SeroMP™Recombinant IgG
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1. P50 P75 et chantillons dilu s Couvrir et incuber 1h 37 C 100 d humidit Laver 3 fois avec l tampon de lavage Ajouter 50ul de conjugu HRP dilu au 1 300 Couvrir et incuber 1 h 37 C 100 d humidit Laver 3 fois avec l tefo de lavage Ajouter 100u de TMB substrat Couvrir et incuber isiin temp rature ambiante Ajouter 100ul de solution d arr t Lire l absorbance 450 620nm Calculer et interpr ter les r sultats Trousse pour 96 d terminations 1 Microplaque rev tue d antig ne recombinants M pneumoniae 96 puits s cables 8x12 rev tus d antig nes M pneumoniae contenus dans un sachet d aluminium contenant un d shydratant 1 Plaque Tampon de lavage concentr 20 X Un tampon PBS Tween 1 flacon 100 ml UniDiluent jaune Solution tampon pr te l emploi Contient moins de de ProClin conservateur 0 05 comme 1 flacon 60 ml Contr le Positif S rum humain positif pour IgG anti M pneumoniae pr t l emploi Contient moins de 0 05 de Proclin et moins de 0 1 d azide de sodium comme conservateur 1 flacon 2 0 ml Contr le N gatif S rum humain n gatif pour IgG anti M pneumoniae pr t l emploi Contient moins de 0 05 de Proclin et moins de 0 1 d azide de sodium comme conservateur 1 flacon 2 0 ml Etalon P10 S rum humain positif pour IgG anti M pneumoniae pr t l emploi Contient 10 UA mI d IgG unit s arbit2. concurrents Evaluation interne R actions crois es Des patients hospitalis s infect s par des agents pathog nes du tractus respiratoire Chlamydia pneumoniae et EBV diagnostiqu s par des tests s rologiques commercialis s ont t aussi tudi s avec la trousse SeroMP Recombinant La plupart des s rums ont t trouv s n gatifs il n a pas t d tect de r actions crois es significatives R p tabilit pr cision Intra essai LEchantilen n N gatif Limites du dosage 1 Le diagnostic final ne doit pas reposer sur le seul r sultat s rologique Toutes les donn es cliniques et de laboratoire doivent tre prises en consid ration 2 Les chantillons dos s trop t t pendant la primo infection ne contiennent pas toujours d anticorps d celables Si une infection M pneumoniae est suspect e un second chantillon doit tre pr lev 2 4 semaines plus tard et dos en parall le avec l chantillon d origine 3 Substances interf rentes Il nest pas conseill d utiliser du s rum lip mique trouble ou contamin Du s rum contenant du pr cipit ou des particules en suspension peut conduire des r sultats erron s Ces chantillons N gatif M1261 01F 05 10 13 devraient tre clarifies par centrifugation ou par filtration avant le dosage Bibliographie de Jacobs E A Bennevwitz and W Bredt Reaction pattern of human anti Mycoplasma p
3. 05 10 13 des anticorps IgG partir d antig nes recombinant ou natif dans un groupe de patients sains Antig ne natif oa o a e Pour le groupe de patients atteint de M pneumoniae le taux de patients trouv s positifs est sup rieur avec l antig ne recombinant et les r sultats douteux ont disparu Antig ne Recombinant e Pour le groupe de patients sains le taux de patients trouv s positifs est inf rieur avec l antig ne recombinant et les r sultats douteux ont disparu Comparaison des r sultats obtenus avec les tests Savyon SeroMP Recombinant IgG IgA et IgM et des tests recombinants concurrents SeroMP Tests Groupe N Recombinant Concurrents POSITIF POSITIF Population saine 30 20 40 IgG Patients atteints de M 32 8 36 1 pneumoniae 61 Population saine 30 6 6 LA 6 6 BL 9 Patients atteints de M 55 7 42 6 pneumoniae 61 Population saine 30 6 6 3 3 IgM Patients atteints de M 64 2 44 6 pneumoniae 56 18 BL e Avec le coffret Savyon SeroMP Recombinant IgG les taux d anticorps IgG les plus forts sont repr sentatifs des infections aigu s ou en cours Alors que les tests concurrents donnent des taux d anticorps IgG lev s pour des infections pass es e De plus leur taux de d tection dans la population saine est plus faible avec le coffret Savyon SeroMP Recombinant IgG que les tests
