations Nous avons aussi observ une chose surprenante le compos 22 Ni2 rentre dans les cellules avec ou sans ch lation par le nickel Figure 13B et C Nous n avons pas d explication cette constatation si ce n est la possibilit que des cations divalents du tampon Mg Ca se substituent au nickel 60 22 Ni2 20 UM HBSS 22 Ni2 20 UM HBSS Figure 14 Tests par imagerie de fluorescence de la toxicit du compos 22 Ni charg dans les cellules HeLa Les cellules sont charg es avec 20 uM du compos 22 Ni2 pendant 30 minutes dans du tampon HBSS pH 7 35 a 37 C Apres lavages la fluorescence des cellules est observ e toutes les 10 secondes pendant 1 h au microscope avec une excitation a 405 nm D veloppeme
240. t N terminal Figure 33 afin de comparer les r sultats obtenus pour ces deux constructions Les r sultats obtenus peuvent tre diff rents du fait de la position des domaines connus SH3 et FCH de Bzz1p aux extr mit s de la prot ine c est dire que l tiquette pourrait occasionner une g ne st rique Pour viter d avoir des faux n gatifs il est judicieux d tiqueter une m me prot ine en C et en N terminal Les constructions ont t r alis es avec l utilisation de vecteurs permettant l tiquetage avec des polyhistidines et l pitope V5 les plasmides pET101 D TOPO et pET151 D TOPO permettant respectivement d tiqueter une prot ine d inter t en C terminal et en N terminal produite dans E coli Dans ces plasmides l expression de la prot ine de fusion est sous le contr le du promoteur T7 Lac de la B galactosidase ce qui permet l induction de la prot ine chim re par ajout d IPTG isopropyl B D thiogalactopyranoside dans le milieu de culture Les fragments d ADN correspondant au gene BZZ1 ont t obtenus par PCR sur de l ADN g nomique provenant de la souche de levure BY4742 l aide des couples d amorces OCO1 0C02 et OCO1 0C03 cf tableau 13 Ils ont ensuite t ins r s dans les plasmides pET101 D TOPO ou pET151 D TOPO Figure 33 Apr s une mise au point des conditions d expression la prot ine chim re a ensuite t purifi e partir de la bact rie E coli apr s une induction d
241. t lin aire sur 30 min de 0 100 d ac tonitrile dans une solution aqueuse de TFA 0 1 puis mode isocratique pendant 10 min avec 100 d ac tonitrile D veloppement d un fluorophore photoactivable L irradiation du compos 18 dans un tampon PBS pH 7 4 315 nm 365nm et 403 nm l aide d une lampe au mercure montre que la r action de photofragmentation est propre apr s analyse des spectres UV enregistr s diff rentes longueurs d onde d irradiation Une diminution de l absorbance 355 nm est concomitante avec l apparition d une absorbance 408 nm et un point isobestique appara t vers 375 nm ce qui t moigne d une photofragmentation propre Figure 11 L analyse par HPLC a permis de confirmer que l irradiation du compos 18 s accompagne d une diminution graduelle de ce dernier en fonction du temps d exposition avec l apparition concomitante d un d riv de la coumarine fluorescent et d un sous produit de la cage visualis s par UV La qualit est tablie par un dosage du d riv de la coumarine a 408 nm la r action de photolyse est quasiment totale gt 95 de coumarine lib r e apres photolyse De plus sur un microscope confocal quand une solution non fluorescente du compos 18 est irradi e par une lampe UV on observe une augmentation de la fluorescence dans le bleu dont le spectre d mission correspond au spectre de fluorescence de la coumarine L efficaci
