Mode d`emploi ELISA Lactoferrine Bovine
Contents
1. Un chronom trage quivalent entre les tapes de distribution des r actifs et de lavage dans chaque puits est imp ratif La solution d arr t doit tre distribu e dans les puits selon le m me ordre et avec le m me timing que le substrat 13 CONSIGNES DE S CURIT Veiller respecter les consignes d hygi ne et de s curit relatives la manipulation des r actifs Les locaux de travail doivent tre bien ventil s Eviter la pr sence de toute source d ignition ou de chaleur flammes tincelles rayons solaires Eviter l inhalation de vapeurs ou d a rosols et porter des appareils de protection adapt s afin d viter tout contact cutan ou oculaire 15 31 14 CARACTERISTIQUES TECHNIQUES Les caract ristiques techniques du test ont t d termin es selon les lignes directrices ICH 62 81 r gression non lin aire mod le logistique 4 Lin arit param tres r2 gt 0 99 LOD 1 8 ng ml Limite de astection interpolation du signal moyen du blanc analytique 3 sd LOQ 3 0 ng ml Limite de quantification interpolation du signal moyen du blanc analytique 10 sd CV compris entre 1 et 5 aux niveaux de R p tabilit concentration 25 50 et 100 ng ml pour les matrices lait intra essai poudre de colostrum et s rum 6 r p titions par run d essai 3 runs n 18 CV compris entre 5 et 14 aux niveaux de Fid lit interm diaire concentration 25 50 et 100 ng ml pour les matrice2. ASSAY CHARACTERISTICS Les caract ristiques techniques du test ont t d termin es selon les lignes directrices ICH Q2 R1 Linearity non linear regression 4 parameters logistic model r2 gt 0 99 Limit of detection LOD 1 8 ng ml interpolation of mean absorbance of blank 3 sd Limit of quantification LOQ 3 0 ng ml interpolation of mean absorbance of blank 10 sd Repeteability intra assay CV 1 5 at concentration levels 25 50 and 100 ng mL for milk colostrum powder and serum within run n 6 3 separate run to run assays Intermediate precision inter assay CV 5 14 at concentration levels 25 50 and 100 ng mL for milk colostrum powder and serum within run n 6 3 separate run to run assays Exactitude of recovery 95 140 for milk 115 20 Spike at 3 concentrations level in milk Range of quantification Range of quantification 5 100 ng ml Specificity Cross reaction weak with goat or sheep milk and sow colostrum medium with buffalo milk no cross reaction with camel milk and mare colostrum No cross reaction with bovine whey protein betalactoglobulin alphalactaloumin immunoglobulin and albumine 29 31 ANNEXE ANNEX Sch ma de d p t Layout 30 31 IDBiotech ImmunoDiffusion Biotechnologies SARL Avenue Marie Curie 63500 Issoire FRANCE Tel
3. Take care not to touch the underside of the plate Place all the microtitration tubes containing the standards blanks samples and controls on a rack following the same location of the plate layout 2 Wash the ELISA strips with an automated or manual plate washer as following Distribute 250 to 300ul of 1X wash buffer R1 in each well Drain the wells by dumping the plate or aspiration system Repeat for a total of 4 washes After the final wash tap over absorbent paper to remove most of the residual liquid NB Do not allow wells to dry between each step of the assay 3 Incubation of standards blanks samples and controls Pipette 100uL well use an 8 channel pipette of the standards blanks samples and controls Cover with an adhesive and shake gently for a few seconds on a plate shaker lt 500 rpm Incubate 1 hour at 25 C without agitation Wash 5 times as described in section 2 4 Incubation of the solution of conjugate IgG HRP Prevent the solution and filled plate from light exposure during this step Pipette 100yL well of the conjugate solution use an 8 channel pipette Cover with an adhesive and shake gently for few seconds on a plate shaker lt 500 rpm Incubate 1 hour at 25 C without agitation in the dark Wash 5 times as described in section 2 5 Incubation of the substrate TMB Discard if the substrate has a distinct blue color prior to the assay Pipette 100uL well of the ready to use
