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BIOHIT CALPROTECTIN ELISA

1. 109 Disposi o sugerida da placa ELISA para calibradores controlos e amostras com procedimento manual Recomenda se a utiliza o de po os duplicados para maior fiabilidade dos resultados Uma placa com pleta tem capacidade para 40 amostras 9 PROCEDIMENTO DE TESTE O seguinte procedimento destina se aos testes manuais Os protocolos validados para os sistemas autom ticos de ELISA Dynex DS2 e DSX est o dispon veis mediante pedido Tenha em aten o que os frascos dos calibradores da solu o em branco e do controlo positivo bem como do tubo do conjugado encaixam diretamente nos sistemas autom ticos de ELISA DS2 ou DSX Podem ser utilizados outros instrumentos ELISA autom ticos mas estes ter o de ser validados pelo cliente 9 1 Notas do procedimento Prepara o Leia cuidadosamente o protocolo de teste antes de re alizar o ensaio A fiabilidade do resultado depende da observ ncia rig orosa do protocolo de teste descrito Antes de come ar o ensaio deve ser cuidadosamente estabelecida uma disposi o da placa para todas as solu es em branco calibradores controlos e amostras utilizando por exemplo a folha fornecida no kit Selecione o n mero necess rio de faixas de titula o As faixas n o utilizadas devem ser fechadas novamente na bolsa de alum nio e armazenadas segundo o procedi mento descrito na Sec o 6 1 e Recomenda se uma dilui o de 1 100 dos extratos de fezes Esta dilui o proporci
2. 50 mg kg Positive value gt 50 mg kg Valor m dio em doentes com cancros colorretais sin 350 mg kg tomaticos Doen a inflamat ria do intestino sintom tica ativa 200 40 000 mg kg Tenha em aten o que um diagn stico n o deve ser baseado apenas no resultado de um nico teste O diagn stico deve ter em considera o o historial cl nico e os sintomas 113 Os seguintes valores de Calprotectina foram encontrados no sangue de 100 dadores de sangue saudaveis 50 homens e 50 mulheres Tipo de amostra M dia ug L DP Plasma EDTA 627 307 11 LIMITA ES DO PROCEDIMENTO O diagn stico n o deve ser baseado apenas no resultado de um nico teste 12 CARACTER STICAS DE DESEMPENHO Nota Todos os estudos de verifica o do projeto foram realizados por meio de testes manuais em amostras de extratos de fezes dilu das a 1 100 ou amostras de plasma EDTA dilu das a 1 20 utilizando o pro cedimento ELISA descrito na Sec o 9 Precis o interensaio e intraensaio dos extratos de fezes e precis o intraensaio do plasma EDTA Precis o interensaio Precis o intraensaio Precis o intraensaio extratos de fezes extratos de fezes plasma EDTA Concen CV Concen CV Concen CV tra o tra o tra o no nas fezes nas fezes plasma mg kg mg kg ug L 32 1 13 28 7 6 7 166 3 8 171 6 0 173 3 6 740 47 368 48 385 4 1 1160 2 9 583 6 1 592 4 0 1360 3 5 1215
3. Muestra Concentraci n mg kg CV Baja 130 8 7 Alta 1357 8 8 Linealidad extractos de heces Los extractos de heces n 10 se diluyeron a 1 100 1 1000 y se anal izaron en ELISA Resultados medios Dilucion de diluci n a 1 100 1 100 100 1 400 103 1 700 105 1 1000 107 95 T ngase en cuenta que se ha observado una variaci n de la muestra en cuanto a la linealidad Linealidad plasma con EDTA Las muestras de plasma n 5 se diluyeron a 1 20 1 80 y se analizaron en ELISA Resultados medios Diluci n de diluci n a 1 20 1 20 100 1 40 107 1 80 116 T ngase en cuenta que se ha observado una variaci n de la muestra en cuanto a la linealidad 13 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES De conformidad con el art culo 1 p rrafo 2b de la Directiva europea 98 79 CE el fabricante de los dispositivos m dicos para diagn stico in vitro persigue con su uso garantizar la idoneidad resultados y se guridad del producto Por lo tanto el procedimiento de an lisis la informaci n las precauciones y las advertencias que figuran en las instrucciones de uso deben seguirse escrupulosamente El uso de los kits con analizadores y aparatos similares a n debe validarse No se autoriza ningun cambio en el dise o composici n y procedimiento de an lisis como tampoco el uso en combinaci n con otros productos no aprobados por el fabricante el usuario es responsable de estos ca
4. e 1M NaOH soluci n de frenado optativa 5 ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO Si se almacenan sin abrir a 2 8 C los reactivos del kit permanecen esta bles hasta la fecha de caducidad que indica la etiqueta Las placas reactivos y amortiguadores concentrados que se hayan abi erto permanecen estables hasta un maximo de tres meses si se alma cenan a 2 8 C Si se preparan en recipientes limpios las soluciones de trabajo 1x de amortiguador para lavado amortiguador para la diluci n de muestras y amortiguador para la extracci n fecal pueden almacenarse a 2 8 C du rante un maximo de un mes Evitar la exposici n a altas temperaturas y a la luz directa del sol 6 PREPARACION DE LOS REACTIVOS Todos los reactivos muestras y controles deben llevarse a temperatura ambiente 18 25 C antes de empezar el an lisis 6 1 Tiras recubiertas de la placa de pocillos Las tiras de la placa est n listas para usar y vienen recubiertas con an ticuerpos murinos monoclonales purificados mediante afinidad especifi cos para la calprotectina Las tiras que no se usen deben eliminarse de la estructura y volverse a sellar inmediatamente en bolsa de papel de 85 aluminio junto con el desecante suministrado Almacenar a 2 8 C 6 2 Amortiguador para la diluci n de muestras Diluir el amortiguador para diluci n de muestras concentrado a 5x afia diendo 1 parte 20 ml a 4 partes 80 ml de agua destilada desionizada en un recipiente limpio
5. o de ajuste da curva de 4 par metros ver figura 1 abaixo Se for necess rio um eixo x logar tmico deve ser usado um valor de 0 001 ng mL para a solu o padr o A 0 ng mL 3 Utilizar a curva de calibra o para determinar a concentra o de Cal protectina nas amostras dilu das ng mL com base nos seus valores de DO 4 Multiplicar a concentra o de Calprotectina ng mL nos extratos de fezes dilu dos por 5 para fazer a convers o em mg kg de Cal protectina na amostra de fezes original Este fator corrige a dilui o total de 1 5000 1 50 durante o procedimento de extra o e a dilui o seguinte de 1 100 dos extratos e converte o valor de ng mL em mg kg Exemplo se uma amostra de extrato dilu da apresentar um valor de 100 ng mL a concentra o na amostra de fezes original era de 100 x 5 112 500 mg kg Nota se os extratos tiverem sido dilu dos numa propor o superior ou inferior propor o de 1 100 o fator de dilui o adicional deve ser tido em considera o no c lculo 3 25 OD 405 nm os o 100 200 300 400 so Concentration ng mL 0 Caiprotectin std A 0 086151 B 1 0908 C 146 71 092 9173 d 0 0048461 r 0 99998 Figura 1 Uma curva padr o representativa com um ajuste de curva de 4 parametros 10 3 Interpreta o dos resultados A literatura publicada exp s os seguintes valores de Calprotectina em amostras de fezes 25 Valor normal 5
6. puhtaaseen as tiaan jolloin liuosta on 100 ml Sekoita hyvin S ilyt laimennettu n yt teen laimennuspuskurikonsentraatti suljetussa astiassa 2 8 C n l mp tilassa Huomautus Jos k yt t Dynex DS2 tai DSX ELISA automaattia laimen nuspuskurikonsentraatti tulee siirt 25 ml n Dynex reagenssiputkeen ennen testin suorittamista 6 3 Pesupuskuri Laimenna 20x pesupuskurikonsentraatti lis m ll yksi osa 50 ml 19 28 osaan 950 ml tislattua deionisoitua vett puhtaaseen astiaan jolloin liuosta on 1000 ml Sekoita hyvin S ilyt laimennettu pesupuskuri sulje tussa astiassa 2 8 C n l mp tilassa 6 4 Ulosten ytepuskuri Laimenna 2 5x ulosten ytepuskurikonsentraatti lis m ll yksi osa 90 ml 1 5 osaan 135 ml tislattua deionisoitua vett puhtaaseen astiaan jolloin liuosta on yhteens 225 ml Sekoita hyvin S ilyt laimennettu puskurikonsentraatti suljetussa astiassa 2 8 C n l mp tilassa 6 5 Kalibraattorit 0 n yteliuos ja kontrollit 0 n yteliuos kalibraattorit ja kontrollit sis lt v t jokainen 1 0 ml k yt t valmista liuosta Kalprotektiinipitoisuus on merkitty jokaisen pullon etikettiin Pullot ovat yhteensopivia Dynex DS2 ja DSX ELISA automaat tien kanssa 6 6 Konjugaattiliuos Putki sis lt 13 ml em ksist fosfataasi leimattua ALP affiniteetti puh distettua kanin kalprotektiinivasta ainetta puskurissa jossa on stabilisaat toria s il nt aineita ja inaktiivista
7. a de Crohn O BIO HIT Calprotectin ELISA foi validado para amostras de fezes O teste destina se utiliza o no diagn stico in vitro 2 CONTEXTO A Calprotectina uma prote na transportadora de c lcio e zinco de 36 quilodaltons libertada sobretudo pelos leuc citos em particular pelos granul citos neutr filos polimorfonucleares PMN para o l men intes tinal durante a inflama o da mucosa intestinal Os microrganismos do intestino estimulam a migra o dos leuc citos para o lumen intestinal Uma vez a eles libertam os seus conte dos incluindo subst ncias an timicrobianas como a Calprotectina Esta prote na constitui cerca de 60 das prote nas totais no citoplasma dos PMN 2 e pode ser estimada de forma fiavel em amostras de fezes armazenadas por um periodo maximo de sete dias temperatura ambiente V rios tipos de doen a como as infe es bacterianas a artrite reuma toide e o cancro levam ativa o dos PMN e ao aumento dos n veis de Calprotectina no plasma no l quido cefalorraquidiano no l quido sinovial no l quido sulcular na urina ou em outros materiais humanos 4 A concentra o de Calprotectina nas fezes esta correlacionada com o n mero de PMN que migram para o l men intestinal 5 e pode ser detetada de forma fi vel mesmo em pequenas amostras aleat rias de fezes com menos de uma grama 22 As doen as org nicas do intestino emitem um sinal forte de Calprotectina isto ap
8. dans un r cipient propre et le remettre au laboratoire le plus t t possible dans un d lai maximum de quatre jours S il est plac dans un r cipient ad quat pour son transport il peut tre envoy par courrier ordinaire au cune r frig ration n est n cessaire L exposition a des temp ratures de plus de 30 C doit tre vit e Les chantillons peuvent galement tre stock s congel s a 20 C ou moins jusqu a leur remise ou envoi Les chantillons congel s doivent tre d congel s et port s temp rature ambiante avant l extraction et le test Il faut savoir que dans certains cas les chantillons de selles congel s peuvent avoir des niveaux de calprotectine sup rieurs proba blement dus a sa lib ration par les granulocytes Remarque Avant de commencer l extraction l chantillon de selles doit tre bien homog n is en utilisant par exemple une spatule avant le pr l vement d une faible quantit Pour l extraction nous recommandons l utilisation de tubes d extraction BIOHIT ou de toute autre des m thodes d crites ci dessous chapitre 67 7 1 1 et 7 1 2 Effectuer l extraction conform ment la notice contenue dans l emballage pour la m thode et le dispositif d extraction choisis D autres m thodes et dispositifs valid s par le client peuvent tre uti lis s 7 1 1 Extraction l aide de tubes BIOHIT Mode d emploi veuillez lire la notice contenue de l emballage du produ
9. js ofta av vaga symtom eller ovilja att utf ra endoskopi och biopsi BIOHIT Calprotectin ELISA kan bidra till tidigare diagnos av IBD eftersom testet vanligtvis r positivt vid aktiv IBD Funktionsst rningar som colon irritabile IBS orsakar inte f rh jda kal protektinkoncentrationer men det g r organiska kommor i buken som IBD Patienter med organiska och funktionsst rningar i buken kan ha liknande symtom och enbart klinisk unders kning kan d rf r vara otill 43 racklig for att ge en specifik diagnos Ett test for fekalt kalprotektin ar en enkel icke invasiv billig och objektiv metod som kan vara till hj lp med att selektera patienter for vidare unders kning t ex endoskopi Buksymtom ar mycket vanliga bland bade barn och vuxna och ett negativt resultat som uppm tts med BIOHIT Calprotectin ELISA kan med stor sannolikhet utesluta inflammatoriska tarmst rningar Lakning av slemhinnan r det optimala m let f r IBD behandling och ett test for fekalt kalprotektin visar nar detta har uppnatts Manga IBD patienter i klinisk remission med normala varden for C reaktivt protein CRP har fortfarande en pagaende inflammation 10 som pavisas av f rh jt fekalt kalprotektin Sadana patienter l per kad risk f r terfall inom n gra m nader 11 Om l kning av slemhinnan kan uppn s min skar risken f r terfall och behovet av omfattande bukkirurgi 12 19 En normalisering av kalprotektinv rdet inneb r att l kni
10. nem a utiliza o em combina o com outros produtos n o aprovados pelo fabricante O utilizador respons vel por tais altera es O fabricante n o respons vel por 116 resultados falsos e incidentes decorrentes dessas altera es O fabri cante n o respons vel por quaisquer resultados obtidos por meio da an lise visual das amostras do doente Apenas para utiliza o no diagn stico in vitro Todos os componentes de origem humana utilizados na produ o destes reagentes foram submetidos a um teste para dete o de anti corpos anti VIH anticorpos anti VHC e antig nio da hepatite B Bag e revelaram se n o reativos N o obstante todos os materiais devem ser considerados e manuseados como potencialmente infeciosos N o utilizar reagentes ou faixas de lotes de produ o diferentes N o utilizar reagentes de outros fabricantes com reagentes deste kit de teste N o utilizar os reagentes depois do prazo de validade indicado no r tulo ou 1 m s depois da prepara o de reagentes concentrados em solu es de trabalho Utilizar apenas pontas de pipeta distribuidores e acess rios de labo rat rio limpos N o trocar as tampas de rosca dos frascos de reagentes para evitar a contamina o cruzada Fechar bem os frascos de reagentes imediatamente ap s a utiliza o para evitar a evapora o e a contamina o microbiana Ap s a primeira abertura e o armazenamento posterior verificar os frascos dos conjug
11. o em branco Calibrateurs 1 5 Calibradores 1 5 Calibradores 1 a 5 Contr le faible Control bajo Controlo baixo Contr le fort Control alto Controlo alto Conjugu Conjugado Conjugado Substrat Sustrato Sustrato BIOHIT Calprotectin ELISA kit 602 260 INSTRUCTIONS FOR USE 6 K YTT OHJE ws stsa tatin 24 INSTRUKTIONER FOR ANVANDANDE 43 MANUEL D INSTRUCTION ii 61 INSTRUCCIONES DE USO sain 81 INSTRU ES DE USO lassarensesesnasssonesinnerassernorsndorsenena 101 REFERENCES KIRJALLISUUS H NVISNINGAR RE FERENCES REFERENCIAS REFERENCIAS 120 ORDERING INFORMATION TILAUSTIEDOT BESTALL NINGSINFORMATION INFORMATION CONCERNANT LA COMMANDE INFORMACION DE PEDIDOS INFOR MA ES PARA COMPRA ii 122 ENGLISH INSTRUCTIONS FOR USE BIOHIT Calprotectin ELISA kit Cat No 602 260 1 INTENDED USE incio ica alesana afili 2 BACKGROUND sociosanitaria 3 PRINCIPLE OF THE TEST ae 4 MATERIALS cool easier ass PTE DEE ESEE nera TEREN 4 1 Reagents supplied with the kit 8 4 2 Materials supplied with the kit ae 4 3 Materials required but not Supplied nannaa 9 5 STABILITY AND STORAGE sucio a 9 6 REAGENT PREPARATION E 6 1 Coated microtiter plate strips 10 6 2 Sample Dilution Buffer seia vasama ada 10 6 3 Washing Buffer 10 6 4 Fecal Extraction Buffer 6 5 Calibr
12. 1 de Kathon Contiene lt 0 1 de acida de sodio Contiene 0 1 de Kathon y lt 0 1 de acida de socio Contiene 0 02 de metilisotiazolona y 0 02 de bromonitrodioxano xxx Pn 4 2 Materiales facilitados con el kit e 2 l minas de sellado 1 protocolo de an lisis 1 esquema de placa 4 3 Materiales necesarios que no se suministran Agua destilada desionizada Aparatos de extracci n ver secciones 7 1 1 y 7 1 2 Asas bacteriol gicas desechables y rompibles si se usa el m todo de pesada de la secci n 7 1 2 Balanza digital sensible 40 150 mg si se usa el m todo de pesada de la secci n 7 1 2 Tubos desechables con tap n de rosca de poliestireno de 5 ml si se 84 usa el m todo de pesada de la secci n 7 1 2 e Agitador vortex Tubos desechables para la diluci n de las muestras Tubos eppendorf o similares si el an lisis se lleva a cabo de forma manual Pipetas para aplicar vol menes de 10 1000 ul si el an lisis se lleva a cabo de forma manual Pipeta repetidora o pipeta multicanal de 100 ul si el an lisis se lleva a cabo de forma manual Limpiador de pocillos o pipeta multicanal de 300 ul si el an lisis se lleva a cabo de forma manual Agitador de placas 500 700 rpm si el an lisis se lleva a cabo de forma manual Temporizador si el an lisis se lleva a cabo de forma manual Lector de placas filtro de 405 nm si el an lisis se lleva a cabo de forma manual
13. 125 ng ml C Kalibrator 3 Kalibrator 3 Prov 3 Prov 3 62 5 ng ml 62 5 ng ml D Kalibrator 2 Kalibrator 2 Prov 4 Prov 4 31 3 ng ml 31 3 ng ml E Kalibrator 1 Kalibrator 1 Prov 5 Prov 5 7 8 ng ml 7 8 ng ml F Blank Blank Prov 6 Prov 6 0 ng ml 0 ng ml G Kontroll L g Kontroll L g Prov 7 Prov 7 Kontroll H g Kontroll H g Prov 8 Prov 8 F rslag till layout f r ELISA platta med kalibratorer kontroller och prover f r manuellt f rfarande Duplicera brunnarna enligt rekommendationerna f r att ka resultatens tillf rlitlighet En full platta rymmer 40 prover 50 9 TESTFORFARANDE F ljande f rfarande g ller manuell testning Validerade protokoll f r Dynex DS2 och DSX ELISA automater r tillg ngliga p beg ran Ob servera att flaskorna med kalibrator blank och positiv kontroll samt kon jugatr ret passar direkt i DS2 eller DSX ELISA automater Andra automa tiska ELISA instrument kan ocks anv ndas men de m ste valideras av kunden 9 o 1 F rklaringar till f rfarandet Beredning Las testprotokollet noga innan analysen utf rs Resultatets tillf rlitlighet beror av att testprotokollet f ljs exakt enligt anvisningarna Innan analysen p b rjas ska en plattlayout f r alla blanka kalibratorer kontroller och prover fastst llas t ex med det blad som ingar i kitet V lj n dv ndigt antal mikrotiterremsor Oanv nda remsor ska ter f rslutas i foliep sen och f
14. 4 9 ml puskuria 100 mg a ulostetta kohti Sulje putki 6 Sekoita voimakkaasti 30 sekunnin ajan vortex sekoittimessa 7 Jatka sekoitusta ravistimessa noin nopeudella 1000 r min noin 30 5 minuutin ajan Silmukan tulee olla putken sis ll sekoituksen ajan 8 Anna uutteen asettua muutaman minuutin ajan ja ota n ytett varov asti pipetill n yteputken yl osasta Sentrifugin k ytt ei ole tarpeel lista mutta lyhyt k sittely voidaan suorittaa jos tarvitaan partikkeliva paa liuos 9 Uute joka edustaa ulosten ytteen laimennusta 1 50 paino m r on nyt valmis laimennusta ja testausta varten 10 Siirr noin 0 5 ml uutetta uuteen putkeen s ilytyst varten Uutteita voidaan s ilytt 2 8 C n l mp tilassa ainakin viiden p iv n ajan tai j dytettyn alle 20 C een kahden vuoden ajan 7 2 Plasma ja seerumin ytteet Luotettava kalprotektiinipitoisuuden m ritt minen seerumista tai plas masta edellytt ett neutrofiiliset granulosyytit eiv t vapauta proteiinia vereen in vitro EDTA on suositeltu antikoagulantti plasmalle Suositeltu n ytteenvalmistustapa 1 Ota verin yte k ytt en vacutainer putkia 2 Sentrifugoi veri mahdollisimman pian sentrifugissa kymmenen minu utin ajan nopeudella 3000 r min korkeintaan kolmen tunnin kuluttua n ytteen ottamisesta 3 Ker vain kaksi kolmasosaa ylemm st seerumi tai plasmaker roksesta pipetill varovasti niin ett leukosyytit buffy coat kerrok
15. B 1 0908 C 148 71 D 2 9173 d 0 0048461 r 0 99998 Figure 1 Arepresentative calibration curve using 4 parameter curve fit 200 Concentration ng mL 10 3 Interpretation of the results The following Calprotectin values in stool samples have been reported in 400 the published literature gt 25 Normal value 5 50 mg kg Positive value gt 50 mg kg Median value in patients with symptomatic colorectal 350 mg kg cancers disease Active symptomatic inflammatory bowel 200 40 000 mg kg Note that a diagnosis should not be established based on a single test result Diagnosis should take into consideration clinical history and symp toms The following Calprotectin values were found in blood from 100 healthy blood donors 50 men and 50 women Sample type Mean ug L SD EDTA plasma 627 307 17 11 LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Diagnosis should not be established based on a single test result 12 PERFORMANCE CHARACTERISTICS Note All design verification studies were performed by manual testing on feces extract samples diluted 1 100 or EDTA plasma samples diluted 1 20 using the ELISA procedure described in Section 9 Inter assay and intra assay precision from feces extracts and intra assay precision from EDTA plasma Inter assay precision Intra assay precision Intra assay precision feces extracts feces extracts
16. DSX ELISA automat the Sample Dilution Buffer must be transferred to a 25 mL Dynex reagent tube before running the test 6 3 Washing Buffer Dilute the 20x concentrated Washing Buffer by adding 1 part 50 mL to 19 parts 950 mL distilled deionised water in a clean vessel to a final volume of 1000 mL Mix well Store the diluted Washing Buffer in a closed vessel at 2 8 C 6 4 Fecal Extraction Buffer Dilute the 2 5x concentrated Fecal Extraction Buffer by adding 1 part 90 mL to 1 5 parts 135 mL distilled deionised water in a clean vessel to a final volume of 225 mL Mix well Store the diluted buffer in a closed vessel at 2 8 C 10 6 5 Calibrators blank and controls The vials labelled with blank calibrator as well as the controls contain 1 0 mL each of a ready to use solution The concentration of Calprotectin is printed on the label of each vial The vials fit directly into Dynex DS2 and DSX ELISA automates 6 6 Conjugate Solution The tube contains 13 mL of alkaline phosphatase AP labelled immu noaffinity purified rabbit antibodies against Calprotectin in a buffer with stabilisers preservatives and an inert red dye The solution is ready to use The tube fits directly into Dynex DS2 and DSX ELISA automates 6 7 Substrate Solution The bottle contains 13 mL of p nitrophenylphosphate pNPP solution The solution is ready to use and must be stored in its original opaque bottle Note If using a Dynex DS
17. ELISA Diluer les chantillons d extraits de selles au 1 100e par ex 10 ul chantillon 990 ul de tampon de dilution d 6chantillon et bien m langer au vortex Ajouter 100 ul de chaque t moin calibrateur contr le et chantillon dilu dans deux puits consulter le plan de plaque recommand au point 8 Couvrir la plaque avec une feuille de scellement et laisser incuber temp rature ambiante pendant 40 5 min sur un vibreur agitateur horizontal de plaques environ 500 700 tr min la fin du temps d incubation retirer le liquide et laver les puits en ajoutant 300 ul de tampon de lavage chaque puits liminer le plus de liquide possible et r p ter l op ration jusqu effectuer un total de trois lavages Si l on utilise un laveur de plaques v rifier que toutes les buses d aspiration et de remplissage sont bien d bouch es afin de garantir un lavage efficace de tous les puits Apr s le lavage final retourner la plaque et tapoter nergiquement les ouvertures des puits sur un papier absorbant pour liminer toute trace de tampon de lav age M langer doucement le contenu du flacon de conjugu avant son uti 71 lisation ne pas agiter Ajouter 100 ul de conjugu dans chaque puits pr f rablement l aide d une pipette r p tition ou multi canaux 6 Couvrir la plaque avec une feuille de scellement et laisser incuber a temp rature ambiante pendant 40 5 min sur un vibreur agitateur hori
18. O n yteliuoksista kalibraattoreista kontrolleista ja potilasn ytteist tulee aina testata my s kaksoiskap paleet Kaikki n ytteet ja pakkauksen reagenssit tulee saattaa huoneen l mp n 18 25 C ennen testin aloittamista 2 ELISA menetelm Laimenna ulosteuuten ytteet suhteeseen 1 100 esim 10 uL n ytett 990 pL n ytteen laimennuspuskuria ja sekoita hyvin Vortex sekoit timessa Lis 100 uL kutakin O n yteliuosta kalibraattoria kontrollia ja laimen nettua n ytett kuoppalevyn kaksoiskappaleeseen Katso suositeltu levyn j rjestys kohdasta 8 Peit levy sulkijakalvolla ja inkuboi huoneenl mm ss 40 5 min vaakatasoisessa levyn ravistimessa nopeudella noin 500 700 r min Poista neste inkubointiajan lopussa ja pese kuoppalevyn kuopat lis m ll 300 uL pesupuskuria jokaiseen kuoppaan Poista mahdol lisimman suuri osa nesteest ja toista pesu viel kaksi kertaa Jos k yt ss on levynpesin tarkista ett kaikki imu ja t ytt anturit ovat auki jotta kuopat puhdistuvat kunnolla K nn viimeisen pesun j l keen levy nurin ja taputtele kuoppia huolellisesti imukykyisell pyyh keell poistaaksesi pesupuskurin j m t Sekoita konjugaattipullon sis lt hell varaisesti ennen k ytt l ravista Lis 100 HL konjugaattiliuosta jokaiseen kuoppaan k yt t m ll mielell n toistopipetti tai monikanavaista pipetti Peit levy sinet intikalvolla ja inkuboi huo
