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Notice d`accompagnement de la trousse - Support

1. 1 2 3 1 2 3 m CO e o o wo o o o so f 31 1717 1G gt A 810 804 804 804 100 100 HET A R347P G551D 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 HET a s m O E ao o o se w x won O ou mo o Om o A 39 F508del 3849 810 12 12 12 798 798 798 100 100 10kbC gt T HET pan 00 60 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Appels concordants Nombr Appels concordants ee Nombre Nombr N E e total positifs variants neeatite deye d appel e Concordan Concordan Concordan Pan A G notype de Varian sauvage Di EN d chantill d appe s d aucu ce positive ce n gative ce globale el Y chantillon ts i en o do Pa SPa Gite Site Site Site Site Site TOT site appels 1 2 3 1 2 3 dd A 41 F508del 3659de 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 IC HET A 43 G85E 621 1G 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 gt T HET x san oo fe 6 6 eu mo Oo ww B 47 2789 5G gt A 810 804 804 804 100 100 100 HOM B 49 F508del 1898 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 1G gt A HET 61 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MOC 1 0 Appels concordants Nombr Appels concordants ee Nombre Nombr N s e total positifs variants neeatite deye d appel e Concordan Concordan Concordan Pan A G notype de Varian sauvage Di EN d chantill d appe s d aucu ce positive ce n gative ce globale el Y chantillon ts
2. Les donn es qui ressortent de ces tudes de pr cision confirment que la plateforme MiSeqDx peut s quencer avec pr cision les l ments suivants Teneur en GC gt 19 toutes les bases dans 135 des 135 amplicons s quenc s ayant un taux de 19 de teneur en GC appel correctement Teneur en GC lt 72 toutes les bases dans 135 des 135 amplicons s quenc s ayant un taux de 72 de teneur en GC appel correctement Longueurs de PolyA lt 7 la r p tition PolyA de 7 nucl otides a t appel e correctement dans 270 des 270 amplicons s quenc s contenant PolyA 7 Longueurs de PolyT lt 8 la r p tition PolyT de 8 nucl otides a t appel e correctement dans 270 des 270 amplicons s quenc s contenant PolyT 8 Longueurs de PolyG lt 6 la r p tition PolyG de 6 nucl otides a t appel e correctement dans 405 des 405 amplicons s quenc s contenant PolyG 6 Longueurs de PolyC lt 7 la r p tition PolyC de 7 nucl otides a t appel e correctement dans 135 des 135 amplicons s quenc s contenant PolyC 7 38 N 15039608 R v FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 e _ Longueurs de r p tition de dinucl otide lt 5 x toutes les bases dans 135 des 135 amplicons s quenc s avec 5 x r p tition de dinucl otide ont t appel es correctement e _ Longueurs de r p tition de trinucl otide lt 4 x toutes les bases dans 810 des 810 amplicons s quenc s avec 4 x r p tition
3. F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 6 Le nombre d appels incorrects est le nombre total d appels incorrects pour le SNV ou l indel dans cet amplicon des d tails suppl mentaires sur les appels incor rects sont pr sent s dans les notes de bas de page ci dessous 7 Le d appels corrects correspond au taux d appels corrects pour toutes les bases dans l amplicon o l appel correct pour le SNV ou l indel est bas sur les ren seignements de r f rence composite bien caract ris e et l appel correct pour les bases dans le reste de la s quence de l amplicon est bas sur la comparaison de la s quence de r f rence du g nome humain version 19 Cette colonne peut afficher plus d un r sultat pr vu pour un amplicon donn si certains chantillons contiennent un indel et d autres non par exemple l amplicon 9 Le d appels corrects pour les chantillons avec un r sultat incorrect est pr sent dans le tableau 8 L amplicon 9 a une analyse d homopolymeres de 14 A selon la s quence de r f rence du g nome humain version 19 Toutefois les renseignements de r f rence composite bien caract ris e pour sept des 13 chantillons ont 13 A dans cette analyse d homopolym res Dans ces sept chantillons cette suppression de paires de base 1 repr sente un faux n gatif dans l tude de pr cision de s quen age MiSeqDx 2 L amplicon 46 a une insertion de base 1 qui est rapport e dans neuf chantillons dans la base de
4. Poly T 5 R gion homologue sur un chromoso me diff rent Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 d Contenu Nomb g 5 g nomiqu IERS Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre Amplico Ch fragme analyses 7 7 e re total total re total total d appe re total total d appe n r nt d chantillo 7 P de d aucu d appels d aucu d appels ls d aucu d appels ls id ns l amplicon n incorrec n incorrec poed n incorrec correct appels tst appels appels s eae LM CA A EA a 4 133 Poly C 7 135 100 100 100 66 en GC KC EE ES E COS EC e e p we CE ede E EC CO b m o p m o CS 2 O1 KC E E E CS CS ES COS CO EC CO CES KC ECO E E COS CO ES COS COR EC CS CE 42 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 d Contenu Nomb g ds g nomiqu dus as Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre Amplico Ch fragme d analyses 7 7 e i re total total re total total d appe re total total d appe n r nt d chantillo gt f P i de d aucu d appels d aucu d appels ls d aucu d appels ls analys F ns 3 l amplicon n incorrec n incorrec correct n incorrec correct 1 appels tst appels tst s appels tst s 39 Poly A 5 Poly T 5 SNV 100 ade w s e p e e o w o CS edes o de bo b
5. 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Nombre Taill Nomb Nomb E Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre P h Pap T de els u appels appels Amplicon Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PP pE PP fragment amplicon anaue analys s vant er corrects par incorrects corrects analys p q y iS PPE chantillon 6 7 effectu s 159 16 122 E 13 15 122 0 122 0 100 165 17 116 Poly C 6 13 15 116 116 60 en GC SNV zo E ES ICO EC E CO CEE m 00 33 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Nombre Taill Nomb Nomb E sl Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre P h Pap T de els u appels appels Amplicon Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PP pE PP fragment amplicon anaue analys s at er corrects par incorrects corrects analys p q y iS g PPE chantillon 6 7 effectu s 173 17 138 61 en GC 13 15 138 0 138 0 100 66 en GC 34 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSegDx MC 1 0 Amplicon 187 188 189 190 191 192 193 194 195 1 S entend par fragment analys la taille de la r gion g nomique s quenc e dans les bases sans prendre en compte les primers sp cifiques la cible Chromosome 19 19 19 19 20 22 22 Taille du fragment analys 121 138 123
6. 27 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Nombre Taille Nombre Nombre d Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre a 1 d 1 danses u appels appels Amplicon Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PP f pE PP fragment amplicon anaue analys s vant sonal corrects par incorrects corrects analys p y y 3 PE chantillon 6 7 effectu s 89 9 130 Poly T 5 13 15 130 0 130 0 100 91 119 R gion 13 15 119 119 100 homologue sur un chromosome diff rent 93 117 R gion 13 15 117 117 100 homologue sur un chromosome diff rent 28 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MOC 1 0 Amplicon 101 103 105 107 109 111 113 Nombre A Taille Nombre Nombre Vo d Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre a 1 d 1 danses u appels appels Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PP f pE PP fragment amplicon anaue analys s a isnels corrects par incorrects corrects analys P q y id y PR chantillon 6 7 effectu s 133 Poly A 5 13 15 133 133 100 57 en GC 136 Poly C 5 13 15 136 136 100 67 en GC 10 139 58 en GC 13 15 139 139 100 SNV 29 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MOC 1 0 Nombre Taille Nombre Nombre d Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre a 1 d 1 danses u appels appels Amplic
7. R vision et Pre Run Check V rification avant analyse 3 S lectionnez Diagnostic Run Analyse de diagnostic Lorsque l cran Load Flow Cell Charger la Flow Cell s affiche nettoyez et chargez la Flow Cell 5 Fermez le verrou de la Flow Cell et la porte du compartiment de la Flow Cell Le verrou et la porte du compartiment doivent tre ferm s avant le lancement de l analyse Une fois la Flow Cell charg e le logiciel lit et enregistre l identification par radiofr quence RFID Une confirmation de lecture RFID correcte s affiche dans le coin inf rieur droit de l cran 6 Lorsque l cran Load Reagents Charger les r actifs s affiche videz le flacon d chets chargez le flacon de Solution SBS PR2 MiSeqDx puis chargez la cartouche de r actifs Lorsque le flacon de MiSeqDx SBS Solution PR2 et la cartouche de r actifs sont charg s le logiciel lit et enregistre le RFID Une confirmation de lecture RFID correcte s affiche dans le coin inf rieur droit de l cran 7 S lectionnez la feuille d chantillons appropri e Par d faut le logiciel recherchera un fichier de feuille d chantillons avec un nom correspondant au code barres de la cartouche de r actifs charg e sur l instrument 8 Confirmez les param tres d analyse et les r sultats de la v rification avant analyse 9 D marrez l analyse L cran Sequencing S quen age s ouvre lorsque l analyse d marre Cet cran fournit une repr sentation visuelle
8. llumina Trousse universelle MiSegDx MC 1 0 DESTIN AUX DIAGNOSTICS IN VITRO UNIQUEMENT N de r f rence DX 103 1001 2 analyses jusqu 96 chantillons par trousse Utilisation pr vue La Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1 0 est un ensemble de r actifs et de consommables utilis la fois dans le traitement d chantillons ADN g nomique humain provenant de sang total p riph rique et dans le s quen age cibl ult rieur des librairies d chantillons qui en d coulent Les r actifs sp cifiques aux analytes fournis par l utilisateur sont n cessaires pour la pr paration des librairies ciblant des r gions g nomiques d int r t sp cifiques La Trousse universelle MiSeqDx 1 0 est destin e tre utilis e avec l instrument MiSeqDx Principes proc duraux La plateforme Illumina MiSeqDx compos e de la Trousse universelle MiSeqDx 1 0 et de l instrument MiSeqDx est con ue pour le s quen age cibl d ADN g nomique humain d apr s des chantillons de sang total p riph rique l aide de r actifs contenus dans le Trousse universelle MiSeqDx 1 0 l ADN g nomique est trait travers les tapes de pr paration de la librairie qui amplifient sp cifiquement Les r gions g nomiques pr vues de chaque chantillon en utilisant les oligonucl otides personnalis s con us par l utilisateur tout en ajoutant les index et les s quences de saisie pour les produits amplifi s Les librairies d chantillons obten
9. 138 117 136 122 122 119 Contenu g nomique de Vamplicon Poly C 5 72 en GC R gion homologue sur un chromosome diff rent 58 en GC 64 en GC Poly T 5 Poly A 7 Poly A 5 Poly C 5 62 en GC SNV 66 en GC Nombre d chantillons uniques 13 13 Nombre total d chantillons analys s 15 15 15 15 15 15 15 15 15 Nombre d appels par chantillon ayant t effectu s 121 138 123 138 117 136 122 122 119 Nombre d aucun appel Nombre d appels corrects par chantillon 121 138 123 138 117 136 122 122 119 Nombre d appels incorrects 6 2 Le nombre total d chantillons r pertori s est de 15 car deux des 13 chantillons uniques analys s ont t analys s en deux r plicats ind pendants 3 Le nombre d appels par chantillon ayant t effectu s est le nombre de bases ayant une qualit suffisante pour tre d finis par le syst me 4 Le nombre d aucun appels est le nombre de bases dans un amplicon entra nant aucun appel dans l analyse d appels corrects 7 100 100 100 100 100 100 100 100 100 5 Le nombre d appels corrects par chantillon est le nombre de bases dans l amplicon qui ont t d finies et ayant des r sultats correspondant la s quence de r f rence du g nome humain version 19 et la r f rence composite bien caract ris e 35 N 15039608 R v FRA
10. 7 127 59 en GC 135 100 100 SNV pot on ES CR A A E 7 O1 m 00 RS a CR CS Ce Co CR CIE PE EE O ESO LE CA 45 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 46 Amplico 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 Ch Taille du fragme nt analys IS m D a m 119 m i 117 N 15039608 R v A FRA Contenu g nomiqu de amplicon 58 en GC 61 en GC nr R gion homologue sur un chromoso me diff rent R gion homologue sur un chromoso me diff rent Nombre d analyses d chantillo ns 135 135 135 MiSeqDx 1 Nomb re total d aucu Nombre total d appels n incorrec appels 100 100 100 100 100 100 100 100 100 MiSeqDx 2 Nomb re total d aucu total tst Nombre d appels incorrec d appe ls correct Ss 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 MiSeqDx 3 Nomb Nombre re total total d aucu d appels n incorrec appels ts d appe ls correct s 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 d Contenu Nomb E S g nomiqu sense Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre Amplico Ch fragme d analyses e i re
11. HET F508del 2184de IA HET Y122X R1158X HET F508del 2183A A gt G HET R75X HET 57 N 15039608 R v A FRA Varian ts Nombr e total d appe ls par site 810 810 810 810 810 810 810 Appels concordants positifs variants Site Site 1 2 6 6 6 6 12 12 112 12 12 10 12 12 6 6 Site 12 12 12 12 Appels concordants n gatifs de type sauvage Site Site 1 2 804 804 804 804 798 798 797 798 798 665 798 798 804 804 Site 804 804 798 798 798 798 804 Nombre d appel s incorrec ts Nombr e d aucu n appels 11 1352 Concordan ce positive 100 100 100 100 94 44 100 100 Concordan ce n gative 100 100 100 100 94 44 100 100 Concordan ce globale 100 100 100 100 94 44 100 100 F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Appels concordants Nombr Appels concordants ee Nombre Nombr N E e total positifs variants neeatite deye d appel e Concordan Concordan Concordan Pan A G notype de Varian sauvage Di EN d chantill d appe s d aucu ce positive ce n gative ce globale el Y chantillon ts i i Co co do Pa SPa Gite Site Site Site Site Site TOT y p site ts appels 1 2 3 1 2 3 A 93 F508del W1282 810 12 11 12 798 797 798 2 97 22 99 96 99 92 X HET 11 F508del 3849 810 12 12 12 798 798 798 100 10