242. tation algorithm J Mol Biol 234 826 836 Los G V Darzins A Karassina N Zimprich C Learish R McDougall M G Encell L P Friedman Ohana R Wood M Vidugiris G et al 2005 HaloTag Interchangeable Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Capture Promega Cell Notes 11 2 6 Loudwig S Specht A and Goeldner M 2002 Caged compounds the photolabile precursors of bioactive molecules Developments and prospects Actualite Chimique 7 12 Lukyanov K A Chudakov D M Lukyanov S and Verkhusha V V 2005 Photoactivatable fluorescent proteins Nat Rev Mol Cell Biol 6 885 890 Luna E J and Hitt A L 1992 Cytoskeleton plasma membrane interactions Science 258 955 964 M Madania A Dumoulin P Grava S Kitamoto H Scharer Brodbeck C Soulard A Moreau V and Winsor B 1999 The Saccharomyces cerevisiae homologue of human Wiskott Aldrich syndrome protein Las17p interacts with the Arp2 3 complex Mol Biol Cell 10 3521 3538 181 R ferences bibliographiques Marks K M Braun P D and Nolan G P 2004a A general approach for chemical labeling and rapid spatially controlled protein inactivation Proc Natl Acad Sci U S A 101 9982 9987 Marks K M and Nolan G P 2006 Chemical labeling strategies for cell biology Nat Methods 3 591 596 Marks K M Rosinov M and Nolan G P 2004b In vivo targeting of organic calcium sensors via geneti
243. te d une r action de photolyse se caract rise par le produit x rendement quantique de photolyse x coefficient d extinction molaire a la longueur d onde d irradiation Le rendement quantique a t estim a 0 26 a partir du glutamate cag avec le m me groupement photolabile Specht et al 2006 Associ a un e lev 364 nm cela conduit a une efficacit photolytique remarquable Les cin tiques de photofragmentation sur le compos 18 ont t r alis es dans le laboratoire du Dr J Wirz a B le Ces cin tiques ont consist a analyser la formation d un d riv de la coumarine apres flash laser 350 nm La demi vie de lib ration du produit a t calcul e 4 us Nous sommes donc en pr sence d une photofragmentation tr s rapide largement compatible avec les tudes de dynamique de prot ines La d termination de la section efficace en bi photon du compos 18 a t effectu e par le Dr T Furuta Tokyo La valeur trouv e 740 nm est de 0 21 GM ce qui conf re au compos 18 une sensibilit faible mais satisfaisante la photolyse bi photonique De plus nous avons irradi ce compos en solution avec un laser puls utilis pour le bi photon 740 nm et on observe une augmentation de la fluorescence en fonction du nombre de flash L ensemble des propri t s photochimiques sont bonnes voire excellentes et permettent d envisager l utilisation de cette sonde pour les tudes de dynamique d
244. te des interactions avec Vrp1 qui se lie l actine G Anderson et al 1998 Evangelista et al 2000 Geli et al 2000 Lechler et al 2000 Wu et al 1996 De plus il a t propos que Myo3p et Myo5p fonctionnent dans un grand complexe avec Las17p R cemment Sun et al 2006 ont montr qu il tait possible de s parer l activit NPF et l activit motrice de Myo5p et que l activit motrice est n cessaire pour induire les mouvements du manteau endocytique vers l int rieur de la cellule lors des derni re tapes de d veloppement des taches corticales L activit NPF de Abp1p actin binding protein 1 prot ine similaire la cortactine de mammif res Uruno et al 2001 Weaver et al 2001 requiert non seulement ses deux motifs acides mais aussi son domaine ADFH ADF cofilin homology qui lie l actine F avec 103 Budding yeast oo Profilin Secretory vesicle Figure 24 R gulation de la polarit cellulaire par les formines Les deux formines Bnitp et Bnrip contr lent la polym risation de l actine localis e a la pointe du bourgeon et au col d tranglement entre le bourgeon et la cellule m re respectivement Le facteur de polarit cellulaire Bud p stimule directement l activit de Bnitp La polym risation de l actine induite par les formines est requise pour le transport de v sicules de s cr tion m di par Myo2p le long des filaments d actine dans le bourgeon pour apporter
