Culture des mycobactéries
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1. 4 semaines Le t moin n gatif est r alis par un tube MGIT non ensemenc Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 9 22 Culture des mycobact ries Rev A NB Le t moin positif peut tre galement pr par en ensemen ant un tube MGIT avec un bacille Gram n gatif type E coli gt Lecture des tubes Le tube MGIT doit tre retir du support et compar aux tubes t moins Placer les tubes sous la lampe UV entre un tube t moin positif et un tube t moin n gatif Eviter de lire les tubes dans une pi ce ensoleill e ou sous une lumi re vive Rechercher les tubes MGIT mettant une fluorescence La fluorescence se caract rise par une couleur orange vif dans le fond du tube et une r flexion orange sur le m nisque de la surface Si la fluorescence du tube MGIT se rapproche de celle du tube t moin positif la culture est positive Si elle se rapproche de celle du tube t moin n gatif la culture est n gative La croissance peut aussi tre d tect e par la pr sence d une turbidit homog ne ou non de petits grains ou de flocons dans le milieu de culture Une coloration de Ziehl Neelsen doit tre faite sur les cultures positives pour contr ler la pr sence de bacilles acido alcoolo r sistants En cas de frottis n gatif rechercher une ventuelle contamination bact rienne par une coloration de Gram Il faut rechercher l apparition d une fluorescence des tubes pendant huit semaines avant de d cla2. Tout flacon donnant un index de croissance gt 20 ne devra pas tre utilis 1 Pr l vements ayant subi une d contamination Il s agit de pr l vement initialement contamin s pour lesquels on compl te l effet de la d contamination en r alisant la culture en pr sence d un m lange antibiotique susceptible d inhiber la croissance des bact ries ind sirables sans perturber la culture des mycobact ries Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 5 22 Culture des mycobact ries Rev A Reconstituer le suppl ment PANTA avec 5 ml de solution de reconstitution PRF Il est possible d ajouter ce suppl ment de la Vancomycine Lilly une concentration finale variable de 1 4 ug ml selon les sites PANTAV Apr s reconstitution ce suppl ment peut tre conserv 4 C au maximum pendant une semaine Ajouter 0 1 ml de ce m lange PANTA ou PANTAV chaque flacon 12B avant l ensemencement Ce suppl ment peut tre ajout 2 3 jours l avance condition que les flacons soient conserv s 4 C 2 Pr l vements non contamin s Les pr l vements aseptiques doivent tre ensemenc s sans d contamination pr alable directement en milieu 12B sans addition de PANTA II est n cessaire d ajouter 0 1 ml de PRF seul solution de reconstitution du PANTA qui contient du st arate de polyoxy thyl ne POES pour favoriser la croissance des mycobact ries gt Ensemencement des flacons Ensem
3. compl ment d antibiotiques reconstitu 3 Pr l vements non contamin s Avant l inoculation ajouter aseptiquement dans chaque flacon 0 5 ml de solution de reconstitution Une coloration rose du milieu indique que le compl ment ou la solution de reconstitution ont t ajout s correctement gt Ensemencement des flacons Ensemencer aseptiquement 0 5 ml de culot MO MYC 002 Il est recommand de proc der parall lement l inoculation d un tube de L wenstein Jensen Incuber 37 C pendant 8 semaines gt Observation des cultures Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 11 22 Culture des mycobact ries Rev A Introduire les flacons MB Bact T inocul s dans le MB Bact T selon les instructions figurant dans le manuel d utilisation Sur les flacons jug s positifs faire la coloration de Ziehl Neelsen pour observer la pr sence de bacilles acido alcoolo r sistants et suivre la proc dure habituelle d identification Si la coloration de Gram r v le la pr sence d autres germes que des mycobact ries demander si possible un nouveau pr l vement sinon la totalit du contenu du flacon peut tre soumise apr s centrifugation une nouvelle d contamination cf MO MYC 002 Apr s 42 jours de s jour dans l appareil tout flacon qui ne montre aucun trouble ni aucune manifestation de culture est d clar n gatif Si le contenu du flacon est trouble pr lever un chantillon pour repiqu