12. Quantit ne Ingr dients actifs Stockage Billes de nettoyage 1 tube 5mL Solution aqueuse tamponn e contenant des billes 2 8 C PCR paramagn tiques en phase solide et du poly thyl ne glycol Lavage de 2 tubes 4 8 mL Solution aqueuse tamponn e contenant des sels 2 8 C normalisation de du 2 mercapto thanol et du formamide librairie Billes de librairie 1 tube 1 2 mL Solution aqueuse tamponn e contenant des billes 2 8 C paramagn tiques en phase solide Flow Cell MiSeqDx 2 conteneurs 1 Flow Cell Substrat en verre avec des oligonucl otides li s 2 8 C par covalence Trousse universelle MiSeqDx 1 0 bo te 4 Table 6 Bo te 4 r actifs de post amplification Volume de Composant Quantit remplissage Ingr dients actifs Stockage Solution SBS 2 flacons 353 1 mL Solution aqueuse tamponn e 2 8 C PR2 MiSeqDx Trousse universelle MiSeqDx 1 0 bo te 5 Table 7 Bo te 5 r actifs de pr amplification Volume de Leal Composant Quantit remplissage Ingr dients actifs Stockage Plaque filtrante 2 plaques S O Plaque de microtitration en polypropyl ne avec une 15 30 C membrane en poly thersulfone modifi e Table 8 Bo te 5 R actifs de post amplification Volume de a Composant Quantit remplissage Ingr dients actifs Stockage Tampon d lution 1 tube 4 8 mL Solution aqueuse tamponn e 15 30 C Tampon de 1 tube 3 5 mL Solution aqueuse tamponn e 15 30 C stockage de
13. chantillon ts i i ei co m di SPA Gite Site Site Site Site Site TOT j d site 1 appels 2 3 1 2 3 ts B F508del G551D 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 HET So R117H F508del HET B 85 2789 5G gt A 810 804 804 804 100 100 100 HOM B 87 F508del 1898 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 1G gt A HET B F508del 2143de 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 IT HET mamon o e CCC CCE Total 74556 2209 221182 99 77 99 88 99 88 64 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 1 L emplacement de type sauvage correspondant au variant N1303K pour un r plicat n a entra n aucun appel cause d une couverture insuffisante 2 Un r plicat des chantillons 5 et 75 avait un d bit d appel de 0 Le compl ment d enqu te indique que des chantillons peuvent ne pas avoir t ajout s la plaque d chantillons avant la pr paration de la librairie car les volumes d chantillon restants dans les tubes ne correspondaient aucun volume ayant t supprim 3 Des preuves indiquent que les chantillons 9 et 10 ont t vraisemblablement chang s par l op rateur avant la pr paration de la librairie 1 L emplacement de type sauvage correspondant au variant M1V pour un r plicat de chacun des deux chantillons n a entra n aucun appel cause d une couverture insuffisante 65 N 15039608 R v FRA F vrier 2014 Trousse universell
14. chantillons de sang total peuvent tre stock s pendant un maximum de 7 jours temp rature ambiante jusqu 30 jours entre 2 et 8 C ou jusqu 30 jours s ils sont congel s entre 15 et 25 C 3 Transportez le sang total pendant un maximum de 7 jours temp rature ambiante 30 jours entre 2 et 8 C ou 30 jours si congel entre 15 et 25 C Le transport de sang total doit se conformer aux r glements nationaux f d raux r gionaux et locaux sur le transport d agents tiologiques 4 Aucun effet n gatif sur la performance de la trousse n a t observ lorsque le sang total a t soumis six cycles de cong lation d cong lation 5 Aucun effet n gatif sur la performance de la trousse n a t observ sur les chantillons de sang total contenant de la bilirubine du cholest rol de l h moglobine des triglyc rides ou de EDTA Avertissements et pr cautions ATTENTION y La loi f d rale am ricaine n autorise la vente de ce dispositif que sur ordonnance ou par un m decin ou tout autre professionnel de la sant autoris par la l gislation de l tat dans lequel il ou elle exerce utiliser ou ordonner l utilisation de cet appareil 1 Certains composants de cette trousse contiennent du formamide un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive Pour plus de renseignements consultez la section R actifs la page 3 Des risques de l sions corporelles peuvent survenir par inhala
15. d indexage figurant dans le Table 10 Pour effectuer avec pr cision des analyses plus petites au moins huit chantillons doivent tre pr sents Si six chantillons uniques l exclusion des contr les positifs et n gatifs ne sont pas disponibles il convient d effectuer l analyse avec des r plicats d chantillons de n importe quel chantillon d ADN g nomique humain Consultez le Table 10 pour conna tre l ensemble minimal d index quilibre chromatique utiliser pour les analyses de s quen age de huit chantillons Table 10 Combinaisons de primers d indexage pour des analyses de s quen age avec 8 chantillons Primer d indexage 1 Primer d indexage 2 Primer d indexage 10 A701 A702 A710 Primer d indexage C Echantillon 1 Echantillon 2 Echantillon 3 A503 Primer d indexage D Echantillon 4 chantillon 5 chantillon 6 A504 Primer d indexage E chantillon 7 chantillon 8 A505 F vrier 2014 N 15039608 R v A FRA 11 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 S quences de primer d indexage Table 11 S quences de Primers d indexage A A501 H A508 Primer d indexage S quence Primer d indexage A A501 Primer d indexage B A502 Primer d indexage C A503 Primer d indexage D A504 Primer d indexage E A505 Primer d indexage F A506 Primer d indexage G A507 Primer d indexage H A508 TGAACCTT TGCTAAGT TGTTCTCT TAAGACAC CTAATCGA CTAGAACA TAAGTTCC TAGACCTA Table 12
16. de trinucl otide ont t appel es correctement e Insertions de base 1 et suppression de 3 bases ou moins 2 des 3 insertions de base test es ont t appel es correctement Des appels corrects ont t effectu s pour deux insertions de base 1 dans des r gions non homopolym res dans 82 amplicons Une insertion de base 1 n a pas t appel e dans une analyse d homopolymeres de 14 A sur le chromosome 2 dans 135 amplicons 3 suppressions de base 1 sur 4 ont t appel es correctement Tous les appels corrects ont t effectu s dans des r gions non homopolymeres dans 4 amplicons Une suppression de base 1 n a pas t appel e dans une analyse d homopolymeres de 14 A sur le chromosome 9 dans 63 amplicons Les suppressions de base 2 ont t appel es correctement dans un chantillon Les suppressions de base 3 ont t appel es correctement dans 21 chantillons Reproductibilit La reproductibilit de la plateforme MiSeqDx a t d termin e l aide de deux tests repr sentatifs Etude 1 Un test repr sentatif a t con u pour tudier divers g nes couvrant 24 434 bases sur 19 chromosomes diff rents et contenant des exons potentiellement cliniquement pertinents L tude a examin 13 chantillons sur neuf analyses l aide de trois diff rents instruments MiSeqDx et trois op rateurs diff rents Table 16 Un seul lot de r actifs de pr paration de librairie et deux lots de consommables pour le s quen ag
17. des 45 analyses analysant l amplicon sp cifique l aide d un instrument MiSeqDx sp cifi 194 22 195 N NIN PR N D PNT NO NO 00 54 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSegDx MC 1 0 5 Le d appels corrects correspond au taux d appels corrects pour toutes les bases dans l amplicon o l appel correct pour le SNV ou l indel est bas sur la base de donn es de r f rence bien caract ris e et l appel correct pour les bases dans le reste de la s quence d amplicon est bas sur la comparaison de la s quence de r f rence du g nome humain version 19 Cette colonne peut afficher plus d un r sultat pr vu pour un amplicon donn si certains chantillons doivent avoir un indel et d autres non par exemple l amplicon 9 6 L amplicon 1 poss dait un certain nombre de bases dont le g notype ne pouvait pas tre appel 12 bases dans une analyse sur neuf dans NA12881 une base dans deux analyses sur neuf et trois bases dans une analyse sur neuf dans NA12886 20 bases dans une analyse sur neuf et 26 bases dans une analyse sur neuf dans NA12888 Cela est d la faible couverture dans les bases sans aucun appel dans ces analyses o la profondeur moyenne de s quen age tait de 33 2 avec un minimum de 21 et un maximum de 52 7 Lorsque le nombre d aucun appels n est pas inclus dans le calcul le taux d appels corrects est de 100 8 L amplicon 9 a une analyse d homopolymeres de 14 A s
18. donn es de r f rence bien caract ris e et est correctement d tect e dans tous les chantillons analys s 10 L amplicon 95 a une analyse d homopolym res de 14 A selon la s quence de r f rence du g nome humain version 19 Cependant les s quences de r f rence com posite bien caract ris e pour 13 des 13 chantillons ont 15 A dans cette analyse d homopolymeres Dans ces 13 chantillons cette insertion de paires de base 1 repr sente un faux n gatif dans l tude de pr cision de s quen age MiSeqDx 36 N 15039608 R v FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Le tableau suivant contient les donn es de l tude 1 pr sent es avec la concordance positive et n gative en pour cent o les r sultats des variants sont compar s aux renseignements de r f rence composite bien caract ris e pour le calcul de la concordance positive en pour cent CPP tant donn que les renseignements de r f rence composite fournissent uniquement des r sultats pour les variants simple nucl otide et les insertions suppressions les r sultats des bases sans variants sont compar s a la s quence de r f rence du g nome humain version 19 pour le calcul de la concordance n gative en pour cent CNP Toutes les bases sans variants avaient un taux de concordance de 100 avec la s quence de r f rence Tous les SNV avaient un taux de concordance de 100 avec la s quence de r f rence Les variants qui ont t ma
19. e l extr mit 5 pour prendre en charge l tape de ligation apr s l extension de la sonde personnalis e 1 ULSO Figure 1 Conception de l oligo pour la Trousse universelle MiSeqDx 1 0 5 3 Sonde Sonde personnalis e 1 P personnalis e 2 y Adaptateur 1 3 gt 5 Adaptateur 2 Cible R gion d int r t e Les param tres de conception de l oligo suivants sont recommand s Longueur de la sonde comprise entre 22 et 30 nucl otides r gion sp cifique aux g nes Taille totale de l amplicon comprise entre 190 et 290 paires de bases adaptateurs compris La teneur en GC recommand e du primer doit tre comprise entre 25 et 70 Plage de fusion recommand e entre 55 et 70 C La concentration du primer doit tre de 15 nM par oligo dans le pool personnalis Aucune purification suppl mentaire de l oligo n est n cessaire l issue de la synth se Un dessalage est recommand Les oligos peuvent tre dilu s dans le tampon TE Le nombre d amplicons par chantillon doit tre compris entre 16 et 384 Si la totalit d une r gion d int r t doit tre recouverte de plaques chaque sonde doit cibler une r gion comprenant entre 1 et 3 bp identiques la r gion adjacente cibl e Les sondes adjacentes doivent tre con ues de sorte alterner les brins afin d viter les interf rences La couverture minimale recommand e par amplicon requise pour un appel de variants est de 75x Le nombre d chantillons par anal
20. est de 75 x Composants du produit Le Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1 0 comprend les composants suivants e Trousse universelle MiSeqDx 1 0 N de r f rence DX 103 1001 2 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 R actifs R actifs fournis La Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1 0 a t configur e pour 2 analyses avec un maximum de 48 chantillons par analyse jusqu 96 chantillons au total Consultez les tableaux ci dessous pour une liste compl te des r actifs fournis dans cette trousse Trousse universelle MiSeqDx 1 0 bo te 1 Table 1 Bo te 1A r actifs de pr amplification Composant Quantit Volume de Ingr dients actifs Stockage remplissage Tampon 1 tube 432mL Solution aqueuse tamponn e contenant des sels et 15 25 C d hybridation du formamide M lange extension 1 tube 4 8 mL Solution aqueuse tamponn e contenant un m lange 15 25 C ligation exclusif d ADN polym rases d ADN ligase et des dNTP Primers d indexage A 1 tube 192 ul Primers PCR avec des s quences d indexage et des 15 25 C A501 H A508 par adaptateurs de s quen age primer Primers d indexage 1 1 tube 128 ul Primers PCR avec des s quences d indexage et des 15 25 C A701 12 A712 par adaptateurs de s quen age primer Polym rase PCR 1 tube 56 ul ADN polym rase exclusive 15 25 C M lange ma tre PCR 1 tube 2 8 mL Solution aqueuse tamp
21. fibrose kystique 139 variants Illumina MiSeqDx incluant un sous ensemble de variations du gene CFTR pertinentes d un point de vue clinique analys es avec le logiciel MiSeq Reporter l aide de la plateforme de flux de travail de s quen age d ADN cibl MiSeqDx L tude en aveugle a t r alis e sur trois sites d essais et a n cessit deux op rateurs sur chaque site Deux panels bien caract ris s de 46 chantillons chacun ont t analys s par chacun des op rateurs sur chaque site pour un total de 810 appels par site Les panels contenaient un m lange d ADN g nomique issu des lign es cellulaires ayant des variants connus dans le g ne CFTR ainsi que du sang d leucocyt enrichi de lign es cellulaires ayant des variants connus dans le g ne CFTR Les chantillons de sang ont t fournis pour permettre l incorporation des tapes d extraction utilis es dans la pr paration d ADN g nomique servant d entr e primaire pour le flux de travail du test Le d bit de passage des chantillons d fini comme le nombre d chantillons passant les m triques de CQ lors de la premi re tentative tait de 99 9 Tous les r sultats des tests sont bas s sur un test initial Table 18 R sum des r sultats de l tude de reproductibilit r alis e avec un test repr sentatif de la fibrose kystique 139 variants MiSeqDx Pan el N d chantill on G notype de chantillon S549N HET 182 TGAN Q493X F508del
