Trousse HISTO SPOT Coeliac Disease
Contents
1. Ces all les servent de station d accueil aux auto anticorps de la maladie c liaque Page 2 sur 13 Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 Plus de 90 des personnes atteintes de la maladie c liaque portent l un de ces all les le DQ2 ou le DQ8 par rapport 25 dans la population globale Par cons quent la d tection en g n tique mol culaire des g notypes de HLA DQ2 et de HLA DQ8 est un outil extr mement utile pour le diagnostic de la maladie c liaque Quand un patient pr sentant un dysfonctionnement gastro intestinal ne dispose pas du marqueur DQ2 ou DQ8 on peut quasiment exclure la maladie c liaque 2 PRINCIPE DU TEST Le test est divis en quatre tapes de base Isolement de l ADN Amplification PCR Hybridation et d tection Interpr tation des donn es L isolement de l ADN est r alis sur l chantillon clinique par une m thode d isolement d ADN d finie au laboratoire ou avec une trousse commerciale L ADN est ensuite amplifi par une r action PCR sp cifique du locus en utilisant le m lange initial et la solution au MgCl fournis dans la trousse La sp cificit de l amplification est obtenue par un ensemble d amorces biotinyl es con ues pour amplifier uniquement le locus HLA retenu Apr s le processus d amplification PCR la plaque PCR contenant l amplicon marqu la biotine est transf r e au processeur Mr SPOT Le processeur MR SPOT ajo2. Toutefois le temps total n cessaire pour cette tape varie selon la vitesse de rampe du thermocycleur utilis Les mod les suivants de thermocycleurs ont t valid s avec le test HISTO SPOT SSO Applied Biosystems PE 9600 PE 9700 Veriti Biorad PTC 100 PTC 200 Mycycler Eppendorf Mastercycler EP Gradient S En cas d utilisation d autres thermocycleurs une validation doit tre effectu e par l utilisateur Une fois l tape d amplification termin e les chantillons peuvent tre analys s imm diatement ou conserv s entre 2 C et 8 C pendant un maximum de 5 jours 5 4 Hybridation amp D tection automatis es sur MR SPOT 5 4 1 Pr paration des r actifs n cessaires Sortir les r actifs et les cupules r actionnelles HISTO SPOT du r frig rateur et les laisser se r chauffer temp rature ambiante On peut observer des cristaux de sel dans le tampon d hybridation et dans la solution de lavage drastique Dans ce cas r chauffer les r actifs 30 C pour dissoudre les cristaux R chauffer tout le contenu du flacon et pas seulement un aliquot Le conjugu doit tre dilu au 1 1 666 dans du tampon de blocage La dilution du conjugu doit toujours tre pr par e fra chement pour chaque s rie de test Le conjugu doit tre m lang au vortex et centrifug chaque fois avant l tape de dilution Les volumes n cessaires de r actifs varient selon le nombre de barrettes utiliser Le
3. est pas install il peut l tre partir du CD livr avec le processeur MR SPOT et interpr ter les donn es selon la description dans le manuel du logiciel HISTO MATCH Page 8 sur 13 Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 6 PR CAUTIONS ET TRAITEMENT DES DECHETS Le test HISTO SPOT est con u pour une utilisation de diagnostic in vitro et il doit tre manipul par du personnel qualifi et form Toute la manipulation doit respecter les bonnes pratiques de laboratoire Les produits biologiques utilis s pour l extraction de l ADN par exemple le sang ou un tissu humain doivent tre manipul s comme des substances potentiellement infectieuses Il est recommand de respecter les pr cautions de s curit adapt es pour manipuler les produits biologiques ne pas pipeter la bouche utiliser des gants jetables pour manipuler les produits biologiques et r aliser le test se d sinfecter les mains une fois le test termin Les produits biologiques doivent tre inactiv s avant leur limination p ex dans un autoclave Les produits jetables doivent tre autoclav s ou incin r s apr s usage Un renversement de produits potentiellement infectieux doit tre ramass imm diatement avec du papier absorbant et les zones contamin es doivent tre nettoy es avec un d sinfectant standard adapt ou avec de l alcool 70 Les mat riels utilis s pour nettoyer les renversements y co
