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Protocoles

1. gt Chaque chantillon doit avoir une r f rence unique m me s il s agit de capsules faites partir du m me chantillon et il est fortement recommand d utiliser des r f rences caract ristiques qui ont peu de chances d tre aussi employ es par un autre utilisateur ne pas utiliser par ex les n de r f rence des puits A1 A2 etc ou Ech 1 Ech 2 gt Sauvegarder le fichier Excel en le renommant avec le m me nom que la r f rence de la bo te 4 Cas des chantillons enrichis Les isotopes stables peuvent utilis s pour des exp rimentations bas es sur des enrichissements partir de produits contenant gt 95 d un l ment enrichi De tr s grandes pr cautions doivent tre prises toutes les tapes de la pr paration d chantillons enrichis la moindre contamination a un effet d sastreux sur les mesures en abondance naturelle En particulier il est demand aux utilisateurs d tre tr s vigilants sur les points suivants le taux d enrichissement ne doit pas d passer 3 comme c est le cas des algues ou proies marqu es dans les exp riences de grazing Leur analyse doit se faire en les diluant par le m me chantillon non marqu au moment de la pes e dans la capsule introduire une toute petite quantit d chantillon marqu 1 20 ou 1 10 de la masse totale que devra contenir la capsule noter le poids puis rajouter une quantit du m me chantillon non marqu dont la signature natur
2. Si les analyses doivent tre faites sur diff rents niveaux s dimentaires ceux ci doivent tre d coup s imm diatement sur le terrain selon leur volume il sont alors plac s soit dans des sacs plastique soit dans des flacons soit dans des bo tes de Petri Les chantillons doivent tre conserv s au frais et l abri de la lumi re si la chlorophylle doit aussi tre mesur e Les chantillons sont ensuite s ch s par lyophilisation r duits en poudre grossi re au mortier pilon et tamis s sur 250 um pour enlever les tr s grosses particules Le s chage en tuve est possible mais peut conduire cas de la vase l obtention d une structure tr s dure difficile broyer sur laquelle il est tr s difficile de r aliser le tamisage pr alable n cessaire Les chantillons sont ensuite broy s finement cf 8 1 1 3 et conserv s au sec temp rature ambiante ou au cong lateur 1 2 2 D carbonatation Les s diments contiennent des quantit s tr s variables de carbonates et la force de l acide devra tre ajust e en cons quence en faisant des tests placer 100 mg de s diment sec dans un tube ajouter 1 ml d HCL 1 N Si la formation de bulles n est pas importante la force de l acide peut tre r duite 0 5 N si elle est tr s importante utiliser de l HCL 2 N Suivre ensuite la proc dure standard cf 8 1 1 5 Attention La plupart des s diments littoraux contiennent des quantit s non n gligeables de carb
3. double ou triple paisseur sur l ouverture des puits avant de refermer le couvercle Deux morceaux de ruban adh sif de laboratoire suffisent maintenir le couvercle mais pour plus de s curit entourer la plaque dans une feuille d aluminium viter le parafilm 12 Ne pas utiliser ni papier type papier filtre ou essuie tout pouvant amener des fibres ni parafilm qui peut laisser des traces de carbone type p trole Les plaques peuvent tre envoy es par la poste en tant prot g es des chocs boite ou enveloppe matelass e suffisamment paisse 3 Formulaire de demande d analyses Les chantillons doivent tre r f renc s dans un formulaire de demande d analyses Classeur Excel qui doit obligatoirement tre adress par courriel aux responsables de la plateforme Une proc dure l g rement modifi e a t mise en place Chaque plaque d chantillons doit tre accompagn e d un formulaire distinct une seule feuille par fichier la nouvelle version du formulaire a t simplifi e en cons quence elle ne permet plus la g n ration automatique de feuilles pour des plaques suppl mentaires Une copie num rique de ce formulaire doit tre adress e l adresse irms univ r fr mais une copie papier sign e du responsable du cr dit et valant acte d engagement doit tre fournie Le nombre d chantillon de chaque type doit tre not le calcul du co t sera fait automatiquement Une case cocher p