4. 1 Solution fille 2000 ng ml 50uL sol m re R3 20ug ml 450uL de tampon R2 Homog n iser le m lange par retournements successifs lents Cette solution est jet e apr s utilisation 2 La gamme d talonnage est r alis e par dilutions successives de la solution fille comme indiqu ci dessous STD 1 gt 200 100 uL sol fille STD 2 gt 100 ng ml 500 uL STD 1 STD 3 gt 50 ng m 500 uL STD 2 900 uL tampon R2 STD 4 gt 25 800 uL STD 3 500 uL tampon R2 500 uL tampon R2 500 uL tampon R2 STD 5 gt 12 5 9 500 uL STD 4 STD 6 gt 6 25 ng ml 500 uL STD 5 500 uL tampon R2 STD 7 gt 3 125 ng ml 500 uL STD 6 500 uL tampon R2 Blanc BLK 500 uL tampon R2 500 uL tampon R2 Les dilutions sont r alis es directement en tubes de microtitration dispos s sur un portoir format 96 puits selon le sch ma de d p t de la plaque Agiter chaque microtube entre chaque dilution Ces solutions sont jet es apr s utilisation Les volumes indiqu s ici permettent de d poser chaque standard en duplicate 9 2 Pr paration du conjugu IgG HRP La solution de conjugu est pr par e partir de la solution d lgG HRP concentr e 40 fois R4 par dilution au 1 40 en tampon de dilution R2 Cette solution est pr parer juste avant utilisation dans le test et prot ger de la lumi re Dilution 1 40 300uL R4 11 7mL de tampon R2 Ho
5. 33 0 4 73 54 95 01 Fax 33 0 4 73 54 43 94 Web www idbiotech com e mail contact idbiotech com Development Manufacture R amp D and OEM Services
6. The kit is delivered in a box containing 6 strips of 16wells coated with purified anti bLF immunoglobulins in a foil zip lock bag with dessicant NB a preliminary wash of the ELISA plate is necessary before performing the assay cf 10 R1 Wash buffer 10 fold concentrated 1 x 100mL vial R2 Dilution buffer for standards samples and the conjugate ready to use 4 x 30mL vial R3 Standard solution at 20ug ml of bovine lactoferrin 1 x 250uL microtube R4 conjugate solution purified IgG labeled to HRP Ig HRP 40 fold concentrated 1 x 500uL microtube SB tetramethyl benzidine substrate TMB ready to use 1 x 15mL vial ST stop solution H2SO 0 45M ready to use 1 x 10mL vial 1 adhesive 5 STORAGE CONDITIONS Store all reagents between 2 C to 8 C Do not use the reagents after their expiry date Prevent reagents R4 and SB from light exposure during storage and assay incubation steps Before use bring all reagents to room temperature Gently homogenise each vial manually by turning upside down several times before use Do not mix reagents from different lots 19 31 6 REAGENTS AND EQUIPMENTS REQUIRED Distilled or deionised water PANREAC 212236 1214 or equivalent Disposable glass tubes Disposable 1 2ml 8 8mm x 45mm microtitration tubes with rack Container to prepare wash buffer Reservoirs for the delivery of the reagents for multichannel pipette Adhesive films Precision
7. complexe form lors de l tape pr c dente La distribution d un substrat chromog ne TMB permet alors de r v ler l ensemble form Apr s addition de la solution d arr t les densit s optiques sont lues 450 nm l aide d un lecteur de microplaques La concentration en lactoferrine bovine est proportionnelle la densit optique mesur e 6 31 4 COMPOSITION DU KIT Le kit est livr sous la forme d un coffret comprenant 6 barrettes de 16 puits 96 puits sensibilis es avec les IgG anti lactoferrine bovine purifi es NB les barrettes doivent tre lav es avant utilisation cf 10 R1 tampon de lavage solution concentr e 10 fois 1 flacon de 100ml R2 tampon de dilution de la gamme talon des chantillons et du conjugu pr t a l emploi 4 flacons de 30ml R3 solution m re 20ug ml de lactoferrine bovine 1 microtube de 250ul R4 solution de conjugu IgG HRP solution concentr e 40 fois 1 microtube de 500ul SB t tramethyl benzidine substrat TMB pr t a l emploi 1 flacon de 15ml ST solution d arr t H2SO 0 45M pr t l emploi 1 flacon de 10ml 1 film adh sif 5 CONDITIONS DE STOCKAGE Conserver tous les r actifs du coffret une temp rature comprise entre 2 C et 8 C Ne pas utiliser les r actifs au del de leur date d expiration Ne pas exposer les r actifs et en particulier les r actifs R4 et SB une lumi re vive pendant le stock
