Manuel d`utilisation
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1. Hot Start gt ADN Polym rase dont l activit est inactive cette temp rature Nous recommandons la Taq Ozyme HS OZYA002 e Le Taq Ozyme Purple Mix2 n est pas adapt pour des amplicons de plus de 5 kb Si besoin voir section Produits associ s LISTE DES COMPOSANTS OZYA007 40 40 r actions 1 ml Taq Ozyme Purple Mix2 2X 5x 1 ml Taq Ozyme Purple Mix2 2X OZYA007 200 200 r actions 1 mi MgCl 25 mM 1 x 5 ml Taq Ozyme Purple Mix2 2X OZYA007 200XL 200 r actions 1 ml MgCl 25 mM 5 x 5 ml Taq Ozyme Purple Mix2 2X 1 ml MgCl 25 mM OZYA007 1000 1000 r actions MU 0ZYA007 0914 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 3 Taq Ozyme Mix2 OZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches EPAR AT TN la PCR et le d p t sur gel COMPOSITION DES SOLUTIONS Composition du mix 1X 16 mM 50 mM pH 9 2 NH 2SO4 Tris HCI Brij58 0 075 MgCl 1 7 mM dNTP 200 uM Taq ADN polym rase recombinante 2 5 unit s dans 25 ul de mix Traces de colorants rouge et bleu Stabilisateurs d enzymes et amplificateurs de PCR Colorants Autres D FINITION DE L UNIT Une unit est d finie comme la quantit d enzyme qui incorpore 10 nmoles de dNTP dans un fragment d ADN en 30 min 74 C PROTOCOLE STANDARD Ce protocole est adapt pour une r action de 50 ll partir de matri2. PROTOCOLE SPECIFIQUE PCR sur colonies La Taq Ozyme Purple Mix2 a t valid e avec succ s pour l amplification d ADN plasmidique partir de colonies bact riennes ou de levures sur milieu solide Nous recommandons de piquer une colonie fra che bien isol e de 1 2 mm avec un cure dent st rile et de la resuspendre directement dans un m lange r actionnel de 50 pl final cf Protocole standard Programmation du thermocycleur pour PCR sur colonie tape Temp rature UK E Stockage option 4 C 1 ou Tm 5 C sur le Tm le plus bas des deux amorces si le Tm des amorces est diff rent de 60 C 1 min kb pour les amplicons gt 1 kb OPTIMISATIONS Pr ambule tester un protocole valid pour un m lange similaire est possible et ne requiert g n ralement que peu d optimisation Nous recommandons de r aliser un gradient de temp rature d hybridation et de respecter le temps d longation du protocole standard Les conditions optimales diff rent d une r action l autre et d pendent des matrices et des amorces utilis es En premier lieu les variables importants optimiser dans toutes PCR sont 1 la quantit de polym rase 2 la temp rature d hybridation des amorces et 3 la concentration en magn sium Les points 1 et 3 sont d j optimis s dans le m lange Taq Ozyme Purple Mix2 Un chapitre a toutefois t rajout concernant la concentration de magn sium pour les rares cas o un rajout de magn
3. e Des femmes et des hommes au service de vos recherches LEL KOZA u Mix2 M lange 2X color pr t l emploi pour la PCR et le d p t sur gel OZYA007 40 40 r actions OZYA007 200 200 r actions avec suppl ment de MgCl OZYA007 200XL 200 r actions avec suppl ment de MgCl OZYA007 1000 1000 r actions avec suppl ment de MgCl Stockage et stabilit un an 20 C ou 3 mois 4 C MANUEL D UTILISATION MU 0ZYA007 0914 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 1 Taq Ozyme Mix2 OZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches A AR R N la PCR et le d p t sur gel SOMMAIRE a ae tt cd P 3 Pr cautions SP rinnen tineineide iaa hrada P 3 Liste des composants s sssssseserrsrsrererrrrnrerernrrurererrrrne P 3 Composition des solutions issues P 4 D finition de l unit cantines ends P 4 Protocole standard oers a P 4 Protocole sp cifique ssessssssssnnnnnrrnrnrrnnrrnrrrnrrrerrrerenus P 5 OPUMI SAONO eonen e a aaa a a aai P 5 R solution des probl mes P 7 Produits aSSoC S ads lasder same benoeninite tes P 8 Avertissement und tracene sure ausesretceistisanelte ue s curs P 8 MU 0ZYA007 0914 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 2 Taq Ozyme Mix2 ZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches MT 00e la
4. Le temps d hybridation recommand est de 30 secondes Temp rature et temps d longation l longation se fait 72 C Le temps d longation d pend de la longueur de l amplicon et de la complexit de la matrice En conditions standard nous recommandons 1 minute ou 1 min kb pour les amplicons de plus de 1 kb Ce temps d longation est g n ralement suffisant pour toutes les matrices Pour les matrices de faible complexit ex plasmide il peut tre r duit 30 sec kb R SOLUTION DES PROBL MES 1 Absence de produits de PCR ou rendement faible Causes possibles Remarques Solutions Omission des composants non e V rifier la pr paration du m lange r actionnel et les volumes inclus dans le m lange Taq Ozyme utilis s Purple Mix2 Erreurs de pipetage e V rifier les concentrations dilutions de tous les composants e V rifier les conditions de stockage de tous les composants Si n cessaire tester chaque composant individuellement Composants d fectueux e Utiliser de l ADN purifi V rifier si l ADN est d grad ou endommag e V rifier la puret des amorces e Titrer la quantit de la matrice d ADN Augmenter la Quantit d ADN non optimale concentration finale voir section Matrice du chapitre Optimisations Concentration insuffisante de MgCl ex pr sence d EDTA e Augmenter la concentration de MgCl par palier de 0 5 mM Diminuer la temp rature d hybridation Id aleme