4. e 3 Plate risque de bloquer l avancement du plateau 4 Carr e risque de rester coinc e dans le puits du passeur 10 7 mm maxi Fig 2b Exemples de boulettes bien form es 5 6 7 Petites boulettes tissus animaux et v g taux 7 Grosse boulette s diments et filtres 2 6 Cas des chantillons sur filtres La taille des puits des plateaux disponibles sur l analyseur l mentaire ne permet pas de faire des boulettes contenant un filtre de 25 mm a fortiori de 47 mm dans une capsule en tain et donc de pouvoir l analyser en entier plusieurs m thodes sont utilis es grattage et r cup ration de la mati re organique des filtres dans tous les cas la r cup ration ne peut tre quantitative et avec la mati re organique une fraction non n gligeable de fibre de verre est prise avec l chantillon Il est important de minimiser cette fraction qui est g nante pour la combustion et augmente la quantit de cendres Ce type de r cup ration pose aussi le probl me de l h t rog n it de la r partition de la mati re sur les filtres voir ci dessous d coupage de fraction de filtres des aliquotes de filtre peuvent tre d coup es avec un emporte pi ce ce qui permet par un rapport de surface d estimer la quantit totale sur le filtre Cependant la r partition de la mati re organique est rarement homog ne et la fois pour l aspect quantitatif que pour les rapports isotopiques ce type de traitemen
5. ne JAMAIS mettre les chantillons dans la capsule directement dans la balance la poser dans la partie inf rieure droite de la plaque d aluminium partie d environ 6 x 6 cm Cette zone doit rester ultra propre il ne faut jamais la toucher avec la main ou le poignet ni y poser la spatule Avec une microspatule en forme de cuill re pr lever l chantillon et le faire tomber dans la capsule en veillant ce qu il tombe au fond et non sur les parois Remettre la capsule dans le portoir sur le plateau de la balance regarder le poids affich uniquement 2 d cimales avec la porte ouverte mais cela permet de juger s il faut rajouter ou enlever de l chantillon Fermer la porte et attendre la stabilisation Noter le poids affich dans le formulaire d analyse 8 3 Note 1 Il est plus difficile d enlever une partie d chantillon de la capsule qu en ajouter Note 2 Si les chantillons sont lectrostatiques brancher l ionisateur il suffit de passer les chantillons pendant une dizaine de secondes dans le faisceau d ions pour supprimer l lectricit statique 2 5 Fermeture des capsules La capsule tant pos e verticale dans la zone de travail de la plaque d aluminium pincer son bord sup rieur sur 1 1 5 mm avec une pince bouts plats Fig 1 A puis replier vers le bas cette partie Fig 1 B Replier ensuite la partie pli e dans l autre sens Fig 1 C et presser la capsule avec les deux pinces plates une se
6. PSI LIENSSs Annexe 2 Protocoles Plateforme de Spectrom trie Isotopique de LIENSSs Annexe 2 Pr paration des chantillons version 3 6 1 d cembre 2012 Cette annexe d taille les proc dures techniques de pr paration de divers chantillons en vue de leur analyse isotopique elle ne pr sente pas les m thodes et strat gies d chantillonnage qui sont de la responsabilit des chercheurs et d pendent de leurs objectifs ainsi que des sites et des mat riels tudi s Ses diff rentes parties traitent de la pr paration proprement dite des chantillons mais aussi de leur mise en capsules et de l criture des formulaires d analyse Cette annexe est plus particuli rement crite en vue d analyses C amp N sa plus grande part peut s appliquer aux autres isotopes ou autres matrices sont les sp cificit s sont ou seront donn es dans des sous annexes additionnelles annexe 2a soufre 1 Traitement des chantillons La pr paration des chantillons d pend en premier lieu de leur type les chantillons de phytoplancton ou de mati re organique particulaire recueillis sur filtres ne se traitent pas comme les s diments ni comme les organismes L analyse des nutriments dissous ainsi que celle des carbonates n cessite des techniques particuli res qui feront aussi l objet de paragraphes sp cifiques 1 1 Organismes v g taux et animaux La grande majorit des chantillons trait s par la Plateforme de Spectrom tr
7. ant aussi peser les standards en abondance naturelle sa contamination ainsi que celle 14 des outils associ s pourrait engendrer de mauvais r sultats sur tous les chantillons y compris ceux d autres utilisateurs Il est imp ratif d indiquer sur les boites et dans les formulaires d analyse qu il s agit d chantillons enrichis 15 Fiche d utilisation du vibro broyeur Retsch MM400 Manuel d taill dans un pr sentoir derri re l appareil Choisir les bols utiliser en fonction de la taille des chantillons 2 bols quivalents doivent toujours tre mis en place les petits chantillons peuvent tre broy s dans des microtubes de 2 ml mettre un support de chaque c t du broyeur avec le m me nombre de tubes minimum 4 Placer les chantillons et les billes correspondantes dans les bols Type de bol volume Billes par bol ou microtube Inox 10 ml 1 ou 2 billes inox 9 ou 10 mm Inox 25 ml 1 ou 2 billes inox de 12 mm Zirconium 35 ml 1 bille zirconium de 12 mm Lipides ou m taux Microtubes PE 2 ml x10 2 billes inox 3 mm 4 mm Petits chantillons Fermer les bols et les mettre en place sur les supports 1 d visser la molette M le cliquet SB tant SB en position haute pour pouvoir placer 25 90 librement le bol entre les deux sabots fixe U RTE SF et mobile SM mettre en place une extr mit du bol dans le sabot fixe SF visser la molette M pour caler le bol dans l