22. nomiqu Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre plico h fragme e E analyses re total total re total total d appe re total total d appe n r nt d chantillo 7 7 i de d aucu d appels d aucu d appels ls d aucu d appels ls analys f 2 ns i a Vamplicon n incorrec n incorrec correct n incorrec correct i appels tst appels tst appels tst s 117 10 135 Poly A 6 R gion homologue sur un chromoso me diff rent ICON E E e p CS EC EC EC ES EC CN w E e ES CS e EE CC p e 49 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 d Contenu Nomb g 5 g nomiqu IERS Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre Amplico Ch fragme analyses 7 7 e i re total total re total total d appe re total total d appe n r nt d chantillo 7 7 i de d aucu d appels d aucu d appels ls d aucu d appels ls analys F ns i 3 l amplicon n incorrec n incorrec correct n incorrec correct i appels tst appels tst s appels tst s aes ER e eo CO e o LE CS CES 11 134 Poly 6 135 100 100 Poly T 5 137 11 133 SNV 135 100 100 26 en GC m 00 50 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 d Contenu Nomb g ds g nomiqu dus as Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre Amplico Ch fragme d analyses 7 7 e i re total total re tot
23. rature ambiante M langez chaque tube d congel puis centrifugez bri vement les tubes Pr voyez une nouvelle plaque PCR 96 puits ci apr s d nomm e la plaque AMP 14 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 5 Ajoutez des primers d indexage la plaque AMP comme suit a Ajoutez 4 ul des primers d indexage s lectionn es A A501 H A508 au puits appropri dans une colonne de la plaque AMP b Mettez au rebut les bouchons blancs d origine et utilisez des bouchons blancs neufs c Ajoutez 4 ul des amorces d index s lectionn es 1 A701 12 A712 la rang e appropri e de la plaque AMP Les extr mit s doivent tre chang es apr s chaque rang e pour viter la contamination crois e de l index d Mettez au rebut les bouchons orange d origine et utilisez des bouchons orange neufs 6 Pr parez la solution de travail PCR M lange ma tre PCR Polym rase PCR comme suit a Pour 96 chantillons ajoutez 56 ul de Polym rase PCR 2 8 ml de M lange ma tre PCR b Retournez la solution de travail PCR pr par e 20 fois pour la m langer La solution de travail PCR est stable temp rature ambiante pendant 10 minutes Proc dure 1 Retirez le FPU de l incubateur puis enlevez l opercule en aluminium 2 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez 2 400 x g a 20 C pendant 2 minutes 3 Ajoutez 25 ul de 0 05 N NaOH chaque puits d chantillon sur
24. ul de Tampon de lavage strict chaque puits d chantillon b Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez 2 400 x g 20 C pendant 5 minutes 5 R p tez le lavage comme d crit l tape pr c dente REMARQUE Si le tampon de lavage n est pas compl tement vacu centrifugez encore 2 400 x g 20 C jusqu ce que tout le liquide ait disparu 5 10 minutes suppl mentaires 6 Jetez tout liquide circulant contenant du formamide puis r assemblez la FPU 7 Ajoutez 45 ul de Tampon de lavage universel chaque puits d chantillon 8 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez 2 400 x g 20 C pendant 10 minutes REMARQUE Veillez ce que tout liquide soit vid apr s la centrifugation R p tez la centrifugation si n cessaire Extension ligature des oligonucl otides li s Proc dure 1 Ajoutez 45 ul de M lange extension ligation chaque puits d chantillon de la plaque filtrante 2 Scellez la plaque filtrante avec une feuille d aluminium adh sive puis posez le couvercle 3 Incubez le FPU dans l incubateur pr chauff 37 C pendant 45 minutes Amplification de la PCR Pr paration 1 2 Pr parez une nouvelle solution 0 05 N NaOH D terminez les primers d indexage utiliser selon le graphique de plaque imprim partir du Gestionnaire de la liste de travail Illumina Ramenez M lange ma tre PCR et les primers d indexage appropri es la temp
25. 0 10kbC gt T HET A 13 E60X F508del 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET A 15 M1101K 810 804 804 804 100 100 HOM j 00 p 00 58 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Appels concordants Nombr Appels concordants ee Nombre Nombr N E e total positifs variants D deye d appel e Concordan Concordan Concordan Pan A G notype de Varian sauvage Di EN d chantill d appe s d aucu ce positive ce n gative ce globale el Y chantillon ts i en o do pa SPa Gite Site Site Site Site Site TOT site appels 1 2 3 1 2 3 dd A 17 F508del 3659de 810 12 12 12 798 798 798 IC HET 19 621 1G gt T 810 12 12 12 798 798 798 100 100 711 1G gt T HET A 21 A455E F508del 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 HET A 23 F508del Y1092 810 12 12 12 798 798 798 100 100 X C gt A HET AO OC om o G551D R553X 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 HET p 00 gt 59 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Appels concordants Nombr Appels concordants ee Nombre Nombr N E e total positifs variants D deye d appel e Concordan Concordan Concordan Pan A G notype de Varian sauvage Di EN d chantill d appe s d aucu ce positive ce n gative ce globale el Y chantillon ts i A o o do pa SPa Gite Site Site Site Site Site TOT a p site ts appels
26. 00 ul d thanol 80 fra chement pr par dans chaque puits d chantillon b Placez la plaque sur le support magn tique pendant 30 secondes ou jusqu ce que le surnageant soit limin c Retirez le surnageant et mettez le au rebut 11 R p tez le lavage comme d crit l tape pr c dente 12 Utilisez une pipette multi canal P20 r gl e sur 20 ul pour retirer l exc s d thanol 13 Retirez la plaque CLP du support magn tique et s chez lair libre pendant 10 minutes 14 Ajoutez 30 ul de Tampon d lution chaque chantillon puis agitez bri vement 15 Scellez la plaque CLP et secouez la dans un agitateur pour microplaques 1 800 tr min pendant 2 minutes Apr s l avoir secou e v rifiez si des chantillons ont t resuspendus Si non r p tez cette tape 16 Incubez temp rature ambiante pendant 2 minutes 17 Placez la plaque CLP sur un support magn tique pendant au moins 2 minutes ou jusqu ce que le surnageant soit vacu 18 Mettez en route une nouvelle plaque MIDI ci apr s d sign comme la plaque LNP 19 Transf rez 20 ul de surnageant de la plaque CLP la plaque LNP 20 En option Transf rez le 10 ul restant du surnageant de la plaque CLP la nouvelle plaque et tiquetez la plaque avec un nom d analyse et une date d analyse Conservez cette plaque entre 15 et 25 C jusqu la fin de l analyse de s quencage et de l analyse de donn es Les produits PCR nettoy s peuvent tr
27. 6 C pendant 2 minutes Apr s l incubation inversez le tube DAL 1 2 fois pour m langer puis placez imm diatement dans un bain d eau glac e Gardez le tube DAL dans un bain d eau glac e pendant 5 minutes Charger les librairies d chantillons dans la cartouche 1 2 Utilisez un embout de pipette distinct propre et vide de 1 ml pour percer l opercule scellant le r servoir de la cartouche de r actifs portant l inscription Load Samples Charger les chantillons Transf rez l aide de la pipette 600 ul des librairies d chantillons dans le r servoir Load Samples Charger les chantillons Prenez soin d viter de toucher l opercule lors de la distribution de l chantillon F vrier 2014 N 15039608 R v FRA 19 Trousse universelle MiSegDx MC 1 0 V rifiez qu il n y ait pas de bulles d air dans le r servoir apr s le chargement de l chantillon S il y a des bulles d air tapotez doucement la cartouche sur le banc pour vacuer les bulles 3 Passez directement la configuration de l analyse depuis l interface du Logiciel d exploitation MiSeq MOS Configuration de l analyse 1 Connectez vous au Logiciel d exploitation MiSeq MOS 2 S lectionnez Sequence S quencer Une s rie d crans de configuration de l analyse s affichent dans l ordre suivant Select Run Type S lectionner le type d analyse Load Flow Cell Charger la Flow Cell Load Reagents Charger les r actifs Review
28. C 0 4 C 60 C Incubateur d chantillons un incubateur four a hybridation est n cessaire L incubateur doit tre conforme aux sp cifications de performance suivantes Plage de temp ratures 10 C 100 C R gulation de temp rature 0 2 C Centrifugeuse de table une centrifugeuse de table capable de maintenir une temp rature de 20 C est n cessaire Une centrifugeuse distincte est n cessaire dans la zone de post amplification N importe quelle centrifugeuse pour plaques capable d atteindre les vitesses indiqu es par le protocole 280 2 400 x g est acceptable Pipettes de pr cision un ensemble de pipettes de pr cision est n cessaire Un ensemble distinct est n cessaire dans la zone de post amplification L utilisation de pipettes de pr cision est n cessaire pour s assurer une distribution pr cise des r actifs et des chantillons Les pipettes mono canal ou multi canal peuvent tre utilis es si elles sont talonn es r guli rement et sont pr cises moins de 5 du volume indiqu F vrier 2014 N 15039608 R v A FRA 7 Trousse universelle MiSegDx MC 1 0 z Consommables les consommables suivants sont n cessaires Plaques PCR jupe 96 puits 0 2 ml polypropyl ne ou quivalent REMARQUE Veillez ce que la plaque 96 puits soit compatible avec le support magn tique Plaques de stockage 96 puits 0 8 ml plaques MIDI Bassin de solution sans PVC DNase RNase creux
29. Opercule adh sif en aluminium Joint appropri pour plaques PCR Pointes de pipette r sistantes l a rosol quipement et mat riel de post amplification 1 Thermocycleur un thermocycleur est n cessaire Le thermocycleur doit avoir un couvercle chauff et respecter les sp cifications de performance suivantes Plage de contr le de la temp rature 4 99 C Pr cision du contr le 0 25 C de 35 99 C Agitateur pour microplaques un agitateur pour microplaques est n cessaire dans la zone du laboratoire de post amplification L agitateur pour microplaques doit tre conforme aux sp cifications de performance suivantes Vitesse de m lange max 3 000 tr min Plage de vitesses de m lange 200 3 000 tr min Centrifugeuse de table une centrifugeuse de table capable de maintenir une temp rature de 20 C est n cessaire Une centrifugeuse distincte est n cessaire dans la zone de pr amplification N importe quelle centrifugeuse pour plaques capable d atteindre les vitesses indiqu es par le protocole 280 2 400 x g est acceptable Bloc chauffant un bloc chauffant pour les tubes est n cessaire Le bloc chauffant doit tre conforme aux sp cifications de performance suivantes Plage de temp ratures ambiante 5 C 99 C R gulation de temp rature 0 1 C 37 C 0 4 C 60 C Support magn tique un support magn tique pour une plaque 96 puits est n cessaire De meilleures per
30. PONSABILIT R SULTANT DE L USAGE ABUSIF DU OU DES PRODUITS D CRITS DANS LES PR SENTES Y COMPRIS LES PI CES DE RECHANGE DE CES PRODUITS OU LE LOGICIEL OU DE TOUTE UTILISATION DE CE S PRODUITS S QUI SORT DU CADRE DES LICENCES O DES PERMISSIONS EXPRESSES ACCORD ES PAR ILLUMINA EN RAPPORT L ACQUISITION DE CES PRODUITS PAR LE CLIENT DESTIN AU DIAGNOSTIC IN VITRO 2012 2014 Illumina Inc Tous droits r serv s Ilumina et MiSeqDx sont des marques de commerce ou des marques d pos es d Illumina Inc Les autres marques et noms contenus dans les pr sentes sont la propri t de leurs d tenteurs respectifs AMPure Beckman et Beckman Coulter sont des marques d pos es ou des marques de commerce de Beckman Coulter Inc 67 N 15039608 R v FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Coordonn es sl Ilumina Emergo Europe San Diego Californie 92122 tats Unis Molenstraat 15 1 800 809 ILMN 4566 2513 BH La Haye 1 858 202 4566 en dehors de l Am rique du Nord Pays Bas techsupport illumina com www illumina com tiquette du produit Reportez vous la l gende des symboles livr e avec chaque trousse pour une r f rence compl te aux symboles qui peuvent appara tre sur l emballage et l tiquetage du produit F vrier 2014 N 15039608 R v FRA 68
31. S quences de Primers d indexage 1 A701 12 A712 Primer d indexage Primer d indexage 1 A701 Primer d indexage 2 A702 Primer d indexage 3 A703 Primer d indexage 4 A704 Primer d indexage 5 A705 Primer d indexage 6 A706 Primer d indexage 7 A707 Primer d indexage 8 A708 Primer d indexage 9 A709 Primer d indexage 10 A710 Primer d indexage 11 A711 Primer d indexage 12 A712 Mode d emploi Pr paration de la feuille d chantillons MiSeqDx 12 1 S quence ATCACGAC ACAGTGGT CAGATCCA ACAAACGG ACCCAGCA AACCCCTC CCCAACCT CACCACAC GAAACCCA TGTGACCA AGGGTCAA AGGAGTGG Dans l cran d accueil du Gestionnaire de la liste de travail Illumina s lectionnez Create Worklist Cr er une liste de travail Dans le champ Test Type Type de test s lectionnez MiSeqDx universel Dans le champ Worklist Name Nom de la liste de travail saisissez un nom pour la feuille d chantillons N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 4 5 6 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Si l identifiant du code barres de la cartouche de r actifs alphanum rique est utilis pour le nom de la feuille d chantillons le Logiciel d exploitation MiSeq MOS trouve automatiquement la feuille d chantillons Si vous utilisez un autre nom pour la feuille d chantillons le bouton Browse Parcourir situ dans le Logiciel d exploitation MiSeq MOS peut tre utilis afin de trouver la feuille d chantillons appro