4. processeur MR SPOT affiche les volumes n cessaires pour le nombre de barrettes choisi Remplir les volumes n cessaires de r actifs dans les flacons tiquet s correspondants Page 7 sur 13 Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 Placer les cupules r actionnelles et la plaque PCR sur les portoirs respective du processeur Mr SPOT Respecter la bonne orientation de la plaque PCR Les barrettes de test peuvent tre scind es en puits unitaires selon la figure 1 si le nombre de tests r aliser est inf rieur 8 Scinder les cupules r actionnelles en les cassant angle droit les extr mit s avec le pouce Ne pas casser les cupules r actionnelles en les pliant vers le haut ou vers le bas et ne pas tordre les puits Fiqure 1 s paration des cupules r actionnelles unitaires 5 4 2 D marrage du processeur MR SPOT Mettre le processeur MR SPOT sous tension L cran de d marrage s affiche R aliser les op rations en suivant les indications l cran Les d tails sont d crits dans le manuel utilisateur du processeur MR SPOTS 5 4 3 Transfert des images sur un PC pour l interpr tation Transf rer les donn es au logiciel HISTO MATCH par l interm diaire du r seau ou d une cl USB selon la description dans le manuel du logiciel HISTO MATCH 5 4 4 Interpr tation des images l aide du logiciel HISTO MATCH Ouvrir le logiciel HISTO MATCH si celui ci n
5. Pr paration des r actifs n cessaires 7 5 4 2 D marrage du processeur MR SPOT een 8 5 4 3 Transfert des images sur un PC pour l interpr tation 8 5 4 4 Interpr tation des images l aide du logiciel HISTO MATCH 8 6 PR CAUTIONS ET TRAITEMENT DES D CHETS 9 7 CARACT RISTIQUES ET PERFORMANCES man 10 7 1 Evaluation des performances ss 10 7 2 Amplitications par POP unes nee mens 10 7 3 R solution de IAB HNIQUS ss nie ten 10 8 LIMITES DE LA M THODE rinnreneerrenensnrnenensnrnenensnnnenennennenennennerenns 10 9 CONTR LE QUALIT INTERNE ennemie ne enr 11 10 GESTION DES INCIDENTS en 12 11 MARQUES COMMERCIALES UTILIS ES 12 12 EXPLICATION DES SYMBOLES U ILIS S seeeeeeeieeeeeeesrererrsrtsresresrerrerrsrrsrenrerrerrerns 13 Distribu en Belgique en France et au Luxembourg par m diane diagnostics Z A de la Cha ne 78370 PLAISIR 33 1 30 07 50 60 info mediane diag fr BAG Health Care GmbH Auftragsannahme Ordering Customer Service Amtsgerichtsstra e 1 5 Tel 49 0 6404 925 0 www bag healthcare com Tel 49 0 6404 925 450 Tel 49 0 6404 925 125 35423 Lich Germany Fax 49 0 6404 925 250 info bag healthcare com Fax 49 0 6404 925 460 Fax 49 0 6404 925 421 verkauf bag healthcare com service bag healthcare com Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 1 DESCRIPTION DU PRODUIT La trousse HISTO SPOT Coeliac Disease est un test de diagnost
6. actifs sont renvers s les diluer avec de l eau avant de les ponger Ne pas exposer le substrat aux m taux ni aux agents oxydants L limination de tous les chantillons des r actifs non utilis s et des d chets doit respecter les r glementations nationales r gionales et locales viter la contamination microbienne des r actifs au moment de pr lever un aliquot dans les flacons L utilisation de pipettes et de pointes de pipettes st riles jetables est recommand e Ne pas utiliser de r actifs pr sentant une turbidit ou une contamination microbienne apparentes Page 9 sur 13 Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 Les Fiches de Donn es de S curit FDS peuvent tre t l charg es l adresse www bag healthcare com 7 CARACT RISTIQUES ET PERFORMANCES 7 1 valuation des performances Chaque trousse HISTO SPOT SSO a fait l objet d valuation avec des chantillons d ADN de typage connu Les r sultats ont t compar s ceux d autres m thodes de typage p ex SSP s quen age Aucune discordance n a t observ e entre les m thodes de typage Pour chaque lot la sp cificit de chaque sonde a t v rifi e avec l ADN d chantillons de r f rence 7 2 Amplification par PCR Les all les amplifi s par la trousse HISTO SPOT Coeliac Disease la version de la nomenclature HLA et les exons amplifi s sont indiqu s avec les informations sp cifiques du lot c