19. Store the substrate solution in the original opaque bottle the solution should be clear to pale yellow Mix gently before use The BIOHIT Calprotectin ELISA is designed for use by qualified per sonnel who are trained in good laboratory practice 13 1 Disposal Considerations Residues of chemicals and preparations are generally considered as haz ardous waste The disposal of this kind of waste is regulated through na tional and regional laws and regulations Contact your local authorities or waste management companies which will give advice on how to dispose of hazardous waste 14 WARRANTY Biohit shall remedy all defects discovered in any Product the Defec tive Product that result from unsuitable materials or negligent workman ship and which prevent the mechanical functioning or intended use of the Products including but not limited to the functions specified in Biohit s specifications for the Products ANY WARRANTLY WILL HOWEVER BE DEEMED AS VOID IF FAULT IS FOUND TO HAVE BEEN CAUSED BY MALTREATMENT MISUSE ACCIDENTAL DAMAGE INCORRECT STORAGE OR USE OF THE PRODUCTS FOR OPERATIONS OUT SIDE THEIR SPECIFIED LIMITATIONS OR OUTSIDE THEIR SPECI FICATIONS CONTRARY TO THE INSTRUCITONS GIVEN IN THE INSTRUCTION MANUAL The period of this warranty is defined in the instruction manual of the Products and will commence form the date the relevant Product is shipped by Biohit This Biohit Diagnostic kit has been manufactured accordi
20. a 405 nm com um leitor ELI SA Agitar brevemente a placa 2 3 segundos antes da leitura caso o leitor de placas tenha esta op o Opcional Per odo de incuba o reduzido procedimento manual O per odo de incuba o pode ser reduzido para 30 5 minutos sem altera o dos resultados Pode ser observada uma redu o dos valores da DO e o valor m ximo da DO para a solu o 111 padr o superior 500 ng mL pode ficar abaixo do valor recomendado de 1800 mas tal nao afeta os resultados 10 RESULTADOS 10 1 Valores de controlo de qualidade Deve ser inclu da uma nova curva padr o em cada execu o Os controlos positivos devem ser inclu dos em cada execu o O valor dos controlos deve estar dentro dos limites impressos nos r tulos dos frascos Como ponto de refer ncia o valor de DO do Calibrador 5 500 ng mL deve ser gt 1 6 e o valor de DO da Solu o em branco 0 ng mL deve ser lt 0 25 Na figura 1 apresentada uma curva representativa do Calibrador 10 2 C lculo dos resultados C lculo da concentra o de Calprotectina em amostras de fezes dos doentes 1 Calcular os valores m dios de DO de todos os po os duplicados solu o em branco calibradores e amostras 2 Representar graficamente o valor da solu o em branco e de cada calibrador e concentra o ng mL no eixo x contra o seu valor m dio de DO no eixo y para obter uma curva padr o Recomenda se a utiliza o de uma fun
21. aproximadamente 500 700 rpm 4 Ap s o per odo de incuba o remover o l quido e lavar os po os atrav s da adi o de 300 uL de Tamp o de lavagem a cada po o Re mover o m ximo de l quido poss vel e repetir at alcan ar um total de tr s lavagens Em caso de utiliza o de um lavador de placas verifi car se todas as sondas de aspira o e enchimento est o desobstrui das para garantir a lavagem eficaz de todos os po os Ap s a ltima lavagem inverter a placa e passar papel absorvente pelas aberturas dos po os para remover quaisquer vest gios de Tamp o de lavagem 5 Misturar cuidadosamente o conte do do frasco do Conjugado an tes da utiliza o n o agitar Adicionar 100 uL de conjugado a cada po o de prefer ncia com uma pipeta repetitiva ou multicanal 6 Cobrir a placa com pel cula vedante e incubar temperatura am biente durante 40 5 minutos num agitador de placas horizontal aproximadamente 500 700 rpm 7 Repetir tr s vezes os passos de lavagem descritos acima com 300 uL de Solu o de lavagem por po o 8 Adicionar 100 uL de Solu o do substrato a cada po o de prefer n cia com uma pipeta repetitiva ou multicanal 9 Incubar a placa temperatura ambiente sem agitar durante 20 30 minutos protegido da luz 10 Opcional adicionar 100 uL de solu o de paragem 1M NaOH a cada po o caso seja necess rio um per odo de incuba o fixo 11 Ler os valores da densidade tica DO
22. de quatro dias Quando colocada num recipiente aprovado para transporte a amostra pode ser enviada por correio normal sem ser necess ria refrigera o Deve ser evitada a exposi o a temperaturas superiores a 30 C As amostras tamb m podem ser armazenadas congeladas a uma tem peratura igual ou inferior a 20 C at serem entregues ou enviadas por correio As amostras congeladas devem ser descongeladas e estabiliza das temperatura ambiente antes da extra o e do teste Tenha em at en o que a congela o de amostras de fezes pode provocar em alguns casos um aumento dos n veis de Calprotectina muito provavelmente devido liberta o dos granul citos Nota antes da extra o da pequena quantidade necess ria a amostra de fezes deve ser bem homogeneizada com uma esp tula por exemplo Para a extra o recomendamos a utiliza o dos tubos de extra o BIO HIT ou do outro m todo descrito abaixo cap tulo 7 1 1 e 7 1 2 Realizar a extra o de acordo com o folheto informativo do dispositivo m todo de extra o escolhido Podem ser utilizados outros m todos e dispositivos 107 validados pelo cliente 7 1 1 Extra o com os tubos de extra o BIOHIT Instru es de utiliza o leia o folheto informativo do produto com a Ref 602 270 7 1 2 Extra o atrav s do m todo de pesagem sem dispositivo de extra o 1 2 10 Pesar avaliar a tara de um tubo com tampa de rosca vaz
23. de tres lavados Si se usa un limpiador de placas comprobar no haya ninguna sonda de aspirado y llenado bloqueada para garantizar el correcto lavado de todos los pocillos Tras el lavado final invertir la placa y golpear con fuerza la aberturas de los pocillos sobre papel absorbente para eliminar cualquier resto de amortiguador para lavado Mezclar el contenido del vial de conjugado suavemente antes de us arlo sin agitarlo A adir 100 ul de conjugado a cada pocillo preferi blemente con una pipeta repetidora o multicanal Tapar la placa con una l mina de sellado e incubar a temperatura ambiente durante 40 5 minutos en un agitador de placas horizontal aproximadamente a 500 700 rpm Repetir los pasos de lavado arriba descritos tres veces con 300 ul de soluci n de lavado por pocillo A adir 100 ul de soluci n de sustrato a cada pocillo preferiblemente con una pipeta repetidora o multicanal Incubar la placa a temperatura ambiente sin agitar durante 20 30 minutos protegida de la luz 10 Optativo A adir 100 ul de soluci n de frenado 1M NaOH a cada pocil lo si se necesita un periodo de incubaci n fijo 11 Leer los valores de densidad ptica DO a 405 nm usando un lector de ELISA Si el lector de placas tiene esta opci n agitar brevemente la placa 2 3 segundos antes de la lectura Optativo Tiempo de incubaci n reducido procedimiento manual El tiempo de incu baci n puede reducirse a 30 5 minutos sin q
24. den p f ljande 1 100 sp dningen av extrakten och om vandlar v rdet fr n ng ml till mg kg Exempel Om ett sp tt extraktprov har ett v rde p 100 ng ml var koncen trationen i det ursprungliga avf ringsprovet 100 x 5 500 mg kg Obs Om extrakt har sp tts mer eller mindre n det rekommenderade 1 100 m ste den ytterligare sp dningsfaktorn tas med i ber kningen 200 300 400 soo Concentration ng mL 0 Calprotectin std A 0 086151 B 1 0908 C 146 71 D 2 9173 d 0 0048461 r 0 99958 53 Bild 1 En representativ kalibratorkurva med 4 parameters kurvanpassn ing 10 3 Resultattolkning F ljande kalprotektinv rden har rapporterats i publicerad litteratur 3 25 Normalv rde 5 50 mg kg Positivt v rde gt 50 mg kg Medelv rde hos patienter med symtomatiska kolorektala 350 mg kg cancerformer Aktiv symtomatisk inflammatorisk tarmsjukdom 200 40 000 mg kg Observera att diagnos inte ska st llas baserat p ett enskilt testresultat diagnosen m ste ven klinisk anamnes och symtom beaktas F ljande kalprotektinv rden p tr ffades i blod fr n 100 friska blodgivare 50 m n och 50 kvinnor Provtyp Medel ug l SD EDTA plasma 627 307 11 F RFARANDETS BEGR NSNINGAR Diagnos ska inte st llas baserat p ett enskilt testresultat 12 KLINISKA PRESTANDA Obs Alla utformningsverifierande studier utf rdes genom manuella test p prover av f
25. des anticorps anti VIH des anticorps anti HCV et un antig ne de l h patite B Bag Les r sultats obtenus montrent qu ils ne sont pas r actifs Quoi qu il en soit tout le mat riel doit tre consid r et manipul comme tant potentiellement infec tieux Ne pas changer des r actifs ou des bandes appartenant des lots de production diff rents Ne pas utiliser de r actifs d autres fabricants avec des r actifs de ce kit de test Ne pas utiliser les r actifs apr s la date d expiration indiqu e sur l tiquette ou 1 mois apr s avoir pr par les solutions de travail partir des r actifs concentr s N utiliser que des embouts de pipette distributeurs et mat riel de labo ratoire propres Pour viter toute contamination crois e ne pas interchanger les bou chons vissants des flacons de r actifs Bien refermer les flacons de r actifs imm diatement apr s l usage pour viter toute vaporation et contamination microbienne Apr s l ouverture et le stockage v rifier l absence de contamination microbienne dans les flacons de conjugu calibrateurs et contr les avant de les r utiliser 77 Pour viter toute contamination crois e et des r sultats faussement lev s pipetter lescalibrateurs contr les et chantillons d extraits de selles et distribuer le conjugu et substrat avec pr cision dans le fond des puits des plaques microtitres sans clabousser e Certains r actifs contiennent de l azo
26. elevado grau de probabilidade Arecupera o da mucosa o grande objetivo do tratamento das DII e um teste de Calprotectina fecal permite saber quando tal conseguido Mui tos doentes que sofrem de DII em remiss o cl nica com n veis normais da prote na C reativa PCR apresentam ainda uma inflama o persistente 0 o que se reflete num aumento da Calprotectina fecal Estes doentes apresentam um maior risco de reca da no espa o de alguns meses M Se for poss vel conseguir a recupera o da mucosa o risco de reca da ser reduzido bem como a necessidade de uma grande cirurgia abdomi nal 12 13 A normaliza o dos n veis de Calprotectina significa que foi conseguida a recupera o da mucosa 14 A nossa tecnologia Calprotec tin ELISA foi tamb m utilizada na an lise de amostras de soro e plasma e foram detetados n veis elevados de Calprotectina nos doentes com infe es bacterianas 15 16 sepsia e doen as inflamat rias como artrite reumatoide AR e L pus Eritematoso Disseminado LED 17 21 Estudos cient ficos mostram que a presen a de Calprotectina no soro plasma um excelente indicador de atividade da doen a na AR e no LED e pode prever crises igualmente um bom indicador de eventos coron rios agudos que antecedem o enfarte do mioc rdio 22 20 3 PRINCIPIO DO TESTE O teste BIOHIT Calprotectin ELISA baseia se na preparac o de um extrato de fezes com o Tamp o de extrac o de fezes O nivel de Calpro
27. for the chosen extraction device method Other methods and devices validated by the customer can be used 7 1 1 Extraction using the BIOHIT Extraction tubes Instructions for use please read package insert for product Ref 602 270 7 1 2 Extraction using the weighing method without extraction device 1 Weigh tare an empty screw cap tube with an inoculation loop 2 Take out approx 100 mg between 40 and 120 mg feces by means of the inoculation loop and place it into the screw cap tube Avoid taking out solid undigested material like fibres and seeds 3 Weigh tube and loop with feces which will give the net feces weight 4 Break or cut off the top half of the loop handle and leave the bottom part inside the tube 5 Add extraction buffer to a weight volume ratio 1 50 for instance 4 9 mL buffer to 100 mg feces Close the tube 6 Mix vigorously for 30 seconds by means of a vortex mixer 7 Continue the mixing on a shaker at approx 1000 rpm for 30 5 min utes with the loop inside the tube as an agitator 8 Allow a couple of minutes on the bench for particles to settle and pi pette carefully from the top of the tube No centrifugation is necessary but a short centrifugation can be performed if a particle free solution is required 9 The extract which represents a 1 50 dilution weight volume of the stool sample is now ready for dilution and testing 10 For storage transfer about 0 5 mL to a new tube Extracts ca
28. heces con lo que se obtendr el peso neto de las heces Romper o cortar la mitad superior del asa bacteriol gica y dejar la parte inferior dentro del tubo Afiadir amortiguador para extracci n en una proporci n peso volu men de 1 50 por ejemplo 4 9 ml de amortiguador a 100 mg de heces Cerrar el tubo Mezclar vigorosamente durante 30 segundos mediante un agitador v rtex Seguir mezclando en un agitador a aproximadamente 1000 rpm du rante 30 5 minutos con el asa dentro del tubo a modo de agitador Dejar un par de minutos sobre el mostrador para que las part culas se asienten y pipetear con cuidado desde la parte superior del tubo No es necesario centrifugar aunque se puede llevar a cabo un breve centrifugado si se necesita una soluci n sin part culas El extracto que representa una diluci n 1 50 peso volumen de la muestra de heces ya est lista para la diluci n y el an lisis Para el almacenamiento transferir aproximadamente 0 5 ml a un nuevo tubo Los extractos pueden almacenarse a 2 8 C durante un m ximo de cinco d as o congelarse por debajo de 20 C durante un m ximo de 2 a os 7 2 Muestras de plasma y suero Para obtener unos niveles precisos de calprotectina en suero o plasma es necesario que no se libere la prote na desde los neutr filos de la san gre in vitro En el caso del plasma el anticoagulante de preferencia es EDTA Procedimiento recomendado para la preparaci n de muestras Extraer la
29. inertti punaista v riainetta Liuos on k ytt valmista Putki on yhteensopiva Dynex DS2 ja DSX ELISA au tomaattien kanssa 6 7 Substraattiliuos Pullo sis lt 13 ml p nitrofenyylifosfaattiliuosta PNPP Liuos on kayt t valmista ja se tulee s ilytt alkuper isess l pin kym tt m ss pul lossaan Huomautus Jos k yt t Dynex DS2 tai DSX ELISA automaattia en tsyymisubstraattiliuosta tulee siirt 25 ml n Dynex reagenssiputkeen en nen testin suorittamista V lt stabilisaattori pellettien siirt mist 7 N YTTEEN OTTAMINEN JA VALMISTELEMINEN BIOHIT kalprotektiini ELISA testi on kehitetty ja hyv ksytty p asiassa ulosten ytteiden tutkimiseen mutta sit voi k ytt my s plasma seeru min ytteisiin 7 1 Ulosten ytteet Koska kalprotektiini s ilyy hyvin ulosteessa potilaat voivat ottaa pienen n ytteen kotioloissa Ota 1 5 gramman noin yksi teelusikallinen n yte 29 laita se sopivaan puhtaaseen astiaan ja toimita se mahdollisimman pian viimeistaan seuraavan neljan paivan aikana laboratorioon Jos nayte laitetaan hyv ksyttyyn kuljetuspakkaukseen n yte voidaan l hett tavallisena postina kylm kuljetusta ei tarvita Altistamista yli 30 C n l mp tiloille tulee v ltt N ytteet voi s ilytt my s pakastettuina 20 C ssa tai alhaisemmassa l mp tilassa kunnes ne toimitetaan tai postitetaan Pakastetut n yt teet tulee sulattaa ja tasapainottaa huoneenl mp
30. keltainen korkki Pullo sis lt stabiloivia pellettej Huomautus Jos k yt t Dynex automaattia substraattiliuos tulee siirt 25 ml n Dynex reagenssiputkeen ennen testin suorittamista Sisaltaa 0 1 Kathonia Sis lt lt 0 1 natriumatsidia Sis lt 0 1 Kathonia ja lt 0 1 natriumatsidia Sis lt 0 02 metyyli isotiatsolonia ja 0 02 bromonitrodioksaania ie pores 4 2 Pakkaukseen sis ltyv t materiaalit 2 sulkemiskalvoa 1 testin suoritusohje e 1 levyn malli 4 3 Tarvittavat materiaalit jotka eivat sis lly toimitukseen Tislattu deionisoitu vesi Uuttamisv lineet katso kohta 7 1 1 ja 7 1 2 e Kertak ytt iset murrettavat inokulaatiosilmukat jos k ytet n koh dassa 7 1 2 mainittua punnitusmenetelm e Herkk digitaalivaaka 40 150 mg jos k ytet n kohdassa 7 1 2 mainittua punnitusmenetelm Kertak ytt iset kierrekorkilla varustetut polystyreeniset n yteputket 5 ml jos k ytet n kohdassa 7 1 2 mainittua punnitusmenetelm Vortex sekoitin Kertak ytt iset putket n ytteiden laimentamiseen Eppendorf putket tai samankaltaiset jos analyysi tehd n manuaalisesti Pipettej joiden tilavuus on 10 1000 ul jos analyysi tehd n manu aalisesti Pipetti tai monikanavainen pipetti 1000 ul jos analyysi tehd n manu aalisesti Mikrotiitterilevyjen pesuri tai monikanavainen pipetti 300 ul jos ana lyysi tehd n manuaalisesti Levyn
31. leurs contenus y compris des substances antimi crobiennes comme la calprotectine Cette prot ine constitue environ 60 de toutes les prot ines pr sentes dans le cytoplasme des PNN 2 et sa quantit peut tre estim e de fa on fiable dans des chantillons de selles stock s pendant un maximum de sept jours temp rature ambiante 3 Plusieurs types de maladie comme les infections bact riennes l arthrite rhumatismale et le cancer d clenchent l activation des PNN et aug mentent les niveaux de calprotectine dans le plasma le liquide c r bro spinal le liquide synovial le liquide cr viculaire et l urine entre autres mat riels humains 4 La concentration de calprotectine dans les selles est corr l e au nombre de PNN qui migrent dans la lumi re du tube digestif 9 et peut tre d tec t e de fa on fiable m me dans des chantillons de faibles dimensions moins d un gramme de selles pr lev s de fa on al atoire 38 Les mala dies organiques de l intestin se traduisent par d importantes quantit s de calprotectine les augmentations sont g n ralement de cinq plusieurs milliers de fois sup rieures la valeur de r f rence des individus sains 3 79 ce qui indique une inflammation intestinale Les maladies inflam matoires chroniques intestinales MICI comme la rectocolite h mor ragique et la maladie de Crohn peuvent appara tre d s la plus tendre enfance jusqu l ge adulte le plus avanc Leur diagn
32. ml med en 4 parameters kurvanpassning mg kg i feces ng ml x 5 kan f rkortas till 30 5 min om analysen k rs manuellt Om du har fragor kontakta info biohit fi 59 FRAN AIS MANUEL D INSTRUCTION BIOHIT Calprotectin ELISA kit Cat No 602 260 APPLICATION accord de aan annee ANT C DENTS PRINCIPE DU TEST once MATERIEL cocoa ccoo lic iia at 4 1 R actifs fournis avec le kit 4 2 Mat riel fourni avec le kit 4 3 Mat riel n cessaire non fourni 64 STABILIT ET STOCKAGE 6 PR PARATION DES R ACTIFS 6 1 Bandes de plaques microtitres coat es 66 6 2 Tampon de dilution d chantillon x 6 3 Tampon IS lA cicatrices 6 4 Tampon d extraction de selles 6 5 Calibrateurs t moins et contr les 6 6 Sol tion de CONUQU rentes nas 6 7 SOIUMOM SUBSE siian aitis rear Caine van antes A VIKAA ind an N vaa KUALA NASA Taa sages 7 PR L VEMENT ET PREPARATION DES CHANTILLONS 7 1 chantillons de Selles 2 44 7 1 1 Extraction l aide de tubes BIOHIT osuuusssn seen eneeen 7 1 2 Extraction l aide de la m thode de pes e 5 7 2 chantillons de plasma et S rum smsmmsssssrsssssssresrrssrnssn ara nana n nan 8 PLAN DE PLAQUE SUGG R 9 PROCEDURE DE TEST s 9 1 Remarques concernant la proc dure
33. neutr filos polimorfonucleares NPM en la luz intestinal durante la inflamaci n de la mucosa intestinal Los microorganismos del intestino estimulan la mi graci n de los leucocitos a la luz intestinal donde liberan su contenido que incluye sustancias antimicrobianas como la calprotectina Esta pro teina constituye alrededor del 60 del total de prote nas que hay en el citoplasma de los NPM2 y puede estimarse de manera fiable en muestras fecales almacenadas hasta siete dias a temperatura ambiente Distintos tipos de enfermedad como las infecciones bacterianas la ar tritis reumatoide y el cancer conllevan la activaci n de los NPM y el au mento de los niveles de calprotectina en plasma l quido cefalorraquideo l quido sinovial l quido crevicular orina u otras sustancias del cuerpo humano Existe una relaci n entre la concentraci n de calprotectina en las heces y el n mero de NPM que migran a la luz intestinal dicha concentraci n pu ede detectarse de forma fiable incluso en muestras fecales aleatorias de peque o tama o inferiores a un gramo Las enfermedades org nicas del intestino arrojan una fuerte se al de calprotectina los aumentos en general superan el nivel de referencia m ximo de los individuos sanos entre cinco y varios miles de veces lo que indica la existencia de inflamaci n intestinal Las enteropat as inflamatorias El como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn pueden aparec
34. ng mL Caiprotectin std A 0 086151 B 1 0908 C 146 71 D 2 9173 d 0 0048461 r 0 99998 Kuva 1 Tyypillinen kalibraatiokayra k yt ss 4P k yr n sovitus 35 10 3 Tulosten tulkinta Kirjallisuudessa on raportoitu seuraavat kalprotektiinin arvot ulostenayt teiss 29 Normaali arvo 5 50 mg kg Positiivinen arvo gt 50 mg kg Mediaaniarvo symptomaattista kolorektaalisy p sai 350 mg kg rastavilla potilailla Aktiivinen oireinen tulehduksellinen suolistosairaus 200 40 000 mg kg Huomaa etta diagnoosia ei tule tehda yksittaisen testituloksen perus teella Diagnoosissa tulee ottaa huomioon potilaan kliininen taudinkuva ja oireet Seuraavat kalprotektiinin arvot on todettu 100 terveen luovuttajan 50 mi esta ja 50 naista veresta N ytetyyppi Keskiarvo ug L Keskihajonta EDTA plasma 627 307 11 TOIMENPITEEN RAJOITUKSET N ytteen toistuva pakastaminen ja sulattaminen saattaa vaikuttaa testitu losten tarkkuuteen Lopullista diagnoosia ei tule tehd yksitt isen testituloksen perusteella 12 TESTIN SUORITUSARVOT Huomautus Kaikki testin varmennustutkimukset suoritettiin uloste uuten ytteiden laimennus 1 100 tai EDTA plasman ytteiden laimennus 1 20 manuaalisella testauksella kohdassa 9 kuvatun ELISA menetelm n mukaisesti 36 Testien v linen ja testien sis inen toistettavuus ulosten ytteist ja testien sisdinen toistettavuus EDTA plasma
35. ng ml ber knad som medelv rde provspadningsbuffert n 32 5x SD 55 Interferens Ingen observerad interferens pa ELISA fran vanligt forekommande l ke medel Prednisolon Imurel Salazopyrin och Ciprofloxacin Extraktionsprecision Tva fecesprover extraherades tio ganger vardera enligt det forfarande som beskrivs i avsnitt 7 1 2 och extrakten analyserades i ELISA Medel resultat fran tre olika laboratorier och ett kitparti Prov Koncentration mg kg CV Lag 130 8 7 H g 1357 8 8 Linearitet fekalextrakt Fekalextrakt n 10 sp ddes 1 100 1 1000 och analyserades i ELISA Medelresultat Sp dning av 1 100 sp dning 1 100 100 1 400 103 1 700 105 1 1000 107 Observera att provvariationen i linearitet har beaktats Linearitet EDTA plasma Plasmaprover n 5 sp ddes 1 20 1 80 och analyserades i ELISA Me delresultat Sp dning av 1 20 sp dning 1 20 100 1 40 107 1 80 116 13 VARNINGAR OCH FORSIKTIGHETSATGARDER enlighet med artikel 1 stycke 2b i Europaparlamentets och R dets direktiv 98 79 EG r anv ndningen av medicintekniska produkter f r in vitro diagnostik av tillverkaren avsedd att s kerst lla produktens l mp 56 lighet prestanda och s kerhet Testf rfarandet informationen samt de varningar och f rsiktighets tg rder som anges i bruksanvisningen maste d rf r f ljas noga Anv ndning av testkit med analy
36. ng ml de acuerdo con sus va lores de DO 4 Multiplicar la concentraci n de calprotectina ng ml en los ex tractos fecales diluidos por 5 para convertir a mg kg de calpro tectina en la muestra de heces original Este factor efect a la correcci n para la diluci n total de 1 5000 1 50 durante el procedimiento de extracci n y la posterior diluci n a 1 100 de los extractos y convierte el valor de ng ml a mg kg Ejemplo si una muestra de extracto diluido tiene un valor de 100 ng ml la concentraci n en la muestra fecal original era de 100 x 5 500 mg kg Nota Si los extractos se han diluido en una relaci n mayor o menor al 92 1 100 recomendado el factor de diluci n adicional deber introducirse en el c lculo 3 25 OD 405 nm os 0 100 200 300 Concentration ng mL 4 Caiprotectin std A 0 086151 B 1 0908 Ca 145 71 D 2 9173 d 20 048461 r 0 99998 400 500 Figura 1 Una curva de patron representativa usando un ajuste de curva de 4 parametros 10 3 Interpretaci n de los resultados En diversas publicaciones se han se alado los siguientes valores de cal protectina en muestras fecales sintom ticos Valor normal 5 50 mg kg Valor positivo gt 50 mg kg Valor mediano en pacientes con c nceres colorrectales 350 mg kg Enteropatia inflamatoria activa sintom tica 200 40 000 mg kg T ngase en cuenta que no se debe establecer un diagn stico
37. ont t ajout s cing niveaux diff rents de calprotectine purifi e Plasma 81 105 test avec du plasma auquel ont t ajout s cing niveaux diff rents de calprotectine purifi e Limite de quantification 5 ng ml test avec des extraits de selles du plasma et de la calprotectine purifi e Les chantillons ont t analys s cinq fois sur cing jours Le C V moyen des diff rents chantillons et d terminations a ce niveau tait de 12 75 Limite de d tection lt 5 ng ml calcul comme une moyenne tampon de dilution d chantillon n 32 5 x cart type Interf rence Aucune interf rence n a t observ e entre ELISA et les m dicaments habituellement utilis s prednisolone Imurel salazopyrine et ciprofloxa cine Pr cision de extraction Deux chantillons de selles ont t extraits 10 fois chacun en utilisant la proc dure d crite au point 7 1 2 et les extraits ont t analys s ELISA R sultats moyens de trois laboratoires diff rents sur un lot de kit Echantillon Concentration mg kg C V Faible 130 8 7 Fort 1357 8 8 Lin arit extraits de selles Des extraits de selles n 10 ont t dilu s au 1 100e 1 1 000e puis analys s au test ELISA R sultats moyens Dilution de dilution au 1 100e 1 100 100 1 400 103 1 700 105 1 1000 107 Une variation de la lin arit des chantillons a t observ