4. CE SeroMP Recombinant IgG Trousse pour la d tection semi quantitative par dosage immuno enzymatique ELISA des anticorps IgG anti Mycoplasma pneumoniae dans le s rum humain Notice d emploi Trousse pour 96 d terminations R f rence 1261 01 Pour Diagnostic n Vitro Pour usage professionnel uniquement Conserver 2 8 C Ne pas congeler Savyon Diagnostics Ltd 3 Habosem St Ashdod 77610 ISRAEL Tel 972 8 8562920 Fax 972 8 8523176 E mail support savyondiagnostics com Indications d utilisation Le kit SeroMP Recombinant IgG est un dosage immuno enzymatique ELISA semi quantitatif pour la d tection des anticorps IgG sp cifiques Mycoplasma pneumoniae dans le s rum humain La trousse Savyon SeroMP M Recombinant IgG est utilis e comme aide dans le diagnostic des infections Mycoplasma pneumoniae Ce test permet aussi de diagnostiquer si l infection est en cours de d veloppement en d terminant la hausse d anticorps IgG partir de deux pr l vements s par s de 2 4 semaines Pour Diagnostic In Vitro Introduction Mycoplasma pneumoniae est une cause fr quente de pneumonie qui se caract rise souvent par une apparition progressive de maux de t te fi vre malaise et plus typiquement une toux s che M pneumoniae est commun tous les groupes d ge cependant il est plus fr quent dans les vingt premi res ann es de vie et il est rare chez des enfants de mo
5. IgG y 0 0171x 0 319 R 1 OD 450 620 40 IgG BU mI Interpr tation des r sultats partir d un seul pr l vement Si R gt 1 55 La diff rence est statistiquement significative p 0 005 lt Interpr tation partir du profile des anticorps IgG IgM et IgA Gr ce au profil d apparition des anticorps IgG IgM et IgA l absence d un d entre eux permet de donner des informations sur la chronologie de l infection Par exemple la pr sence d IgM et l absence d IgG peut donner une indication claire sur la stade de l infection Afin d obtenir un profil d anticorps complet les IgA et les IgM doivent tre dos s Interpr tation des r sultats partir de la d tection combin e des anticorps IgG IgM et IgA Niveau d anticorps M pneumoniae IgG IgM IgA N gatif N gatif N gatif Pas d infection M pneumoniae N gatif Positif A Infection M ou Positif Positif pneumoniae en cours Infection M Positif N gatif N gatif pneumoniae ancienne N gatif N gatif Positif Infection en cours ou IgG ou Positif 9 r infections UA mI R sultat Interpr tation diagnostique Pas d infection Performance du test M pneumoniae N gatif P srifier l int station il lt 10 Pas OU ETNEN SIpTEra ION Comparaison des r sultats obtenus pour la d tection PERE est recommand de tester un A Ne AFEA UA mI d anticorps IgG
6. cons non ouverts sont stables jusqu la date de p remption indiqu e sur la trousse L exposition des composants bouch s ou scell s temp rature ambiante pendant quelques heures n affectera pas les r actifs NE PAS CONGELER Une fois ouverte la dur e de vie de la trousse est de 90 jours 3 Les barrettes non utilis es doivent tre rescell es dans le sachet en aluminium avec les d shydratants en enroulant le c t ouvert et en fermant fortement avec la bande sur toute la longueur 4 Il est courant que des cristaux se forment dans le tampon de lavage concentr x 20 pendant sa conservation au froid Redissoudre ces cristaux en chauffant le tampon 37 C avant de le diluer Une fois dilu le tampon peut tre conserv 2 8C pendant 3 semaines Pr l vement du s rum Pr parer le s rum partir d chantillons pr lev s aseptiquement selon les m thodes classiques Ne pas utiliser du s rum inactiv par la chaleur L utilisation de s rum contamin trouble ou lipidique est fortement d conseill e Des particules et des pr cipit s dans le s rum peuvent entra ner des r sultats erron s Clarifier ces chantillons par centrifugation ou filtration avant le dosage Conservation Les chantillons doivent tre conserv s 2 8 C et dos s dans les 7 jours l addition d azide de sodium 0 1 est fortement recommand e Pour une conservation plus longue aliquoter les chantillons et les conser
