notice technique
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1. GenoType Enterococcus Extraction et Amplification de l ADN de l esp ce bac t rienne Enterococcus ssp Introduction Ce protocole d crit l amplification par PCR multiplex de fragments d ADN en vue de l i dentification des esp ces enteroccales faecalis E faecium E casseliflavus et E galli narum ainsi que des g nes de resistance La vancomycine vanA vanB venC1 et vanC2 C3 La PCR est couverte par des brevets d tenus par la soci t Hoffmann La Roche Aucune autorisation licence implicite ou explicite pour la pratique de La PCR ni aucune autre m thode utilisant la PCR ne sont couvertes en cas d acquisition de cette trousse Les informations sur l obtention d une licence pour ta pratique de La PCR ou sur d autres m thodes utilisant ta PCR peuvent tre obtenues en contactant F Hoffmann La Roche AG CH 4070 B le Conservation et Pr cautions D s r ception conserver Le m lange Amorces Nucl otides PNM 2 8 C et isol s de toute source d ADN potentiellement contaminante Si La dur e de conservation doil exc der 4 semaines conserver 20 C Il est recommand d aliquoter le m lange PN afin d viter tes cong lations d cong tations r p t es Ne pas utiliser Les r actifs au del de leur date de p remption Tous les chantillons doivent tre consid r s comme potentieliement infectieux et tre manipul s comme tel Observer Les pr cautions usuelles pour la pr paration de l anplification It2. Milieu tamponn 1 agent bloquant lt 1 NaCl 20 mt 120 ml Substrat Concentr SUB C concentr contient du Dimethyl Sulfoxide solution substrat 0 2 ml 1 2 ml Tampon Substrat SUB D Milieu tamponn lt 1 MgCl lt 1 NaCl 20 ml 120 ml portoir feuille de Lecture 1de chaque 4 de chaque manuel d utilisation matrice 1de chaque f de chaque Mat riel Requis mais Non Fourni Bain marie agitateur TwinCubator Gants usage unique Chronom tre Papier absorbant Eau distill e Pincettes Embouts de pipettes Pipettes r glables pour 10 20 200 Ide pr f rence st riles avec tiltre et 1000 pl Eprouvette Plateau agitateur TwinCubator Thermom tre catibr Donn es Techniques chantillon requis culture bact rienne fra che Volume n cessaire 20 yl de solution d ADN amplifi par chantillon Dur e du test approximativement 2 heures Conservation 2 8 C pour conserver gt 4 semaines le m lange PN doivent tre conserv s 20 C Art No 888 12 tests Art No 88896 96 tests Fabricant Hain Lifescience GmbH Hardwiesenstralie 1 72147 Nehren Allemagne Rttp www hain lifescience de 12 2003
3. autres puits 4 D poser une bandelette dans chaque puit utilis E gallinarum Le d veloppement d une ligne color e dans cette zone indique la pr sence de l ADN de E gallinarum E casseliflavus Le d veloppement d une ligne color e dans cette zone indique la pr sence de l ADN de casseliflavus noter que l ADN de E flavescens hybride galement dans cette zone de r action vanA Le d veloppement d une ligne color e dans cette zone indique la pr sence du g ne de r sistance La vancomycine vanA vanB Le d veloppement d une ligne color e dans cette zone indique la pr sence du g ne de r sistance la vancomycine van8 vanti Le d veloppement d une ligne color e dans cette zone indique la pr sence du g ne de r sistance La vancomycine vanC1 vanC2 C3 Le d velappement d une ligne color e dans cette zone indique la pr sence du g ne de r sistance la vancomycine vanC2 C3 Limitations En vue de l amplification l ADN doit tre extrait partir de culture de bact ries l aide d une m thode appropri e L ADN cible doit avoir t correctement amplifi Le test fonctionne dans les limites de La r gion du g nome choisie pour chaque sonde Un s quen age potentiel doit tre r alis s s par ment La pr sence de diff rentes esp ces bact riennes dans un m me chantillon peut entrav e l interpr tation du test Camme dans tout syst me de d tection bas sur l hybridation il exi