7. sur le PC de l utilisateur Le programme d analyse d image du logiciel HISTO MATCH d termine l intensit de chaque spot de la biopuce et la compare l intensit du fond partir de ces donn es les r actions positives et n gatives sont d termin es Le programme de Page 3 sur 13 Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 correspondance de sch ma du logiciel HISTO MATCH d termine le type HLA de l chantillon en fonction du sch ma d hybridation sp cifique 3 MAT RIEL 3 1 R actifs fournis avec la trousse HISTO SPOT Coeliac Disease Les r actifs d une trousse sont en quantit suffisante pour r aliser 48 tests Chaque trousse de r actifs contient les l ments suivants Mestwells I Coeliac Cupules r actionnelles emball es 6 barrettes individuellement chaque barrette contenant 8 tests contient des sondes immobilis es d oligonucl otides sp cifiques de s quence Mastermix Coeliaq M lange initial pr t l emploi contient des 650 ul amorces biotinyl es dNTP Taq polym rase tampon de r action 0 05 d azide de sodium MgcI2 Chlorure de magn sium 6 mM pr t l emploi 600 ul contient 0 001 de Proclin 300 Chaque trousse est livr e avec un CD comportant le fichier de sous lot relatif aux sondes pr sentes sur les biopuces qui doit tre enregistr dans la base de donn es du logiciel d interpr tation HISTO MATCH s il s agit
8. 1 de ProClin 150 SUBS Substrat BCIP NBT pr t l emploi 5 bromo 36 ml 4 chloro 3 indolyl phosphate chlorure de nitrobleu de t trazolium CONJ Conjugu marqu la streptavidine et la 40 ul phosphatase alcaline concentr contient lt 0 1 d azide de sodium diluer au 1 1666 dans du tampon de blocage 3 3 R actifs et quipements n cessaires mais non fournis Processeur MR SPOT avec le logiciel HISTO MATCH R F 726100 Pointes de pipette pour le processeur MR SPOT 1 000 uL R F 726099 et 200 uL R F 726097 R actifs d extraction de l ADN pas de m thode de relargage salting out Plaques PCR jupe avec couvercles ou film adh sif plaques PCR HISTO SPOT R F 726095 bouchons PCR HISTO SPOT R F 726090 feuilles PCR HISTO SPOT R F 726089 Thermocycleur Eau d sionis e Pipettes volume variable gamme 0 5 1 000 pl et pointes jetables 4 CONSERVATION ET STABILIT Tous les r actifs et composants des trousses doivent tre conserv s entre 2 C et 8 C La date de p remption est indiqu e sur l tiquette de chaque r actif Elle est valable pour les r actifs non entam s La date de p remption indiqu e sur l tiquette externe correspond au r actif de la trousse ayant la validit la plus courte Il est possible d entamer des barrettes individuelles de 8 puits de d ta
9. O BAG eam care E E Notice utilisateur Trousse HISTO SPOT Coeliac Disease Trousses de test pour le typage des all les HLA associ s la maladie c liaque par m thode de g n tique mol culaire 48 typages CE Evo Lire attentivement les instructions figurant dans le manuel d utilisation du ou des syst me s et sur les tiquetages et ou dans la notice d utilisation du r actif R F 726071 HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 R F 726098 HISTO SPOT Reagent kit Table des mati res 1 DESCRIPTION DU PRODUI SSSR ee E 2 1 1 Introduction et CONMOXIS 3 ds tinnsssantnnsenetanasossande a nE EESK NS Esri EEP Edesse 2 2 PRINCIPE DU TES Taire een en ss teen cime mes 3 3 MATERIEL onie da n 4 3 1 R actifs fournis avec la trousse HISTO SPOT Coeliac Disease s s snnisisisie1riinee1s1e1nn 4 3 2 R actifs fournis avec la trousse HISTO SPOT Reagent Kit 4 3 3 R actifs et quipements n cessaires mais non fournis eeeeeeeeeeeeeeeerereererrerrrrrrnrnrnrereee 5 4 CONSERVATION ET STABILIT nine 5 5 PROTOCOLE Sn eee a an tee tee ee 5 5 1 Pr cautions et recommandations sieste ennnen nennen ennnen ennnen 5 52 Isolement d ADN a tan 6 5 3 Amplification de PADN 58e surnideridestnhese tonne enter p nis ons te R rrere seen ee tpenqeass 6 5 4 Hybridation amp D tection automatis es sur MR SPOT a sessseeseiseieerrerrereeirerrererrrrerrerrenrnn 7 5 4 1