8. micropipettes 10 5000 ul with adapted disposable tips 8 channel micropipette with variable volume 50 200 uL with adapted disposable tips Microtiter plate washer manual or automatic Orbital shaker type IKA Vibrax or equivalent with tray for microtiter plate Microtiter plate reader with 450nm filter Biotek ELx808 or equivalent Data treatment software including the 4 parameter logistics regression model Y A D 1 X C B D 7 PREPARATION OF THE WASH BUFFER Prepare the wash buffer as follows Into a clean vial mix the 100mL of 10X wash buffer R1 with 900mL of distilled or deionised water 20 31 1 2 Homogenise slowly This solution can be stored at 2 C 8 C for two weeks 8 SAMPLES PREPARATION If samples will not be assayed immediately stored refrigerated for up to a few days or frozen for long term storage avoid freeze thaw cycles Bring to room temperature and vortex the samples before preparation Samples may be assayed with proper dilution Dilute the samples based on the expected concentration of bovine lactoferrin to fall within the range of the standard curve Concentration bLF Recommended sample ug ml dilution raw milk 150 200 1 4000 pasteurized milk crude semi skimmed me 100 1 2000 sterilised milk lt 0 03 1 10 colostrum 700 900 1 20000 normal bovine serum 0 5 0 7 1 20 milk powder whole and semi skimmed 0 5 2 1 25 reconstitued
9. oxydante antivirale antifongique et anti inflammatoire En novembre 2012 la bLF purifi e partir du lait est agr e comme Novel Food Ingredient par l Autorit Europ enne de S curit des Aliments EFSA Elle peut donc tre aujourd hui utilis e comme un additif dans de nombreux produits alimentaires tels que les formulations infantiles ou les produits laitiers 2 DOMAINE D APPLICATION Le kit ELISA bLF Test s applique au dosage de la lactoferrine bovine dans les colostrums et poudres de colostrums bovins les laits et poudres de laits bovins les s rums bovins Ce kit est destin la recherche uniquement et n est pas pr vu pour tre utilis des fins de diagnostic 3 PRINCIPE Ce test immuno enzymatique est un test ELISA de type sandwich Il a t d velopp partir d un s rum de lapin immunis contre la lactoferrine bovine Les immunoglobulines IgG de ce s rum ont t purifi es par chromatographie d changes d ions Une fraction des IgG a t marqu e la peroxydaxe IgG HRP Les plaques ELISA sont sensibilis es avec les IgG purifi es et stabilis es Elles sont fournies pr tes a l emploi 5 31 Lors des essais les standards et les chantillons sont incub s dans les puits des plaques sensibilis es La lactoferrine bovine pr sente est captur e par les IgG anti bLF Apr s l tape de lavage les IgG HRP sont distribu es dans les puits Celles ci r agissent avec le
10. BLK les chantillons et les contr les dans un portoir au format 96 puits en suivant le sch ma de d p t Distribuer la pipette multicanal 8 canaux 100 pl puits de chaque solution Filmer la plaque et agiter doucement sur un agitateur de plaque lt 500 rpm Incuber 1 heure a 25 C sans agitation Proc der au lavage de la plaque 5 fois cf point 2 4 Incubation du conjugu IgG HRP Verser la solution d lgG HRP dilu e au 1 40 dans un r servoir propre et neuf Distribuer la pipette multicanal 8 canaux 100 pl puits de cette solution Filmer la plaque et agiter doucement sur un agitateur de plaque lt 500 rpm Incuber 1 heure 25 C sans agitation et au noir Proc der au lavage de la plaque 5 fois cf point 2 11 31 5 Incubation du substrat TMB solution pr te l emploi Jeter la solution de TMB si celle ci pr sente une coloration bleue Verser la solution de TMB dans un r servoir propre et neuf Distribuer la pipette multicanal 8 canaux 100 pl puits de cette solution Filmer la plaque et agiter doucement sur un agitateur de plaque lt 500 rpm Incuber entre 15 et 30 minutes 25 C sans agitation et au noir 6 Solution stop Verser la solution d H2SO 0 45M dans un r servoir propre et neuf Distribuer la pipette multicanal 8 canaux 50 pl puits de cette solution La coloration bleue vire alors au jaune Filmer la plaque et agiter doucement sur un agitateur de plaque lt 500 r