7. es hautement immunog nes tels que la prot ine P1 consiste les incorporer dans les tests sous la forme d antig nes recombinants En effet plusieurs polypeptides ont t identifi s dans la litt rature comme tant de bons candidats pour cela 9 Les anticorps IgM sp cifiques M pneumoniae apparaissent rapidement apr s le d clenchement de la maladie atteignant des pics en une quatre semaines puis retombant des niveaux non significatifs du point de vue du diagnostic en l espace de quelques mois 7 Compte tenu de l apparition pr coce et de la dur e de vie relativement courte des anticorps IgM leur d tection permet de diagnostiquer une infection aigu en utilisant un seul chantillon de s rum Les patients jeunes ont tendance pr senter des taux d IgM sup rieurs ceux des adultes 8 Les taux d IgG augmentent plus lentement que les taux d IgM mais ils restent lev s plus longtemps de sorte qu une augmentation significative entre deux chantillons cons cutifs pr lev s au moins 2 semaines d intervalle peut indiquer une infection ou r infection en cours m me en l absence d IgM Les anticorps IgA se trouvent des taux plus lev s chez les patients g s 7 et ils peuvent tre plus utiles que les IgM pour diagnostiquer une infection en cours chez l adulte 8 Savyon Diagnostics Ltd a d velopp des kits semi quantitatifs utilisant des antig nes recombinants dans des dosages ELISA d IgG et IgA
8. et un kit qualitatif utilisant un m lange d antig nes recombinant et natif dans le dosage ELISA des IgM qui permettent de suivre la variation des taux d anticorps dans les s rums humains Principe du dosage e Les plaques de microtitration SeroMP Recombinant sont fournies rev tues d antig nes recombinants du Mycoplasma pneumoniae e Le s rum doser est dilu et mis incuber dans les puits de la microplaque Lors de cette tape les anticorps de M pneumoniae vont se fixer aux antig nes des puits e Les anticorps non fix s sont limin s par lavage e Des immunoglobulines anti IgG humaines conjugu es la peroxydase du raifort HRP sont ajout es Lors de cette tape le conjugu se lie au complexe antig ne anticorps fix au puits e Le conjugu non li est limin par lavage e Apr s ajout du TMB substrat celui ci est hydrolys par la peroxydase formant ainsi par r duction du substrat une r action color e bleue e Apr s ajout de la solution d arr t la coloration bleue vire au jaune et peut ensuite tre lue au spectrophotom tre 450 620 nm e L absorbance est proportionnelle la concentration en anticorps sp cifiques ayant r agi avec les antig nes fix s sur les parois des puits Proc dure de dosage Puits rev tus d antig nes recombinants M pneumoniae 4 Ajouter 50ul de contr le n gatif 50ul de contr le positif 50l Contenu de la trousse de chaque talon P10