10. cher les cupules n cessaires pour une s rie et de remettre les cupules restantes dans le sachet d emballage ouvert pour tre utilis es ult rieurement avec la trousse Les cupules r actionnelles conserv es dans des sachets ouverts doivent tre utilis es dans les 30 jours suivant l ouverture Les autres r actifs ouverts doivent tre utilis s dans les 3 mois La dilution du conjugu doit toujours tre pr par e fra chement pour chaque s rie de test 5 PROTOCOLE 5 1 Pr cautions et recommandations Les techniques de g n tique mol culaire sont des m thodes particuli rement sensibles qui doivent tre r alis es par du personnel bien form ayant l exp rience des techniques de g n tique mol culaire et des tests d histocompatibilit Les r sultats de ces tests ne doivent pas tre utilis s comme seul d terminant pour prendre des d cisions cliniques Page 5 sur 13 Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 Les directives de transplantation ainsi que les normes EFI doivent tre respect es de mani re r duire le risque de typages erron s dans le cas particulier des discordances entre les m thodes de s rologie et de g n tique mol culaire Des conditions particuli res de s curit doivent tre respect es pour viter la contamination et donc les fausses r actions Porter des gants pour manipuler sans poudre si possible Utiliser de nouveaux embouts chaque ta
11. d un nouveau lot trousse pour le laboratoire N B pour obtenir des d tails consulter le mode d emploi du logiciel HISTO MATCH Chaque trousse est compos e de lots et de sous lots e Trousse par ex HISTO SPOT Coeliac Disease d finit le test e Lot par ex CDO06 CDO007 d finit la disposition et la sp cificit des sondes contenues dans la trousse Un m me lot peut comporter plusieurs sous lots e Sous lot par ex CD006 1 CD006 2 CD006 3 d finit comment une sonde r agit par rapport aux sondes de contr le valeurs seuil et pr cise leurs dates de fabrication et de p remption 3 2 R actifs fournis avec la trousse HISTO SPOT Reagent Kit Les r actifs d une trousse sont en quantit suffisante pour r aliser 96 tests Chaque trousse de r actifs contient les l ments suivants BLOCKBUF Tampon de blocage pr t l emploi contient 80 ml 0 001 de ProClin 150 HYBBUF Tampon d hybridation pr t l emploi contient 40 ml 0 001 de colorant 0 1 de dod cylsulfate de sodium 0 001 de ProClin 150 STRGWASH Tampon de lavage drastique pr t l emploi 100 ml contient 0 001 de colorant 0 1 de dod cylsulfate de sodium 0 001 de ProClin 150 Page 4 sur 13 Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 TBSWASH Tampon de lavage TBS Tris Buffered Saline 100 ml pr t l emploi contient 20 mM de Tris 0 003 de colorants 0 00
12. eur MR SPOT doivent tre talonn s conform ment aux instructions des fabricants Page 10 sur 13 Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 L exactitude et l uniformit de temp rature des thermocycleurs peuvent tre test es p ex avec le test BAG CyclerCheck R F 7104 9 CONTR LE QUALIT INTERNE Le contr le qualit interne des nouveaux lots de la trousse HISTO SPOT Coeliac Disease peut tre r alis avec une association d chantillons d ADN de type HLA connu Chaque cupule r actionnelle contient des contr les positifs internes pour v rifier la r ussite de l amplification et de l hybridation Il est recommand d utiliser des contr les n gatifs pour d tecter d ventuelles contaminations Utiliser une r action PCR sans ADN dans l hybridation comme contr le n gatif Page 11 sur 13 Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 10 GESTION DES INCIDENTS Sympt me Probl me s possible s Solution s ventuelle s Dysfonctionnement de l instrument Nombreux Consulter le manuel utilisateur du processeur MR SPOT Message d erreur au transfert de donn es Erreur de transfert des donn es Transf rer les donn es manuellement avec une cl USB Pas de r sultat Erreur sur l image quadtrill e R aliser manuellement le quadrillage Aucun spot dans le puits M lange initial non a
