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MYCOPLASMA TISSUE CULTURE NI (MTC-NI) RAPID

1. 15 de lign es cellulaires infect es apr s passages Il est par cons quent recommand de tester toutes les lign es cellulaires une fois par mois afin de v rifier la diss mination de l infection 3 6 9 Lorsqu ils sont pr sents dans une culture les mycoplasmes sont une source d interf rences pour l tude des param tres cellulaires Ils peuvent faire appara tre des anomalies chromosomiques et provoquer des variations antig niques sur les membranes cellulaires Ils peuvent galement affecter le m tabolisme cellulaire car ils utilisent les substances nutritives destin es aux cellules Enfin ils peuvent avoir une influence sur les m canismes de fusion cellulaire 8 Il a t d montr que 98 des contaminations dans les laboratoires taient dues six esp ces appartenant aux genres Mycoplasma et Acholeplasma 5 Ces esp ces sont Acholeplasma laidlawii Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma orale Mycoplasma salivarium Mycoplasma arginini Mycoplasma hominis Mycoplasma hyorhinis est l origine de 30 40 des infections dans certains laboratoires Les m thodes habituellement utilis es pour la d tection des mycoplasmes reposent sur la culture et sur l identification biochimique La culture des mycoplasmes peut prendre jusqu trois semaines Elle est difficile car doit tre r alis e sur milieu sp cifique et en atmosph re micro a rophile En outre certaines esp ces ne peuvent pas tre cultiv es selon les m thodes
2. HYBRIDISIERUNG 1 Den Folienbeutel am oberen Ende aufschneiden Entnehmen Sie die f r die Proben und oder Kontrollen erforderliche Anzahl an Sonden reagenzr hrchen Den Beutel an der ge ffneten Seite mehrfach umschlagen und mit Klebeband oder einer Klammer wieder dicht verschlieBen Den Trockenbeutel nicht herausnehmen und den verschlossenen Beutel wieder bei 2 8 C lagern 2 Beschriften Sie f r die Proben und Kontrollen eine ausreichende Anzahl Sondenreagenzr hrchen Entfernen Sie die Stopfen und bewahren Sie diese auf Pipettieren Sie 100 ul Hybridisierungsreagenz auf den Boden der negativen Kontrollr hrchen Pipettieren Sie 100 ul der Positivkontrolle auf den Boden der positiven Kontrollr hrchen Pipettieren Sie 100 ul jeder Probe auf den Boden der entsprechend beschrifteten Probenr hrchen DATE 30 VerschlieBen Sie alle R hrchen und vortexen Sie sie bei mittlerer Geschwindigkeit f r 1 bis 3 sec um den Inhalt durchzumischen Die gesamte Fl ssigkeit sollte sich w hrend der Inkubation auf dem Boden der R hrchen befinden 7 Inkubieren Sie f r 45 min bei 60 1 C in einem Wasserbad oder Heizblock SELEKTION 1 Nehmen Sie die Sondenreagenzr hrchen aus dem Wasserbad oder Heizblock Entfernen Sie die Stopfen und bewahren Sie diese auf Pipettieren Sie sofort 300 ul Reagenz 3 Selektionsreagenz in jedes R hrchen VerschlieBen Sie die R hrchen und vortexen Sie diese bei mittlerer Geschwindigkeit f r 1 bis 3 sec um den Inh
3. Les suspensions cellulaires peuvent galement tre test es Le test peut tre pratiqu sur des cultures r alis es dans des milieux contenant des antibiotiques mais la concentration de mycoplasmes sera plus faible II est recommand de transf rer les cellules successivement dans deux milieux ne contenant pas d antibiotique avant de les tester Les milieux test s doivent avoir t en contact avec les cellules pendant au moins trois jours Se r f rer au paragraphe REMARQUES pour l analyse d chantillons ne r pondant pas ces crit res Si n cessaire les chantillons peuvent tre conserv s 7 jours 4 C avant de subir le test Pour une plus grande sensibilit des chantillons ils doivent tre pr par s moins de 4 heures apr s le pr l vement En cas d impossibilit les milieux peuvent tre conserv s 2 8 C pendant un maximum de 3 jours Les chantillons peuvent tre archiv s ou conserv s pour des essais ult rieurs en proc dant jusqu l tape 3 de la PREPARATION DE L ECHANTILLON Le tampon d hybridation devra tre ajout au culot et l chantillon conserv 20 C ou au dessous pour un mois NOTE Les chantillons troubles sont probablement contamin s par des levures ou par un autre type de bact ries et doivent tre limin s 14 104574F Rev D MODE OPERATOIRE A PREPARATION DE L APPAREILLAGE 1 R gler la temp rature du bloc chauffant ou du bain marie 60 1 C 2 Pr parer le lumino
4. Remove the Probe Reagent Tubes from the water bath or heating block and leave them at room temperature for at least 5 minutes Remove and discard the caps Read the results in the GEN PROBE Luminometer within 30 minutes after removing from the water bath or heating block DETECTION 1 Select the appropriate protocol from the menu of the GEN PROBE Luminometer software 2 Using a damp tissue or paper towel wipe each tube to ensure that no residue is present on the outside of the tube and insert the tube into the GEN PROBE Luminometer according to the instrument directions 3 When the analysis is complete remove the tube s from the luminometer PROCEDURAL NOTES A REAGENT Reagent 2 Hybridization Reagent and the Positive Control may precipitate Warming and mixing the solution at 60 1 C for 2 minutes will dissolve this precipitate TEMPERATURE The Hybridization and Selection reactions are temperature dependent Therefore it is imperative that the water bath or heating block is maintained within the specified temperature range during the entire assay TIME The Hybridization and Selection reactions are time dependent Hybridize at least 45 minutes but no more than 60 minutes Incubate the Probe Reagent Tubes during the SELECTION step for at least 10 minutes but no more than 12 minutes WATER BATH The level of water in the water bath should be maintained to ensure that the liquid reaction mixture in the Probe Reagent Tube is comp
5. 100 ul di ogni campione sul fondo delle rispettive provette campione 6 Richiudere tutte le provette e vortexare a velocit moderata la miscela per una durata di 1 3 secondi Durante Pincubazione tutti i campioni devono essere sul fondo delle provette 7 Mettere in incubazione per 45 minuti a 60 1 C a bagnomaria o in incubatore D SELEZIONE 1 Prelevare le provette di Reagente Sonda dal bagnomaria o dall incubatore Rimuovere e conservare i tappi Dispensare immediatamente 300 yl di Reagente 3 Reagente di Selezione in ogni provetta Richiudere le provette e vortexare la miscela per una durata da 1 a 3 secondi Durante l incubazione tutti i campioni dovranno essere sul fondo delle provette Mettere le provette di Reagente Sonda in incubazione per 10 minuti a 60 1 C a bagnomaria o in incubatore Rimuovere le provette di Reagente Sonda dal bagnomaria o dall incubatore e mantenerle a temperatura ambiente almeno per 5 minuti Togliere e buttare via i tappi Avvalendosi di un Luminometro GEN PROBE leggere i risultati del test nell ora Successiva E LETTURA 1 Selezionare il protocollo giusto sul Luminometro GEN PROBE 2 Per eliminare completamente i residui dalla superficie delle provette asciugare utilizzando un foglio assorbente inumidito Inserire successivamente le provette nel Luminometro GEN PROBE e seguire attentamente le istruzioni contenute nel manuale d uso 3 Una volta conclusa l analisi estrarre le provette dal luminome
6. 4 These organisms which lack cell walls do not normally produce turbidity in cell cultures and therefore cannot be detected visually Mycoplasmas are resistant to antibiotics that act on the cell wall making them difficult to eliminate from tissue cultures The incidence and effects of mycoplasma contamination of tissue cultures have been described by Barile et al 2 and McGarrity and Kotani 6 Infections have been demonstrated in up to 15 of cell lines after passage Therefore it has been recommended that all cell lines should be screened monthly to properly control spread of the contamination 3 6 9 When present in a culture mycoplasma interfere with investigational cell parameters Mycoplasma can induce chromosomal abnormalities and alter the antigenicity of cell membranes They can affect cellular metabolism by competing for nutrients and influence cell fusion procedures 8 Six species from the genera Mycoplasma and Acholeplasma have been shown to cause 98 of laboratory infections 5 These are Acholeplasma laidlawii Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma orale Mycoplasma salivarium Mycoplasma arginini Mycoplasma hominis with Mycoplasma hyorhinis causing 30 4096 of infections in some laboratories Early methods for the detection of mycoplasma relied on culture or biochemical procedures Culturing mycoplasma can take up to three weeks and is difficult due to their requirements for microaerophilic growth conditions and specia
7. Aufladung der R hrchen indem Sie diese mit einem feuchten Tuch abwischen bevor Sie sie in das luminometer stellen PROBEN IM GRAUBEREICH 3000 5000 RLU A Vergewissern Sie sich da die Inkubationen bei 60 1 C durchgef hrt werden Verwenden Sie einen genauen Thermometer B Vergewissern Sie sich daB die Proben homogen sind und bei allen Inkubationen keine Tropfen auf der Fl ssigkeitsoberfl che verbleiben C Die Kulturen k nnen mit einer sehr geringen Zahl an Bakterien kontaminiert sein Erh hen Sie die Sensitivitat des Tests wie im Abschnitt HINWEISE ZUR TESTDURCHFUHRUNG Punkt H beschrieben Es kann sein da die Zellen nach der tiefgek hlten Lagerung mindestens zweimal subkultiviert werden m ssen um eine ausreichende Keimzahl zu erhalten D Die Kulturmedien d rfen nicht vor der Zentrifugation eingefroren werden Arbeitsschritt 2 der PROBENVORBEREITUNG 11 104574F Rev D ABWEICHUNGEN BEI DER ABLESUNG A berpr fen Sie die Pr zision der Pipettierger te B Vermeiden Sie eine statische Aufladung der R hrchen indem Sie diese mit einem feuchten Tuch abwischen bevor Sie sie in das luminometer stellen C Vergewissern Sie sich da das gesamte Probensediment homogen resuspendiert wurde und das gesamte Sediment in das Sondenr hrchen transferiert wurde D Pr fen Sie die Funktion der Pumpen des luminometers siehe Handbuch berpr fen Sie die Kalibration des Ger tes E Eine Kontamination der R hrchen od
8. MUESTRAS Debe a adirse tamp n de hibridaci n al sedimento y la muestra debe conservarse a 20 C o menos durante un mes NOTA Las muestras que est n visiblemente turbias pueden haber sido contaminadas con levaduras u otras bacterias y deben ser descartadas 20 104574F Rev D TECNICA A PREPARACION DEL EQUIPO 1 Ajustar el bloque calefactor o ba o mar a a 60 1 C 2 Preparar el Lumin metro GEN PROBE Verificar que hay un volumen suficiente de Reactivos de Detecci n y II para efectuar los tests B PREPARACION DE LAS MUESTRAS 1 Pipetear 1 5 ml de medio de cultivo tisular en un tubo de microcentr fuga Identificar y marcar el lado del tubo en el cual se formar el residuo Para muestras que contengan m s de 1 mill n de c lulas eucari ticas remitirse a las FICHAS TECNICAS SOBRE EL PROCEDIMIENTO 2 Centrifugar a 12 000 15 000 x g durante 10 minutos Retirar todo el sobrenadante con una pipeta Pasteur y desecharlo El residuo puede no ser visible y se debe tener cuidado de no perder el sedimento cuando se retira el sobrenadante 3 A adir 100 ul de Reactivo de Hibridaci n al tubo de microcentr fuga Agitar vigorosametn en el Vortex para homogeneizar bien Estas muestras pueden ser conservadas a 20 C o menos durante 1 mes Las muestras congeladas deben ser calentadas a 60 1 C durante 2 minutos y agitadas en el Vortex para homogeneizarlas antes de utilizarlas en el ensayo C HIBRIDACION 1 Abrir la bolsa de alu
9. controlli negativi e positivi moogm Eliminare le cariche statiche asciugando i flaconi con carta assorbente o un panno umido prima di inserirli nel luminometro CAMPIONI NELL AREA DI INCERTEZZA 3 000 5 000 RLU Verificare che la temperatura delle incubazioni sia di 60 1 C necessario impiegare un termometro gt B Verificare che il campione sia omogeneo ed assicurarsi che durante le messe in incubazione nessuna goccia risalga alla superficie del liquido C Lecolture possono essere state contaminate con una concentrazione molto bassa di batteri Aumentare la sensibilit del test come descritto nel paragrafo OSSERVAZIONI H Alcune cellule hanno forse bisogno di subire due sottocolture dopo averle prelevate dalla fase di congelazione allo scopo di avere una quantit sufficiente di batteri per la rilevazione D terreni di coltura non possono essere congelati prima della centrifugazione fase 2 del paragrafo PREPARAZIONE DEL CAMPIONE 29 104574F Rev D LETTURE VARIABILI A B C Verificare il funzionamento degli strumenti di pipettaggio Asciugare i flaconi con carta assorbente o un panno umido prima di inserirli nel luminometro al fine d eliminare statiche Assicurarsi che la totalit del sedimento del campione sia nuovamente in sospensione in modo omogeneo e ch trasportato nella provetta sonda Verificare il funzionamento delle pompe del luminometro attenendosi a quanto indicato nel manuale d uso della
10. de ce test A utiliser pour la d tection de la contamination par les mycoplasmes des cultures cellulaires Utiliser uniquement le mat riel fourni ou du mat riel de laboratoire moo Dp Eviter le contact des R actifs de D tection et Il avec la peau les yeux et les muqueuses En cas de contact rincer l eau Si ces r actifs sont renvers s les diluer avec de l eau avant d essuyer CONSERVATION Les Tubes de R actifs Sonde doivent tre conserv s dans leur sachet en aluminium 2 8 C Ils sont stables avant ouverture jusqu la date d expiration Apr s ouverture le sachet doit tre referm et conserv 2 8 C et les tubes doivent tre utilis es dans le mois qui suit l ouverture et avant la date de p remption Le contr le positif doit tre conserv 2 8 C et chauff en agitant doucement 60 C pendant 2 minutes avant utilisation Les autres r actifs du coffret MTC NI peuvent tre conserv s entre 2 25 C et sont stables jusqu la date de p remption Les tiquettes du r actifs MTC NI comportent les symboles suivants pour la conservation Date de p remption x Num ro de lot LOT Limites de temp rature A Les symboles se r f rent a la norme europ enne aux recommandations NE PAS CONGELER LES REACTIFS PREPARATION DE L ECHANTILLON Le SYSTEME GEN PROBE DE DETECTION RAPIDE DES MYCOPLASMES MTC NI est con u pour d tecter la contamination par les mycoplasmes des tissus cellulaires
11. de routine Le SYSTEME GEN PROBE MTC NI DE DETECTION RAPIDE utilise le principe d hybridation des acides nucl iques et l ARN ribosomal ARNr pour la d tection des mycoplasmes dans les cultures cellulaires 10 Les chantillons positifs peuvent tre d tect s en 75 minutes Le coffret MTC NI GEN PROBE contient une sonde bact rienne qui permet de d tecter toutes les esp ces de Mycoplasma et d Acholeplasma susceptibles de contaminer les cultures cellulaires ainsi que toutes les esp ces bact riennes qui peuvent tre pr sentes PRINCIPES Les tests par hybridation d acides nucl iques sont bas s sur la capacit de brins compl mentaires d acides nucl iques s apparier de mani re sp cifique pour former des complexes bicat naires stables Le SYSTEME GEN PROBE MTC NI DE DETECTION RAPIDE utilise une sonde ADN monocat naire compl mentaire de l ARNr de l organisme cible Lorsque l ARNr de l organisme cible est lib r la sonde s hybride avec celui ci pour former un complexe ADN ARN stable Les sondes hybrid es sont alors S par es des sondes non hybrid es Le R actif de S lection permet de diff rencier les sondes hybrid es des non hybrid es Les hybrides ARN ADN marqu s sont mesur s l aide du Luminom tre GEN PROBE 7 Un r sultat positif est une lecture du luminom tre donnant une valeur gale ou sup rieure la valeur seuil Une valeur au dessous du seuil donne un r sultat n gatif REACTIFS Les r actifs utilis s po