38. para obtener un volumen final de 100 ml Mezclar bien Almacenar el amortiguador para la diluci n de muestras diluido en un recipiente cerrado a 2 8 C Nota Si se usa un instrumento autom tico Dynex DS2 o DSX ELISA el amortiguador para la diluci n de muestras debe transferirse a un tubo de reactivo Dynex de 25 ml antes de realizar el an lisis 6 3 Amortiguador para lavado Diluir el amortiguador para lavado concentrado a 20x afiadiendo 1 parte 50 ml a 19 partes 950 ml de agua destilada desionizada en un re cipiente limpio para obtener un volumen final de 1000 ml Mezclar bien Almacenar el amortiguador para lavado diluido en un recipiente cerrado a 2 8 C 6 4 Amortiguador para extraccion fecal Diluir el amortiguador para extracci n fecal concentrado a 2 5x afiadi endo 1 parte 90 ml a 1 5 partes 135 ml de agua destilada desionizada en un recipiente limpio para obtener un volumen final de 225 ml Mezclar bien Almacenar el amortiguador diluido en un recipiente cerrado a 2 8 C 6 5 Calibradores blanco y controles Los viales marcados como blanco calibrador y controles contienen cada uno 1 0 ml de una soluci n lista para usar La concentraci n de calpro tectina viene impresa en la etiqueta de cada vial Los viales encajan di rectamente en los instrumentos automaticos Dynex DS2 y DSX ELISA 6 6 Soluci n conjugada El tubo contiene 13 ml anticuerpos de conejo contra la calprotectina mar cados con fosfatasa alcal
39. partiendo del resultado de un solo an lisis El diagn stico debe tomar en consid eraci n los antecedentes clinicos y los sintomas Se han detectado los siguientes niveles de calprotectina en sangre de 100 donantes de sangre sanos 50 hombres y 50 mujeres 93 Tipo de muestra Media ug L DE Plasma con EDTA 627 307 11 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO No se debe establecer un diagn stico partiendo del resultado de un solo an lisis 12 CARACTER STICAS DE LOS RESULTADOS Nota Todos los estudios de verificaci n del dise o se llevaron a cabo mediante an lisis manual de muestras de extractos fecales diluidas a 1 100 o muestras de plasma con EDTA diluidas a 1 20 siguiendo el procedimiento de ELISA que se describe en la secci n 9 Precisi n entre an lisis y dentro del mismo an lisis de los extractos fecales y precisi n dentro del mismo an lisis del plasma con EDTA Precisi n entre an lisis Precisi n dentro del Precisi n dentro del extractos fecales mismo an lisis mismo an lisis plasma extractos fecales con EDTA Concen CV Concen CV Concen CV traci n traci n traci n en en heces en heces plasma mg kg mg kg ug l 32 1 13 28 7 6 7 166 3 8 171 6 0 173 3 6 740 4 7 368 4 8 385 4 1 1160 2 9 583 6 1 592 4 0 1360 3 5 1215 6 8 1210 4 2 2980 3 2 1977 7 9 1966 5 0 3660 10 Resultados medios de tres laboratorios distintos cad
40. ra f rh jda kalprotektinv rden sannolikt p grund av fris ttning fr n granulocyter 48 Obs Innan extraktionen p b rjas ska avf ringsprovet blandas v l med t ex en spatel innan en mindre m ngd tas ut f r extraktion F r extraktionen rekommenderar vi BIOHIT extraktionsr r eller den andra metod som beskrivs nedan avsnitt 7 1 1 och 7 1 2 Utf r extraktionen en ligt bipacksedeln som medf ljer den valda extraktionsenheten metoden Andra metoder och enheter som validerats av kunden kan anv ndas 7 1 1 Extraktion med BIOHIT extraktionsr r Bruksanvisning se bipacksedeln f r produktref 602 270 7 1 2 Extraktion med v gningsmetoden utan extraktionsenhet 1 V g tara ett tomt skruvlocksr r med en ymp gla 2 Tautcirka 100 mg mellan 40 och 120 mg feces med ymp glan och placera det i skruvlocksr ret Undvik att ta med fast ospj lkat material som fibrer och fr n 3 V gr ret och glan med feces f r att ber kna nettovikten f r feces 4 Bryt eller sk r av den vre halvan av ymp glans skaft och l mna den nedre halvan inuti r ret 5 Tills tt extraktionsbuffert till f rh llandet vikt volym 1 50 t ex 4 9 ml buffert till 100 mg feces S tt p korken p r ret 6 Blanda kraftigt i 30 sekunder med en vortexblandare 7 Forts tt att blanda pa en skak cirka 1 000 r min i 30 5 minuter med glan inuti r ret som agitator 8 Lat r ret st ett par minuter p b nken s att partiklar
41. ravistelija 500 700 r min jos analyysi tehd n manuaalisesti 27 e Ajastin jos analyysi tehd n manuaalisesti Kuoppalevyn lukija suodatin 405 nm jos analyysi tehd n manuaal isesti 1 M NaOH pys ytysliuos valinnainen 5 S ILYVYYS JA S ILYTYS S ilytett ess avaamattomina 2 8 C ssa pakkauksen reagenssit pysy v t stabiileina etikettiin merkittyyn viimeiseen k ytt p iv n asti Levyt reagenssit ja konsentroidut puskuriliuokset s ilyv t avattuina kol me kuukautta s ilytettyn 2 8 C ssa Pesupuskuriliuoskonsentraatin laimennuspuskurikonsentraatin ja ulos ten ytepuskurikonsentraatin ty liuokset 1x s ilyv t kuukauden ajan s i lytettyn 2 8 C ssa kun ne valmistetaan puhtaisiin astioihin V lt altistamista korkeille l mp tiloille ja suoralle auringonvalolle 6 REAGENSSIEN VALMISTAMINEN Kaikki reagenssit n ytteet ja kontrollit tulee tasapainottaa huoneen l mp n 18 25 C ennen testin aloittamista 6 1 P llystetyn kuoppalevyn liuskat K ytt valmiit liuskat on p llystetty affiniteetti puhdistetulla monok laanisella hiiren kalprotektiinivasta aineella K ytt m tt m t liuskat tu lee poistaa kehyksest ja sulkea heti alumiinifoliopussiin kuivausaineen kanssa S ilytys 2 8 C n l mp tilassa 6 2 N ytteen laimennuspuskuri Laimenna 5x n ytteen laimennuspuskurikonsentraatti lis m ll yksi osa 20 ml nelj n osaan 80 ml tislattua deionisoitua vett
42. rdet f r toppstandarden 500 ng m kan sjunka under det rekommenderade 1 800 men detta p verkar inte resultaten 10 RESULTAT 10 1 Kvalitetskontrollv rden En ny standardkurva m ste inkluderas i varje k rning Positiva kontroller b r inkluderas i varje k rning Kontrollernas v rden ska ligga inom de gr nser som r tryckta p flasketiketterna Som riktlinje b r OD v rdet f r Kalibrator 5 500 ng ml vara gt 1 6 och OD v rdet f r Blank 0 ng ml b r vara lt 0 25 En representativ kalibra torkurva visas nedan i bild 1 10 2 Resultatber kning Ber kning av kalprotektinkoncentrationen i fecesprover fr n patient 1 Ber kna OD medelv rdet f r alla duplikatbrunnar blanka kalibratorer 52 och prover 2 Plotta vardet for blank och varje kalibrator och koncentration ng ml pa x axeln mot dess OD medelv rde pa y axeln f r att fa en standard kurva En kurvanpassningsfunktion med fyra parametrar rekom menderas se bild 1 nedan Om en logaritmisk x axel kravs maste ett varde pa 0 001 ng ml anvandas f r standard A 0 ng ml 3 Bestam med hjalp av kalibreringskurvan kalprotektinkoncentrationen i de spadda proverna ng ml baserat pa deras OD varden 4 Multiplicera kalprotektinkoncentrationen ng ml i de sp dda fecesextrakten med 5 f r att omvandla till mg kg kalprotektin i det ursprungliga avf ringsprovet Denna faktor korrigerar f r den totala sp dningen p 1 5000 1 50 under extraktionen och
43. sammanlagt tre tv ttar har 51 utforts Om en plattvatt anvands kontrollera att aspirations och pa fyllningsslangarna inte r tillt ppta f r att s kerst lla effektiv tv tt av alla brunnar V nd efter sista tv tten plattan upp och ned och knacka brunns ppningarna ordentligt mot ett absorberande papper f r att av l gsna eventuell kvarvarande buffert 5 Blanda varsamt inneh llet i konjugatflaskan innan det anv nds skaka inte Tills tt 100 ul konjugat i varje brunn helst med en repeter eller flerkanalspipett 6 T ck plattan med f rslutningsfolie och inkubera i rumstemperatur i 40 45 min p en horisontal plattskak cirka 500 700 r min 7 Upprepa tv ttstegen enligt anvisningarna ovan tre ganger med 300 ul tv ttl sning per brunn 8 Tills tt 100 ul substratl sning i varje brunn helst med en repeter eller flerkanalspipett 9 Inkubera plattan i rumstemperatur utan att skaka den i 20 30 mi nuter skyddat fr n solljus 10 Valfritt Tills tt 100 ul 1M NaOH stoppl sning i varje brunn om en best md inkuberingstid kr vs 11 L s av v rdena f r optisk densitet OD vid 405 nm med en ELISA l sare Om plattl saren har funktionen f r det kan plattan skakas kort 2 3 sekunder f re avl sning Valfritt F rkortad inkuberingstid manuellt f rfarande Inkuberingstiden kan f rkortas till 30 5 min utan att resultaten p verkas En minskning i OD v rden kan observeras och det h gsta OD v
44. suurella todenn k isyydell auttaa poissulkemaan tulehdukselliset suolistosairaudet Limakalvon parantuminen on onnistuneen IBD n hoidon tavoite ja kal protektiinin testaus ulosteesta kertoo milloin t m tavoite on saavutettu Monilla IBD potilailla on kliinisen toipumisjakson aikana normaalit C reaktiivisen proteiinin CPR tasot mutta heill on silti jatkuva tulehdus 0 joka n kyy kalprotektiinin m r n kasvuna ulosteessa N ill poti lailla IBD n uusiutumisriski seuraavien kuukausien aikana on korkea 11 Jos limakalvo paranee uusiutumisriski ja merkitt v n suolistoleik kauksen tarve pienenev t 12 18 Kalprotektiinin tason normalisoituminen merkitsee sit ett limakalvon paraneminen on alkanut 14 Kalprotek tiini ELISA teknologiaa on k ytetty my s seerumi ja plasman ytteiden analysointiin ja korkeita kalprotektiiniarvoja todettiin my s potilailta joilla on bakteeri infektio 15 16 sepsis tai muu tulehdussairaus kuten nivel reuma RA tai systeeminen lupus erythematosus SLE 17 21 Tieteel liset tutkimukset osoittavat ett kalprotektiini seerumissa plasmassa on ensisijainen mittari RA n ja SLE n aktiivisuuden toteamisessa ja se voi ennustaa taudin puhkeamista Se on my s hyv syd ninfarktiin johtavan sepelvaltimotaudin mittari 22 2 3 TESTIN PERIAATE BIOHIT kalprotektiini ELISA testi perustuu ulosten ytteen k sittelyyn eristyspuskurin Fecal Extraction Buffer avulla Kalprotektiinipitoisuus
45. value of Blank 0 ng mL should be lt 0 25 A representative 15 calibration curve is shown in figure 1 10 2 Calculation of the results Calculation of Calprotectin concentration in patient fecal samples 1 Calculate the mean OD values of all duplicate wells blank calibra tors and samples 2 Plot the value of blank and each calibrator concentration ng mL on the x axis against its mean OD value on the y axis to obtain a calibra tion curve A 4 parameter curve fit function is recommended see figure 1 below If a logarithmic x axis is required a value of 0 001 ng mL must be used for standard A 0 ng mL 3 Use the calibration curve to determine the Calprotectin concentration in the diluted samples ng mL based on their OD values 4 Multiply the Calprotectin concentration ng mL in the diluted fe cal extracts by 5 in order to convert to mg kg Calprotectin in the original stool sample This factor corrects for the total dilution of 1 5000 1 50 during the ex traction procedure and the following 1 100 dilution of the extracts and converts the value from ng mL to mg kg Example if a diluted extract sample has a value of 100 ng mL the concen tration in the original stool specimen was 100 x 5 500 mg kg Note If extracts have been diluted more or less than the recommended 1 100 the additional dilution factor must be entered into the calculation 16 25 0D 405 nm Calprotectin std A 0 086151
46. ydetyt viat Viallinen tuote jotka johtuvat ep sopivista materiaaleista tai huolimattomasta valmistusty st mik est tuotteen mekaanisen toiminnan tai tarkoite tun k yt n mukaanlukien muttei rajoitettuna vain toiminnat jotka on lueteltu valmistajan antamassa tuoteselostuksessa TAKUU TULLAAN SILTI PIT M N MIT T ITYN JOS VIAN HUOMATAAN AIHEU TUNEEN TUOTTEEN VAHINGOITTAMISESTA V RINK YT ST V R ST S ILYTYKSEST TAI K YT ST ANNETTUJEN SPE SIFIKAATIOIDEN TAI RAJOITUSTEN ULKOPUOLELLA TAI K YT T OHJEEN VASTAISESTI Takuun voimassaoloaika vastaa tuotteen s ilyvyysaikaa T m Biohitin diagnostinen kitti on valmistettu ISO 9001 ISO 13485 laaduntarkkailuk yt nn n mukaisesti S ilyvyysaika on es itetty pakkausmerkinn iss Tulkinnasta johtuvien ep selvyyksien kysee nollessa englanninkielinen versio on voimassa 40 15 TESTIN LYHYT KUVAUS BIOHIT kalprotektiini ELISA testi kalprotektiinin analysoimiseen ulosteesta Katso tuoteselosteen kohdista 7 9 yksityiskohtaiset testin k ytt ohjeet sek plasma seerumn ytteiden analysointiohjeet N ytteen uuttaminen Tee uuttaminen k ytt en yht kohdassa 7 1 1 7 1 2 kuvattua me netelm ELISA manuaalinen menetelm Laimenna ulosteuutetta suhteessa 1 100 laimennuspuskuriin e Lis 100 uL kalibraatoreita kontrollin yteit 0 n yteliuosta ja n yt teit ELISA levyylle Inkuboi levynravistimessa huoneenl mm ss 40
47. 2 or DSX ELISA automat the Enzyme Sub strate Solution must be transferred to a 25 mL Dynex reagent tube before running the test Avoid transferring the stabilising pellets 7 SAMPLE COLLECTION AND PREPARATION The BIOHIT Calprotectin ELISA has been developed and validated mainly for fecal samples but can also be used for plasma serum samples 7 1 Fecal samples Since Calprotectin is very stable in stools patients can collect small fecal samples at home Collect 1 5 g approximately one teaspoonful place it in a suitable clean container and deliver it to the laboratory as soon as possible but within four days When put in a container approved for transport it can be sent by ordinary mail i e no refrigeration is needed Exposure to temperatures above 30 C should be avoided Samples can also be stored frozen at 20 C or lower until delivery or mailing Frozen samples must be thawed and equilibrated to room tem perature before extraction and testing Note that freezing fecal samples can in some cases result in increased Calprotectin levels most likely due to release from granulocytes Note Before commencing extraction the stool sample should be homog 11 enised well using for example a spatula before the small amount for extraction is taken out For extraction we recommend the use of BIOHIT Extraction tubes or the other method described below chapter 7 1 1 and 7 1 2 Perform extrac tion according to package insert
48. 3 Roseth AG et al Assessment of disease activity in ulcerative colitis by fecal calprotectin a novel granulocyte marker protein Digestion 120 1997 58 176 80 14 Devlin SM and Panaccione R Evolving inflammatory bowel disease treatment paradigms top down versus step up Med Clin North Am 2010 94 1 18 15 Pineton de Chambrun G et al Clinical implications of mucosal heal ing for the management of IBD Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2010 7 1 15 29 16 Lichtenstein GR and Rutgeerts P Importance of mucosal healing in ulcerative colitis Inflamm Bowel Dis 2010 16 338 346 17 Smith MA et al Pharmacogenomics in the treatment of inflammatory bowel disease Pharmarcogenetics 2010 11 3 421 437 18 Lin MV et al What is the optimal therapy for Crohn s disease step up or top down Expert Rev Gastroenterol Hepatol 2010 4 2 167 180 19 Strauch U and Sch lmerich J Emerging drugs to treat Crohn s dis ease Expert Opin Emerg Drugs 2010 15 2 309 322 20 Isaacs KL How rapidly should remission be achieved Dig Dis 2010 28 3 548 555 21 Schwartz M and Regueiro M Prevention and treatment of postopera tive Crohn s disease recurrence an update for a new decade Curr Gastroenterol Rep 2011 Feb 13 1 95 100 22 Ha C and Kornbluth A Mucosal healing in inflammatory bowel dis ease where do we stand Curr Gastroenterol Rep 2010 12 6 471 478 23 Fagerberg UL et al Fecal calprotectin a quantitative marker of colon ic in
49. 5 minuutin ajan e Pese kuopat kolme kertaa 300 ul lla pesupuskuria e Lis 100 uL konjugaattiliuosta jokaiseen kuoppaan Inkuboi levynravistimessa huoneenl mm ss 40 5 minuutin ajan e Pese kuopat kolme kertaa 300 uL lla pesupuskuria Lis 100 uL substraattiliuosta jokaiseen kuoppaan e Inkuboi peitettyn 20 30 minuutin ajan e Vaihtoehtoinen lis 100 uL 1 M NaOH a jokaiseen kuoppaan Lue OD arvot 405 nm n kohdalla ELISA lukijan avulla Laske tulokset ng ml k ytt en neliparametrist sovitusk yr mg kg ulosteessa ng ml x 5 voidaan lyhent 30 5 minuuttiin jos analyysi tehd n manuaalisesti Jos sinulla on kysymyksi ota yhteytt s hk postiosoitteeseen info biohit fi 41 SVENSKA INSTRUKTIONER FOR ANVANDANDE BIOHIT Calprotectin ELISA kit Kat nr 602 260 AVSEDD ANVANDNING coord anaes 43 BAKGRUND E J ESTETS PRINCIP iach siete Ae NS enfia cet f e oil ails pda 7 MATERIAL annee tae 4 1 Reagenser som ingar i kitet 4 2 Material som ing r i kitet 4 3 Material som kr vs men ej medf ljer 46 STABILITET OCH F RVARING ss 6 REAGENSBEREDNING basics cocoiionsstaci radicada ii 6 1 Bestrukna remsor f r mikrotiterplatta oooooocinicnnnnccninncnnn 47 6 2 Provsp dningsbuffert s 6 3 VANDUT an ks nr sas osa nes nitrate ra 6 4 Fekalextraktionsbuffert 6 5 Kalib
50. 6 8 1210 4 2 2980 32 1977 7 9 1966 5 0 3660 10 Resultados m dios de tr s laborat rios distintos com cada um a testar dois lotes de kit diferentes foram testadas seis amostras num total de 10 vezes durante cinco dias Resultados m dios de tr s laborat rios distintos com cada um a testar dois lotes de kit diferentes foram testadas seis amostras com 10 r plicas numa execu o 114 Testado com um lote de kit foram diluidas seis amostras a 1 20 e testadas com 10 r plicas numa execu o Recupera o Fezes 85 105 testadas com extrato de fezes fortificado com Calpro tectina purificada em cinco n veis diferentes Plasma 81 105 testado com plasma fortificado com Calprotectina purificada em cinco n veis diferentes Limite de quantifica o 5 ng mL testado com extrato de fezes plasma e Calprotectina purifica da As amostras foram analisadas cinco vezes durante cinco dias Neste n vel o CV m dio das diferentes amostras e determina es era de 12 Limite de dete o lt 5 ng mL calculado como m dia Tamp o de dilui o da amostra n 32 5x DP Interfer ncia N o foi observada qualquer interfer ncia sobre o ELISA por parte de medicamentos utilizados vulgarmente Prednisolona Imurel Salazopi rina e Ciprofloxacina Precis o de extra o Foram extra das duas amostras de fezes 10 vezes cada segundo o pro cedimento descrito na sec o 7 1 2 e os extrat
51. 97 50 113 123 Roseth AG et al Correlation between fecal excretion of Indium 111 labelled granulocytes and calprotectin a granulocyte marker pro tein in patients with inflammatory bowel disease Scand J Gastroen terol 1999 34 50 54 Ton H et al Improved assay for fecal calprotectin Clinica Chimica Acta 2000 292 41 54 Tibble J et al A simple method for assessing intestinal inflammation in Crohn s disease Gut 2000 47 506 513 Bunn SK et al Fecal calprotectin Validation as a non invasive meas ure of bowel inflammation in childhood inflammatory bowel disease J Pediatr Gastroenterol Nutr 2001 33 14 22 Bjarnason and Sherwood R Fecal calprotectin A significant step in the noninvasive assessment of intestinal inflammation J Paediatric Gastroenterology Nut 2001 33 11 13 Siegmund B et al What has been confirmed in the treatment of in flammatory bowel disease Internist 2010 51 1492 1498 10 Tibble JA et al Surrogate markers of intestinal inflammation are pre dictive of relapse in patients with inflammatory bowel disease Jour nal Article Gastroenterology 2000 119 1 15 22 11 Schnitzler F et al Mucosal healing predicts long term outcome of maintenance therapy with infliximab in Crohn s disease Inflamm Bowel Dis 2009 15 1295 1301 12 Bj rkesten CG et al Endoscopic monitoring of infliximab therapy in Crohn s disease Inflamm Bowel Dis 2011 17 4 947 953 1
52. CT RISTIQUES DES PERFORMANCES Remarque Toutes les tudes de v rification de la conception ont t r alis es moyennant test manuel sur des chantillons d extraits de selles dilu s au 1 100e ou des chantillons de plasma EDTA dilu s au 1 20e l aide de la proc dure ELISA d crite au point 9 74 Pr cision inter essai et intra essai sur des extraits de selles et pr ci sion intra essai sur du plasma EDTA Pr cision inter essai Pr cision intra essai Pr cision intra essai extraits de selles extraits de selles plasma EDTA Concentra C V Concentra CN Concentra CN tion dans tion dans tion dans les selles les selles le plasma mg kg mg kg Ug L 32 1 13 28 7 6 7 166 3 8 171 6 0 173 3 6 740 4 7 368 4 8 385 4 1 1160 2 9 583 6 1 592 4 0 1360 35 1215 6 8 1210 4 2 2980 3 2 1977 7 9 1966 5 0 3660 10 R sultats moyens de trois laboratoires diff rents chacun d eux ayant test deux lots de kit diff rents six chantillons ont t test s 10 fois sur cing jours R sultats moyens de trois laboratoires diff rents chacun d eux ayant test deux lots de kit six chantillons ont t test s avec 10 r p titions sur une m me s rie Test sur un seul lot de kit six chantillons ont t dilu s au 1 20e et test s avec 10 r p titions sur une m me s rie R cup ration Selles 85 105 test sur des extraits de selles auxquels
53. DNING AV PRODUKTERNA F R BRUK SOM LIGGER UTANF R DERAS ANGIVNA BEGR NSNINGAR ELLER SPECIFIKATIONER STRID MOT DE ANVISNINGAR SOM LAMNAS INSTRUKTIONSMAN UALEN Garantiperioden framg r av Produkternas instruktionsmanual och b rjar g lla fr n det datum d den relevanta Produkten skickas av Biohit Detta diagnostiska kit fr n Biohit har tillverkats i enlighet med kvalitetsledningsprotokollen ISO 9001 ISO 13485 fall av tolkningsdis pyter ar det den engelska texten som g ller 58 15 FORFARANDET KORTHET BIOHIT Calprotectin ELISA kit for analys av kalprotektin i feces Se avsnitt 7 9 i bipacksedeln f r en fullst ndig beskrivning av de prak tiska stegen och om analys av plasma serum Extraktion Utf r extraktionen enligt en av de metoder som beskrivs i avsnitt 7 1 1 7 1 2 ELISA manuellt f rfarande Sp d fekalextrakt 1 100 i provsp dningsbuffert Tills tt 100 uL kalibratorer kontroller blanka och prover till ELISA plattan Inkubera pa en plattskak i rumstemperatur i 40 5 min Tv tta brunnarna tre g nger med 300 uL tvattbuffert Tills tt 100 uL konjugatl sning till varje brunn Inkubera pa en plattskak i rumstemperatur i 40 5 min Tv tta brunnarna tre g nger med 300 ul tvattbuffert Tills tt 100 uL substratl sning till varje brunn Inkubera vert ckt i 20 30 min Valfritt tills tt 100 uL 1M NaOH till varje brunn L s av OD v rdena vid 405 nm med en ELISA l sare Ber kna resultaten ng
54. EDTA plasma Concen CV Concen CV Concen CV tration in tration in tration in feces feces plasma mg kg mg kg ug L 32 1 13 28 7 6 7 166 3 8 171 6 0 173 3 6 740 47 368 4 8 385 41 1160 2 9 583 6 1 592 4 0 1360 3 5 1215 6 8 1210 4 2 2980 3 2 1977 7 9 1966 5 0 3660 10 Mean results from three different laboratories each testing two different kit lots six samples were tested a total of 10 times over five days Mean results from three different laboratories each testing two kit lots six samples were tested with 10 replicates in one run Tested using one kit lot six samples were diluted 1 20 and tested with 10 replicates in one run Recovery Feces 85 105 tested with fecal extract spiked with purified Calpro tectin at five different levels Plasma 81 105 tested with plasma spiked with purified Calprotectin at five different levels 18 Limit of Quantification 5 ng mL tested with feces extract plasma and purified Calprotectin Samples were analysed five times over five days The mean CV for the different samples and determinations at this level was 12 Limit of Detection lt 5 ng mL calculated as mean Sample Dilution Buffer n 32 5x SD Interference No observed interference on the ELISA from commonly used pharmaceu ticals Prednisolon Imurel Salazopyrin and Ciprofloxacin Extraction precision Two feces samples were extracted 10 times each using the procedu
55. INDEBIDO USO INDEBIDO DANO ACCIDENTAL CONSERVACION INCORRECTA O USO DE LOS PRODUCTOS PARA PROCEDIMIENTOS FUERA DE LAS LIMITACIONES INDICADAS O DE SUS ESPECIFICACIONES CONTRARIOS A LAS INSTRUC CIONES PROPORCIONADAS EN EL MANUAL DE INSTRUCCIONES CUALQUIER GARANTIA SE CONSIDERARA NULA El periodo de esta garant a se indica en el manual de instrucciones de los Productos y en trar en vigor a partir de la fecha de expedici n del Producto en cuesti n por parte de Biohit Este kit de Diagn stico de Biohit se ha elaborado en conformidad con los protocolos de gesti n de calidad ISO 9001 ISO 13485 En caso de conflicto con respecto a su interpretaci n se aplicar el texto en ingl s 98 15 BREVE DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO Kit BIOHIT Calprotectin ELISA para an lisis de calprotectina en heces Consultar las secciones 7 9 del prospecto del envase para obtener una descripci n completa de los pasos pr cticos e informacion sobre el an li sis de plasma suero Extracci n e Realizar la extracci n de acuerdo con uno de los m todos que se de scriben en las secciones 7 1 1 7 1 2 ELISA procedimiento manual Diluir los extractos fecales a 1 100 en amortiguador para diluci n de muestras A adir 100 uL de calibradores controles blanco y muestras a la placa de ELISA Incubar en un agitador de placas a temperatura ambiente durante 40 5 minutos Lavar los pocillos tres veces con 300 uL de amortiguador para lavado A
56. IONS OU CARACTERISTIQUES OU CONTRAIRES AUX IN STRUCTIONS FOURNIES PAR CE MODE D EMPLOI La p riode de garantie est d finie dans le mode d emploi et prend effet a compter de la date d exp dition du Produit par Biohit Ce coffret de diagnostic Biohit a t fabriqu conform ment aux protocoles de gestion de la qualit d finis par la norme ISO 9001 ISO 13485 En cas de litiges c est la version anglaise du texte qui s applique 78 15 RESUME DE LA PROCEDURE A SUIVRE Kit BIOHIT Calprotectin ELISA pour l analyse de calprotectine dans les selles Se reporter aux points 7 9 de la notice contenue dans l emballage pour une description compl te de la proc dure ainsi que pour l analyse de plasma s rum Extraction Effectuer l extraction conform ment l une des m thodes d crites aux points 7 1 1 7 1 2 ELISA proc dure manuelle e Diluer des extraits de selles au 1 100e dans le tampon de dilution d chantillon Ajouter 100 uL de chaque calibrateur contr le t moin et chantillon sur la plaque ELISA Laisser incuber sur un vibreur agitateur de plaques temp rature am biante pendant 40 5 min Laver les puits trois fois avec 300 ul de tampon de lavage Ajouter 100 uL de solution de conjugu dans chaque puits Laisser incuber sur un vibreur agitateur de plaques temp rature am biante pendant 40 5 min Laver les puits trois fois avec 300 ul de tampon de lavage Ajouter 100 uL de s