13. ic in vitro pour le typage par m thode de g n tique mol culaire des all les HLA associ s la maladie c liaque Les r sultats de typage ont une r solution moyenne lev e Le processeur HISTO SPOT SSO est compos des trousses de typage HISTO SPOT de la trousse de r actifs HISTO SPOT Reagent Kit du processeur MR SPOT et du logiciel d interpr tation HISTO MATCH Les trousses de typage HISTO SPOT contiennent tous les composants n cessaires la r action PCR ainsi que les cupules r actionnelles de d tection des produits PCR contenant des sondes immobilis es d oligonucl otides sp cifiques de s quence La trousse de r actifs HISTO SPOT Reagent Kit contient tous les r actifs n cessaires l hybridation et la d tection Elle peut tre utilis e en association avec toutes les trousses de typage HISTO SPOT Le processeur MR SPOT est sp cialement con u pour tre utilis avec les trousses HISTO SPOT et traite entre 1 et 96 chantillons Il automatise l analyse depuis l hybridation et la d tection jusqu l interpr tation des r sultats Le logiciel HISTO MATCH est n cessaire l interpr tation des r sultats 1 1 Introduction et contexte La maladie c liaque MC est un trouble g n tique qui touche les enfants et les adultes des deux sexes Elle peut apparaitre tout ge depuis l enfance d s que les c r ales sont introduites dans l alimentation jusqu un ge avanc m me si
14. illon amplifier ajouter les r actifs suivants chaque tube PCR 10 pL M lange initial 5 pL MgCh 5 uL chantillon d ADN 15 30 ng L Le volume total de chaque r action d amplification est de 20 uL Pr m lange initial pour plusieurs chantillons Nb d chantillons 2 x 10 uL m lange initial utiliser 15 pL de pr m lange initial Nb d chantillons 2 x 5 pL MgCl par chantillon Remarque il est important que la concentration en ADN soit comprise entre 15 et 30 ng uL Des concentrations plus lev es peuvent conduire des r actions de sondes faussement positives et des concentrations plus faibles peuvent entra ner des checs d amplification Pour r aliser un Contr le n gatif pr parer une r action PCR avec de l eau distill e la place de l ADN chantillon Page 6 sur 13 Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 Sceller les tubes d amplification avec des couvercles ou un film adh sif et centrifuger bri vement le liquide Les placer dans le thermocycleur et amplifier sous les conditions suivantes tape de programme Dur e Temp rature Nb de cycles Premi re d naturation 2 min 96 1 cycle D naturation 15 sec 96 10 cycles Hybridation extension 60 sec 65 D naturation 10 sec 96 20 cycles Hybridation 50 sec 61 Extension 30 sec 72 Attente Hold co 22 Les conditions sont identiques pour tous les thermocycleurs
15. jout la PCR Recommencer toute l analyse et v rifier le produit PCR sur gel Seuls les spots de contr le sont positifs ADN non ajout la PCR ou erreur d amplification Recommencer toute l analyse et v rifier le produit PCR sur gel Sondes faussement positives Utilisation d une quantit d ADN trop importante ou conjugu trop concentr non centrifug V rifier la concentration en ADN Centrifuger le conjugu avant utilisation Absence d amplification de lexon Concentration en ADN trop lev e ou ADN d grad V rifier la concentration en ADN tester l ADN sur gel Aucun r sultat ou r sultat non concluant en raison de signaux faibles Erreur de dilution du conjugu ou amplification faible Dysfonctionnement de l instrument Recommencer l analyse V rifier la temp rature d hybridation sur l instrument 11 MARQUES COMMERCIALES UTILIS ES ProClin est une marque commerciale de Rohm amp Haas BCIP est une marque commerciale de Sigma Aldrich Co Page 12 sur 13 Notice d utilisation HISTO SPOT Coeliac Disease Version 1 2012 12 EXPLICATION DES SYMBOLES UTILIS S IVD Pour usage de diagnostic in vitro Temp rature de conservation LOT N de lot T Utiliser avant REF Code produit BA Consulter la Notice utilisateur Destin au Typage HLA Mastermix Coeliac M lange initia