12. describe en las OBSERVACIONES Positiva Negativa Valores umbral 5 000 RLU 3 000 RLU Zona de incertidumbre 3 000 a 5 000 RLU B CONTROL DE CALIDAD Y ACEPTABILIDAD DE LOS RESULTADOS El Control Negativo y el Control Positivo deben encontrarse dentro de los rangos siguientes Control Negativo 3 000 RLU Control Positivo 35 000 85 000 RLU Para verificar el calibrado y el funcionamiento de la m quina remitirse al manual del instrumento LIMITES DEL METODO Utilizar s lo para detectar contaminaci n bacteriana en muestras de cultivos celulares Otras bacterias diferentes de los micoplasmas pueden inducir una reacci n positiva si se lisan durante la preparaci n de la muestra Este test no diferencia especies bacterianas Un resultado negativo no excluye la posibilidad de que se encuentre presente contaminaci n con micoplasma a niveles inferiores a la sensibilidad del test que es de aproximadamente de 100 000 micoplasmas por ml de medio de cultivo Este test detectar algunas otras especies de bacterias si son lisadas por los procedimientos de preparaci n de la muestra ver VALORES ESPERADOS Y CARACTERISTICAS DE LA TECNICA En cualquier caso un resultado positivo indica la contaminaci n de la muestra de cultivo celular VALORES ESPERADOS Y CARACTERISTICAS DE LA TECNICA La hibridaci n de la sonda con una amplia gama de especies comunmente presentes tales como Acholeplasma Mycoplasma Spiroplasma y Ureaplasma han rendido
13. 00 RLU Los valores umbral para las muestras negativas variaron de 490 a 2 963 RLU No se presentaron muestras discrepantes todas las muestras positivas en el ensayo isot pico tambi n fueron positivas en este ensayo no isot pico se determin que todas las muestras negativas eran negativas en ambos ensayos B CONTROLES Fueron analizados 150 controles que dieron los siguientes resultados N mero de Observaciones Valores RLU Controles Negativos 81 273 a 2 484 media 903 371 DS Controles Positivos 69 35 489 a 72 955 media 52 092 8 283 DS Estos datos fueron dados por varios t cnicos en diferentes d as con lotes multiples de reactivos utilizando diferentes lumin metros LEADERS GEN PROBE RESOLUCION DE INCIDENTES CONTROL POSITIVO BAJO POR DEBAJO DE 35 000 RLU A Confirmar que el tubo de control positivo contenga aproximadamente 800 ul Lecturas bajas pueden indicar que se a adieron menos de 100 ul de Control Positivo al tubo de sonda de Control Positivo B Verificar que la temperatura del ba o mar a o bloque calefactor es de 60 1 C C Verificar que el tubo sonda se encuentra sumergido en el ba o mar a o el bloque calefactor de modo que se cubra por completo el contenido de l quido durante la reacci n No permitir que durante el ensayo penetre agua ni soluciones no est riles en los tubos sonda D Verificar el ajuste del lumin metro para confirmar un tiempo de lectura de 2 segundos E Verificar la exact
14. BE 50 Testes bioM rieux Ref 39503 Gen Probe Cat No 104573 Reagente 1 Reagente Sonda P 5 x 10 tubos Controlo positivo PC 1x 2 5 ml soluc o de ARN tamp o Reagente 2 Reagente de Hibridiza o H 1 x 15 ml solu o tamp o Reagente 3 Reagente de Selec o S 1 x 20 ml solu o tampao REAGENTES DE DETEC O GEN PROBE bioM rieux Ref 39300 Gen Probe Cat No 201791 Reagente de detec o RI 1 x 240 ml 0 1 de peroxido de hidrog nio em acido nitrico 0 001 N Reagente de detecc o II RII 1x240 ml Hidr xido de s dio 1 N 31 104574F Rev D MATERIAL NECESS RIO MAS N O FORNECIDO Banho maria ou bloco de aquecimento 60 1 C Micropipetas 100 ul 300 ul Pipetas repetitivas 300 ul Vortex Microcentr fuga 12 000 15 000 x g Tubos para microcentrifuga 2 ml DISPON VEL NOS DISTRIBUIDORES GEN PROBE GEN PROBE Lumin metro LEADER 50i bioM rieux Ref 39400 Gen Probe Cat No 1031001 GEN PROBE Reagentes de Detecc o bioM rieux Ref 39300 Gen Probe Cat No 201791 GEN PROBE Bloco de aquecimento 60 1 C bioM rieux Ref 39406 Gen Probe Cat No 302902 ou 302903 PRECAUC ES DE UTILIZACAO Utilizac o reservada aos laborat rios N o utilizar para o diagn stico Seguir as precau es de utiliza o durante a realiza o deste teste Utilizar para a detecc o de contaminac o por micoplasmas em culturas celulares Utilizar unicamente o material fornecido ou materi
15. EKTIONSREAGENZIEN KIT bioM rieux Best Nr 39300 Gen Probe Kat Nr 201791 GEN PROBE Heizblock 60 1 C bioM rieux Best Nr 39406 Gen Probe Kat Nr 302902 oder 302903 VORSICHTSMASSNAHMEN A Nur f r den Laborgebrauch Nicht f r die Diagnostik verwenden Beachten Sie bei der Testdurchf hrung die blichen VorsichtsmaBnahmen Dieser Test ist f r den Nachweis von Mycoplasma Kontaminationen in Zellkulturen bestimmt Verwenden Sie nur die mitgelieferten oder empfohlenen Einweg Labormaterialien moogm Vermeiden Sie jeden Kontakt der Detektionsreagenzien und Il mit der Haut den Augen oder den Schleimh uten Bei eventuellem Kontakt sofort mit Wasser sp len Beim Versch tten einer dieser Reagenzien die Fl ssigkeit vor dem Aufwischen mit Wasser verd nnen LAGERUNG Die Sondenreagenzr hrchen m ssen bei 2 8 C in den Aluminiumbeuteln gelagert werden Die original verpackten Sondenreagenzr hrchen sind bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar Ge ffnete Beutel stets wieder sorgf ltig verschlieBen bei 2 8 C lagern und die R hrchen innerhalb eines Monats und vor dem Verfallsdatum aufbrauchen Die Positivkontrolle sollte bei 2 bis 8 C gelagert werden und vor Gebrauch 2 min unter vorsichtigem Mischen bei 60 C erhitzt werden Die brigen Reagenzien des MTC NI Kits sind bei 2 25 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar Auf den Etiketten der MTC NI Reagenzien sind folgende Standardsymbole f r die Lagerun
16. IO OPERATIVO test di ibridazione degli acidi nucleici sfruttano la capacit dei filamenti complementari di acidi nucleici di accoppiarsi in maniera specifica per formare composti stabili a doppia catena Il SISTEMA GEN PROBE MTC NI PER L IDENTIFICAZIONE RAPIDA impiega una sonda a DNA a catena singola associata ad un marker chemioluminescente complementare all rRNA dell organismo bersaglio Una volta liberato I RNA dell organismo bersaglio la sonda si combina con le sue sequenze omologhe formando un complesso DNA RNA stabile Le sonde ibridate vengono separate dalle sonde non ibridate Il Reagente di Selezione permette di differenziare le sonde ibridate da quelle non ibridate Il Luminometro GEN PROBE 7 permette di misurare gli ibridi DNA RNA Il risultato sar positivo se il luminometro indicher un valore superiore o uguale al valore soglia negativo se mostrer un valore inferiore REAGENTI reagenti impiegati nel SISTEMA GEN PROBE MTC NI PER L IDENTIFICAZIONE RAPIDA sono forniti in due diversi kit MTC NI KIT GEN PROBE 50 Test bioM rieux cod 39503 Gen Probe Cat N 104573 Reagente 1 Reagente Sonda P 5 x 10 provette Controllo positivo PC 1x2 5 ml soluzione tamponata di RNA Reagente 2 Reagente di Ibridazione H 1 x 15 ml soluzione tamponata Reagente 3 Reagente di Selezione S 1 x 20 ml soluzione tamponata KIT DI REAGENTI DI IDENTIFICAZIONE GEN PROBE bioM rieux cod 39300 Gen Probe Cat N 201791 Reagente
17. N EI Reactivo de Selecci n permite diferenciar las sondas no hibridadas de las sondas hibridadas Los h bridos ADN ARN marcados son medidos en un Lumin metro GEN PROBE 7 Un resultado positivo es una lectura del Lumin metro GEN PROBE igual o superior al umbral Un valor por debajo de este umbral es un resultado negativo REACTIVOS Los reactivos del SISTEMA GEN PROBE DE DETECCION RAPIDA MTC NI son suministrados en dos kits de reactivos separados KIT MTC NI GEN PROBE 50 Tests bioM rieux ref 39503 Gen Probe Cat No 104573 Reactivo 1 Reactivo Sonda P 5 x 10 tubos Control Positivo PC 1x2 5 ml soluci n de ARN tamponada Reactivo 2 Reactivo de Hibridaci n H 1 x 15 ml soluci n tamponada Reactivo 3 Reactivo de Selecci n S 1 x 20 ml soluci n tamponada KIT DE REACTIVOS DE DETECCION GEN PROBE bioM rieux ref 39300 Gen Probe Cat No 201791 Reactivo de Detecci n RI 1 x 240 ml per xido de hidr geno al 0 1 en cido nitrico 0 001 N Reactivo de Detecci n II RII 1 x 240 ml hidr xido de sodio 1 N 19 104574F Rev D MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS Ba o mar a o bloque calefactor 60 1 C Micropipetas 100 ul 300 ul Pipetas de repetici n 300 ul Mezclador Vortex Microcentrifuga 12 000 15 000 x g Tubos de microcentr fuga 2 ml DISPONIBLES EN SU DISTRIBUIDOR GEN PROBE Lumin metro LEADER GEN PROBE 50i bioM rieux ref 39400 Gen Probe Cat No 1031001 Kit de Reactiv
18. ORTAMENTO FUNCIONAL DO TESTE A hibridizac o da sonda com um leque variado de esp cies de Acholeplasma Mycoplasma Spiroplasma e Ureaplasma deram sinais positivos a gt 10 organismos As seguintes esp cies de micoplasmas est o entre as que s o testadas com o SISTEMA GEN PROBE MTC NI DE DETEC O R PIDA Acholeplasma laidlawii Mycoplasma arginini Mycoplasma arthritidis Mycoplasma collis Mycoplasma fermentans Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma iowae Mycoplasma muris Mycoplasma negroni Mycoplasma neurolyticum Mycoplasma orale Mycoplasma pirum Mycoplasma primatum Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pulmonis Mycoplasma sualvi Spiroplasma species Ureaplasma parvum Ureaplasma urealyticum Os organismos Gram negativos provenientes de uma grande variedade de taxons produzem tamb m sinais positivos com a sonda bacteriana de largo espectro utilizada neste dispositivo aquando da prepara o como est descrito no par grafo Prepara o da Amostra A reacc o com microrganismos Gram positivos depende da capacidade de lise das bact rias durante a prepara o da amostra Utilizando condi es de lise apropriadas qualquer organismo Gram positivo de uma grande variedade de taxons pode reagir com este sistema de sondas N o foi observada nenhuma reac o com eucariotas alvos 34 104574F Rev D VALORES ESPERADOS A AMOSTRAS Foram testadas cento e cinque
19. Probe Reagent P 5 x 10 tubes Positive Control PC 1x2 5 mL buffered RNA solution Reagent 2 Hybridization Reagent H 1x15 mL buffered solution Reagent 3 Selection Reagent S 1x20 mL buffered solution GEN PROBE DETECTION REAGENT KIT bioM rieux ref 39300 Gen Probe Cat No 201791 Detection Reagent I RI 1x240mL 0 196 hydrogen peroxide in 0 001 N nitric acid Detection Reagent II RII 1x240mL 1 N sodium hydroxide 2 104574F Rev D MATERIALS REQUIRED BUT AVAILABLE SEPARATELY Water bath or heating block 60 1 C Micropipettes 100 uL 300 pL Re pipettor 300 uL Vortex Mixer Microcentrifuge 12 000 15 000 x g Microcentrifuge tubes 2 mL AVAILABLE FROM YOUR GEN PROBE DISTRIBUTOR GEN PROBE LEADER 50i Luminometer bioM rieux ref 39400 Gen Probe Cat No 1031001 GEN PROBE Detection Reagent Kit bioM rieux ref 39300 Gen Probe Cat No 201791 GEN PROBE Heating Block 60 1 C bioM rieux ref 39406 Gen Probe Cat No 302902 or 302903 WARNINGS AND PRECAUTIONS A For laboratory use only Not for use in diagnostic procedures Use Universal Precautions when performing this assay Use for the detection of mycoplasma contamination in tissue cultures Use only supplied or specified disposable laboratory ware moogm Avoid contact of Detection Reagents and Il with skin eyes and mucous membranes Wash with water if these reagents come into contact with skin If spills of these reagents oc
20. Relative Light Unit RLU Grenzwerten cut off interpretiert Ergebnisse deren Lichtsignale dem positiven cut off entsprechen oder dar ber liegen werden als positiv bewertet Signale unterhalb des negativen cut off Wertes werden als negativ bewertet Liegt das Ergebnis im Graubereich sollte der Test wiederholt werden Proben deren Werte wiederholt innerhalb des Graubereichs liegen k nnen eine sehr geringe Kontamination anzeigen und k nnen erneut getestet werden wie im Abschnitt HINWEISE ZUR TESTDURCHFUHRUNG beschrieben Positiv Negativ cut off Werte 5 000 RLU 3 000 RLU Graubereich 3 000 bis 5 000 RLU B QUALIT TSKONTROLLE UND VALIDIERUNG DER ERGEBNISSE Die Negativkontrolle und die Positivkontrolle sollten innerhalb folgender Bereiche liegen Negativkontrolle 3 000 RLU Positivkontrolle 35 000 85 000 RLU Zur Kalibrations und Funktionskontrolle des Ger tes beachten Sie bitte das Handbuch LIMITIERUNGEN Verwenden Sie diesen Test nur zum Nachweis von Bakterienkontaminationen in Zellkulturproben Andere Bakterien auBer Mycoplasmen k nnen positiv reagieren wenn sie w hrend der Probenvorbereitung lysiert wurden Dieser Test erm glicht keine Differenzierung der einzelnen Bakterienspezies Ein negatives Ergebnis schlieBt die M glichkeit nicht aus daB eine Mycoplasmenkontamination vorliegt die unterhalb der Sensitivitat des Tests liegt welche ca 100 000 Mycoplasmen pro ml Kulturmedium betr gt Dieser Test wei
21. SO 1 O crescimento das culturas na presen a de antibi ticos pode reduzir a concentra o dos micoplasmas aconselhado transferir as c lulas para dois meios consecutivos sem antibi ticos antes de test las Os meios testados devem ter estado em contacto com as c lulas durante pelo menos tr s dias 2 A prepara o de uma quantidade maior de amostra favorece proporcionalmente a sensibilidade do teste Para preparar um sedimento a partir de uma amostra maior fazer da seguinte maneira a Pegar num tubo de centrifuga que possa conter de 10 a 50 ml e que suporte uma centrifuga o a grande velocidade Marcar cuidadosamente a posi o do sedimento quando este se formar b Acrescentar os meios colhidos e centrifugar de 12 000 a 15 000 x g durante 15 minutos Decantar cuidadosamente o sobrenadante e elimin lo O sedimento pode n o ser vis vel por isso devem ser tomadas precau es durante esta etapa para o preservar c Resuspender o sedimento em suspens o em 1 5 ml de soro fisiol gico est ril ou de meio de cultura celular e proceder etapa 1 da PREPARA O DA AMOSTRA RESULTADOS _ A INTERPRETA O DOS RESULTADOS Os resultados do SISTEMA GEN PROBE MTC NI DE DETEC O R PIDA s o interpretados em fun o de valores limiares RLU Relative Light Unit As amostras produzindo um sinal luminoso de valor superior ou igual a este limite s o consideradas como positivas Os sinais luminosos inferiores a este limiar s o consider
22. ados como negativos Quando o resultado est situado numa zona duvidosa o teste deve ser repetido Se a segunda an lise der novamente resultados duvidosos induzindo a uma fraca contamina o necess rio testa la novamente como descreve o par grafo NOTAS Positivo Negativo Valor limiar 5 000 RLU 3 000 RLU Valor duvidoso 3 000 a 5 000 RLU B CONTROLO DE QUALIDADE E VALIDAGAO DOS RESULTADOS Os controlos negativos e positivos devem estar dentro dos seguintes valores Controlo negativo 3 000 RLU Controlo positivo 35 000 85 000 RLU Para verificar a calibrac o da m quina e o seu funcionamento consultar o manual do Aparelho LIMITES DO TESTE Utilizar unicamente para a detec o de contamina o bacteriana em amostras de culturas celulares Outras bact rias al m dos micoplasmas podem induzir uma reacc o positiva se forem lisadas durante a preparac o da amostra Este teste nao permite diferenciar as esp cies bacterianas Um resultado negativo nao pode excluir a possibilidade de contamina o por micoplasmas com uma concentra o abaixo da sensibilidade do teste que aproximadamente de 100 000 micoplasmas por ml de meio de cultura Este teste vai detectar algumas outras esp cies bacterianas se estas forem lisadas durante a prepara o da amostra consultar o par grafo COMPORTAMENTO FUNCIONAL DO TESTE Em todos os casos um resultado positivo indica uma contamina o da amostra de cultura celular COMP
23. afo NOTAS 2 Centrifugar a 12 000 15 000 x g durante 10 minutos Eliminar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur O sedimento pode n o ser vis vel e por isso devem ser tomadas precau es para evitar a sua perda durante a elimina o do sobrenadante 3 Acrescentar 100 ul de Reagente de Hibridiza o no tubo de microcentrifuga Agitar vigorosamente a mistura em Vortex Estas amostras podem ser conservadas a 20 C ou abaixo durante um m s As amostras congeladas devem ser aquecidas a 60 1 C durante 2 minutos Antes de serem utilizadas agitar em Vortex para obter uma solu o homog nea HIBRIDIZAGAO 1 Cortar horizontalmente a parte superior da saqueta sachet de alum nio Retirar o n mero necess rio de tubos de Reagentes Sonda para testar as amostras e ou as estirpes cepas de controlo Fechar bem a saqueta sachet dobrando v rias vezes a sua extremidade e fixando a com fita cola ou com um clip N o retirar a saqueta sachet que cont m o dissecante e conservar o saco fechado a 2 8 C 2 Etiquetar um n mero suficiente de tubos de Reagente Sonda para testar as amostras e as estirpes cepas de controlo Tirar e conservar as tampas Pipetar 100 ul de Reagente de Hibridiza o para tubos de Controlo Negativo Pipetar 100 ul de Controlo Positivo para tubos de Controlo Positivo Pipetar 100 ul de cada amostra para tubos de amostra apropriados DATE 99 Tapar todos os tubos e agitar a velocidade moderada a mistura em Vortex d