245. te un tat des lieux sur les m thodes d j disponibles pour marquer une prot ine au sein d une cellule Enfin je d cris les diff rentes strat gies de synth se d un fluorophore photoactivable capable de se lier une prot ine d velopp es au cours de cette these et les r sultats obtenus au niveau chimique photochimique et cellulaire Dans un deuxi me temps je pr sente mon travail sur la prot ine Bzz1p dont j ai voulu pr ciser les interactions avec diff rents partenaires cellulaires Dans une premi re partie je d cris l organisation g n rale du cytosquelette d actine ainsi que ses m canismes de r gulation au sein de la levure Saccharomyces cerevisiae le mod le d tude au laboratoire J aborde ensuite les relations entre le cytosquelette d actine et les m canismes d endocytose suivi par un tat des lieux sur le r le des prot ines de la famille PCH dont Bzz1p est membre Dans les parties suivantes je pr sente et discute les r sultats obtenus sur les partenaires de Bzz1p identifi s au cours de cette these 15 Partie 1 D veloppement d un fluorophore photoactivable Chapitre 1 Fluorophores photoactivables et tiquettes chimiques de prot ines D veloppement d un fluorophore photoactivable Chapitre 1 Fluorophores photoactivables et tiquettes chimiques de prot ines Avant de pr senter les strat gies de synth se utilis es pour d velopper un fluorophore photoactivable ca
246. teins cofilin and Aip1 in Saccharomyces cerevisiae Genes Cells 4 21 32 Imai K Nonoyama S and Ochs H D 2003 WASP Wiskott Aldrich syndrome protein gene mutations and phenotype Curr Opin Allergy Clin Immunol 3 427 436 Innocenti M Zucconi A Disanza A Frittoli E Areces L B Steffen A Stradal T E Di Fiore P P Carlier M F and Scita G 2004 Abi is essential for the formation and activation of a WAVE2 signalling complex Nat Cell Biol 6 319 327 Insall R Muller Taubenberger A Machesky L Kohler J Simmeth E Atkinson S J Weber l and Gerisch G 2001 Dynamics of the Dictyostelium Arp2 3 complex in endocytosis cytokinesis and chemotaxis Cell Motil Cytoskeleton 50 115 128 Ito T Chiba T Ozawa R Yoshida M Hattori M and Sakaki Y 2001 A comprehensive two hybrid analysis to explore the yeast protein interactome Proc Natl Acad Sci U S A 98 4569 4574 Itoh T Erdmann K S Roux A Habermann B Werner H and De Camilli P 2005 Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F BAR proteins Dev Cell 9 791 804 Jedd G Mulholland J and Segev N 1997 Two new Ypt GTPases are required for exit from the yeast trans Golgi compartment J Cell Biol 137 563 580 Johnsson N and Johnsson K 2003 A fusion of disciplines chemical approaches to exploit fusion proteins for functional genomics
247. thotrexate et le SLF ligand synth tique pour FKBP12 avec des constantes de dissociation de 25 pM et 94 pM Clackson et al 1998 Sasso et al 1994 La dissociation du ligand peut causer une d t rioration du signal au cours du temps Un autre probleme est la pr sence de DHFR endogene ce qui cause un fort bruit de fond fluorescent a moins d utiliser des lign es cellulaires mutantes d l t es pour la DHFR Pour r duire ce probl me de perte du signal au cours du temps de nouvelles sondes ont t d velopp es Apr s reconnaissance de l tiquette prot ique et de la sonde il y a formation d une liaison covalente Par exemple le laboratoire de Johnsson a exploit l alkylation de la Cys145 de la O alkylguanine transf rase humaine hAGT aussi connu sous le nom de SNAP tag avec de nombreux substrats O benzylguanine pour lier 33 Figure 6 Marquage d une prot ine avec une sonde chimique en utilisant une tiquette prot ique excisable La prot ine d int r t en fusion une tiquette prot ique int ine ubiquitine bleue est exprim e Apr s reconnaissance de l tiquette par la sonde chimique losange rouge l tiquette s excise ce qui lie de fa on covalente la sonde chimique la prot ine d int r t D veloppement d un fluorophore photoactivable covalemment des prot ines recombinantes avec des fluorophores dans de nombreux types cellulaires Keppler et al 2003 2004a 2004b D autr