4. ou l autoclave 85 C pendant 45 minutes 2 Milieu de Coletsos Dissoudre 33 4 g de base d shydrat e dans 600 ml d eau distill e froide contenant 12 ml de glyc rol pour bact riologie M langer jusqu obtention d une suspension homog ne Chauffer lentement en agitant constamment puis porter bullition pendant 2 minutes St riliser l autoclave 121 C pendant 15 minutes Pr parer st rilement 800 ml d oeufs frais entiers et 200 ml de jaunes seuls voir pr paration des oeufs pour milieu de L wenstein Jensen M langer aseptiquement et parfaitement les 600 ml de base st rile et refroidie aux environs de 45 60 C et l ensemble des oeufs en vitant d inclure des bulles d air R partir st rilement le milieu complet en tubes st riles de pr f rence bouch s VIS Coaguler en position inclin e au coagulateur trou l tuve ou l autoclave 85 C pendant 45 minutes 3 Milieux de L wenstein Jensen enrichis 1 Avec du pyruvate de sodium partir de milieu d shydrat Pr paration de 100 tubes de milieu de L wenstein Jensen enrichi avec 0 2 de pyruvate de sodium mettre st rilement dans un Erlenmeyer 600 ml de milieu de L wenstein Jensen avant coagulation Ajouter st rilement 6 ml de Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 20 22 Culture des mycobact ries Rev A pyruvate de Na 20 ampoules de 5 ml Institut Pasteur r f 62535 conser
5. 0 32 C Milieu de L wenstein Jensen enrichi en mycobactine pour isoler certains M avium d ficients Ensemencer un milieu liquide pour la recherche de M genavense Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 4 22 Culture des mycobact ries Rev A B Culture en milieu liquide 1 Technique radiom trique Bactec 460 TB Becton Dickinson a Principe La m thode de respirom trie radiom trique Bactec consiste appr cier la croissance des mycobact ries en mesurant la quantit de 14CO5 lib r e par le m tabolisme de l acide palmitique marqu au 4C pr sent dans le milieu de culture 7H12 L appareil Bactec s permet de mesurer la quantit de CO dans l atmosph re gazeuse du flacon et de l exprimer selon une graduation appel e GI Growth Index allant de O absence de 4CO2 999 correspondant la quantit maximale de croissance d celable par l automate b Technique Toutes les inoculations dans le flacon 12B sont faites la seringue insuline Plastipak 1 ml Sub Q Becton Dickinson r f 305501 Avant et apr s chaque manipulation les opercules des flacons sont d contamin s avec un d sinfectant mycobact ricide cf PR HS 001 gt Pr paration des flacons Avant l ensemencement l atmosph re des flacons 12B doit tre standardis e par administration d un m lange gazeux convenable Ceci peut tre effectu une fois par semaine pour les flacons qui seraient utilis s pendant la semaine
6. 22 73 20 ml pour 180 ml de base sont ajout s 56 C avant g lification du milieu Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 21 22 Culture des mycobact ries Rev A B CULTURES EN MILIEU LIQUIDE hormis h mocultures 1 Technique radiom trique Bactec 460 TB Becton Dickinson D signation du produit Conditionnement Bactec 12B milieu Middlebrook 7H12 pour isolement100 flacons 4402004 des mycobact ries dans des pr l vements autres que le 14 sang avec substrat C Bactec PANTA PLUS additif d antibiotiques D5Otests 4404764 livraison apr s avis favorable de la CIREA NB Pour les r f rences concernant le mat riel consommable et la maintenance du TB 460 consulter la notice du fabricant 2 Technique de fluorescence manuelle BBL amp MGIT Becton Dickinson D signation du produit Conditionnement Tubes MGIT BBL Middlebrook 7H9 modifi 25 tubes 4345111 Tubes MGIT BBL Middlebrook 7H9 modifi 100 tubes 4345113 MGIT OADC BBL 15 ml de suppl md 6 ampoules 4345116 d enrichissement MGIT PANTA BBL pour 150 tests 6 ampoules 4345114 Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 22 22 Culture des mycobact ries Rev A 3 Syst me MB BactT Organon Teknika D signation du produit Conditionnement Flacons de culture MB BacT 100 flacons 59591 Kit de d contamination MB BacT 100 tests 5 flacons kit compl ment d antibiotiques MB Bac
7. Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 1 22 Culture des mycobact ries Rev A Nature de la modification Cr ation SOMMAIRE TODE quai ma o nt neue 2 E Redes mo sadio a en nn NL RS Res VON Ra ap RO A ne 2 M M thodolo fie sas ssa tel edit ara ra rendent 2 IN Annexes ist RS re a M cet I da 15 R dig par Approuv par Date Pour application le Signature Signature Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 2 22 Culture des mycobact ries Rev A I Objet Ce document a pour objet de d tailler les modalit s de la mise en culture des mycobact ries et l interpr tation des r sultats de la culture II R actifs Les modalit s de la pr paration des milieux de culture et des r actifs pour chacune des m thodes d crites se trouvent en annexe du document HI M thodologie Trois modalit s de culture des mycobact ries peuvent tre utilis s Milieu de L wenstein Jensen Culture en Milieu de L wenstein Jensen 0 2 de pyruvate de sodium milieu Milieu de Coletsos solide Milieu de Middlebrook 7H11 Milieu de Middlebrook 7H9 Culture en o k milieu Milieu Bactec 460 TB liquide Milieu BBL MGIT Milieu MB Bact T Culture en TM milieu Milieu BBL Septi Check AFB diphasique Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 3 22 Culture des mycobact ries Rev A A Culture en milieu solide 1 Ensemencement classique Selon la nomenclature l ensemen
8. T 5 flacons kit solution de reconstitution MB BactT NB Pour la maintenance du MB BacT consulter la notice du fabricant C CULTURES EN MILIEU DIPHASIQUE I Milieux de culture BBL Septi Check TMAFB Becton Dickinson D signation du produit Conditionnement AFB BBL Septi Check bouillon base liquij 10 flacons 4343558 Middlebrook 7 H9 AFB BBL O Septi Chek lame g los e 4343559 AFB BBL Q Septi Check suppl ment pd 5 flacons 4343560 enrichissement et PANTA Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 23 22 Culture des mycobact ries Rev A D HEMOCULTURES Becton Dickinson D signation du produit Conditionnement Bactec 13A avec suppl ment milieu Middlebro 7H13 pour isolement des mycobact ries dans le sai 50 flacons 4402018 14 avec substrat C Bactec 13A milieu Middlebrook 7H13 avec e 4402121 Myco F lytic milieu Middlebrook 7H9 modifi 4402288 livraison apr s avis favorable de la CIREA Unipath Oxoid D signation du produit Conditionnement Tubes Isolator 10 BC 507C 57781 57811 Consommable BC 509 C capuchon de pr l vemel 100 57801 pipette surnageant et pipette culot Adaptateur pour centrifugeuse BC 501C 57821
9. age et subculture 4 Conditions particuli res de culture Ensemencer un flacon compl mentaire et l incuber 30 C pour les l sions cutan es M marinum M ulcerans 42 C en cas de suspicion d infection M xenopi C Culture en milieu diphasique BBL Septi Check AFB a Principe Le dispositif MB Check est un ensemble diphasique qui associe un flacon contenant le milieu liquide 7H9 et un syst me prismatique contenu dans un tube qui se visse sur le flacon Les faces du prisme sont recouvertes respectivement de milieu de L wenstein Jensen de milieu 7H11 et de g lose au sang cuit Le culot de pr l vement est inocul dans la phase liquide et intervalles r guliers le flacon est retourn ce qui permet l ensemencement des faces du prisme avec le milieu liquide b Technique Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 12 22 Culture des mycobact ries Rev A gt Reconstitution du suppl ment pour culture de mycobact ries Reprendre le Iyophilisat par 9 ml d eau distill e st rile Une fois dissout le suppl ment peut tre conserv l abri de la lumi re pendant 2 semaines entre 2 C et 8 C ou 20 C Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 13 22 Culture des mycobact ries Rev A gt Pr paration des flacons Ajouter 1 ml de suppl ment reconstitu chaque flacon de milieu de base avant ensemencement Les flacons ainsi pr par s peuvent tre cons