4. est essentiel que Le mat riel et Les r actifs utilis s pour l extraction de l ADN et pour la pr paration de l amplification soient exempts de DNases Ne pas m langer les r actifs provenant de diff rents Lots de trousses Mat riel Requis mais Non Fourni ADN polym rase thermostable avec tampon enzyme de type hot start recom mand e taux d extension 2 4 kb min 72 C demi vie 10 min 97 C 60 min 94 C rendement d amplification gt 105 Eau niveau de puret pour Biologie Mol culaire Embouts de pipettes st riles avec filtre Gants usage unique Huile min rale niveau de puret pour biologie mol culaire pour thermocycleur sans couvercle chauffant Micro tubes pour thermocycleur exempt de contamination par DNase et RNase Pipettes r glables pour 10 20 200 et 1000 pl R actifs pour l xtraction de l ADN ainsi que les appareils associ s Thermocycleur taux de chauffage 3 C sec taux de refroidissement 2 C sec pr cision 0 2 C Extraction de l ADN Le mat riel de d part conseill pour l extraction de l ADN consiste en des bact ries fra chement cultiv es en milieu sotide minimum de 100 colonies La pi ce de travail doit tre d nu e de tout ADN amplifi Toute proc dure d extraction d ADN bact rien conduisant de l ADN amplifiable peut tre utilis e Le protocole d extraction rapide d crit ci apr s permet galement de pr parer UADN en vue
5. utilisation Les r actifs ne doi vent pr senter aucun pr cipit noter cependant que la solution CON D est opaque Si besoin agiter Equilibrer les autres r actifs l exception des sotutions CON C et SUB C temp rature ambiante Dans un tube appropri diluer Le Conjugu Con centr CON C orange et Le Substrat Concentr SUB C jaune au 1 100 dans un volume ad quat du tampon correspondant CON C avec CON D SUB C avec SUB D Bien homag n iser et quilibrer temp rature ambiante Pour chaque chantillon test ajouter 10 pl de concentr 1 mt de tampon Diluer CON C avant chaque utilisation Une fois dilu SUB C reste stable pendant 4 semaines conserv tem p rature ambiante et l obscurit 1 D poser 20 pl de Solution de D naturation DEN bleu une extr mit de chaque puit utilis 2 Ajouter 20 pt d chantillon amplifi et m langer Les deux solutions par pipe tages r p t s Incuber 5 minutes temp rature ambiante Pendant ce temps l aide d une pince sortir du tube le nombre appropri de bandelettes STRIPS et inscrire au crayon leur num ro d identification dans l espace situ sous la ligne de rep re Toujours porter des gants pour manipuler les bandelettes 3 Ajouter dans chaque puit 1 mt de Tampon d Hybridation HYB vert pr chauff et homog n is Homog n iser jusqu ce que te m lange devienne une co loratian homog ne Eviter les claboussures vers Les
6. antillons amplifier nambre d chantillons analyser contr les Pour un contr le n gatif par exemple la solution d ADN amplifier est remplac e par 5 pl d eau Pr parer une solution m re de m lange r actionnel con tenant tous les r actifs l exception de l ADN et bien homog n iser ne pas vortexer Si le thermocycleur ne poss de pas de couvercle chauffant recouvrir les chan tillons d huile min rale Profil d Amplification Emin 95 C 1 cycle 5 30 sec 95 C 10 c cles 2 min 58 C 25sec 95C 40sec 53 C 20 cyctes 4 amp sec 70 C 8 min 70C 1 cycle a La dur e de cette tape doit tre rallong e en cas d utilisation d ADN polym rase de type hot start se r f rer au manuel de l enzyme Selon te thermocycleur utilis Le profil d amplification peut demander des modi fications contacter votre distributeur Les produits de l amplification peuvent tre conserv s avec 4 20 C Les amplicons ont une taille de 68 pb fragment Contr le Universel 248 pb Ente rococcus s5p 131 pb fvanA 51 pb fvanB 222 pb vanC1 et 51 pb fvanC2 C31 L valuation des performances du test a t r alis e l aide de la Taq polym rase HotStarTaq fournie par la soci t Qiagen Fabricant Hain Lifescience GmbH Hardwiesensirafie 1 72147 Nehren Attemagne C http www hain lifescience de 12 2003 GenoType Enterococcus Test G n tique d identification des Entero