248. tion utilis es M Cage coumarine Lysine NTA SEM 13 Dans un ballon anhydre sous argon et agitation le compos 11 910 mg 1 04 mmol et le 3 4 5 dim thoxy 2 nitroph nyl butan 2 ol 645 mg 2 53 mmol 2 4 qu sont dissous dans 7 mL de benz ne anhydre Dans un autre ballon anhydre sous argon et agitation la triphenylphosphine 1 23 g 4 68 mmol 4 5 qu et le DIAD 922 uL 4 68 4 5 qu sont dissous dans 8 mL de benzene distill Ce m lange est ensuite ajout dans le ballon contenant la coumarine NTA SEM et la cage La r action est laiss e une nuit temp rature ambiante Le brut est vapor sec et chromatographi sur gel de silice luant heptane ac tate d thyle 7 3 728 mg d un solide jaune sont r cup r s p 63 74 D veloppement d un fluorophore photoactivable RMN H CDCl3 8 0 02 s 27H Ht 0 96 t 6H Hs 1 26 1 75 m 15H Hf Hh Hm Hn et Ho 3 45 m 3H Hl et Hp 3 70 m 10H Hr et Hu 3 78 q 1H He 3 92 s 6H Ha et Hb 4 85 q 1H Hg 5 29 m 6H Hq 6 76 s 1H Hd 7 07 s 1H Hi 7 43 s 1H Hc 7 64 s 1H Hj 8 72 s 1H Hk La d protection s est faite par ajout de 4 quivalents de Bu NF en solution dans le THF apr s 2h 0 C la r action est laiss e une nuit a temp rature ambiante Le brut est vapor a sec Ensuite la purification par HPLC n a pas permis d obtenir le produit d sir En effet t
249. tiquet en N terminal est produit en relative abondance et a ainsi pu tre purifi comme pr c demment expliqu es cf section 1 A En revanche nous n avons pas pu produire notre construction du domaine F BAR malgr de nombreuses conditions test es Nos r sultats montrent dans la figure 39 que le domaine FCH de Bzz1p est capable de se lier a l acide phosphatidique la phosphatidylcholine et tous les phosphatidylinositols phosphoryl s Il est d ailleurs int ressant de noter que le domaine FCH de Bzz1p ne se lie pas au phosphatidylinositol non phosphoryl Ceci indique que la pr sence d au moins un phosphate est essentielle pour la liaison du domaine FCH un lipide B Localisation de Bzz1 GFP et les phosphoinositides Pour tudier de plus pres l interaction du domaine FCH de Bzzip avec les phospholipides nous avons alors observ la localisation de Bzz1 GFP Soulard et al 2002 dans des souches affect es dans la formation des phosphoinositides c est dire des souches o une kinase permettant la phosphorylation d un des phosphoinositides manque Au laboratoire nous disposons de souches dont les kinases Mss4p Fab1p et Vps34p sont inactives Le mutant mss4A n est pas capable de convertir le Pl 4 P en Pl 4 5 P la souche fab1A est d ficiente en Pl 3 5 P et la souche vps34A ne peut pas phosphoryler le phosphatidylinositol en PI 3 P Figure 40 Dans ces trois souches mutantes Bzz1 GFP est localis e dans des taches
250. transformation de 40 uL de cellules par de l ADN lt 100 ng est r alis e l aide d un appareil d lectroporation Gene pulser II de BioRad avec un voltage de 2 5 kV une r sistance de 200 Ohms et une capacit de 25 pF La constante de temps est alors de 4 5 a 5 ms Imm diatement apr s le choc lectrique 200 uL de milieu SOB ou LB froid sont ajout s aux cellules Elles sont alors agit es a 37 C pendant 30 min puis la suspension est tal e sur un milieu solide de s lection Les bo tes de P tri sont incub es une nuit 37 C 2 Pr paration d ADN Tous les plasmides utilis s ont t isol s l aide de colonne QIAGEN provenant du QlAprep Spin Miniprep Kit bas sur une lyse alcaline des cellules et une adsorption de VADN sur une membrane de silice en pr sence d une forte concentration de sels Le protocole suivi est celui d crit dans le manuel d utilisation du manufacturier ll Levures A Souches utilis es et g notype Les souches suivantes de la levure Saccharomyces cerevisiae ont t utilis es dans cette tude BY4742 MAT a his3A1 leu240 lys240 ura3 40 Les souches haplo des portant la d l tion d un g ne sont issues de l une des deux banques de souches obtenues lors du Saccharomyces Genome Deletion Project Winzeler et al 1999 Science 285 901 6 Cette banque comporte l ensemble des souches viables d l t es pour une ORF du g nome de Saccharomyces cerevisiae Le g ne d l