11. H HHHH HoH 2 000 1 500 e 1 000 e 0 500 e 0 1 1 10 100 1000 Concentration lactoferrine bovine Les concentrations des chantillons sont calcul es au moyen du mod le logistique par interpolation des absorbances DO 450nm lues 14 31 12 CONSEILS TECHNIQUES Des changements au niveau de l op rateur de la technique de pipetage ou de lavage des temps d incubation et ou de la temp rature peuvent engendrer des variations dans les r sultats Pour l obtention de r sultats pr cis et reproductibles les distributions des talons et chantillons doivent tre soigneuses Utiliser obligatoirement une pipette multicanal 8 canaux distribuer de gauche droite pour toutes les tapes du test Utiliser uniquement des pipettes de pr cision ayant t v rifi es m trologiquement et dont la v rification est encore valide De la m me fa on utiliser un lecteur de plaques v rifi m trologiquement une attention toute particuli re doit tre port e la v rification de sa lin arit et la d termination de sa DO max la longueur d onde de travail Eviter de faire mousser les solutions lors des dilutions Pour viter les contaminations crois es changer les c nes de pipettes entre chaque chantillon talon et r actif Utiliser des flacons et des r servoirs individuels r f renc s ou neufs pour chaque r actif Les tapes de lavage sont tr s importantes respecter le nombre de cycles de lavage
12. HANTILLONS PR PARATION DES R ACTIFS 10 9 1 PR PARATION DE LA GAMME D TALONNAGE 10 9 2 PR PARATION DU CONJUGU IGG HRP 10 MODE OP RATOIRE 11 RESUETATS 44 12 CONSEILS TECHNIQUES 13 CONSIGNES DE SECURITE 14 CARACTERISTIQUES TECHNIQUES TABLE OF CONTENTS INTRODUCTION nn ns FIELD OF APPLICATION ASSAY PRINCIPLE KIT CONTENT STORAGE CONDITIONS REAGENTS AND EQUIPMENTS REQUIRED PREPARATION OF THE WASH BUFFER SAMPLES PREPARATION REAGENTS PREPARATION 9 1 STANDARDS PREPARATION 9 2 CONJUGATE SOLUTION PREPARATION IG HRP 10 INSTRUCTIONS 11 RESULTS 12 TECHNICAL ADVICES 13 SAFETY RECOMMENDATIONS 14 ASSAY CHARACTERISTICS CLONES D ANNEXE ANNEX s 1 5525 555555558555535 355955599555993259449594 55344555279459655 30 4 31 1 INTRODUCTION La lactoferrine bovine bLF est une glycoprot ine s rique de 80 kDa ayant la capacit de se lier au fer Fe3 Elle est retrouv e dans la plupart des fluides biologiques notamment dans le lait et joue un r le majeur dans le syst me de d fense de l organisme On lui attribue de nombreuses actions physiologiques r le antimicrobien immuno modulateur anti tumoral r le dans l absorption du fer ou encore dans la croissance osseuse La bLF poss derait galement des propri t s anti
13. SC32_PR_vi_14 09 2015 VIDBiotech hnologi ELISA bLF kit Kit ELISA pour la quantification de la lactoferrine bovine dans les laits et poudres de lait les colostrums et poudres de colostrum et les s rums bovins ELISA kit for quantification of bovine lactoferrin in milk and milk s powders colostrum and colostrum s powders and in bovine sera Manuel d utilisation Instruction manual Development Manufacture R amp D and OEM Services www idbiotech com 2 31 ELISA bLF kit R f rence catalogue E_bLF_01 Kit ELISA de dosage de la lactoferrine bovine Catalogue reference E_bLF_01 ELISA kit for quantification of bovine lactoferrin Kit ELISA pour la quantification de la lactoferrine bovine dans les laits et poudres de lait les colostrums et poudres de colostrum et les s rums bovins ELISA kit for quantification of bovine lactoferrin in milk and milk s powders colostrum and colostrum s powders and in bovine sera Ce document doit tre lu dans son int gralit avant utilisation du test This document must be fully read before running the kit for the first time 50 9901 Quality Management System 1S09001 2008 certified by BUREAU VERTS 3 31 TABLE DES MATIERES INTRODUCTION DOMAINE D APPLICATION 1 2 3 4 COMPOSITION DU KIT 5 CONDITIONS DE STOCKAGE 6 7 8 9 REACTIFS ET EQUIPEMENTS PREPARATION DU TAMPON DE LAVAGE PREPARATION DES EC