8. ar flux d air filtr en prenant soin ce que tous les tubes plongeurs soient bien introduits dans les fioles d environ 1 cm Ouvrir l air comprim et v rifier 2 heure apr s que le flux n a pas diminu laisser s cher plusieurs heures laisser de pr f rence une nuit reprendre par 1 ml d eau pure homog n iser par ex 1 minute dans un bain ultrasons congeler les fioles viter de le faire 80 ces fioles sont fragiles et les lyophiliser avec une spatule craser la poudre et gratter les parois pour tout r cup rer transf rer les chantillons dans un tube plastique 2 ml capuchon vissant laver et s cher les fioles Attention la d carbonatation peut avoir un effet aussi sur la signature isotopique de l azote qui est normalement non significatif sur les tissus animaux ou v g taux peu carbonat s cet effet est surtout observ quand il y a ensuite lavage de l chantillon pour enlever l acide Il peut cependant tre plus important sur certains chantillons biologiques et les s diments tr s carbonat s pour lesquels il faut utiliser de l acide plus concentr Faire des tests pour v rifier cet effet et dans certains cas il peut tre pr f rable de faire 2 analyses une avec d carbonatation C l autre sans d carbonatation N 1 2 S diments 1 2 1 Pr l vement pr traitement et conservation des chantillons Les chantillons de s diment sont le plus souvent pr lev s par carottage
9. e sabot mobile SM mais sans serrer tourner le cliquet SB de 90 pour l abaisser dans les encoches pr vues visser la molette de fa on entendre quelques clics 8 10 maxi NE JAMAIS FORCER Abaisser le capot R gler ventuellement les param tres de broyage cf manuel le seul r glage utile est celui du temps de broyage Pour le modifier appuyer sur la touche SET puis ajuster au temps d sir enfin sauvegarder en appuyant nouveau sur la touche SET Lancer le broyage pour des chantillons bien secs 1 3 minutes suffisent g n ralement R cup rer les chantillons avec une spatule ou en retournant le bol sur un papier pes e Laver les bols attention les joints ne peuvent pas tre enlev s il faut les soulever l g rement pour nettoyer dessous avec un petit goupillon les rincer soigneusement en finissant par une rin age l alcool et les mettre s cher l tuve remplissez le cahier d utilisation Points respecter absolument ne jamais utiliser le broyeur avec un seul bol install et charger avec des masses voisines ne pas utiliser des billes d un mat riau diff rent de celui du bol ne jamais serrer fortement le dispositif de serrage le syst me d encliquetage est largement suffisant pour maintenir les bols 16
10. elle devra tre mesur e part noter le poids total et fermer la capsule Dans le calcul des enrichissements on ne travaille pas directement sur les donn es exprim es en mais sur les abondances absolues il suffit ensuite de tenir compte du facteur de dilution donn par le rapport des masses de chaque type enrichi et non enrichi On peut aussi diluer par un autre produit que le m me chantillon non enrichi mais dans ce cas il faut tenir compte aussi de la teneur en l ment C ou N de chaque constituant du m lange Il est du ressort des utilisateurs de s assurer qu ils ne d passent pas ce taux au del de 3 d enrichissement il y a contamination irr m diable des r acteurs parfois m me de la colonne CPG dont le remplacement pourra tre factur Entre 1 et 3 d enrichissement il peut y avoir un effet m moire sur les chantillons suivants les utilisateurs doivent donc pr voir autant que faire se peut leurs s ries d analyse pour aller d chantillons peu enrichis aux chantillons tr s enrichis et pr voir ventuellement des blancs suppl mentaires entre chantillons Tous les quipements et petits mat riels utilis s pour la pr paration des chantillons enrichis doivent tre utilis s en prenant garde aux contaminatons possibles Ils doivent en outre tre tr s soigneusement nettoy s apr s Une attention particuli re doit tre port e l utilisation de la microbalance celle ci serv