57. ISA sp cifique de la calprotectine Dans ELISA des chantillons et calibraterus sont incub s dans des puits de plaques microtitres s par s coat s avec des anticorps mono clonaux qui fixent la calprotectine Apr s incubation et lavage des puits la calprotectine fix e peut r agir avec des anticorps sp cifiques de la calprotectine purifi s par immuno affinit marqu s avec une enzyme Apres cette r action la quantit d enzyme fix e dans les puits de la plaque microtitre est proportionnelle a la quantit de calprotectine dans l chantillon ou l talon Elle est d termin e par incubation de l enzyme avec un substrat pour donner un produit color L intensit de la couleur est d termin e par absorbance l aide d un lecteur de plaques ELISA et est proportionnelle a la concentration de calprotectine dans les calibra teurs et chantillons L essai est calibr par l utilisation de calprotectine purifi e a partir d un extrait leucocytaire 4 MATERIEL 4 1 R actifs fournis avec le kit Plaque microtitre coat e 12 bandes 8 puits par bande coat es avec des anticorps de souris monoclonaux purifi s par immuno affinit sp cifiques de la calprotectine La plaque est conserv e dans un sachet tanche contenant un agent d shydratant DILBUF 5x Tampon de dilution d chantillon 5 x conc 1 x 20 ml concentr 5 x diluer dans de l eau distill e d sionis e pH 8 0 0 2 solution de couleur j
58. IT Calprotectin ELISA can contribute to an earlier diagnosis of IBD since the test is usually positive in active IBD Functional disorders like irritable bowel syndrome IBS do not cause increased fecal Calprotectin concentrations but organic abdominal dis orders like IBD do Patients with organic and functional abdominal dis orders may have similar symptoms and clinical examination alone may not be sufficient to give a specific diagnosis A test for fecal Calprotectin 6 is a simple non invasive inexpensive and objective method that can help selecting patients for additional examination like endoscopy Abdominal symptoms are very common both in children and adults and a negative result as measured by the BIOHIT Calprotectin ELISA can with high probability rule out inflammatory bowel disorders Mucosal healing is the optimal goal for IBD treatment and a test for fecal Calprotectin shows when this has been achieved Many IBD patients in clinical remission with normal C reactive protein CRP levels still have on going inflammation 10 reflected by increased fecal Calprotectin Such patients have increased risk of relapse within a few months 11 If mucosal healing can be achieved the risk of relapse and need for major abdomi nal surgery will be reduced 12 13 Normalisation of Calprotectin levels means that mucosal healing has been achieved 14 Our Calprotectin ELISA technology has also been used for analysis of serum and plasma sampl
59. Innovating for Health MANUEL D INST INSTRUCCIONES 602 260 For in vitro diagnostic use Store at 2 8 C Upon Receipt Biohit Oyj Laippatie 1 Fl 00880 Helsinki Finland Tel 358 9 773 861 infoldbiohit fi www biohithealthcare com SYMBOLS SYMBOLIT SYMBOLER SYMBOLES S MBOLOS SIMBOLOS English Suomi Svenska For in vitro diagnostic use In vitro diagnostiseen k ytt n F r in vitro diagnos tiskt bruk LOT Batch code Er numero Batchkod Use b Er ntymis Anv nds f re y p iv m r Storage limitation Store at 2 8 C L mp tilarajoitteet S ilytys 2 8 C F rvaringsbegr n sning F rvaras vid 2 8 C CE Mark CE merkki CE marke Catalogue Number Kataloginumero Katalognummer 96 determinations 96 m rityst 96 best mningar Do not re use l k yt uudelleen F r ej teranv ndas Consult instructions for use Lue k ytt ohjeet Se bruksanvisningen Washing Buffer Con centrate 20x Pesupuskuri konsen traatti 20x Tv ttbuffertkoncentrat 20x Sample Diluent Buffer Concentrate 5x Laimennospuskuri konsentraatti 5x Provsp dningsbuffert koncentrat 5x Fecal Extraction Buffer 2 5x Ulosten ytepuskuri konsentraatti 2 5x Fekalextraktionsbuffert 2 5x Blank 0 n yteliuos Blank Calibrators 1 5 Kalibraattorit 1 5 Kalibratorer 1 5 L
60. SA automaatteihin Muitakin automaattisia ELISA v lineit voidaan my s k ytt mutta asiakkaan tulee validoida ne 9 1 Menetelmi koskevia huomioita Valmistelu Lue testiohje huolellisesti ennen m rityksen tekemist Tulosten luotettavuus on riippuvainen kuvatun testiohjeen huolellis esta noudattamisesta Ennen testauksen aloittamista pipetointimalli 0 n yteliuoksineen kalibraattoreineen kontrolleineen ja n ytteineen tulee varmistaa huolellisesti k ytt en esimerkiksi pakkauksessa ole vaa pohjaa apuna Valitse tarvittava m r kuoppalevyn liuskoja K yt t m tt m t liuskat tulee sulkea alumiinipussiin ja s ilytt kohdassa 6 1 kuvatulla tavalla 32 Suositeltava laimennos ulostenaytteesta on 1 100 Talla laimennok sella naytteen tulos on valilla 25 mg kg LoQ 2500 mg kg ulosteesta N ytteit joiden kalprotektiiniarvot ovat korkeat voidaan laimentaa enemm n gt 1 100 ja testata uudelleen jos tarkka arvo tarvitaan N ytteit joiden kalprotektiiniarvot ovat alhaiset voidaan laimentaa v hemm n 1 50 K ytetty laimennuskerroin tulee huomioida kon vertoitaessa m ri yksik st ng ml yksikk n mg kg katso kohta 10 j ljemp n Tee kaikki testin vaiheet annetussa j rjestyksess ilman huomattavia viiv styksi vaiheiden v lill Jokainen kalibraattori kontrolli ja n yte tulee annostella puhtaalla ker tak ytt isell pipettik rjell Jotta tulokset olisivat luotettavia
61. a no soro ou no plasma a pro teina n o pode ser libertada dos granul citos neutr filos no sangue in vitro Para o plasma o EDTA o anticoagulante preferido Procedimento recomendado de prepara o das amostras 1 Colher sangue com Vacutainers 2 Centrifugar o sangue a 3000 rpm durante 10 minutos o mais rapida mente poss vel e no prazo m ximo de tr s horas ap s a amostragem 3 Recolher apenas os dois ter os superiores da camada de soro ou plasma por meio de pipetagem cuidadosa a fim de evitar a aspira o dos leuc citos da camada leucocit ria Para testes ELISA diluir o plasma ou o soro numa propor o de 1 20 por exemplo 50 uL de amostra 950 uL do Tamp o de dilui o da amostra e seguir o procedimento de ensaio descrito na Sec o 9 8 DISPOSI O SUGERIDA DA PLACA 1 2 3 4 etc A Calibrador 5 Calibrador 5 Amostra 1 Amostra 1 500 ng mL 500 ng mL B Calibrador 4 Calibrador 4 Amostra 2 Amostra 2 125 ng mL 125 ng mL C Calibrador 3 Calibrador 3 Amostra 3 Amostra 3 62 5 ng mL 62 5 ng mL D Calibrador 2 Calibrador 2 Amostra 4 Amostra 4 31 3 ng mL 31 3 ng mL E Calibrador 1 Calibrador 1 Amostra 5 Amostra 5 7 8 ng mL 7 8 ng mL F Solu o em Solu o em Amostra 6 Amostra 6 branco branco 0 ng mL 0 ng mL G Controlo Controlo Amostra 7 Sample 7 Baixo Baixo H Controlo Controlo Amostra 8 Amostra 8 Alto Alto
62. a uno de los cuales analizo dos lotes de kits distintos se analizaron seis muestras un total de 10 veces a lo largo de cinco dias Resultados medios de tres laboratorios distintos cada uno de los cuales analiz dos lotes de kits distintos se analizaron seis muestras con 10 r plicas en una tanda Analizado un lote de kits seis muestras se diluyeron a 1 20 y se anal izaron con 10 r plicas en una tanda 94 Recuperacion Heces 85 105 analizados con extracto fecal al que se afiadi calpro tectina purificada en cinco niveles distintos Plasma 81 105 analizados con plasma al que se afiadi calprotectina purificada en cinco niveles distintos Limite de cuantificacion 5 ng ml analizados con extracto de heces plasma y calprotectina puri ficada Las muestras se analizaron cinco veces a lo largo de cinco dias El CV medio de las distintas muestras y determinaciones en este nivel fue del 12 Limite de deteccion lt 5 ng ml calculado como media amortiguador para diluci n de mues tras n 32 5x DE Interferencia No se observ interferencia en ELISA procedente de medicamentos de uso frecuente prednisolona imurel salazopirina y ciprofloxacina Precision de la extracci n Se extrajeron dos muestras de heces 10 veces cada una siguiendo el procedimiento que se describe en la secci n 7 1 2 y los extractos se analizaron en ELISA Resultados medios de tres laboratorios distintos y un lote de kits
63. adir 100 uL de soluci n de conjugado a cada pocillo Incubar en un agitador de placas a temperatura ambiente durante 40 5 minutos Lavar los pocillos tres veces con 300 uL de amortiguador para lavado e A adir 100 uL de soluci n de sustrato a cada pocillo Incubar con la placa tapada durante 20 30 minutos Optativo a adir 100 uL de 1M NaOH a cada pocillo Leer los valores de DO a 405 nm usando un lector de ELISA Usando un ajuste de curva de 4 par metros calcular los resultados ng ml mg kg en heces ng ml x 5 Puede reducirse a 30 5 minutos si el an lisis se lleva a cabo de forma manual Para plantear preguntas ponerse en contacto con info biohit fi 99 PORTUGU S INSTRU ES DE USO BIOHIT Calprotectin ELISA kit Cat N 602 260 1 UTILIZA O PREVISTA mmm a a neen 101 2 CONTEXTO mummun 101 3 PRINC PIO DO TESTE 102 4 MATERIAIS iia li Ada 103 103 104 4 1 Reagentes fornecidos com o kit 4 2 Materiais fornecidos com o kit 4 3 Materiais necess rios mas n o fornecidos 104 5 ESTABILIDADE E ARMAZENAMENTO 22 105 6 PREPARA O DOS REAGENTES es 105 6 1 Faixas da placa de titula o revestidas 105 6 2 Tamp o de dilui o da amostra 106 6 3 Tamp o de lavagem 106 6 4 Tamp o de extra o de fezes 106 6 5 Calibradores solu o em branco e con
64. ados das solu es calibradores e dos controlos quanto exist ncia de uma poss vel contamina o microbiana antes da reutiliza o Para evitar a contamina o cruzada e resultados falsamente eleva dos pipetar as solu es calibradores os controlos e as amostras dos extratos de fezes e dispensar o conjugado e o substrato com precis o no fundo dos po os de microplacas sem salpicos Alguns reagentes cont m azida de s dio numa concentra o inferior a 0 1 p v e ou Kathon a 0 1 Armazenar a solu o do substrato no frasco opaco original a solu o deve apresentar uma cor l mpida a ligeiramente amarela Misturar cui dadosamente antes da utiliza o O BIOHIT Calprotectin ELISA foi concebido para ser utilizado por pessoal qualificado com forma o em boas pr ticas de laborat rio 13 1 Considera es relativas elimina o Os res duos de produtos qu micos e prepara es s o geralmente con siderados res duos perigosos A elimina o deste g nero de res duos 117 regulamentada por leis e regulamentos nacionais e regionais Contactar as autoridades ou empresas de gest o de res duos locais para obter orienta es em mat ria de elimina o de res duos perigosos 14 GARANTIA O Biohit deve solucionar todos os defeitos detectados em qualquer Produto o Produto com defeito que resultarem de materiais inade quados ou de fabrica o negligente e que impe am o funcionamento mec nico ou a util
65. ala kaninantikroppar mot kalprotektin i en buffert med stabiliserare konserveringsmedel och ett inert r tt fargamne L s ningen ar fardig att anv nda R ret passar direkt i Dynex DS2 och DSX ELISA automater 6 7 Substratl sning Flaskan innehaller 13 ml p nitrofenylfosfatl sning PNPP L sningen r f rdig att anv nda och m ste f rvaras i den ogenomskinliga originalflas kan Obs Om Dynex DS2 eller DSX ELISA automat anv nds m ste enzym substratl sningen verf ras till ett 25 ml Dynex reagensr r innan testet k rs Undvik att verf ra den stabiliserande pelletsen 7 PROVTAGNING OCH BEREDNING BIOHIT Calprotectin ELISA har utvecklats och validerats fr mst f r fecesprover men kan ocks anv ndas med plasma eller serumprover 7 1 Fecesprover Eftersom kalprotektin r mycket stabilt i avf ring kan patienten ta sm fecesprover i hemmet Ta 1 5 g cirka en tesked placera provet i en l mplig ren beh llare och leverera det till laboratoriet snarast m jligt dock senast inom 4 dagar Om provet l ggs i en beh llare som r god k nd f r transport kan det skickas med vanlig post kylf rvaring r inte n dv ndig Undvik exponering f r temperaturer ver 30 C Prover kan ocksa frysf rvaras vid 20 C eller l gre tills de levereras el ler postas Frysta prover m ste tinas och ekvilibreras till rumstemperatur innan de extraheras och testas Observera att frysning av fecesprover i vissa fall kan medf
66. ally Plate shaker 500 700 rpm if assay is performed manually Timer if assay is performed manually Microplate reader filter 405 nm if assay is performed manually 1M NaOH stop solution optional STABILITY AND STORAGE When stored unopened at 2 8 C kit reagents are stable up to the expiry date stated on the label Opened plates reagents and concentrated buffers are stable for up to 9 three months when stored at 2 8 C When prepared in clean vessels working solutions 1x of Washing Buff er Sample Dilution Buffer and Fecal Extraction Buffer can be stored at 2 8 C for up to one month Avoid exposure to high temperature and direct sunlight 6 REAGENT PREPARATION All reagents samples and controls should be brought to room tempera ture 18 25 C before starting the test run 6 1 Coated microtiter plate strips The ready to use plate strips are coated with affinity purified monoclo nal mouse antibodies specific for Calprotectin Unused strips should be removed from the frame and immediately re sealed in the aluminium foil pouch along with the desiccant supplied Store at 2 8 C 6 2 Sample Dilution Buffer Dilute the 5x concentrated Sample Dilution Buffer by adding 1 part 20 mL to 4 parts 80 mL distilled deionised water in a clean vessel to a final volume of 100 mL Mix well Store the diluted Sample Dilution Buffer in a closed vessel at 2 8 C Note If using a Dynex DS2 or
67. an k ytt apuna ohutsu olen paksusuolen tai mahalaukun elimellisen taudin tunnistamisessa taudin aktiivisuuden m ritt misess ja hoitovasteen seurannassa kuten Chronin taudissa ja haavaisessa paksusuolitulehduksessa BIOHIT kal protektiini ELISA on validoitu k ytett v ksi ulosten ytteiden tutkimuk seen Testi on tarkoitettu in vitro diagnostiseen k ytt n 2 TAUSTA Kalprotektiini on 36 kilodaltonin kokoinen kalsiumia ja sinkki sitovaa proteiini jota vapautuu erityisesti leukosyyteist tarkemmin polymor fonukleaarisista neutrofiilisist granulosyyteist PMN suolen luumeniin suoliston limakalvon tulehduksen aikana Suolen mikro organismit stimu loivat leukosyyttej siirtym n suolen luumeniin miss ne vapauttavat sis lt ns johon kuuluu mikrobeja tappavia aineita kuten kalprotektiinia T m proteiini muodostaa noin 60 kaikista PMN n soluliman proteii neista 2 ja sen m r voidaan luotettavasti arvioida ulosten ytteist joita on s ilytetty korkeintaan seitsem n p iv huoneenl mm ss 3 Erityyppiset sairaudet esimerkiksi bakteeri infektiot nivelreuma ja sy p johtavat PMN n aktivoitumiseen ja lis v t kalprotektiinin m r soluli massa selk ydinnesteess nivelnesteess ientaskunesteess virtsas sa tai muissa kehon nesteiss Ulosteen kalprotektiinipitoisuus korreloi suolen luumeniin siirtyneiden PMN en lukum r n kanssa 5 ja pitoisuus voidaan m ritt
68. aso o ensaio seja realizado manualmente Agitador de placas 500 700 rpm caso o ensaio seja realizado manualmente Temporizador caso o ensaio seja realizado manualmente Leitor de microplacas filtro de 405 nm caso o ensaio seja realizado manualmente 1M NaOH solu o de paragem opcional 5 ESTABILIDADE E ARMAZENAMENTO Se forem armazenados numa embalagem fechada temperatura de 2 8 C os reagentes do kit permanecem est veis at ao prazo de vali dade indicado no r tulo As placas reagentes e tamp es concentrados abertos permanecem es t veis por um m ximo de tr s meses quando armazenados tempera tura de 2 8 C Se forem preparadas em recipientes limpos as solu es de trabalho 1x do Tamp o de lavagem do Tamp o de dilui o da amostra e do Tamp o de extra o de fezes podem ser armazenadas temperatura de 2 8 C pelo per odo m ximo de um m s Evitar a exposi o a temperaturas elevadas e luz solar direta 6 PREPARA O DOS REAGENTES Todos os reagentes amostras e controlos devem estar temperatura ambiente 18 25 C antes da realiza o do teste 6 1 Faixas da placa de titula o revestidas As faixas da placa prontas a utilizar est o revestidas com anticorpos monoclonais de rato purificados por afinidade e espec ficos para a Cal protectina As faixas n o utilizadas devem ser removidas da estrutura e 105 fechadas imediatamente na bolsa de alum nio jun
69. ators blank and controls N 6 6 Conjugate Solution 11 6 7 Substrate Solution 7 SAMPLE COLLECTION AND PREPARATION ad Rol Fecal Samples uussa poda s Ti 7 1 1 Extraction using the BIOHIT Extraction tubes 1112 7 1 2 Extraction using the weighing method 2 12 7 2 Plasma and serum samples 13 8 SUGGESTED PLATE LAYOUT 9 TEST PROCEDURE 14 9 1 Procedural Notes 14 9 2 ELISA Procedure 14 10 RESULT S ote 15 10 1 Quality Control Values 15 10 2 Calculation of the results 16 10 3 Interpretation of the results Pur 11 LIMITATIONS OF THE PROCEDURE 18 12 PERFORMANCE CHARACTERISTICS 18 13 WARNINGS AND PRECAUTIONS HA 13 1 Disposal ConsideratiOhs i siissssa tanassa saas a aaia 114 AVARRANTY cri ca tes vier sentra rs vu utan en a 15 SHORT OUTLINE OF THE PROCEDURE usines 22 1 INTENDED USE The BIOHIT Calprotectin ELISA is a quantitative method for the detec tion of Calprotectin in stool samples It can be used as an aid in identify ing organic disease of the small intestine large bowel or the stomach in patients to determine the disease activity and monitor the response to treatment in patients with ulcerative colitis or Crohn s disease The BIO HIT Calprotectin ELISA has been validated for stool samples The test is for in vitro diagnostic use 2 BACKGROUND Calprotectin is a 36 kiloda
70. aune bouteille bouchon bleu Tampon de lavage 20 x conc 1 x 50 ml concentr 20 x diluer dans de l eau distill e d sionis e pour laver les puits des plaques microtitres pH 7 8 0 2 solution transparente bouteille a bou chon blanc FEC EXTRBUF 2 5X Tampon d extraction de selles 2 5 x conc 2 x 90 ml concentr 2 5 x diluer dans de l eau distill e d sionis e pH 8 0 0 2 solution transparente bouteilles bouchon blanc CAL 1 5 Calibrateurs de calprotectine et BLANK 6 flacons de 63 1 0 ml pr ts l utilisation solution de couleur jaune flacons avec des bouchons de couleurs diff rentes Blank bouchon bleu 0 ng ml Calibrateur 1 bouchon vert 7 8 ng ml Calibrateur 2 bouchon jaune 31 3 ng ml Calibrateur 3 bouchon rouge 62 5 ng ml Calibrateur 4 bouchon blanc 125 ng ml Calibrateur 5 bouchon noir 500 ng ml CONTROL CONTROL HIGH Contr les Faible et Fort 2 flacons de 1 0 ml pr ts l utilisation solution de couleur jaune Ctr faible flacon avec un bouchon marron Ctr fort flacon avec un bouchon mauve Solution de conjugu 113 ml anticorps de lapin polyclonaux purifi s par immuno affinit marqu s avec une phosphatase alcaline contre la calprotectine pr ts l usage solution de couleur rouge 25 ml tube de r actif Dynex a bouchon blanc Solution substrat pNPP 113 ml pr t l usage solution trans parent
71. ci n mediante el m todo de pesada a 7 2 Muestras de plasma y Suero ia 8 SUGERENCIA DE ESQUEMA DE PLACA na 9 M TODO ANAL TICO 5 9 1 Notas sobre el procedimiento 9 2 Procedimiento de ELISA 10 RESULTADOS i 10 1 Valores del control de calidad 10 2 C lculo de los resultados ee 10 3 Interpretaci n de los resultados 11 LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO 12 CARACTER STICAS DE LOS RESULTADOS 13 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 13 1 Consideraciones respecto a la eliminaci n 14 GARANTIA 0r0di5sssosronsensosaseersnsradeindsotnosarestdenesnerer i 15 BREVE DESCRIPCI N DEL PROCEDIMIENTO uuuuuiiiinni 99 q 80 1 USO PREVISTO BIOHIT Calprotectin ELISA es un m todo cuantitativo para la detecci n de calprotectina en muestras de heces Puede usarse como complemen to en la identificaci n de una enfermedad organica del intestino delgado el intestino grueso o el est mago de los pacientes para determinar la actividad de la enfermedad y controlar la respuesta al tratamiento en pacientes con colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn BIOHIT Calpro tectin ELISA est validado para muestras de heces La prueba est destinada a uso diagn stico in vitro 2 ANTECEDENTES La calprotectina es una prote na de fijaci n al calcio y zinc de 36 kilodal tonios que liberan sobre todo los leucocitos en concreto los
72. co com tampa amarela O frasco cont m p letes estabilizadores Nota em caso de utiliza o de um instrumento Dynex necess rio transferir o substrato para um tubo de reagente Dynex de 25 mL antes de realizar o teste j Cont m Kathon a 0 1 Cont m azida de s dio a lt 0 1 Cont m Kathon a 0 1 e azida de s dio a lt 0 1 Cont m metilisotiazolona a 0 02 e bromonitrodioxano a 0 02 4 2 Materiais fornecidos com o kit 2 pel culas vedantes 1 protocolo de teste e 1 disposi o da placa 4 3 Materiais necess rios mas n o fornecidos gua destilada desionizada Dispositivos de extra o consultar sec o 7 1 1 e 7 1 2 Ansas de inocula o descart veis e quebr veis em caso de utiliza o do m todo de pesagem descrito na sec o 7 1 2 Balan a digital de precis o 40 150 mg em caso de utiliza o do m todo de pesagem descrito na sec o 7 1 2 Tubos de poliestireno descart veis com tampa de rosca 5 mL em caso de utiliza o do m todo de pesagem descrito na sec o 7 1 2 104 Agitador vortex e Tubos descart veis para dilui o das amostras tubos Eppendorf ou semelhantes caso o ensaio seja realizado manualmente e Pipetas para distribuir volumes entre 10 e 1000 uL caso o ensaio seja realizado manualmente e Pipeta repetitiva ou pipeta multicanal 100 uL caso o ensaio seja re alizado manualmente Lavador de pocos de microplacas ou pipeta multicanal 300 uL c
73. das a 20 C o menos hasta su entrega o envio Las muestras congeladas deben des congelarse y equilibrarse hasta la temperatura ambiente antes de la extracci n y el an lisis T ngase en cuenta que al congelar muestras fecales pueden aumentar en ocasiones los niveles de calprotectina de bido muy probablemente a su liberaci n a partir de los granulocitos Nota Antes de comenzar la extracci n la muestra fecal debe homo geneizarse bien usando por ejemplo una esp tula antes de retirar la peque a cantidad para la extracci n Para la extracci n recomendamos usar tubos de extracci n BIOHIT o los otros m todos que se describen a continuaci n cap tulos 7 1 1 y 7 1 2 Realizar la extracci n de acuerdo con el prospecto del envase correspon diente al dispositivo m todo de extracci n escogido Pueden emplearse otros m todos y dispositivos validados por el cliente 87 7 1 1 Extracci n mediante tubos de extracci n BIOHIT Instrucciones de uso leer el prospecto del envase del producto ref 602 270 7 1 2 Extracci n mediante el m todo de pesada sin dispositivo de extracci n 1 2 10 88 Pesar tarar un tubo vacio con tap n de rosca con un asa bacteri ol gica Tomar aproximadamente 100 mg entre 40 y 120 mg de heces me diante el asa bacteriol gica e introducirlos en el tubo con tap n de rosca Evitar tomar material s lido no digerido como fibras y semillas Pesar el tubo y el asa con
74. desionizada pH 8 0 2 solu o amarela frasco com tampa azul Tamp o de lavagem conc 20x 1 x 50 mL concentrado 20x para ser dilu do com gua destilada desionizada destinado lav agem dos po os de titula o pH 7 8 0 2 solu o l mpida frasco com tampa branca EXTRBUF 25X Tamp o de extra o de fezes conc 2 5x 2 x 90 mL concentrado 2 5x para ser dilu do com gua destilada de sionizada pH 8 0 2 solu o l mpida frascos com tampas brancas CAL 1 5 calibradores de Calprotectina e BLANK 6 frascos de 1 mL prontos a utilizar solu o amarela frascos com tampas de cores diferentes Solu o em branco tampa azul 0 ng mL Calibrador 1 tampa verde 7 8 ng mL 103 Calibrador 2 tampa amarela 31 3 ng mL Calibrador 3 tampa vermelha 62 5 ng mL Calibrador 4 tampa branca 125 ng mL Calibrador 5 tampa preta 500 ng mL CONTROL CONTROL HIGH Controlos Baixo e Alto 2 frascos de 1 mL prontos a utilizar solu o amarela Controlo baixo frasco com tampa castanha Controlo alto frasco com tampa roxa Solu o do conjugado 13 mL de anticorpos policlonais de coelho purificados por imunoafinidade e marcados com fosfatase alcalina contra a Calprotectina pronto a utilizar solu o vermelha tubo de rea gente Dynex de 25 mL com tampa branca Solu o do substrato pNPP 113 mL pronto a utilizar solu o de cor l mpida a ligeiramente amarela frasco opa