10. ant avec la pipette Isolator pour surnageant Homog n iser le culot au vortex Pr lever la totalit du culot la pipette Isolator pour culot de centrifugation Mettre 100 ul du culot dans 900 ul d eau distill e st rile et ensemencer la totalit par inondation sur 4 tubes de milieu l oeuf L wenstein Jensen ou Coletsos Ensemencer le reste du culot sur 6 tubes 4 5 gouttes par tube Bien r partir l inoculum sur la surface du milieu de culture Mettre l tuve 37 C Ne pas serrer les bouchons pour permettre l vaporation de l inoculum V rifier que les tubes restent bien plat sur le portoir Visser les tubes lorsqu ils sont secs gt Observation des cultures La lecture des tubes est faite 1 fois par semaine Les cultures sont incub es pendant 3 mois avant d tre consid r es n gatives 2 Technique radiom trique Bactec 460 TB Becton Dickinson gt Ensemencement Le sang est reccueilli soit sur tubes type Vacutainer 5 ml sur SDS ou inocul directement dans le flacon Bactec 13A 5 ml avec l adaptateur Bactec r f 4405380 Becton Dickinson Les flacons 13A ne doivent pas tre gaz s avant l ensemencement Avant de les placer l tuve introduire de fa on aseptique 0 5 ml de milieu d enrichissement Il est livr en m me temps que les flacons 13A gt Observation des cultures La lecture des flacons se fait raison de 2 fois par semaine pendant les 2 premi res semaines puis 1 foi
11. cement doit tre fait au moins sur 4 tubes En pratique on utilisera 2 tubes de milieux de L wenstein Jensen et 2 tubes de milieu enrichi 1 tube de milieu Coletsos et 1 tube de milieu de L wenstein Jensen enrichi avec 0 2 de pyruvate Inoculer 0 2 ml de culot de pr l vement par tube Incuber les tubes non viss s en position inclin e 37 C Surveiller r guli rement l vaporation de liquide 3 6 jours avant de revisser les tubes 2 Observation des cultures La lecture est faite 1 fois par semaine Eliminer les tubes contamin s et noter la nature des contaminants Si tous les tubes sont contamin s refaire si possible une deuxi me d contamination soit partir du pr l vement initial soit partir du du culot Sinon demander un nouveau pr l vement Garder les tubes de culture au moins 8 semaines l tuve 37 C avant de consid rer la culture comme n gative R aliser l identification des cultures positives MO MYC 005 3 Conditions particuli res de culture Ensemencer des tubes de L wenstein Jensen compl mentaires e A diff rentes temp ratures d incubation 30 C pour les l sions cutan es M marinum M ulcerans 42 C en cas de suspicion d infection M xenopi e Enrichis pour les mycobact ries de croissance difficile Milieu de L wenstein Jensen enrichi avec du citrate de fer ammoniacal ou milieu au sang cuit polyvitex pour M haemophilum incub en atmosph re de CO2 3
12. e milieu sec dans 600 ml d eau distill e froide contenant 12 ml de glyc rol pour bact riologie M langer jusqu obtention d une suspension homog ne Chauffer lentement en agitant constamment puis porter 1 2 minutes bullition St riliser l autoclave 121 C pendant 15 minutes Pr parer st rilement 1000 ml d une suspension tr s homog ne d oeufs frais sans antibiotiques Mettre tremper les oeufs environ 25 oeufs dans une solution de soude 5 pendant 30 minutes rin er l eau courante les mettre 10 minutes dans de l eau additionn e d un volume gal d alcool d natur 1 litre d eau 1 litre d alcool Les laisser s cher sous la