EGR1/5p15 DNA-FISH Probe VC s wF
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1. Utiliser de l eau distill e pour la pr paration de toutes les solutions m res et de toutes les solutions de travail S rie d thanol 70 85 et 100 Pr parer des dilutions vol vol d thanol 100 et d eau distill e Conserver TA HCI 0 01N acide chlorhydrique Ajouter 0 5 mL de HCI 1N 49 5 mL d eau distill e Conserver TA Pr chauffer la solution 37 C dans un bain marie avant usage Solution m re de pepsine 0 4 4 mg mL Dissoudre 100 mg de pepsine dans 25 mL de HCL O 2N Conserver des aliquots de 500 uL 20 C Formald hyde 1 Ajouter 12 5 mL de formaline 10 4 formaldehye 37 mL de PBS 1X Ajouter 500 uL de MgCl 100X Conserver 4 C jusqu une semaine SSC 0 5X Citrate de sodium salin Tween 20 0 1 Ajouter 25 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 974 mL d eau distill e Bien m langer en tour noyant Conserver TA PBS 1X solution saline dans un tampon phosphate M langer 100 mL de PBS 10X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver TA SSC 2X M langer 100 mL de SSC 20X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver temp rature ambiante TA SSC 2X Tween 20 0 1 Ajouter 100 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 899 mL d eau distill e Bien m langer en tournoyant Conserver TA MgCl 100X Chlorure de magnesium dans PBS 1X Ajouter 50 uL de MgCI2 1M a 450 uL de PBS 1X Proc dure Standard for FISH Remarque Produit p2. EGR1 5p15 DNA FISH Probe Sonde d num ration bicolore CE 11 014 EX fa Mode d emploi a Usage pr vu La Sonde DNA FISH EGR1 5p15 de Cancer Genetics Italia est con ue pour d tecter la d l tion du g ne EGR1 situ en 5q31 par rapport au locus con tr le 5p15 par hybridation in situ en fluorescence FISH La perte du g ne EGRI est d tect e dans 10 15 des patients avec un syndrome my lo dysplasique SMD de novo ou une leuc mie my lo de aigu LMA et dans 35 42 des cas de SMD ou LMA li s la th rapie t SMD t LMA P Quand cette aberration chromosomique est observ e seule dans les cas de SMD aussi appel syndrome 5q la perte du g ne EGRI est associ e un pronostic favorable et une bonne r ponse au traitement par l nalido mide Dans les cas de SMD LMA et t SMD t LMA la perte de EGR1 dans le cadre d un caryotype complexe est associ e un mauvais pronostic et une issue d favorable ITALIA Er g 5p15 5p15 EGR1 Chromosome 5 t lom re l 5 1 3 t lom re aa g 554kb 222kb EGR1 5 Repr sentation sch matique de la sonde DNA FISH EGR1 5p15 Les barres horizontales rouges et vertes indiquent les r gions couvertes par les sondes approximativement l chelle GRCh37 Hg19 2009 La sonde EGR1 mar qu e directement rouge s tend sur la totalit du g ne et la sonde 5p15 verte sert de contr le Conservation l arriv e conserver le produit 20 C l abri
3. ant que le lavage soit fini 1 Pr chauffer les solutions de SSC 2X Tween 20 0 1 et de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C Retirer la colle de caoutchouc de la lame l aide de pinces Tremper bri vement la lame dans la solution de SSC 2X TA Retirer la lamelle couvre objet Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 2X Tween 20 0 1 45 C Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C Rincer bri vement la lame dans de l eau distill e Laisser s cher la lame l air libre l abri de la lumi re directe Appliquer 20 uL de DAPI Antifade la zone hybrid e et recouvrir d une lamelle couvre objet 25 x 25 mm N Accessoires pour microscope Objectifs Un objectif 10X est adapt au balayage de la zone cible Un grossissement sup rieur s av re n cessaire pour l analyse des signaux et doit avoir lieu avec un objectif immersion huile 63X ou 100X Huile d immersion L huile d immersion doit tre adapt e la microscopie en fluorescence Lampe Une lampe mercure de 100 watts avec une dur e de vie maximale de 200 heures est recommand e Remplacer la lampe avant qu elle ne d passe les 200 heures Filtres recommand s Fluorophore Excitation mission f ax Visualisation et interpr tation des signaux Le signal doit tre visualis l aide d un microscope pifluorescence qui p des