24. al do laborat rio espec fico moom r Evitar o contacto dos Reagentes de Detecc o e Il com a pele os olhos e as mucosas No caso de contacto lavar com agua Se estes reagentes forem derramados dilu los com gua antes de limpar CONSERVA O Os Tubos de Reagente Sonda devem ser conservados nas saquetas sachets de alum nio 2 8 C S o est veis antes de abertura at data de validade Ap s abertura a saqueta sachet deve ser bem fechada e conservada a 2 8 C e os tubos devem ser utilizados num prazo de um m s ap s abertura e antes da data de validade O controlo positivo deve ser conservado a 2 8 C e aquecido mexendo devagar a 60 C durante 2 minutos antes da utiliza o Os outros reagentes do dispositivo MTC NI podem ser conservados entre 2 25 C e s o est veis at data de validade As etiquetas do reagente MTC NI possuem os s mbolos seguintes para a sua conserva o Data de validade t N mero de lote LOT Limites de temperatura v d Os s mbolos referem se norma europeia s recomendac es N O CONGELAR OS REAGENTES PREPARAC O DA AMOSTRA O SISTEMA GEN PROBE DE DETECGAO R PIDA DE MICOPLASMAS MTC NI concebido para detectar a contamina o por micoplasmas em tecidos celulares As suspens es celulares podem igualmente ser testadas O teste pode Ser praticado com culturas realizadas em meios contendo antibi ticos mas a concentrac o de micoplasmas ser mais fraca E recomendado tran
25. alt durchzumischen Die gesamte Fl ssigkeit sollte sich w hrend der Inkubation auf dem Boden der R hrchen befinden Inkubieren Sie die Sondenreagenzr hrchen f r 10 min bei 60 1 C in einem Wasserbad oder Heizblock Nehmen Sie die Sondenreagenzr hrchen aus dem Wasserbad oder Heizblock und lassen Sie sie f r mindestens 5 min bei Raumtemperatur stehen Entfernen Sie die Stopfen und verwerfen Sie diese Die R hrchen sollten innerhalb 30 min nachdem Sie aus dem Wasserbad oder Heizblock entfernt wurden gemessen werden DETEKTION 1 W hlen Sie auf dem GEN PROBE Luminometer das geeignete Programm 2 Zur Sauberung der R hrchenwand sowie zur Vermeidung von elektrostatischen Einfl ssen w hrend der Messung durch das R hrchenmaterial selbst sollte jedes R hrchen vor der Messung mit einem feuchten Tuch bzw Papier abgewischt werden Stellen Sie die R hrchen gemaB den Anweisungen im Handbuch in das GEN PROBE Luminometer 3 Nehmen Sie die R hrchen nach der Messung aus dem luminometer HINWEISE ZUR TESTDURCHF HRUNG A REAGENZIEN Das Reagenz 2 Hybridisierungsreagenz und die Positivkontrolle k nnen pr zipitieren Zur Aufl sung des Niederschlags die L sung f r 2 min bei 60 1 C erhitzen und mischen TEMPERATUR Die Hybridisierung und Selektion sind temperaturabh ngige Reaktionen Es mu deshalb unbedingt darauf geachtet werden da das Wasserbad oder der Heizblock w hrend des gesamten Tests im angegebenen Temperaturbereich g
26. ces of Mycoplasma contamination a brief review p 35 45 In G J McGarrity D G Murphy and W W Nicholes ed Mycoplasma infection of cell culture Plenum Press New York New York Lincoln C K and M G Gabridge 1998 Methods Cell Biol 57 49 65 Maniloff C J R N McElhaney L R Finch and J B Baseman 1992 ed Mycoplasmas molecular biology and pathogenesis American Society for Microbiology Washington D C McGarrity G J 1982 Detection of Mycoplasmal infection of cell cultures p 99 131 Advances in cell culture Vol 2 Academic Press New York New York McGarrity G J and H Kotani 1985 Cell culture Mycoplasmas n S Razin and M F Barile ed The Mycoplasmas Vol IV Mycoplasma pathogenicity Academic Press New York New York Nelson N C M A Reynolds and L J Arnold Jr 1995 Detection of acridinium esters by chemiluminescence p 391 428 In Kricka L J ed Non isotopic probing plotting and sequencing Academic Press Inc San Diego CA Rottem S and M F Barile 1993 Beware of mycoplasmas TIBTECH 11 143 151 Stacey A and A Doyle 1997 Routine testing of cell cultures and their products for mycoplasma contamiation Methods in Molecular Biol 75 305 11 Weisburg W G J G Tully D L Rose P Petzel H Oyaizu D Yang L Mandelco J Sechrest T G Lawrence J Van Etten J Maniloff and C R Woese 1989 A phylogenetic analysis of the mycoplasmas basis for their clas
27. cur dilute with water before wiping dry STORAGE AND HANDLING REQUIREMENTS Probe Reagent Tubes must be stored in the foil pouches at 2 to 8 C The Probe Reagent Tubes are stable in the unopened pouches until the expiration date indicated Once opened the pouch should be resealed stored at 2 to 8 C and the tubes should be used within one month and prior to the expiration date The positive control should be stored at 2 to 8 C and warmed with gentle mixing at 60 C for 2 minutes prior to use Other reagents used in the MTC NI Kit may be stored between 2 to 25 C and are stable until the expiration date indicated MTC NI reagent labels include the following standardized symbols for storage and handling instructions Expiration Date 2 Lot Number Temperature Limitation Symbols are based on European Standard recommendations DO NOT FREEZE THE REAGENTS SAMPLE COLLECTION The GEN PROBE MTC NI RAPID DETECTION SYSTEM is designed to detect mycoplasma contamination in tissue culture Tissue culture cell suspensions may also be assayed using this method This test may be performed on cultures grown in antibiotic containing media but Mycoplasma levels will be reduced due to the presence of the antibiotics It is recommended that cells be passed twice in the absence of antibiotics before being assayed Media to be tested should be exposed to cells a minimum of three days Refer to the PROCEDURAL NOTES for processing specimens that do not meet th
28. della PREPARAZIONE DEL CAMPIONE RISULTATI DEL TEST A INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI risultati del SISTEMA GEN PROBE MTC NI PER L IDENTIFICAZIONE RAPIDA vengono interpretati in base a valori soglia RLU Relative Light Units campioni che originano un segnale luminoso di valore superiore o uguale a questa soglia vengono considerati positivi segnali luminosi inferiori a questa soglia sono considerati negativi Quando il risultato si posiziona nell area di incertezza il test deve essere ripetuto Se la seconda analisi evidenzia ancora risultati equivoci che inducono una debole contaminazione occorre testare di nuovo come descritto nel paragrafo OSSERVAZIONI Positivo Negativo Valore soglia gt 5 000 RLU 3 000RLU Area di incertezza da 3 000 a 5 000 RLU B CONTROLLO DI QUALIT ED ACCETTABILIT DEI RISULTATI controlli negativi e positivi devono soddisfare i seguenti valori Controllo negativo 3 000 RLU Controllo positivo 35 000 85 000 RLU Per verificare la taratura della macchina ed il suo funzionamento attenersi alle istruzioni contenute nel manuale strumentazioni LIMITI DEL TEST Riservato esclusivamente all identificazione di una contaminazione batterica nei campioni di colture cellulari Batteri diversi dai micoplasmi possono indurre una reazione positiva se vengono lisati durante la preparazione del campione Questo test non consente di differenziare le specie batteriche Un risultato negativo non pu esclude
29. di Reagente Sonda devono essere conservate nelle confezioni di alluminio a temperature comprese fra 2 e 8 C Prima dell apertura rimangono stabili fino alla data di scadenza Dopo l apertura la confezione deve essere richiusa ermeticamente e le provette devono essere usate nell arco di due mesi entro e non oltre la data di scadenza Il controllo positivo deve essere conservato a una temperatura compresa tra 2 e 8 C Riscaldarlo e agitarlo leggermente a 60 per due minuti prima dell uso Gli altri reagenti del kit MTC NI possono essere conservati ad una temperatura compresa tra 2 e 25 C e rimangono stabili fino alla data di scadenza Le etichette dei reagenti MTC NI contengono i seguenti simboli ai fini della conservazione Data di scadenza x Numero lotto a Limiti di temperatura simboli fanno riferimento alla norma europea alle raccomandazioni NON CONGELARE REAGENTI PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Il SISTEMA GEN PROBE PER L IDENTIFICAZIONE RAPIDA DEI MICOPLASMI MTC NI stato progettato per rilevare la contaminazione da micoplasmi dei tessuti cellulari possibile anche testare le sospensioni cellulari Il test pu essere condotto su colture realizzate in terreni che contengono antibiotici ma la concentrazione dei micoplasmi sar pi debole Prima di effettuare il test si consiglia di ripassare due volte le cellule in due terreni di coltura che non contengano antibiotici terreni testati devono essere stati a contatto con l
30. di Rivelazione RI 1x240 ml 0 196 di perossido di idrogeno in acido nitrico 0 001 N Reagente di Rivelazione Il RII 1x240 ml Idrossido di sodio 1 N 25 104574F Rev D MATERIALI RICHIESTI MA DISPONIBILI SEPARATAMENTE Bagnomaria o incubatore 60 1 C Micropipette 100 ul 300 ul Micropipette a volume fisso 300 ul Vortex Microcentrifuga 12 000 15 000 x g Provette per microcentrifuga 2 ml ULTERIORE MATERIALE DISPONIBILE PRESSO IL VOSTRO DISTRIBUTORE GEN PROBE Luminometro GEN PROBE LEADER 50i bioM rieux cod 39400 Gen Probe Cat N 1031001 Kit di Reagenti di Rivelazione GEN PROBE bioM rieux cod 39300 Gen Probe Cat N 201791 Incubatore GEN PROBE 60 1 C bioM rieux cod 39406 Gen Probe Cat N 302902 o 302903 PRECAUZIONI D USO A ll test riservato esclusivamente ad un uso di laboratorio Non impiegare a fini diagnostici B Durante la realizzazione di questo test adottare le normali precauzioni C Dausarsi esclusivamente per l identificazione della contaminazione da micoplasmi delle colture cellulari D Impiegare unicamente il materiale compreso nel kit o materiale monouso di laboratorio E Evitare qualsiasi contatto della cute e delle mucose con i Reagenti di Rivelazione e Il In caso di contatto sciacquare accuratamente con acqua le parti interessate Se si verificassero versamenti di reagenti diluirli con acqua prima di asciugare la superficie CONSERVAZIONE Le Provette
31. e cellule almeno per tre giorni Fare riferimento al paragrafo OSSERVAZIONI per l analisi dei campioni che non rispondono a questi criteri Qualora fosse necessario i campioni possono essere conservati per 7 giorni a 4 C prima di essere sottoposti al test Per una maggiore sensibilit dei campioni la loro preparazione deve avvenire a meno di 4 ore dal prelievo In caso di impossibilit i terreni possono essere conservati a una temperatura di 2 8 C per un massimo di tre giorni campioni possono essere archiviati o conservati per ulteriori test procedendo alla fase 3 della PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Il tampone di ibridazione deve essere aggiunto al sedimento del campione conservato a 20 C o al di sotto per la durata di un mese NOTA I campioni torbidi sono probabilmente contaminati da lieviti o da un altro tipo di batteri e devono essere eliminati PROCEDIMENTO A PREPARAZIONE DELL APPARECCHIATURA 1 Impostare un incubatore o un sistema a bagnomaria a 60 1 C 2 Preparare il Luminometro GEN PROBE Assicurarsi che la quantit di Reagenti di Rivelazione e Il sia sufficiente per condurre i test 26 104574F Rev D B PREPARAZIONE DEL CAMPIONE 1 Trasferire tramite pipetta 1 5 ml di coltura cellulare in una provetta per microcentrifuga Identificare ed evidenziare mediante un segno la provetta in cui verr realizzato il sedimento Per i campioni che contengono oltre 1 milione di cellule eucariotiche fare riferimento al paragra
32. ehalten werden ZEIT Die Hybridisierung und Selektion sind zeitabh ngige Reaktionen Die Hybridisierungsdauer sollte nicht unter 45 min liegen jedoch 60 min nicht berschreiten Die Sondenreagenzr hrchen w hrend des Selektionsschrittes f r mindestens 10 min jedoch nicht l nger als 12 min inkubieren WASSERBAD Achten Sie darauf da der Wasserstand ausreichend hoch bleibt um zu gew hrleisten da sich die Reaktionsl sung der Sondenreagenzr hrchen w hrend der Reaktion vollst ndig im Wasser befindet VORTEXEN W hrend des Arbeitsschritts SELEKTION mu besonders darauf geachtet werden da die Probenmischung absolut homogen ist insbesondere nach Zugabe von Reagenz 3 Die gesamte Fl ssigkeit muB sich w hrend der Inkubationen auf dem Boden der R hrchen befinden PROBENMEDIEN DIE ZELLEN ENTHALTEN Enth lt die Probe eine groBe Anzahl an eukaryontischen Zellen z B Zellsuspensionen zentrifugieren Sie f r 5 min bei 500 x g Entfernen Sie den bei dieser niedrigen Geschwindigkeit gebildeten Uberstand und verwenden Sie 1 5 ml dieses Uberstandes als Probe Beginnen Sie wieder ab Arbeitsschritt 1 des Abschnitts PROBENVORBEREITUNG 9 104574F Rev D G VORBEREITUNG DES SEDIMENTS Bei der Probenvorbereitung sollte mit einer Pasteurpipette so viel berstand wie m glich von den zentrifugierten Proben abgenommen werden Es wurde nachgewiesen da berreste des Mediums zu schwachen falsch positiven Ergebnissen gef hrt haben Arbeiten S
33. ement C S assurer que les tubes sont incub s 10 minutes pendant l tape de S lection CONTR LE NEGATIF HAUT gt 3000 RLU A Contr ler que le tube de contr le n gatif contient approximativement 800 ul Des valeurs de lecture hautes peuvent indiquer que 300 ul de r actif de s lection n a pas t ajout B V rifier que la temp rature du bain marie ou du bloc chauffant est de 60 1 C et que le luminom tre fonctionne correctement C S assurer que les tubes sont incub s 10 minutes pendant l tape de S LECTION D NE PAS interchanger les bouchons des contr les n gatifs et positifs E Eliminer les charges statiques en essuyant les flacons avec du papier absorbant ou du tissu humide avant de les placer dans le luminom tre ECHANTILLONS DANS LA ZONE D INCERTITUDE 3000 5000 RLU A V rifier que la temp rature des incubations est de 60 1 C Un thermom tre doit tre utilis B V rifier que l chantillon est homog ne et qu aucune goutte ne remonte la surface du liquide lors des incubations C Les cultures ont pu tre contamin es avec une concentration tr s basse de bact ries Augmenter la sensibilit du test comme d crit dans le paragraphe REMARQUES H Des cellules ont peut tre besoin de subir deux subcultures apr s les avoir retir es de la cong lation afin d avoir un nombre suffisant de bact ries pour la d tection D Lesmilieux de culture ne peuvent pas tre congel s avant la centrif
34. er Reagenzien mit RNase oder Bakterien kann die Testergebnisse beeinflussen Bei der Handhabung aller R hrchen und Reagenzien sollte aseptisch gearbeitet werden 12 104574F Rev D DETECTION DES MYCOPLASMES DANS LES CULTURES MTC NI SYSTEME DE DETECTION RAPIDE bioM rieux R f 39503 Gen Probe Cat No 104573 UTILISATION Le SYSTEME GEN PROBE DE DETECTION RAPIDE DES MYCOPLASMES DANS LES CULTURES CELLULAIRES MTC NI est un produit qui permet de d tecter la pr sence de contamination par les mycoplasmes dans les cultures cellulaires Pour usage en laboratoire INTRODUCTION Les esp ces du genre Mycoplasma constituent une importante source de contamination des cultures cellulaires Les mycoplasmes qui se d veloppent sur les cultures cellulaires peuvent atteindre des concentrations de 10 UFC Unit Formant Colonie par millilitre de surnageant En outre les mycoplasmes peuvent se fixer sur les membranes cellulaires 1 4 Les mycoplasmes qui sont d pourvus de paroi cellulaire ne modifient pas la turbidit des cultures cellulaires et ne peuvent donc tre d tect s visuellement Ces micro organismes sont r sistants aux antibiotiques qui agissent sur la paroi cellulaire ce qui rend difficile l radication de la contamination Les cons quences de la contamination des cultures par les mycoplasmes ont t d crites par Barile et son quipe 2 et par McGarrity et Kotani 6 Il a t d montr qu il pouvait y avoir jusqu
35. es Carefully remove and discard the supernatant The pellet may not be visible and care must be taken to avoid any loss of the pellet during this step c Resuspend the pellet in 1 5 mL of sterile saline or cell culture media and proceed to step 1 of the SAMPLE PREPARATION procedure 4 104574F Rev D RESULTS A INTERPRETATION OF RESULTS The results of the GEN PROBE MTC NI RAPID DETECTION SYSTEM are based on Relative Light Unit RLU cut off values Samples producing greater than or equal to the positive cut off value are considered positive Signals less than the negative cut off value are considered negative Results in repeat range should be repeated Samples continuing to give values within the repeat range may represent very low level contamination and you may wish to re test as described in PROCEDURAL NOTES Positive Negative Cut off Values 5 000 RLU 3 000 RLU Repeat Range 3 000 to 5 000 RLU B QUALITY CONTROL AND ACCEPTABILITY OF RESULTS Negative Control and Positive Control should be within the following ranges Negative Control 3 000 RLU Positive Control 35 000 85 000 RLU To check machine calibration and functioning please refer to the instrument manual LIMITATIONS Use only for the detection of bacterial contamination in tissue culture samples Bacteria other than mycoplasma will vary in positivity based on their lysis during the sample preparation This test does not distinguish among bacterial species A ne