14. age et les p riodes d incubation Laisser remonter temp rature ambiante tous les r actifs avant utilisation Homog n iser chaque flacon manuellement par retournements successifs avant utilisation Ne pas m langer de r actifs provenant de lots diff rents 6 R ACTIFS ET QUIPEMENTS Eau distill e ou d ionis e PANREAC 212236 1214 ou quivalent Tubes h molyse en verre usage unique Tubes de microtitration 1 2mL usage unique 8 8mm x 45mm avec portoir de tubes au format plaque ELISA Flacon usage unique pour pr paration du tampon de lavage R servoirs pour distribution des r actifs Films adh sifs pour plaque ELISA Micropipettes de pr cision 10 5000 ul et c nes jetables adapt s Micropipette multicanal 8 canaux volume variable 30 300 ul et c nes jetables adapt s Microcentrifugeuse et cupules adapt es Laveur de plaque automatique ou laveur manuel Agitateur orbital type IKA Vibrax avec plateau pour microplaque Lecteur de plaques ELISA avec filtre 450 nm Logiciel d exploitation des donn es avec mod le logistique 4 param tres 7131 7 PREPARATION DU TAMPON DE LAVAGE Pr parer le tampon de lavage comme suit dans un flacon propre verser le flacon de 100mL de tampon de lavage 10X R1 Compl ter avec 900mL d eau d ionis e ou distill e 1 Homog n iser le tampon de lavage par agitation manuelle douce 2 La solution peut tre conserv e entre 2 C et 8 C pendant 15
15. at 100mg mL milk powder skimmed 10 30 1 400 reconstitued at 100 mg mL colostrum powder reconstituted at 100 mg mL 200 900 1 4000 The recommended dilution for samples should be used as a guideline If unsure of sample level a serial dilution with one or two representative samples before running the entire plate is highly recommended In order to optimize the use of the dilution buffer R2 provided in the kit we advise to dilute the samples by serial dilution under appropriate volumes For example a dilution 1 4000 can be realized as follow dili 1 10 50ul sample dil2 1 10 1 100 final 50ul dil1 dil3 1 10 1 1000 final 50ul dil2 dil4 1 4 1 4000 final 125ul dil3 450ul buffer R2 450ul buffer R2 450ul buffer R2 375ul buffer R2 Reconstitute milk and colostrum powders at 100 mg mL in deionised water Homogenise with a vortex and mix slowly on a rotative shaker for 20min at room temperature Centrifuge 5min gt 100000 collect the supernatant and then dilute at the recommended dilution 21 31 It is recommended that each laboratory uses internal quality controls samples in routine analysis to insure that all reagents and procedures are correct 22 31 9 REAGENTS PREPARATION 9 1 Standards preparation A working solution at 2000 ng mL of bovine lactoferrin is prepared extemporaneously by diluting the stock solution R3 solution at 20ug ml of bovine lactoferrin to 1 10 in the R2 dilution buffer as fol
16. er software using curve fitting models such as 4 parameter logistic model Y A D 1 X C B D Exemple of standard curve n kit E_BLfir_01_ 152241 3 000 9 2 500 2 000 1 800 1 000 e 0 500 0 000 0 1 1 10 100 1000 Concentration lactoferrine bovine Absorbances of samples are interpolated from the calibration curve It is recommended that each laboratory uses internal quality controls samples in each routine analysis to insure that all reagents and procedures are correct 27 31 12 TECHNICAL ADVICES Any improper handling of samples or modification of the test procedure may influence the results The indicated pipetting volumes incubation times temperatures and pretreatment steps have to be performed strictly according to the instructions Avoid contamination of reagents pipettes and wells tubes Use new disposable plastic pipette tips for each component and sample Do not interchange caps Always cap not used vials Do not reuse wells tubes or reagents Once the test has been started all steps should be completed without interruption Make sure that required reagents materials and devices are prepared ready at the appropriate time Allow all reagents and samples to reach room temperature and gently homogenize each vial of liquid reagent and sample before