9. ff rents puits de la barrette 7 Couvrir les barrettes avec un couvercle et incuber 1 heure 37 C en chambre humide 8 Eliminer le liquide pr sent dans les puits 9 Etape de lavage Remplir chaque puits avec le tampon de lavage jusqu en haut du puits et liminer ensuite le tampon de lavage recommencer cette tape 3 fois 10 S cher les puits en les tapotant d licatement sur du papier absorbant M1261 01F 05 10 13 C Incubation avec le conjugu 11 Afin d obtenir la solution de travail le conjugu anti IgG humaine concentr HRP doit tre dilu Diluer le conjugu HRP au 1 300 avec le UniDiluent Par exemple pour 2 barrettes pr parer un minimum de 3 ml de conjugu de la mani re suivante 10 ul de conjugu HRP anti IgG concentr m lang 3 mi de UniDiluent 12 Distribuer 50 ul de conjugu dilu dans chaque puits 13 Recouvrir les barrettes avec un couvercle et incuber 1 h 37 C en chambre humide 14 Eliminer le liquide et laver comme dans les tapes 9 et 10 D Incubation avec le TMB Substrat 15 Distribuer 100 ul de TMB substrat dans chaque puits couvrir les barrettes avec un couvercle et incuber 15 minutes temp rature ambiante 16 Arr ter la r action par ajout de 100 ul de solution d arr t H2SO4 1 M dans chaque puits E D termination des r sultats 17 D terminer l absorbance 450 620nm et enregistrer les r sultats La lecture doit se faire dans les 30 minutes maximum ap
10. ins de quatre ans Il est reconnu comme tant responsable de plus de 30 des cas de pneumonie 2 On peut retrouver M pneumoniae l origine de maladies non respiratoires telles que des manifestations neurom ning es pancr atiques ORL et du syndrome neurologique aigu au niveau du tronc c r bral 5 Etant donn sa grande fr quence on peut incriminer M pneumoniae en cas de pneumonie mais les sympt mes tant les m mes pour divers agents pathog nes d autres tests s rologiques sont n cessaires au diagnostic 3 M1261 01F 05 10 13 La technique ELISA est sensible sp cifique et permet une diff renciation des anticorps sp cifiques IgG IgA et IgM 6 Du point de vue du diagnostic et du traitement la carac t ristique structurelle saillante de MP est l absence de paroi cellulaire Il a t tabli que les polypeptides expos s en surface d clenchent une r ponse immunog ne en particulier ceux qui sont impliqu s dans l organite d attachement de MP Cet organite d attachement se compose d un complexe de polypeptides dans lequel la prot ine cytadh sine P1 joue un r le majeur 1 4 10 Compte tenu de sa forte immunog nicit la prot ine P1 est un mod le pour l utilisation d un antig ne d finitif dans des syst mes de diagnostic bas s sur la s rologie en essayant d am liorer divers param tres de performances de l essai Une mani re courante d am liorer les performances d essais utilisant des polypeptid
11. l et embouts jetables Flacon d un litre Eprouvette de 50 ml Bouteille de lavage Papier absorbant Agitateur Vortex Bain marie 37 C avec couvercle 10 Lecteur de plaque ELISA avec filtres 450 et 620 nm 11 Eau distill e ou bidistill e Avertissements et Pr cautions Pour Diagnostic In Vitro 1 La trousse contient du s rum humain qui a t test par des techniques approuv es par la FDA et a t trouv n gatif vis vis des antig nes HBV et des anticorps anti HCV et anti HIV 1 et 2 Puisqu il n existe aucune m thode garantissant l absence totale d agents pathog nes on doit consid rer tout mat riau d origine humaine comme tant potentiellement infectieux C est pourquoi il faudra le manipuler avec pr caution selon les conseils publi s dans le manuel Biosafety in Micro Biological and Biomedical Laboratories 1988 de CDC NIH La solution de TMB Substrat est irritante pour la peau et les muqueuses Eviter le contact direct Tous les composants de cette trousse ont t talonn s et 1 test s par lot Ne pas m langer provenant de lots diff rents des composants L acide sulfurique dilu H2SO4 1M est irritant pour les yeux et la peau En cas de contact avec les yeux rincer grande eau imm diatement et consulter un m decin Conservation et dur e de vie des r actifs Tous les r actifs fournis doivent tre conserv s 2 8 C Les fla