11. ermet d indiquer si les chantillons sont irrempla ables des pr cautions plus particuli res seront prises pour viter au maximum les incidents analytiques ou logiciels Cependant aucune garantie ne peut tre donn e des incidents tant toujours possibles coupure de courant blocage d une boulette dans le passeur etc Les formulaires doivent tre remplis en suivant les recommandations ci dessous gt Chaque plaque doit avoir une r f rence indiqu e sur la bo te et en haut de la 2 feuille du formulaire d analyse cf Fig 4 et doit permettre une identification certaine par ex ne pas utiliser Box 1 Box 2 ou Boite 1 Boite 2 gt Demandeur P Richard Programme FoodWeB1io R f Bo te FWB 4 _ Pr par par P Richard Date 14 01 09 _ Impression R f rence Echantillon Remarque EWBIRM4 osse muse FWB LR M5 T Pl QT a A 4 FWB LA M2 0 288 E Fig 4 Formulaire d analyse 2 feuille du classeur gt La r f rence des chantillons ne doit pas comporter de caract res tels que les espaces et tirets sont autoris s Cette r f rence tant utilis e par le logiciel comme nom du dossier o sont rang s les fichiers correspondant l chantillon Il est pr f rable galement de ne pas utiliser de lettres accentu es non reconnues gt Ne pas avoir comme r f rence un seul chiffre ou lettre les fichiers cr s ne sont pas reconnus par le logiciel de l IRMS bug 13
12. ie Isotopique sont des chantillons de ce type plantes sup rieures phan rogames marines microalgues macrofaune m iofaune tissus de mammif res ou d oiseaux etc La chaine de traitement des chantillons depuis leur pr l vement n est pas tr s contraignante pour les analyses isotopiques en comparaison d autres types d analyses La plupart des chantillons peuvent tre analys s apr s simplement s chage et broyage d autres n cessiteront des traitements suppl mentaires pour liminer certains constituants ind sirables comme les carbonates beaucoup plus enrichis en C que la mati re organique ils doivent tre enlev s pour des tudes de r seaux trophiques ou les lipides appauvris en 5 il est n cessaire dans certains cas de retirer les lipides de r serve qui peuvent fausser l estimation de l origine de la nourriture 1 1 1 Pr l vement pr traitement et conservation des chantillons Contrairement ce qui est dit dans certains articles anciens qui pr conisent d utiliser uniquement des flacons en verre parfois m me recommandent un lavage acide les organismes peuvent tre pr lev s sur le terrain dans des flacons ou des sacs en mati re plastique en prenant soin cependant d utiliser des r cipients lav s m me s ils sont neufs et ne pas gratter des fioles plastiques avec des instruments m talliques pouvant arracher des particules de plastique Les organismes doivent tre transport s au frais et le
13. lyses isotopiques sur de la mati re organique d s qu il y a un risque d avoir dans les chantillons des carbonates min raux Leur contenu en C toujours tr s lev peut fausser les r sultats m me si la teneur en carbone inorganique est faible Il est ainsi pr f rable de d carbonater les muscles de poissons qui peuvent contenir des ar tes parfois peu visibles certains crustac s et certains invert br s Les macrophytes peuvent aussi avoir des pibiontes calcaires fix s Sur organismes frais La d carbonatation peut tre faite sur les organismes frais si la p n tration de l acide jusqu aux carbonates est assur e cas des macrophytes voir 8 1 1 1 dans ce cas immerger les chantillons dans HCI 0 1 N et observer la formation de bulles quand celle ci cesse rincer soigneusement par de l eau pure Sur organismes s ch s Protocole de d carbonatation organismes secs broy s placer environ 100 mg maximum d chantillon broy dans une fiole d carbonatation en verre fiole 8 ml fond plat ou tube 8 ml ajouter 1 ml HCI 0 1 N ou 0 5 N si les chantillons sont susceptibles de contenir beaucoup de carbonates placer dans un bain ultrasons pendant 1 min observer la formation de bulles lorsque celle ci cesse ajouter 100 ul d HCI pour v rifier que tous les carbonates ont t transform s placer les fioles dans le bain sec Techne 60 C mettre en place le syst me d vaporation p
14. natation N 1 3 Phytoplancton et MOP Mati re Organique Particulaire sur filtres 1 3 1 Pr l vement pr traitement et conservation des chantillons Le phytoplancton et la MOP sont r colt s sur filtres en fibre de verre type GF C ou GF F ou sur filtres en fibre de quartz mat riaux qui n am nent pas de carbone d azote ou de soufre lors de l analyse elle m me Les filtres en fibre de verre ont le d savantage par rapport au quartz de fondre lors de la combustion avec parfois constitution d un bloc dans l insert difficile enlever Cela n cessite donc d enlever plus fr quemment les cendres Cependant les filtres en quartz sont beaucoup plus difficiles manipuler au moment de la filtration Dans tous les cas les filtres doivent tre nettoy s par combustion 450 C max pendant 3h certains nettoient aussi pr alablement par HCI 0 1 N et rin age soigneux l eau pure Le volume filtr est fortement d pendant de la taille et l abondance des particules en suspension ainsi que de la taille du filtre Le volume filtr doit tre not si la quantit absolue de C et ou N doit tre connue Dans ce cas il est aussi important de consid rer les points concernant la mise en boulettes des chantillons 8 2 5 et 2 6 Apr s filtration les filtres sont plac s individuellement dans des r cipients propres bo tes de Petri flacons verre et conserv s au frais l abri de la lumi re puis stock s au laboratoire au co