17. jours 8 PREPARATION DES ECHANTILLONS Stocker les chantillons a 5 3 C si ceux ci doivent tre analys s sous quelques jours Les congeler pour une conservation plus long terme viter les cycles cong lation d cong lation Laisser remonter temp rature ambiante les chantillons avant analyse 65 chantillons doivent tre dilu s de fa on appropri e afin de se situer dans le domaine de concentration de la gamme d talonnage Ne pas utiliser de tubes polystyr ne lors des phases de pr paration et de dilution des chantillons Les concentrations moyennes observ es permettent de recommander les facteurs de dilution suivants en fonction de la nature des chantillons Concentration bLF Facteur de Echantillon ug ml dilution conseill lait cru 150 200 1 4000 lait pasteuris entier demi cr m ie lait UHT lt 0 030 1 10 colostrum 700 900 1 20000 s rum bovin normal 0 5 0 7 1 20 poudre de lait type R gilait entier et demi cr m 0 5 2 1 25 reprise sous 100mg ml poudre de lait type R gilait cr m 10 30 1 400 reprise sous 100 mg ml poudre de colostrum 200 300 1 4000 reprise sous 100 mg ml 8 31 Ces facteurs de dilution sont des valeurs recommand es Si le niveau de concentration attendu n est pas connu il est recommand de r aliser sur 1 ou 2 chantillons repr sentatifs un essai en proc dant des dil
18. lows 50uL stock solution R3 450uL R2 buffer Homogenise the solution Discard after use The standard solutions are prepared in micro titration tubes as follows STD 1 gt 200 ng ml 100 uL work Sol 900 uL R2 buffer STD 2 gt 100 ng ml 500 uL STD 1 500 uL R2 buffer STD 3 gt 50 ng ml 500 uL STD 2 500 uL R2 buffer STD 4 gt 25 ng ml 500 uL STD 3 500 uL R2 buffer STD 5 gt 12 5 ng ml 800 uL STD 4 500 uL R2 buffer STD 6 gt 6 25 ng ml 800 uL STD 5 500 uL R2 buffer STD 7 gt 3 125 ng ml 500 uL STD 6 500 uL R2 buffer Blank BLK 500 uL R2 buffer Homogenise the solution with an orbital shaker between each dilution Discard after use The volumes are indicated for standards assays in duplicate 9 2 Conjugate solution preparation Ig HRP Prepare a 1 40 diluted solution of the 40 fold concentrated Conjugate Ig HRP 84 in the dilution buffer R2 19 HRP 1 40 300uL R4 conjugate 40X 11 7mL R2 buffer Homogenise slowly by manual inversions of the vial Discard after use 23 31 10 INSTRUCTIONS Bring all reagents to room temperature including the coated ELISA plate in its aluminum pouch kept closed do not open until temperature equilibration All standards controls and samples should be tested at least in duplicate 1 Prepare the wash buffer samples standards and controls Remove the appropriate number of strips from the aluminum pouch and return to 2 C 8 C
19. mog n iser par retournements successifs lents Cette solution est jet e apr s utilisation 10 MODE OP RATOIRE 10 31 Laisser remonter tous les r actifs temp rature ambiante avant utilisation Il est recommand d analyser les chantillons contr les et standards en duplicate 1 Pr parer le tampon de lavage les chantillons contr les et standards comme d crit dans les paragraphes pr c dents Sortir la plaque ELISA du r frig rateur et la laisser s quilibrer a la temp rature du laboratoire dans son sachet aluminium non ouvert environ 30 minutes a temp rature du laboratoire Sortir le nombre de barrettes n cessaires du sachet aluminium et les fixer sur le cadre Refermer soigneusement le sachet aluminium et le replacer 5 3 C Veiller ne pas toucher le dessous des barrettes 2 Laver les barrettes l aide d un laveur de plaque ELISA manuel ou automatique selon le protocole suivant Distribuer 250 300ul de tampon de lavage R1 1X dans chaque puits Vider les puits par retournement ou par aspiration R p ter l op ration 4 fois Apr s le dernier lavage liminer les gouttelettes r siduelles en tapant la plaque retourn e sur du papier absorbant propre et sec NB Ne pas laisser s cher les puits entre deux tapes 3 Incubation de la gamme talon du blanc des chantillons et t moins de contr le Disposer les tubes de microtitration contenant la gamme d talonnage les blancs