16. l pour lamplification des loci sp cifiques estwells Coeliac Cupules r actionnelles avec des sondes fix es pour typer les all les sp cifiques du risque de d clarer une maladie c liaque a N Solution de chlorure de magn sium BLOCKBUF Tampon de blocage Tampon d hybridation STRGWASH Solution de lavage drastique Tampon TBS Tris buffered saline SUBS Substrat CONJ Conjugu Streptavidine marqu e la phosphatase alcaline Pour les notices d utilisation en d autres langues consulter http www ba healthcare com en Diagnostika Downloads Page 13 sur 13
17. la personne consommait r guli rement des c r ales Les patients atteints de MC ne doivent pas manger d aliments contenant du gluten un compos pr sent dans le bl le seigle l orge et d autres c r ales En effet le gluten d clenche chez eux une r action auto immune qui entra ne la destruction des villosit s dans l intestin gr le Les patients produisent des anticorps qui touchent l intestin entra nant des l sions et une pathologie p ex fatigue carence alimentaire L apparition de la maladie semble n cessiter deux composants une pr disposition g n tique et un d clencheur Le d clencheur peut tre de type environnemental comme une surexposition au bl li une situation stress s v re physique comme une grossesse ou une intervention chirurgicale ou pathologique infection virale Il existe des preuves nettes en faveur d une tendance familiale de la maladie c liaque En effet 5 10 des parents au premier degr parents enfants fr res et s urs des personnes atteintes de MC peuvent d velopper la maladie Par cons quent il est important de poser rapidement un diagnostic fiable pour mettre en place un traitement pr coce Comme indiqu ci dessus la MC survient uniquement chez des personnes pr sentant une pr disposition g n tique Le patrimoine g n tique de la maladie c liaque est fortement associ au g notype HLA DQA1 05 DQB1 02 HLA DQ2 et g notype HLA DQA1 03 DQB1 0302 HLA DQ8
18. mpris les gants doivent tre inactiv s avant leur limination p ex dans un autoclave Le tampon de blocage le tampon d hybridation le tampon de lavage drastique et le tampon de lavage TBS contiennent du ProClin 150 et la solution de chlorure de magn sium contient du ProClin 300 La concentration en conservateur dans les r actifs est seulement de 0 001 viter toutefois le contact avec la peau et les membranes muqueuses Le m lange initial et le conjugu contiennent de l azide de sodium comme conservateur Les r actifs contiennent une concentration lt 0 1 d azide de sodium qui n est pas consid r e comme dangereuse Toutefois viter le contact avec la peau et les membranes muqueuses L azide de sodium peut r agir avec les tuyauteries de plomb et de cuivre et former des azides m talliques explosifs Au moment d liminer les solutions contenant de l azide de sodium dans les viers de laboratoire rincer les tuyauteries avec de grandes quantit s d eau pour viter l accumulation d azide Toute la manipulation avec les r actifs doit tre r alis e en respectant les pr cautions adapt es Porter une protection oculaire une blouse de laboratoire et des gants jetables pour manipuler les r actifs viter le contact de ces produits avec la peau les yeux et les membranes muqueuses En cas de contact rincer imm diatement avec une grande quantit d eau Sinon une br lure pourrait se produire Si des r