15. ng lateur 20 avant les traitement ult rieurs 1 3 2 D carbonatation Cette tape est n cessaire pour enlever les carbonates de l eau de mer encore pr sente sur le filtre ou des organismes ou particules calcaires filtr s Les filtres sont d abord lyophilis s La d carbonatation est r alis e par exposition des vapeurs d HCI en pla ant sous hotte les r cipients contenant les filtres contenants ouverts dans un dessicateur avec un b cher contenant une dizaine de ml d HCI fumant 37 sous vide l ger pendant 4 h Attention Ne pas manipuler l acide fumant sans blouse ni gants et en dehors de la hotte Apr s avoir enlev le b cher avec l acide le dessicateur contenant les filtres est laiss ouvert au minimum une nuit sous la hotte Les chantillons sont ensuite conserv s soit au cong lateur soit dans un dessicateur sous vide 2 Mise en capsule des chantillons 2 1 Poids des chantillons M me si la configuration du spectrom tre de masse utilis permet d analyser des chantillons dans une large gamme de poids avec la m me pr cision il est pr f rable d essayer de rester dans la gamme optimale En dessous des valeurs minimales les valeurs obtenues ne sont pas fiables Au dessus des valeurs maximales il peut y avoir saturation des d tecteurs Le tableau ci dessous indique les poids minimum maximum et optimaux pour chaque type d chantillon en mg PS pour des analyses C et N Pour les s dimen
16. on Environ 80 100 mg d chantillons broy s sont plac s dans des tube de verre de 10 ml bouchon vis avec joint T flon 2 x 20 chantillons peuvent tre pr par s en m me temps Ajouter 4 ml de cyclohexane p a distributeur automatique boucher soigneusement agiter avec un vortex et placer ventuellement pendant 1 minute dans un bain ultrasons attention l chauffement Placer les tubes sur un agitateur rotatif pendant 1h Centrifuger 2500 t min 1200 g pendant 10 min 10 C Noter la couleur des surnageants et les vacuer avec pr caution dans le flacon Poubelle Cyclohexane Si le surnageant est color refaire l extraction partir de l tape 2 Rincer le culot en ajoutant 2 ml de cyclohexane boucher le tube agiter au vortex ventuellement placer pendant 1 min dans un bain ultrasons attention l chauffement Centrifuger nouveau 1200 g 10 min 10 C vacuer le surnageant dans la poubelle cyclohexane S cher les culots en pla ant les tubes dans un bain sec r gl sur maximum 45 C Le s chage est rapide 2h 10 R cup rer les chantillons dans des tubes 2 ml bouchons joint torique 11 Laver et s cher les tubes Attention il peut arriver que les surnageants ne soient pas color s malgr une forte teneur en lipides certains poissons 1 1 5 D carbonatation des chantillons Ce traitement est n cessaire lorsque l on r alise des ana
17. onates il faut donc des quantit s d acide importantes pour les d carbonater Il se forme alors beaucoup de CaCl avec 3 cons quences non n gligeables le CaCl lors de la combustion des chantillons peut se transformer en divers produits chlor s qui d gradent rapidement les produits de la colonne de combustion et attaquent m me le quartz de la colonne jusqu la rendre poreuse voire aller jusqu une cassure le poids du CaCl form est sup rieur au poids des carbonates d compos s le changement de poids des chantillons doit tre pris en compte si la teneur en carbone C doit tre mesur e le CaCl est un produit tr s hygroscopique les chantillons doivent tre conserv s au dessicateur et leur pes e lors de leur mise en capsules doit se faire rapidement Note Les s diments acidifi s m me apr s vaporation de l acide restent cependant tr s acides et attaquent assez rapidement les capsules d tain Pour viter cela on peut utiliser des capsules en argent ou analyser les chantillons tr s rapidement 8 10 j apr s leur mise en capsules En attendant les chantillons doivent tre conserv s dans un dessicateur sur P20 sous vide Rappel la d carbonatation peut avoir un effet sur la signature de l azote Cet effet doit tre estim sur les chantillons trait s en fonction de l acide utilis Il pourra tre pr f rable de faire 2 analyses une avec d carbonatation C l autre sans d carbo