20. pm 7 Retirer l adh sif et lire les DO 450nm l aide d un lecteur de microplaques 12 31 R sum du mode op ratoire Pr parer le tampon de lavage Pr parer la gamme d talonnage Pr parer les chantillons contr les Laver les barrettes Distribuer 100 de chaque talon chantillon ou contr le Incuber 1 heure 25 C sans agitation g Laver les barrettes Distribuer 100ul puits de la solution de conjugu IgG HRP Incuber 1 heure 25 C sans agitation au noir g Laver les barrettes Distribuer 100yl puits de la solution de substrat Incuber entre 15 30 minutes 25 C sans agitation au noir Distribuer 50yl puits de la solution stop Lire l absorbance a 450 nm Interpr ter les r sultats 13 31 11 RESULTATS La courbe d talonnage est obtenue en portant en ordonn es les densit s optiques DO lues pour chaque standard et en abscisse leurs concentrations en ng ml chelle logarithmique La courbe d talonnage est g n r e en utilisant un mod le logistique 4 param tres Y A D 1 X C B D au moyen d un logiciel d exploitation des donn es poss dant cette fonction Un exemple de courbe d talonnage obtenue est donn ci dessous n kit E_BLfr_01_152241 3 000 2 500 H
21. r the quantification of bovine lactoferrin bLF in bovine milk and milk powders bovine colostrum and colostrum powder bovine serum This kit is intended for research and manufacturing use only not for diagnostic uses 3 ASSAY PRINCIPLE This immuno enzymatic assay is a sandwich ELISA It was developed from a rabbit serum raised against bovine lactoferrine bLF The immunoglobulins IgG were purified by ion exchange chromatography A fraction of these IgG is used as purified capture antibody the ELISA plate is coated with the purified fraction of IgG stabilized and delivered ready to use Another fraction was labeled to horseradish peroxidase IgG HRP and is used as a conjugate antibody When performing the assay wells of the ELISA plate are filled with standards and samples The anti bLF antibody solid phase capture the bovine lactoferrin contained in the standards and samples The ELISA plate is washed to remove any unbound material 17 31 The solution of IgG HRP is distributed in ELISA wells and react with the antibody bLF complex of the solid phase The reaction results in the formation of a sandwich complex After washing the complex is revealed using tetramethyl benzidine chromogen substrate TMB The Optical Density OD generated by the hydrolysis of the substrate is measured using a microtiter plate reader The OD is directly proportional to the concentration of bovine lactoferrin 18 31 4 KIT CONTENT
22. s lait inter essai poudre de colostrum et s rum 6 r p titions par run d essai 3 runs n 18 de recouvrement compris entre 95 et 140 sur la matrice lait en moyenne 115 20 Spike a 3 niveaux de concentration sur la matrice lait x d terminations Exactitude Range de quantification Range de quantification 5 100 ng ml R action crois e faible avec lait de ch vre brebis et colostrum de truie moyenne avec lait de bufflonne Sp cificit n ante avec lait de chamelle colostrum de jument Aucune reconnaissance des autres prot ines solubles du lait de vache betalactoglobuline alphalactalbumine immunoglobulines G et albumine 16 31 1 INTRODUCTION Bovine lactoferrin bLF is a 80 kDa glycoprotein able to bind iron Fe3 It is found in most of the biological fluids mainly in milk and plays key roles in the defense mechanism of the organism A lot of biological activities have been reported for bLF antimicrobial immuno modulator anti tumoral absorption of iron or bone growth Anti oxydant antiviral antifungal and anti inflammatory activities have also been reported for bLF In November 2012 bLF purified from milk and whey was approved as a Novel Food Ingredient by the European Food Safety Authority EFSA Accordingly bLF can now be used as an additive in many food products such as infant formula and dairy products 2 FIELD OF APPLICATION This kit is intended fo