36. es ebenfalls mit diesem Sondensystem Es wurde keine Reaktion gegen ber eukaryontischen Zielzellen festgestellt NORMALWERTE A PROBEN 150 Proben wurden mit dem GEN PROBE MTC NI kit und dem isotopischen GEN PROBE MTC Test getestet Die RLU Werte der positiven Proben lagen in einem Bereich von 7 644 bis 3 034 700 RLU Die RLU Werte der negativen Proben lagen in einem Bereich von 490 bis 2 963 RLU Es gab keine diskrepanten Proben alle Proben die im isotopischen Test positiv reagierten ergaben mit diesem nicht isotopischen Test ebenfalls ein positives Ergebnis Alle negativen Proben reagierten in beiden Tests negativ B KONTROLLEN 150 Kontrollen wurden getestet und ergaben folgende Ergebnisse Anzahl Tests RLU Werte Negativkontrollen 81 273 bis 2 484 Mittelwert 903 371 SD Positivkontrollen 69 35 489 bis 72 955 Mittelwert 52 092 8 283 SD Diese Daten wurden von verschiedenen Technikern an unterschiedlichen Tagen mit mehreren Reagenzienchargen unter Verwendung verschiedener GEN PROBE LEADER ermittelt FEHLERM GLICHKEITEN SCHWACH POSITIVE KONTROLLE UNTER 35 000 RLU A Vergewissern Sie sich da das R hrchen mit der Positivkontrolle ca 800 ul enth lt Geringe Werte k nnen darauf hinweisen da weniger als 100 ul Positivkontrolle in das Sondenr hrchen mit der Positivkontrolle hinzugegeben wurde B Pr fen Sie ob die Temperatur des Wasserbades oder Heizblocks 60 1 C betr gt C Vergewissern Sie sich da d
37. ese criteria For maximum sensitivity samples should be prepared within 4 hours of collection If this is not possible the media may be stored at 2 to 8 C for no longer than 3 days before sample preparation Samples may be archived or stored for later assay by processing them through step 3 of SAMPLE PREPARATION The hybridization buffer should be added to the pellet and the sample stored at 20 C or below for one month NOTE Samples which are visibly turbid may be contaminated with yeast or other bacteria and should be discarded TEST PROCEDURE A EQUIPMENT PREPARATION 1 Adjust the heating block or water bath to 60 1 C 2 Prepare the GEN PROBE Luminometer for operation Make sure there is sufficient volume of Detection Reagents and II to complete the tests B SAMPLE PREPARATION 1 Pipette 1 5 mL of tissue culture medium into a microcentrifuge tube Identify and mark the side of the tube on which the pellet will form For samples containing greater than 1 million eukaryotic cells please refer to PROCEDURAL NOTES 2 Centrifuge at 12 000 15 000 x g for 10 minutes Remove all of the supernatant with a Pasteur pipette and discard The pellet may not be visible and care must be taken to avoid any loss of the pellet when removing the supernatant 3 104574F Rev D 3 Add 100 uL of Hybridization Reagent to the microcentrifuge tube Vortex to mix thoroughly These samples may be stored at 20 C or below for 1 month Frozen samples sho
38. f r einen Monat gelagert werden HINWEIS Proben mit sichtbarer Tr bung k nnen mit Hefen oder anderen Bakterien kontaminiert sein und sollten verworfen werden TESTDURCHF HRUNG A VORBEREITUNG DER GER TE UND MATERIALIEN 1 Den Heizblock oder das Wasserbad auf 60 1 C einstellen 2 Bereiten Sie das GEN PROBE Luminometer f r die Messung vor Vergewissern Sie sich da f r die Durchf hrung der Tests ausreichend Detektionsreagenz und Il vorhanden ist 8 104574F Rev D PROBENVORBEREITUNG 1 Pipettieren Sie 1 5 ml Zellkulturmedium in ein Mikrozentrifugenr hrchen Bestimmen und markieren Sie die Seite des R hrchens auf der sich das Sediment bilden wird Bei Proben die mehr als 1 Million eukaryontische Zellen enthalten beachten Sie bitte die HINWEISE ZUR TESTDURCHFUHRUNG 2 Zentrifugieren Sie f r 10 min bei 12 000 15 000 x g Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette den gesamten berstand und verwerfen Sie diesen Es kann sein daB das Sediment nicht sichtbar ist Arbeiten Sie deshalb bei der Entfernung des Uberstandes vorsichtig um jeglichen Verlust des Sediments zu vermeiden 3 Geben Sie 100 ul Hybridisierungsreagenz in das Mikrozentrifugenr hrchen Vortexen Sie dieses um den Inhalt gr ndlich durchzumischen Diese Proben k nnen einen Monat bei 20 C oder darunter gelagert werden Tiefgefrorene Proben sollten vor der Testung f r 2 min bei 60 1 C erhitzt und gevortext werden um eine homogene L sung zu erhalten
39. fo OSSERVAZIONI 2 Centrifugare a 12 000 15 000 x g per 10 minuti Togliere ed eliminare il supernatante tramite una pipetta Pasteur Il sedimento potrebbe non essere visibile e di conseguenza occorre prendere tutte le precauzioni necessarie per evitarne la perdita durante l eliminazione del supernatante 3 Aggiungere 100 ul di Reagenti di Ibridazione nella provetta di microcentrifugazione Vortexare con forza la miscela Questi campioni possono essere conservati a una temperatura di 20 C o al di sotto per un mese campioni congelati devono essere riscaldati a 60 1 C per 2 minuti Prima dell impiego mescolare con un Vortex al fine di ottenere una soluzione omogenea C IBRIDAZIONE 1 Tagliare orizzontalmente la parte superiore delle confezioni di alluminio Prelevare il numero necessario di provette di Reagente Sonda per testare i campioni e o le colture di controllo Richiudere ermeticamente la confezione ripiegando pi volte l estremit e fermandola con nastro adesivo o con una clip Non asportare dalla confezione di agenti essiccanti e conservarla chiusa a una temperatura di 2 8 C 2 Predisporre un numero sufficiente di provette di Reagente Sonda per testare i campioni e le colture di controllo Rimuovere e conservare i tappi 3 Dispensare 100 ul di Reagente di Ibridazione sul fondo delle provette di Controllo Negativo 4 Dispensare 100 ul di Controllo Positivo sul fondo delle provette di Controllo Positivo 5 Dispensare
40. g und Handhabung der Reagenzien angegeben Verfallsdatum 2 Chargennummer a LOT Temperatureinschr nkung Die Symbole basieren auf dem europ ischen Standard Empfehlungen DIE REAGENZIEN NICHT EINFRIEREN PROBENGEWINNUNG Das GEN PROBE MTC NI SCHNELLNACHWEISSYSTEM dient zum Nachweis von Mycoplasma Kontaminationen in Zellkulturen Suspensionen aus Zellkulturen k nnen ebenfalls mit dieser Methode getestet werden Dieser Test kann mit Kulturen durchgef hrt werden die in Antibiotika haltigen Medien gewachsen sind die Mycoplasmenspiegel werden jedoch aufgrund der vorhandenen Antibiotika verringert sein Es ist empfehlenswert die Zellen vor der Testung zweimal in Abwesenheit von Antibiotika zu subkultivieren Die zu testenden Medien sollten mindestens 3 Tage Kontakt mit den Zellen haben Bei der Testung von Proben die diesen Kriterien nicht entsprechen beachten Sie die HINWEISE ZUR TESTDURCHF HRUNG Um eine maximale Sensitivitat zu erreichen sollten die Proben innerhalb 4 Stunden nach der Probengewinnung vorbereitet werden Wenn dies nicht m glich ist k nnen die Medien bei 2 8 C maximal 3 Tage bis zur Probenvorbereitung gelagert werden Die Proben k nnen archiviert oder f r eine sp tere Testung aufbewahrt werden bearbeiten Sie die Proben in diesem Fall wie im Abschnitt PROBENVORBEREITUNG bis einschlieBlich Arbeitsschritt 3 beschrieben Der Hybridisierungspuffer sollte dem Sediment zugegeben werden und die Probe bei 20 C oder darunter
41. gative result does not exclude the possibility that mycoplasma contamination is present at a level below the sensitivity of the test which is approximately 100 000 mycoplasma per mL of culture media This test will detect certain other bacterial species if they are lysed by the sample preparation procedures see PERFORMANCE CHARACTERISTICS In any case a positive result indicates contamination of the tissue culture sample PERFORMANCE CHARACTERISTICS Hybridization of the probe with a wide range of commonly occurring species of Acholeplasma Mycoplasma Spiroplasma and Ureaplasma have yielded positive signals at gt 10 organisms The following species of Mycoplasma are among those tested with the GEN PROBE MTC NI RAPID DETECTION SYSTEM Acholeplasma laidlawii Mycoplasma negroni Mycoplasma arginini Mycoplasma neurolyticum Mycoplasma arthritidis Mycoplasma orale Mycoplasma collis Mycoplasma pirum Mycoplasma fermentans Mycoplasma primatum Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma genitalium Mycoplasma pulmonis Mycoplasma hominis Mycoplasma sualvi Mycoplasma hyorhinis Spiroplasma species Mycoplasma iowae Ureaplasma parvum Mycoplasma muris Ureaplasma urealyticum Gram negative organisms from a wide variety of taxa also yield positive signals with the broad spectrum bacterial probe contained in this kit when prepared as outlined in the SAMPLE PREPARATION section Reaction to Gram positive organisms is dependent on the ability of
42. ginini Mycoplasma hominis de las cuales Mycoplasma hyorhinis causa el 30 40 de las infecciones en algunos laboratorios Los primeros m todos para la detecci n de micoplasmas se basaron en el cultivo o en procedimientos bioqu micos El cultivo de micoplasmas puede exigir hasta tres semanas y es dif cil dada su exigencia de condiciones de crecimiento microaer f las y de medios de cultivo especializados Adem s algunas especies no pueden ser cultivadas mediante m todos rutinarios El SISTEMA GEN PROBE DE DETECCION RAPIDA MTC NI emplea el principio de hibridaci n de cidos nucleicos y de detecci n del ARN ribos mico ARNr 10 Es posible detectar muestras positivas en 75 minutos El kit MTC NI GEN PROBE utiliza una sonda exclusivamente bacteriana que detecta todas las especies de Mycoplasma y Acholeplasma que infectan habitualmente los cultivos celulares as como otras especies bacterianas que puedan encontrarse presentes PRINCIPIO DE LA TECNICA Los ensayos con hibridaci n del cido nucleico se basan en la capacidad de cadenas complementarias de cido nucleico para unirse y formar complejos bicatenarios estables El SISTEMA GEN PROBE DE DETECCION RAPIDA MTC NI utiliza una sonda de ADN monocatenario marcada con quimioluminiscencia complementaria del ARNr del organismo diana Despu s que el organismo ha liberado el ARN ribos mico la sonda de ADN marcado se combina con el ARNr del organismo diana para formar un h brido estable ADN AR
43. hemilumineszenzmarker der ungebundenen Sonde ab w hrend der Marker der gebundenen Sonde intakt bleibt Das GEN PROBE Luminometer miBt das von den DNA RNA Hybriden abgegebene Lichtsignal 7 Ein positives Ergebnis liegt vor wenn der vom luminometer angezeigte Wert gleich oder gr Ber ist als der Grenzwert cut off Liegt der Wert unterhalb des Grenzwertes ist das Ergebnis negativ REAGENZIEN Die Reagenzien des GEN PROBE MTC NI SCHNELLNACHWEISSYSTEM werden in zwei separaten Reagenzienkits geliefert GEN PROBE MTC NI KIT 50 Tests bioM rieux Best Nr 39503 Gen Probe Kat Nr 104573 Reagenz 1 Sondenreagenz P 5 x 10 R hrchen Positivkontrolle PC 1x2 5 ml RNA Pufferl sung Reagenz 2 Hybridisierungsreagenz H 1x 15 ml Pufferl sung Reagenz 3 Selektionsreagenz S 1 x 20 ml Pufferl sung GEN PROBE DETEKTIONSREAGENZIEN KIT bioM rieux Best Nr 39300 Gen Probe Kat Nr 201791 Detektionsreagenz RI 1x240 ml 0 196 Wasserstoffperoxid in 0 001 N Salpeters ure Detektionsreagenz II RII 1x240 ml 1 N Natriumhydroxyd 7 104574F Rev D ERFORDERLICHE JEDOCH NICHT IM LIEFERUMFANG ENTHALTENE MATERIALIEN Wasserbad oder Heizblock 60 1 C Mikropipetten 100 ul 300 ul Repetierpipette 300 ul Vortex Mikrozentrifuge 12 000 15 000 x g Mikrozentrifugenr hrchen 2 ml ZUS TZLICHE VERF GBARE MATERIALIEN GEN PROBE LEADER 50i Luminometer bioM rieux Best Nr 39400 Gen Probe Kat Nr 103100i GEN PROBE DET
44. idiza o dos cidos nucl icos e detec o do ARN riboss mico ARNr para a detec o dos micoplasmas em culturas celulares 10 As amostras positivas podem ser detectadas em 75 minutos O dispositivo MTC NI GEN PROBE cont m uma sonda bacteriana que permite detectar todas as esp cies de Mycoplasma e de Acholeplasma suscept veis de contaminar as culturas celulares assim como todas as esp cies bacterianas que podem estar presentes PRINC PIO Os testes por hibridiza o de cidos nucl icos s o baseados na capacidade de cadeias complementares de cidos nucl icos emparelharem de forma espec fica para formar complexos bicaten rios est veis O SISTEMA GEN PROBE MTC NI DE DETEC O R PIDA utiliza uma sonda ADN monocaten ria complementar do ARNr do organismo alvo Quando o ARNr do organismo alvo libertado a sonda hibridiza com este para formar um complexo ADN ARN est vel As sondas hibridizadas s o ent o separadas das sondas n o hibridizadas O Reagente de Selec o permite diferenciar as sondas hibridizadas das n o hibridizadas Os h bridos ARN ADN marcados s o medidos com o Lumin metro GEN PROBE 7 Um resultado positivo corresponde a uma leitura do lumin metro dando um valor igual ou superior ao valor limiar Um valor abaixo do limiar d um resultado negativo REAGENTES 2 Os reagentes utilizados para o SISTEMA GEN PROBE MTC NI DE DETECGAO R PIDA s o fornecidos em duas embalagens distintas Embalagem MTC NI GEN PRO
45. ie Sondenr hrchen so im Wasserbad oder Heizblock stehen da der R hrcheninhalt w hrend der Inkubation vollstandig umschlossen ist Wahrend des Tests darf kein Wasser oder andere nicht sterile L sungen in die Sondenreagenzr hrchen gelangen D Pr fen Sie ob die Ablesezeit des luminometers auf 2 sec eingestellt ist E Pr fen Sie die Pr zision der Pipettierger te STARK POSITIVE KONTROLLE BER 85 000 RLU A Vergewissern Sie sich da das R hrchen mit der Positivkontrolle ca 800 ul enth lt Hohe Werte k nnen darauf hinweisen da keine 300 ul Selektionsreagenz zugegeben wurden B Pr fen Sie ob die Temperatur des Wasserbades oder Heizblocks 60 1 C betr gt und ob das luminometer korrekt eingestellt ist C Vergewissern Sie sich da die R hrchen w hrend des Selektionsschrittes 10 min inkubiert werden STARK NEGATIVE KONTROLLE BER 3000 RLU A Vergewissern Sie sich da das R hrchen mit der Negativkontrolle ca 800 ul enth lt Hohe Werte k nnen darauf hinweisen da keine 300 ul Selektionsreagenz zugegeben wurden B Vergewissern Sie sich da die Temperatur des Wasserbades oder Heizblocks 60 1 C betr gt und das luminometer korrekt eingestellt ist C Vergewissern Sie sich da die R hrchen w hrend des Selektionsschrittes 10 min inkubiert werden D Achten Sie darauf da die Verschlu kappen der Positivkontrollen und der Negativkontrollen NICHT VERTAUSCHT werden E Vermeiden Sie eine statische
46. ie jedoch vorsichtig um das Mycoplasmensediment das nicht sichtbar sein kann nicht aufzuwirbeln H PROBEN IM GRAUBEREICH 1 Das Kulturwachstum in Gegenwart von Antibiotika kann zu einer Verringerung der Mycoplasmenkonzentration f hren Es ist empfehlenswert die Zellen vor der Testung zweimal in antibiotikafreien Medien zu subkultivieren Die zu testenden Medien m ssen mindestens 3 Tage mit den Zellkulturzellen in Kontakt sein 2 Die Vorbereitung einer gr Beren Probe erh ht proportional die Sensitivit t des Tests Das Sediment aus einem gr Beren Probenvolumen wird folgendermaBen vorbereitet a Nehmen Sie ein Zentrifugenr hrchen mit einem Fassungsverm gen von 10 bis 50 ml das bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert werden kann Markieren Sie sorgf ltig die Stelle an der das Sediment gebildet wird b F gen Sie die gewonnenen Medien hinzu und zentrifugieren Sie f r 15 min bei 12 000 bis 15 000 x g Entfernen Sie vorsichtig den Uberstand und verwerfen Sie diesen Es kann sein daB das Sediment nicht sichtbar ist arbeiten Sie deshalb vorsichtig um jeglichen Verlust des Sediments w hrend dieses Arbeitsschrittes zu vermeiden c Resuspendieren Sie das Sediment in 1 5 ml steriler physiologischer Kochsalzl sung oder Zellkulturmedium und fahren Sie ab Schritt 1 des Abschnittes PROBENVORBEREITUNG fort ERGEBNISSE A INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Die Ergebnisse des GEN PROBE MTC NI SCHNELLNACHWEISSYSTEMS werden auf der Basis von