32. a plateforme MiSeqDx pour 13 chantillons bien caract ris s Nombre Variants simple nucl otide SNV Insertions suppressions indels N IAE de d analyses Nombre NN a 1 Nombre l chantillon Nombre de Nombre Nombre Nombre de Nombre Nombre TADN d ADN par dean bases appel es de faux de faux dindels bases appel es de faux de faux ediantillon correctement positifs n gatifs correctement positifs n gatifs 1 NA128773 18 16 16 0 0 3 1 0 2 2 NA128783 18 117 17 0 0 2 0 0 2 3 NA12879 9 18 18 0 0 2 1 0 1 4 NA12880 9 17 17 0 0 3 il 0 2 5 NA12881 9 19 19 0 0 3 1 0 2 6 NA12882 9 15 15 0 0 il 0 0 l 7 NA12883 9 22 22 0 0 2 1 0 1 8 NA12884 9 19 19 0 0 2 1 0 il 9 NA12885 9 17 17 0 0 2 0 0 2 10 NA12886 o 19 19 0 0 3 1 0 2 11 NA12887 9 18 18 0 0 1 0 0 1 12 NA12888 9 222 22 0 0 2 1 0 1 13 NA12893 9 17 17 0 0 3 1 0 2 1 Faux positif variant appel par l analyse de s quen age MiSeqDx mais non r pertori dans la base de donn es de r f rence 2 Faux n gatif variant dans la base de donn es de r f rence mais non appel dans l analyse de s quen age MiSeqDx 3 Les chantillons NA12877 et NA12878 ont t analys s en double exemplaire Les chantillons r pliqu s ont g n r des r sultats identiques 56 N 15039608 R v FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 tude 2 Une tude de reproductibilit de site site a t effectu e avec un test repr sentatif le test de la
33. al total d appe re total total d appe n r nt d chantillo 7 7 i de d aucu d appels d aucu d appels ls d aucu d appels ls analys F ns 3 l amplicon n incorrec n incorrec correct n incorrec correct appels tst appels tst s appels tst s 13 123 Poly T 5 135 100 100 26 en GC seje es be b dee e mp p se E es COS e w o o m e CS sow ER e e CO w o o w o o 51 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 d Contenu Nomb g ds g nomiqu dus as Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre Amplico Ch fragme d analyses 7 7 e i re total total re total total d appe re total total d appe n r nt d chantillo 7 P r i de d aucu d appels d aucu d appels ls d aucu d appels ls analys F ns 3 l amplicon n incorrec n incorrec correct n incorrec correct 5 appels tst appels tst s appels tst s 17 116 Poly C 6 135 100 100 60 en GC SNV IC EE ES e p CS e ES CO e CN o 52 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 d Contenu Nomb g ds g nomiqu dus as Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre Amplico Ch fragme d analyses 7 7 e i re total total re total total d appe re total total d appe n r nt d chantillo 7 P r i de d aucu d appels d aucu d appels ls d aucu d appels ls analys F ns 3
34. aux visibles Avant utilisation agitez vigoureusement l aide d un agitateur vortex puis inspectez visuellement pour vous assurer qu il n y a aucun pr cipit 7 Suivez la lettre les meilleures pratiques suivantes lors de la manipulation de Billes de nettoyage PCR et de Billes de librairie Les billes ne doivent jamais tre congel es Laissez les billes atteindre la temp rature ambiante 6 N 15039608 R v FRA F vrier 2014 10 11 12 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Imm diatement avant utilisation agitez vigoureusement les billes l aide d un agitateur vortex jusqu obtenir une suspension ad quate et que la couleur apparaisse homog ne M langez bien l chantillon une fois les billes ajout es en pipettant de haut en bas 10 fois Un agitateur peut tre utilis pour bien m langer les chantillons Incubez le m lange bille chantillon temp rature ambiante pendant la dur e totale indiqu e Suivez les instructions lorsque vous utilisez un brin magn tique Attendez que la solution soit claire avant d aspirer Gardez la plaque sur le brin magn tique lorsque vous aspirez doucement le surnageant en prenant soin de ne pas d ranger les billes s par es La plaque d amplification par PCR peut rester sur la platine thermique toute la nuit ou bien elle peut tre conserv e entre 2 C et 8 C pendant un maximum de deux jours Avant de stocker la plaque entre 2 C et 8 C scellez la bien N
35. chantillon d ADN de contr le positif doit tre un chantillon bien caract ris avec une variation connue dans la r gion d int r t Avant de commencer le protocole du Trousse universelle MiSeqDx 1 0 extrayez et quantifiez l ADN Toute m thode d extraction d ADN valid e peut tre utilis e Quantifiez l ADN l aide d un spectrophotom tre V rifiez que le A260 A280 de l chantillon d ADN est gt 1 5 Normalisez l chantillon d ADN sur 50 ng ul Chaque chantillon n cessite 5 ul d ADN g nomique 250 ng au total 10 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 D bit d chantillons et repr sentation d index Pour la Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1 0 le d bit d chantillons par analyse MiSeqDx peut tre compris entre 8 et 48 chantillons Les primers d indexage utilis s pendant l amplification par PCR doivent tre choisis en fonction du d bit d chantillons final souhait pour assurer la diversit dans la s quence d index L REMARQUE Pour une efficacit maximale du d bit proc dez la pr paration de la librairie pour 96 chantillons au plus puis r partissez les chantillons en deux analyses de s quen age avec un maximum de 48 chantillons par analyse MiSeqDx utilise un voyant DEL vert pour s quencer des bases G T et un voyant DEL rouge pour s quencer des bases A C chaque cycle au moins un des deux nucl otides de chaque canal de couleur doi
36. corrects par incorrects corrects analys P q gt id Pp chantillon 6 7 effectu s I 1 132 Poly C 5 13 15 132 0 132 0 100 63 en GC Poly C 5 22 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MOC 1 0 Nombre Taill Nomb Nomb a a Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre Pris H PiN A ia els u appels appels Amplicon Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PP f pE PP fragment amplicon anaue analys s AA t t sonal corrects par incorrects corrects analys p q y y y PR chantillon 6 7 effectu s 19 3 131 Poly T 5 13 15 131 131 100 SNV 21 3 117 Poly A 6 13 15 117 117 Poly T 5 R gion homologue sur un chromosome diff rent 25 4 133 Poly C 7 13 15 133 133 100 66 en GC m 00 23 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Nombre Taill Nomb Nomb E sl Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre P h Pap T de dle u appels appels Amplicon Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PE pE PP fragment amplicon anaue analys s vant er corrects par incorrects corrects analys p q y y PPE chantillon 6 7 effectu s 27 4 123 SNV 13 15 123 0 123 0 100 39 4 129 Poly A 5 13 15 129 129 Poly T 5 SNV m 00 24 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MOC 1 0 Nombre Taille No
37. de l analyse en cours y compris les intensit s et les scores de qualit N Proc dures de contr le qualit Les bonnes pratiques de laboratoire exigent qu un chantillon d ADN de contr le positif et un chantillon de contr le n gatif sans mod le soient inclus dans chaque analyse L chantillon d ADN de contr le positif doit tre un chantillon bien caract ris avec des variants connus dans la r gion d int r t e Si un contr le sans mod le g n re un d bit d appel gt 10 alors une contamination dans le contr le sans mod le s est produite Le test est consid r comme un chec et l ensemble du protocole doit tre r p t et ce partir de la pr paration de la librairie e L chantillon de contr le positif doit g n rer le r sultat attendu Si le contr le positif g n re un r sultat diff rent de celui attendu alors il y a peut tre eu une erreur dans le suivi de l chantillon ou un enregistrement incorrect des primers d indexage L ensemble du protocole doit tre r p t et ce partir de la pr paration de la librairie 20 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Caract ristiques de performance Pr cision Deux tudes distinctes ont t men es pour valuer la pr cision de la plateforme MiSeqDx Etude 1 Cette tude a utilis un test repr sentatif con u pour tudier divers g nes couvrant 24 434 bases sur 19 chromosomes diff ren
38. e MiSeqDx MC 1 0 Extraction d ADN Trois diff rentes m thodes d extraction savoir l extraction base de billes magn tiques la pr cipitation dans l alcool et la filtration sur colonne de silice ont t valu es l aide de sang total K EDTA anticoagul Quatorze chantillons de sang unique ont t utilis s dans l tude repr sentant une plage de g notypes d un seul g ne repr sentatif Les trois m thodes d extraction de l ADN ont t test es ind pendamment par 2 op rateurs diff rents qui ont chacun effec tu 3 analyses par la m thode d extraction Chaque extraction a t r alis e par chaque op rateur des jours dif f rents La concentration d ADN et le rapport A260 A280 des chantillons d ADN g nomique extrait ont t d termin s par spectrophotom trie La taille totale des chantillons pour chaque m thode d extraction dans cette tude tait de 168 14 chantillons x 2 op rateurs m thode d extraction x 3 analyses op rateur x 2 r plicats chantillon d ADN g nomique extrait D bit au premier None Nombre z D bit d appel Pr cision passage de d extraction d chantillons test s j l chantillon Pr cipitation dans 168 100 100 100 l alcool Filtration sur colonne 168 100 100 100 de silice Extraction base de 168 100 100 100 billes magn tiques Pr cision la concordance en pour cent avec une m thode d essai de r f rence s quen age bidirectionnel d
39. e Sanger calcul e pour les positions de base qui re oivent un appel de base D bit au premier passage de l chantillon le nombre d chantillons respectant le taux d appel sp cifi la premi re fois qu ils sont trait s c est dire sans qu il soit n cessaire de proc der une nouvelle analyse ou un traitement suppl mentaire en pourcentage du nombre total d analyses d chantillons au cours d une seule exp rience de s quencage MiSeqDx Entr e d ADN La plage d entr e d ADN pour la plateforme MiSeqDx a t valu e en effectuant une tude de dilution en s rie l aide de 14 chantillons d ADN repr sentatifs contenant 16 variants du g ne unique Chaque chantillon a t test en double exemplaire 9 niveaux d entr e d ADN allant de 1 250 ng 1 ng 1 250 ng 500 ng 250 ng 100 ng 50 ng 25 ng 10 ng 5 ng et 1 ng Pour la d termination de la pr cision des g notypes de l chantillon ont t compar s aux don n es de s quencage bidirectionnel par la m thode de Sanger La limite sup rieure de l entr e d ADN a t d termin 1 250 ng et la limite inf rieure 25 ng car celles ci pr sentaient un d bit au premier passage de l chantillon gt 95 sans aucun appel incorrect taux de 100 de pr cision et d appel Les entr es d ADN de 1 250 ng 250 ng et 100 ng ont fait l objet d autres tests avec 4 chantillons d ADN repr sentatifs et 20 r plicats par niveau d entr e d ADN pour chaq
40. e congelez pas les Billes de librairie et ne les m langez pas au r actif Diluant de normalisation de librairie si ce n est pas pour une utilisation imm diate La plaque de normalisation de librairie termin e peut tre conserv e entre 15 C et 25 C pendant un maximum de 3 jours La librairie d amplicons regroup s peut tre conserv e entre 15 C et 25 C pendant un maximum de 3 jours Chargez imm diatement le groupe d amplicons fra chement dilu s dans la cartouche de r actifs Le stockage du groupe d amplicons dilu s peut entra ner une r duction consid rable de la densit des amplifiats quipement et mat riel quipement et mat riel fournis vendus s par ment 1 2 3 4 MiSeqDx Instrument catalogue n DX 410 1001 Trousse de montage de plaque d index TruSeq n de r f rence FC 130 1005 Trousse de montage de plaque d index TruSeq amp trousse de collier n de r f rence FC 130 1007 Bouchons de rechange pour l adaptateur d index n de r f rence DX 502 1003 quipement et mat riel n cessaires non fournis quipement et mat riel de pr amplification 1 Bloc chauffant un bloc chauffant pour une plaque 96 puits est n cessaire Le bloc chauffant doit tre conforme aux sp cifications de performance suivantes Il est possible d utiliser des blocs chauffants avec des couvercles chauff s Plage de temp ratures ambiante 5 C 99 C R gulation de temp rature 0 1 C 37
41. e les oligonucl otides non li s de l ADN g nomique e Extension Ligation relie les oligonucl otides en amont et en aval hybrid s Un ADN polym rase s tend des oligonucl otides en amont travers la r gion cibl e suivi par une ligation l extr mit 5 de l oligonucl otide en aval l aide d un ADN ligase Le r sultat est la formation de produits contenant des oligonucl otides sp cifiques aux r gions d int r t bord s par les s quences n cessaires pour l amplification e Amplification par PCR amplifie les produits de l extension ligation l aide des primers qui ajoutent des s quences d index pour le multiplexage des chantillons tout comme les s quences de saisie de Flow Cell n cessaires la g n ration d amplifiats sur le MiSeqDx la fin de ce processus une proc dure de nettoyage PCR purifie les produits PCR d sign s comme une librairie F vrier 2014 N 15039608 R v A FRA 1 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 e Normalisation de librairie normalise la quantit de chaque librairie pour assurer une repr sentation plus gale des librairies dans la derni re librairie regroup e la fin de ce processus la librairie regroup e est charg e dans le MiSeqDx pour le s quen age l aide de la chimie de s quencage par synth se SBS S quen age La chimie SBS utilise la m thode bas e sur des terminateurs r versibles pour d tecter les bases de nucl otides uniques mesure q