18. peu de pr cautions sont n cessaires pour la conservation des chantillons le point important est qu il n y ait pas d veloppement de bact ries ou de champignons 1 1 2 S chage des chantillons Le s chage peut tre obtenu de diff rentes fa ons s chage l tuve ou par lyophilisation voire m me au soleil pour des missions dans des zones sans lectricit l important est qu il n y ait pas de d veloppement bact rien Le s chage en tuve ne devrait pas tre fait une temp rature gt 50 C risque de perte de certains lipides volatils Contrairement la lyophilisation le s chage en tuve conduit g n ralement l obtention d une mati re parfois tr s dure difficile broyer ensuite au mortier Les chantillons tr s gras lard de mammif res marins par exemple ne peuvent g n ralement pas tre ni s ch s ni lyophilis s correctement Sauf si on les broie ensuite sous azote liquide il est pr f rable de faire une d lipidation pr liminaire en les d coupant en petits morceaux avec des ciseaux avant de les s cher de pr f rence par lyophilisation D autre part le broyage l aide d un broyeur billes cf ci dessous exige des chantillons extr mement secs I est pr f rable dans ce cas de placer les chantillons pendant une nuit dans un dessicateur sur P205 et sous vide avant de broyer 1 1 3 Broyage des chantillons Le broyage pour les analyses isotopiques doit permettre d obtenir une po
19. r et s cher les bols Attention cependant ne pas broyer dans ces tubes des chantillons trop durs qui pourraient arracher des particules de plastique par ex des bouts de coquilles L utilisation du broyeur est tr s simple mais doit respecter les points suivants ne jamais l utiliser avec un seul bol install m me s il n y a qu un chantillon broyer le deuxi me bol de m me taille avec les billes correspondantes doit tre mis en place ne pas utiliser des billes d un mat riau diff rent de celui du bol charger les deux bols avec approximativement la m me masse la quantit d chantillon ne doit pas tre lt 25 du volume du bol ne jamais serrer fortement le dispositif de serrage le syst me d encliquetage est largement suffisant pour maintenir les bols Le manuel complet du broyeur ainsi que la fiche r sum de sa mise en uvre d crite aussi en fin de cette annexe Fiche Retsch MM400 page 13 sont disponibles sur un pr sentoir fix sur le mur juste au dessus de l appareil Il est absolument imp ratif de lire cette fiche avant d utiliser le broyeur pour la 1 re fois 1 1 4 D lipidation des chantillons La d lipidation des chantillons de consommateurs est n cessaire dans les tudes de r seaux trophiques quand leur contenu en lipides est important et quand il varie beaucoup au cours de l ann e ex constitution de r serves pour la reproduction En effet les lipides
20. res des v tements surtout des pull overs et l lectricit statique il ne faut utiliser que du papier d essuyage de donnant pas de fibres Kimwipes et des gants sans poudre tous les instruments pinces spatules doivent d abord tre nettoy s l alcool ainsi que la plaque d aluminium o sont pos es les capsules ne jamais toucher avec les doigts les capsules ou les parties d instruments en contact avec les capsules ou la plaque sur laquelle sont manipul es les capsules Utiliser des gants ou ne travailler qu avec les pinces 2 4 Pes e Le manuel d utilisation de la microbalance se trouve dans un pr sentoir fix sur le mur au niveau de cette derni re Avant de peser les chantillons se munir d un formulaire de demande d analyse et lire les instructions pour le remplir correctement 3 L utilisation de la balance en routine se r sume quelques points Ouvrir la balance appuyer sur un des deux grands boutons situ s de chaque c t du clavier la porte coulissante circulaire s ouvre sur la droite pour les gauchers elle peut s ouvrir gauche cf le manuel Placer le petit support en plastique sur le plateau puis l aide de la pince bouts fins recourb s mettre dans le support une capsule vide Fermer la porte en pressant un des grands boutons Attendre que la balance se stabilise affichage de mg apr s le chiffre et presser le bouton Tare Ouvrir la porte retirer la capsule