47. iliser uniquement pour la d tection d une contamination bact rienne dans les chantillons de cultures cellulaires Des bact ries autres que les mycoplasmes peuvent induire une r action positive si elles sont lys es au cours de la pr paration de l chantillon Zone d incertitude Ce test ne permet pas de diff rencier les esp ces bact riennes Un r sultat n gatif ne peut pas exclure la possibilit d une contamination mycoplasmes une concentration en dessous du taux de sensibilit qui est approximativement de 100 000 mycoplasmes par ml de milieux de culture Ce test d tectera certaines autres esp ces bact riennes si elles sont lys es au cours de la pr paration de l chantillon se r f rer au paragraphe PERFORMANCE DU TEST Dans tous les cas un r sultat positif indiquera une contamination de l chantillon de culture cellulaire PERFORMANCE DU TEST L hybridation de la sonde avec un large ventail d esp ces commun ment trouv s de Acholeplasma Mycoplasma Spiroplasma et Ureaplasma ont donn des signaux positifs gt 10 organismes Les esp ces suivantes de mycoplasmes sont parmi celles test es avec le SYSTEME GEN PROBE MTC NI DE DETECTION RAPIDE Acholeplasma laidlawii Mycoplasma arginini Mycoplasma arthritidis Mycoplasma collis Mycoplasma fermentans Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma iowae Mycoplasma muris Mycoplasma negroni Mycopla
48. ionner le protocole appropri sur le Luminom tre GEN PROBE 2 Afin de retirer tout r sidu de la surface des tubes les essuyer l aide de papier absorbant humide Placer ensuite les tubes dans le Luminom tre GEN PROBE et suivre les instructions du manuel d utilisation 3 Lorsque l analyse est termin e retirer les tubes du Luminom tre GEN PROBE REMARQUES A REACTIF Le R actif 2 R actif d Hybridation et le Contr le Positif peuvent pr cipiter Chauffer et m langer 60 1 C pendant 2 minutes pour dissoudre ce pr cipit B TEMPERATURE Les tapes d Hybridation et de S lection sont des r actions thermo d pendantes Par cons quent il est imp ratif de maintenir le bain marie ou le bloc chauffant la temp rature pr conis e durant tout le test C DUREE Les tapes d Hybridation et de S lection sont des r actions d pendantes du temps L Hybridation doit durer au moins 45 minutes mais pas plus de 60 minutes Pendant l tape de SELECTION incuber les tubes R actif Sonde pendant au moins 10 minutes mais pas plus de 12 minutes D BAIN MARIE Le niveau d eau doit tre maintenu de mani re ce que la totalit du liquide r actionel contenu dans les tubes de R actifs Sonde soit immerg e E UTILISATION DU VORTEX Il est important d avoir un m lange homog ne lors de l tape de SELECTION plus particuli rement lors de l addition du R actif 3 Tous les m langes doivent tre au fond du tube pendant les incubation
49. ismo cellulare poich usano le sostanze nutritive destinate alle cellule Infine possono avere una rilevante influenza sui meccanismi di fusione cellulare 8 stato dimostrato che il 9896 delle contaminazioni nei laboratori era dovuto a sei specie appartenenti ai generi Mycoplasma e Acholeplasma 5 Queste specie sono le seguenti Acholeplasma laidlawii Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma orale Mycoplasma salivarium Mycoplasma arginini Mycoplasma hominis Il Mycoplasma hyorhinis all origine del 30 40 delle infezioni in determinati laboratori Le metodiche abitualmente impiegate per l identificazione dei micoplasmi si basano sulla coltura e la rilevazione biochimica La coltura dei micoplasmi pu richiedere fino a tre settimane E un operazione complessa perch deve essere condotta su un medium specifico e in atmosfera microaerofila Inoltre determinate specie non possono essere coltivate secondo le metodiche di routine II SISTEMA GEN PROBE MTC NI PER L IDENTIFICAZIONE RAPIDA impiega il principio dell ibridazione degli acidi nucleici e dell RNA ribosomiale rRNA per la rilevazione dei micoplasmi nelle colture cellulari 10 campioni positivi possono essere identificati nell arco di 75 minuti Il kit MTC NI GEN PROBE contiene una sonda batterica che consente di rilevare tutte le specie di Mycoplasma e di Acholeplasma in grado di contaminare le colture cellulari cosi come tutte le specie batteriche che possano essere presenti PRINCIP
50. itud de los instrumentos de pipeteado CONTROL POSITIVO ELEVADO POR SOBRE 85 000 RLU A Confirmar que el tubo de control positivo contenga aproximadamente 800 ul Lecturas elevadas pueden indicar que no se a adieron 300 ul del Reactivo de Selecci n B Verificar que la temperatura del ba o mar a o bloque calefactor es de 60 1 C y que el ajuste del lumin metro es correcto C Verificar que los tubos son incubados durante 10 minutos durante la etapa de Selecci n CONTROL NEGATIVO ELEVADO POR SOBRE 3000 RLU A Confirmar que el tubo de control negativo contiene aproximadamente 800 ul Lecturas elevadas pueden indicar que no se a adieron 300 ul del Reactivo de Selecci n B Verificar que la temperatura del ba o mar a o del bloque calefactor es de 60 1 C y que el ajuste del lumin metro es correcto C Verificar que los tubos sean incubados durante 10 minutos durante la etapa de Selecci n D NO intercambiar los tapones de los controles positivo y negativo E Eliminar la electricidad est tica limpiando los tubos con un pa o h medo o una toalla de papel antes de colocarlos en el lumin metro MUESTRAS EN LA ZONA DE INCERTIDUMBRE 3000 5000 RLU A Verificar que la temperatura de las incubaciones es de 60 1 C Debe utilizarse un term metro exacto B Verificar que la muestra es homog nea y que no quedan gotas sobre la superficie del l quido durante ninguna incubaci n C Los cultivos pueden estar contaminados c
51. ivos MTC NI incluyen los siguientes s mbolos est ndar para las instrucciones de conservaci n y manipulaci n Fecha de caducidad N mero de lote a L mite de temperatura a Los simbolos se basan en la norma europea en las recomendaciones NO CONGELAR LOS REACTIVOS PREPARACION DE LA MUESTRA El SISTEMA GEN PROBE DE DETECCION RAPIDA MTC NI ha sido dise ado para detectar la contaminaci n de los cultivos de tejidos con micoplasmas Las suspensiones celulares de los cultivos de tejidos pueden ser analizadas utilizando este m todo El test puede ser realizado en cultivos desarrollados en medios que contengan antibidticos pero los niveles de micoplasmas estaran reducidos Se recomienda transferir las c lulas sucesivamente dos veces en dos medios sin antibi ticos antes de ser analizadas Los medios por analizar deben haber estado expuestos a las c lulas por lo menos durante tres d as Remitirse a las FICHAS TECNICAS SOBRE EL PROCEDIMIENTO para el procesamiento de las muestras que no cumplan estos criterios Si es necesario las muestras pueden conservarse 7 dias a 4 C antes de realizar el test Para obtener la m xima sensibilidad las muestras deben ser preparadas en las 4 horas que siguen a la toma de muestra Si esto no es posible los medios de cultivo deben ser conservados entre 2 y 8 C durante no m s de 3 d as Las muestras pueden ser archivadas o almacenadas para analizarlas posteriormente procediendo a la etapa 3 de la PREPARACION DE LAS
52. l Campione La reazione con microrganismi Gram positivi dipende dalla capacit di lisi dei batteri durante la preparazione del campione Avvalendosi di adeguate condizioni di lisi qualsiasi organismo Gram positivo di una grande variet di taxa in grado di reagire con questo sistema sonda Non stata rilevata alcuna reazione con cellule eucariotiche bersaglio 28 104574F Rev D VALORI ATTESI A CAMPIONI Sono stati analizzati centocinquanta campioni con il sistema il kit GEN PROBE MTC NI ed il test isotopico GEN PROBE MTC valori soglia per i campioni positivi variano da 7 644 a 3 034 700 RLU valori soglia per i campioni negativi variano da 490 a 2 963 RLU Non vi campione discordante tutti i campioni positivi al test isotopico lo sono anche nel test non isotopico Tutti i campioni negativi sono risultati negativi nell insieme dei test B CONTROLLI Sono stati testati centocinquanta controlli e i risultati sono i seguenti Numero di Osservazioni Valori soglia RLU Controlli negativi 81 da 273 a 2 484 media 903 371 SD Controlli positivi 69 da 35 489 a 72 955 media 52 092 8 283 SD Questi dati sono stati forniti da pi tecnici in giorni diversi con lotti di reagenti differenti che impiegano LEADERS GEN PROBE diversi SOLUZIONE DI EVENTUALI PROBLEMI BASSO CONTROLLO POSITIVO 35 000 RLU A Controllare che la provetta di controllo positivo contenga circa 800 ul Bassi valori di lettura possono indicare che men
53. letely submerged during the reaction VORTEXING It is crucial to have a homogeneous mixture during the SELECTION step specifically after the addition of Reagent 3 All liquid must be in the bottom of the tube during the incubations MEDIA SAMPLES CONTAINING CELLS If a large number of eukaryotic cells are present in the sample i e cell suspensions centrifuge at 500 x g for 5 minutes Remove the supernatant from this low speed spin and use 1 5 mL of it as the sample Proceed from step 1 in SAMPLE PREPARATION PELLETING When preparing samples remove as much supernatant as possible from the centrifuged samples with a Pasteur pipette Remnants of media have proven to cause low false positives However be careful not to disturb the Mycoplasma pellet which may not be visible SAMPLES IN REPEAT RANGE 1 Growth of cultures in antibiotics may reduce Mycoplasma levels It is recommended that cells be passed twice in the antibiotic free media before performing the assay Media to be tested must be in contact with the tissue culture cells for a minimum of three days 2 Preparing a larger sample proportionately increases the sensitivity of the test Prepare a pellet from a larger sample volume as follows a Obtain a centrifuge tube which will contain from 10 to 50 mL and which can be centrifuged at high speed Carefully mark the position where the pellet will form b Add the collected media and centrifuge at 12 000 to 15 000 x g for 15 minut
54. lized media In addition some species cannot be cultivated by routine methods The GEN PROBE MTC NI RAPID DETECTION SYSTEM employs the principle of nucleic acid hybridization and ribosomal RNA rRNA detection 10 It is possible to detect positive samples in 75 minutes The GEN PROBE MTC NI kit utilizes an all bacterial probe that detects all species of Mycoplasma and Acholeplasma which commonly infect tissue culture as well as other bacterial species which may be present PRINCIPLES OF THE PROCEDURE Nucleic acid hybridization assays are based on the ability of complementary nucleic acid strands to come together to form stable double stranded complexes The GEN PROBE MTC NI RAPID DETECTION SYSTEM uses a single stranded DNA probe with a chemiluminescent label which is complementary to the rRNA of the target organism After the rRNA is released from the organism the labeled DNA probe combines with the target organism s rRNA to form a stable DNA RNA hybrid The Selection Reagent allows for the differentiation of non hybridized and hybridized probe The labeled DNA RNA hybrids are measured in a GEN PROBE Luminometer 7 A positive result is a luminometer reading equal to or greater than the cut off A value below this cut off is a negative result REAGENTS Reagents for the GEN PROBE MTC NI RAPID DETECTION SYSTEM are provided in two separate reagent kits GEN PROBE MTC NI KIT 50 Tests bioM rieux ref 39503 Gen Probe Cat No 104573 Reagent 1
55. m tre GEN PROBE S assurer que les volumes des r actifs de D tection et Il sont suffisant pour effectuer les tests B PREPARATION DE L ECHANTILLON 1 Transf rer la pipette 1 5 ml de culture cellulaire dans un tube pour microcentrifugeuse Identifier en marquant le c t du tube sur lequel le culot sera r alis Pour les chantillons contenant plus de 1 million de cellules eucaryotes vous r f rer au paragraphe REMARQUES 2 Centrifuger 12 000 15 000 x g pendant 10 minutes Enlever et liminer le surnageant avec une pipette Pasteur Le culot peut ne pas tre visible et des pr cautions sont prendre pour viter sa perte lors de l limination du surnageant 3 Ajouter 100 pl de R actifs d Hybridation dans le tube de microcentrifugation Agiter vigoureusement le m lange au Vortex Ces chantillons peuvent tre conserv s 20 C ou au dessous pendant un mois Les chantillons congel s doivent tre chauff s 60 1 C pendant 2 minutes Avant utilisation m langer l aide d un Vortex pour obtenir une solution homog ne C HYBRIDATION 1 D couper horizontalement la partie sup rieure du sachet en aluminium Retirer le nombre n cessaire de tubes de R actifs Sonde pour tester les chantillons et ou les souches de contr le Refermer le sachet herm tiquement en rabattant plusieurs fois son extr mit et en la fixant par un ruban adh sif ou une pince Ne pas retirer le sachet d ssicant et conserver le sac fe
56. minio cortando por la la parte superior de la bolsa Retirar un n mero suficiente de tubos de Reactivo Sonda para analizar las muestras y o los controles Volver a cerrar la bolsa doblando varias veces la parte superior y asegur ndola con una cinta adhesiva o una pinza Dejar la bolsa desecante en la bolsa y conservar la bolsa vuelta a cerrar entre 2 y 8 C 2 Colocar una etiqueta en un n mero suficiente de tubos de Reactivo Sonda para las muestras y controles Retirar y conservar los tapones 3 Pipetear 100 ul de Reactivo de Hibridaci n en el fondo de los tubos de Control Negativo 4 Pipetear 100 ul de Control Positivo en el fondo de los tubos de Control Positivo 5 Pipetear 100 ul de cada muestra en el fondo de un tubo de muestra adecuadamente etiquetado 6 Volver a cerrar todos los tubos y mezclar en el Vortex a velocidad moderada durante 1 a 3 segundos Todo el l quido debe encontrarse en el fondo de los tubos durante la incubaci n 7 Incubar durante 45 minutos a 60 1 C en ba o mar a o bloque calefactor D SELECCION 1 Retirar los tubos de Reactivo Sonda del ba o mar a o del bloque calefactor Retirar y conservar los tapones Pipetear de inmediato 300 ul de Reactivo 3 Reactivo de Selecci n en cada tubo Volver a cerrar los tubos y mezclar en Vortex a velocidad moderada durante 1 a 3 segundos Todo el l quido debe estar en el fondo de los tubos durante la incubaci n Incubar los tubos de Reactivo Sonda durante 10 minut
57. n Mycoplasmen wachsen in Zellkulturen in hohen Konzentrationen mit bis zu 10 Kolonie bildenden Einheiten pro Milliliter berstand Au erdem k nnen sich Mycoplasmen an die Zellmembranen binden 1 4 Diese Organismen denen die Zellw nde fehlen rufen normalerweise keine Tr bung in Zellkulturen hervor und k nnen deshalb visuell nicht nachgewiesen werden Mycoplasmen sind gegen ber Antibiotika die auf die Zellwand einwirken resistent so daB es schwierig ist sie aus Zellkulturen zu eliminieren Die Inzidenz und die Auswirkungen von Mycoplasma Kontaminationen in Zellkulturen wurde von Barile et al 2 und McGarrity und Kotani 6 beschrieben In bis zu 1596 der Zellinien wurden nach der Passage Infektionen nachgewiesen Es wurde deshalb empfohlen daB alle Zellinien monatlich gescreent werden sollten um eine Ausbreitung der Kontamination zu kontrollieren 3 6 9 Wenn in einer Kultur Mycoplasmen vorhanden sind kommt es zu Interferenzen bei der Untersuchung von Zellparametern Mycoplasmen k nnen Ver nderungen an den Chromosomen und den Antigenen der Zellmembranen hervorrufen Sie k nnen den Zellstoffwechsel beeinflussen da sie mit den Zellen um die N hrstoffe konkurrieren und Zellfusionsvorg nge beeinflussen 8 Es wurde gezeigt da folgende 6 Spezies aus der Gattung Mycoplasma und Acholeplasma f r 98 der Laborkontaminationen verantwortlich sind 5 Acholeplasma laidlawii Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma orale Mycoplasma sali