42. e ont t utilis s Les 13 chantillons provenaient de deux parents et 11 enfants qui avaient t fr quemment s quenc s par plusieurs laboratoires et selon plusieurs m thodes de s quen age Deux chantillons ont t analys s en double exemplaire donc chaque analyse a g n r des r sultats pour 15 chantillons Pour l valuation de la reproductibilit de lot lot 94 chantillons et deux contr les sans mod le ont t test s dans l ensemble de trois lots Chaque lot a t scind en deux analyses de 48 chantillons pour tester tous les r actifs et les combinaisons de primers d indexage possibles Toutes les analyses de s quencage ont t effectu es par un seul op rateur et sur un seul instrument MiSeqDx pour liminer tout cart ventuel d op rateur ou instrument Table 17 Des appels corrects ont t d termin s pour des variants de nucl otides uniques SNV en comparant les donn es de l tude des renseignements de r f rence bien caract ris e Il n y a eu aucun chec d analyse ou r p tition d analyse pour l tude de reproductibilit Les tableaux suivants montrent les r sultats des tudes pour valuer la repro ductibilit du syst me F vrier 2014 N 15039608 R v A FRA 39 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Table 16 R sultats de la reproductibilit d instrument a instrument de l tude 1 pour la plateforme MiSeqDx au niveau de amplicon 40 Taille du Amplico Ch fra
43. e utilis s pour des efforts de d pannage en cas de pannes d chantillon POINT D ARR T DE S CURIT Si vous vous arr tez cette tape scellez la plaque LNP et centrifugez la a 1 000 x g 20 C pendant 1 minute La plaque est stable pendant une dur e maximale de 3 heures entre 2 8 C Normalisation de la librairie Pr paration 1 2 Pr parez une nouvelle solution 0 1N NaOH Ramenez Diluant de normalisation de librairie Billes de librairie et Lavage de normalisation de librairie a la temp rature ambiante M langezDiluant de normalisation de librairie vigoureusement et assurez vous que tous les pr cipit s ont completement dissous M langez les Billes de librairie vigoureusement pendant une minute avec inversion intermittente jusqu ce que les billes soient remises en suspension et qu aucun culot ne se trouve au fond du tube lorsque celui ci est inverse 16 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Proc dure 1 10 11 12 13 14 15 16 M langez Diluant de normalisation de librairie et Billes de librairie dans un tube conique de 15 ml tout juste rempli comme suit j REMARQUE En cas de traitement de lt 24 chantillons utilisez un nouveau tube de 1 5 ml a Pour 96 chantillons ajoutez 4 4 ml de Diluant de normalisation de librairie b Pipettez Billes de librairie de haut en bas 10 fois et remettez en suspension 4 REMARQUE Il est extr memen
44. elon la s quence de r f rence du g nome humain version 19 Cependant les renseignements de r f rence bien caract ris e pour 7 des 13 chantillons ont 13 A dans cette analyse d homopolymeres Dans ces 7 chantillons cette suppression de paires de base 1 s appelle un faux n gatif et est appel e comme faux n ga tif de fa on reproductible dans les neuf analyses 2 L amplicon 95 a une analyse d homopolymeres de 14 A selon la s quence de r f rence du g nome humain version 19 Cependant les s quences de renseignements de r f rence bien carac t ris e pour 13 des 13 chantillons ont 15 A dans cette analyse d homopolym res Dans ces 13 chantillons cette insertion de paires de base 1 n est pas appel e de fa on reproductible 100 c d qu il s agit d un faux n gatif 55 N 15039608 R v FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Les r sultats de l tude 1 de reproductibilit pour chaque chantillon sont pr sent s compos s partir des neuf analyses dans une seule colonne Les r sultats affi ch s sont exclusivement ceux des variants simple nucl otide et les r sultats des insertions suppressions par rapport la s quence de base de donn es de r f rence pour trois analyses sur trois instruments Cette analyse a d montr que les r sultats pour les variants taient reproductibles sur neuf analyses pour ces chantillons Table 17 R sum des r sultats de reproductibilit de l
45. formances sont observ es lorsque les aimants sont situ s sur le c t du support et non au bas de ce dernier Pipettes de pr cision un ensemble de pipettes de pr cision est n cessaire Un ensemble distinct est n cessaire dans la zone de pr amplification L utilisation de pipettes de pr cision est n cessaire pour s assurer une distribution pr cise des r actifs et des chantillons Les pipettes mono canal ou multi canal peuvent tre utilis es si elles sont talonn es r guli rement et sont pr cises moins de 5 du volume indiqu Consommables les consommables suivants sont n cessaires Plaques PCR jupe 96 puits 0 2 ml polypropyl ne ou quivalent REMARQUE Veillez ce que la plaque 96 puits soit compatible avec le support magn tique Plaques de stockage 96 puits 0 8 ml plaques MIDI Tubes coniques 15 ml Tubes de microcentrifugeuse Eppendorf bouchon viss recommand Barrettes de huit tubes PCR Bassin de solution sans PVC DNase RNase creux Opercule adh sif en aluminium Timbre adh sif pour plaques Pointes de pipette r sistantes l a rosol 8 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Collecte transport et stockage des chantillons 4 REMARQUE Manipulez tous les chantillons comme s il s agissait d agents potentiellement infectieux 1 Les chantillons de sang total recueillis dans des tubes K EDTA peuvent tre utilis s Les
46. gme n r nt analys 1 o n 2 a N 15039608 R v A FRA Contenu g nomiqu de Vamplicon Poly C 5 63 en GC Poly T 5 Poly T 5 Poly A 6 Poly T 5 Poly C 5 Poly T 5 Poly A 14 Poly A 5 Nombre d analyses d chantillo ns 135 135 135 165 135 135 135 135 135 135 135 165 135 MiSeqDx 1 Nomb re total Nombre total d appels incorrec d aucu n appels d appe ls correct MiSeqDx 2 Nomb Nombre re total total d appe d aucu d appels ls n incorrec correct appels 236 0 99 617 K k MiSeqDx 3 Nomb re total d aucu n appels Nombre total d appels incorrec tst 7 d appe ls correct s5 99 347 100 100 100 100 100 100 100 99 54 100 100 100 100 F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 d Contenu Nomb E S g nomiqu dus as Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre Amplico Ch fragme d analyses 7 7 e i re total total re total total d appe re total total d appe n r nt d chantillo 7 P i de d aucu d appels d aucu d appels ls d aucu d appels ls analys ns i l amplicon n incorrec n incorrec correct n incorrec correct i appels tst appels tst s appels tst s 3 131 Poly T 5 135 100 100 100 SNV 41 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 1 NO 21 Poly A 6
47. i i ei co m Pa SPa Gite Site Site Site Site Site TOT j d site appels 1 2 3 1 2 3 di B 51 F508del 2143de 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 IT HET MEME CO Le CC Le w E MC CO O CC o CI 15 os ur wo o E CC A E E e e n E CO o 5 um wo A E E ou et we oo EC wo A E E CC me oo o an mm 0 6 so fwo CIO ECC ETS IT 62 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Appels concordants Nombr Appels concordants ee Nombre Nombr N E e total positifs variants D deye d appel e Concordan Concordan Concordan Pan A G notype de Varian sauvage Di EN d chantill d appe s d aucu ce positive ce n gative ce globale el Y chantillon ts i i ei co m pa SPa Gite Site Site Site Site Site TOT j d site 1 appels 2 3 1 2 3 di B 67 S549R c 1647T 810 6 6 6 804 804 804 100 100 100 gt G HET CCOO Le Le DO CA CI CI w E92X F508del 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 HET II OCC SCENE MIE 77 621 1G gt 810 12 12 12 798 798 798 100 100 100 T A455E HET CN CN CO E CC o so w w w w w 63 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Appels concordants Nombr Appels concordants ner Nombre Nombr N E e total positifs variants EL d appel e Concordan Concordan Concordan Pan A G notype de Varian sauvage Di EN d chantill d appe s d aucu ce positive ce n gative ce globale el Y
48. it d appel de 100 a t atteint pour tous les chantillons test s en plus des 100 de reproductibilit dans les typages g notypes entre les chantillons en pr sence et en l absence de substances interf rentes Concentration Concentration A en en total de a dans le a dans le D bit d appel limite sup rieure limite inf rieure Bilirubine 16 684 umol L 137 umol L 100 Cholest rol 16 13 mmol L 2 6 mmol L 100 H moglobine 16 2 g l 0 4 g l 100 Triglyc ride 16 37 mmol L 7 4 mmol L 100 EDTA 16 7 mg mL 2 8 mg mL 100 Indexage de l chantillon Des primers d indexage de l chantillon sont utilis s dans la trousse pour attribuer un code barres unique chaque chantillon d ADN permettant de grouper plusieurs chantillons en une seule analyse de s quencage Un total de 96 index d chantillons a t analys l aide d un test repr sentatif con u pour tudier un seul g ne cou vrant 11 529 bases gr ce 8 chantillons d ADN unique pour v rifier la capacit du test faire syst matiquement un appel de g notypage pour un chantillon donn travers des combinaisons diff rentes de primers d indexage Chaque chantillon a t analys avec 12 combinaisons diff rentes de primers d indexage Quarante huit 48 combinaisons d in dex ont t test es en une seule analyse de s quen age Les r sultats des chantillons ont t compar s aux donn es de s quen age bidirectionnel de Sanger pour l ense
49. l amplicon n incorrec n incorrec correct n incorrec correct y appels tst appels tst s appels tst s 19 122 Poly G 6 135 100 100 66 en GC 53 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 d Contenu Nomb Amoli Ch a g nomiqu do Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre si ou TABENE e ae yses re total total d appe re total total d appe re total total d appe n r nt d chantillo 7 7 f de d aucu d appels ls d aucu d appels ls d aucu d appels ls analys f 2 ns i a Vamplicon n incorrec correct n incorrec correct n incorrec correct 1 appels tst appels tst appels ts 187 191 Poly C 5 72 en GC R gion homologue sur un chromoso me diff rent 188 19 64 en GC 189 190 19 191 122 a 1 S entend par fragment analys la taille de la r gion g nomique s quenc e dans les bases sans prendre en compte les primers sp cifiques la cible 2 Le nombre d chantillons est calcul partir de 9 analyses de 15 chantillons 11 chantillons analys s une fois et 2 chantillons analys s deux fois 3 Le nombre total d aucun appels est le nombre total d aucun appels obtenu pour l ensemble des 45 analyses analysant l amplicon sp cifique l aide d un instrument MiSeqDx sp cifi Le nombre total d appels incorrects est le nombre total d appels incorrects obtenus pour l ensemble
50. la plaque filtrante Pipettez la solution NaOH de haut en bas 5 6 fois 4 Recouvrez et incubez la plaque filtrante la temp rature ambiante pendant 5 minutes 5 Pendant que la plaque filtrante est en incubation transf rez 22 ul de la solution de travail PCR chaque puits de la plaque AMP contenant des amorces d index 6 Transf rez les chantillons lu s du filtre la plaque AMP comme suit a Pipettez les chantillons de la premi re colonne de la plaque filtrante de haut en bas 5 a 6 fois b Transf rez 20 ul de la plaque filtrante la colonne correspondante de la plaque AMP c Pipettez doucement de haut en bas 5 6 fois pour combiner soigneusement l ADN la solution de travail PCR d Transf rez les autres colonnes de la plaque filtrante la plaque AMP en proc dant de la m me mani re Les extr mit s doivent tre chang es apres chaque colonne pour viter la contamination crois e de l index et de l chantillon 7 Scellez la plaque AMP et s curisez avec un rouleau en caoutchouc 8 Centrifugez a 1 000 x g 20 C pendant 1 minute 9 Transf rez la plaque AMP vers la zone de post amplification 10 R alisez la PCR en utilisant le programme suivant sur un thermocycleur 95 C pendant 3 minutes 25 cycles de 95 C pendant 30 secondes 62 C pendant 30 secondes 72 C pendant 60 secondes 72 C pendant 5 minutes Maintenez a 10 C POINT D ARR T DE S CURIT Si vous ne proc dez pas im
51. laque SGP scell e une temp rature comprise entre 15 et 25 C pendant trois jours au Maximum F vrier 2014 N 15039608 R v A FRA 17 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Groupement des librairies Pr parer le groupage de librairies 1 R glez un bloc chauffant convenable aux tubes centrifuger de 1 5 ml sur 96 C 2 Dans un seau glace pr parez un bain d eau glac e R frig rez le Tampon de dilution de librairie dans le bain d eau glac e 3 Commencez par d congeler la cartouche de r actifs de MiSeqDx Pr parer une nouvelle dilution de NaOH ATTENTION L utilisation de NaOH nouvellement dilu est essentielle pour d naturer compl tement les chantillons pour la g n ration d amplifiats sur le MiSeqDx 1 Combinez les volumes suivants dans un tube de microcentrifugeuse eau sans DNase et sans RNase 900 pul NaOH 1 0 N 100 ul de r serve 2 Retournez le tube plusieurs fois pour m langer D naturer et diluer le Contr le interne PhiX 1 Combinez les volumes suivants pour diluer la librairie Contr le interne PhiX 2 nM Librairie Contr le interne PhiX de 10 nM 2 ul tampon 1X TE 8 ul 2 Combinez les volumes suivants pour obtenir une librairie Contr le interne PhiX de 1 nM Librairie Contr le interne PhiX de 2 nM 10 ul 0 1 N NaOH 10 ul 3 Agitez bri vement la solution de la librairie Contr le interne PhiX de 1 nM 4 Centrifugez la solution du mod le 280 x g a 20 C