12. nd pr l vement et ouid des anticorps IgG partir d antig nes recombinant ou d tect s PARIS ELEMENT CUOU CE natif dans un groupe de patients atteint de M rechercher les anticorps IgM p et lg A2 pneumoniae Infection Antig ne Antig ne M pneumoniae en cours ou Ea i Positif pass e 2 2 gt 10 Concentration Pour v rifier l interpr tation il UA mI d anticorps IgG est recommand de tester un significative second pr l vement et ou de N gatif rechercher les anticorps IgM et IgA Comparaison des r sultats obtenus pour la d tection Interpr tation des r sultats partir deux pr l vements Dans les cas de r sultats n gatifs pour lesquels il est n cessaire de diff rencier une infection en cours d une absence d infection et dans les cas de r sultats positifs pour lesquels il est n cessaire de diff rencier une infection pass e et d une infection en cours actuelle il est conseill de pr lever un deuxi me chantillon apr s 2 4 semaines Une augmentation significative de la valeur en UA mi du deuxi me chantillon indique une infection en cours Pour valuer si la diff rence entre les 2 mesures est significative au moins un des deux pr l vements doit tre positif La diff rence entre les deux pr l vements devra tre calcul e comme suit BU2 15 R BU1 15 BU1 Concentration en UA mI du premier chantillon BU2 Concentration en UA mI du second chantillon M1261 01F
13. neumoniae antibodies in enzyme linked immunosorbent assays and immunoblotting J Clin Microbiol 23 3 517 22 1986 Liberman D Schlaffer F Boldur l Liberman D Horowitz S Friedman M G Leioninen M Horowitz O Manor E and Porath A 1996 Multiple pathogens in adult patients admitted with Community aquired pneumonia a one year prospective study of 346 consective patients Thoras 1996 51 179 184 Lieberman D Shvartzman P Lieberman D Ben Yaakov M Lazarovich Z Hoffman S Mosckovitz R Ohana B Leinonen M Luffy D and Boldur I 1998 Etiology of Respiratory Tract Infection in Adults in a General Practice Setting Eur J Clin Bicrobiol Infect Dis 17 685 689 Macadam S and N Cimolai Anti Mycoplasma pneumoniae secretory antibody in human breast milk Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 43 3 247 250 2002 Okada T Kato I Miho l Minami S Kinoshita H Akao l Kemmochi M Miyabe S and Takeyama I 1996 Acute Sensorimeural Hearing Loss Cause by M Pneumoniae Acute Otolaryngol Stockh 1996 522 22 25 Raisanen S M Suni J l and Leinikki P O 1980 Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections by enzyme immunoassay J Clin Pathol 33 836 840 Seggav J S Sedmark G V and Krup V 1996 Isotype specific antibody responses to acute M pneumoniae infection Ann Allergy Asthma Immuno 77 67 73 Samra Z and Gadba R 1993 Diagnosis of Mycoplasma pneumo
14. niae infection by specific IgM antibodies using a new capture enzyme immunoassay Eur J Epidermol 9 97 99 Tuuminen T and R Vainionpaa Development of enzyme immunoassays to detect salivary sigA to Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae Scandinavian Journal of Clinical amp Laboratory Investigation 61 5 357 362 2001 10 Tuuminen T S Varjo H Ingman T Weber J Oksi and M Viljanen Prevalence of Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae immunoglobulin G and A antibodies in a healthy Finnish population as analyzed by quantitative enzyme immunoassays Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 7 5 734 738 2000 CE European Authorized Representative Obelis s a Boulevard G n ral Wahis 53 B 1030 Brussels Belgium Tel 32 2 732 59 54 Fax 32 2 732 60 03 E mail mail obelis net di Limitation de temp rature Consulter la notice Dispositif m dical pour le diagnostic in vitro all Fabricant Repr sentant Ec ner autoris en Europe