hotte Chaque oeuf est cass dans un premier temps dans un b cher st rile puis son contenu est vers dans une prouvette st rile jaug e de 1 litre Tout oeuf suspect doit tre jet Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 19 22 Culture des mycobact ries Rev A Bien m langer les oeufs au mixer Sous la hotte filtrer le m lange au chinois pos sur l entonnoir M langer aseptiquement 600 ml de base st rile et refroidie aux environs de 45 50 C et les 1000 ml d oeufs entiers toujours en vitant d inclure des bulles d air R partir st rilement le milieu complet en tubes st riles raison de 6 ml par tube de pr f rence bouch s vis Coaguler en position inclin e au coagulateur trou l tuve
13. encer 0 5 ml de culot de pr l vement voir MO MYC 002 Il est recommand d ensemencer en parall le un milieu de L wenstein Jensen avec 0 2 ml de culot de pr l vement gt Observation des cultures La lecture des flacons se fait sur l appareil Bactec 460 TB 2 fois par semaine pendant les deux premi res semaines puis 1 fois par semaine jusqu la fin de la 6 ME semaine Remarques Pour les pr l vements frottis n gatifs la lecture peut tre faite qu une fois par semaine la premi re semaine Pour les pr l vements frottis tr s positifs 3 4 il est conseill de faire la lecture tous les jours d s le lendemain de l ensemencement Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 6 22 Culture des mycobact ries Rev A Un index de croissance GI gt 30 est consid r comme potentiellement positif et sera suivi par des lectures quotidiennes Une augmentation rapide de l index de croissance ou de la turbidit doit faire suspecter une contamination On confirmera celle ci par la r alisation d une double coloration de gram et de Ziehl Neelsen Une deuxi me d contamination peut tre envisag e partir du pr l vement initial conserv 4 C ou d faut apr s centrifugation du milieu contamin et d contamination du culot MO MYC 002 Enfin un nouveau pr l vement peut tre demand Quand l index de croissance est gt 100 faire un frottis et colorer par la m thode de Z
14. erv s l abri de la lumi re pendant 2 semaines entre 2 et 8 C gt Ensemencement des flacons Ensemencer 1 ml de culot de pr l vement voir fiche technique de pr paration des chantillons M langer Mettre en place le prisme contenant les 3 phases solides sur le flacon Retourner le flacon pour ensemencer le prisme Incuber en position verticale 37 C gt Observation des cultures Lecture quotidienne des flacons bouillon prisme la premi re semaine pour d tecter les mycobact ries croissance rapide ou les contaminants ventuels Au del de la 1 re semaine lecture hebdomadaire pendant 3 mois A chaque lecture retourner le flacon pour ensemencer le prisme Un trouble dans le flacon ou des colonies sur le prisme sont des indicateurs de positivit Faire une coloration de Ziehl Neelsen et suivre les proc dures habituelles d identification MO MYC 005 D H mocultures Deux techniques sont utilis es pour rechercher les mycobact ries dans les pr l vements sanguins 1 Technique Isolator 10 gt Ensemencement Pr lever 10 ml de sang au lit du malade sur tube Isolator et retourner le tube plusieurs reprises pour initier la lyse des cellules Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 14 22 Culture des mycobact ries Rev A Apr s centrifugation de 30 mn 3000 g d sinfecter le bouchon et poser le capuchon de pr l vement la presse Isostat Aspirer et liminer le surnage