5. sium peut tre n cessaire MU 0ZYA007 0914 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 5 LECKA Mix2 y OZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches A ET IR RR T E la PCR et le d p t sur gel M lange r actionnel Quantit d enzyme la quantit d enzyme est optimis e dans le m lange Taq Ozyme Purple Mix2 Magn sium MgCl la concentration en magn sium dans le m lange Taq Ozyme Purple Mix2 est de 1 7 mM Pour certaines amorces une augmentation de la concentration en magn sium peut tre utile C est particuli rement le cas en pr sence importante d EDTA un ch lateur des ions Mg Concentration finale en MgCl Volume de MgCl solution de 25 mM dans 50 ul D une mani re g n rale il est recommand d utiliser la concentration la moins lev e possible En effet une concentration trop lev e de magn sium conduit des hybridations non sp cifiques pouvant g n rer des produits de PCR non souhait s dNTP la concentration en dNTP est optimis e dans le m lange Taq Ozyme Purple Mix2 Matrice la quantit optimale de matrice pour une PCR d pend essentiellement du type d ADN Nous recommandons pour une r action de 50 l Plasmide ou complexit ADN g nomique ou complexit quivalente quivalente Taq Ozyme Purple Mix2 1 10 ng commencer avec 10 ng 50 500 ng commencer avec 200 ng ADNc
6. PCR et le d p t sur gel DESCRIPTIF Taq Ozyme Purple Mix2 est un m lange 2X pr t l emploi Il facilite l utilisation et diminue les erreurs de pipettage Le d p t des produits de PCR sur gel est direct gr ce la pr sence de colorants Deux colorants inertes un rouge et un bleu sont inclus au m lange permettant un contr le visuel de la distribution dans les tubes et le suivi de la migration en gel Ces colorants n interf rent pas avec les applications en aval Taq Ozyme Purple Mix2 est une nouvelle formulation du Taq Ozyme Purple Mix Il fonctionne dans toutes les applications valid es avec le Taq Ozyme Purple Mix ex PCR sur colonie et permet de plus d amplifier jusqu 5 kb partir des matrices d ADN complexes ex ADN g nomique humain et ou riches en GC Ce nouveau mix PCR inclut du MgCl concentration optimale et est pr t l emploi Le magnesium demeure n anmoins adjustable au del de 1 7 mM Une solution de MgCl 25 mM est fournie s par ment Zone de migration des colorants dans un gel d agarose Gel 0 5 1 5 Gel 2 3 4 10 kb 200 750 pb 1 2 kb 125 200 pb PR CAUTIONS e viter les cong lations d cong lations r p t es e Conserver le m lange r actionnel sur la glace jusqu au d marrage des cycles de PCR Cette enzyme ne convient pas la pr paration du m lange r actionnel temp rature ambiante Le cas ch ant utiliser une ADN polym rase d marrage chaud automatique
7. optimale Amorces PRODUITS ASSOCI S optimales Contamination Taq Ozyme OZYAO01 1000 Taq Ozyme HS OZYA002 250 Hot Start Emerald Amp MAX PCR Master Mix PCR gt 5 Kb ExactLadder DNA PreMix 100 bp Plus OZYCO01 100 ExactLadder DNA PreMix 2 Log OZYCO02 100 ExactLadder DNA PCR PreMix OZYCO04 100 dNTP PreMix 4 x 10 mM OZYDO01 500 dNTP PreMix 4 x 25 mM OZYDO02 1000 SeaKem LE Agarose 500 g LON50004 AccuGENE Molecular Biology Water 1 L LON51200 AVERTISSEMENT Ce produit est usage de recherche uniquement MU 0ZYA007 0914 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 8
8. pr lever un aliquot du m lange r actionnel de transcription inverse Le volume de celui ci ne doit pas d passer 10 du volume r actionnel de la PCR 5 ul pour une r action de 50 yl IMPORTANT ne pas utiliser de l ADN solubilis dans une solution contenant de l EDTA ex tampon TE agent ch lateur des ions Mg libres Amorces la conception et la concentration des amorces sont essentielles au succ s de toutes PCR Des sites en ligne d aide la conception d amorces sont tr s utiles Citons Primer 3 Nous recommandons des amorces de 18 30 nucl otides contenant 40 60 de GC Dans la mesure du possible les temp ratures de fusion Tm des deux amorces doivent tre le plus proche possible et aux environs de 60 C La m thode la plus simple pour estimer le Tm est Tm 2 C x A T 4 C x G C Les amorces sens et anti sens sont g n ralement utilis es une concentration finale comprise entre 0 2 0 6 uM Nous recommandons de commencer avec 0 2 uM de chaque amorce 10 pmol de chaque dans 50 pl de m lange r actionnel Une concentration trop lev e en amorces peut diminuer la sp cificit d hybridation et induire en cons quence des amplifications non sp cifiques Programmation du thermocycleur Nombre de cycles le nombre de cycles est g n ralement compris entre 25 et 35 en fonction du nombre de copies de la s quence amplifier Augmenter le nombre de cycles ne conduit pas n cessairement am liorer l