7. cocci R sistants la Vancomycine Principe Le test GenoType Enterococcus est bas sur la technologie DNA STRIP et permet l identification combin e des esp ces enterocaccales E faecalis E faecium E cas seliflavus et E gallinarum ainsi que des g nes de r sistance la vancomycine vanA vanB vanCT et vanC2 C3 La proc dure compl te comporte trois phases extraction de l ADN partir de cultures mat riel requis pour l extraction de l ADN non fournil une amplification multiplex l aide d amorces biotinyl es ADN polym rase thermostable non fournie et d tection de ADN amplifi par hybridation inverse Cette derni re phase comporte les tapes suivantes d naturation chimique de ADN amplifi hy bridation des amplicons simples brins biotinyl s aux sondes pr immobilis es sur la membrane lavage stringent et enfin addition d un conjugu streptavidine phos phatase alcaline suivie d une r v lation chromog nique Les signaux obtenus sont fa cilement et rapidement interpr t s l aide d une matrice fournie avec chaque trousse Pr cautions Tous Les chantillons doivent tre consid r s comme potentiellement infectieux et tre manipul s comme tels Les chantillons pr lev s sur des patients risques doi vent tre identifi s et manipul s dans des conditions de s curit ad quates Suivre les recommandations f d rale nationale locale d hygi ne de s curit et d envi ronment Se prot g
8. d une amplification 1 Pr lever jusqu 5 colonies l aide d une oeuse et resuspendre dans 150 pl d eau 2 Incuber la suspension bact rienne 95 C pendant 10 minutes 3 Incuber dans un bain ultrasons pendant 15 minutes 4 Centrifuger pendant 5 minutes vitesse maximale et utiliser directement 5 pl de surnageant pour la PCR Si l ADN doit tre conserv pendant une longue p riode transf rer le suri geant dans un nouveau tube Pr paration de l Amplification Pr parer le m lange r actionnet 45 pi dans une pi ce exempte d ADN L chan tillon d ADN doit tre rajout dans une pi ce s par e l est recommand d utiliser une ADN polym rase de type hot start Si cette enzyme n est pas utilis e tous les pipetages doivent tre r alis s sur de la glace Pr parer le m lange suivant par tube 35 pl de m lange Amerces Nucl otides PNM 5 pl de tampon d incubation de La polym rase 10x non fourni x pl de MgC non fourni 1 2 unit fs d ADN polym rase thermostable se r f rer au manuel non fourni y pl d eau qsp 45 pl ihors volume de l enzyme non fourni Ajouter 5 pl de solution d ADN fra chement extrait 20 100 ng d ADN pour at teindre un volume final de 50 pl hors volume de l enzymel 1 Selon le syst me tampon enzyme utilis la concentration optimale de MgCl peut varier de 1 5 2 5 mM A noter que certains tampons contiennent d j te MgCl D terminer le nombre d ch
9. ence d ADN bac t rien dans l chantillon test ainsi qu une extraction et une amplification de l ADN correctes E faecalis Le d veloppement d une tigne color e dans cette zone indique La pr sence de l ADN de E faecalis E faecium Le d veloppement d une tigne color e dans cette zone indique la pr sence de l ADN de E faecium cubations Le portoir n a pas t correctement agit Bruit de fond important CON C et ou SUB C trop concentr Les tapes de lavage n ont pas t correctement effectu es Les solutions de lavage taient trop froides tors de leur utilisation Composition du Kit Quantit Bandelettes sensibilis es avec les sondes sp cifiques