75. e Lin arit plasma EDTA Des chantillons de plasma n 5 ont t dilu s au 1 20e 1 80e et an alys s au test ELISA R sultats moyens Dilution de dilution au 1 20e 1 20 100 1 40 107 1 80 116 76 Une variation de la lin arit des chantillons a t observ e 13 MISES EN GARDE ET PRECAUTIONS En vertu de l article 1 paragraphe 2b de la directive europ enne 98 79 CE l utilisation de dispositifs m dicaux de diagnostic in vitro est con cue de la part du fabricant pour garantir la convenance performance et s curit du produit La proc dure de test l information les pr cautions et les avertissements contenus dans le mode d emploi doivent donc tre strictement respect s L utilisation des kits de test avec des analy seurs ou un quipement similaire doit tre valid e Toute modification de la conception composition et proc dure de test ainsi que toute utilisation en association avec d autres produits non approuv s par le fabricant est interdite l utilisateur lui m me est responsable de telles modifications Le fabricant n est pas responsable des faux r sultats et incidents dus de telles causes Le fabricant n est pas responsable des r sultats issus d une simple analyse visuelle des chantillons du patient Utilisation r serv e au seul diagnostic in vitro Tous les composants d origine humaine utilis s pour la production de ces r actifs ont t test s avec
76. e l g rement jaune bouteille opaque bouchon jaune La bouteille contient des granulats de stabilisation Remarque si l on utilise un instrument Dynex le substrat doit tre trans f r dans un tube de r actif Dynex de 25 ml avant de r aliser le test ta Contient 0 1 de Kathon vi Contient lt 0 1 d azoture de sodium a Contient 0 1 de Kathon et lt 0 1 d azoture de sodium Kk Contient 0 02 de m thylisothiazolinone et 0 02 de bromonitrodioxane 4 2 Mat riel fourni avec le kit e 2 feuilles de scellement e 1 protocole d essai 1 plan de plaque 4 3 Mat riel n cessaire non fourni Eau distill e d sionis e Dispositifs d extraction voir points 7 1 1 et 7 1 2 e Boucles d inoculation jetables cassables si l on utilise la m thode de pes e du point 7 1 2 64 Balance num rique de precision 40 150 mg si l on utilise la m th ode de pes e du point 7 1 2 Tubes bouchon vissable en polystyr ne jetables 5 ml si l on utilise la m thode de pes e du point 7 1 2 Vortex Tubes jetables pour la dilution des chantillons tubes Eppendorf ou similaires si l essai est r alis manuellement Pipettes permettant de distribuer des volumes 10 1 000 ul si l essai est r alis manuellement e Pipette r p tition ou multi canaux 100 ul si l essai est r alis ma nuellement Pipette de lavage de puits de plaque microtitre ou multi canaux 300 ul si l essai e
77. e do not shake Add 100 uL of conjugate to each well preferably using a repetitive or multichannel pipette 6 Cover the plate with sealing foil and incubate at room temperature for 4045 min on a horizontal plate shaker approximately 500 700 rpm 7 Repeat the washing steps as described above three times with 300 uL Washing Solution per well 8 Add 100 uL Substrate Solution to each well preferably using a repeti tive or multichannel pipette 9 Incubate the plate at room temperature without shaking for 20 30 minutes protected from light 10 Optional Add 100 uL 1M NaOH stop solution to each well if a fixed incubation period is required 11 Read the optical density OD values at 405 nm using an ELISA reader If the plate reader has this option shake the plate briefly 2 3 seconds before reading Optional Reduced incubation time manual procedure The incubation time can be reduced to 30 5 min without changing the results A reduction in OD values may be observed and the maximum OD value for the top standard 500 ng mL may fall below the recommended 1 800 but this does not affect the results 10 RESULTS 10 1 Quality Control Values Anew standard curve must be included in each run The positive controls should be included in each run The value of the controls should be within the limits printed on the vial labels As a guide the OD value of Calibrator 5 500 ng mL should be gt 1 6 and the OD
78. e och r proportionell mot kalprotektinkoncentrationen i kalibratorerna och proverna Analysen kali 44 breras med kalprotektin som renats fran leukocytextrakt 4 MATERIAL 4 1 Reagenser som ingar i kitet Bestruken mikrotiterplatta 12 remsor 8 brunnar per remsa bestrukna med affinitetsrenade monoklonala musantikroppar som r specifika f r kalprotektin Plattan f rvaras i en f rsluten p se med torkmedel DILBUF 5x Provspadningsbuffert 5x konc 1 x 20 ml 5x koncen trat for spadning med destillerat avjoniserat vatten pH 8 0 2 gulfargad l sning flaska med bl tt lock Tv ttbuffert 20x konc 1 x 50 ml 20x koncentrat f r sp dning med destillerat avjoniserat vatten f r tv ttning av mikrotiterb runnarna pH 7 8 0 2 of rgad l sning flaska med vitt lock EXTRBUF 2 5X Fekalextraktionsbuffert 2 5x konc 2 x 90 ml 2 5x koncentrat f r sp dning med destillerat avjoniserat vatten pH 8 0 2 of rgad l sning flaskor med vita lock CAL 1 5 Kalprotektinkalibratorer och BLANK 6 flaskor med 1 ml gulfargad l sning som r f rdig att anv nda flaskor med lock i olika f rger Blank Bl tt lock 0 ng ml Kalibrator 1 Gr nt lock 7 8 ng ml Kalibrator 2 Gult lock 31 3 ng ml Kalibrator 3 R tt lock 62 5 ng ml Kalibrator 4 Vitt lock 125 ng ml Kalibrator 5 Svart lock 500 ng ml CONTROL CONTROL HIGH Kontroller L g och H g 2 flaskor med 1 ml gulf rgad l sn
79. ecesextrakt sp dda 1 100 eller EDTA plasmaprover sp dda 1 20 med det ELISA f rfarande som beskrivs i avsnitt 9 54 Precision i interanalys och intraanalys fran fecesextrakt och i in traanalys fran EDTA plasma Interanalysprecision Intraanalysprecision Intraanalysprecision fecesextrakt fecesextrakt EDTA plasma Koncentra CV Koncentra CV Koncen CV tion i feces tion i feces tration i mg kg mg kg plasma ug l 32 1 13 28 7 6 7 166 3 8 171 6 0 173 3 6 740 47 368 48 385 41 1160 2 9 583 6 1 592 4 0 1360 3 5 1215 6 8 1210 4 2 2980 3 2 1977 7 9 1966 5 0 3660 10 Medelresultat fran tre olika laboratorier som vardera testade tva olika kitpartier 6 prover testades sammanlagt 10 ganger under 5 dagar Medelresultat fran tre olika laboratorier som vardera testade tva olika kitpartier 6 prover testades med 10 replikat i en k rning Testat med ett kitparti 6 prover spaddes 1 20 och testades med 10 replikat i en k rning Pavisning Feces 85 105 testat med fekalextrakt spetsat med renat kalprotektin pa fem olika nivaer Plasma 81 105 testat med plasma spetsad med renat kalprotektin pa fem olika nivaer Kvantifieringsgrans 5 ng ml testad med fecesextrakt plasma och renat kalprotektin Prov erna analyserades fem ganger under fem dagar CV medelvardet f r de olika proverna och bestamningarna pa den har nivan var 12 Detektionsgr ns lt 5
80. edell pH 8 0 0 2 keltainen liuos pullossa sininen korkki pesupuskurikonsentraatti 20x konsentraatti 1 x50 ml 20x konsentraatti laimennetaan tislatulla deionisoidulla vedell kuoppalevyn pesuun pH 7 8 0 2 kirkas liuos pullossa valkoinen korkki FEC EXTRBUF 25X ulosten ytepuskurikonsentraatti 2 5x konsentraat ti 2 x 90 ml 2 5x konsentraatti laimennetaan tislatulla deionisoidulla vedella pH 8 0 0 2 kirkas liuos pulloissa valkoiset korkit CAL 1 5 kalprotektiinin kalibraattorit ja BLANK 0 n yteliuos 6 kpl 1 0 ml n pulloja k ytt valmis keltainen liuos ampulleissa eriv riset korkit Blank Sininen korkki 0 ng ml Kalibraattori 1 Vihre korkki 7 8 ng ml Kalibraattori 2 Keltainen korkki 31 3 ng ml Kalibraattori 3 Punainen korkki 62 5 ng ml Kalibraattori 4 Valkoinen korkki 125 ng ml Kalibraattori 5 Musta korkki 500 ng ml CONTROL CONTROL HIGH Matala ja korkea kontrolli 2 kpl 1 0 ml n ampullia k ytt valmiita keltainen liuos matala kontrolli ampulli jossa ruskea korkki korkea kontrolli ampulli jossa violetti korkki 26 CONJ Konjugaattiliuos 13 ml em ksist fosfataasi leimattua af finiteetti puhdistettua polyklonaalista kanin kalprotektiini vasta ainetta k ytt valmis punainen liuos 25 ml n Dynex reagenssiputki jossa valkoinen korkki Substraattiliuos pNPP 13 ml k ytt valmis kirkas tai vaalean keltainen liuos l pin kym t n pullo jossa
81. er entre la ni ez tem prana y el final de la edad adulta y el diagn stico suele ser tard o debido a la vaguedad de los s ntomas o la renuencia a someterse a endoscopias y biopsias BIOHIT Calprotectin ELISA puede contribuir a un diagn s tico m s temprano de las El ya que la prueba suele arrojar un resultado 81 positivo cuando hay una El activa Los trastornos funcionales como el s ndrome del intestino irritable SII no provocan un aumento de la concentraci n de calprotectina fecal a diferencia de los trastornos abdominales org nicos como las El Los pacientes con trastornos abdominales org nicos y funcionales pueden tener s ntomas similares y la exploraci n cl nica por s sola puede no ser suficiente para obtener un diagn stico espec fico La prueba de calpro tectina fecal es un m todo sencillo no invasivo econ mico y objetivo que puede ayudar a seleccionar pacientes para someterlos a explora ciones adicionales como la endoscopia Los sintomas abdominales son muy frecuentes tanto en nifios como en adultos y un resultado negativo medido por BIOHIT Calprotectin ELISA puede descartar con un gran ndice de probabilidad las enteropat as inflamatorias La curaci n de la mucosa es el objetivo principal del tratamiento de las El y una prueba de calprotectina fecal demuestra si dicha curaci n se ha producido Muchos pacientes de El en remisi n cl nica con niveles normales de prote na C reactiva PCR siguen tenie
82. es and high Calprotectin levels have been found in patients with bacterial infections 15 16 sepsis and inflammatory conditions like rheu matoid arthritis RA and Systemic Lupus Erythematosus SLE 1721 Scientific papers show that Calprotectin in serum plasma is a superior marker of disease activity in RA and SLE and can predict flares It is also a good marker of acute coronary artery events leading to myocardial infarction 22 24 3 PRINCIPLE OF THE TEST The BIOHIT Calprotectin ELISA is based upon preparation of an extract of feces using Fecal Extraction Buffer The level of Calprotectin is deter mined by testing the extract in an enzyme linked immunoassay ELISA specific for Calprotectin In the ELISA samples and calibrators are incubated in separate microti ter wells coated with monoclonal antibodies which bind the Calprotectin After incubation and washing of the wells bound Calprotectin is allowed to react with enzyme labelled immunoaffinity purified Calprotectin spe cific antibodies After this reaction the amount of enzyme bound in the microtiter wells is proportional to the amount of Calprotectin in the sam ple or calibrator which is determined by incubation with a substrate for the enzyme giving a colored product The color intensity is determined by absorbance using an ELISA plate reader and is proportional with the concentration of Calprotectin in the calibrators and samples The assay is calibrated using Calprotectin pu
83. extrait dilu poss de une valeur de 100 ng ml la concentration dans l chantillon original de selles tait de 100 x 5 500 mg kg Remarque Si les extraits ont t dilu s davantage ou moins que la valeur recommand e de 1 100 le facteur de dilution suppl mentaire doit tre saisi dans le calcul 3 OD 405 nm 200 300 Concentration ng mL Calprotectin std A 0 086151 B 1 0906 C 146 71 D 2 9173 d 0 0048461 r 0 99996 73 Figure 1 Courbe talon repr sentative utilisant un ajustement de courbe 4 param tres 10 3 Interpr tation des r sultats Les valeurs suivantes de calprotectine dans les chantillons de selles sont issues de la bibliographie 3 25 Valeur normale 5 50 mg kg Valeur positive gt 50 mg kg Valeur moyenne chez des patients atteints de cancers 350 mg kg colorectaux symptomatiques Maladie inflammatoire chronique intestinale active 200 40 000 mg kg Le diagnostic ne doit pas toutefois pas tre tabli sur la seule base d un r sultat de test II doit prendre en consid ration le dossier clinique et les sympt mes Les valeurs suivantes de calprotectine ont t relev es chez 100 don neurs de sang sains 50 hommes et 50 femmes Type d chantillon Moyenne pg L cart type Plasma EDTA 627 307 11 LIMITATIONS DE LA PROC DURE Le diagnostic ne doit pas tre tabli sur la seule base d un r sultat de test 12 CARA
84. flammation in children with inflammatory bowel disease J Pediatr Gastroenterol Nutr 2007 45 4 414 420 24 Johne B et al A new fecal calprotectin test for colorectal neoplasia Scand J Gastroenterol 2001 36 291 296 121 ORDERING INFORMATION TILAUS INFORMAATIO BESTALLNINGSINFORMATION INFORMATION CONCERNANT LA COMMANDE INFORMACION DE PEDIDOS INFORMAGOES PARA COMPRA BIOHIT Calprotectin ELISA kit Cat No 602 260 Headguarters P konttori Huvudkontor Siege principal Sede centrale Sede BIOHIT OYJ Laippatie 1 00880 Helsinki Finland Tel 358 9 773 861 Fax 358 9 7738 6200 E mail info biohit fi www biohithealthcare com 122 L0 0L6007
85. he 4 1 Pakkaukseen sis ltyv t reagenssit nns 4 2 Pakkaukseen sis ltyv t materiaalit 4 3 Tarvittavat materiaalit jotka eiv t sis lly toimitukseen as WSAILYVYYS JA S ILYTYS Len mia dias REAGENSSIEN VALMISTAMINEN sveis seisis 6 1 Paallystetyn kuoppalevyn liuskat 5 6 2 N ytteen laimennuspuskuri nn a naamaan 6 3 POSOPUSKU ii 6 4 Ulostenaytepuskuri as 6 5 Kalibraattorit 0 n yteliuos ja kontrollit eKOMUGAAINUOS ccoo circense crea panic ou Til WIOSLEMAYME CE sn es ras rca 7 1 1 Uuttaminen BIOHIT uuttamisputkien avulla 7 1 2 Uuttaminen punnitusmenetelm ll ilman uuttamislaitetta 30 7 2 Plasma ja seerumin ytteet ouuususss n n taanneet 8 SUOSITELTU LEVYN PIPETOINTIKAAVIO A 9 TESTIMENETELM iii 9 1 Menetelmi koskevia huomioita nsnnsssssssseessersesrenrenrenrenrennnnnnn nn 9 2 ELISA menetelm 10 TULOKSET 10 1 Kalibroidut kontrollien raja arvot 10 2 Tulosten laskenta 10 3 Tulosten tulkinta 11 TOIMENPITEEN RAJOITUKSET 12 TESTIN SUORITUSARVOT N 13 VAROITUKSET JA VAROTOIMENPITEET 38 13 1 Huomioitava h vitett ess 40 1 K YTT TARKOITUS BIOHIT kalprotektiini ELISA on kvantitatiivinen menetelm kalprotekti inin m ritt miseen ulosten ytteist Sit voida
86. ina FA y purificados mediante inmunoafinidad en un amortiguador con estabilizantes conservantes y un tinte rojo in erte La soluci n viene lista para usar El tubo encaja directamente en los instrumentos autom ticos Dynex DS2 y DSX ELISA 86 6 7 Soluci n de sustrato El frasco contiene 13 ml de soluci n de p nitrofenilfosfato pNPP La soluci n viene lista para usar y debe almacenarse en su frasco opaco original Nota Si se usa un instrumento autom tico Dynex DS2 o DSX ELISA la soluci n de sustrato enzim tico debe transferirse a un tubo de reactivo Dynex de 25 ml antes de realizar el an lisis Debe evitarse transferir los sedimentos de estabilizaci n 7 OBTENCION Y PREPARACION DE MUESTRAS BIOHIT Calprotectin ELISA se ha elaborado y validado principalmente para muestras fecales pero tambi n puede usarse con muestras de plasma suero 7 1 Muestras fecales Dado que la calprotectina es muy estable en las heces los pacientes pu eden obtener peque as muestras fecales en casa Se debe recoger una muestra de 1 5 g aproximadamente una cucharadita introducirla en un recipiente limpio apropiado y enviarla al laboratorio lo antes posible en un plazo maximo de cuatro dias Si se introduce en un recipiente apto para el transporte puede enviarse por correo ordinario es decir no se necesita refrigeraci n Debe evitarse exponer la muestra a temperaturas superiores a 30 C Las muestras tambi n pueden almacenarse congela
87. incubaci n y el lavado de los pocillos la calprotectina fijada puede reaccionar con anticuerpos especificos para la calprotectina marcados enzimaticamente y purificados mediante inmunoafinidad Tras esta reac ci n la cantidad de enzima fijada en los pocillos es proporcional a la cantidad de calprotectina que hay en la muestra o el patr n que viene determinada por la incubaci n con un sustrato para la enzima lo que resulta en un producto coloreado La intensidad del color viene determi nada por la absorbencia utilizando un lector de placas ELISA y es propor cional a la concentraci n de calprotectina en los calibradores y muestras El an lisis se calibra mediante calprotectina purificada procedente de extracto de leucocitos 4 MATERIALES 4 1 Reactivos facilitados con el kit Placa de pocillos recubiertos 12 tiras 8 pocillos por tiras recubiertas con anticuerpos murinos monoclonales purificados mediante afinidad es pec ficos para la calprotectina La placa viene almacenada en una bolsa sellada con desecante DILBUF 5x Amortiguador para diluci n de muestras conc 5x 1 unidad de 20 ml en concentraci n 5x para diluir en agua destilada desionizada soluci n de color amarillo con pH 8 0 0 2 frasco con tap n azul Amortiguador para lavado conc 20x 1 unidad de 50 ml en concentraci n 20x para diluir en agua destilada desionizada para el lavado de los pocillos soluci n transparente con pH 7 8 0 2 fra
88. ing som r f rdig att anv nda Ktr L g flaska med brunt lock Ktr H g flaska med lila lock CONJ Konjugatl sning 113 ml alkaliska fosfatasmarkta immunoaf finitetsrenade polyklonala kaninantikroppar mot kalprotektin rodfargad l sning som ar fardig att anv nda 25 ml Dynex reagensr r med vitt lock Substratl sning pNPP 13 ml of rgad till svagt gulf rgad l sn 45 ing som ar fardig att anvanda ogenomskinlig flaska med gult lock Flas kan innehaller stabiliserande pellets Obs Om ett Dynex instrument anv nds m ste substratet verf ras till ett 25 ml Dynex reagensr r innan testet k rs E Inneh ller 0 1 kathon Inneh ller lt 0 1 natriumazid Inneh ller 0 1 kathon och lt 0 1 natriumazid Inneh ller 0 02 metylisotiazolon och 0 02 bromnitrodioxan pi p 4 2 Material som ing r i kitet 2 bitar f rslutningsfolie e 1 testprotokoll 1 plattlayout 4 3 Material som kr vs men ej medf ljer Destillerat avjoniserat vatten Extraktionsinstrument se avsnitt 7 1 1 och 7 1 2 Brytbara ymp glor f r eng ngsbruk om vagningsmetoden i avsnitt 7 1 2 anv nds K nslig digitalvag 40 150 mg om vagningsmetoden i avsnitt 7 1 2 anvands Polystyrenr r med skruvlock f r engangsbruk 5 ml om vagningsme toden i avsnitt 7 1 2 anv nds Vortexblandare Eng ngsr r f r sp dning av prover Eppendorf r r eller liknande om analysen utf rs manuellt Pipetter f
89. io com uma ansa de inocula o Retirar aproximadamente 100 mg entre 40 e 120 mg de fezes com a ansa de inocula o e coloc las no tubo com tampa de rosca Evitar a extra o de material s lido e n o digerido como fibras e sementes Pesar o tubo e a ansa com as fezes para obter o peso l quido das fezes Quebrar ou cortar a metade superior da haste da ansa e deixar a metade inferior no interior do tubo Adicionar o tamp o de extra o at obter uma rela o peso vol ume de 1 50 por exemplo 4 9 mL de tamp o para 100 mg de fezes Fechar o tubo Misturar energicamente durante 30 segundos num agitador vortex Continuar a mistura num agitador a aprox 1000 rpm durante 30 5 minutos com a ansa no interior do tubo a servir de agitador Deixar repousar alguns minutos na bancada para que as part culas assentem e pipetar cuidadosamente a partir da parte superior do tubo N o necess ria centrifuga o No entanto se for necess ria uma solu o sem part culas pode ser realizado um pequeno ciclo de centrifuga o O extrato que representa uma dilui o de 1 50 peso volume da amostra de fezes est pronto para a dilui o e o teste Para armazenar transferir cerca de 0 5 mL para um novo tubo Os extratos podem ser armazenados a 2 8 C durante pelo menos 108 cinco dias ou congelados a menos de 20 C pelo periodo maximo de 2 anos 7 2 Amostras de plasma e soro Para obter os niveis reais de Calprotectin
90. iotarvikkeita Est ristikontaminaatio l k vaihda reagenssipullojen korkkeja kes ken n Sulje reagenssien pullot tiukasti heti k yt n j lkeen v ltt ksesi haih tumista ja mikrobikontaminaatiota Tarkista ensimm isen k yt n ja sit seuraavan s ilytyksen j lkeen konjugaatin kalibraattorien ja kontrollien pullot mikrobikontaminaation varalta ennen uudelleenk ytt V lt ksesi ristikontaminaatio ja virheellisen korkeat testitulokset pi petoi kalibraattorit kontrollit ja ulosteuuten ytteet ja annostele kon jugaatti ja substraatti tarkasti ja l ikytt m tt kuoppalevyn kuopan pohjalle Jotkin reagenssit sis lt v t natriumatsidia alle 0 1 w v ja tai 0 1 Kathonia S ilyt substraattiliuos alkuper isess l pin kym tt m ss pullossa liuoksen tulee olla kirkasta tai vaaleankeltaista Sekoita varovasti en nen k ytt BIOHIT kalprotektiini ELISA testi on tarkoitettu sellaisten p tevien 39 ammattilaisten k ytt n jotka tuntevat hyv t laboratoriok yt nn t 13 1 Huomioitava h vitett ess Kemikaalien ja liuosten j mi tulee yleisesti k sitell ongelmaj tteen T m nkaltaisen j tteen h vitt misest on s detty kansallisissa ja al ueellisissa laeissa ja s d ksiss Ota yhteytt paikallisiin viranomaisiin ja j tteenk sittely yhti ihin jotka neuvovat vaarallisen j tteen h vit t misess 14 TAKUU Valmistaja lupaa korvata kaikki sen tuotteissa l
91. is not liable for false results and inci dents for these reasons The manufacturer is not liable for any results by visual analysis of the patient samples Only for in vitro diagnostic use All components of human origin used for the production of these rea gents have been tested for anti HIV antibodies anti HCV antibodies and hepatitis B antigen Bag and have been found to be non reactive Nevertheless all materials should be regarded and handled as poten tially infectious Do not interchange reagents or strips of different production lots Do not use reagents from other manufacturers with reagents of this test kit Do not use reagents after expiry date stated on the label or after 1 month of preparation of concentrated reagents to working solutions Use only clean pipette tips dispensers and lab ware To prevent cross contamination do not interchange screw caps of rea gent vials Close reagent vials tightly immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination 20 After first opening and subsequent storage check conjugate calibra tors and control vials for microbial contamination prior to further use To avoid cross contamination and falsely elevated results pipette cali brators control and fecal extract samples and dispense conjugate and substrate accurately to the bottom of microplate wells without splash ing Some reagents contain sodium azide at less than 0 1 w v and or 0 1 Kathon
92. it r f 602 270 7 1 2 Extraction l aide de la m thode de pes e sans dispositif d extraction 1 2 68 Peser tarer un tube bouchon vissant vide avec une boucle d inoculation Pr lever env 100 mg entre 40 et 120 mg de selles a l aide de la boucle d inoculation et l introduire dans le tube bouchon vissant Eviter de pr lever des mati res solides non dig r es telles que des fibres et des graines Peser le tube et la boucle avec les selles pour obtenir le poids net de selles Casser ou couper la moiti sup rieure du manche de la boucle et lais ser la partie inf rieure l int rieur du tube Ajouter le tampon d extraction jusqu a un rapport poids volume de 1 50 par exemple 4 9 ml de tampon pour 100 mg de selles Fermer le tube M langer soigneusement pendant 30 secondes l aide d un vortex Continuer m langer avec un vibreur agitateur env 1 000 tr min pendant 30 5 minutes avec la boucle l int rieur du tube faisant office d agitateur Laisser reposer pendant deux minutes sur la paillasse pour que les particules se d posent et pipetter soigneusement la partie sup rieure du tube La centrifugation n est pas n cessaire mais elle peut tre r alis e pendant un bref intervalle de temps si l on souhaite une solu tion exempte de particules 9 L extrait qui repr sente une dilution au 1 50e poids volume de l chantillon de selle
93. itt edustavan kalibraattorik yr n 10 2 Tulosten laskenta Kalprotektiinipitoisuuden laskeminen potilaan ulosten ytteest 1 Laske kaikkien kaksoism ritysten 0 n yteliuos kalibraattorit ja n yt teet keskim r iset OD arvot 2 Merkitse 0 n yteliuoksen ja jokaisen kalibraattorin ja pitoisuuden ng ml arvo X akselille vastaamaan sen Y akselilla olevaa OD keskiar voa piirt ksesi standardik yr n Neliparametrist sovitusk yr curve fit function suositellaan k ytett v ksi katso kuva 1 alla Jos logaritminen x akseli on tarpeen arvoa 0 001 ng ml tulee k ytt 0 n yteliuokselle 0 ng ml 3 M rit kalprotektiinipitoisuus laimennetuissa n ytteiss ng ml OD arvojen perusteella k ytt m ll kalibrointik yr 4 Kerro kalprotektiinipitoisuus ng ml laimennetuissa ulosten yt 34 teiss viidell jotta voit muuntaa ne yksikk n mg kg kalprotek tiinia alkuper isess ulosten ytteess T m korjaa laimennoksen suhteessa 1 5000 1 50 uuttamisvaiheessa ja sit seuraava uutteen laimennus 1 100 ja muuttaa arvon yksik ist ng ml yksikk n mg kg Esimerkki jos laimennetun uutetun n ytteen arvo on 100 ng ml alku per isen ulosten ytteen pitoisuus on 100 x 5 500 mg kg Huomautus Jos uutteita on laimennettu suositeltua suhdetta 1 100 enem m n tai v hemm n lis laimennuskerroin tulee huomioida laskelmissa 3 OD 405 nm 20 300 400 500 Concentration