52. le surnageant et mettez le au rebut R p tez la proc dure de Lavage de normalisation de librairie comme d crit l tape pr c dente Utilisez une pipette multicanaux P20 r gl e a 20 ul pour retirer tout exc s de Lavage de normalisation de librairie D poser la plaque LNP du support magn tique et ajoutez 30 ul de la solution 0 1 N NaOH chaque puits Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques 1 800 tr min pendant 5 minutes Pendant l lution de 5 minutes pr voyez une nouvelle plaque PCR 96 puits ci apr s d nomm e la plaque SGP Ajoutez 30 ul de Tampon de stockage de librairie dans chaque puits a utiliser dans la plaque SGP Apr s l lution de 5 minutes assurez vous que tous les chantillons dans la plaque LNP sont compl tement remis en suspension Si les chantillons ne sont pas compl tement remis en suspension pipettez doucement ces chantillons de haut en bas ou tapotez doucement la plaque sur le banc pour remettre en suspension les billes puis secouez pendant encore 5 minutes Placez la plaque LNP sur le support magn tique pendant au moins 2 minutes Transf rez le surnageant de la plaque LNP la plaque SGP Pipettez de haut en bas 5 fois pour m langer Scellez la plaque SGP puis centrifugez 1 000 x g 20 C pendant 1 minute POINT D ARR T DE S CURIT Si vous ne proc dez pas imm diatement au groupement des librairies et au s quen age qui suit sur le MiseqDx stockez la p
53. librairie R actifs n cessaires non fournis Pool d oligos personnalis Les oligonucl otides sp cifiques au primer sont con us pour tre d velopp s par l utilisateur et ne sont pas inclus dans la trousse de pr paration de la librairie La Figure 1 illustre le principe de conception de l oligo personnalis La conception de l oligo doit respecter les exigences suivantes 4 N 15039608 R v FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 e Une paire d oligonucl otides personnalis s doit tre con ue pour chaque amplicon une sonde personnalis e 1 oligonucl otide locus sp cifique en amont ULSO et une sonde personnalis e 2 oligonucl otide locus sp cifique en aval DLSO e Les oligos personnalis s doivent entourer la r gion d int r t Celle ci peut comporter entre 150 et 250 bp pour permettre un s quen age complet du fragment l aide de la trousse 2 x 150 e Les deux oligonu cl otides doivent s hybrider avec le m me brin d ADN e Les oligos personnalis s doivent contenir les adaptateurs propres Illumina pour permettre l ajout d indices ainsi que des adaptateurs de s quen age par PCR L adaptateur 1 5 CAACGATCGTCGAAATTCGC 3 doit tre situ l extr mit 5 de la sonde personnalis e 1 ULSO L adaptateur 2 5 AGATCGGAAGAGCGTCGTGTA 3 doit tre situ l extr mit 3 de la sonde personnalis e 2 ULSO e La sonde personnalis e 2 DLSO est phosphoryl
54. m diatement au nettoyage PCR la plaque AMP peut rester sur le thermocycleur durant la nuit ou tre stock e entre 2 et 8 C jusqu 48 heures Nettoyage PCR Pr paration 1 2 Ramenez les Billes de nettoyage PCR a la temp rature ambiante Pr parez une nouvelle solution d thanol a 80 partir de l thanol absolu F vrier 2014 N 15039608 R v FRA 15 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Proc dure 1 Centrifugez la plaque AMP 1 000 x g 20 C pendant 1 minute 2 Mettez en route une nouvelle plaque MIDI ci apr s d sign comme la plaque CLP 3 Renversez les Billes de nettoyage PCR 10 fois M langez vigoureusement l aide d un agitateur vortex puis renversez 10 fois de plus Inspectez visuellement la solution pour s assurer que les billes sont suspendues 4 Ajoutez 45 ul de Billes de nettoyage PCR dans chaque puits de la plaque CLP 5 Transf rez la totalit du produit PCR de la plaque AMP la plaque CLP 6 Scellez la plaque CLP et secouez la dans un agitateur pour microplaques 1 800 tr min pendant 2 minutes 7 Incubez temp rature ambiante sans secouer pendant 10 minutes 8 Placez la plaque sur un support magn tique pendant au moins 2 minutes ou jusqu ce que le surnageant soit vacu 9 Avec la plaque CLP sur le support magn tique retirez soigneusement et jetez le surnageant 10 Avec la plaque CLP sur le support magn tique lavez les billes comme suit a Ajoutez 2
55. m oe p w o p eee E de CS CH e e o e e CE adr woes oo p m o o w o CS 43 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 d Contenu Nomb E S g nomiqu dus as Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre Amplico Ch fragme d analyses 7 7 e i re total total re total total d appe re total total d appe n r nt d chantillo 7 i de d aucu d appels d aucu d appels ls d aucu d appels ls A ns l amplicon n incorrec n incorrec poed n incorrec correct appels tst appels appels s KC ECO E EI CO O E E CN CI CS oe E e p CO CI EC CC p oe o E CS CO EC EC CI CCE E CC ER ES ES CS e ER CE EN CE CHE ECON EC ema e E C e ES CC CCE EEN e E ER CO EC CA CD A EA 44 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 d Contenu Nomb g ds g nomiqu dus as Nomb Nombre Nomb Nombre Nomb Nombre Amplico Ch fragme d analyses 7 7 e i re total total re total total d appe re total total d appe n r nt d chantillo 7 7 r i de d aucu d appels d aucu d appels ls d aucu d appels ls PA ns l amplicon n incorrec n incorrec poed n incorrec correct appels tst appels appels s NE ES ES COS E CI CC E CE OS pp A ES A A AA pe E AA E A
56. mble des positions variants La reproductibilit et la pr cision ont t de 100 pour toutes les combinaisons de primers d indexage chantillon Brevets et marques commerciales Ce document et son contenu sont exclusifs Illumina Inc et ses soci t s affili es Illumina et sont exclusivement destin s l usage contractuel de son client dans le cadre de l utilisation du ou des produits d crits dans les pr sentes et aucune autre fin Ce document et son contenu ne seront utilis s ou distribu s aucune autre fin et ou communiqu s divulgu s ou reproduits d aucune fa on sans le consentement crit pr alable d Illumina Illumina ne c de aucune licence en vertu de son brevet de sa marque de commerce de son droit d auteur ou de ses droits en common law ni de droits similaires d un tiers quelconque par ce document Les instructions contenues dans ce document doivent tre suivies strictement et explicitement par un personnel qualifi et ad quatement form de fa on assurer l utilisation correcte et s re du ou des produits d crits dans les pr sentes Le contenu int gral de ce document doit tre lu et compris avant d utiliser ces produits LE MANQUEMENT LIRE COMPL TEMENT ET SUIVRE EXPLICITEMENT TOUTES LES INSTRUCTIONS CONTENUES DANS LES PR SENTES POURRA CAUSER DES DOMMAGES AUX PRODUITS DES BLESSURES AUX PERSONNES UTILISATEURS O AUTRES ET DES DOMMAGES AUX AUTRES BIENS ILLUMINA REJETTE TOUTE RES
57. mbre Nombre d Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre a 1 d 1 de dle u appels appels Amplicon Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PP f pE PP fragment amplicon anaue analys s at sonal corrects par incorrects corrects analys P q y y a PE chantillon 6 7 effectu s ECON E CC EC EC CI CI E ECON e ECN e EC e CE EE CI eoo E ES ECO E E EC CEE EOS E E ES EC E IC E CC 25 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Nombre Taill Nomb Nomb E Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre P h Pap T de els u appels appels Amplicon Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PE pE PP fragment amplicon annus analys s at er corrects par incorrects corrects analys p q y y PPE chantillon 6 7 effectu s 59 5 118 E 13 15 118 0 118 0 100 26 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 si Nombre A Taille Nombre Nombre Yo d Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre a 1 d 1 danses u appels appels Amplicon Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PP f pE PP fragment amplicon anaue analys ant er corrects par incorrects corrects analys p q y id 3 PE chantillon 6 7 effectu s 75 7 127 59 en GC 13 15 127 127 100 SNV E CI EE EC e e IC e CI IQM EI ESO ECON E EI EC EC CC EOS EI E ES EC E IC EC CC
58. ncordance positive en pour cent CPP 100 x TP TP EN o les vrais positifs TP sont le nombre d appels de variants posi tifs aux coordonn es g nomiques o sont pr sents les variants selon la s quence de r f rence et l all le mutant appel est concor dant avec la s quence de r f rence colonne nomm e Variants appel s correctement et les faux n gatifs FN sont le nombre d appels de variants n gatifs aux coordonn es g nomiques o sont pr sents les variants selon la s quence de r f rence colonne nomm e Variants manqu s 5 Concordance n gative en pour cent CNP 100 x TN FP TN o les faux positifs FP sont le nombre d appels de variants posi tifs aux coordonn es g nomiques o sont absents les variants selon la s quence de r f rence ou si l all le mutant appel est dis cordant avec la s quence de r f rence non r f renc dans le tableau aucun appel de variants faux positifs n a t effectu dans cette tude et les vrais n gatifs TN sont le nombre d appels de variants n gatifs aux coordonn es g nomiques o sont absents les variants selon la s quence de r f rence colonne nomm e Bases sans variants appel es correctement Etude 2 Les r sultats de s quen age pour le panel d amplicons ci dessus ont t compar s un g notype d une grande fia bilit tabli pour NA12878 par le National Institutes of Standards and Technology NIST Institut national des no
59. nqu s taient des insertions de base 1 ou des suppressions de base 1 dans les r gions d homopolymeres Table 14 Concordance des r sultats des appels de bases de la plateforme MiSeqDx avec les donn es de r f rence pour 13 chantillons bien caract ris s de Variants Bases sans Nb attendus Variants Variants variants CN Echantillo p couverture E f CPP d amplicon ar correctemen manqu appel es ao ps n d amplicon 3 o s A chantillo t appel s s correctemen s n t NA12877 195 100 19 17 2 24418 89 4 100 7 NA12878 195 100 19 17 2 24417 89 4 100 7 NA12879 195 100 20 19 1 24416 95 0 100 0 NA12880 195 100 20 18 2 24417 90 0 100 0 NA12881 195 100 22 20 2 24415 90 9 100 1 NA12882 195 100 16 15 Jl 24419 937 100 5 NA12883 195 100 24 23 1 24412 95 8 100 3 NA12884 195 100 211 20 il 24415 952 100 4 NA12885 195 100 19 17 2 24417 89 4 100 7 NA12886 195 100 22 20 2 24415 90 9 100 1 NA12887 195 100 19 18 1 24416 94 7 100 4 NA12888 195 100 24 23 il 24412 95 8 100 3 NA12893 195 100 20 18 2 24417 90 0 100 0 1 Le de couverture d amplicons est le nombre de bases dans les amplicons s quenc es avec fiabilit 2 Les variants pr vus par chantillon comprennent les SNV et les indels 3 Pour les variants manqu s veuillez consulter le premier tableau de l tude 1 et les notes de bas de page 8 10 F vrier 2014 N 15039608 R v A FRA 37 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Co
60. ocycleurs refroidissement actif p ex le refroidissement thermo lectrique Peltier n est pas recommand e pour l tape d hybridation L tape de refroidissement passif est essentielle pour une hybridation ad quate Ajoutez toujours le Polym rase PCR au M lange ma tre PCR juste avant utilisation Ne stockez jamais la solution de travail combin e Durant l tape de normalisation de la librairie il est extr mement important de resuspendre compl tement le culot des billes de la librairie C est essentiel pour accomplir une densit consistante d amplifiats sur la lame de la Flow Cell MiSeqDx Respectez les temps d incubation indiqu s dans l tape de normalisation de librairie Une incubation inappropri e peut affecter la repr sentation de la librairie et la densit des amplifiats tant donn le nombre de transferts de plaque et le risque de contamination qui en d coule prenez de grandes pr cautions pour vous assurer que le contenu du puits reste entierement dans le puits N claboussez pas le contenu La recommandation en mati re d entr e d ADN de 250 ng permet la variation de quantit d ADN la performance de la trousse d pend de ce niveau d entr e Notes proc durales 1 W Ilumina n cessite qu un chantillon d ADN de contr le positif et un contr le n gatif NTC ou aucune commande de mod le soient inclus dans chaque analyse qui est d finie comme une s rie d chantillons trait s en parall le L
61. on les chantillons d ADN g nomique et l chantillon de contr le positif temp rature ambiante 2 M langez vigoureusement le pool d oligos personnalis et le Tampon d hybridation pour s assurer que tous les pr cipit s ont t compl tement dissous puis centrifugez bri vement les tubes pour recueillir le liquide 3 R glez un bloc chauffant de 96 puits 95 C 4 Pr chauffez un incubateur 37 C 5 Cr ez la plaque d chantillon en fonction du graphique de la plaque imprim partir d IWM Proc dure 1 Pr voyez une nouvelle plaque PCR de 96 puits ci apr s d nomm e la plaque d HYBRIDATION 2 Ajoutez 5 ul d chantillon ou de contr le 50 ng ul 250 ng total dans les puits appropri s dans la plaque d HYBRIDATION Suivez la disposition de la plaque g n r e pour une s lection appropri e des puits 3 Ajoutez 5 ul de pool d oligos personnalis tous les puits contenant l ADN g nomique 4 Ajoutez 40 ul de Tampon d hybridation chaque chantillon dans la plaque d HYBRIDATION Pipettez doucement vers le haut et le bas 3 5 fois pour m langer 5 Scellez la plaque HYB et centrifugez 1 000 x g a 20 C pendant 1 minute 6 Placez la plaque d HYBRIDATION dans le bloc pr chauff 95 C et incubez pendant 1 minute 7 R duisez le bloc chauffant 40 C et continuez incuber jusqu ce que le bloc chauffant atteigne 40 C environ 80 minutes Le refroidissement progressif est tr s important po
62. on Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PP f pE PP fragment amplicon anaue analys s dt de sonal corrects par incorrects corrects analys p q y y e PE chantillon 6 7 effectu s 115 10 124 Poly T 6 13 15 124 0 124 0 100 R gion homologue sur un chromosome diff rent 117 10 135 Poly A 6 13 15 135 135 100 R gion homologue sur un chromosome diff rent 30 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Nombre Taill Nomb Nomb E Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre P h Pap T de els u appels appels Amplicon Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PE pE PP fragment amplicon anaue analys s oati er corrects par incorrects corrects analys p q y y g PPE chantillon 6 7 effectu s 127 11 129 E 13 15 129 0 129 0 100 aoo e ER CC e EE CE e e 11 134 Poly A 5 13 15 134 134 Poly T 5 137 11 133 26 en GC 13 15 133 133 100 SNV 31 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Nombre Taill Nomb Nomb E S Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre Pris H PiN A ia els u appels appels Amplicon Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PP f pE PP fragment amplicon angues analys ME CE sonal corrects par incorrects corrects analys p q y id 3 PE chantillon 6 7 effectu s 26 en GC 32 N