9. ces purifi es Les amorces ont pr f rentiellement une temp rature de fusion Tm proche de 60 C C est un point de d part pour les optimisations voir section Optimisations Apr s d cong lation compl te de chaque r actif bien homog n iser l aide d un vortex puis centrifuger bri vement tous les r actifs avant leur utilisation 1 Les r actifs sont m lang s dans un micro tube st rile dans l ordre suivant R actif Volume Concentration finale Taq Ozyme Purple Mix2 Amorce sens ex 20 UM Amorce anti sens ex 20 uM Matrice d ADN Plasmide 10 ng lt 500 ng 50 ll ADNg 200 ng ADNc non dilu lt 5 pl Eau st rile redistill e SE OU a O Volume final SO O 8 aliquot d un m lange r actionnel de transcription inverse q s p quantit suffisante pour 2 Le m lange r actionnel est vortex doucement puis centrifug bri vement pour rassembler l chantillon au fond du tube 3 Programmation du thermocycleur MU 0ZYA007 0914 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 4 LECKA Mix2 y OZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches PARET IR RR T E la PCR et le d p t sur gel tape Temp rature Temps Nbr de cycles Stockage option variable ou Tm 5 C sur le Tm le plus bas des deux amorces si le Tm des amorces est diff rent de 60 C 1 min kb pour les amplicons gt 1 kb
10. e rendement d amplification du fragment d int r t Au del d un certain nombre de cycles le bruit de fond provenant d amplifications non sp cifiques s accro t D naturation initiale la d naturation initiale est n cessaire pour activer l enzyme et d naturer efficacement la matrice Nous recommandons 2 minutes 95 C Cependant pour les matrices plus complexes comme l ADN g nomique eucaryote un temps de d naturation plus long pouvant aller jusqu 5 minutes peut tre n cessaire MU 0ZYA007 0914 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 6 Taq Ozyme Mix2 yOZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches Y ETIA T la PCR et le d p t sur gel D naturation nous recommandons 30 secondes 95 C pour l tape de d naturation Cette condition convient aux matrices jusqu 60 de GC Temp rature et temps d hybridation la temp rature d hybridation optimale d pend des amorces utilis es et de la composition du tampon de r action Elle est g n ralement 2 5 C en dessous du Tm le plus bas des deux amorces Dans le protocole standard nous recommandons des amorces de Tm similaires et le plus proche possible de 60 C voir Amorces dans ce chapitre L hybridation se fait en premi re instance 55 C Si n cessaire r aliser un gradient de temp rature afin de d terminer la temp rature d hybridation optimale entre 45 et 68 C
11. nt r aliser un gradient pour d terminer la temp rature d hybridation optimale Augmenter le temps d longation ou utiliser une enzyme mieux Programmation des cycles PCR non adapt e voir section Produits associ s si la s quence cible optimale est longue riche en GC Augmenter le nombre de cycles Augmenter le temps de d naturation particuli rement pour les matrices complexes ADN g nomique MU 0ZYA007 0914 BP 268 78053 St Quentin Yvelines Cedex T l 01 34 60 24 24 Fax 01 34 60 92 12 email info ozyme fr P 7 Taq Ozyme Mix2 OZYME Des femmes et des hommes au service de vos recherches PAPE rm la PCR et le d p t sur gel 2 Bandes multiples smear ou bandes non sp cifiques Causes possibles Remarques Solutions e Titrer la quantit d ADN Diminuer la concentration Quantit de matrice non optimale finale voir section Matrice du chapitre Optimisations Conditions des cycles PCR non Diminuerle nombre de cycles e Diminuer le temps d longation e Augmenter la temp rature d hybridation accro t la stringence Concentrations d amorces trop r lev e Diminuer les concentrations des amorces lev es e Remplacer chaque composant afin de trouver la source de contamination e R aliser les r actions de PCR dans un espace r serv et s par de celui d di l analyse des produits de PCR Conception d amorces non e D signer des nouvelles amorces voir section
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