94. iza o prevista dos Produtos incluindo sem limita o as fun es descritas nas especifica es Biohit para os Produtos NO ENTANTO QUALQUER GARANTIA SER CONSIDERADA NULA SE A FALHA FOR CAUSADA POR TRATAMENTO INADEQUADO UTILI ZA O INADEQUADA DANOS ACIDENTAIS ARMAZENAMENTO INCORRETO OU USO DOS PRODUTOS PARA OPERA ES FORA DE SUAS LIMITA ES ESPECIFICADAS OU FORA SUAS ESPECIFI CA ES CONTR RIAS S INSTRU ES DETERMINADAS NO MANUAL DE INSTRU ES O per odo dessa garantia definido no manual de instru es dos Produtos e come ar a partir da data em que o Produto relevante for enviado pela Biohit Esse kit de diagn stico Biohit foi fabricado de acordo com os protocolos de gest o de qualidade ISO 9001 ISO 13485 Em caso de lit gio de interpreta oo texto em Ingl s aplica 118 15 RESUMO BREVE DO PROCEDIMENTO Kit BIOHIT Calprotectin ELISA para an lise de Calprotectina nas fezes Consultar as sec es 7 9 no folheto informativo para obter uma de scri o completa dos passos pr ticos e para a an lise de plasma soro Extra o Realizar a extra o de acordo com um dos m todos descritos na sec o 7 1 1 7 1 2 ELISA procedimento manual Diluir os extratos de fezes na propor o de 1 100 no Tamp o de di lui o da amostra Adicionar 100 uL de calibradores controlos solu es em branco e amostras placa ELISA Incubar num agitador de placas temperatura ambiente durante 40 5
95. jan toimesta varmistettu k ytt n soveltuvaksi toimivaksi ja turvalliseksi Sen vuoksi k ytt ohjeessa esitettyj k ytt ohjeita tietoja varatoimia ja varoituksia on seurattava tarkasti Testikitin soveltuvuus k ytett v k si analysaattoreiden tai vastaavien laitteiden kanssa tulee validoida Kaikki muutokset koskien muotoilua kokopanoa ja testin suoritu sohjetta sek i kaikki yhteisk ytt muiden sellaisten tuotteiden kanssa joita valmistaja ei ole hyv ksynyt ovat kiellettyj ja k ytt j on itse vastuussa muutoksista Valmistaja ei ole vastuussa edell mainituista syyst johtuvista virheellisist tuloksista tai tapaturmista Valmistaja ei ole vastuussa potilasn ytteiden visuaalisesta analysoinnista Ainoastaan in vitro diagnostiseen k ytt n Kaikki n iden reagenssien valmistuksessa k ytetyt ihmisper iset ain eet on testattu HIV vasta aineiden HCV vasta aineiden ja hepatiitti B antigeenien Bag suhteen ja ne on todettu negatiivisiksi Kuitenkin kaikkia materiaaleja on k sitelt v potentiaalisesti tartuntavaarallisina l vaihda reagensseja tai liuskoja tuote erien v lill l k yt t m n testin reagensseja yhdess toisten valmistajien rea genssien kanssa l k yt reagensseja niiden etikettiin merkityn viimeisen k ytt p iv n j lkeen tai yhden kuukauden j lkeen siit kun konsentraateista on valmistettu k ytt liuos K yt vain puhtaita pipettik rki annostelijoita ja laborator
96. lton calcium and zinc binding protein released specially from leukocytes in particular polymorphonuclear neutrophilic granulocytes PMN to the gut lumen during intestinal mucosal inflam mation Micro organisms of the bowel stimulate leukocytes to migrate into the gut lumen where they release their contents including antimicrobial substances like Calprotectin This protein constitutes about 60 of total proteins in the cytoplasm of PMNs 2 and can be reliably estimated in fe cal samples stored for up to seven days at ambient temperature 3 Different types of disease for instance bacterial infections rheumatoid arthritis and cancer lead to activation of PMNs and increased levels of Calprotectin in plasma cerebrospinal fluid synovial fluid crevicular fluid urine or other human materials 4 The concentration of Calprotectin in feces is correlated with the number of PMNs migrating into the gut lumen 5 and can be detected reliably even in small less than one gram random stool samples 3 6 Organic diseases of the bowel give a strong Calprotectin signal i e elevations are regularly five to several thousand times the upper reference in healthy individuals 3 79 indicating intestinal inflammation Inflammatory bowel diseases IBD i e ulcerative colitis and Crohn s disease may appear from early childhood to late adulthood and the diagnosis is often delayed due to vague symptoms or reluctance to perform endoscopy and biopsy The BIOH
97. luotet tavasti my s pienist alle gramman painoisista satunnaisista ulos ten ytteist 6 Suoliston elimelliset taudit j tt v t selke n suolistotul ehduksesta kertovan kalprotektiinij ljen tyypillisesti kalprotektiinin arvot nousevat viisi tai monituhatkertaisiksi siit mit terveiden henkil iden arvot enimmill n ovat 9 Tulehdukselliset suolistosairaudet IBD kuten haavainen paksusuolitulehdus ja Crohnin tauti voivat esiintya var haislapsuudesta my h iseen aikuisik n asti ja diagnoosia viiv stytt v t usein vaikeaselkoiset oireet tai vastahakoisuus endoskopian ja biopsian suorittamiseen BIOHIT kalprotektiini ELISA voi t ydent aiempaa di agnoosia tulehduksellisesta suolistosairaudesta IBD sill testi on posi tiivinen aktiivisen IBD n yhteydess Toiminnalliset h iri t kuten rtyv n suolen oireyhtym IBS eiv t aiheu 24 ta lis ntynytt kalprotektiinin pitoisuutta ulosteessa toisin kuin IBD Potilailla joilla on elimellinen tai toiminnallinen vatsavaiva voi olla sa mankaltaisia oireita ja pelkk kliininen tutkimus ei v ltt m tt riit oikean diagnoosin varmistamiseen Kalprotektiinin testaaminen ulosteesta on yksinkertainen ei invasiivinen edullinen ja objektiivinen tapa valikoida potilaita lis tutkimuksiin kuten endoskopiaan Vatsan oireilu on hyvin tavallista sek lapsilla ett aikuisilla ja BIOHIT kalprotektiini ELISA tes till mitatut negatiiviset tulokset voivat
98. m ritet n entsyymi immunologisella menetelm ll ELISA joka on kalprotektiinille spesifinen ELISA testiss n ytteet ja kalibraattorit inkuboidaan erillisill kuoppa levyill jotka on p llystetty kalprotektiinia sitovilla monoklonaalisilla vasta aineilla Inkuboinnin ja kuoppalevyjen pesun j lkeen sitoutuneen kalprotektiinin annetaan reagoida entsyymill leimatun affiniteetti puh distetun kalprotektiinispesifisen vasta aineen kanssa T m n reaktion j lkeen kuoppalevyyn sitoutuneen entsyymin m r on verrannollinen 25 kalprotektiinin m r n n ytteess tai kalibraattorissa mik m ritet n lis m ll kuoppiin substraattia joka reagoi entsyymin kanssa muodos taen v rireaktion V rin intensiivisyys m ritet n mittaamalla kuoppien absorbanssi k ytt en ELISA lukijalaitetta Intensiteetti on suoraan ver rannollinen kalibraattorien ja n ytteen kalprotektiinipitoisuuden kanssa Analyysi kalibroidaan k ytt m ll leukosyyttiuutteesta puhdistettua kal protektiinia 4 MATERIAALIT 4 1 Pakkaukseen sis ltyv t reagenssit P llystetty kuoppalevy 12 liuskaa 8 kuoppaa liuskassa p llystetty affiniteetti puhdistetulla monoklaanisella kalprotektiinispesifisell hiiren vasta aineella Levy on pakattu umpiopakattuun pussiin yhdess kui vausaineen kanssa DILBUF 5x laimennuspuskurikonsentraatti 5x konsentraatti 1 x20 ml 5x konsentraatti laimennetaan tislatulla deionisoidulla v
99. mbios El fabricante no se hace responsable de resultados err neos e incidentes debidos a estos motivos El fabricante no se hace respon sable de los resultados obtenidos por an lisis visual de las muestras de pacientes Solo para uso diagn stico in vitro Todos los componentes de origen humano empleados para la elabo raci n de estos reactivos se han analizado en busca de anticuerpos anti VIH anticuerpos anti VHC y ant geno de la hepatitis B HBsAg se ha determinado que no son reactivos No obstante todos los ma teriales deben considerarse potencialmente contaminados y tratarse como si lo fueran No intercambiar reactivos o tiras de distintos lotes de producci n No usar reactivos de otros fabricantes con reactivos de este kit de an lisis 96 e No usar los reactivos tras la fecha de caducidad indicada en la etiqueta o despu s de un mes de haber convertido reactivos concentrados en soluciones de trabajo Usar solo puntas de pipeta dispensadores y material de laboratorio limpios e Para impedir la contaminaci n cruzada no intercambiar los tapones de rosca de los viales de reactivos e Cerrar los viales de reactivos con firmeza justo despu s de su uso para evitar la evaporaci n y la contaminaci n microbiana Tras haberlos abierto y almacenado comprobar si hay contaminaci n microbiana en los viales de conjugado calibradores y control antes de seguir us ndolos Para evitar la contaminaci n cruzada y resultado
100. minium avec l agent d shydratant fourni Stocker 2 8 C 6 2 Tampon de dilution d chantillon Diluer le tampon de dilution d chantillon concentr 5 x en ajoutant 1 partie 20 ml 4 parties 80 ml d eau distill e d sionis e dans un r cipi ent propre jusqu a un volume final de 100 ml Bien m langer Stocker le tampon de dilution d chantillon dilu dans un r cipient ferm 2 8 C Remarque si l on utilise un syst me automatis Dynex DS2 ou DSX le tampon de dilution d chantillon doit tre transf r dans un tube de r actif Dynex de 25 ml avant de r aliser le test 6 3 Tampon de lavage Diluer le tampon de lavage concentr 20 x en ajoutant 1 partie 50 ml a 19 parties 950 ml d eau distill e d sionis e dans un r cipient propre jusqu un volume final de 1 000 ml Bien m langer Stocker le tampon de lavage dilu dans un r cipient ferm 2 8 C 6 4 Tampon d extraction de selles Diluer le tampon d extraction de selles concentr 2 5 x en ajoutant 1 par tie 90 ml 1 5 partie 135 ml d eau distill e d sionis e dans un r cipi ent propre jusqu un volume final de 225 ml Bien m langer Stocker le tampon dilu dans un r cipient ferm 2 8 C 6 5 Calibrateurs t moins et contr les Les flacons tiquet s comme t moins calibrateurs et contr les con tiennent chacun 1 0 ml de solution pr te usage La concentration de calprotectine est i
101. minutos Lavar os po os tr s vezes com 300 uL de Tamp o de lavagem Adicionar 100 uL de solu o de Conjugado a cada po o Incubar num agitador de placas temperatura ambiente durante 40 5 minutos Lavar os po os tr s vezes com 300 uL de Tamp o de lavagem Adicionar 100 uL de Solu o de substrato a cada po o Incubar com uma cobertura durante 20 30 minutos Opcional adicionar 100 uL de 1M NaOH a cada po o Ler os valores de DO a 405 nm com um leitor ELISA Calcular os resultados por meio da utiliza o de um ajuste de curva de 4 par metros ng mL mg kg nas fezes ng mL x 5 pode ser reduzido para 30 5 minutos se o ensaio for executado manu almente Para qualquer pergunta contactar info biohit fi 119 REFERENCES KIRJALLISUUS HANVISNINGAR REFERENCES REFERENCIAS REFERENCIAS 9 Dale et al Purification and partial characterization of a highly im munogenic human leukocyte protein the L1 antigen Eur J Biochem 1983 134 1 6 Fagerhol MK et al Calprotectin The L1 leukocyte pro tein in Smith VL and Dedman JR eds Stimulus response coupling The role of intracellular calcium binding proteins CRC Press Boca Raton 1990 p 187 210 Roseth AG et al Assessment of the neutrophil dominating protein calprotectin in feces Scand J Gastroenterol 1992 27 793 798 Johne B et al Functional and clinical aspects of the myelomonocytic protein calprotectin J Clin Pathol Mol Pathol 19
102. mprim e sur l tiquette de chaque flacon Les flacons peuvent tre plac s directement dans les syst mes automatis s Dynex DS2 et DSX 6 6 Solution de conjugu Le tube contient 13 ml d anticorps de lapin purifi s par immuno affinit marqu s avec une phosphatase alcaline ALP contre la calprotectine dans un tampon avec des stabilisateurs conservateurs et un colorant rouge inerte La solution est pr te l usage Le tube peut tre plac di 66 rectement dans les systemes automatis s Dynex DS2 et DSX 6 7 Solution substrat La bouteille contient 13 ml de solution de p nitroph nylphosphate pNPP La solution est pr te usage et doit tre conserv e dans sa bouteille opaque originale Remarque Si l on utilise un automate ELISA Dynex DS2 ou DSX la solu tion de substrat enzymatique doit tre transf r e dans un tube de r actif Dynex de 25 ml avant de r aliser le test Eviter de transf rer les granulats de stabilisation 7 PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS Le kit BIOHIT Calprotectin ELISA a t d velopp et valid principale ment pour des chantillons de selles mais il peut galement tre utilis pour des chantillons de plasma s rum 7 1 Echantillons de selles Dans la mesure ou la calprotectine est tr s stable dans les selles les patients peuvent pr lever de petits chantillons de selles chez eux Ef fectuer un pr l vement de 1 5 g environ une petite cuiller le placer
103. n be 12 stored at 2 8 C for at least five days or frozen below 20 C for up to 2 years 7 2 Plasma and serum samples True levels of Calprotectin in serum or plasma require that the protein is not released from neutrophil granulocytes in blood in vitro For plasma EDTA is the preferred anticoagulant Recommended sample preparation procedure 1 Collect blood using vacutainers 2 Centrifuge the blood at 3000 rpm for 10 minutes as soon as possible and no longer than three hours after sampling 3 Harvest only the upper two thirds of the serum or plasma layer by careful pipetting so that leucocytes from the buffy coat are not aspi rated For ELISA dilute the plasma or serum 1 20 e g 50 mL sample 950 mL Sample Dilution Buffer and follow the assay procedure described in Section 9 8 SUGGESTED PLATE LAYOUT 1 2 3 4 etc A Calibrator 5 Calibrator 5 Sample 1 Sample 1 500 ng mL 500 ng mL B Calibrator 4 Calibrator 4 Sample 2 Sample 2 125 ng mL 125 ng mL C Calibrator 3 Calibrator 3 Sample 3 Sample 3 62 5 ng mL 62 5 ng mL D Calibrator 2 Calibrator 2 Sample 4 Sample 4 31 3 ng mL 31 3 ng mL E Calibrator 1 Calibrator 1 Sample 5 Sample 5 7 8 ng mL 7 8 ng mL F Blank 0 ng mL Blank 0 ng mL Sample 6 Sample 6 G Control Low Control Low Sample 7 Sample 7 Control High Control High Sample 8 Sample 8 Suggested ELISA plate la
104. n ennen uuttamista ja testausta V lt n ytteen uudelleenpakastusta ja sulatusta Huomioi ett ulosten ytteen j dytt minen voi joissain tapauksissa johtaa kohon neisiin kalprotektiinipitoisuuksiin todenn k isimmin granulosyyteist va pautumisen seurauksena Huomautus Ennen uuttamisen aloittamista uloste tulee homogenisoida hyvin esimerkiksi lastalla ennen kuin pieni osa erotetaan uuttamista var ten Suosittelemme BIOHIT uuttamisputkien tai jonkin alla kuvatun me netelm n kohdat 7 1 1 ja 7 1 2 k ytt uuttamiseen Tee uuttaminen pakkausselosteen ohjeen mukaisesti sen mukaan mik uuttamisv line tai menetelm on valittu My s muita asiakkaan validoimia menetelmi tai laitteita voi k ytt 7 1 1 Uuttaminen BIOHIT uuttamisputkien avulla K ytt ohjeet Lue tuotteen Ref 602 270 pakkausseloste 7 1 2 Uuttaminen punnitusmenetelm ll ilman uuttamislaitetta 1 Punnitse tyhj n yteputki tyhj paino yhdess inokulaatiosilmukan kanssa 2 Ota silmukan avulla noin 100 mg 40 120 mg ulostetta ja aseta se kierrekorkilliseen n yteputkeen V lt kiinteiden sulamatta j neiden 30 materiaalien kuten kuitujen ja siemenien ottamista 3 Punnitse nayteputki ja silmukka yhdessa ulosteen kanssa jolloin saat laskettua ulosteen nettopainon 4 Murra tai leikkaa silmukan k densijan yl osa irti ja j t alaosa put keen 5 Lis ulosten ytepuskuri painoon m r n suhde 1 50 esimerkiksi
105. na sjunker och pipettera sedan f rsiktigt fr n r rets ppning Centrifugering r inte n dv ndig men en kort centrifugering kan utf ras om en partikelfri l sning beh vs 9 Extraktet som utg r en 1 50 sp dning vikt volym av avf ringsprovet r nu klart f r sp dning och testning 10 Om provet ska f rvaras ska cirka 0 5 ml verf ras till ett nytt r r Ex trakt kan f rvaras vid 2 8 C i minst 5 dagar eller nedfryst under 20 49 C i upp till 2 ar 7 2 Plasma och serumprover For sanna nivaer av kalprotektin i serum eller plasma kravs att proteinet inte fris tts fran neutrofila granulocyter i blodet in vitro F r plasma r EDTA den lampligaste antikoagulantian Rekommenderat provberedningsf rfarande 1 Ta ett blodprov med en vacutainer 2 Centrifugera blodet med 3 000 r min i 10 minuter snarast m jligt men dock senast inom 3 timmar efter provtagningen 3 Samla in endast de vre tv tredjedelarna av serum eller plasmala gret genom f rsiktig pipettering s att leucocyterna i buffy coat lagret inte aspireras Om ELISA anv nds ska plasma eller serum sp das 1 20 t ex 50 ul prov 950 ul provsp dningsbuffert F lj sedan analysf rfarandet enligt anvis ningarna i avsnitt 9 8 F RSLAG TILL PLATTLAYOUT 1 2 3 4 etc A Kalibrator 5 Kalibrator Prov 1 Prov 1 500 ng ml 500 ng ml B Kalibrator 4 Kalibrator 4 Prov 2 Prov 2 125 ng ml
106. ndo inflamaci n 0 reflejada por un aumento de la calprotectina fecal Estos pacientes tienen mayor riesgo de sufrir una reca da al cabo de pocos meses Si se logra la curaci n de la mucosa se reducir el riesgo de reca da y la necesidad de cirug a abdominal mayor 213 La normalizaci n de los niveles de cal protectina indica que se ha logrado la curaci n de la mucosa 4 Nuestra tecnologia ELISA para calprotectina se ha usado tambi n para analizar muestras de suero y plasma y se han detectado niveles elevados de calprotectina en pacientes con infecciones bacterianas 116 septicemia y patologias inflamatorias como artritis reumatoide AR y lupus eritema toso diseminado LED 721 Diversas publicaciones cient ficas demues tran que la calprotectina en suero plasma es un indicador excelente de la actividad de la enfermedad en casos de AR y LED y puede prevenir su reagudizaci n Tambi n es un buen marcador de episodios de la arteria coronaria agudos que conlleven infarto de miocardio 224 3 PRINCIPIO DE LA PRUEBA BIOHIT Calprotectin ELISA se basa en la preparaci n de un extracto de heces mediante un amortiguador para extracci n fecal El nivel de calpro tectina se determina analizando el extracto en un enzimoinmunoan lisis de adsorci n ELISA espec fico para la calprotectina 82 En el ELISA las muestras y calibradores se incuban en pocillos distintos recubiertos de anticuerpos monoclonales que fijan la calprotectina Tras la
107. neenl mm ss 40 5 min vaakatasoisessa levyn ravistimessa noin nopeudella 500 700 r min Toista yll kuvatut pesuvaiheet jokaiselle kuopalle kolme kertaa 300 33 pyL ll pesuainetta 8 Lis 100 uL substraattiliuosta jokaiseen kuoppaan k yt mielell n toistopipetti tai monikanavaista pipetti 9 Inkuboi huoneenl mm ss ala ravista valolta suojattuna 20 30 minuutin ajan 10 Vaihtoehtoinen Lis 100 uL 1 M NaOH pys ytysliuosta jokaiseen kuoppaan jos ennalta m ritetty inkubaatioaika on tarpeen 11 Lue optisen tiheyden OD arvot 405 nm n kohdalla ELISA lukijan avulla Jos levyn lukijassa on ravistelutoiminto ravistele levy hetken 2 3 sekuntia ennen lukemista Vaihtoehtoinen Lyhennetty inkubaatioaika manuaalinen toimenpide Inkubaatioaika voidaan lyhent 30 5 minuuttiin tulosten muuttumatta OD n arvot saattavat laskea ja OD n enimm isarvo yl standardille 500 ng ml voi olla alhaisempi kuin suositeltu 1 800 mutta t m ei vaikuta tuloksiin 10 TULOKSET 10 1 Kalibroidut kontrollien raja arvot e Uusi standardik yr pit sis llytt jokaiseen k ytt kertaan Positiiviset kontrollit pit sis llytt jokaiseen k ytt kertaan Kontrol lien arvojen tulee olla l kepullojen etiketteihin merkittyjen raja arvojen mukaiset Ohjeena on ett kalibraattori 5 n 500 ng ml OD arvon tulee olla 21 6 ja O n yteliuoksen 0 ng ml OD arvon tulee olla lt 0 25 Kuva 1 es
108. ng av slemhinnan har uppn tts 14 Var Calprotectin ELISA teknik har ocks anv nts f r analys av serum och plasmaprover och h ga kalprotektinv rden har p tr ffats hos patienter med bakteriella infektioner 15 16 sepsis och inflammatoris ka tillst nd som reumatoid artrit RA och systemisk lupus erythematosus SLE 1721 Vetenskapliga rapporter visar att kalprotektin i serum plas ma r en verl gsen mark r f r sjukdomsaktivitet vid RA och SLE och kan f ruts ga anfall Det r ocksa en bra mark r f r akuta kranskarlshan delser som leder till myokardiell infarkt 22 24 3 TESTETS PRINCIP BIOHIT Calprotectin ELISA bygger p beredning av ett fecesextrakt med fekalextraktionsbuffert Kalprotektinv rdet best ms genom att testa ex traktet i en enzymkopplad immunadsorberande analys ELISA som r specifik f r kalprotektin ELISA analysen inkuberas prover och standarder i separata mikroti terbrunnar som r bestrukna med monoklonala antikroppar som binder kalprotektin Efter inkubering och tv ttning av brunnarna kan bundet kal protektin reagera med enzymm rkta immunoaffinitetsrenade kalprotek tinspecifika antikroppar Efter denna reaktion r m ngden bundet enzym i mikrotiterbrunnarna proportionell mot m ngden kalprotektin i provet ellerkalibratoren vilket best ms genom inkubering med ett substrat f r enzymet som ger en f rgad produkt F rgens intensitet best ms genom absorbans med hj lp av en ELISA plattl sar
109. ng to ISO 9001 ISO 13485 quality management protocols In case of interpretation disputes the English text applies 21 15 SHORT OUTLINE OF THE PROCEDURE BIOHIT Calprotectin ELISA kit for analysis of Calprotectin in feces Please refer to sections 7 9 in the package insert for a full description of the practical steps and for analysis of plasma serum Extraction Perform extraction according to one of the methods described in section 7414 712 ELISA manual procedure Dilute fecal extracts 1 100 in Sample Dilution Buffer Add 100 uL calibrators controls blank and samples to the ELISA plate Incubate on a plate shaker at room temperature for 40 5 min Wash the wells three times with 300 uL Washing Buffer Add 100 uL of Conjugate solution to each well Incubate on a plate shaker at room temperature for 40 5 min Wash the wells three times with 300 uL Washing Buffer Add 100 uL Substrate Solution to each well Incubate under cover for 20 30 min Optional add 100 uL 1M NaOH to each well Read the OD values at 405 nm using an ELISA reader Using a 4 parameter curve fit calculate the results ng mL mg kg in feces ng mL x 5 can be reduced to 30 5 min if the assay is run manually For questions please contact info biohit fi 22 KAYTTOOHJE BIOHIT Calprotectin ELISA kit Kat nro 602 260 AKAYTTOTARKOITUS 000 a rime Rossas 24 2 TAU STA irte sane ovio 24 3 TESTINIP RIAATE cvs anneau 25 4 MATERIAALIT
110. obkontaminering innan de anv nds Undvik korskontaminering och falskt f rh jda resultat genom att pipet tera standarder kalibratorer och fekalextraktprover och dispensera konjugat och substrat korrekt till botten i mikroplattans brunnar utan st nk Vissa reagenser inneh ller natriumazid med en halt under 0 1 v v och eller 0 1 kathon F rvara substratl sningen i sin ogenomskinliga originalflaska l snin gen ska vara of rgad till svagt gul Blanda varsamt f re anv ndning BIOHIT Calprotectin ELISA r avsedd f r anv ndning av utbildad per sonal med kunskaper i god laboratoriepraxis 57 13 1 Kasseringsh nseenden Rester av kemikalier och beredningar betraktas allmant som riskavfall Kassering av sadant avfall regleras i nationella och lokala f rordningar och best mmelser Kontakta lokala myndigheter eller avfallshanterings f retag som kan ge r d om hur riskavfall ska kasseras 14 GARANTI Biohit ska avhj lpa alla defekter som p tr ffas i n gon Produkt den Defekta produkten som h rr r franolampliga material eller f rsumligt utf rande och som f rhindrar Produkternas mekaniska funktion eller avsedda anv ndning inklusive men inte begr nsat till de funktioner som anges i Biohits Produktspecifikationer EVENTUELL GARANTI BETRAK TAS DOCK SOM OGILTIG OM FELET VISAR SIG HA UPPST TT TILL F LJD AV FELAKTIG HANTERING ELLER ANV NDNING SKADATILL F LJD AV OLYCKSH NDELSE FELAKTIG F RVARING ELLER AN V N
111. olution substrat chaque puits e Couvrir et laisser incuber pendant 20 30 min En option ajouter 100 uL de 1M NaOH chaque puits Lire les valeurs de D O 405 nm l aide d un lecteur ELISA Calculer les r sultats ng ml l aide d un ajustement de courbe 4 param tres mg kg dans les selles ng ml x 5 peut tre r duit 30 5 min si l essai est r alis manuellement Pour toute question pri re de contacter info biohit fi 79 ESPANOL INSTRUCCIONES DE USO BIOHIT Calprotectin ELISA kit Cat N 602 260 ALUSO PREVISTO nue i 81 2 ANTECEDENTE S Se aero cence TiN oktaani m eds 81 3 PRINCIPIO DE LA PRUEBA sas sasgra ta as cias seen ai aac seats 82 4 MATERIALES 4 1 Reactivos facilitados con el kit nannaa 4 2 Materiales facilitados con el kit n rr nn rann 4 3 Materiales necesarios que no se suministran ie ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO 6 PREPARACI N DE LOS REACTIVOS ereta 6 1 Tiras recubiertas de la placa de pocillos x 6 2 Amortiguador para la diluci n de muestras 6 3 Amortiguador para lavado n a naa a nenne 6 4 Amortiguador para extracci n fecal ia 6 5 Calibradores blanco y controles non n nn 6 6 SOMUCION conjugada ici 7 OBTENCION Y PREPARACION DE MUESTRAS TA Muestras fecales viii iii cid 7 1 1 Extracci n mediante tubos de extracci n BIOHIT 88 7 1 2 Extrac
112. on 3 Echantillon 3 62 5 ng ml 62 5 ng ml D Calibrateur 2 Calibrateur 2 Echantillon 4 Echantillon 4 31 3 ng ml 31 3 ng ml E Calibrateur 1 Calibrateur 1 chantillon 5 Echantillon 5 7 8 ng ml 7 8 ng ml F T moin T moin Echantillon 6 Echantillon 6 0 ng ml 0 ng ml G Contr le Contr le Echantillon 7 Echantillon 7 faible faible H Contr le fort Contr le fort Echantillon 8 Echantillon 8 Plan de plaque ELISA sugg r pour les calibrateurs contr les et chantil lons en utilisant la proc dure manuelle Il est recommand de dupliquer les puits pour accro tre la fiabilit des r sultats Una plaque compl te con tient 40 chantillons 9 PROC DURE DE TEST La proc dure suivante correspond un essai manuel Des protocoles vali d s pour les syst mes automatis s Dynex DS2 et DSX sont disponibles sur demande Les flacons des calibrateurs t moins et contr les positifs ainsi que le tube de conjugu peuvent tre directement plac s dans les syst mes automatis s DS2 ou DSX D autres instruments automatis s ELISA peuvent tre utilis s mais ils doivent tre valid s par le client 9 1 Remarques concernant la proc dure suivre Pr paration Lire soigneusement le protocole avant d effectuer le test La fiabilit du r sultat d pend du strict respect du protocole de test tel qu il est d crit Avant de commencer le test un plan de la plaque avec tou