STRIPS 12 96 M lange PN PNM h contient amorces sp cifiques des loci test s nucl otides colorant 0 5 m 4 ml Solution de D naturation DEN pr t l emploi contient lt 2 NaOH colorant 0 3 mt 24m Solution d Hybridation HYB pr t l empioi contient 8 10 de d tergent anionique colorant 20 ml 120 ml Solution de Lavage Stringent STR pr t l emploi contient gt 25 d un sel d ammonium quaternaire lt 1 d tergent anionique colorant 20 mt 320 ml Solution de Rin age RIN pr t l emploi Milieu tamponn lt 1 NaCl lt 1 de d tergent anionique 50ml 360 ml Conjugu Concentr CON C concentr contient de la phosphatase alcaline conjugu la streptavidine colorant 02 mt 1 2 ml Tampon Conjugu CON D
10. er l aide de v tements ad quats et de gants Lors de la manipulation du kit tenir compte des indications de s curit suivantes La Solution de D naturation DEN contient du NaOH lt 2 et est irritante pour la peau et Les yeux R36 38 et 526 537 39 545 Le Substrat Concentr SUB C contient du Dimethyl Sulfoxide et est irritante R36 37 38 523 26 36 Pour des informations suppl mentaires consulter les fiches de s curit Contr le de Qualit Afin de contr ler te bon d roulement du test et Le bon fonctionnement des r actifs chaque bandelette comporte deux zones de contr le une zone Contr le Conjugu pour contr ler la fixation du conjugu sur la ban delette et Le bon d raulernent de La r v lation chromog nique une zone Contr le Universel qui d tecte au vue des connaissances actuelles toutes les esp ces bact riennes Puisqu l chantillon de d part tant une culture bact rienne cette zone doit toujours d velopper un signal positif L amplification du contr le peut n anmoins tre att nuer par l amplification des s quences sp cifiques noter que cette zone n est pas un contr le de PCR puisqu un chan tillon de contr le de contamination eau entra nera un signal n gatif dans la zone Contr le Universel Proc dure Pr paration Pr chauffer le bain marie agitateur TwinCubator exactement 45 C 1 C Pr chauffer les solutions HYB et STR 37 45 C avant
11. i Lorsque tes r actifs d amplification sont contami n s un contr le n gatif entra ne galement le d veloppement des lignes tests Dans certaines conditions de test une forte concentration d ADN amplifi peut entra ner une r action chramog nique tr s rapide En pareil cas afin de pr venir le d veloppement de bandes dues des r actions d hybridation crois es arr ter la r action chromog nique d s que les premi res lignes color es de viennent visibles Contamination des puits voisins par des claboussures lors de l addition du So lution d Hybridation La culture de d part n est pas pure Cotoration non homog ne Les bandelettes n ont pas t suffisamment immerg es Lors des diff rentes in Les bandelettes doivent tre enti rement recouvertes par le liquide avec ta face sensibilis e identifiable par la ligne de rep re tourn e vers le haut Les ban deteties mal orient es doivent tre remises en position l aide de pincettes pro pres Afin d viter toute contamination bien nettoyer les pincettes apr s chaque utilisation Celta vaut aussi pour toutes les tapes suivantes 5 Placer la plaque dans les bain marie agitateur YwinCubator et incuber 30 mi nutes 45 C Pour le bain marie agitateur s lectionner une fr quence d agitation suffisante pour assurer un bon brassage du tampon Ajuster Le niveau de l eau dans le bain marie agitateur au moins un tiers de ta hauteur des