19. oncern Ces informations sont rassembl es sur un CD fourni avec chaque trousse 7 3 R solution de la technique La trousse HISTO SPOT Coeliac Disease est con ue pour fournir des r sultats sans ambigu t sur les all les HLA associ s la maladie c liaque Des associations d all les diff rentes qui recoupent les groupes d all le mais qui pr sentent le m me sch ma de sonde positive sont consid r es comme ambigu s 8 LIMITES DE LA M THODE En raison de la grande sensibilit de l analyse par PCR aux variations de concentration et de qualit de l ADN seuls des chantillons d ADN avec une concentration comprise entre 15 et 30 ng ul et un indice de puret rapport DO 6 DO2s0 compris entre 1 5 et 2 0 doivent tre utilis s Un soin particulier doit tre pris pour viter la contamination des r actifs de la trousse et des autres produits et quipements de laboratoire avec des amplicons ou de l ADN Il est fortement recommand de r aliser r guli rement des tests de contamination p ex BAG Wipetest R F 7091 et d utiliser des contr les n gatifs dans chaque s rie d analyse L hybridation est un proc d tr s sensible la temp rature De ce fait les trousses HISTO SPOT SSO ne doivent tre utilis es qu en association avec le processeur MR SPOT pour assurer des temp ratures et temps d incubation corrects Tous les instruments p ex pipettes thermocycleurs blocs chauffants process
20. pe de pipetage avec un filtre int gr Utiliser des zones de travail s par es pour les t ches avant l amplification isolement de l ADN et pr paration des r actions et apr s l amplification hybridation et d tection De pr f rence utiliser deux pi ces diff rentes Les amplicons ne doivent pas tre ramen s dans la zone de pr paration de la PCR Utiliser les dispositifs et autres mat riels uniquement leur place respective et ne pas les changer 5 2 Isolement de l ADN Pr parer l ADN chantillon par la m thode habituelle du laboratoire d isolement de l ADN utilis e avec la PCR de pr f rence pas de m thode de relargage La pr sence d h parine peut inhiber la PCR De ce fait il est recommand d utiliser du sang recueilli sur EDTA ou sur citrate pour le typage L ADN de l chantillon doit avoir une concentration comprise entre 15 et 30 ng L et un indice de puret rapport DO69 DO2s0 Compris entre 1 5 et 2 0 Des valeurs plus lev es sont le signe de la pr sence d ARN des valeurs plus faibles celui d une contamination par des prot ines 5 3 Amplification de l ADN Utiliser des plaques PCR jupe pour l amplification car elles doivent ensuite tre maintenues au niveau de la jupe par un collier dans le processeur Mr SPOT Les plaques PCR HISTO SPOT ont t valid es pour cette application Les plaques d autres fournisseurs doivent tre valid es par l utilisateur Pour chaque chant
21. ute le tampon d hybridation chaque puits et transf re chaque m lange amplicon tampon d hybridation dans une cupule r actionnelle contenant une biopuce de sondes immobilis es d oligonucl otides sp cifiques de s quence SSO sequence specific oligonucleotide Ces sondes sont soit de simples sondes d oligonucl otides soit une association d au moins 2sondes individuelles immobilis es dans le m me spot sonde mosa que con ues pour am liorer l identification des polymorphismes situ s en cis L amplicon marqu la biotine se fixe aux sondes SSO qui contiennent une s quence cible compl mentaire et il peut ensuite tre d tect par r action colorim trique Pour viter la fixation non sp cifique de l amplicon la surface des cupules r actionnelles le syst me MR SPOT bloque les puits avec du tampon de blocage avant de transf rer l amplicon Apr s une tape de lavage drastique pour liminer tout l amplicon non fix un conjugu marqu la streptavidine et la phosphatase alcaline est ajout aux cupules et se fixe sur les amplicons marqu s la biotine captur s par la sonde SSO Suite des tapes suppl mentaires de lavage le substrat de BCIP NBT est ajout et produit une coloration bleu violet quand il est converti par la phosphatase alcaline Les points color s r sultants au fond de chaque cupule r actionnelle sont photographi s par MR SPOTS et l image est transmise au logiciel HISTO MATCH install
Download Pdf Manuals
Related Search