113. onar resultados da amostra entre 25 mg kg LoQ e 2500 mg kg nas fezes Os extratos com valores mais elevados de Calprotectina podem ser mais dilu dos gt 1 100 e testados novamente caso seja necess rio um valor Os extratos com valores baixos de Cal protectina podem ser menos dilu dos 1 50 O fator de dilui o ajusta do deve ser tido em conta ao fazer a convers o entre ng mL e mg kg consultar a sec o 10 abaixo Execute todos os passos do ensaio segundo a ordem indicada e sem qualquer atraso consider vel entre eles Deve ser utilizada uma ponta de pipeta descart vel e limpa na dis tribui o de cada solu o padr o controlo e amostra Para obter os resultados mais fi veis as solu es em branco os con trolos e as amostras do doente devem ser sempre processados em duplicado Todas as amostras e reagentes do kit devem ser estabilizados tem 110 peratura ambiente 18 25 C antes do inicio do teste 9 2 Procedimento ELISA 1 Diluir as amostras dos extratos de fezes numa propor o de 1 100 por exemplo 10 uL de amostra 990 uL do Tamp o de dilui o da amostra e misturar bem por vortex 2 Adicionar 100 uL de cada solu o em branco calibrador controlo e amostra dilu da a po os duplicados consultar a disposi o recomen dada da placa na Sec o 8 3 Cobrir a placa com uma pel cula vedante e incubar temperatura ambiente durante 40 5 minutos num agitador de placas horizontal
114. os con valores de calprotectina bajos pueden diluirse menos 1 50 El factor de diluci n ajustado debe tenerse en cuenta al convertir de ng ml a mg kg v ase la secci n 10 m s adelante Llevar a cabo todos los pasos del an lisis en el orden indicado y sin demoras apreciables entre ellos Debe usarse una punta de pipeta limpia y desechable para dispensar cada patr n control y muestra Para obtener unos resultados lo m s fiables posible los blancos cali bradores controles y muestras de pacientes deben analizarse siempre por duplicado Todas las muestras y reactivos del kit deben equilibrarse a tempera tura ambiente 18 25 C antes de empezar el an lisis 90 9 2 Procedimiento de ELISA 1 8 9 Diluir las muestras de extracto de heces a 1 100 p ej 10 ul de mues tra 990 ul de amortiguador para diluci n de muestras y mezclar bien mediante el agitador vortex A adir 100 ul de cada blanco calibrador control y muestra diluida en pocillos duplicados v ase el esquema de placa recomendado en la secci n 8 Tapar la placa con una l mina de sellado e incubar a temperatura ambiente durante 40 5 minutos en un agitador de placas horizontal aproximadamente a 500 700 rpm Al final del tiempo de incubaci n retirar el l quido y lavar los pocil los afiadiendo 300 ul de amortiguador para lavado a cada pocillo Retirar tanto l quido como sea posible y repetir hasta que se hayan realizado un total
115. os foram analisados no ELISA Resultados m dios de tr s laborat rios distintos e um lote de kit Amostra Concentra o mg kg CV Low 130 8 7 High 1357 8 8 115 Linearidade extratos de fezes Os extratos de fezes n 10 foram diluidos a 1 100 e 1 1000 e analisados no ELISA Resultados m dios Dilui o da dilui o de 1 100 1 100 100 1 400 103 1 700 105 1 1000 107 Tenha em aten o que foi observada uma varia o amostral na lineari dade Linearidade plasma EDTA As amostras de plasma n 5 foram dilu das a 1 20 e a 1 80 e analisadas no ELISA Resultados m dios Dilui o da dilui o de 1 20 1 20 100 1 40 107 1 80 116 Tenha em aten o que foi observada uma varia o amostral na lineari dade 13 AVISOS E PRECAU ES Em conformidade com o par grafo 2b do artigo 1 da diretiva europeia 98 79 CE a utiliza o dos dispositivos m dicos para diagn stico in vitro prevista pelo fabricante para assegurar a adequa o o desem penho e a seguran a do produto Por conseguinte o procedimento de teste as informa es as precau es e os avisos presentes nas in stru es de utiliza o devem ser rigorosamente seguidos A utiliza o de kits de teste com analisadores e equipamento semelhante n o foi validada N o permitida qualquer altera o a n vel de conce o composi o e procedimento de teste
116. ostic est souvent retard en raison de sympt mes vagues ou d une r ticence pratiquer Pendoscopie et la biopsie Le kit BIOHIT Calprotectin ELISA peut con 61 tribuer a un diagnostic plus pr coce des MICI dans la mesure ou le test est g n ralement positif sur les MICI actives Des troubles fonctionnels comme le c lon irritable ne provoquent pas d augmentation de la concentration de calprotectine dans les selles mais des troubles abdominaux organiques semblables a ceux provoqu s par les MICI Les patients atteints de troubles abdominaux organiques et fonctionnels peuvent montrer des sympt mes similaires et un examen clinique peut ne pas tre suffisant lui seul pour tablir un diagnostic sp cifique Le test de la calprotectine f cale est une m thode simple non invasive peu co teuse et objective pouvant aider a s lectionner les patients sur lesquels pratiquer un examen suppl mentaire comme une endoscopie Les sympt mes abdominaux sont tr s fr quents chez les enfants et les adultes et un r sultat n gatif mesur par le kit BIOHIT Calprotectin ELISA permet d carter avec une forte probabilit le risque de troubles intestinaux inflammatoires La cicatrisation de la muqueuse est l objectif ultime de tout traitement contre les MICI et le test de la calprotectine f cale permet de savoir quand celui ci est atteint Beaucoup de patients atteints de MICI en r mission clinique avec des niveaux de prot ine C
117. ow Control Matala kontrolli L g kontroll High Control Korkea kontrolli H g kontroll Conjugate Konjugaattiliuos Konjugat Substrate Substraattiliuos Substrat Frangais Espanol Portugu s Utilisation r serv e au diagnostic in vitro Para uso diagn stico in vitro Para utiliza o no diagn s tico in vitro Lot C digo de lote C digo de lote Utiliser avant Fecha de caducidad N o utilizar depois de Conserver une temp rature comprise entre 2 et 8 C Limitaci n de almacenami ento Almacenar a 2 8 C Limites de armazenamento Armazenar a 2 8 C Marquage CE Marca CE Marca CE Num ro de r f rence N mero de cat logo N mero de cat logo 96 d terminations 96 determinaciones 96 determina es Ne pas r utiliser No reutilizar N o reutilizar Consulter le mode d emploi Consultar las instrucciones de uso Consultar as instru es de utiliza o Tampon de lavage concen tr 20x Concentrado de amortigua dor para lavado 20x Tamp o de lavagem con centrado 20x Tampon de dilution d chantillon concentr 5x Concentrado de amor tiguador para diluci n de muestras 5x Tamp o de dilui o da amostra concentrado 5x Tampon d extraction de selles 2 5 x Amortiguador para extrac ci n fecal 2 5x Tamp o de extra o de fezes 2 5x T moin Blanco Solu
118. p dningsbuffert Spad den 5x koncentrerade provspadningsbufferten genom att tillsatta 1 del 20 ml till 4 delar 80 ml destillerat avjoniserat vatten i ett rent karl till en slutlig volym p 100 ml Blanda val F rvara den sp dda provsp dn ingsbufferten i ett slutet karl vid 2 8 C Obs Om Dynex DS2 eller DSX ELISA automat anv nds m ste provs p dningsbufferten verf ras till ett 25 ml Dynex reagensr r innan testet k rs 6 3 Tv ttbuffert Sp d den 20x koncentrerade tv ttbufferten genom att tills tta 1 del 50 ml till 19 delar 950 ml destillerat avjoniserat vatten i ett rent k rl till en slutlig volym p 1 000 ml Blanda v l F rvara den sp dda tv ttbufferten i ett slutet karl vid 2 8 C 6 4 Fekalextraktionsbuffert Sp d den 2 5x koncentrerade fekalextraktionsbufferten genom att tills tta 1 del 90 ml till 1 5 delar 135 ml destillerat avjoniserat vatten i ett rent karl till en slutlig volym p 225 ml Blanda v l F rvara den sp dda buffer ten i ett slutet karl vid 2 8 C 47 6 5 Kalibratorer blank och kontroller Flaskorna som ar markta med blank eller kalibrator samt kontrollerna in nehaller 1 ml l sning vardera som ar f rdig att anv nda Kalprotektinkon centrationen ar tryckt pa etiketten pa varje flaska Flaskorna passar direkt i Dynex DS2 och DSX ELISA automater 6 6 Konjugatl sning R ret inneh ller 13 m alkaliska fosfatas markta ALP immunoaffi nitetsrenade polyklon
119. r verf ring av volymer mellan 10 1 000 ul om analysen utf rs manuellt Repeterpipett eller flerkanalspipett 100 ul om analysen utf rs ma nuellt Tv ttinstrument f r mikroplattans brunnar eller flerkanalspipett 300 ul om analysen utf rs manuellt e Plattskak 500 700 r min om analysen utf rs manuellt Timer om analysen utf rs manuellt Mikroplattl sare filter 405 nm om analysen utf rs manuellt e 1M NaOH stoppl sning valfritt 5 STABILITET OCH F RVARING Vid f rvaring i o ppnat skick vid 2 8 C r kitets reagenser stabila fram till det uty ngsdatum som anges p etiketten 46 Oppnade plattor reagenser och koncentrerade buffertar ar stabila i upp till tre manader vid f rvaring vid 2 8 C Arbetsl sningar 1x med tv ttbuffert provsp dningsbuffert och fekalex traktionsbuffert som bereds i rena karl kan f rvaras i upp till en m nad vid 2 8 C Undvik exponering for h g temperatur och direkt solljus 6 REAGENSBEREDNING Lat alla reagenser prover och kontroller anta rumstemperatur 18 25 C innan testet k rs 6 1 Bestrukna remsor f r mikrotiterplatta Plattremsorna som r fardiga att anv nda ar bestrukna med affinitetsre nade monoklonala musantikroppar som r specifika f r kalprotektin Oan v nda remsor ska tas bort fran ramen och genast terf rslutas i foliepas en tillsammans med det medf ljande torkmedlet F rvara vid 2 8 C 6 2 Provs
120. r active CRP normaux souffrent toujours d inflammation 10 refl t e par une augmentation de la calprotectine f cale Ces patients augmentent le risque de rechute au cours des prochains mois 11 Si la cicatrisation des muqueuses peut tre atteinte le risque de rechute et les besoins de chirurgie abdominale majeure diminueront 12 13 Une normalisation des niveaux de calprotec tine signifie que la cicatrisation des muqueuses s est produite 14 Notre technologie Calprotectin ELISA a galement t utilis e pour l analyse d chantillons de s rum et plasma et de hauts niveaux de calprotectine ont t d tect s chez des patients souffrant d infections bact riennes 15 16 de sepsis et de conditions inflammatoires telles que la polyarthrite rhumato de PR et le lupus ryth mateux syst mique LES 17 21 Des publications scientifiques montrent que la calprotectine dans le s rum plasma est un marqueur sup rieur de l activit de la maladie dans le cas de la PR et du LES et peut permettre de pr dire d ventuelles intensifica tions C est aussi un bon marqueur d v nements art riels coronariens aigus conduisant a un infarctus du myocarde 22 24 3 PRINCIPE DU TEST Le kit BIOHIT Calprotectin ELISA repose sur la pr paration d un chantil 62 lon de selles l aide d un tampon d extraction de selles Le niveau de cal protectine est d termin est soumettant l chantillon un test immuno enzymatique EL
121. ratorer blank och kontroller N 6 6 KONJUGAH SNING a 50scsrecserussecresoksunvsdesdersersra eer ess sne ava ist nananana kant 0 70 SUDStratlOSNING s nistsa massaa nc 7 PROVTAGNING OCH BEREDNING 7 1 Fecesprover 7 1 1 Extraktion med BIOHIT extraktionsr r 49 7 1 2 Extraktion med v gningsmetoden utan extraktionsenhet 49 7 2 Plasma och serumprover manninen aan annan aa enenn 50 8 F RSLAG TILL PLATTLAYOUT mnt teaa neen 50 9 TESTF RFARANDE s 9 1 F rklaringar till forfarandet 51 9 2 ELISA forarande cas es suossa taksa seia a e alan 51 10 RESULTAT 10 1 Kvalitetskontrollvarden 10 2 Resultatberakning 10 3 Resultattolkning 11 F RFARANDETS BEGR NSNINGAR 12 KLINISKA PRESTANDA 13 VARNINGAR OCH F RSIKTIGHETS TG RDER 13 1 Kasseringsh nseenden PEN a 15 FORFARANDET KORTHET teette aatteeseen 59 42 1 AVSEDD ANVANDNING BIOHIT Calprotectin ELISA ar en kvantitativ metod for detektion av kalprotektin i avf ringsprover Den kan anv ndas som hj lpmedel till att identifiera organisk sjukdom i tunntarmen tjocktarmen eller mags cken f r att best mma sjukdomsaktiviteten och f lja behandlingsrespons hos patienter med ulcer s kolit eller Crohns sjukdom BIOHIT Calprotectin ELISA har validerats f r avf ringsprover Tes
122. re described in section 7 1 2 and the extracts analysed in the ELISA Mean results from three different laboratories and one kit lot Sample Concentration mg kg CV Low 130 8 7 High 1357 8 8 Linearity fecal extracts Fecal extracts n 10 were diluted 1 100 1 1000 and analysed in the ELISA Mean results Dilution of 1 100 dilution 1 100 100 1 400 103 1 700 105 1 1000 107 Note that sample variation in linearity has been observed 19 Linearity EDTA plasma Plasma samples n 5 were diluted 1 20 1 80 and analysed in the ELI SA Mean results Dilution of 1 20 dilution 1 20 100 1 40 107 1 80 116 Note that sample variation in linearity has been observed 13 WARNINGS AND PRECAUTIONS In compliance with article 1 paragraph 2b European directive 98 79 EC the use of the in vitro diagnostic medical devices is intended by the manufacturer to secure suitability performance and safety of the product Therefore the test procedure the information the precautions and the warnings in the instructions for use have to be strictly followed The use of the test kits with analysers and similar equipment has to be validated Any change in design composition and test procedure as well as for any use in combination with other products not approved by the manufacturer is not authorized the user himself is responsible for such changes The manufacturer
123. re indicatif la valeur de D O du calibrateur 5 500 ng ml doit tre 2 1 6 et celle du t moin 0 ng ml lt 0 25 Une courbe repr sentative de calibrateur est montr e la figure 1 10 2 Calcul des r sultats Calcul de la concentration de calprotectine dans les chantillons de selles des patients 1 Calculer la moyenne des valeurs de D O de toutes les r p titions t moins calibrateurs et chantillons 2 Repr senter sous forme graphique la valeur de concentration du t 72 moin et de chaque calibrateur ng ml sur l axe des abscisses en fonc tion de la valeur moyenne de la D O sur celui des ordonn es pour obtenir une courbe talon Une fonction d ajustement de la courbe a 4 param tres est recommand e voir figure 1 ci dessous Si un axe des abscisses logarithmiques est requis une valeur de 0 001 ng ml doit tre utilis e comme talon A 0 ng ml 3 Utiliser la courbe d talonnage pour d terminer la concentration en calprotectine dans les chantillons dilu s ng ml a partir de leurs valeurs de D O 4 Multiplier la concentration de calprotectine ng ml dans les ex traits de selles dilu s par 5 pour effectuer la conversion en mg kg de calprotectine dans l chantillon de selles d origine Ce facteur corrige la dilution totale de 1 5000e 1 50e pendant la proc dure d extraction puis la dilution au 1 100e des extraits et convertit la valeur de ng ml mg kg Exemple si un chantillon d
124. resentam frequente mente eleva es entre cinco e v rios milhares de vezes superiores ao n vel de refer ncia mais alto nos indiv duos saud veis 3 7 9 o que in dica uma inflama o intestinal As doen as inflamat rias do intestino DII como a colite ulcerosa e a doen a de Crohn podem surgir entre a primeira inf ncia e a idade adulta tardia e o diagn stico muitas vezes tardio devido a sintomas vagos ou relut ncia dos doentes em realizar uma endoscopia e uma biopsia O BIOHIT Calprotectin ELISA pode contribuir para um diagn stico mais precoce das DII uma vez que o teste 101 apresenta geralmente um resultado positivo para as DII ativas Os dist rbios funcionais como a s ndrome do intestino irritavel SII n o provocam um aumento das concentra es de Calprotectina fecal ao contr rio dos dist rbios abdominais org nicos como as DII Os doentes com dist rbios abdominais funcionais e org nicos podem apresentar sin tomas semelhantes e um simples exame cl nico pode n o ser suficiente para encontrar um diagn stico espec fico Um teste de Calprotectina fe cal um m todo objetivo econ mico n o invasivo e simples que pode ajudar a determinar quais os doentes que devem ser submetidos a ex ames adicionais como uma endoscopia Os sintomas abdominais s o muito comuns nas crian as e nos adultos e um resultado negativo obtido pelo BIOHIT Calprotectin ELISA pode excluir doen as inflamat rias do intestino com um
125. rified from leukocyte extract 4 MATERIALS 4 1 Reagents supplied with the kit Coated Microtiterplate 12 strips 8 wells per strip coated with affinity purified monoclonal mouse antibodies specific for Calprotectin The plate is stored in a sealed bag with desiccant DILBUF 5x Sample Dilution Buffer 5x conc 1 x 20 mL 5x con centrate to be diluted with distilled deionised water pH 8 0 0 2 yellow colored solution bottle with blue cap Washing Buffer 20x conc 1 x 50 mL 20x concentrate to be diluted with distilled deionised water for washing the microtiter wells pH 7 8 0 2 clear solution bottle with white cap FEC EXTRBUF 2 5X Fecal Extraction Buffer 2 5x conc 2 x 90 mL 5x concentrate to be diluted with distilled deionised water pH 8 0 0 2 clear solution bottles with white caps CAL 1 5 Calprotectin Calibrators and 6 vials with 1 0 mL ready to use yellow colored solution vials with different colored caps Blank Blue cap 0 ng mL Calibrator 1 Green cap 7 8 ng mL Calibrator 2 Yellow cap 31 3 ng mL Calibrator 3 Red cap 62 5 ng mL Calibrator 4 White cap 125 ng mL Calibrator 5 Black cap 500 ng mL CONTROL CONTROL HIGH Controls Low and High 2 vials one tube each with 1 0 mL ready to use yellow colored solution Ctr Low vial with brown cap Ctr High vial with purple cap CONJ Conjugate Solution 13 mL alkaline phosphatase labelled immunoaffini
126. rotectina est impressa no r tulo de cada frasco Os frascos encaixam diretamente nos sistemas autom ticos de ELISA Dynex DS2 e DSX 6 6 Solu o do conjugado O tubo cont m 13 mL de anticorpos de coelho purificados por imunoafi nidade e marcados com fosfatase alcalina ALP contra a Calprotectina num tamp o com estabilizadores conservantes e um corante vermelho inerte A solu o est pronta a utilizar O tubo encaixa diretamente nos sistemas autom ticos de ELISA Dynex DS2 e DSX 106 6 7 Solu o do substrato O frasco cont m 13 mL de solu o de p nitrofenilfosfato PNPP A solu o est pronta a utilizar e deve ser armazenada no frasco opaco original Nota em caso de utiliza o de um sistema autom tico de ELISA Dynex DS2 ou DSX necess rio transferir a Solu o do substrato enzim tico para um tubo de reagente Dynex de 25 mL antes de realizar o teste Evitar a transfer ncia dos p letes estabilizadores 7 RECOLHA E PREPARA O DAS AMOSTRAS O teste BIOHIT Calprotectin ELISA foi concebido e validado principal mente para amostras de fezes mas tamb m pode ser utilizado para amostras de plasma soro 7 1 Amostras de fezes Uma vez que a Calprotectina muito est vel em fezes os doentes po dem recolher pequenas amostras de fezes em casa Recolher 1 5 g aproximadamente uma colher de ch colocar num recipiente limpo ad equado e entregar no laborat rio o mais rapidamente poss vel no prazo m ximo
127. rvaras enligt anvisningarna i avsnitt 6 1 En 1 100 sp dning av fecesextrakt rekommenderas Denna sp dning ger provresultat p mellan 25 mg kg LoQ och 2 500 mg kg i feces Extrakt med h gre kalprotektinv rde kan sp das mer gt 1 100 och omtestas om ett v rde kr vs Extrakt med l ga kalprotektinv rden kan sp das mindre 1 50 Den justerade sp dningsfaktorn m ste beaktas vid omvandling fr n ng ml till mg kg se avsnitt 10 nedan Utf r alla steg i analysen i den ordning de anges och utan v sentliga dr jsm l mellan stegen Anv nd en ren pipettspets till dispensering av vardera standard kon troll och prov F r att f de mest tillf rlitliga resultaten ska blanka kalibratorer kon troller och patientprover alltid k ras i duplikat Ekvilibrera alla prover och reagenser i kitet till rumstemperatur 18 25 C innan testet p b rjas 2 ELISA f rfarande Sp d fecesextraktprover 1 100 t ex 10 ul prov 990 ul provsp dn ingsbuffert och vortexblanda val Tills tt 100 pl vardera av blank kalibrator kontroll och sp tt prov i duplicerade brunnar se rekommenderad plattlayout i avsnitt 8 Tack plattan med f rslutningsfolie och inkubera i rumstemperatur i 40 5 min pa en horisontal plattskak cirka 500 700 r min Avl gsna v tskan mot slutet av inkuberingstiden och tv tta brunnarna genom att tills tta 300 ul tv ttbuffert i varje brunn Avl gsna s my cket v tska som m jligt och upprepa tills
128. s est d sormais pr t tre dilu et test 10 Pour le stockage transf rer environ 0 5 ml dans un nouveau tube Les extraits peuvent tre stock s 2 8 C pendant au moins cinq jours ou congel s moins de 20 C pendant un maximum de deux ans 7 2 chantillons de plasma et s rum Les v ritables niveaux de calprotectine dans le s rum ou le plasma exi gent que la prot ine ne soit pas lib r e par les granulocytes neutrophiles sanguins in vitro Pour le plasma EDTA est l anticoagulant de pr dilec tion Proc dure de pr paration recommand e pour les chantillons 1 Pr lever du sang l aide d un Vacutainer 2 Centrifuger le sang 3 000 tr minute pendant 10 minutes d s que possible jamais plus de trois heures apr s le pr l vement 3 R cup rer uniquement les deux tiers sup rieurs de la couche de s rum ou plasma par un pipetage soigneux de fa on ce que les leuco cytes de la couche leucocytaire ne soient pas aspir s Pour le test ELISA diluer le plasma ou s rum au 1 20e par ex 50 ul chantillon 950 ul tampon de dilution d 6chantillon et suivre le proto cole d essai d crit au point 9 69 8 PLAN DE PLAQUE SUGGERE 1 2 3 4 etc A Calibrateur 5 Calibrateur 5 Echantillon 1 Echantillon 1 500 ng ml 500 ng ml B Calibrateur 4 Calibrateur 4 Echantillon 2 Echantillon 2 125 ng ml 125 ng ml C Calibrateur 3 Calibrateur 3 chantill
129. s falsamente eleva dos pipetear loscalibradores controles y muestras de extracto fecal y dispensar el conjugado y sustrato de forma precisa en el fondo de los pocillos sin salpicar e Algunos reactivos contienen menos de 0 1 m v de acida de sodio y o 0 1 de Kathon Almacenar la soluci n de sustrato en el frasco opaco original la solu ci n debe ser de color transparente a amarillo claro Mezclar suave mente antes de usar e BIOHIT Calprotectin ELISA est dise ado para su uso por parte de personal cualificado que cuente con formaci n en buenas pr cticas de laboratorio 13 1 Consideraciones respecto a la eliminaci n Los residuos de productos qu micos y preparaciones suelen consider arse peligrosos La eliminaci n de este tipo de residuos est regulada mediante leyes y normativas nacionales y regionales Se recomienda ponerse en contacto con las autoridades o las empresas de tratamiento de residuos locales que facilitar n informaci n sobre c mo desechar los residuos peligrosos 14 GARANTIA Biohit deber solucionar todo defecto hallado en cualquier Producto el Producto Defectuoso causado por materiales inadecuados o negligen cia en la manufacturaci n y que eviten el funcionamiento mec nico o el uso previsto de los Productos incluyendo entre otros aspectos las funciones indicadas en las especificaciones de Biohit para los Produc tos SIN EMBARGO EN CASO DE HALLARSE UNA FALTA CAUSA 97 DA POR TRATO
130. s les t moins calibrateurs contr les et chantillons doit tre soigneusement dress en utilisant par exemple la feuille fournie dans le kit S lectionner le nombre n cessaire de bandes de plaques micro titres Les bandes non utilis es doivent tre replac es dans le sachet 70 O tanche en aluminium et stock es conform ment aux instructions du point 6 1 Il est recommand de diluer les extraits de selles au 1 100e Cette dilution fournira pour les chantillons des r sultats compris entre 25 mg kg LoQ et 2 500 mg kg dans les selles Les extraits contenant les plus hautes valeurs de calprotectine peuvent tre dilu s davantage gt 1 100e et retest s si leur valeur l exige Les extraits ayant de faibles valeurs de calprotectine peuvent tre moins dilu s 1 50e Le facteur de dilution ajust doit tre pris en compte lorsqu on effectue la conver sion de ng ml mg kg voir point 10 ci dessous R aliser toutes les tapes du test dans l ordre indiqu sans d lai ap pr ciable entre les tapes Un embout jetable propre de pipette doit tre utilis pour chaque tal on contr le et chantillon Pour garantir les r sultats les plus fiables les t moins calibrateurs contr les et chantillons du patient doivent toujours tre analys s en double Tous les chantillons et r actifs du kit doivent tre port s temp rature ambiante 18 25 C avant de commencer le test 2 Proc dure