12. nutes notamment de la temp rature de la pi ce Des temps de r v lation trop longs peuvent entrainer un bruit de fond qui peut g ner l inter pr tation des r sultats 13 Arr ter La r action en rin ant bri vement deux fois l eau distill e 14 A l aide de pincettes r cup rer les bandelettes et les s cher entre deux cou ches de papier absorbant Lecture et Interpr tation des R sultats Classer et ranger les bandelettes l abri de la lumi re Une feuille de lecture est fournie avec le kit mais peut galement tre t l charg e l adresse suivante http www hain lifescience de pdf enterococcus _evaluation pdf La matrice fournie avec la trousse permet d identifier chaque zone r actionnelle par superposition Chaque bandelette comprend 10 zones r actionnelles voir figure fe Contr le Conjugu CC Contr le Universel UC faecalis E faecium E gallinarum E casseliflavus VanA vanB vanCt vanC2 C3 Contr le Conjugu CC Une ligne color e doit se d velopper dans cette zone Cette ligne t moigne de ta bonne fixation du conjugu et le bon d roulement de ta r v lation Contr le Universel UC Cette zone comprend une sonde s hybridant au niveau d une r gion d ADN haute ment conserv e au sein de toutes les esp ces bact riennes test es ce jour Le d veloppement d une ligne color e dans cette zone indique ta pr s
13. puits de fa on assurer un bon transfert de chaleur Cela vaut aussi pour toutes les tapes suivantes 6 Aspirer le contenu des puits Utiliser par exemple une pipette pasteur reli e une pompe vide 7 Ajouter chaque puit 1 ml de Solution de Lavage Stringent STR rouge et incuber 15 minutes 45 C dans Le bain marie agitateur TwinCubator 8 A partir de cette tape travailler temp rature ambiante Eliminer La Solution de Lavage Stringent Vider La Solution de Lavage Stringent dans un container d chets Eliminer tout le liquide r siduel en retournant les puits sur du papier absorbant effectuer de m me pour les autres tapes de lavage Laver chaque puit avec 1 ml de Sotution de Rin age RIN et incuber pendant une minute sous agitation Vider La Solution de Rin age 10 Ajouter chaque puit 1 mi de Conjugu dilu voir ci dessus et incuber 30 mi nutes sous agitation 11 Vider Le contenu des puits et rincer sous agitation 1 minute l aide de 1 ml de Solution de Rin age RIN Vider RIN R p ter ce rin age une nouvelle fois puis rincer une fois avec environ 1 mt d eau distill e l aide d une pissette Bien liminer toute trace d eau dans les puits apr s cette derni re tape 12 Ajouter 1 mt de Substrat dilu voir ci dessus dans chaque puit et incuber sans agitation l obscurit Le temps de r v lation peut varier en fonction des conditions de d roulement du test de 3 20 mi
14. ste la possibilit que des variations dans la s quence d ADN g nomique cible et pour lesquelles Le test n a pas t con u entra nent un r sultal erron En raison de l extr me variabi lt des g nomes bact riens il est possible que certains saus types puissent ne pas tre d tect s Le test refl te l tat actuel des connaissances de la soci t HAIN LIFESCIENCE Causes d Erreurs R sultats faibles ou absence de signal incluant ta zone de contr le conjugu Temp rature ambiante trop basse ou r actifs mal quilibr s CON C et ou SUB C trop dilu ou CON D et ou SUB D utilis sans dilution pr alable R sultats faibles ou absence de signal except dans la zone de contr le conjugu La qualit et ou la quantit de l ADN extrait n ont pas permis une amplification correcte Analyser l ADN amplifi sur un gel Si aucun amplicon n est visible r p ter les tapes d extraction et d amplification Essayer ventuellement une autre m thode d extraction de l ADN A noter que la r action d amplification peut tre inhib par un chantillon de d part trop concentr Temp rature d incubation trop lev e Signaux faux positifs Temp rature d incubation trop basse Solution d Hybridation et ou Solution de Lavage Stringent incorrectement gui tibr s ou homog n is s Contamination de l ADN extrait et ou des r actifs d amplification avec de l ADN pr c demment extrait ou amplif
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