251. tructure and filament dynamics J Biol Chem 266 1 4 Carlier M F Le Clainche C Wiesner S and Pantaloni D 2003 Actin based motility from molecules to movement Bioessays 25 336 345 Carlier M F Nioche P Broutin L Hermite Boujemaa R Le Clainche C Egile C Garbay C Ducruix A Sansonetti P and Pantaloni D 2000 GRB2 links signaling to actin assembly by enhancing interaction of neural Wiskott Aldrich syndrome protein N WASp with actin related protein ARP2 3 complex J Biol Chem 275 21946 21952 173 R ferences bibliographiques Casamayor A and Snyder M 2002 Bud site selection and cell polarity in budding yeast Curr Opin Microbiol 5 179 186 Chang L Adams R D and Saltiel A R 2002 The TC10 interacting protein CIP4 2 is required for insulin stimulated Glut4 translocation in 3T3L1 adipocytes Proc Natl Acad Sci USA 99 12835 12840 Chant J and Herskowitz I 1991 Genetic control of bud site selection in yeast by a set of gene products that constitute a morphogenetic pathway Cell 65 1203 1212 Chapman S Oparka K J and Roberts A G 2005 New tools for in vivo fluorescence tagging Curr Opin Plant Biol 8 565 573 Chen l Howarth M Lin W and Ting A Y 2005 Site specific labeling of cell surface proteins with biophysical probes using biotin ligase Nat Methods 2 99 104 Chen l and Ting A Y 2005 Site specific labeling of proteins with s
252. tures de croissance 25 30 et 37 C Les r sultats r sum s dans le tableau 10 indiquent que les souches d pourvues des prot ines candidates sont capables de cro tre aussi bien que les cellules sauvages toutes les temp ratures de croissance test es Ainsi ces diff rentes d l tions n entrainent aucune thermo sensibilit sur milieu classique de croissance b Croissance sur milieux hyper osmotiques La sensibilit d un mutant une forte osmolarit extracellulaire est souvent le signe d un d faut de synth se ou d organisation de la paroi cellulaire l ment essentiel la pr servation de l int grit osmotique de la cellule Ce ph notype est souvent associ des mutations ou d l tions de g nes impliqu es dans la voie de signalisation HOG High Osmolarity Growth pour revue Saito et Tatebayashi 2004 ou dans l organisation du cytosquelette d actine Ainsi nous avons voulu d terminer si des conditions d hyper osmolarit pouvaient engendrer des d fauts de croissance des diff rents mutants Des tests en goutte ont donc t r alis s sur milieu YPD et SC contenant de fortes concentrations en chlorure de sodium 1 M ou sorbitol 1 8 M deux agents osmotiques importants Ces essais ont t r alis s diff rentes temp ratures 25 30 et 37 C afin de visualiser une ventuelle synergie d effet entre l osmolarit et la temp rature de croissance sur les mutants Dans les conditions te
253. u 19 Dans un ballon anhydre le compos 16 44 mg 67 36 mmol est dissous dans 2 mL de dichlorom thane anhydre et est refroidit a 0 C Puis sous argon et agitation la tri thylamine 11 3 uL 80 83 mmol 1 2 qu et le 5 4 uL 74 09 mmol 1 1 qu sont ajout s et la r action est laiss e 110 min a 0 C puis 1 h temp rature ambiante Le brut est vapor a sec puis redissous avec de l eau et la phase aqueuse est extraite 3 fois avec du dichlorom thane Les phases organiques sont rassembl es s ch es par du sulfate de sodium anhydre filtr es et vapor es sec Le produit obtenu est purifi sur colonne de silice luant heptane ac tate d thyle 1 1 37 mg d un solide jaune sont r cup r s p 87 RMN H CDCL 5 1 45 s 18H Hk 1 46 s 9H Hl 1 57 1 70 m 6H Hf Hg et Hh 2 42 s 3H Ha 3 33 t 1H Hi 3 42 3 56 m 6H He et Hj 7 26 s 1H Hb 7 77 6 1H Hc 8 82 s 1H Hd 78 D veloppement d un fluorophore photoactivable RMN C CDCI3 5 21 0 s CH3a 23 9 s CH g 28 5 et 28 6 2s CH tBu 29 6 s CHf 30 8 s CHzh 40 4 s CHze 54 1 s CH j 65 6 s CHi 81 0 et 81 5 2s C tBu 112 8 s CHb 124 8 s Cc C Cd 127 5 s Cd C CO 129 3 s CCl 133 5 s CHc 150 4 s CHd 153 6 s Cb C O 155 1 s CCl CO 158 7 s O CO C 160 9 s CO NH 168 0 s CH3 CO 0 171 0 et 172 7 s COO tBu T Ac C
