MycAssay™ Aspergillus
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1. aide d ADN extrait de diverses esp ces fongiques et non fongiques Les esp ces suivantes n ont pas donn de r sultat positif Alternaria alternata Blastomyces capitatus Candida albicans C glabrata C parapsilosis C tropicalis Cladosporium spp Cryptococcus neoformans Doratomyces microsporus Fusarium solani Histoplasma capsulatum Pneumocystis jirovecii Rhizomucor pusillus Rhodotonila rubra Saccharomyces cerevisiae Scedosporium apiospermum S prolificans Sporothrix schenkii Trichosporon capitatum Les esp ces bact riennes suivantes n ont pas donn de r sultat positif Bordetella pertussis Corynebacterium diphtheriae Escherichia coli Haemophilus influenzae Lactobacillus plantarum Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae S pyogenes S salivarius L ADN du g nome humain ne donne pas de r sultat positif avec ce test Reproductibilit et r p tabilit La r p tabilit et la reproductibilit du test ont t d termin es par cinq op rateurs qui ont analys en aveugle un ensemble de sept matrices en trois exemplaires chacune Les exp riences ont t men es sur trois lots de fabrication du kit MycAssay Aspergillus sur trois automates situ s sur deux sites au Royaume Uni Les r sultats ont t compar s la limite du blanc et la valeur limite clinique une concentrat2. archiver s affiche Si ce nombre est correct cliquer sur Proceed Pour importer les donn es d analyse s lectionner Data Management dans le r pertoire Tools en haut de l cran puis dans le menu d roulant s lectionner Retrieve Run s Un message s affiche Cliquer sur Proceed Dans le menu d roulant Look in s lectionner le p riph rique de stockage utilis pour archiver les donn es d analyse voir la section 3 4 ci dessus S lectionner le fichier d analyse r cup rer puis cliquer sur Open Un nouvel cran invite l utilisateur s lectionner l analyse r cup rer S lectionner l analyse r cup rer puis cliquer sur OK Un message indiquant le nombre d analyses r cup rer s affiche Si ce nombre est correct cliquer sur Proceed Si une copie papier des r sultats est galement souhait e cliquer sur Report puis sur Print D pannage 4 1 Le t moin n gatif a mis un signal positif dans la voie FAM gt Une contamination s est produite pendant la pr paration Aucun des r sultats de l analyse n est fiable R p ter toute l analyse en faisant preuve de pr caution lors de l ajout des matrices en particulier du t moin positif Tube 4 pour viter toute contamination crois e Veiller ce que le plan de travail et l quipement soient bien d contamin s avant et apr s utilisation Le t moin n gatif a t mal positionn sur l automate Veiller placer les tubes r actionnels aux empla
3. nomique total des chantillons cliniques de LBA et d autres chantillons des voies respiratoires inf rieures cette fin il est recommand d utiliser le kit d isolement et l quipement suivants employ s pour la validation du test Kit d extraction d ADN fongique MycXtra R F 080 005 disponible aupr s de Myconostica Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc New York tats Unis Adaptateur vortex R F 080 015 disponible aupr s de Myconostica Remarques sur le mode op ratoire Lire le mode op ratoire dans son int gralit avant de commencer La dur e totale du mode op ratoire du test MycAssay Aspergillus extraction d ADN exclue est d environ 2 heures selon le nombre d chantillons analys s Il convient de pr parer le test sur un poste de travail pour PCR ou dans un laboratoire pr PCR Si aucun poste de travail pour PCR n est disponible il convient de pr parer le test dans une zone d di e du laboratoire s par e des zones utilis es pour l extraction d ADN et nettoy e r guli rement avec un agent de d contamination de l ADN Toutefois les agents de d contamination de ADN sont susceptibles d inhiber la r action du test Il faut donc viter leur utilisation lors de la pr paration de la PCR en temps r el Transvaser les liquides au moyen de micropipettes Il convient d utiliser des micropipettes d di es la pr paration des r actions et de les d contaminer r guli rement Il est r
4. Il contient un t moin positif base d ADN qui en cas de contamination risque de donner des r sultats faussement positifs 1 7 Laisser le contenu des tubes d congeler temp rature ambiante pendant 5 10 minutes V rifier que le contenu de chaque tube est enti rement d congel avant utilisation Agiter les tubes et les chantillons de patient au vortex pour en m langer le contenu puis centrifuger bri vement dans une microcentrifugeuse pour s assurer qu il ne reste pas de d p t au fond des tubes avant utilisation 1 8 Placer le nombre requis de tubes r actionnels SmartCycler sur les portoirs Veiller toujours saisir les tubes r actionnels par le col 1 9 Pr parer toujours le t moin n gatif en premier suivi des chantillons de patients Il convient de toujours pr parer le t moin positif en dernier 1 10 Les volumes de r actifs et d ADN sont indiqu s dans le tableau ci dessous R action 030 116 Version 2 6 01MAR12 R actif T moin n gatif chantillon de patient T moin positif Tube 1 bouchon orange Tube 2 bouchon vert Tube 3 bouchon transparent chantillon de patient Tube 4 bouchon noir 7 5 uL 7 5 uL 10 uL 7 5 uL 7 5 uL 10 uL 7 5 uL 7 5 uL Volume total Fran ais 5 25uL MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro Cepheid SmartCycler Echantillons Respiratoires 1 11 Ajouter les r actifs dans l ordre indiqu da