21. rvant maintenir la capsule sur la plaque jusqu obtenir une boulette en forme de section de cylindre d au maximum 3 mm de diam tre et d environ 1 5 2 mm de hauteur pour les chantillons animaux ou v g taux t B A C Fig 1 Fermeture des capsules et photographie d une boulette de petite taille Eo 3 mm Pour les s diments et les filtres des capsules de cette taille sont g n ralement difficiles faire le volume des chantillons tant plus important Dans ce cas les boulettes sont plut t sph riques elles ne doivent cependant pas d passer 7 mm de diam tre Note Il est pr f rable de faire de petites boulettes si cela est possible cela permet d utiliser un plateau de 100 positions au lieu de 50 et ainsi de r aliser au moins 30 d analyses suppl mentaires par jour Attention Ne pas faire de boulettes trop petites de diam tre lt 1 5 mm qui peuvent rester coinc es dans le passeur Note il est important de respecter les consignes concernant la forme et la taille des boulettes Des boulettes mal faites cf fig 2a peuvent soit se rouvrir perte d chantillon et contamination des autres soit se coincer dans le puits du passeur et ne pas tre analys es soit m me bloquer le passeur avec dans des cas extr mes perte de tous les chantillons du plateau Fig 2a Exemples de boulettes mal form es 1 Mal ferm e perte d chantillon 2 Avec des protub rances risque de rester coinc
22. s animaux gard s vivants pour tre plac s au laboratoire dans de l eau filtr e pour vider leur estomac le bol alimentaire pouvant interf rer avec leur signature isotopique propre Ceci est particuli rement important pour les animaux ing rant du s diment Les organismes doivent tre nettoy s avant cong lation de tout d bris ou s diment les macrophytes doivent ventuellement tre plac es quelques minutes dans un bain d HCI 0 1 N pour enlever tout carbonate associ certains pibiontes puis rinc es l eau pure Les chantillons peuvent ensuite tre conserv s congel s 20 C ou s ch s puis conserv s au cong lateur ou m me dans un dessicateur sous vide temp rature ambiante Cas particuliers dans certains lieux d chantillonnage o aucun quipement n est disponible pour conserver congel s ou s cher les chantillons ces derniers peuvent tre conserv s dans de l thanol pur 70 qu il faut vaporer ensuite au laboratoire L thanol est le moins mauvais des conservateurs ne jamais utiliser de formol il faut s assurer cependant qu il n a aucun effet ou quantifier cet effet sur le type d chantillons analys s pour information des tests ont montr qu il n a aucun effet sur les plantes terrestres mais qu il a un l ger effet sur la signature de graines Il est d autre part souvent utilis pour conserver les chantillons de sang pr lev s sur les oiseaux Pour les analyses isotopiques
23. sont beaucoup plus pauvres en C que les autres constituants biochimiques ils affectent donc la signature totale sans qu il y ait changement de ressources trophiques Cependant si l organisme tudi est une proie de teneur en lipides peu variable sa d lipidation est moins justifi e les lipides et le carbone qu ils contiennent participant aux ressources trophiques du pr dateur Dans tous les cas seuls les lipides de r serve devraient tre retir s tant ceux qui sont susceptibles de varier beaucoup La m thode de d lipidation utilis e cyclohexane froid a cet avantage elle att nue en effet les inconv nients observ s avec les m thodes g n ralement utilis es bas es sur des m langes chloroforme m thanol qui ont souvent un effet secondaire sur les rapports isotopiques de l azote Ces m thodes extraient en effet aussi d autres mol cules en particulier amin es Attention m me si le cyclohexane a moins d effet que les m thodes chloroforme m thanol il peut y avoir un effet plus prononc sur certains tissus glandes digestives Faire des tests pour v rifier cet effet et dans certains cas il peut tre pr f rable de faire 2 analyses une avec d lipidation C l autre sans d lipidation N Dans le cas o il faut effectuer la fois une d lipidation et une d carbonatation il vaut mieux commencer par la d lipidation en particulier quand la teneur en lipides est importante Protocole de d lipidati
24. t peut amener une certaine variabilit utilisation de mini filtres la filtration peut tre r alis e sur des filtres de 12 mm de diam tre d couper soi m me dans des filtres plus grands la filtration tant faite gr ce des supports de filtres de 13 mm Sweenex par exemple Apr s d coupage de la partie ext rieure non filtrante qui se d coupe bien simplement par serrage fort du Sweenex sur le filtre encore humide en fin de filtration et traitement cf 8 1 3 d tacher autant que faire se peut la face verso du filtre exempte de mati re organique Tout le reste tient facilement dans une petite capsule Cette m thode permet d obtenir une valeur correspondant l ensemble du volume filtr il est n cessaire cependant d avoir une charge minimale dans l eau la surface de filtration tant r duite 2 7 Rangement conservation et transport des chantillons 2 7 1 Rangement Les capsules sont rang es dans des plaques 96 puits Fig 3 identifi s en lignes A H et colonnes 1 12 Les formulaires d analyse feuilles Excel correspondent ce rangement cf 3 11 De pr f rence grouper en s ries les chantillons animaux v g taux et s diments filtres petites et grosses capsules 1 grosse boulette parmi les petites oblige utiliser le plateau gros puits et diminue la capacit d analyse Ne pas laisser de puits vide entre les s ries Le couvercle des plaques de capsules doi