4. de la lumi re jusqu la date de p remption Conservation des lames Conserver les lames hybrid es a 20 C l abri de la lumi re Remarque Ces conditions de conservation s appliquent la fois aux produits non ouverts et ouverts Le nombre de cycles de gel d gel ne doit pas d passer le nombre de tests recommand s par flacon Conserver dans le flacon d origine Les flacons conserv s dans d autres conditions peu vent ne pas offrir de performance optimale et par cons quent affecter les r sultats du test Manipulation Tous les r actifs doivent tre manipul s comme s ils taient capables de trans mettre des agents infectieux Apr s usage tout le mat riel doit tre limin conform ment la loi nationale en vigueur Manipuler tous les r actifs et lames contenant des fluorophores en clairage r duit afin d viter toute d t rioration du signal fluorescent Avertissements et mises en garde Lire le mode d emploi avant toute utilisation Tout transport ou conservation impropre peut d truire ou d t riorer la perfor mance du produit En cas de r ception d emballage ou de flacon endommag de d faillance du dispositif apr s utilisation conforme au mode d emploi ou de blessure de l utilisateur contacter le fabricant Tout flacon endommag doit tre limin conform ment la loi nationale en vigueur et aucun essai ne doit tre r alis partir d un tel r actif Manipuler to
5. filtres appropri s Remarque sur la proc dure Les signaux peuvent tre diff rents plans focaux c est pourquoi il est important de focaliser vers le haut et vers le bas des sp ci mens afin de s assurer du comptage de tous les signaux Dans la m taphase diplo de normale et dans les noyaux en interphase la sonde DNA FISH EGR1 5p15 g n re deux signaux rouges et deux verts correspondant respectivement aux deux chromosomes 5 Lors des cas de d l tions dans la r gion 5p15 dans lesquels le g ne EGR1 est d l t et le locus 5p15 maintenu un signal rouge et deux signaux verts pourront tre observ s Lors de la perte d un chromosome 5 entier un signal rouge et un vert uniques pourront tre observ s correspondant au chromosome 5 res tant Recommandations et limitations Ce produit a t optimis pour tre utilis sur des lames pr par es partir de sp cimens de sang p riph rique et de moelle osseuse conform ment aux m thodes cytog n tiques courantes Le fabricant garantit que ce produit r pond aux caract ristiques de performance analytique sensi bilit sp cificit reproductibilit et intervalle de validit tablies sur du sang p riph rique normal ou des tissus pr vus Chaque nouveau lot de sonde DNA FISH doit tre test pour la sp cificit du locus sur un sp cimen de sang p riph rique normal et sur le tissu pr vu pour v rifier la bonne performance du r actif Il
6. incombe au labo ratoire d tablir les intervalles de validit l aide de sp cimens de controle positifs et n gatifs du tissu pr vu l utilisation de filtres aux caract ristiques spectrales autres que celles sp cifi es peut affecter n gativement la force du signal Par exemple le fluorophore rouge est visible travers un filtre orange mais les signaux apparaissent faibles La technique FISH sur m taphase est recommand e pour caract riser les variantes et les patrons de signaux anormaux atypiques Le test FISH est consid r comme une adjonction la cytog n tique classique caryotype Les r sultats de ces tests doivent tre interpr t s dans la totalit du contexte des ant c dents cliniques du patient Aucune d cision m dicale ne peut tre prise en se fondant uniquement sur les r sultats du test FISH Glossaire des symboles Num ro de lot Dispositif m dical de diagnostic in vitro D Risques biologiques PN 4N Conserver labri de la lumi re du REF Num ro de catalogue soleil Attention consulter la documenta ud Fabricant tion d accompagnement C LL Limite sup rieure de temp rature Marquage CE de conformit 7 i Utiliser avant le Contient suffisamment pour 10 tests Bibliographie 1 2 Herry et al Eur J Haematol 2007 78 6 p 457 67 3 Schoch C et al Genes Chromosomes Cancer 2002 35 1 p 20 9 4 5 Haase D Ann Hematol 2008 87 7