5. du test MycAssay Aspergillus Myconostica Mode d emploi Certificat d analyse Conservation Il convient de conserver le kit au cong lateur de 15 C 25 C jusqu la date d expiration indiqu e sur l tiquette de la bo te du kit date au del de laquelle il convient de mettre le kit au rebut conform ment la r glementation locale en vigueur Le contenu d un sachet doit tre utilis imm diatement apr s ouverture Ne pas le recongeler ni le r utiliser ult rieurement Fran ais 3 030 116 Version 2 6 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro Cepheid SmartCycler Echantillons Respiratoires quipement et mat riel n cessaires et non fournis A quipement n cessaire Automate de PCR en temps r el SmartCycler avec manuel d utilisation ordinateur reli et logiciel SmartCycler Dx version 3 0 ou 1 7b Tubes r actionnels SmartCycler Minicentrifugeuse adapt e aux tubes r actionnels SmartCycler Portoir en plastique pour tubes r actionnels SmartCycler B quipement n cessaire commun Microcentrifugeuse Agitateur vortex Micropipettes volumes de 7 5 uL 20 uL Embouts filtres st riles faible r tention Gants usage unique non poudr s Solution de d contamination de l ADN exclusive Marqueur permanent Kit d isolement d ADN voir ci dessous chantillon L chantillon soumettre au test MycAssay Aspergillus est l ADN g
6. puis cliquer sur l onglet Define Assays et importer le fichier MycAssay Aspergillus v1_3 sca du CD ROM Cliquer sur l onglet Create Run Saisir un nom d analyse dans le champ Run Name il est recommand d inclure au moins la date et les initiales de l op rateur dans le nom ou laisser le champ vierge afin que le logiciel g n re automatiquement un nom S lectionner le test MycAssay Aspergillus v1 3 Dans les champs Lot Number et Expiration Date saisir respectivement le num ro de lot et la date d expiration du kit tels qu imprim s sur la bo te du kit et sur chaque sachet Le num ro de lot est sous la forme M XXXXXXXYX Dans les champs Patient Sample ID et Number of specimens saisir respectivement l identifiant du patient de l chantillon et le nombre d chantillons r plicats puis cliquer sur Apply R p ter l op ration pour tous les chantillons de patient analyser Le logiciel inclut automatiquement un t moin n gatif et un t moin positif l analyse par PCR en temps r el Placer avec pr caution les tubes r actionnels sur les emplacements d sign s sur le bloc SmartCycler puis cliquer sur Start Run Remarque Faire preuve de pr caution lors du placement des tubes r actionnels sur les emplacements d sign s car ceux ci peuvent se trouver dans un ordre diff rent de celui de la pr paration Noter le nom de l analyse puis cliquer sur OK L analyse d marre et des voyants rouges s allument au dessus de chaque em
7. Pour diagnostic in vitro MycAssay Aspergillus Cepheid SmartCycler myconosjica chantillons Respiratoires MycAssay Aspergillus Cepheid SmartCycler chantillons Respiratoires REF 080 045 Usage pr vu L utilisation de MycAssay Aspergillus r serv e au personnel de laboratoire qualifi est indiqu e pour la d tection qualitative d ADN g nomique d Aspergillus spp extrait d chantillons respiratoires des voies respiratoires inf rieures par exemple chantillons bronchiques comme aide au diagnostic chez les patients adultes suspects d infection ou d allergie Aspergillus Le test MycAssay Aspergillus a t valid pour une utilisation sur l automate Cepheid SmartCycler avec le logiciel Dx versions 1 7b et 3 0 R sum et explication Aspergillus spp est une moisissure opportuniste ubiquiste qui provoque des syndromes la fois allergiques et invasifs Ce genre se d cline en 300 esp ces environ parmi lesquelles 41 sont associ es des maladies chez l homme La majorit des infections sont provoqu es par A fumigatus A flavus A terreus et A niger Moins couramment A nidulans et d autres esp ces rares telles qu A sydowii A versicolor A lentulus et A pseudofischeri sont impliqu es La plupart des infections et des allergies dues Aspergillus spp affectent les voies respiratoires Les syndromes allergiques incluent notamment l aspergillose bronchopulmonaire allergique et la sinu
8. ation du kit tels qu imprim s sur la bo te du kit et sur chaque sachet Le num ro de lot est sous la forme M XXXXXXXX Saisir le nombre d chantillons dans le champ Number of specimens puis cliquer sur Apply Le logiciel renseigne automatiquement le champ Sample ID de chaque chantillon avec la mention SPEC Par cons quent des fins d identification renommer chaque chantillon en double cliquant sur SPEC pour le mettre en surbrillance puis en saisissant un identifiant Le logiciel inclut automatiquement un t moin n gatif et un t moin positif l analyse par PCR en temps r el Placer avec pr caution les tubes r actionnels sur les emplacements d sign s sur le bloc SmartCycler puis cliquer sur Start Run Remarque Faire preuve de pr caution lors du placement des tubes r actionnels sur les emplacements d sign s car ceux ci peuvent se trouver dans un ordre diff rent de celui de la pr paration Noter le nom de l analyse puis cliquer sur OK L analyse d marre et des voyants rouges s allument au dessus de chaque emplacement utilis du bloc Pour d terminer le temps d analyse cliquer sur l onglet Check Status Le nom de l analyse et le temps restant s affichent Logiciel de diagnostic SmartCycler Dx version 3 0 D marrer le logiciel de diagnostic SmartCycler Dx version 3 0 et saisir le nom d utilisateur et le mot de passe Introduire le CD ROM du mode op ratoire du test MycAssay Aspergillus Myconostica dans le lecteur