25. ts des tests sur quelques chantillons doivent tre faits pour d terminer le poids optimal Pour les filtres le poids n est pas utile il est impossible de conna tre le poids de fibre de verre par rapport la mati re organique on se r f re plut t dans ce cas au volume filtr cf 8 1 3 1 organique 2 2 Choix des capsules Pour les chantillons d animaux ou de plantes les quantit s d chantillons sont tr s petites des capsules de 8 x 5 mm conviennent parfaitement ne pas utiliser de capsules plus petites pour des raisons de combustion et de taille optimale pour le passeur Pour les s diments et les filtres on utilise aussi les m mes capsules mais il peut tre n cessaire d en utiliser de plus grandes Les capsules d tain peuvent tre attaqu es par les s diments acidifi s en particulier n ayant pas t gard s l abri de l humidit dans un d lai assez rapide Si l analyse ne peut tre faite dans un d lai court apr s la pes e il est pr f rable d utiliser des capsules en argent 2 3 Pr paration des pes es pr cautions n cessaires La mise en capsules et la pes e des chantillons est l tape qui requiert le plus de soin dans sa r alisation toute contamination m me par la plus petite particule ou fibre pourrait entrainer un fort risque de mauvais r sultat il est donc imp ratif de porter une blouse en coton ce stade cela permet d viter en grande partie la diss mination des fib
26. udre tr s fine comme de la farine et homog ne ce qui permet de garantir i une bonne combustion et ii une bonne repr sentativit de l chantillon Cependant si l chantillon est consid r comme homog ne sang muscle d invert br un broyage approfondi est moins n cessaire Les tout petits organismes peuvent aussi tre analys s in toto si leur masse ne d passe pas la limite haute Il existe de tr s nombreux syst mes de broyage Pour les analyses isotopiques le vibro broyeur billes est particuli rement efficace il permet d obtenir rapidement des poudres tr s fines Il faut cependant que les chantillons soient tr s secs ou l utiliser sous azote liquide Le broyeur utilis est un vibro broyeur Retsch MM400 Haan Allemagne Divers bols de broyage sont disponibles 10 ml en inox 1 ou 2 billes de 9 ou 10 mm 25 ml en inox 1 ou 2 billes de 12 mm 35 ml en zirconium 1 bille de 12 mm ainsi que des supports pour 20 microtubes 2 ml 1 bille de 3 mm 1 bille de 4 mm Les bols en zirconium sont r serv s pour le broyage pour des analyses de lipides ou de m taux Le broyage en microtubes est utile pour les chantillons de petite taille dont le volume n exc de pas 1 3 du volume du microtube m me si le temps de broyage est plus long 3 minutes contre 1 g n ralement en bols inox 20 chantillons peuvent tre broy s simultan ment et les chantillons conserv s dans le tube ce qui vite d avoir lave
27. vent tre maintenus par du ruban adh sif de laboratoire repositionnable Il est en effet n cessaire d ouvrir plusieurs fois les plaques pour y placer ou en enlever les capsules cela doit pouvoir tre fait facilement Ne pas utiliser de ruban adh sif de bureau pour fixer les couvercles fort risque d ouverture brutale et de m lange ou renversement des capsules sans compter les traces de colle Chaque plaque doit tre marqu e sur un morceau de ruban adh sif de laboratoire sur le couvercle de fa on permettre l identification du demandeur et de la s rie d chantillons Fig 3 Ne pas crire directement sur les bo tes les bo tes sont r utilis es apr s lavage Important Il est tr s fortement recommand d identifier les bo tes en utilisant un nom identique ou tr s proche du nom du fichier informatique correspondant cf 8 3 Fig 3 Bo te de rangement des capsules 2 7 2 Conservation Except es les capsules d chantillons de s diments acidifi s qu il faut analyser rapidement les capsules des autres chantillons peuvent tre conserv es pendant de longues p riodes de pr f rence au dessicateur sous vide et au sec plut t qu au cong lateur o il y a reprise d eau 2 7 3 Transport Pour viter que les capsules surtout les plus petites sortent de leur puits et se m langent pendant le transport en particulier si les plaques sont envoy es par la poste placer une feuille d aluminium en

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