58. nazione da micoplasmi nelle colture cellulari Riservato esclusivamente ad un impiego di laboratorio INTRODUZIONE Le specie del genere Mycoplasma costituiscono una fonte importante di contaminazione delle colture cellulari micoplasmi che si sviluppano sulle colture cellulari possono raggiungere concentrazioni di 10 CFU colony forming units per millimetro di supernatante Inoltre i micoplasmi possono fissarsi sulle membrane cellulari 1 4 micoplasmi che sono sprovvisti di parete cellulare non modificano la torbidit delle colture cellulari e di conseguenza non possono essere rilevati visivamente Questi microrganismi sono resistenti agli antibiotici che agiscono sulla parete cellulare e questo rende difficile l eradicazione della contaminazione Le conseguenze della contaminazione delle colture da parte dei micoplasmi sono state descritte da Barile e dal suo team 2 e da McGarrity e Kotani 6 E stato dimostrato che dopo passaggio poteva risultare infettato fino al 1596 delle linee cellulari Di conseguenza si raccomanda di testare tutte le linee cellulari una volta al mese allo scopo di verificare la disseminazione dell infezione 3 6 9 micoplasmi quando sono presenti in una coltura rappresentano una fonte di interferenza per lo svolgimento dello studio dei parametri cellulari Possono far apparire anomalie cromosomiche e provocare variazioni antigeniche sulle membrane cellulari Sono anche in grado di compromettere il metabol
59. nta amostras com o dispositivo GEN PROBE MTC NI e com o teste isot pico GEN PROBE MTC Os valores limiares para as amostras positivas variam de 7 644 a 3 034 700 RLU Os valores limiares para as amostras negativas variam de 490 a 2 963 RLU N o houve amostras discordantes todas as amostras positivas pelo teste isot pico tamb m o s o pelo teste n o isot pico Todas as amostras negativas deram resultados negativos pelos dois m todos B CONTROLOS Foram testados cento e cinquenta controlos dando os seguintes resultados N mero de observa es Valores limiares RLU Controlos negativos 81 273 a 2 484 m dia 903 371 SD Controlos positivos 69 35 489 a 72 955 m dia 52 092 8 283 SD Estes dados foram obtidos por v rios t cnicos em dias diferentes com lotes de reagentes diferentes utilizando LEADERS GEN PROBE diferentes RESOLU O DE PROBLEMAS CONTROLO POSITIVO BAIXO 35 000 RLU A Confirmar se o tubo de controlo positivo cont m aproximadamente 800 ul Valores de leitura baixos podem indicar que foram acrescentados menos de 100 ul de Controlo positivo no tubo Sonda Controlo Positivo B Verificar se a temperatura do banho maria ou do bloco de aquecimento de 60 1 C C Assegurar se que o tubo de Reagente Sonda esteja imerso em banho maria ou no bloco de aquecimento de modo a que o l quido reaccional esteja completamente coberto Durante o teste evitar qualquer entrada de agua ou de solu o nao est ril nos
60. o GEN PROBE MYCOPLASMA TISSUE CULTURE NI MTC NI RAPID DETECTION SYSTEM bioM rieux r f 39503 Gen Probe Cat No 104573 MYCOPLASMA TISSUE CULTURE NI MTC NI SCHNELLNACHWEISSYSTEM bioM rieux Best Nr 39503 Gen Probe Kat Nr 104573 DETECTION DES MYCOPLASMES DANS LES CULTURES MTC NI SYSTEME DE DETECTION RAPIDE bioM rieux r f 39503 Gen Probe Cat No 104573 CULTIVO TISULAR NI DE MICOPLASMA MTC NI SISTEMA DE DETECCION RAPIDA bioM rieux ref 39503 Gen Probe Cat No 104573 MYCOPLASMA IN COLTURE CELLULARI MTC NI SISTEMA PER L IDENTIFICAZIONE RAPIDA bioM rieux cod 39503 Gen Probe Cat N 104573 MICOPLASMA TECIDO CULTURA NI MTC NI SISTEMA DE DETECCAO RAPIDA bioM rieux ref 39503 Gen Probe Cat No 104573 1 104574F Rev D o GEN PROBE MYCOPLASMA TISSUE CULTURE NI MTC NI RAPID DETECTION SYSTEM bioM rieux ref 39503 Gen Probe Cat No 104573 INTENDED USE The GEN PROBE MYCOPLASMA TISSUE CULTURE NI MTC NI RAPID DETECTION SYSTEM is a DNA probe test for the detection of mycoplasma contamination in tissue culture For laboratory use SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST Species from the genus Mycoplasma are a serious source of contamination in tissue cultures Mycoplasmas grow to high titers in cell cultures with concentrations of up to 10 colony forming units per milliliters of supernatant medium Additionally Mycoplasma may be found attached to the cell membranes 1
61. o di 100 ul di Controllo positivo siano stati aggiunti nella provetta Sonda Controllo Positivo B Verificare che la temperatura del bagnomaria o dell incubatore sia di 60 1 C C Assicurarsi che la provetta di Reagente Sonda sia immersa nel bagnomaria o nell incubatore per far s che il liquido di reazione sia completamente sommerso Durante il test evitare che l acqua o la soluzione non sterile penetri nelle provette sonda D Impostare il luminometro per una durata di lettura di 2 secondi E Verificare il materiale di pipettaggio ALTO CONTROLLO POSITIVO gt 85 000 RLU A Controllare che la provetta di controllo positivo contenga circa 800 ul Alti valori di lettura possono indicare che non sono stati aggiunti 300 ul di reagente di selezione B Verificare che la temperatura del bagnomaria o dell incubatore sia di 60 1 C e che il luminometro funzioni correttamente C Assicurarsi che le provette vengano messe in incubazione per 10 minuti durante la fase di Selezione ALTO CONTROLLO NEGATIVO gt 3000 RLU A Verificare che la provetta di controllo negativo contenga circa 800 ul Alti valori di lettura possono indicare che non sono stati aggiunti 300 ul di reagente di selezione Verificare che la temperatura del bagnomaria o dell incubatore sia di 60 1 C e che il luminometro funzioni correttamente Assicurarsi che le provette vengano messe in incubazione per 10 minuti durante la fase di SELEZIONE NON scambiare i tappi dei
62. o s o termo dependentes Consequentemente imperativo manter o banho maria ou o bloco de aquecimento temperatura preconizada durante todo o teste DURAGAO As etapas de Hibridizac o e de Selec o s o dependentes do tempo A Hibridiza o deve durar pelo menos 45 minutos mas n o mais de 60 minutos Durante a etapa de SELECCAO incubar os tubos Reagente Sonda durante pelo menos 10 minutos mas nunca mais de 12 minutos BANHO MARIA O n vel de gua deve ser mantido de maneira a que a totalidade do l quido reaccional contido nos tubos de Reagentes Sonda esteja bem imerso UTILIZA O DO VORTEX importante ter uma mistura homog nea durante a etapa de SELEC O mais especificamente desde a adi o do Reagente 3 Todas as misturas devem estar no fundo do tubo durante as incubac es AMOSTRAS DE MEIOS CONTENDO C LULAS Se um grande n mero de c lulas eucariotas est presente na amostra ou seja suspens es de c lulas centrifugar a 500 x g durante 5 minutos Retirar o sobrenadante formado e pipetar 1 5 ml como amostra Voltar etapa 1 da PREPARACAO DA AMOSTRA PREPARAGAO DO SEDIMENTO Durante a prepara o das amostras retirar o m ximo de sobrenadante das amostras centrifugadas com uma pipeta Pasteur Ficou provado que restos de meio levam a falsos positivos baixos No entanto ter cuidado em n o tocar no sedimento de micoplasmas uma vez que este pode n o ser vis vel 33 104574F Rev D H AMOSTRAS COM RESULTADO DUVIDO
63. odia haver at 15 de linhas celulares infectadas ap s passagens E em consequ ncia recomendado testar todas as linhas celulares uma vez por m s para verificar a dissemina o da infec o 3 6 9 Quando os micoplasmas est o presentes numa cultura os micoplasmas s o uma fonte de interfer ncias para o estudo dos par metros celulares Podem provocar o aparecimento de anomalias cromoss micas e de varia es antig nicas sobre as membranas celulares Podem tamb m afectar o metabolismo celular porque utilizam as subst ncias nutritivas destinadas s c lulas Por fim podem ter uma influ ncia sobre mecanismos de fus o celular 8 Mostrou se que 98 das contamina es nos laborat rios eram devidas a seis esp cies pertencendo aos g neros Mycoplasma e Acholeplasma 5 Estas esp cies s o Acholeplasma laidlawii Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma orale Mycoplasma Salivarium Mycoplasma arginini Mycoplasma hominis O Mycoplasma hyorhinis est na origem de 30 a 40 das infec es em certos laborat rios Os primeiros m todos utilizados para a detec o dos micoplasmas baseavam se na cultura e na identifica o bioqu mica A cultura dos micoplasmas pode levar at tr s semanas Ela dif cil porque deve ser realizada em meio espec fico e em atmosfera micro aer fila Al m disso algumas esp cies n o podem ser cultivadas segundo m todos de rotina O SISTEMA GEN PROBE MTC NI DE DETEC O R PIDA utiliza o princ pio de hibr
64. on un nivel muy bajo de bacterias Aumentar la sensibilidad del test tal como se describe en las OBSERVACIONES H Puede ser necesario que las c lulas pasen por lo menos dos veces despu s de sacarlas de la congelaci n antes de que haya suficientes bacterias para la detecci n D Los medios de cultivo no pueden ser congelados antes del centrifugado etapa 2 de la PREPARACION DE LAS MUESTRAS 23 104574F Rev D LECTURAS VARIABLES A B C Verificar la exactitud de los instrumentos de pipeteo Eliminar la carga est tica y cualquier residuo limpiando los tubos con un pa o h medo o toalla de papel inmediatamente antes de colocarlos en el lumin metro Verificar que todo el residuo de muestra se encuentra homog neamente resuspendido y que es transferido en su totalidad al tubo sonda Verificar el funcionamiento de las bombas del lumin metro como se indica en el manual del instrumento Verificar el calibrado del instrumento La contaminaci n de los tubos con Rnasa o bacterias puede afectar los resultados del test Utilizar t cnicas as pticas cuando se manipulan todos los tubos y reactivos 24 104574F Rev D MYCOPLASMA IN COLTURE CELLULARI MTC NI SISTEMA PER L IDENTIFICAZIONE RAPIDA bioMerieux cod 39503 Gen Probe Cat N 104573 IMPIEGO Il SISTEMA GEN PROBE PER L IDENTIFICAZIONE RAPIDA DEI MICOPLASMI NELLE COLTURE CELLULARI MTC NI un prodotto che permette la rilevazione della presenza di contami
65. os a 60 1 C en ba o mar a o en bloque calefactor Retirar los tubos de Reactivo Sonda del ba o mar a o del bloque calefactor y dejarlos a la temperatura ambiente por lo menos durante 5 minutos Retirar y eliminar los tapones Leer los resultados en el Lumin metro GEN PROBE en los 30 minutos siguientes a sacarlos del ba o mar a o del bloque calefactor E DETECCION 1 Seleccionar el protocolo apropiado en el men del software del Lumin metro GEN PROBE 2 Utilizando un pa o h medo o una toalla de papel limpiar todos los tubos para verificar que no existen residuos en la parte exterior del tubo e insertar el tubo en el Lumin metro GEN PROBE conforme a las instrucciones del instrumento 3 Una vez completado el an lisis retirar el o los tubos del lumin metro OBSERVACIONES A REACTIVO El Reactivo 2 Reactivo de Hibridaci n y el Control Positivo pueden precipitar Calentar y mezclar la soluci n a 60 1 C durante 2 minutos para disolver este precipitado B TEMPERATURA Las reacciones de Hibridaci n y Selecci n son termodependientes Por lo tanto es imperativo que el ba o mar a o el bloque calefactor se mantengan dentro del rango de temperatura especificado durante toda la prueba C TIEMPO Las reacciones de Hibridaci n y Selecci n son cronodependientes Hibridar por lo menos durante 45 minutos pero no m s de 60 minutos Incubar los tubos del Reactivo Sonda durante la etapa de SELECCI N por lo menos durante 10 minutos
66. os de Detecci n GEN PROBE bioM rieux ref 39300 Gen Probe Cat No 201791 Bloque calefactor GEN PROBE 60 1 C bioM rieux ref 39406 Gen Probe Cat No 302902 o 302903 CUIDADOS DE UTILIZACION A S lo para uso en laboratorio No utilizar para el diagn stico Utilizar las precauciones habituales cuando se realiza este ensayo Utilizar para la detecci n de contaminaci n con micoplasmas en cultivos tisulares Utilizar s lo el material de laboratorio suministrado o el material desechable especificado moogm Evitar el contacto de los Reactivos de Detecci n y II con la piel los oros y las membranas mucosas Lavar con agua si estos reactivos entran en contacto con la piel Si se derraman estos reactivos diluir con agua antes de secar CONSERVACION Los tubos del Reactivo Sonda deben ser conservados en las bolsas de aluminio entre 2 y 8 C Los tubos del Reactivo Sonda son estables en las bolsas cerradas hasta la fecha de caducidad indicada Una vez abiertas las bolsas deben ser cerradas nuevamente conservadas entre 2 y 8 C y los tubos deben ser utilizados en el mes siguiente a su apertura y antes de la fecha de caducidad El control positivo debe ser conservado entre 2 y 8 C y calentado agitando suavemente a 60 C durante 2 minutos antes de utilizarlo Otros reactivos utilizados en el kit MTC NI deben ser conservados entre 2 y 25 C y son estables hasta la fecha de caducidad indicada Las etiquetas de los react
67. pero no m s de 12 minutos D BA O MARIA El nivel de agua en el ba o mar a debe mantenerse verificando que la mezcla de reacci n l quida en el tubo del Reactivo Sonda se encuentre enteramente sumergida durante la reacci n E VORTEX Es crucial contar con una mezcla homog nea durante la etapa de SELECCI N y espec ficamente despu s de a adir el Reactivo 3 Todo el l quido debe encontrarse en el fondo del tubo durante las incubaciones F MUESTRAS DE MEDIOS DE CULTIVO QUE CONTIENEN CELULAS Si se encuentra presente un elevado n mero de c lulas eucari ticas en la muestra es decir suspensiones celulares centrifugar a 500 x durante 5 minutos Retirar el 21 104574F Rev D sobrenadante de este centrifugado a baja velocidad y utilizar 1 5 ml de sta como muestra Proceder desde la etapa 1 de la PREPARACION DE LAS MUESTRAS G PREPARACION DEL SEDIMENTO Cuando se preparan las muestras retirar con una pipeta Pasteur la mayor cantidad posible de sobrenadante de las muestras centrifugadas Se ha observado que los remanentes de medio de cultivo provocan falsos positivos bajos Sin embargo tener cuidado de no alterar el residuo con micoplasmas que puede no ser visible H MUESTRAS EN ZONA DE INCERTIDUMBRE 1 El crecimiento de los cultivos con antibi ticos puede reducir los niveles de micoplasmas Se recomienda transferir las c lulas dos veces por el medio libre de antibi ticos antes de realizar el an lisis Los medios por analiza
68. r lev s et centrifuger de 12 000 15 000 x g pendant 15 minutes D canter soigneusement le surnageant et l liminer Le culot peut ne pas tre visible et toute pr caution durant cette tape doit tre prise pour le pr server c Remettre le culot en suspension dans 1 5 ml de s rum physiologique st rile ou de milieux de culture cellulaire et proc der l tape 1 de la PREPARATION DE L ECHANTILLON RESULTATS A INTERPRETATION DES RESULTATS Les r sultats du SYSTEME GEN PROBE MTC NI DE DETECTION RAPIDE sont interpr t s en fonction de valeurs seuils RLU Relative Light Unit Les chantillons produisant un signal lumineux de valeur sup rieure ou gale ce seuil sont consid r s comme positifs Les signaux lumineux inf rieures ce seuil sont consid r s comme n gatifs Lorsque le r sultat est situ dans la zone d incertitude le test doit tre r p t Si la seconde analyse donne toujours des r sultats quivoques induisant un faible contamination il faut la retester comme d crit dans le paragraphe REMARQUES Positive Negative Valeur seuil 5 000 RLU 3 000 RLU 3 000 5 000 RLU B CONTROLE DE QUALITE ET ACCEPTABILITE DES RESULTATS Les contr les n gatifs et positifs doivent satisfaire aux valeurs suivantes Contr le n gatif 3 000 RLU Contr le positif 35 000 85 000 RLU Pour v rifier la calibration machine et son fonctionnement merci de vous r f rer au manuel op ratoire LIMITES DU TEST A ut
69. r deben encontrarse en contacto con las c lulas del cultivo celular por lo menos durante tres d as 2 Al preparar una muestra de tama o grande se aumenta proporcionalmente la sensibilidad del test Preparar un residuo de un volumen considerable de muestra como sigue a Obtener un tubo de centr fuga que contenga de 10 a 50 ml y que pueda ser centrifugado a gran velocidad Marcar cuidadosamente la posici n donde se formar el residuo b A adir el medio de cultivo tomado y centrifugar entre 12 000 y 15 000 x g durante 15 minutos Decantar cuidadosamente el sobrenandante y desecharle El sedimento puede no ser visible y debe tenerse cuidado de no perderlo durante esta etapa c Volver a suspender el residuo en 1 5 ml de soluci n salina est ril o de medio de cultivo celular y proceder a la etapa 1 del procedimiento de PREPARACION DE LAS MUESTRAS RESULTADOS A INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Los resultados del SISTEMA GEN PROBE DE DETECCION RAPIDA MTC NI se basan en valores umbral de Unidades Relativas de Luz Relative Light Unit RLU Las muestras que producen una se al luminosa de valor superior o igual al valor umbral son consideradas positivas Las se ales inferiores al valor umbral son consideradas negativas Cuando el resultado se situa en la zona de incertidumbre el test debe repetirse Las muestras que siguen presentando valores en dicha zona pueden corresponder a un nivel de contaminaci n muy bajo y deben repetirse conforme se