131. sangre mediante vacutainers 1 2 Centrifugar la sangre a 3000 rpm durante 10 minutos lo antes posi ble y antes de que transcurran tres horas desde la obtenci n de la muestra Extraer unicamente los dos tercios superiores de la capa de suero o plasma mediante un pipeteo cuidadoso a fin de no aspirar los leu cocitos de la capa leucocitaria Para ELISA diluir el plasma o suero en proporci n 1 20 p ej 50 ul de muestra 950 ul de amortiguador para diluci n de muestras y seguir el procedimiento de an lisis que se describe en la secci n 9 8 SUGERENCIA DE ESQUEMA DE PLACA 1 2 3 4 etc A Calibrador 5 Calibrador 5 Muestra 1 Muestra 1 500 ng ml 500 ng ml B Calibrador 4 Calibrador 4 Muestra 2 Muestra 2 125 ng ml 125 ng ml C Calibrador 3 Calibrador 3 Muestra 3 Muestra 3 62 5 ng ml 62 5 ng ml D Calibrador 2 Calibrador 2 Muestra 4 Muestra 4 31 3 ng ml 31 3 ng ml E Calibrador 1 Calibrador 1 Muestra 5 Muestra 5 7 8 ng ml 7 8 ng ml F Blanco Blanco Muestra 6 Muestra 6 0 ng ml 0 ng ml G Control Control bajo Muestra 7 Muestra 7 bajo H Control alto Control alto Muestra 8 Muestra 8 Sugerencia de esquema de placa ELISA para calibradores controles y muestras siguiendo un procedimiento manual Se recomienda duplicar 89 los pocillos para aumentar la fiabilidad de los resultados En una placa completa caben 40 mue
132. sco con tap n blanco EXTRBUF 25X Amortiguador para extracci n fecal conc 2 5x 2 unidades de 90 ml en concentraci n 2 5x para diluir en agua destilada desionizada soluci n transparente con pH 7 8 0 2 frascos con tap n blanco CAL 1 5 Calibradores de calprotectina 1 5 y BLANK 6 viales de 1 0 ml soluci n de color amarillo lista para usar viales con tapones de distinto color 83 Blanco tap n azul 0 ng ml Calibrador 1 tap n verde 7 8 ng ml Calibrador 2 tap n amarillo 31 3 ng ml Calibrador 3 tap n rojo 62 5 ng ml Calibrador 4 tap n blanco 125 ng ml Calibrador 5 tap n negro 500 ng ml CONTROL CONTROL HIGH Controles bajo y alto 2 viales de 1 0 ml soluci n de color amarillo lista para usar control bajo vial con tap n marron control alto vial con tap n morado Soluci n conjugada 113 ml de soluci n de color rojo lista para usar con anticuerpos policlonales de conejo contra la calprotectina marcados con fosfatasa alcalina y purificados mediante inmunoafinidad en un tubo de reactivo Dynex de 25 ml con tap n blanco Soluci n de sustrato pNPP 113 ml de soluci n lista para usar de color transparente a amarillo claro en frasco opaco con tap n ama rillo El frasco contiene sedimentos de estabilizaci n Nota Si se usa un instrumento Dynex el sustrato debe transferirse a un tubo de reactivo Dynex de 25 ml antes de realizar el an lisis Contiene 0
133. serare och liknande utrustning m ste valideras ndring av utformning samman s ttning och testf rfarande samt anv ndning i kombination med andra produkter som inte godk nts av tillverkaren till ts inte anv ndaren ansvarar sj lv f r s dana ndringar Tillverkaren ansvarar inte f r fal ska resultat och incidenter av denna anledning Tillverkaren ansvarar inte f r eventuella resultat fr n visuell analys av patientproverna Endast f r in vitro diagnostiskt bruk Alla komponenter av m nskligt ursprung som anv nts i tillverkningen av dessa reagenser har testats f r anti HIV antikroppar anti HCV an tikroppar och hepatit B antigen Bag och har visats vara icke reaktiva Allt material ska dock betraktas och hanteras som potentiellt smit tf rande Blanda inte reagenser och remsor fran olika tillverkningspartier Anv nd inte reagenser fr n andra tillverkare med reagenser i det h r testkitet Anv nd inte reagenser efter det utgangsdatum som anges p etiketten eller senare n en m nad efter beredning av koncentrerade reagenser till arbetsl sningar Anv nd endast rena pipettspetsar dispenserare och labbutrustning F rebygg korskontaminering genom att inte blanda ihop skruvlocken till reagensflaskorna Dra at flasklocken ordentligt direkt efter anv ndning f r att undvika av dunstning och mikrobkontaminering Efter att ha ppnats och sedan f rvarats ska konjugat kalibrator och kontrollflaskor kontrolleras f r mikr
134. ses ta eiv t tule mukaan Laimenna plasma tai seerumi suhteessa 1 20 esim 50 ul n ytett 950 uL n ytteen laimennuspuskuria ELISA menetelm varten ja seuraa os assa 9 kuvattuja analyysitoimenpiteit 31 8 SUOSITELTU LEVYN PIPETOINTIKAAVIO 1 2 3 4 etc A Kalibraattori 5 Kalibraattori 5 N yte 1 N yte 1 500 ng ml 500 ng ml B Kalibraattori 4 Kalibraattori 4 N yte 2 N yte 2 125 ng ml 125 ng ml C Kalibraattori 3 Kalibraattori 3 N yte 3 N yte 3 62 5 ng ml 62 5 ng ml D Kalibraattori 2 Kalibraattori 2 Nayte 4 Nayte 4 31 3 ng ml 31 3 ng ml E Kalibraattori 1 Kalibraattori 1 Nayte 5 Nayte 5 7 8 ng ml 7 8 ng ml F 0 n yteliuos 0 n yteliuos Nayte 6 Nayte 6 0 ng ml 0 ng ml G Matala kontrolli Matala kontrolli N yte 7 Nayte 7 H Korkea kontrolli Korkea kontrolli N yte 8 Nayte 8 Suositeltava ELISA levyn pipetointimalli kalibraattoreille kontrolleille ja naytteille manuaalisessa testivaihtoehdossa Kahden rinnakkaisen kuo pan k ytt yhdelle naytteelle suositellaan tuloksien luotettavuuden par antamiseksi T yteen levyyn mahtuu 40 n ytett 9 TESTIMENETELM Seuraavat toimenpiteet koskevat manuaalista testausta Hyv ksytyt toimenpiteet Dynex DS2 ja DSX ELISA automaattien k ytt n ovat saatavilla pyynn st Huomioi ett kalibraattorin O nayteliuoksen ja positiivisen kontrollin sek konjugaatin putki sopivat DS2 ja DSX ELI
135. st r alis manuellement e Vibreur agitateur de plaques 500 700 tr min si l essai est r alis manuellement Minuterie si l essai est r alis manuellement e Lecteur de plaques microtitres filtre 405 nm si l essai est r alis ma nuellement 1M NaOH solution d arr t option 5 STABILITE ET STOCKAGE Lorsqu ils sont non ouverts et conserv s 2 8 C les r actifs du kit sont stables jusqu la date d expiration indiqu e sur l tiquette Une fois ouverts les plaques r actifs et tampons concentr s sont stables pendant trois mois s ils sont conserv s 2 8 C Si elles sont pr par es dans des r cipients propres les solutions de tra vail 1 x de tampon de lavage tampon de dilution d chantillon et tampon d extraction de selles peuvent tre conserv es 2 8 C pendant un mois Eviter toute exposition aux hautes temp ratures et a la lumi re directe du soleil 6 PREPARATION DES REACTIFS Tous les r actifs chantillons et contrdles doivent tre port s temp ra ture ambiante 18 25 C avant de commencer la s rie de tests 65 6 1 Bandes de plaques microtitres coat es Les bandes de plaques pr tes l usage sont coat es avec des anticorps de souris monoclonaux purifi s par immuno affinit sp cifiques de la cal protectine Les bandes non utilis es doivent tre retir es de la plaque et imm diatement replac es dans le sachet tanche en papier d alu
136. sta Testien v linen toistet Testien sis inen toistet Testien sis inen toistet tavuus ulosten ytteet tavuus ulosten ytteet tavuus EDTA plasma Pitoisuus CV Pitoisuus CV Pitoisuus CV ulosteessa ulosteessa plasmassa mg kg mg kg ug l 32 1 13 28 7 6 7 166 3 8 171 6 0 173 3 6 740 47 368 4 8 385 4 1 1160 2 9 583 6 1 592 4 0 1360 3 5 1215 6 8 1210 4 2 2980 3 2 1977 7 9 1966 5 0 3660 10 Keskim r iset tulokset kolmesta eri laboratoriosta jokainen testasi kitin kaksi valmistuseraa kuusi n ytett testattiin yhteens kymmenen kertaa viiden p iv n aikana Keskim r iset tulokset kolmesta eri laboratoriosta jokainen testasi kaksi valmistuser kuusi n ytett ja kymmenen toistoa yhdell kerralla Testattu k ytt en yht valmistuser kuusi n ytett laimennettiin suhteessa 1 20 ja testattiin kymment samanaikaista toistoa Saanto recovery Uloste 85 105 testattu ulosten ytteell johon lis tty puhdistettua kal protektiinia viidell eri pitoisuudella Plasma 81 105 testattu plasmalla johon lis tty puhdistettua kalpro tektiinia viidell eri pitoisuudella Kvantifiointiraja limit of guantification 5 ng ml testattu ulosten ytteell plasmalla ja puhdistetulla kalprotekti inilla N ytteet analysoitiin viisi kertaa viiden p iv n aikana Eri n ytteiden ja m ritysten CV n keskiarvo t ll tasolla oli 12 M rit
137. stras 9 M TODO ANAL TICO El siguiente procedimiento se refiere al an lisis manual Se pueden so licitar protocolos validados para instrumentos autom ticos Dynex DS2 y DSX ELISA Debe tenerse en cuenta que los viales para calibrador blanco y control positivo as como el tubo de conjugado encajan directa mente en los instrumentos autom ticos DS2 o DSX ELISA Tambi n pu eden usarse otros instrumentos autom ticos para ELISA pero el cliente debe validarlos previamente 9 1 Notas sobre el procedimiento e Preparaci n Leer con atenci n el protocolo de an lisis antes de llevar lo a cabo La fiabilidad de los resultados depende de que se siga es crupulosamente el protocolo de an lisis descrito Antes de comenzar el an lisis debe establecerse minuciosamente un esquema de placa para todos los blancos calibradores controles y muestras utilizando por ejemplo la hoja que se incluye en el kit Seleccionar el n mero necesario de tiras de la placa Las tiras que no se usen deben volverse a sellar inmediatamente en bolsa de papel de aluminio y almacenarse seg n se describe en la secci n 6 1 Se recomienda emplear una diluci n a 1 100 de extractos de heces Esta diluci n arrojar unos resultados de muestra de entre 25 mg kg l mite de cuantificaci n y 2500 mg kg en heces Los extractos con valores de calprotectina m s altos pueden diluirse m s gt 1 100 y volverse a someter an lisis si se necesita un valor Los extract
138. suivre 9 2 Proc dure ELISA 10 R SULTATS a 10 1 Valeurs de contr le de qualit neen 10 2 Calculides resultats cuand 10 3 Interpretation des r sultats ka 11 LIMITATIONS DE LA PROC DURE 12 CARACT RISTIQUES DES PERFORMANCES nsise 13 MISES EN GARDE ET PR CAUTIONS 13 1 Consid rations relatives l limination 14 GARANTIE conoci sica 15 RESUME DE LA PROCEDURE A SUIVRE BON q 60 1 APPLICATION Le kit BIOHIT Calprotectin ELISA est une m thode quantitative pour la d tection de calprotectine dans les chantillons de selles Il peut tre utilis pour aider identifier une maladie organique de l intestin gr le du gros intestin ou de l estomac d terminer l activit de la maladie et surveil ler la r ponse au traitement chez des patients atteints de rectocolite h morragique ou de maladie de Crohn Le kit BIOHIT Calprotectin ELISA a t valid pour les chantillons de selles Le test est con u pour son utilisation en diagnostic in vitro 2 ANT C DENTS La calprotectine est une prot ine de liaison au calcium et au zinc de 36 kD notamment lib r e par les leucocytes et tout particuli rement les granulocytes neutrophiles PNN dans la lumi re du tube digestif en cas d inflammation de la muqueuse intestinale Les micro organismes de l intestin stimulent la migration des leucocytes dans la lumi re du tube digestif o ils lib rent
139. tamente com o desse cante fornecido Armazenar a 2 8 C 6 2 Tamp o de dilui o da amostra Diluir o Tamp o de dilui o da amostra concentrado 5x atrav s da adi o de 1 parte 20 mL a 4 partes 80 mL de gua destilada desionizada num recipiente limpo at atingir um volume final de 100 mL Misturar bem Armazenar o Tamp o de dilui o da amostra dilu do num recipiente fechado a 2 8 C Nota em caso de utiliza o de um sistema autom tico de ELISA Dynex DS2 ou DSX necess rio transferir o Tamp o de dilui o da amostra para um tubo de reagente Dynex de 25 mL antes de realizar o teste 6 3 Tamp o de lavagem Diluir o Tamp o de lavagem concentrado 20x atrav s da adi o de 1 parte 50 mL a 19 partes 950 mL de gua destilada desionizada num recipiente limpo at atingir um volume final de 1000 mL Misturar bem Armazenar o Tamp o de lavagem dilu do num recipiente fechado a 2 8 C 6 4 Tamp o de extra o de fezes Diluir o Tamp o de extra o de fezes concentrado 2 5x atrav s da adi o de 1 parte 90 mL a 1 5 partes 135 mL de gua destilada desionizada num recipiente limpo at atingir um volume final de 225 mL Misturar bem Armazenar o tamp o dilu do num recipiente fechado a 2 8 C 6 5 Calibradores solu o em branco e controlos Os frascos rotulados com solu o em branco calibrador e controlos con t m 1 mL cada de uma solu o pronta a utilizar A concentra o de Cal p
140. tectina determinado por meio da submiss o do extrato a um teste num ensaio de imunoabsorc o enzim tica ELISA especifico para a Calpro tectina 102 No ELISA as amostras e as solu es padr o s o incubadas em po os de titula o separados revestidos com anticorpos monoclonais que ligam a Calprotectina Ap s a incuba o e a lavagem dos po os permite se que a Calprotectina ligada reaja com anticorpos espec ficos da Calpro tectina purificados por imunoafinidade e marcados com enzima Ap s esta rea o a quantidade de enzimas ligadas aos po os de titula o proporcional quantidade de Calprotectina na amostra ou na solu o padr o que determinada por incuba o com um substrato para a enzi ma que produz um produto colorido A intensidade da cor determinada por absorv ncia atrav s da utiliza o de um leitor de placas ELISA e proporcional concentra o de Calprotectina nas solu es calibradores nas amostras O ensaio calibrado utilizando Calprotectina purificada de extrato de leuc citos 4 MATERIAIS 4 1 Reagentes fornecidos com o kit Placa de titula o revestida 12 faixas 8 po os por faixa revestidas com anticorpos monoclonais de rato purificados por afinidade e especi ficos para a Calprotectina A placa est armazenada numa embalagem selada com dessecante DILBUF 5x Tamp o de dilui o da amostra conc 5x 1 x 20 mL concentrado 5x para ser dilu do com agua destilada
141. tet r avsett f r in vitro diagnostiskt bruk 2 BAKGRUND Kalprotektin r ett kalcium och zinkbindande protein med en moleky l rvikt pa 36 kDa som fris tts speciellt fran leukocyter i s rskilda poly morfonukle ra neutrofila granulocyter PMN till tarmlumen vid tunntarm sinflammation Tarmens mikroorganismer stimulerar leukocyter till att migrera till tarmlumen d r de fris tter sitt inneh ll inklusive antimikro biella mnen som kalprotektin Detta protein utg r cirka 60 av det totala proteinet i PMN ernas cytoplasma 2 och kan m tas tillf rlitligt i fecesprov er som har f rvarats i upp till sju dagar i rumstemperatur 3 Olika sjukdomar t ex bakteriella infektioner reumatoid artrit och cancer medf r aktivering av PMN er och f rh jda kalprotektinv rden i plasma ryggm rgsv tska ledv tska tandk ttsv tska urin eller andra humanma terial Kalprotektinkoncentrationen i feces korrelerar med antalet PMN er som migrerar till tarmlumen 5 och kan p visas tillf rlitligt ven i sma min dre n ett gram slumpvisa avf ringsprover 39 Organiska sjukdomar i tarmen ger en stark kalprotektinsignal d v s f rh jningen r ofta fem till flera tusen ganger h gre an den vre referensnivan bland friska individer 3 79 vilket indikerar tunntarmsinflammation Inflammatoriska tarmsjuk domar IBD t ex ulcer s kolit och Crohns sjukdom kan uppst fran tidig barndom till h g vuxen lder och diagnosen f rdr
142. trolos 106 6 6 Solu o do conjugado ssssrsrrsrrsreerernens 106 6 7 Solu o do substrato oirinn sas 107 7 RECOLHA E PREPARA O DAS AMOSTRAS 107 7 1 Amostras de fezes ooooocococcccoconcoocccoononononoconnoos 107 7 1 1 Extra o com os tubos de extra o BIOHIT 108 7 1 2 Extra o atrav s do m todo de pesagem 108 7 2 Amostras de plasma e soro 109 8 DISPOSI O SUGERIDA DA PLACA 109 9 PROCEDIMENTO DE TESTE N 110 9 1 Notas do procedimento 110 9 2 Procedimento ELISA 411 10 RESULTADOS ccoo ici a 112 10 1 Valores de controlo de qualidade a 112 10 2 C lculo dos resultados z112 10 3 Interpreta o dos resultados 113 11 LIMITA ES DO PROCEDIMENTO 114 12 CARACTER STICAS DE DESEMPENHO 114 13 AVISOS E PRECAU ES urines 116 13 1 Considera es relativas elimina o nnmmmnssseresnrenerennnennnrnn nn 117 14 GARANTIA 118 15 RESUMO BREVE DO PROCEDIMENTO 119 100 1 UTILIZA O PREVISTA O teste BIOHIT Calprotectin ELISA um m todo quantitativo destinado dete o de Calprotectina em amostras de fezes Pode ser utilizado como um instrumento de aux lio na identifica o de doen a org nica do intestino delgado do intestino grosso ou do est mago nos doentes para determinar a atividade da doen a e para monitorizar a resposta ao tratamento nos doentes com colite ulcerosa ou doen
143. ture de sodium moins de 0 1 p v et ou 0 1 de Kathon Stocker la solution substrat dans sa bouteille opaque originale la solu tion doit tre transparente ou jaune pale M langer l g rement avant usage Le kit BIOHIT Calprotectin ELISA est con u pour tre utilis par un personnel qualifi form aux bonnes pratiques de laboratoire 13 1 Consid rations relatives a l limination Les d chets de produits chimiques et pr parations sont g n ralement consid r s comme des d chets dangereux L limination de ce type de d chets est assujettie aux lois et r glementations nationales et r gion ales Veuillez contacter les autorit s locales ou des soci t s de gestion des d chets qui vous informeront sur la mani re d liminer les d chets dangereux 14 GARANTIE Biohit est tenu de rem dier a tout d faut d couvert dans un produit quel qu il soit le Produit d fectueux r sultant de l emploi de composants inappropri s ou d une qualit de fabrication n gligente qui emp che le fonctionnement ou l utilisation pr vue du produit y compris mais pas uniquement les fonctions indiqu es parmi les sp cificit s des produits tablies par Biohit CEPENDANT LA PRESENTE GARANTIE N EST PAS APPLICABLE SI LE DEFAUT A ETE CAUSE PAR UNE UTILISA TION IMPROPRE OU ABUSIVE DU PRODUIT UN DOMMAGE AC CIDENTEL UNE CONSERVATION INCORRECTE OU ENCORE L UTILISATION DU PRODUIT POUR DES OPERATIONS HORS DES LIMITAT
144. ty purified polyclonal rabbit antibodies against Calprotectin ready to use red colored solution 25 mL Dynex reagent tube with white cap Substrate Solution pNPP 13 mL ready to use clear to faint yellow solution opaque bottle with yellow cap The bottle contains sta bilising pellets 8 Note If using a Dynex instrument the substrate has to be transferred into a 25 mL Dynex reagent tube before running the test xx kx Contains 0 1 Kathon Contains lt 0 1 sodium azide Contains 0 1 Kathon and lt 0 1 sodium azide vsk Contains 0 02 methylisothiazolone and 0 02 bromonitrodioxane 4 2 Materials supplied with the kit 2 Sealing foils 1 Test protocol 1 Plate layout 4 3 Materials reguired but not supplied 5 Distilled deionised water Extraction devices see section 7 1 1 and 7 1 2 Disposable breakable inoculation loops if using weighing method in section 7 1 2 Sensitive digital scale 40 150 mg if using weighing method in sec tion 7 1 2 Disposable polystyrene screw cap tubes 5 mL if using weighing meth od in section 7 1 2 Vortex mixer Disposable tubes for dilution of samples Eppendorf tubes or similar if assay is performed manually Pipettes to deliver volumes 10 1000 uL if assay is performed manu ally Repetitive pipette or multi channel pipette 100 uL if assay is per formed manually Microplate well washer or multi channel pipette 300 uL if assay is performed manu
145. ue los resultados se vean modificados Tal vez se observe una reducci n de los valores de DO y el valor m ximo de DO del patr n superior 500 ng ml puede descender del valor recomendado de 1 800 pero ello no 91 afecta a los resultados 10 RESULTADOS 10 1 Valores del control de calidad Debe incluirse una nueva curva de patr n en cada tanda Los controles positivos deben incluirse en cada tanda El valor de los controles debe encontrarse dentro de los l mites impresos en las eti quetas de los viales Amodo de gu a el valor de DO del calibrador 5 500 ng ml debe ser gt 1 6 mientras que el valor de DO del blanco 0 ng ml debe ser lt 0 25 En la figura 1 se muestra una curva de calibrador representativa 10 2 C lculo de los resultados C lculo de la concentraci n de calprotectina en muestras fecales de pa cientes 1 Calcular los valores medios de DO de todos los pocillos duplicados blanco calibradores y muestras 2 Trazar el valor del blanco y de cada calibrador y la concentraci n ng ml en el eje de la x frente a su valor de DO medio en el eje de la y para obtener una curva de patr n Se recomienda una funci n de ajuste de curvas de 4 par metros v ase la figura 1 a continu aci n Si se necesita un eje de la x logar tmico debe usarse un valor de 0 001 ng ml para el patr n A 0 ng ml 3 Usar la curva de calibraci n para determinar la concentraci n de cal protectina en las muestras diluidas
146. verting from ng mL to mg kg see section 11 below Perform all assay steps in the order given and without any appreciable delays between the steps Aclean disposable pipette tip must be used for dispensing each cali brator control and sample To achieve the most reliable results blanks calibrators controls and patient samples should always be run in duplicate All samples and kit reagents should be equilibrated to room tempera ture 18 25 C before testing is begun 9 2 ELISA Procedure 1 Dilute feces extract samples 1 100 e g 10 uL sample 990 uL Sam ple Dilution Buffer and mix well by vortexing 2 Add 100 uL of each blank calibrator control and diluted sample in duplicate wells see recommended plate layout in Section 8 14 3 Cover the plate with a sealing foil and incubate at room temperature for 4045 min on a horizontal plate shaker approximately 500 700 rpm 4 At the end of the incubation time remove the liquid and wash the wells by adding 300 uL Washing Buffer to each well Remove as much liquid as possible and repeat until a total of three washings have been performed If a plate washer is used check that all aspirating and fill ing probes are unblocked to ensure efficient washing of all wells After the final wash invert the plate and tap the well openings thoroughly on absorbent tissue to remove any remaining Washing Buffer 5 Mix the content of the Conjugate vial gently prior to us
147. yout for calibrators controls and samples using 13 manual procedure Duplicate wells are recommended for increased reli ability of results A full plate takes 40 samples 9 TEST PROCEDURE The following procedure is for manual testing Validated protocols for Dynex DS2 and DSX ELISA automates are available upon request Please note that the calibrator blank and positive control vials as well as the conjugate tube fit directly into the DS2 or DSX ELISA automates Other automated ELISA instruments can also be used but have to be validated by the customer 9 1 Procedural Notes Preparation Please read the test protocol carefully before performing the assay Result reliability depends on strict adherence to the test protocol as described Prior to commencing the assay a plate layout for all blanks calibrators controls and samples should be carefully es tablished using for example the sheet supplied in the kit Select the required number of microtiter strips Unused strips should be re sealed in the aluminium pouch and stored as described in Section 6 1 A 1 100 dilution of feces extracts is recommended This dilution will give sample results between 25 mg kg LoQ and 2500 mg kg in feces Extracts with higher Calprotectin values can be diluted more gt 1 100 and re tested if a value is required Extracts with low Calprotectin val ues can be diluted less 1 50 The adjusted dilution factor must be taken into account when con
148. ysraja limit of detection lt 5 ng ml laskettu keskiarvona laimennuspuskuri n 32 5x SD 37 H iritsev t tekijat Yeisesti k ytettyjen l kkeiden prednisoloni Imurel salatsopyriini ja siprofloksasiini ei todettu vaikuttavan ELISA testin tuloksiin Uuttamisen toistettavuus precision Kaksi ulostenaytetta uutettiin molemmat kymmenen kertaa kohdassa 7 1 2 kuvailtujen toimenpiteiden mukaisesti ja uutteet analysoitiin ELISA menetelmalla Keskim r iset tulokset kolmesta eri laboratoriosta ja yh desta kitin valmistuserasta Nayte Pitoisuus mg kg CV Low 130 8 7 High 1357 8 8 Lineaarisuus ulosten yteuutteet Ulosten yteuutteet n 10 laimennettiin suhteessa 1 100 1 1000 ja an alysoitiin ELISA menetelm ll Keskim r iset tulokset Laimennus laimennussuhteen 1 100 tuloksesta 1 100 100 1 400 103 1 700 105 1 1000 107 N ytteiden vaihtelu on huomioitu lineaarisuudessa Lineaarisuus EDTA plasma Plasman ytteet n 5 laimennettiin suhteessa 1 20 1 80 ja analysoitiin ELISA menetelm ll Keskim r iset tulokset Laimennus laimennussuhteen 1 20 tuloksesta 1 20 100 1 40 107 1 80 116 N ytteiden vaihtelu on huomioitu lineaarisuudessa 13 VAROITUKSET JA VAROTOIMENPITEET e EU direktiivin 98 79 EY 1 artiklan kohdan 2b mukaisesti t m in vitro 38 diagnostiikkaan tarkoitettu l kinn llinen laite on valmista
149. zontal de plaques environ 500 700 tr min 7 Recommencer les tapes de lavage telles que d crites ci dessus trois fois avec 300 ul de solution de lavage par puits 8 Ajouter 100 ul de solution substrat dans chaque puits pr f rablement l aide d une pipette r p tition ou multi canaux 9 Laisser incuber la plaque temp rature ambiante sans agiter pen dant 20 30 minutes l abri de la lumi re 10 En option Ajouter 100 ul de solution d arr t 1M NaOH chaque puits si une p riode d incubation fixe est requise 11 Lire les valeurs de densit optique D O 405 nm l aide d un lec teur ELISA Si le lecteur de plaques poss de cette option agiter la plaque bri vement 2 3 secondes avant la lecture En option Temps d incubation r duit proc dure manuelle Le temps d incubation peut tre r duit 30 5 min sans changer les r sultats Une r duction des valeurs de D O peut tre envisag e et la valeur maximale de D O pour l talon sup rieur 500 ng ml peut descendre au dessous de la valeur recommand e de 1 800 mais cela n a aucun effet sur les r sultats 10 R SULTATS 10 1 Valeurs de contr le de qualit Une nouvelle courbe talon doit tre r alis e chaque s rie de tests e Les contr les positifs doivent tre inclus chaque s rie de tests La valeur des contr les doit tre comprise dans les limites imprim es sur les tiquettes des flacons A tit

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