63. onn e contenant des sels et 15 25 C des dNTP Table 2 Bo te 1B r actifs de post amplification Composant Quantit Volume e Ingr dients actifs Stockage remplissage Diluant de 1 tube 4 6 mL Solution aqueuse tamponn e contenant des sels du 15 25 C normalisation de 2 mercapto thanol et du formamide librairie Tampon de dilution 1 tube 4 5 mL Solution aqueuse tamponn e 15 25 C de librairie Contr le interne 1 tube 10 ul Solution aqueuse tamponn e contenant de l ADN 15 25 C PhiX g nomique PhiX Trousse universelle MiSeqDx 1 0 bo te 2 Table 3 Bo te 2 r actifs de post amplification Composant Quantit Contenu Stockage Cartouche de r actifs 2 cartouches Cartouche usage unique contenant une g n ration 15 25 C MiSeqDx d amplifiats et des r actifs de s quencage pour une utilisation avec le MiSeqDx comprenant du formamide du 2 mercapto thanol et lt 2 de DMSO F vrier 2014 N 15039608 R v FRA 3 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Trousse universelle MiSeqDx 1 0 bo te 3 Table 4 Bo te 3A r actifs de pr amplification Composant Quantit Rs Ingr dients actifs Stockage Tampon de lavage 1 flacon 24mL Solution aqueuse tamponn e contenant des sels du 2 8 C strict 2 mercapto thanol et du formamide Tampon de lavage 1 tube 4 8 mL Solution aqueuse tamponn e contenant des sels 2 8 C universel Table 5 Bo te 3B r actifs de post amplification Composant
64. ont d congel es 18 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 REMARQUE Il est essentiel que les r actifs contenus dans la cartouche soient parfaitement d congel s et m lang s afin de garantir un s quen age correct Inspectez visuellement le r actif de l emplacement 1 pour v rifier qu il est compl tement m lang et qu il ne contient pas de pr cipit s Tapotez doucement la cartouche sur la paillasse pour r duire les bulles d air dans les r actifs 4 REMARQUE Les tubes des dispositifs d aspiration MiSeqDx descendant au fond de chaque r servoir pour aspirer les r actifs il est important qu aucune bulle d air ne reste dans les r servoirs Placez la cartouche de r actifs sur la glace ou r servez la une temp rature comprise entre 2 et 8 C jusqu 6 heures jusqu ce que vous soyez pr t configurer l analyse Pour obtenir de meilleurs r sultats chargez directement l chantillon et configurez l analyse Pr parer les chantillons pour le s quencage 1 O1 amp N 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Ramenez le Tampon de dilution de librairie la temp rature ambiante Agitez le Tampon de dilution de librairie et assurez vous que tous les pr cipit s sont compl tement dissous Si la plaque SGP a t conserv e congel e d congelez la plaque SGP temp rature ambiante Centrifugez la plaque SGP 1 000 x g 20 C pendant 1 minute Mette
65. ontamination crois e Utilisez des nouvelles pointes de pipette entre les chantillons et entre les r actifs distribu s M langez les chantillons l aide d une pipette et centrifugez la plaque lorsque c est indiqu N agitez pas les plaques avec un agitateur vortex L utilisation des pointes r sistantes l a rosol r duit le risque de r tention d amplicons et de contamination crois e d un chantillon l autre Une paire index chantillon doit correspondre exactement la feuille d chantillons Les inad quations entre la feuille d chantillons et le sch ma de la plaque entra neront une perte de l identification positive des chantillons et un rapport de r sultats incorrect Pr parez toujours de l thanol frais a 80 pour les tapes de lavage L thanol peut absorber l eau pr sente dans l air ce qui affecte les r sultats Veillez ce que tout l thanol soit retir du bas des puits pendant les tapes de lavage Des r sidus d thanol pourraient affecter les r sultats Respectez le temps de s chage indiqu apr s l tape du support magn tique pour assurer une vaporation totale L thanol r siduel peut modifier les performances des r actions ult rieures Ne m langez pas le pool d oligos personnalis et le Tampon d hybridation avant de les stocker Lorsqu il est combin le pool d oligos personnalis devient instable m me lorsqu il est conserv congel L utilisation des therm
66. pendant 1 minute 5 Incubez temp rature ambiante durant 4 5 minutes pour d naturer la librairie Contr le interne PhiX en brins uniques 6 Ajoutez le volume suivant de Tampon de dilution de librairie r frig r au pr alable au tube contenant la librairie Contr le interne PhiX d natur pour obtenir une librairie Contr le interne PhiX de 20 pM Librairie Contr le interne PhiX d natur e 20 ul Tampon de dilution de librairie pr alablement r frig r 980 ul Pr parer la cartouche de r actifs 1 D congelez le Cartouche de r actifs MiSeqDx dans un bain d eau contenant assez d eau d ionis e temp rature ambiante pour submerger la base de la cartouche de r actifs jusqu la ligne de d limitation de l eau imprim e sur la cartouche de r actifs Ne pas permettre l eau de d passer la ligne de d limitation de l eau maximale 2 Laissez la cartouche de r actifs d congeler dans le bain d eau temp rature ambiante pendant environ une heure ou jusqu d cong lation complete 3 Retirez la cartouche du bain d eau et tapotez la doucement contre la paillasse pour retirer l eau de la base de la cartouche S chez la base de la cartouche Assurez vous que l eau n a pas clabouss la partie sup rieure de la cartouche de r actifs Inspecter la cartouche de r actifs 1 Retournez la cartouche de r actifs 10 fois pour m langer les r actifs d congel s puis v rifiez visuellement que toutes les positions s
67. pri e Facultatif Entrez une description pour identifier l analyse Assurez vous que la date correspond la date de d but de l analyse S lectionnez Next Suivant Saisie des renseignements sur les chantillons 1 5 Dans l onglet Table Tableau ou l onglet Plate Plaque saisissez les renseignements suivants pour chaque puits contenant un chantillon a Sample ID Identifiant de l chantillon saisissez un seul identifiant d chantillon b Index 1 et Index 2 sp cifiez l adaptateur qui sera utilis pour chaque lecture d index c Manifest Manifeste pr cise le nom du fichier de manifeste qui contient les renseignements sur les chantillons dans ce puits en particulier Pour plus de renseignements sur le fichier de manifeste consultez Poo d oligos personnalis la page 4 Facultatif Pour enregistrer des renseignements plus d taill s sur les chantillons saisissez un nom et une description Facultatif Pour identifier les contr les sur la plaque s lectionnez Negative N gatif ou Positive Positif dans le menu d roulant Control Contr le Acc dez l onglet Plate Graphic Graphique de la plaque et utilisez les options Copy to Clipboard Copier vers le bloc notes ou Print Imprimer pour capturer une image de la plaque d chantillon S lectionnez Finish Terminer Hybridation des pools d oligonucl otides Pr paration 1 Amenez le pool d oligos personnalis le Tampon d hybridati
68. r le interne PhiX Cartouche de r actifs MiSeqDx Except pour la cartouche de r actifs les r actifs sont stables pendant un maximum de six cycles de cong lation d cong lation ayant lieu avant la date d expiration indiqu e Il ne faut pas recongeler la cartouche de r actifs apr s qu elle ait t d congel e Elle peut tre conserv e pendant un maximum de six heures entre 2 C et 8 C 3 Les r actifs suivants sont exp di s r frig r s et sont stables lorsqu ils sont stock s entre 2 C et 8 C jusqu la date d expiration indiqu e Tampon de lavage strict Tampon de lavage universel Billes de nettoyage PCR Billes de librairie Lavage de normalisation de librairie Solution SBS PR2 MiSeqDx Flow Cell MiSeqDx 4 Les r actifs suivants sont exp di s temp rature ambiante et sont stables lorsqu ils sont stock s temp rature ambiante jusqu la date d expiration indiqu e Tampon d lution Plaque filtrante Tampon de stockage de librairie 5 Les changements dans l apparence physique des r actifs fournis peuvent indiquer une d t rioration des mat riaux Si vous constatez des changements dans l apparence physique des r actifs p ex des changements notables de la couleur ou un voile apparent signe d une contamination microbienne ne les utilisez pas 6 Les r actifs Tampon d hybridation Tampon de lavage strict et Diluant de normalisation de librairie peuvent former des pr cipit s ou des crist
69. rmes et de la technologie v 2 151 Sur les 195 amplicons 184 amplicons taient compris dans les appels de r f rence d une grande fiabilit dans la s quence du NIST et ont t compar s Les appels des bases sans variants ont t compar s a la s quence du g nome humain de r f rence version 19 Table 15 Comparaison des r sultats de s quencage de la plateforme MiSeqDx pour l chantillon NA12878 dans la base de donn es du NIST o Bases sans z Nb mes Variant Variants Variants variants CPP CN Echantillo 7 3 couverture s 7 d amplicon correctemen manqu appel es pS n d amplicon attendu o A s e pl t appel s s correctemen t NA12878 184 100 17 16 15 23066 94 1 100 1 Zook JM et al Integrating sequencing datasets to form highly confident SNP and indel genotype calls for a whole human genome 2 Le de couverture d amplicons est le nombre de bases dans les amplicons s quenc es avec fiabilit 3 Concordance positive en pour cent CPP 100 x TP TP FN 1 Concordance n gative en pour cent CNP 100 x TN FP TN 5 Le variant manqu est la suppression de paires de base 1 dans l amplicon 9 d une analyse d homopolymeres de 14 A non appel e par le MiSeqDx pr sent dans la s quence NIST Notez que la s quence du NIST r inclut pas l insertion de paires de base 1 dans l autre homopolymere de A qui tait pr sent dans l autre base de donn es de r f rence utilis e ci dessus dans l tude 1
70. sse 6 N utilisez pas un composant de la trousse au del de la date d expiration indiqu e sur l tiquette du carton de la trousse N interchangez pas les composants de la trousse venant de lots de trousse diff rents Notez que les num ros de lots de trousse sont indiqu s sur l tiquette du carton de la trousse 7 Conservez les composants de la trousse la temp rature sp cifi e dans les zones de pr amplification et post amplification indiqu es 8 Des cycles de cong lation d cong lation r p t s jusqu six des composants de la Bo te 1 ne compromettront pas l int grit de la trousse F vrier 2014 N 15039608 R v FRA 9 Trousse universelle MiSegDx MC 1 0 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Pour emp cher la d gradation des chantillons ou r actifs veillez ce que toutes les vapeurs d hypochlorite de sodium se dissipent avant de commencer le protocole Des pratiques de laboratoire appropri es et une bonne hygi ne de laboratoire sont n cessaires pour emp cher les produits PCR de contaminer les r actifs les instruments et les chantillons d ADN g nomiques La contamination des PCR peut causer des r sultats incorrects et non fiables Pour viter la contamination veillez ce que les zones de pr amplification et de post amplification aient des quipements d di s p ex pipettes pointes de pipette agitateur vortex et centrifugeuse vitez la c
71. t tre lu pour assurer un enregistrement appropri Il est important de maintenir l quilibrage des couleurs pour chaque base de l index lu en cours de s quen age sinon l chec de l enregistrement pourrait se produire lors du s quen age de la lecture d index Consultez le Table 9 pour choisir les combinaisons de primers d indexage pour des analyses avec 48 ou 96 chantillons Table 9 Combinaisons de primers d indexage pour des analyses de s quencage avec 48 ou 96 chantillons Rang es A H Colonnes 1 6 Colonnes 7 12 Primer d indexage A A501 Primer d indexage 1 A701 Primer d indexage 6 A706 Primer d indexage B A502 Primer d indexage 2 A702 Primer d indexage 7 A707 Primer d indexage C A503 Primer d indexage 3 A703 Primer d indexage 8 A708 Primer d indexage D A504 Primer d indexage 4 A704 Primer d indexage 9 A709 Primer d indexage E A505 Primer d indexage 5 A705 Primer d indexage 11 A7011 Primer d indexage F A506 Primer d indexage 10 A710 Primer d indexage 12 A712 Primer d indexage G A507 Primer d indexage H A508 Si le s quen age est inf rieur 48 chantillons dans une analyse de s quen age s lectionnez les index appropri s sur la base de leurs s quences pour maintenir l quilibrage des couleurs dans les canaux verts et rouges Consultez le Table 11 etle Table 12 Au minimum les analyses comportant 8 48 chantillons doivent inclure les combinaisons de Primer
72. t important de remettre en suspension compl tement le culot de billes de la librairie au fond du tube L utilisation d un P1000 permet de s assurer que les billes sont remises en suspension de mani re homog ne et qu il n y a aucune masse de billes au fond du tube C est essentiel pour atteindre la densit r guli re des amplifiats sur le Flow Cell c Pour 96 chantillons pipettez 800 ul de Billes de librairie dans le tube contenant le Diluant de normalisation de librairie d M langez en retournant le tube 15 20 fois Ajoutez 45 ul de la solution de travail Diluant de normalisation de librairie Billes de librairie combin e chaque puits de la plaque LNP contenant des librairies Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques 1 800 tr min pendant 30 minutes Placez la plaque sur un support magn tique pendant au moins 2 minutes ou jusqu ce que le surnageant soit vacu La plaque LNP sur un support magn tique retirez avec pr caution le surnageant et mettez le au rebut D posez la plaque LNP du support magn tique et lavez les billes avec Lavage de normalisation de librairie comme suit a Ajoutez 45 ul de Lavage de normalisation de librairie chaque puits d chantillon b Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques a 1 800 tr min pendant 5 minutes c Placez la plaque sur un support magn tique pendant au moins 2 minutes ou jusqu ce que le surnageant soit vacu d Retirez