254. uis formation de v sicules qui sont achemin es vers la vacuole Deux types d endocytoses peuvent tre distingu s l endocytose en phase fluide ou l internalisation des composants membranaires bulk membrane endocytosis et l internalisation par Vinterm diaire de r cepteurs membranaires ou autres transporteurs De nombreux marqueurs ont t d velopp s chez la levure pour tudier l endocytose un colorant neutre le Lucifer Yellow CH pour suivre l endocytose en phase fluide jusqu au lumen vacuolaire Dulic et al 1991 le colorant lipophile FM 4 64 Vida et Emr 1995 pour suivre les endosomes jusqu la membrane de la vacuole la ph romone facteur alpha radioactif pour l internalisation par l interm diaire de son r cepteur Ste2p Dulic et al 1991 ou l uracile radiomarqu pour suivre l internalisation du transporteur membranaire la perm ase a uracile Volland et al 1994 L utilisation de ces diff rents marqueurs a permis de mettre en vidence que de nombreux composants du cytosquelette d actine jouaient un r le dans l endocytose L tape d internalisation de l endocytose n cessite au minimum une cinquantaine de prot ines pour revues Goode et Rodal 2001 Winsor et Schiebel 1997 entre autres 138 Bzz1 GFP DIC bzz1A aiplA ycr076CA Figure 38 Localisation de Bzz1 GFP dans diff rentes souches mutantes et sauvage La souche sauvage est BY4742 Recherche de parte
255. une constante de dissociation de 25 pM Marks et al 2004b L quipe de Vogel a montr que des r cepteurs membranaires fusionn s avec des polyhistidines 6 10 pouvaient tre marqu s par des chromophores fonctionnalis s avec un motif acide nitrilotriac tique nickel Ni NTA Kd 0 2 10 uM Guignet et al 2004 En pratique l utilisation de liaison non covalente m ne une d t rioration du signal L quipe de Tsien a con u des compos s biarsenics fluorog niques FLASH capables de se lier un motif peptitique tetracyst ine Cys Cys Pro Gly Cys Cys Griffin et al 1998 2000 Ces sondes sont perm ables la membrane et deviennent fluorescentes apr s une liaison de forte affinit Kd 2 4 pM des thiols L interaction est assez forte pour tenir sur SDS PAGE De nombreuses am liorations des sondes chimiques ont t apport es afin d apporter un plus grand choix de sondes Adams et al 2002 Ces sondes ont t utilis es dans diff rents types de cellules cellules de mammif res Gaietta et al 2002 Ju et al 2004 Panchal et al 2003a drosophiles Poskanzer et al 2003 bact ries Ignatova et Gierasch 2004 et levures Rice et al 2001 Malgr toutes ces avanc es la m thodologie FlAsH a ses limites Les compos s biarsenics se fixent a des thiols isol s de nombreux lavages sont alors n cessaires pour liminer le bruit de fond d des interactions non sp cifiques m me si les
256. ur le compos 7 apr s activation de l acide carboxylique en ester de succinimide en pr sence de DCC et de DIEA afin de donner une fonction amide Berthelot et al 2005 Puis la cage ou l ac tate a pu tre coupl en position 7 sur le compos 7 Le compos 13 est obtenu par un couplage de Mitsunobu apr s activation du DIAD Diisopropyl azidocarboxylate par la triph nylphosphine Mitsunobu 1981 Specht et Goeldner 2004 La coumarine est ac tyl e avec de l anhydride ac tique Ensuite il a fallu d prot ger les trois acides en pr sence d ions fluorures pour obtenir le compos final