9. cements d sign s 4 2 La valeur Ct de IAC du t moin n gatif ne se trouve pas dans la plage acceptable gt La PCR a t inhib e V rifier que le plan de travail et l quipement soient compl tement secs apr s nettoyage avec un agent de d contamination et avant pr paration de la PCR Les conditions de conservation du kit ne sont pas conformes aux instructions de la section Conservation du mode d emploi ou le kit a atteint sa date d expiration V rifier que le kit a t conserv dans de bonnes conditions V rifier la date d expiration des r actifs sur la bo te du kit ou l tiquette des sachets et si n cessaire r p ter l analyse avec un kit encore valable 030 116 Version 2 6 01MAR12 Fran ais 8 Pour diagnostic in vitro MycAssay Aspergillus Echantillons Respiratoires Cepheid SmartCycler gt Le r actif du Tube 1 ou du Tube 2 n a pas t ajout au m lange r actionnel pour PCR ou deux fois trop de r actif du Tube 2 a t ajout R p ter l analyse en faisant preuve de pr caution lors de la phase de pr paration De telles erreurs sont d tectables lorsque le niveau de liquide d un tube r actionnel est plus lev ou plus bas que celui des autres tubes 4 3 Le t moin positif donne un r sultat n gatif 4 4 4 5 gt Les conditions de conservation du kit ne sont pas conformes aux instructions de la section Conservation du mode d emploi ou le kit a atteint sa dat
10. dans deux h pitaux dont l ADN a t extrait avec le kit MycXtra puis qui ont t congel s ont servi valuer les performances du kit MycAssay Aspergillus avec les chantillons cliniques Les r sultats ont t compar s la fois au diagnostic clinique et la culture La valeur limite de Ct 36 0 a t d termin e suite au passage en revue d un ensemble de donn es d chantillons issus de diff rents sites et pr lev s sur diff rentes populations de patients La probabilit de diff renciation entre la maladie et l tat sain a t valu e avec plusieurs valeurs limites Comparaison entre la PCR et le diagnostic clinique Diagnostic clinique Diagnostic clinique positif n gatif PCR positive 31 1 0 97 VPP PCR n gative 2 10 0 83 VPN 0 94 0 91 Sensibilit Sp cificit Comparaison entre la PCR et la culture d Aspergillus Culture positive Culture n gative PCR positive 29 3 0 91 VPP PCR n gative 2 10 0 83 VPN 0 94 0 77 Sensibilit Sp cificit Parmi les chantillons analys s 0 8 contiennent des inhibiteurs de la PCR suite l extraction l aide du kit MycXtra comme indiqu par lIAC Rapport clinique REMARQUE Lors de lexamen du rapport des r sultats v rifier que le bon mode op ratoire a t suivi Pour les chantillons respiratoires il est imp ratif d utiliser MycAssay Aspergillus Dx1 7b v1 3 ou MycAssay Aspergillus v1_3 L
11. des parties aliquotes des tubes Greene R 2005 The radiological spectrum of pulmonary aspergillosis Med Mycol 43 Suppl 1 5147 54 1 Denning DW Riniotis K Dobrashian R Sambatakou H 2003 Chronic cavitary and fibrosing pulmonary and pleural aspergillosis Case series proposed nomenclature and review Clin Infect Dis 37 Suppl 3 S265 80 1 Camuset J Lavol A Wislez M Khalil A Bellocq A Bazelly B Mayaud C Cadranel J 2007 Bronchopulmonary aspergillosis infections in the non immunocompromised patient Rev Pneumol Clin 63 155 166 E Tyagi S Kramer FR 1996 Molecular beacons probes that fluoresce upon hybridization Nature Biotechnology 14 303 308 030 116 Version 2 6 01MAR12 Fran ais 2 Pour diagnostic in vitro MycAssay Aspergillus Echantillons Respiratoires Cepheid SmartCycler est recommand d utiliser des embouts pour pipettes st riles exempts de DNAse et usage unique de type filtres faible r tention ou d placement direct Utiliser un embout neuf pour chaque chantillon et chaque r actif Mettre au rebut les r actifs inutilis s et les d chets conform ment la r glementation nationale r gionale et locale en vigueur Afin d viter la contamination par les amplicons d Aspergillus et de l IAC ne pas ouvrir les tubes r actionnels apr s amplification L analyse de t moins suppl mentaires peut tre exig e par les recommandations ou la r glementation natio
12. e mode op ratoire SERUM MycAssay Asp v1 est r serv au kit MycAssay Aspergillus SmartCycler Serum IFU R f 030 169 L utilisation d un mode op ratoire inadapt peut invalider les r sultats Le kit MycAssay Aspergillus est destin servir d aide au diagnostic Les r sultats doivent tre consid r s dans le contexte de l tat clinique du patient et en association avec les r sultats d autres tests de diagnostic Il est recommand d employer la phras ologie suivante dans le rapport en fonction de l interpr tation des r sultats du test R sultat 1 Aspergillus spp non d tect R sultat 2 Aspergillus spp d tect R sultat positif Ce test est galement susceptible de d tecter P nicillium spp R sultat 3 chec du test pr sence d inhibiteurs ou d une autre substance inconnue Limites du mode op ratoire La principale limite de ce mode op ratoire est li e la qualit de l chantillon primaire Si l chantillon est tr s petit ou n a pas t pr lev dans la zone affect e du poumon le test peut se r v ler moins sensible et donner un r sultat faussement n gatif Il convient de centrifuger les chantillons de LBA avant extraction de ADN du culot Fran ais 11 030 116 Version 2 6 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro Cepheid SmartCycler Echantillons Respiratoires Les donn es ont galement montr qu une diminution lors de l tape de cent