23. substrate solution use an 8 channel pipette Cover with an adhesive and shake gently for a few seconds on a plate shaker lt 500 rpm Incubate 30minutes at 25 C without agitation in the dark A blue coloration will develop gradually during this step 24 31 6 Stop solution Pour the ready to use stop solution ST H2SO 0 45M into a clean reservoir Pipette 50yul well of the stop solution use an 8 channel pipette The blue coloration will turn to yellow Cover with an adhesive and shake gently for a few seconds on a plate shaker lt 500 rpm 7 Remove the adhesive and read the absorbance at 450nm with a microplate reader 25 31 26 31 Simplified assay protocol Prepare the wash buffer standards samples and controls g Wash the strips Pipette 100ul well of standards blanks samples and controls in duplicate Incubate 1 hour at 25 C without agitation g Wash the strips Pipette 100yl well of the conjugate solution IgG HRP Incubate 1 hour at 25 C without agitation in the dark Wash the strips Q Pipette 100ul well of the substrate Incubate from 15 to 30 minutes at 25 C in the dark Fill 50 of the stop solution g Read the absorbance at 450nm 11 RESULTS The standard curve is constructed by reporting the OD at 450nm of each standard on the Y axis versus their respective concentrations of HCP in ng mL on the X axis The data reduction is performed through a comput
24. use Mix reagents without foaming Incubation time affects results All wells should be handled in the same order and time sequences It is recommended to use an 8 channel Micropipettor for pipetting of solutions in all wells Maintain a repetitive timing sequence from well to well for all assay steps to insure that all incubation times are the same for each well Microplate washing is important Improperly washed wells will give erroneous results It is recommended to use a multichannel pipette or an automatic microplate washing system Do not allow the wells to dry between incubations Do not scratch coated wells during rinsing and aspiration Rinse and fill all reagents with care While rinsing check that all wells are filled precisely with Wash Buffer and that there are no residues in the wells Use qualified and approved equipment and devices pipettes plate reader Humidity can affect the ELISA coated wells Do not open the aluminum pouch until the ELISA plate reaches room temperature Change pipette tips between each sample calibration standard and reagent to avoid cross contamination 13 SAFETY RECOMMENDATIONS Follow good laboratory practice and safety guidelines Wear lab coats disposable gloves and protective glasses where when necessary Stop solution is 0 45M H SO4 Avoid contact with eyes skin and clothing At the concentrations used in this kit none of the other reagents are believed to be harmful 28 31 14
25. utions successives avant de lancer un essai complet Afin de disposer de suffisamment de tampon de dilution R2 fourni dans le kit nous recommandons d effectuer les dilutions de fa on successives sous des volumes adapt s Par exemple pour une dilution 1 4000 911 1 10 50ul chantillon 450ul tampon R2 dil2 1 10 1 100 final 50ul dil1 450ul tampon R2 dil3 1 10 1 1000 final 50ul dil2 450ul tampon R2 dil4 1 4 1 4000 final 125ul 913 375ul tampon R2 Les facteurs de dilution indiqu s pour les chantillons de type poudre correspondent a des reprises de poudre 100mg ml Les reprises sont faites en eau d ionis e Homog n iser la solution au moyen d un vortex puis placer sur un agitateur rotatif 20 minutes TA Centrifuger 5min en cupules 1 5ml gt 10000g r cup rer le surnageant et le diluer comme indiqu ci dessus Pour l analyse de routine il est recommand de disposer de t moins de contr le internes caract ris s int grer lors de chaque essai afin de s assurer de la performance du test 9 31 9 PREPARATION DES REACTIFS 9 1 Pr paration de la gamme d talonnage La gamme d talonnage est pr par e a partir de la solution m re R3 dont la concentration est de 20ug mL en lactoferrine bovine bLF La gamme d talonnage est r alis e a partir d une solution fille 2000 ng ml de bLF La solution fille est r alis e par dilution au 1 10 en tampon R2 de la solution m re R3
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