Malheureusement cette tape nous avons rencontr de nouveaux probl mes de purification En effet la d protection n tait pas totale De plus pour le compos 12 une 49 w HOOC gg es H ON NH cooH b N e o ai Y Br COOH Y ar aa Pee SR 8 icone Cc HO O_O COOSEM a 20 poe y r N___COOSEM HN N __ COOSEM re es f COOSEM 1 COOSEM 10 Es O_O ur ___COOSEM eeu RS amp ee ss COOSEM OMe 13 HN N _ COOSEM COOSEM NO O 00 5 ao LN COOH ALL om Te eR ar OMe BN ee NEE COOH COOH Sch ma 11 Strat gie Cbz SEM a NaOH 2 M 2 h 0 C puis une nuit TA puis 2 h 50 C addition de HCl 1 M r 50 b DIEA DMF 1 h O C r 87 c H2 Pd C MeOH 24 h ATA r 98 d NHS DCC DIEA DMF 2 h 0 C r 20 e CH2CI2 une nuit TA r 80 f PPh3 DIAD benz ne une nuit TA
257. us gallus Hs Homo sapiens Mm1 Mus musculus Mm2 Macaca mulatta Nc Neurospora crassa champignon Oc Oryctolagus cuniculus lapin Om Oncorhynchus mykiss truite Pt Pan troglodytes chimpanz Rn Rattus norvegicus Sc Saccharomyces cerevisiae Sp Schizosaccharomyces pombe Spr Strongylocentrotus purpuratus oursin XI Xenopus laevis Xt Xenopus tropicalis Adapt e de Chitu et Stanley 2007 Recherche de partenaires de Bzz1p Panip Myo3p et Myo5p Les signaux provoquant cette transition ne sont pas connus mais il semblerait que les kinases Ark1p et Prk1p soient impliqu es Leur localisation au sein d une tache corticales se fait par une association directe avec Abp1p et Sla2p et elles phosphorylent Slaip et Panip et probablement d autres composants pour revue Smythe et Ayscough 2003 La phosphorylation de Panip par Prk1p inhibe sa capacit se lier l actine et d activer le complexe Arp2 3 Toshima et al 2005 Las17p est perdu avant Pan1p Kaksonen et al 2003 ce qui sugg re que Las17p et Pantp ont des r les diff rents dans l internalisation des v sicules De plus des mutations de Bbcip End3p Slaip et Sla2p montrent la formation de protrusions d actine Kaksonen et al 2005 sugg rant qu ils peuvent contribuer a la r gulation n gative de l assemblage de l actine a cette tape et ou promouvoir la lib ration des v sicules Ce processus requiert aussi les prot ines Myo3p Myo5p Rvs1
258. utefois certaines tudes r centes chez la levure tendraient montrer que l ATP serait responsable du d tachement des filaments Kovar 2006 D autres activateurs de Arp2 3 sont connus comme ActA une prot ine bact rienne utilis e par Listeria monocytogenes pour l infection de la cellule humaine la myosine dont on retrouve diff rents homologues chez les champignons et les levures ou encore la cortactine qui a la capacit de stabiliser 88 Verprobn homology WHVEVH1 Basic GTP binding Proline nch connecting region domain region domain domain WHZ acidic regon GRSGPXPPXP GRGSPXPPXP A O 39 9 237 t 257 t 430446 469 487 502 WIP cdc42 Btk Grb2 Actin Arp2 3 binding CIP4 Intersectin2 CrkL Neck Fyn PSTPIP1 WH wi N WASp O nyo EVHt BR GBD Proline Rich V CA wit Scar nool INAVE SH Proline Rich Vv CA Drosophila WH1 win WASp CA A y EVHt BR GB Proline Rich V CA C elegans Wet win WASp To 0 se EvH1 BR GBD Proline Rich V CA Dictyostelium WH1 wit WASp m A 8 8 EvHI BR GBD Proline Rich V CA S cerevisiae WH wm Beep ee Figure 18 Les prot ines de la famille WASP L ensemble des prot ines de cette famille est organis selon une structure modulaire similaire WH1 amp 2 domaine WASP Homology 1 amp 2 PRO r gion riche en r sidus proline GBD domaine de liaison aux GTPases GTPases Binding Domain BR R gion basique C r gion de liaison A domaine acide riche en acides aspart