15. iehl Neelsen Observer la pr sence de bacilles acido alcoolo r sistants et leurs caract ristiques morphologiques cordes chelles etc pour orienter l identification voir MO MYC 005 Faire l identification imm diate des cultures positives l aide de sondes nucl iques avant d informer le clinicien Sil n y a pas d augmentation d index de croissance au bout de 6 semaines d incubation rendre la culture n gative Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 7 22 Culture des mycobact ries Rev A Surveillance des cultures en milieu BACTEC Flacon BACTEC 12B Surveillance 2 fois semaine S ill li les 2 premi res semaines Rene OUAIS puis 1 fois semaine les 4 semaines suivantes Pas d augmentation de Gl apr s 6 semaines gt 100 Culture n gative Ziehl Neelsen Gram GS Pr sence de micro organismes non acido alcoolo r sistants avec pr sence ou absence de BAAR Pr sence de Absence de BAAR BAAR et absence et absence d autres d autres micro organismes micro organismes Deuxi me d contamination si possible sinon rendre culture contamin e et demander un deuxi me pr l vement cf Organigramme Remettre le flacon en identification antibiogramme incubation et faire une MO MYC 005 surveillance journali re Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 8 22 Culture des mycobact ries Rev A 2 Technique de fluorescence manuel
16. le BBL MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube Becton Dickinson a Principe Cette m thode utilise un milieu 7H9 contenant un sel de Ruth nium Cette susbstance met une fluorescence d autant plus vive que la pression partielle d oxyg ne est plus faible Le m tabolisme microbien provoque une d pl tion en oxyg ne et entra ne l apparition d une fluorescence dont l intensit est proportionnelle au niveau de r duction du milieu b Technique gt Pr paration des tubes Reconstituer l ampoule de suppl ment PANTA avec 3 ml d eau distill e st rile Cette solution peut tre aliquot e et congel e 20 C pour conservation D visser le tube MGIT et ajouter de mani re aseptique 0 1 ml de PANTA reconstitu voir page 5 21 0 5 ml de MGIT OADC gt Ensemencement Ensemencer la pipette 0 5 ml de culot de pr l vement MO MYC 002 Fermer le tube et homog n iser au vortex Incuber 37 C pendant 8 semaines Il est recommand d ensemencer en parall le un milieu L wenstein Jensen avec 0 2 ml de culot de pr l vement gt Observation des cultures Pr paration du t moin positif Vider le bouillon d un tube MGIT Pr parer une solution de sulfite de sodium 0 4 0 4 g dans 100 ml d eau distill e Mettre 5 ml de la solution de sulfite de sodium dans le tube et laisser reposer 1 heure avant de l utiliser Ce t moin positif conserv temp rature ambiante ne pourra tre utilis au del de
17. lytic 5 ml de sang sont inocul s directement au lit du malade l aide d un adaptateur adaptateur Vacutainer r f 364887 Becton Dickinson gt Observation des cultures Les flacons sont incub s dans l appareil Bactec 9240 selon la notice du fabricant La dur e d incubation est programm e pour 42 jours Un signal sonore et visuel indique les flacons positifs Sur ces flacons faire une coloration de Ziehl Neelseen pour observer la pr sence de bacilles acido alcoolo r sistants et suivre la proc dure habituelle d identification MO MYC 005 Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 16 22 Culture des mycobact ries Rev A IV ANNEXES A CULTURES EN MILIEU SOLIDE 1 Milieux pr ts l emploi Milieu de L wenstein Jensen Sanofi Diagnostic Pasteur D si o o NE S ES o E a Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 17 22 Culture des mycobact ries Rev A Milieu de Coletsos Sanofi Diagnostics Pasteur La longueur des tubes est non standardis e 140 X 17 mm les tubes ne s adaptent pas tous les portoirs Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 18 22 Culture des mycobact ries Rev A II Milieux reconstituer Base pour milieu de Conditionnement Sanofi Diagnostics NE 450 g 69671 500 g AS044417 Middlebrook 7H10 500 g A5083801 Middlebrook 7H11 A5083801 Pr paration des milieux 1 Milieu de L wenstein Jensen Mettre 37 2 g d