13. e Run s E Retrieve Run s installation Qualification Complete Backup Control Trending Complete Restore System Monitoring foet R Retrieve Run s This will retrieve the selected run s into the main database Would you like to continue _ Proceed 2 1 4 S lectionner le fichier MycAssay Aspergillus Dx1_7bv1_3 DXA sur le CD ROM comme indiqu ci dessous Ce fichier doit tre l un des deux fichiers reconnus par le logiciel 2 1 5 Sur l cran suivant mettre en surbrillance le fichier MycAssay Aspergillus Dx1 7b v1 3 puis cliquer sur OK Proceed et nouveau OK 030 116 Version 2 6 01MAR12 Fran ais 6 Pour diagnostic in vitro MycAssay Aspergillus Echantillons Respiratoires Cepheid SmartCycler 2 1 8 2 1 9 2 1 10 2 1 11 2 1 12 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 2 4 2 2 5 2 2 6 2 2 7 2 2 8 3 1 3 2 3 3 Fermer le logiciel la prochaine ouverture du logiciel le test MycAssay Aspergillus Dx1 7b v1 3 pourra tre utilis pour cr er une nouvelle analyse Cliquer sur l onglet Create Run Saisir un nom d analyse dans le champ Run Name il est recommand d inclure au moins la date et les initiales de l op rateur dans le nom ou laisser le champ vierge afin que le logiciel g n re automatiquement un nom S lectionner le test MycAssay Aspergillus Dx1 7b v1 3 Dans les champs Lot Number et Expiration Date saisir respectivement le num ro de lot et la date d expir
14. e d expiration V rifier que le kit a t conserv dans de bonnes conditions V rifier la date d expiration des r actifs sur la bo te du kit ou l tiquette des sachets et si n cessaire r p ter l analyse avec un kit encore valable Une erreur s est produite l tape 1 12 et la matrice du t moin positif Tube 4 a t plac e dans le mauvais tube r actionnel R p ter l analyse en faisant preuve de pr caution lors de la phase de pr paration De telles erreurs sont d tectables lorsque le niveau de liquide d un tube r actionnel est plus lev que celui d un autre Le r actif du Tube 1 ou du Tube 2 n a pas t ajout au m lange r actionnel R p ter l analyse en faisant preuve de pr caution lors de la phase de pr paration De telles erreurs sont d tectables lorsque le niveau de liquide de ce tube r actionnel est plus bas que celui des autres tubes Le t moin positif a t mal positionn sur l automate Veiller placer les tubes r actionnels aux emplacements d sign s Les chantillons de patient donnent le R sultat 3 Invalid gt Il est probable que les chantillons cliniques extraits contiennent des inhibiteurs de la PCR Il est recommand d extraire l ADN des chantillons cliniques l aide du kit d extraction d ADN fongique MycXtraTM Aucune voie ne donne de r sultat pour aucun des chantillons ni des t moins gt Les conditions de conservation du kit
15. ecommand d utiliser des embouts filtres faible r tention afin d viter toute perte d ADN pendant la phase de pr paration Manipuler le Tube 4 avec pr caution Il contient un t moin positif base d ADN qui en cas de contamination risque de donner des r sultats faussement positifs Toujours porter des gants Tous les tubes r actionnels doivent tre bouch s apr s utilisation et avant mise au rebut En cas de traitement d chantillons de plusieurs patients veiller identifier les tubes r actionnels SmartCycler de mani re adapt e Faire preuve de vigilance lors de la s lection du fichier du mode op ratoire d analyse S lectionner UNIQUEMENT MycAssay Aspergillus Dx1 7b v1 3 ou MycAssay Aspergillus v1_3 Ne pas s lectionner SERUM MycAssay Asp v1 13 Voir par exemple Miffin T E 2003 Setting up a PCR Laboratory In PCR Primer 2nd Ed eds Dieffenbach and Dveksler Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour NY USA 030 116 Version 2 6 01MAR12 Fran ais 4 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro Cepheid SmartCycler Echantillons Respiratoires Mode op ratoire 1 Pr paration de la PCR en temps r el 1 1 Pour commencer mettre en marche le syst me de PCR en temps r el automate et ordinateur reli et lancer le logiciel correspondant Saisir le nom d utilisateur et le mot de passe 1 2 V rifier que le plan de travail a t nettoy l aide d un agent de d contaminat
16. ence de bulles dans le m lange r actionnel 1 15 Passer aussit t la Section 2 Les r actions du test MycAssay Aspergillus restent stables temp rature ambiante pendant un maximum de 60 minutes 1 16 Apr s pr paration de la PCR nettoyer soigneusement le plan de travail l aide d un agent de d contamination de l ADN 2 R alisation de l analyse Avant de poursuivre v rifier la version du logiciel Dx install e sur l ordinateur Lancer le logiciel s lectionner Help dans la barre d outils puis cliquer sur About Pour la version 1 7b suivre les consignes de la Section 2 1 ci dessous Pour la version 3 0 suivre les consignes de la Section 2 2 ci dessous Noter galement que la r cup ration d analyses avec l option Retrieve Run s et l importation de test avec l option Import exigent des droits d acc s particuliers Seul l administrateur de l instrument peut assigner ces droits 2 1 Logiciel de diagnostic SmartCycler Dx version 1 7b 2 1 1 D marrer le logiciel de diagnostic SmartCycler Dx version 1 7b et saisir le nom d utilisateur et le mot de passe 2 1 2 Introduire le CD ROM du mode op ratoire du test MycAssay Aspergillus Myconostica dans le lecteur puis cliquer sur l onglet Define Assays 2 1 3 S lectionner Retrieve Run s dans le r pertoire Tools situ dans la barre d outils sup rieure puis cliquer sur Proceed Smart Cycler Dx User Logs Setup Tools Help Data Management P Archiv