259. utton J L Olson J M and Payne G S 2002 Slatp serves as the targeting signal recognition factor for NPFX 1 2 D mediated endocytosis J Cell Biol 157 315 326 Huckaba T M Gay A C Pantalena L F Yang H C and Pon L A 2004 Live cell imaging of the assembly disassembly and actin cable dependent movement of endosomes and actin patches in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae J Cell Biol 167 519 530 Humphries C L Balcer H I D Agostino J L Winsor B Drubin D G Barnes G Andrews B J and Goode B L 2002 Direct regulation of Arp2 3 complex activity and function by the actin binding protein coronin J Cell Biol 159 993 1004 Hussain N K Jenna S Glogauer M Quinn C C Wasiak S Guipponi M Antonarakis S E Kay B K Stossel T P Lamarche Vane N and McPherson P 178 R ferences bibliographiques S 2001 Endocytic protein intersectin l regulates actin assembly via Cdc42 and N WASP Nat Cell Biol 3 927 932 Icking A Matt S Opitz N Wiesenthal A Muller Esterl W and Schilling K 2005 NOSTRIN functions as a homotrimeric adaptor protein facilitating internalization of eNOS J Cell Sci 118 5059 5069 Ignatova Z and Gierasch L M 2004 Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real time fluorescent labeling Proc Natl Acad Sci U S A 101 523 528 lida K and Yahara I 1999 Cooperation of two actin binding pro
260. y J A and et al 1989 Synthesis photochemistry and biological activity of a caged photolabile acetylcholine receptor ligand Biochemistry 28 49 55 Millard T H Sharp S J and Machesky L M 2004 Signalling to actin assembly via the WASP Wiskott Aldrich syndrome protein family proteins and the Arp2 3 complex Biochem J 380 1 17 Miller L W and Cornish V W 2005 Selective chemical labeling of proteins in living cells Curr Opin Chem Biol 9 56 61 Mirey G Soulard A Orange C Friant S and Winsor B 2005 SH3 domain containing proteins and the actin cytoskeleton in yeast Biochem Soc Trans 33 1247 1249 Mitchison T J 1989 Polewards microtubule flux in the mitotic spindle evidence from photoactivation of fluorescence J Cell Biol 109 637 652 Mitchison T J Sawin K E and Theriot J A 1994 Caged fluorescent probes for monitoring cytoskeleton dynamics Vol 2 Academic Press New York Mitchison T J Sawin K E Theriot J A Gee K and Mallavarapu A 1998 Caged fluorescent probes Methods Enzymol 291 63 78 Mitsunobu O 1981 The Use of Diethylazodicarboxylate and Triphenylphosphine in Synthesis and Transformations of Natural Products Synthesis 1 1 28 Moreau V Galan J M Devilliers G Haguenauer Tsapis R and Winsor B 1997 The yeast actin related protein Arp2p is required for the internalization step of endocytosis Mol Biol Cell 8 1361 1375 182
261. z1p Ces exp riences sont en cours D apr s les r sultats obtenus avec le crible par la technique du Protoarray quatre prot ines interagissant avec l ubiquitine Uba1p Ubp15p Ubp7p et Doa1p ont t retrouv es Il semblerait donc que Bzz1p puisse tre ubiquitin e pour tre internaliser ou d grader sp cifiquement soit Bzz1p peut elle m me faire partie de la voie de signalisation menant l ubiquitination ou d ubiquitination d autres prot ines pour revue Dupre et al 2004 150 Recherche de partenaires de Bzz1p lll Spectrom trie de masse En collaboration avec G Ren et A Shevchenko nous avons r alis des GST pulldown et identifi les interactants par spectrom trie de masse Les domaines SH3 de Bzzip sont capables d interagir avec de nombreuses prot ines impliqu es dans le trafic membranaire en particulier les complexes COPI Ret1p Ret2p Sec 21p Sec 26p Sec27p et Sec 28p et COPII Sec23p et Sec31p Le complexe COPI est associ aux v sicules assurant le transport r trograde de prot ines entre les compartiments golgiens et du Golgi vers le r ticulum alors que le complexe COPII est impliqu dans le transport ant rograde des prot ines du r ticulum vers le compartiment interm diaire du Golgi Or Bzzip est principalement localis dans les taches corticales d actine a la membrane plasmique Soulard et al 2002 Cela sugg re soit que les interactions entre le premier domaine SH3 de

I. Le cytosquelette d`actine

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