70. re la possibilit di una contaminazione da micoplasmi con una concentrazione inferiore al tasso di sensibilit che di circa 100 000 micoplasmi per ml di terreni di coltura Questo test identificher talune altre specie batteriche se vengono lisate durante la preparazione del campione fare riferimento al paragrafo PERFORMANCE DEL TEST In ogni caso un risultato positivo indicher una contaminazione del campione di coltura cellulare PERFORMANCE DEL TEST L ibridazione della sonda con un amplio ventaglio di specie comunemente rilevate di Acholeplasma Mycoplasma Spiroplasma e Ureaplasma hanno fornito segnali positivi in gt 10 organismi Le seguenti specie di micoplasmi sono fra quelle testate con il SISTEMA GEN PROBE MTC NI PER L IDENTIFICAZIONE RAPIDA Acholeplasma laidlawii Mycoplasma arginini Mycoplasma arthritidis Mycoplasma collis Mycoplasma fermentans Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma iowae Mycoplasma muris Mycoplasma negroni Mycoplasma neurolyticum Mycoplasma orale Mycoplasma pirum Mycoplasma primatum Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pulmonis Mycoplasma sualvi Spiroplasma species Ureaplasma parvum Ureaplasma urealyticum Gli organismi Gram negativi provenienti da una grande variet di taxa producono anche segnali positivi con la sonda batterica ad ampio spettro usata in questo kit durante la preparazione come descritto nel paragrafo Preparazione de
71. remain above the surface of the liquid during either incubation C Cultures may be contaminated with a very low level of bacteria Increase the sensitivity of the test as described in PROCEDURAL NOTES H Cells may need to be passed at least twice after removal from cryogenic storage before there are sufficient bacteria for detection D Culture media cannot be frozen before centrifugation step 2 of SAMPLE PREPARATION VARIABLE READINGS A Check accuracy of pipetting instruments Eliminate static charge and any residue by wiping tubes with a damp cloth or tissue just prior to placing in the luminometer Ensure that the entire sample pellet is homogeneously resuspended and that all of it is transferred to the probe tube Check function of luminometer pumps as directed by the instrument manual Check instrument calibration moogm Contamination of tubes or reagents with RNase or bacteria may affect test results Use aseptic technique when handling all tubes and reagents 6 104574F Rev D MYCOPLASMA TISSUE CULTURE NI MTC NI SCHNELLNACHWEISSYSTEM bioM rieux Best Nr 39503 Gen Probe Kat Nr 104573 VERWENDUNGSZWECK Das GEN PROBE MYCOPLASMA TISSUE CULTURE NI MTC NI SCHNELLNACHWEISSYSTEM ist ein DNA Sonden Test zum Nachweis von Mycoplasma Kontaminationen in Zellkulturen F r den Labor Gebrauch ZUSAMMENFASSUNG UND TESTERKLARUNG Spezies der Gattung Mycoplasma sind eine ernstzunehmende Ursache f r Kontaminationen in Zellkulture
72. rm 2 8 C 2 Etiqueter un nombre suffisant de tubes de R actif Sonde pour tester les chantillons et les souches de contr le Oter et conserver les bouchons 3 Distribuer 100 ul de R actif d Hybridation au fond des tubes de Contr le N gatif 4 Distribuer 100 ul de Contr le Positif dans le fond des tubes de Contr le Positif 5 Distribuer 100 ul de chaque chantillon dans le fond des tubes chantillon appropri 6 Reboucher tous les tubes et agiter vitesse mod r e le m lange au Vortex pendant 1 3 secondes Durant toute l incubation tous les chantillons devront tre au fond des tubes 7 ncuber pendant 45 minutes 60 1 C dans un bain marie ou un bloc chauffant D SELECTION 1 Retirer les tubes de R actif Sonde du bain marie ou du bloc chauffant Retirer et conserver les bouchons Distribuer imm diatement 300 ul de R actif 3 R actif de S lection dans chaque tube Refermer les tubes et agiter le m lange l aide d un Vortex pendant 1 3 secondes Durant l incubation tous les chantillons devront tre au fond des tubes Incuber les tubes de R actif Sonde pendant 10 minutes 60 1 C dans un bain marie ou un bloc chauffant Retirer les tubes de R actif Sonde du bain marie ou du bloc chauffant et les laisser temp rature ambiante au moins 5 minutes Oter et jeter les bouchons Lire les r sultats l aide du Luminom tre GEN PROBE dans la demi heure qui suit E DETECTION 1 S lect
73. s F ECHANTILLONS DE MILIEUX CONTENANT DES CELLULES Si un grand nombre de cellules eucaryotes est pr sent dans l chantillon savoir des suspensions de cellules centrifuger 500 x g pendant 5 minutes Retirer le surnageant form et transf rer 1 5 ml de celui ci comme chantillon Reprendre l tape 1 de la PREPARATION DE L ECHANTILLON 15 104574F Rev D G PREPARATION DU CULOT Lors de la pr paration des chantillons retirer un maximum de surnageant des chantillons centrifug s avec une pipette Pasteur Il a t prouv que des d bris de milieux engendrent des faux positifs bas Cependant prendre garde de ne pas troubler le culot de mycoplasmes qui peut ne pas tre visible H ECHANTILLONS EN ZONE D INCERTITUDE 1 La croissance des cultures en pr sence d antibiotiques peut r duire la concentration des mycoplasmes Il est recommand de transf rer les cellules dans deux milieux cons cutifs ne contenant pas d antibiotiques avant de les tester Les milieux test s doivent avoir t en contact avec les cellules pendant au moins trois jours 2 La pr paration d un grand nombre d chantillon favorise la sensibilit du test Pour pr parer un culot pour un grand nombre d chantillon faire comme suit a Prendre un tube centrifuger qui puisse contenir de 10 50 ml et qui puisse supporter une centrifugation grande vitesse Marquer soigneusement la position du culot lorsqu il se formera b Ajouter les milieux p
74. s podem estar contamidadas com uma concentrac o muito baixa de bact rias Aumentar a sensibilidade do teste como est descrito no par grafo NOTAS H As c lulas podem precisar de duas subculturas ap s as ter retirado da congelac o de modo a ter um n mero suficiente de bact rias para a detecc o D Os meios de cultura n o podem ser congelados antes da centrifuga o etapa 2 do par grafo PREPARA O DA AMOSTRA 35 104574F Rev D LEITURAS VARI VEIS A B C Verificar o funcionamento do material de pipetagem Eliminar a electricidade est tica limpando os tubos com papel absorvente ou tecido h mido antes de os colocar no lumin metro Assegurar se que a totalidade do sedimento da amostra est novamente em suspens o de forma homog nea e que foi transferido para o tubo sonda Verificar o funcionamento das bombas do lumin metro como indicado no Manual do Aparelho Verificar a calibra o do aparelho A contaminac o dos tubos ou dos reagentes com RNase ou bact rias pode afectar os resultados do teste Utilizar uma t cnica ass ptica durante a manipula o dos tubos e dos reagentes 36 104574F Rev D BIBLIOGRAPHY BIBLIOGRAPHIE LITTERATURE BIBLIOGRAFIA 1 10 Barile M F 1977 Mycoplasma contamination of cell cultures a status report p 291 334 Cell culture and its applications Academic Press New York New York Barile M F H E Hoops and M W Grabowski 1978 Incidence and sour
75. s por mililitro de sobrenadante Adem s pueden encontrarse micoplasmas adheridos a las membranas celulares 1 4 Estos organismos que carecen de pared celular no producen habitualmente turbidez en los cultivos celulares y no pueden por lo tanto ser detectados visualmente Los micoplasmas son resistentes a los antibi ticos que act an sobre la pared celular y por lo tanto son dif ciles de eliminar de los cultivos celulares La incidencia y los efectos de la contaminaci n con micoplasmas en los cultivos celulares han sido descritos por Barile y col 2 y por McGarrity y Kotani 6 Se ha demostrado que puede haber hasta un 15 de l neas celulares infectadas despu s de hacer pases Por lo tanto se recomienda estudiar todas las l neas celulares cada mes con el fin de controlar la diseminaci n de la contaminaci n 3 6 9 Cuando est n presentes en un cultivo los micoplasmas interfieren con los par metros celulares de la investigaci n Los micoplasmas pueden inducir anormalidades cromos micas y alterar la antigenicidad de las membranas celulares Pueden afectar el metabolismo de las c lulas compitiendo por los nutrientes y ejerciendo influencia sobre los procesos de fusi n celular 8 Se ha demostrado que seis especies de los g neros Mycoplasma y Acholeplasma producen el 98 de las infecciones de laboratorio 5 Estas especies son Acholeplasma laidlawii Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma orale Mycoplasma salivarium Mycoplasma ar
76. s r sultats sont les suivants Nombre d observations Valeurs seuils RLU Contr les n gatifs 81 273 2 484 moyenne 903 371 SD Contr les positifs 69 35 489 72 955 moyenne 52 092 8 283 SD Ces donn es ont t rendues par plusieurs techniciens des jours diff rents avec des lots de r actifs diff rents utilisant des LEADERS GEN PROBE diff rents RESOLUTION D INCIDENTS CONTR LE POSITIF BAS 35 000 RLU A Cont ler que le tube de contr le positif contient approximativement 800 ul Des valeurs de lecture faibles peuvent indiquer que moins de 100 ul de Contr le positif a t ajout dans le tube Sonde Contr le Positif B V rifier que la temp rature du bain marie ou du bloc chauffant est de 60 1 C C S assurer que le tube de R actif Sonde soit immerg dans le bain marie ou le bloc chauffant afin que le liquide r actionnel soit compl tement recouvert Pendant le test viter toute entr e d eau ou de solution non st rile dans les tubes sonde R gler le luminom tre pour un temps de lecture 2 secondes E V rifier le mat riel de pipetage CONTR LE POSITIF HAUT gt 85 000 RLU A Contr ler que le tube de contr le positif contient approximativement 800 ul Des valeurs de lecture hautes peuvent indiquer que 300 ul de r actif de s lection n a pas t ajout B V rifier que la temp rature du bain marie ou du bloc chauffant est de 60 1 C et que le luminom tre fonctionne correct
77. se ales positivas con gt 10 organismos Las siguientes especies de micoplasmas se encuentran entre las analizadas con el SISTEMA GEN PROBE DE DETECCION RAPIDA MTC NI Acholeplasma laidlawii Mycoplasma arginini Mycoplasma arthritidis Mycoplasma collis Mycoplasma fermentans Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma iowae Mycoplasma muris Mycoplasma negroni Mycoplasma neurolyticum Mycoplasma orale Mycoplasma pirum Mycoplasma primatum Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pulmonis Mycoplasma sualvi Spiroplasma species Ureaplasma parvum Ureaplasma urealyticum 22 104574F Rev D Los organismos Gram negativos de una amplia variedad de g neros tambi n dieron se ales positivas con la sonda bacteriana de amplio espectro contenida en este kit cuando se prepararon siguiendo las indicaciones de la secci n Preparaci n de la muestra La reacci n frente a organismos Gram positivos depende de la capacidad del m todo de preparaci n de la muestra para lisar los organismos En condiciones de lisis adecuadas todos los organismos Gram positivos de una amplia variedad de g neros tambi n reaccionar n a este sistema de sonda No se ha observado reacci n a las dianas eucari ticas VALORES ESPERADOS A MUESTRAS Fueron analizadas 150 muestras utilizando el kit MTC NI GEN PROBE y la prueba isot pica MTC GEN PROBE Los valores umbral para las muestras positivas variaron de 7 644 a 3 034 7
78. sferir as c lulas sucessivamente para dois meios sem antibi ticos antes de as testar Os meios testados devem ter estado em contacto com as c lulas durante pelo menos tr s dias Consultar o par grafo NOTAS para a an lise de amostras n o respondendo a estes crit rios Se necess rio as amostras podem ser conservadas 7 dias a 4 C antes de ser feito o teste Para uma maior sensibilidade as amostras devem ser preparadas at 4 horas ap s a colheita coleta Em caso de impossibilidade os meios podem ser conservados a 2 8 C durante um m ximo de 3 dias As amostras podem ser guardadas ou conservadas para ensaios posteriores procedendo at a etapa 3 da PREPARA O DA AMOSTRA O tamp o de hibridiza o dever juntar se ao sedimento e a amostra conservada a 20 C ou abaixo durante um m s NOTA As amostras turvas est o provavelmente contaminadas com leveduras ou outro tipo de bact rias e devem ser eliminadas PROCEDIMENTO A PREPARA O DO MATERIAL 1 Regular a temperatura do bloco de aquecimento ou do banho maria a 60 1 C 2 Preparar o Lumin metro GEN PROBE Assegurar se que os volumes dos reagentes de Detec o e Il s o suficientes para efectuar os testes 32 104574F Rev D PREPARAGAO DA AMOSTRA 1 Pipetar 1 5 ml de cultura celular para um de microcentr fuga Identificar e marcar o lado do tubo no qual se formar o sedimento Para as amostras contendo mais de 1 milh o de c lulas eucariotas consultar o par gr
79. sification J Bacteriol 171 6455 6467 37 104574F Rev D Gen Probe and associated logos are trademarks and or registered trademarks of Hologic Inc and or its subsidiaries in the United States and or other countries Gen Probe und die zugeh rigen Logos sind Marken und oder eingetragene Marken von Hologic Inc und oder seinen Tochterunternehmen in den Vereinigten Staaten und oder anderen L ndern Gen Probe et les logos associ s sont des marques commerciales et ou des marques d pos es d Hologic Inc et ou de ses filiales aux Etats Unis et ou dans d autres pays Gen Probe y los logotipos asociados son marcas comerciales y o marcas comerciales registradas de Hologic Inc y o de sus subsidiarias en los Estados Unidos y o en otros pa ses Gen Probe e i relativi loghi sono marchi commerciali e o marchi commerciali registrati di Hologic Inc e o delle aziende consociate negli Stati Uniti e o in altri paesi Manufactured by Hergestellt von Fabriqu par Fabricado por Prodotto da Fabricado por Gen Probe Incorporated San Diego CA 92121 USA Distributed by Vertrieb durch Distribu par Distribuido por Distribuito da Distribu do por bioM rieux s a 69280 Marcy l Etoile FRANCE 104574F Rev D 2013 03 1999 2013 Gen Probe Incorporated 38 104574F Rev D
80. sma neurolyticum Mycoplasma orale Mycoplasma pirum Mycoplasma primatum Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pulmonis Mycoplasma sualvi Spiroplasma species Ureaplasma parvum Ureaplasma urealyticum 16 104574F Rev D Les organismes Gram n gatif provenant d une grande vari t de taxons produisent aussi des signaux positifs avec la sonde bact rienne large spectre utilis e dans ce coffret lors de la pr paration comme d crit dans le paragraphe Pr paration de l Echantillon La r action avec des microorganismes Gram positifs d pend de la capacit de lyse des bact ries au cours de la pr paration de l chantillon En utilisant des conditions de lyse appropri es tout organisme Gram positif d une grande vari t de taxons peuvent aussi r agir avec ce syst me sonde Aucune r action avec des cellules eukaryotes cibles n a t observ e VALEURS ATTENDUES A ECHANTILLONS Cent cinquante chantillons ont t test s avec le coffret GEN PROBE MTC NI et le test isotopique GEN PROBE MTC Les valeurs seuils pour les chantillons positifs varient de 7 644 3 034 700 RLU Les valeurs seuils pour les chantillons n gatifs varient de 490 2 963 RLU Il n y a pas d chantillon discordant tous les chantillons positifs par le test isotopique le sont aussi par le test non isotopique Tous les chantillons n gatifs ont t trouv n gatifs dans l ensemble des tests B CONTROLES Cent cinquante contr les ont t test s et le
81. st bestimmte andere Bakterienspezies nach wenn sie durch die Probenvorbereitungsverfahren lysiert wurden siehe Abschnitt PERFORMANCE Ein positives Ergebnis zeigt in jedem Fall eine Kontamination der Zellkulturprobe an PERFORMANCE Die Sonde ist mit einer groBen Auswahl h ufig vorkommender Spezies von Acholeplasma Mycoplasma Spiroplasma und Ureaplasma hybridisiert die positive Signale bei gt 10 Organismen ergaben Folgende Mycoplasma Spezies geh ren zu den mit dem GEN PROBE MTC NI SCHNELLNACHWEISSYSTEM getesteten Spezies Acholeplasma laidlawii Mycoplasma arginini Mycoplasma arthritidis Mycoplasma collis Mycoplasma fermentans Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma iowae Mycoplasma muris Mycoplasma negroni Mycoplasma neurolyticum Mycoplasma orale Mycoplasma pirum Mycoplasma primatum Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pulmonis Mycoplasma sualvi Spiroplasma species Ureaplasma parvum Ureaplasma urealyticum Gramnegative Bakterien einer groBen Vielzahl an Spezies ergeben mit der in diesem Kit enthaltenen Breitspektrum Sonde ebenfalls positive Signale wenn sie gem den Anweisungen im Abschnitt PROBENVORBEREITUNG vorbereitet werden Die Reaktion 10 104574F Rev D grampositiver Keime h ngt davon ab ob die Bakterien bei der Probenvorbereitung lysiert werden Bei entsprechenden Lysebedingungen reagieren alle grampositiven Bakterien eines breiten Spektrums an Spezi