17. gne Ce produit est vendu sous licence par le Public Health Research Institute PHRI Newark New Jersey tats Unis et il est sous protection de la propri t intellectuelle du PHRI Son utilisation se limite au diagnostic humain in vitro SmartCycler est une marque d pos e de Cepheid 904 Caribbean Drive Sunnyvale Californie 94089 tats Unis Une partie de ce produit est soumis une autorisation exclusive d exploitation de brevet en instance d tenu par le Fred Hutchinson Cancer Centre Seattle Etats Unis Lab21 184 Cambridge Science Park Cambridge CB4 0GA United Kingdom Telephone 44 0 1638 552 882 Facsimile 44 0 1638 552 375 Email productsupport lab21 com 030 116 Version 2 6 01MAR12 Fran ais 12
18. gnificance Clin Microbiol Infect 4 710 716 Perfect JR Cox GM Lee JY Kauffman CA de Repentigny L Chapman SW Morrison VA Pappas P Hiemenz JW Stevens DA and the Mycoses Study Group 2001 The impact of culture isolation of Aspergillus species A hospital based survey of Aspergillosis Clinical Infectious Diseases 33 1824 33 7 Maertens J Van Eldere J Verhaegen J Verbeken E Verschakelen J Boogaerts M 2002 Use of Circulating Galactomannan Screening for Early Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Allogeneic Stem Cell Transplant Recipients The Journal of Infectious Diseases 186 1297 306 8 Tillie Leblond I Tonnel AB 2005 Allergic bronchopulmonary aspergillosis Allergy 60 1004 13 Fran ais 1 030 116 Version 2 6 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro Cepheid SmartCycler Echantillons Respiratoires Les m thodes actuelles de diagnostic de l aspergillose pulmonaire chronique font appel la fois la radiologie qui n est pas sp cifique et la s rologie anticorps IgG d Aspergillus ou pr cipitines qui se r v le positive avec la plupart des formes d aspergillose et qui n est donc pas sp cifique d une manifestation particuli re d aspergillose 1 Les cultures donnent des r sultats positifs dans seulement 40 65 des cas confirm s par radiologie ou s rologie Dans la mesure o le diagnostic diff rentiel est vaste et inclut notamment la tuberculose les mycobact rioses atypique
19. ibilit de l isolat qui entra ne l infection L aspergillose bronchopulmonaire allergique complique l asthme et la mucoviscidose et appara t rarement sans affection sous jacente La plupart des cas sont associ s l A fumigatus Occasionnellement d autres champignons sont impliqu s Cette maladie est caract ris e par un encombrement pisodique des voies a riennes par d pais bouchons d expectorations contenant de nombreuses hyphes d Aspergillus un taux d IgE totales s riques gt 1 000 IU mL et des anticorps IgE et IgG d tectables sp cifiques d A fumigatus ou un test positif de la piq re pidermique par Aspergillus Les cultures d expectorations peuvent tre positives pour A fumigatus et la bronchectasie est visible sur un tomodensitogramme de la poitrine 1 Base de donn es des esp ces sur www aspergillus org uk Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 The invasive and saprophytic syndromes due to Aspergillus spp Medical Mycology 43 suppl 1 S207 38 3 Hope WW Walsh TJ Denning DW 2005 Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis Lancet Infectious Diseases 9 609 22 4 Levy H Horak DA Tegtmeier BR Yokota SB Forman SJ 1992 The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis Respir Med 86 243 8 5 Greub G and Bille J 1998 Aspergillus species isolated from clinical specimens suggested clinical and microbiological criteria to deteremine si
20. ion gale trois fois le seuil de d tection 100 des chantillons ont donn des r sultats conformes la limite du blanc r sultats positifs et 91 des chantillons ont donn des r sultats conformes la valeur limite clinique des concentrations sup rieures trois fois le seuil de d tection 100 des chantillons pr sentaient des r sultats conformes la valeur limite clinique et la limite du blanc Dans le cas des matrices n gatives tous les chantillons analys s ont donn un r sultat n gatif la valeur limite clinique Substances interf rentes contre indications Les compos s suivants ont t analys s des concentrations pertinentes du point de vue clinique et d termin s comme non inhibiteurs du test ac tylcyst ine amphot ricine dipropionate de b clom tasone bud sonide colistim thate sodique propionate de fluticasone fumarate de formot rol dihydrat bromure d ipratropium lidoca ne mannitol sulfate de salbutamol salm t rol chlorure de sodium cromoglicate de sodium terbutaline tobramycine 14 Nierman WC Pain A Anderson MJ et al 2005 Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigates Nature 438 1151 6 030 116 Version 2 6 01MAR12 Fran ais 10 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro Cepheid SmartCycler Echantillons Respiratoires valuation des performances Des chantillons respiratoires LBA pr lev s