15. r s l arr t de la r action color e e Note Toute bulle d air doit tre limin e avant la lecture Le fond de la plaque ELISA doit tre soigneusement essuy Validation du dosage Afin de valider le dosage les crit res suivants doivent tre v rifi s et valid s Si ces crit res ne sont pas remplis le dosage est invalid et doit tre refait 1 D O p75 gt 1 2 2 Rapport D O p40 D O cn gt 1 5 3 Rapport D O p50 D O cn gt 4 4 Rapport D O p75 D O cn gt 6 5 Contr le Positif devra tre gt 40 UA ml Calcul des r sultats M thode manuelle avec du papier millim tr 1 Reporter les valeurs d absorbance D 0 des 3 talons P10 P50 et P75 en ordonn es en fonction de leur concentration UA ml en abscisses 2 Tracer partir des points la courbe la mieux adapt e 3 partir de la courbe d talonnage interpoler la valeur des concentrations en UA nl des chantillons correspondant chaque absorbance mesur e exemple 1 Exemple 1 Interpolation des r sultats Lire la valeur d absorbance des chantillons sur l axe des ordonn es Y et tracer une ligne horizontale jusqu la courbe d talonnage Au point d intersection de la courbe d talonnage tracer une ligne verticale jusqu l axe des abscisses X Lire la concentration de l chantillon en UA ml Po w 0480 so so 1 es 75 1 608 Sample x za0 vi 100 Sero MP recombinant
16. raires Contient moins de 0 1 d azide de sodium et moins de 0 05 de Proclin comme conservateur 1 flacon 2 0 ml Etalon P50 S rum humain positif pour IgG anti M pneumoniae pr t l emploi Contient 50 UA ml d IgG unit s arbitraires Contient moins de 0 1 d azide de sodium et moins de 0 05 de Proclin comme conservateurs 1 flacon 2 0 ml M1261 01F 05 10 13 10 11 12 Couvercle pour plaque Etalon P75 S rum humain positif pour IgG anti M pneumoniae pr t l emploi Contient 100 UA mI IgG unit s arbitraires Contient moins de 0 1 d azide de sodium et moins de 0 05 de Proclin comme conservateurs 1 flacon 2 0 ml Conjugu HRP concentr X 300 Conjugu d anti lgG humaines sp cifiques de la cha ne y conjugu la peroxydase du raifort Contient moins de 0 05 de Proclin comme conservateur 1 flacon 0 2 ml TMB Substrat Solution pr te l emploi Contient 3 3 5 5 t tram thylbenzidine comme chromog ne et du peroxyde comme substrat 1 flacon 14 ml Solution d arr t Solution pr te l emploi Contient 1M H2SO4 1 flacon 15 ml 1 unit 13 Manuel d utilisation 1 Mat riel n cessaire mais non fourni 1 2 w O J O O1 BR Tubes de dosage propres pour la dilution des s rums des patients Flacon plastique jetable pour la dilution du conjugu HRP concentr Micropipettes gradu es pipettes multicanaux 5 50 50 200 et 200 1000 u
17. ver 20 C Eviter les d cong lations et cong lations r p t es Proc dure de dosage Manuelle Proc dure sur automate disponible sur demande A Pr paration des r actifs 1 Porter tous les composants et les chantillons cliniques temp rature ambiante Bien m langer les talons P10 P50 P75 le contr le n gatif contr le positif et les chantillons avant utilisation 2 D terminer le nombre total d chantillons tester En plus de ces chantillons pr voir pour chaque dosage un puits pour le contr le n gatif contr le positif et trois puits pour les 3 talons P10 P50 P75 3 Retirer la microplaque de son sachet d aluminium en coupant l extr mit de l emballage Placer le nombre de puits n cessaires pour le dosage sur le support selon le nombre d chantillons tester 4 Diluer le tampon concentr au 1 20 avec de l eau distill e par exemple pour 1 litre de tampon de lavage ajouter 50 mi de tampon de lavage concentr 950 ml d eau distill e ou bidistill e B Incubation des s rums et des contr les 5 Diluer chaque s rum de patient au 1 105 avec le UniDiluent comme suit Ajouter 10 ul de s rum de patient 200 ul de UniDiluent 1 21 et diluer ensuite en ajoutant 25 ul de dilution au 1 21 100 ul de UniDiluent 6 Distribuer 50 ul de contr le n gatif contr le positif des 3 talons P10 P50 P75 et d chantillon s rique dilu au 1 105 dans les di
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