7. lame pendant 5 min dans du formald hyde 1 TA 5 Laver la lame pendant 5 min dans une solution PBS 1X TA 6 D shydrater la lame dans de l thanol 70 85 et 100 TA pendant 1 min chacun 7 Laisser s cher la lame l air libre Remarque sur la proc dure V rifier la morphologie de l chantillon l aide d un microscope contraste de phase avant l hybridation Ne pas hybrider en cas de compromission de la morphologie nucl aire Suite la page suirante Proc dure Standard for FISH D naturation hybridation de la sonde DNA FISH 1 Vortexer bri vement la sonde DNA FISH et centrifuger le tube dans une microcentrifugeuse pendant 30 secondes Appliquer 10 uL de sonde DNA FISH sur la zone cible sur la lame et la recouvrir d une lamelle couvre objet 22 x 22 mm Remarque sur la proc dure Prendre soin d viter toute formation de bulles d air Des lamelles couvre objets plus petites ou plus grandes peuvent tre utilis es en fonction du changement proportionnel de volume de la sonde DNA FISH Sceller soigneusement les bords de la lamelle couvre objet l aide de colle de caoutchouc Co d naturer la lame et la sonde DNA FISH pendant 3 min 80 C sur une plaque chauffante temp rature control e Incuber pendant 12 18 heures dans une chambre humidifi e 37 C l abri de toute lumi re directe Lavage post hybridation Remarque sur la proc dure Eviter de faire s cher la lame av
8. p 515 26 NCBI Gene database www ncbi nim nih gov List A et al N Engl J Med 2006 355 14 p 1456 65 Cancer Genetics Italia S r l Viale Luigi Majno 17 20122 Milano Italia wWwWw cancergeneticsitalia com support cancergeneticsitalia com DNA FISH Probe fabriqu e dans la communant europ enne par Cancer Genetics ltalia S r l 2012 Cancer Genetics Italia S r l Version 05 14 12
9. r t l emploi Ne pas reconstituer ni diluer Pour usage professionnel uniquement Seul e un e technologiste m dical e familiaris e avec les m thodes de cytog n tique et form e la technique FISH peut r aliser le test Tout l quipement doit tre talonn avant la r alisation du test Le tissu vis est du sang p riph rique et la moelle osseuse Les lames doi vent tre pr par es conform ment aux directives des m thodes cytog n tiques standards du laboratoire r alisant le test Pr paration des lames Toutes les lames fra chement pr par es doivent tre vieillies pendant 1 heure et demie 45 50 C avant l hybridation Si l hybridation n a pas lieu le m me jour que la pr paration conserver les lames 4 C ou 20 C Les lames avec des cellules cytoplasme visible peuvent n cessiter un pr trai tement l aide d un enzyme prot olytique du type pepsine voir pr traite ment facultatif la pepsine Pr traitement facultatif des lames la pepsine 1 Pr chauffer 50 mL de HCI 0 01N 37 C 2 Ajouter 10 15 ul de solution m re de pepsine 0 4 aux 50 mL de HCI 0 01N pr chauff s et incuber la lame pendant 5 10 min 37 C dans la pepsine Remarque sur la proc dure Certains sp cimens peuvent n cessiter des temps de digestion plus longs dans la pepsine 3 Laver deux fois la lame pendant 5 min dans une solution PBS 1X tem p rature ambiante TA 4 Incuber la
10. us les r actifs avec soin et porter un quipement de protection in dividuelle appropri Le formamide la solution saline de citrate de sodium SSC Saline Sodium Citrate et le dod cyl sulfate de sodium SDS peuvent avoir des effets t ratog nes et mu tag nes viter toute inhalation ingestion ou contact avec la peau Le DAPI estun irritant Consulter le Material Safety Data Sheet MSDS du produit pour les informations concernant la s curit R actif fourni Sonde DNA FISH pr te l emploi 100 uL par flacon 10 tests Un test est d fini comme suffisant pour une aire de 22mm x 22mm Sonde tiquet e au fluorophore pour le locus EGR1 rouge et au fluoro phore pour le locus 5p15 vert pr m lang e avec de l ADN bloquant et un tampon d hybridation formamide sulfate de dextran SSC et SDS R actifs et mat riel n cessaire mais non fournis Equipements Reactifs Bocal coplin Microcentrifugeuse tanol 100 Lamelles couvre objets Microtube centrifuger 0 5 PBS 10X 22x22 e 25x25 mL HCI 1N Microscope pifluores Micropipettes 1 200 mL MgCl 1M cence pH m tre NaOH 1M Pinces Colle de caoutchouc SSC 20X Hotte aspirante Plateau pour lames Formaline 10 Gants Thermom tre calibr DAPI et Antifade Chambre humidifi e 37 C to 80 C Eau distill e Huile d immersion Plaque chauffante Pepsine Incubateur Bain marie Tween 20 Lampe mercure 100 watts Pr paration des r actifs Remarque
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