21. ion de l ADN et qu il est sec viter cependant l utilisation de tels agents pendant la pr paration du test car un exc s de solution nettoyante peut inhiber la PCR 1 3 Un sachet contient un Tube 1 un Tube 2 un Tube 3 et un Tube 4 Chaque sachet contient les quantit s n cessaires de r actifs pour r aliser 8 r actions Pour chaque passage au moins une r action avec un t moin positif et une r action avec un t moin n gatif doivent tre r alis es avec les r actifs d un m me lot du kit Un sachet permet ainsi d analyser 6 chantillons de patient S il y a plus de 6 chantillons analyser plusieurs sachets peuvent tre utilis s condition que ceux ci proviennent du m me lot du kit Les 5 sachets du kit permettent d analyser un maximum de 38 chantillons de patient 1 4 Calculer le nombre de r actions requises en se reportant au tableau ci dessous Nombre de sachets Nombre maximum d chantillons de patient 6 1 5 Sortir le nombre adapt de sachets du cong lateur Ne pas utiliser un sachet non scell En cas de cong lation des chantillons de patient apr s extraction sortir galement ceux ci du cong lateur 1 6 Ouvrir le nombre n cessaire de sachets en les d chirant et en extraire les tubes En cas d utilisation de plusieurs sachets mais d analyse d un seul jeu de t moins positif et n gatif les Tubes 3 et 4 ne doivent tre retir s que d un seul sachet Manipuler le Tube 4 avec pr caution
22. nale r gionale et ou locale en vigueur ou par l organisme d agr ment Ne pas manger boire ni fumer proximit des zones de manipulation des chantillons et des r actifs L ADN faible concentration peut tre instable s il nest pas conserv correctement I est recommand de conserver l ADN extrait des chantillons cliniques 80 C afin d en pr server l int grit Dans la mesure du possible il convient galement d viter la d cong lation et la recong lation r p t es Contenu du kit Description Le kit est constitu de 5 sachets en aluminium 3 compartiments scell s utilisables individuellement Chaque sachet contient les quantit s n cessaires de r actifs pour r aliser 8 r actions Volume Tube 1 dNTP 66 uL bouchon MgCl orange Solution tamponn e de complexe d ADN polym rases Tube 2 lt 0 01 d amorces 66 uL bouchon vert lt 0 01 de balises mol culaires lt 0 0001 d IAC Le contr le interne d amplification est un plasmide recombinant contenant une s quence non infectieuse et sans relation avec la s quence cible Aspergillus Tampon Tris HCI Tube 3 T moin n gatif 25 uL bouchon Eau transparent Tube 4 T moin positif 25 uL bouchon noir lt 0 0001 d ADN t moin positif La mol cule du t moin positif est un plasmide recombinant contenant la s quence cible d Aspergillus Tampon Tris HCI Autres l ments contenus dans le kit CD ROM du mode op ratoire
23. ne sont pas conformes aux instructions de la section Conservation du mode d emploi ou le kit a atteint sa date d expiration V rifier que le kit a t conserv dans de bonnes conditions V rifier la date d expiration des r actifs sur la bo te du kit ou l tiquette des sachets et si n cessaire r p ter l analyse avec un kit encore valable L automate ne fonctionne pas de fa on optimale V rifier que l entretien et l talonnage de l automate de PCR en temps r el sont jour conform ment aux instructions du guide d installation et de maintenance La configuration du logiciel a t faite avec un fichier de mode op ratoire incorrect Se reporter la Section 2 et s lectionner le fichier de mode op ratoire correct sur le CD ROM de mode op ratoire Myconostica tel qu indiqu pour chaque version du logiciel Seul le fichier compatible avec le logiciel peut tre charg R p ter l analyse avec le fichier de mode op ratoire correct Pour toute question ou en cas de probl me contacter le Service d assistance technique productsupport lab21 com Fran ais 9 030 116 Version 2 6 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro Cepheid SmartCycler Echantillons Respiratoires Caract ristiques de performance et limites Sensibilit analytique partir du mode op ratoire d crit ci dessus et des cibles de PCR g n r es par Myconostica la limite du blanc d termin e pour le test MycAssay A
24. ns le tableau ci dessus Tube 1 suivi du Tube 2 puis de la matrice t moin n gatif chantillon de patient ou t moin positif Faire preuve de pr caution lors du pr l vement des parties aliquotes du Tube 1 le liquide est l g rement visqueux et peut adh rer la paroi interne du tube Si c est le cas proc der une nouvelle centrifugation pour recueillir le reste du contenu dans le fond du tube avant de tenter de pr lever les derni res parties aliquotes 1 12 Utiliser un embout de pipette neuf pour chaque transfert de liquide Apr s utilisation reboucher chaque tube r actionnel et jeter imm diatement le tube et le contenu restant dans un conteneur d chets cliniques scellable Il est impossible de conserver les r actifs inutilis s pour un usage ult rieur 1 13 Faire preuve d une extr me pr caution lors du pr l vement la pipette dans le Tube 4 ADN t moin positif afin de ne pas contaminer d autres tubes r actionnels Le bouchage des autres tubes r actionnels avant ouverture du Tube 4 peut r duire le risque de contamination crois e 1 14 V rifier que tous les tubes r actionnels sont bien bouch s puis marquer chaque bouchon au marqueur permanent par exemple avec les mentions POS pour t moin positif NEG pour t moin n gatif et l identifiant du patient pour les chantillons Centrifuger les tubes r actionnels pendant 10s dans la minicentrifugeuse sp cialement adapt e V rifier par un contr le visuel l abs