18. rer les cultures n gatives et de v rifier l ventuelle pr sence d une turbidit ou de petits grains avant de les liminer 3 Syst me MB BacT EM Organon Teknika a Principe Le syst me MB BacT utilise une m thode de d tection qui en permanence value dans le flacon de culture l volution de la croissance microbienne en mesurant gr ce un indicateur color convenable la quantit de CO2 labor Le syst me de lecture compl t d un quipement informatique sophistiqu compare les mesures Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 10 22 Culture des mycobact ries Rev A obtenues un syst me algorithmique de r f rence et d clenche le signal de positivit quand la variation des diff rents param tres est suffisante b Technique Toutes les manipulations sont faites la seringue insuline type Plastipak 1 ml Sub Q Becton Dickinson r f 305501 Avant chaque manipulation l opercule des flacons est d contamin avec un d sinfectant mycobact ricide ex Hexanios de la Soci t ANIOS gt Pr paration des flacons 1 Pr parer le compl ment d antibiotiques Ajouter aseptiquement 10 ml de solution de reconstitution dans chaque flacon de compl ment d antibiotiques MB Bact Le compl ment d antibiotiques peut tre conserv 7 jours entre 2 et 8 C 2 Pr l vements ayant subi une d contamination Avant l inoculation ajouter aseptiquement dans chaque flacon 0 5 ml de
19. s par semaine pour un total de 8 semaines L incubation peut tre prolong e jusqu 3 mois pour la d tection de mycobact ries de croissance difficile M genavense Azay Mycobact ries MODE OPERATOIRE MO MYC 003 P 15 22 Culture des mycobact ries Rev A Un index de croissance GI 230 est consid r comme susceptible d tre positif Quand l index de croissance atteint 50 r aliser un frottis et le colorer par la m thode de Ziehl Neelsen Suivre ensuite la proc dure r serv e aux flacons 12B Si la coloration de Ziehl Neelsen est n gative remettre le flacon en incubation pour contr ler sur des GI plus importants NB Ne pas inoculer le culot de sang trait par la technique de centrifugation lyse Isolator dans les flacons de culture en milieu liquide car le tube Isolator contient des inhibiteurs 3 Technique de fluorescence Bactec 9240 Becton Dickinson Principe Le syst me Bactec 9240 utilise une m thode de d tection qui en permanence value dans le flacon de culture grace la pr sence d un sel de ruth nium la fluorescence cons cutive la r duction du milieu sous l influence de la croissance microbienne Le syst me de lecture compl t d un quipement informatique sophistiqu compare les mesures obtenues un syst me algorithmique de r f rence et d clenche le signal de positivit quand la variation des diff rents param tres est suffisante gt Ensemencement des flacons Bactec Myco F
20. ver 4 C Bien agiter et r partir en tubes raison de 6 ml par tube Coaguler en position inclin e au coagulateur trou l tuve ou l autoclave 85 C pendant 45 minutes partir de milieu de L wenstein Jensen pr t l emploi Les tubes de L wenstein Jensen sont impr gn s avec 0 2 ml d une solution m re d acide pyruvique Merck r f 6619 6 de fa on obtenir une concentration finale de 0 2 2 Avec mycobactine J Dissoudre la mycobactine r f mycobactine J 2 mg Rh ne M rieux Lyon en solution alcoolique 0 05 2 mg de mycobactine dans 4 ml d thanol absolu Ajouter la pr paration 1 litre de milieu de L wenstein Jensen avant coagulation Ce milieu est utilis pour la culture de souches de M avium d ficientes dans la synth se de mycobactine 3 Avec du citrate de fer ammoniacal 15 mg ml Faire une solution de citrate de fer ammoniacal 1000 mg ml dans l eau distill e R partir 0 1 ml la surface d un tube de milieu de L wenstein Jensen Ce milieu est utilis pour la culture de M haemophilum Dans tous les cas les tubes doivent tre stock s 4 C et l obscurit Il est conseill de soumettre un chantillonnage de chaque lot pr par un contr le de qualit et de st rilit 4 Milieu Middlebrook 7H11 7H10 Les milieux de base g los s 7H11 ou 7H10 sont pr par s selon les recommandations du fabricant l OADC Difco A5 07
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