82. strumentazione Verificare la taratura dello strumento le cariche e sia stato La contaminazione delle provette o dei reagenti con RNasi o batteri pu compromettere i risultati del test Impiegare la tecnica asettica durante la manipolazione delle provette e dei reagenti 30 104574F Rev D MICOPLASMA TECIDO CULTURA NI MTC NI SISTEMA DE DETECGAO R PIDA bioM rieux Ref 39503 Gen Probe Cat No 104573 UTILIZACAO ral O SISTEMA GEN PROBE DE DETEC O R PIDA DE MICOPLASMAS NAS CULTURAS CELULARES MTC NI um produto que permite detectar a presen a de contamina o pelos micoplasmas em culturas celulares Para uso em laborat rio INTRODU O As esp cies do g nero Mycoplasma constituem uma importante fonte de contamina o das culturas celulares Os micoplasmas que se desenvolvem em culturas celulares podem atingir concentra es de 10 UFC Unidade Formadora Col nia por millilitro de sobrenadante Al m disto os micoplasmas podem fixar se nas membranas celulares 1 4 Os micoplasmas que n o t m membrana celular n o modificam a turbidez das culturas celulares n o podendo ser detectados visualmente Estes microrganismos s o resistentes aos antibi ticos que agem sobre a membrana celular o que torna dif cil a irradica o da contamina o As consequ ncias da contamina o das culturas pelos micoplasmas foram descritas por Barile e a sua equipa 2 e por McGarrity e Kotani 6 Foi demonstrado que p
83. te la preparazione dei campioni prelevare il pi possibile di supernatante dai campioni centrifugati avvalendosi di una pipetta Pasteur E stato dimostrato che i residui di terreni causano falso positivi bassi Non dimeno aver cura di non alterare il sedimento di micoplasmi che potrebbe non essere visibile 27 104574F Rev D H CAMPIONI NELL AREA DI INCERTEZZA 1 La crescita delle colture in presenza di antibiotici pu diminuire la concentrazione dei micoplasmi Prima di effettuare il test si consiglia di ripassare due volte le cellule in due terreni di coltura che non contengano antibiotici terreni testati devono essere stati a contatto con le cellule per almeno tre giorni 2 La preparazione di un grande campione favorisce la sensibilit del test Per preparare un sedimento per un grande campione procedere nel modo seguente a Prendere una provetta da centrifugare che possa contenere da 10 a 50 ml e che sia in grado di sopportare una centrifugazione a grande velocit Segnare con cura la posizione di formazione del sedimento b Aggiungere terreni prelevati e centrifugare da 12 000 a 15 000 x g per 15 minuti Decantare con la massima cura il supernatante ed eliminarlo Il sedimento potrebbe non essere visibile e di conseguenza occorre adottare tutte le precauzioni necessarie durante questa fase per preservarlo c Rimettere il sedimento in sospensione in 1 5 ml di siero fisiologico sterile o di medium cellulare Procedere alla fase 1
84. th or heat block so as to completely cover the liquid contents during the reaction Do not allow any water or other non sterile solutions to enter the probe tubes during the assay D Check luminometer settings to confirm a reading time of 2 seconds E Check accuracy of pipetting instruments HIGH POSITIVE CONTROL ABOVE 85 000 RLU A Confirm that the positive control tube contains approximately 800 pL High readings may indicate that 300 uL of the selection reagent was not added B Check that the temperature of the water bath or heat block is 60 1 C and that the luminometer settings are correct C Ensure that the tubes are incubated for 10 minutes during the Selection step HIGH NEGATIVE CONTROL ABOVE 3000 RLU A Confirm that the negative control tube contains approximately 800 uL High readings may indicate that 300 uL of the Selection Reagent was not added Check that the temperature of water bath or heat block is 60 1 C and that the luminometer settings are correct Ensure that the tubes are incubated for 10 minutes during the SELECTION Step DO NOT interchange the caps of positive and negative controls moom Eliminate static charge by wiping tubes with a damp cloth or tissue just prior to placing in the luminometer SAMPLES IN THE REPEAT RANGE 3000 5000 RLU Check that the temperature of the incubations is 60 1 C An accurate thermometer must be used m Check that the sample is homogeneous and that no drops
85. the sample preparation method to lyse the organisms With appropriate lysis conditions all Gram positive organisms from a wide range of taxa also react with this probe system No reaction to eukaryotic targets has been observed EXPECTED VALUES A SAMPLES One hundred and fifty samples were tested using GEN PROBE MTC NI kit and the GEN PROBE MTC isotopic assay RLU values for positive samples ranged from 7 644 to 3 034 700 RLU RLU values for the negative samples ranged from 490 to 2 963 RLU There were no discrepant samples all samples positive by the isotopic assay were also positive by this non isotopic assay all negative samples were determined to be negative in both assays B CONTROLS One hundred and fifty controls were tested and gave the following results Number of Observations RLU Values Negative Controls 81 273 to 2 484 mean 903 371 SD Positive Controls 69 35 489 to 72 955 mean 52 092 8 283 SD 5 104574F Rev D These data were generated by several technicians on different days with multiple lots of reagents using various GEN PROBE LEADERS TROUBLESHOOTING LOW POSITIVE CONTROL BELOW 35 000 RLU A Confirm that the positive control tube contains approximately 800 pL Low readings may indicate that less than 100 uL of Positive Control was added to the Positive Control probe tube B Check that the temperature of the water bath or heat block is 60 1 C C Ensure that the probe tube is immersed in water ba
86. tro OSSERVAZIONI A REAGENTE il Reagente 2 Reagente di Ibridazione pu precipitare Riscaldare e mescolare a 60 C 1 C per 2 minuti per sciogliere il precipitato B TEMPERATURA L Ibridazione e la Selezione sono reazioni temperatura dipendenti Di conseguenza indispensabile mantenere il bagnomaria o l incubatore alla temperatura raccomandata per l intera durata del test C DURATA DELLE OPERAZIONI Le reazioni di Ibridazione e Selezione dipendono dal tempo L ibridazione deve durare come minimo 45 minuti e come massimo 60 minuti Durante la SELEZIONE mettere le provette di Reagente Sonda in incubazione almeno per 10 minuti senza superare per il limite dei 12 minuti D BAGNOMARIA II livello d acqua deve essere sufficientemente alto per far si che la totalita del liquido di reazione delle provette di Reagente Sonda sia completamente sommerso E USO DEL VORTEX fondamentale disporre di una miscela omogenea durante la SELEZIONE in modo particolare dopo l aggiunta del Reagente 3 Tutte le miscele devono trovarsi sul fondo della provetta durante le fasi di messa in incubazione F CAMPIONI DI TERRENI CONTENENTI DELLE CELLULE se un elevato numero di cellule eucariotiche presente nel campione vale a dire delle sospensioni cellulari centrifugare a 500 x g per 5 minuti Prelevare il supernatante e trasportare 1 5 ml dello stesso come campione Riprendere la fase 1 della PREPARAZIONE DEL CAMPIONE G PREPARAZIONE DEL SEDIMENTO Duran
87. tubos sonda D Regular o lumin metro para um tempo de leitura de 2 segundos E Verificar o material de pipetagem CONTROLO POSITIVO ALTO gt 85 000 RLU A Confirmar se o tubo de controlo positivo cont m aproximadamente 800 ul Os valores de leitura altos podem indicar que os 300 ul de reagente de selec o nao foram adicionados B Verificar se a temperatura do banho maria ou do bloco de aquecimento de 60 1 C e se o lumin metro funciona correctamente C Confirmar se os tubos s o incubados 10 minutos durante a etapa de Selecc o CONTROLO NEGATIVO ALTO 3000 RLU A Controlar se o tubo de controlo negativo cont m aproximadamente 800 ul Valores de leitura altos podem indicar que os 300 ul de reagente de selec o n o foram adicionados B Verificar se a temperatura do banho maria ou do bloco de aquecimento de 60 1 C e se o lumin metro funciona correctamente C Confirmar se os tubos s o incubados 10 minutos durante a etapa de SELEC O D NAO trocar as tampas dos controlos negativos e positivos E Eliminar a electricidade est tica limpando os tubos com papel absorvente ou tecido h mido antes de os colocar no lumin metro AMOSTRAS NA ZONA DUVIDOSA 3000 5000 RLU A Verificar se a temperatura das incuba es de 60 1 C Deve ser utilizado um term metro B Verificar se a amostra homog nea e se n o h nenhuma gota acima da superficie do l quido durante as incuba es C As cultura
88. ugation tape 2 du paragraphe PREPARATION DE L ECHANTILLON 17 104574F Rev D LECTURES VARIABLES A B C V rifier le fonctionnement du mat riel de pipetage Eliminer les charges statiques en essuyant les flacons avec du papier absorbant ou du tissu humide avant de les placer dans le luminom tre S assurer que la totalit du culot de l chantillon est de nouveau en suspension de fa on homog ne et qu il a t transf r dans le tube sonde V rifier le fonctionnement des pompes du luminom tre comme indiqu dans le manuel Instrument V rifier la calibration de l instrument La contamination des tubes ou des r actifs avec RNase ou des bact ries peut affecter les r sultats du test Utiliser une technique aseptique lors de la manipulation des tubes et des r actifs 104574F Rev D CULTIVO TISULAR NI DE MICOPLASMA MTC NI SISTEMA DE DETECCION RAPIDA bioM rieux ref 39503 Gen Probe Cat No 104573 UTILIZACION El SISTEMA GEN PROBE DE DETECCION RAPIDA DE MICOPLASMAS EN CULTIVOS CELULARES MTC NI es un producto que permite detectar la presencia de contaminaci n por micoplasmas en cultivos celulares Para uso en laboratorio RESUMEN Y EXPLICACION DEL TEST Las especies del g nero Mycoplasma son una fuente de contaminaci n de cultivos celulares Los micoplasmas se desarrollan hasta alcanzar elevados t tulos en los cultivos celulares con concentraciones de hasta 10 unidades formadoras de colonia
89. uld be heated at 60 1 C for 2 minutes and vortexed to achieve homogeneity prior to use in the assay HYBRIDIZATION 1 Open the foil pouch by cutting evenly across the top of the pouch Remove enough Probe Reagent Tubes to test the samples and or controls Re seal the pouch by folding the opened edge over several times and securing with adhesive tape or a clip Leave the desiccant pillow in the pouch and store the resealed pouch at 2 to 8 C Label a sufficient number of Probe Reagent Tubes for samples and controls Remove and retain the caps Pipette 100 uL Hybridization Reagent into the bottom of the Negative Control Tubes Pipette 100 uL of Positive Control into the bottom of the Positive Control Tubes Pipette 100 uL of each sample into the bottom of the appropriately labeled sample tube oa PF D Recap all tubes and vortex at moderate speed for 1 to 3 seconds to mix All liquid should be in the bottom of the tubes during the incubation 7 Incubate for 45 minutes at 60 1 C in a water bath or heat block SELECTION 1 Remove the Probe Reagent Tubes from the water bath or heating block Remove and retain the caps Immediately pipette 300 uL of Reagent 3 Selection Reagent into each tube Re cap the tubes and vortex at moderate speed for 1 to 3 seconds to mix All liquid should be in the bottom of the tubes during the incubation Incubate the Probe Reagent Tubes for 10 minutes at 60 1 C in a water bath or heating block
90. ur le SYSTEME GEN PROBE MTC NI DE DETECTION RAPIDE sont fournis en deux coffrets distincts COFFRET MTC NI GEN PROBE 50 Tests bioM rieux R f 39503 Gen Probe Cat No 104573 R actif 1 R actif Sonde P 5 x 10 tubes Contr le positif PC 1 x 2 5 ml solution d ARN tamponn e R actif 2 R actif d Hybridation H 1x 15 ml solution tamponn e R actif 3 R actif de S lection S 1 x 20 ml solution tamponn e 13 104574F Rev D COFFRET DE REACTIFS DE DETECTION GEN PROBE bioM rieux R f 39300 Gen Probe Cat No 201791 R actif de d tection RI 1 x 240 ml 0 1 de p roxyde d hydrog ne dans acide nitrique 0 001 N R actif de d tection II RII 1 x 240 ml Hydroxyde de sodium 1 N MAT RIEL REQUIS MAIS DISPONIBLE S PAR MENT Bain marie ou bloc chauffant 60 1 C Micropipettes 100 ul 300 ul Pipettes r p titives 300 ul Vortex Microcentrifugeuse 12 000 15 000 x g Tubes pour microcentrifugeuse 2 ml DISPONIBLE AUPR S DES DISTRIBUTEURS GEN PROBE GEN PROBE Luminom tre LEADER 50i bioM rieux R f 39400 Gen Probe Cat No 1031001 GEN PROBE Coffret de R actifs de D tection bioM rieux R f 39300 Gen Probe Cat No 201791 GEN PROBE Bloc chauffant 60 1 C bioM rieux R f 39406 Gen Probe Cat No 302902 ou 302903 PRECAUTIONS D UTILISATION A Usage r serv aux laboratoires Ne pas utiliser pour le diagnostic Utiliser les pr cautions d usage lors de la r alisation
91. urante 1 a 3 segundos Durante a incuba o todas as amostras dever o estar no fundo dos tubos 7 Incubar durante 45 minutos a 60 1 C em banho maria ou no bloco de aquecimento SELECC O 1 Retirar os tubos de Reagente Sonda do banho maria ou do bloco de aquecimento Retirar e conservar as tampas Distribuir imediatamente 300 ul de Reagente 3 Reagente de Selec o em cada tubo Voltar a fechar os tubos e agitar em Vortex durante 1 a 3 segundos Durante a incuba o todas as amostras devem estar no fundo dos tubos Incubar os tubos de Reagente Sonda durante 10 minutos a 60 1 C em banho maria ou num bloco de aquecimento Retirar os tubos de Reagente Sonda do banho maria ou do bloco de aquecimento e deix los temperatura ambiente pelo menos 5 minutos Retirar e eliminar as tampas Ler os resultados com o Lumin metro GEN PROBE na meia hora seguinte DETEC O 1 Seleccionar o protocolo apropriado no Lumin metro GEN PROBE 2 Para retirar qualquer res duo da superf cie dos tubos limp los com papel absorvente h mido Colocar os tubos no Lumin metro GEN PROBE e seguir as instru es do manual de utiliza o 3 Quando terminar a an lise retirar os tubos do lumin metro AS A NOT REAGENTE O Reagente 2 Reagente de Hibridiza o e o Controlo Positivo podem precipitar Aquecer e misturar a 60 1 C durante 2 minutos para dissolver este precipitado TEMPERATURA As etapas de Hibridiza o e de Selecc
92. varium Mycoplasma arginini Mycoplasma hominis In einigen Laboratorien ist Mycoplasma hyorhinis f r 30 4096 der Infektionen verantwortlich Erste Methoden zum Nachweis von Mycoplasmen basierten auf der Kultur und biochemischen Verfahren Die Anzucht von Mycoplasmen kann bis zu 3 Wochen dauern und ist aufgrund der Wachstumsanspr che dieser Organismen mikroaerophile Atmosph re und Spezialmedien schwierig AuBerdem k nnen einige Spezies mit Routinemethoden nicht angez chtet werden Das GEN PROBE MTC NI SCHNELLNACHWEISSYSTEM arbeitet nach dem Prinzip der Nukleins urehybridisierung und dem Nachweis ribosomaler RNA rRNA 10 Positive Proben k nnen innerhalb von 75 Minuten nachgewiesen werden Der GEN PROBE MTC NI Kit enth lt eine Sonde f r alle Bakterien mit der alle Mycoplasma und Acholeplasma Spezies die h ufig Zellkulturen infizieren sowie andere Bakterienspezies die vorhanden sein k nnen nachge wiesen werden PRINZIP Nukleins ure Hybridisierungstests basieren auf der F higkeit komplementarer Nukleins uresequenzen spezifisch zu hybridisieren und stabile Doppelstrang Komplexe zu bilden Der GEN PROBE MTC NI SCHNELLNACHWEISSYSTEM enth lt eine einzelstr ngige DNA Sonde an die ein Chemilumineszenzmarker gekoppelt ist Diese Sonde ist der rRNA der Zielsequenz komplement r Nachdem die rRNA des Zielorganismus freigesetzt ist verbindet sich die Sonde mit dieser und bildet einen stabilen DNA RNA Komplex Ein Selektionsreagenz baut den C

MYCOPLASMA TISSUE CULTURE NI (MTC-NI) RAPID

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