25. placement utilis du bloc Pour d terminer le temps d analyse cliquer sur l onglet Check Status Le nom de l analyse et le temps restant s affichent Analyse et interpr tation des donn es Les r sultats peuvent tre affich s dans le logiciel Dx en s lectionnant l onglet View Results Cliquer sur le bouton View Another Run en bas de la page s lectionner l analyse afficher puis cliquer sur OK L option Patient Results doit d j tre s lectionn e dans la liste Views L identifiant du patient de l chantillon et les r sultats du test sont clairement num r s Les r sultats peuvent tre interpr t s l aide du tableau ci dessous Fran ais 7 030 116 Version 2 6 01MAR12 MycAssay Aspergillus Pour diagnostic in vitro Cepheid SmartCycler chantillons Respiratoires R sultat R sultat patient Couleur Interpr tation Action n cessaire 1 Negative Vert N gatif pour Aspergillus Mentionner les r sultats dans le rapport 2 Positive Rouge Positif pour Aspergillus Mentionner les r sultats dans le rapport 3 Invalid Gris chec de FIAC dans l chantillon R p ter l analyse de clair l chantillon 4 Invalid Gris chec du t moin positif ou du R p ter toute l analyse clair t moin n gatif Le r sultat ND en gris clair correspond au code d erreur 3079 Il est d une forte fluorescence dans une ou plusieurs voies Si une valeur de Ct lt 36 0 est enregis
26. rifugation du volume de surnageant utilis pour l extraction r duit la proportion d inhibiteurs p n trant dans le syst me est possible d obtenir des r sultats faussement positifs si l agent infectieux est P nicillium spp car celui ci ne peut pas tre diff renci d Aspergillus spp avec ce kit Bien que le proc d d extraction d ADN fongique MycXtra M soit con u pour liminer les inhibiteurs de la PCR tous les m dicaments et toutes les populations de patients n ont pas t valu s Ce mode op ratoire n a pas t valu de mani re approfondie sur les expectorations et n a pas non plus t valu sur les chantillons provoqu s dans le s rum physiologique ni sur des chantillons pr lev s sur des enfants Des r sultats faussement positifs peuvent tre obtenus en cas de contamination externe de l chantillon initial ou du test par exemple par de l air contenant de l Aspergillus par une mauvaise technique de manipulation du t moin positif ou par contamination externe en particulier de la pipette par l ADN d Aspergillus Dans la mesure o un r sultat vraiment positif peut tre obtenu avec des chantillons de patients colonis s temporairement ou en permanence par Aspergillus spp le r sultat du test doit tre interpr t cliniquement dans le contexte de la maladie LICENCE TopTaq Hot Start est fourni par QIAGEN QIAGEN est une marque d pos e de Qiagen GmbH Hilden Allema
27. s la sarco dose l histoplasmose la coccidio domycose la pneumoconiose le poumon rhumato de la pelvispondylite rhumatismale et d autres il est important d tablir la pr sence d Aspergillus spp dans les chantillons respiratoires afin d viter tout retard de diagnostic de l aspergillose et les traitements inadapt s MycAssay Aspergillus est un kit de diagnostic mol culaire qui repose sur la d tection de l ADN g nomique d Aspergillus spp par la technologie de la PCR en temps r el balises mol culaires Le mode op ratoire complet extraction d ADN de l chantillon clinique comprise peut tre r alis en 4 heures alors que la m thode par culture peut prendre plusieurs jours pour produire des r sultats positifs Ce test pr sente plusieurs avantages par rapport aux m thodes de diagnostic actuelles de l aspergillose invasive aigu et de l aspergillose pulmonaire chronique notamment une d tection plus rapide d Aspergillus spp et une augmentation potentielle de la sensibilit Aspergillus spp chez les patients fortement immunod prim s suspects d aspergillose pulmonaire invasive Principes de la m thode Apr s m lange des r actifs du kit MycAssay Aspergillus avec un chantillon contenant la s quence cible d ADN d Aspergillus une partie du g ne ribosomal 18S d Aspergillus un cycle thermique entra ne l amplification de l ADN Le test utilise galement un contr le interne d amplification IAC po
28. site aspergillaire allergique g n ralement dues A fumigatus Les aspergilloses pulmonaires chroniques comprennent l aspergillome l aspergillose pulmonaire cavitaire chronique et l aspergillose fibrosante chronique L aspergillose invasive appara t chez les groupes de patients risque notamment ceux trait s par cortico des et ceux atteints de neutrop nie ou de dysfonctionnement du syst me phagocytaire c est dire granulomatose chronique ou infection VIH Environ 80 des cas d aspergillose invasive touchent les poumons Le diagnostic g n ral de l aspergillose pulmonaire invasive inclut un examen de tomodensitom trie TDM une bronchoscopie et un lavage broncho alv olaire observation sous microscopie et culture une recherche de l antig ne d Aspergillus dans le sang ou un examen histologique d chantillons pr lev s par biopsie Dans ce cas de figure les cultures sont souvent faussement n gatives En effet le lavage broncho alv olaire donne un r sultat positif par culture dans environ 40 des cas seulement m me lorsque le diagnostic a t confirm par d autre moyens 4567 ce qui traduit le manque de sensibilit de la culture pour la d tection de l aspergillose invasive et de l aspergillose pulmonaire chronique N anmoins les cultures sont importantes lorsqu elles sont positives car la plupart des tests de diagnostic n indique ni le genre ni l esp ce du champignon responsable de la maladie ni le profil de sens
29. spergillus correspond Ct 38 0 tandis que le seuil de d tection est lt 50 copies de l ADN cible Ces valeurs ont t d termin es avec la souche AF293 d Aspergillus fumigatus dont le g nome a t enti rement s quenc II a t d montr par cartographie optique que le g nome contient 37 copies de la cible Ainsi 50 copies de la cible repr sentent environ 1 3 g nomes Sp cificit et s lectivit analytiques La sp cificit analytique a t valu e l aide d ADN extrait de 15 esp ces d Aspergillus dont plusieurs souches d A fumigatus d A niger d A terreus et d A nidulans Les signaux d tect s au del de la limite du blanc ont t enregistr s comme r sultats positifs Les 15 esp ces d Aspergillus spp ont donn un r sultat positif avec ce test Outre les esp ces mentionn es ci dessus les esp ces suivantes ont t test es A flavus A versicolor A glaucus A sclerotiorum A niveus A lentulus A unguis A candidus A wentii A tubingensis et A foetidus L ADN g nomique extrait de P nicillium spp a galement donn des r sultats positifs Cela s explique par le fait que les s quences des cibles mol culaires sont tr s similaires entre Aspergillus et P nicillium Par cons quent il est noter qu un r sultat positif avec ce test peut provenir d une infection P nicillium plut t qu une infection Aspergillus La s lectivit analytique a t valu e l
30. tr e dans la voie Aspergillus mentionner ce r sultat comme positif dans le rapport 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 Pour afficher les r sultats des chantillons individuels s par ment pour Aspergillus ou l IAC s lectionner Sample Results dans la liste Views puis cliquer sur les onglets de chacune des cibles Les r sultats s affichent dans le m me format que pour l option Patient Results mais concerne chaque cible Si un chantillon de patient pr sente un r sultat invalide celui ci est d l chec de l IAC indiqu par la mention Unresolved dans l onglet Sample Results Dans ce cas r p ter la r action ainsi que l analyse des t moins positif et n gatif Si la r action choue nouveau il se peut que la matrice contienne une substance inhibitrice et que le r sultat n gatif ne soit pas fiable Pour exporter les donn es d analyse vers un autre ordinateur s lectionner Data Management dans le r pertoire Tools en haut de l cran puis dans le menu d roulant s lectionner Archive Run s Un message s affiche Cliquer sur Proceed S lectionner l analyse archiver en cochant la case de gauche puis cliquer sur OK Un message d avertissement indiquant le nombre d analyses archiver s affiche Si ce nombre est correct cliquer sur Proceed S lectionner un emplacement d enregistrement du fichier d analyse par exemple une cl USB Cliquer sur Save et noter le nom du fichier Un message indiquant le nombre d analyses
31. ts ce moment L automate de PCR en temps r el surveille simultan ment la fluorescence mise par toutes les balises Pr cautions L utilisation du kit est r serv e aux professionnels de laboratoire Les modes op ratoires doivent tre suivis de mani re viter la production d a rosols lors de la manipulation des chantillons Il convient d observer les pr cautions habituelles et les recommandations en vigueur dans l tablissement lors de la manipulation des chantillons Une fiche de donn es de s curit est disponible aupr s de Myconostica Ltd Ce test est r serv au diagnostic in vitro Ce test est compatible uniquement avec l automate Cepheid SmartCycler et le logiciel de diagnostic Dx versions 1 7b et 3 0 Ne pas utiliser les r actifs ni les t moins si les sachets protecteurs sont ouverts ou endommag s la livraison Les r actifs et les t moins ne sont pas interchangeables d un lot un autre Ne jamais m langer les r actifs ou les t moins provenant de diff rents tubes m me s ils sont du m me lot Ne jamais utiliser les r actifs ni les t moins au del de la date d expiration convient de ne pas recongeler ni r utiliser les r actifs et les t moins apr s ouverture Porter des v tements de protection et des gants usage unique pour manipuler les r actifs du kit viter la contamination des r actifs par les microbes et la d soxyribonucl ase DNAse lors du pr l vement
32. ur Internal Amplification Control un fragment d ADN non pr sent dans le g nome des Aspergillus d autres champignons des bact ries ni de l homme pour d tecter les substances inhibitrices de la PCR et confirmer la fonctionnalit des r actifs Les cibles d ADN amplifi es sont d tect es par des balises mol culaires Il s agit de sondes d hybridation oligonucl otidiques monobrins qui forment une structure tige boucle La boucle contient une s quence de la sonde compl mentaire la s quence de la cible tandis que la tige est form e par annelage de s quences lat rales compl mentaires de part et d autre de la s quence de la sonde Un fluorophore qui met de la fluorescence lorsqu il est excit par une lumi re de longueur d onde adapt e est fix par liaison covalente une extr mit d un bras et un extincteur de fluorescence qui inhibe la fluorescence du fluorophore lorsqu il en est physiquement proche est fix par liaison covalente l extr mit de l autre bras Libres en solution les balises mol culaires ne sont pas fluorescentes Par contre lors de l hybridation avec un brin d acide nucl ique contenant une s quence cible elles subissent un changement de conformation qui s pare le fluorophore et l extincteur de fluorescence ce qui les rend fluorescentes lorsqu elles sont excit es L intensit de la fluorescence pendant un cycle donn ou apr s un cycle d pend de la quantit d amplicons sp cifiques pr sen
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