73. tion ingestion contact avec la peau et avec les yeux Mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilis conform ment aux normes de s curit gouvernementales locales applicables Pour plus de renseignements communiquez avec l assistance technique d Illumina 2 Certains composants de cette trousse contiennent du 2 mercapto thanol un agent r ducteur Pour plus de renseignements consultez la section R actifs a la page 3 Des risques de l sions corporelles peuvent survenir par inhalation ingestion contact avec la peau et avec les yeux Utilisez ces composants dans une zone bien a r e et mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilis conform ment aux normes de s curit gouvernementales locales applicables Pour plus de renseignements communiquez avec l assistance technique d Illumina 3 Manipulez tous les chantillons comme s il s agissait d agents potentiellement infectieux 4 Le non respect des proc dures d crites peut entra ner des r sultats erron s ou une baisse consid rable de la qualit des chantillons 5 Utilisez les pr cautions de laboratoire habituelles Ne pipettez pas avec la bouche Ne mangez pas ne buvez pas et ne fumez pas dans les zones de travail indiqu es Portez des gants jetables et des blouses de laboratoire lors de la manipulation des chantillons et des r actifs de la trousse Lavez vous les mains soigneusement apr s avoir manipul les chantillons et les r actifs de la trou
74. total total re total total d appe re total total d appe n r nt d chantillo A r i de d aucu d appels d aucu d appels ls d aucu d appels ls analys ns l amplicon n incorrec n incorrec correct n incorrec correct y appels tst appels tst s appels tst s A ER PAS ER CSI CE Rs O e CE ER RE RES ES E A E 133 Poly A 5 135 100 100 100 57 en GC 103 47 N 15039608 R v A FRA F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC Taille du Amplico Ch fragme n r nt analys 1 k PE a e il E 115 ji 48 N 15039608 R v A FRA 1 0 a A Nombre 5 q d analyses d chantillo 2 Vamplicon dis 67 en GC 58 en GC 57 en GC Poly T 5 26 en GC Poly T 5 R gion homologue 135 sur un chromoso me diff rent CA 4 135 MiSeqDx Nomb re total d aucu n appels 1 Nombre total d appels incorrec 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 MiSeqDx 2 Nomb re total d aucu n appels Nombre total d appels incorrec d appe ls correct 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 MiSeqDx Nomb re total d aucu n appels 3 d appe ls correct Nombre total d appels incorrec ts 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 F vrier 2014 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Taille MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx 3 du Contenu Nombre g
75. ts et contenant des exons potentiellement pertinents d un point de vue clinique Les 13 chantillons uniques uti lis s dans cette tude proviennent de deux parents et 11 enfants qui ont t fr quemment s quenc s par plusieurs labo ratoires et selon plusieurs m thodes de s quencage Il y a six chantillons de sujets f minins et sept chantillons de sujets masculins La pr cision a t d termin e pour les variants simple nucl otide SNV en comparant les donn es de l tude une base de donn es de r f rence bien caract ris e La s quence de la base de donn es de r f rence a t obtenue partir de la combinaison de plusieurs m thodes de s quen age de donn es accessibles au public et de ren seignements h r ditaires Le tableau suivant permettant d valuer la pr cision du syst me a t tabli partir des don n es de la premi re analyse au cours de l tude Le test n a pas t r p t pour cette tude Les r sultats de cette tude sont pr sent s ci dessous F vrier 2014 N 15039608 R v FRA 21 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 Table 13 Donn es de pr cision de niveau amplicon de l tude 1 pour la plateforme MiSeqDx Nomb Taille E Nombre Nombre d Contenu Nombre Nombre total d appels par Nombre a 1 d 1 d appels u appels appels Amplicon Chromosome g nomique de d chantillons d chantillons chantillon d aucun PE PE PP fragment amplicon andues alysis wani t appel
76. u elles sont int gr es aux brins d ADN croissants Pendant chaque cycle de s quen age un seul triphosphate de d oxynucl otide marqu par fluorescence dNTP est ajout la cha ne d acide nucl ique Le marqueur nucl otidique sert de terminateur pour la polym risation ainsi apr s chaque incorporation de dNTP le colorant fluorescent est imag pour identifier la base puis enzymatiquement fendu pour permettre l incorporation du prochain nucl otide tant donn que tous les quatre dNTP li s des terminateurs r versibles A G T C sont pr sents comme mol cules seules et s par es la comp tition naturelle minimise le biais li l incorporation Les d finitions de base sont faites directement partir des mesures d intensit de signal pendant chaque cycle de s quen age Le r sultat final est le s quen age base par base Analyse Le logiciel int gr d analyse primaire en temps r el RTA ex cute les analyses d images et la d finition des bases et affecte galement un score de qualit chacune des bases de chaque cycle de s quen age Une fois l analyse primaire termin e le logiciel MiSeq Reporter sur l instrument MiSeqDx lance une analyse secondaire MiSeq Reporter traite les d finitions de base g n r es pendant l analyse primaire et fournit des renseignements sur chaque chantillon en fonction des renseignements indiqu s dans la feuille d chantillons L analyse secondaire comprend le d multiple
77. ue chantillon n 4 20 80 chantillons tandis que la limite inf rieure de 25 ng a t test e avec 14 chantillons 20 r plicats pour chaque chantillon n 14 20 280 chantillons Le d bit au premier passage de l chantillon et le taux de pr cision tait de 100 tous les niveaux d entr e d ADN et les taux d appel de l chantillon taient gt 99 Substances interf rentes Pour valuer l impact des substances interf rentes sur la plateforme MiSeqDx un test repr sentatif con u pour tudier un seul g ne couvrant 11 529 bases a t valu en pr sence et en absence d interf rences potentielles Huit chan tillons de sang total repr sentant huit g notypes uniques ont t utilis s dans l tude Quatre substances interf rentes endog nes bilirubine cholest rol h moglobine et triglyc rides ont t test es en les int grant dans les chantillons de sang total avant l extraction d ADN Pour valuer l interf rence r sultant du pr l vement sanguin petit volume de l EDTA a t int gr dans des chantillons de sang deux concentrations Les limites de concentration pour chaque F vrier 2014 N 15039608 R v FRA 66 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 substance sont indiqu es dans le tableau ci dessous En outre afin d valuer les interf rences r sultant de la pr paration des chantillons on a ajout 15 de tampon de lavage 8 ADN g nomiques purifi s Un d b
78. ues sont pr tes pour le s quencage sur l instrument Ilumina MiSeqDx L utilisation de la Trousse universelle Illumina MiSeqDx 1 0 comporte trois principales proc dures pour lesquelles tous les r actifs sont fournis l exception des oligonucl otides personnalis s La premiere proc dure est la pr paration de la librairie qui pr pare manuellement les chantillons pour le s quen age La pr paration de la librairie comporte quatre tapes cl s l hybridation l extension ligation l amplification par PCR et la normalisation de librairie La deuxi me proc dure est de s quencer l chantillon pr par en utilisant la chimie SBS s quencage par synth se sur le MiSeqDx La troisi me proc dure utilise le logiciel d analyse pour analyser les r sultats de s quen age et g n rer des fichiers au format Variant Call Format VCF contenant des appels de variants pour chaque chantillon Les renseignements n cessaires pour configurer et analyser une analyse de s quen age y compris une liste des chantillons et leurs s quences d index sont d taill s dans un fichier de feuille d chantillons valeurs s par es par des virgules csv Pr paration de la librairie e Hybridation hybride un groupe d oligonucl otides en amont et en aval sp cifiques aux r gions d int r t en chantillon d ADN g nomique la fin du processus une proc dure de lavage en trois tapes avec un filtre capable de s lectionner la taille retir
79. ur une bonne hybridation par cons quent les thermocycleurs PCR avec refroidissement actif p ex le refroidissement thermo lectrique Peltier ne sont pas recommand s pour ce processus F vrier 2014 N 15039608 R v FRA 13 Trousse universelle MiSeqDx MC 1 0 POINT D ARR T DE S CURIT Apr s que le bloc chauffant ait atteint 40 C la plaque d HYBRIDATION est stable lorsqu elle est d maintenue 40 C pendant 2 heures Retrait des oligonucl otides non li s Pr paration 1 Ramenez le M lange extension ligation le Tampon de lavage strict et le Tampon de lavage universel la temp rature ambiante puis agitez bri vement 2 Assemblez l unit d assemblage de la plaque filtrante ci apr s d sign e comme FPU en ordre de haut en bas couvercle plaque filtrante collier d adaptateur et plaque MIDI 3 Lavez au pr alable la membrane de la plaque filtrante comme suit a Ajoutez 45 ul de Tampon de lavage strict chaque puits b Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez 2 400 x g 20 C pendant 5 minutes Proc dure 1 Retirez la plaque HYB du bloc chauffant et centrifugez 1 000 x g 20 C pendant 1 minute 2 Transf rez le volume total d environ 55 ul de chaque chantillon aux puits correspondants de la plaque filtrante 3 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez 2 400 x g 20 C pendant 5 minutes 4 Lavez la plaque filtrante comme suit a Ajoutez 45
80. xage la g n ration de fichier FASTO l alignement la d finition de variant et la g n ration des fichiers VCF contenant des renseignements sur les variants trouv s dans des positions sp cifiques d un g nome de r f rence Limites de la proc dure 1 Destin au diagnostic in vitro uniquement 2 Ce produit se limite fournir Sortie de s quen age gt 1Gb Lectures gt 3 millions Longueur de lecture en analyse lecture appari e 2 x 150 bp Bases sup rieures Q30 gt 75 plus de 75 des bases ont un score de qualit Phred sup rieur 30 indiquant une pr cision de d finition de bases sup rieure 99 9 3 Le syst me a t valid pour la d tection de SNV et jusqu 3 suppressions de base L valuation d insertions de base 1 a t limit e 3 insertions diff rentes sur 3 chromosomes distincts 4 Le syst me a des problemes de d tection des insertions de base 1 ou des suppressions d encha nements homopolym riques par exemple ployA 5 Le syst me MiSeqDx est con u pour offrir des r sultats qualitatifs c d de g notype 6 Comme avec n importe quel flux de travail base d hybridation les polymorphismes ou mutations sous jacents dans les r gions de liaison d un oligonucl otide peuvent affecter les alleles sond s et par cons quent les appels r alis s 7 La couverture minimale recommand e par amplicon n cessaire pour un appel de variants pr cis Q max_gt poly_site gt 100
81. yse doit tre calcul en fonction de la couverture minimale recommand e Il d pen dra de l uniformit de la couverture du pool d oligos personnalis Un fichier de manifeste doit tre cr pour chaque pool d oligos personnalis Le manifeste est un fichier texte conte nant des renseignements sur des r gions g nomiques cibl es MiSeq Reporter en a besoin pour r aliser l analyse Con sultez le site Web d Illumina pour t l charger un mod le de fichier de manifeste R actifs de pr amplification e 10 N NaOH pr parez partir de comprim s ou utilisez une solution standard e Tampon TE e Eau exempte de DNase et de RNase R actifs de post amplification e 10 N NaOH pr parez partir de comprim s ou utilisez une solution standard F vrier 2014 N 15039608 R v FRA 5 Trousse universelle MiSegDx MC 1 0 thanol 200 pour la biologie mol culaire e Tampon TE e Eau exempte de DNase et de RNase Stockage et manipulation 1 La temp rature ambiante est d finie comme tant entre 15 C et 30 C 2 Les r actifs suivants sont exp di s congel s et sont stables lorsqu ils sont stock s entre 15 C et 25 C jusqu la date d expiration indiqu e Tampon d hybridation M lange extension ligation Primers d indexage A A501 H A508 Primers d indexage 1 A701 12 A712 Polym rase PCR M lange ma tre PCR Diluant de normalisation de librairie Tampon de dilution de librairie Cont
82. z en route un tube Eppendorf frais ci apr s d sign comme le tube PAL D terminez les chantillons regrouper pour le s quen age Un maximum de 48 chantillons peut tre regroup pour le s quen age Si la plaque SGP a t conserv e congel e m langez chaque librairie s quencer en pipettant de haut en bas 3 5 fois Transf rez 5 ul de chaque librairie s quencer de la plaque SGP colonne par colonne une barrette de tubes PCR Scellez la SGP avec un timbre adh sif pour plaque et r servez k REMARQUE Apr s utilisation conservez la plaque SGP scell e une temp rature de 15 25 C La plaque SGP scell e est stable pendant un maximum de 3 jours Combinez et transf rez les contenus de la barrette de huit tubes PCR dans le tube PAL M langez le tube PAL completement Mettez en route un tube Eppendorf frais ci apr s d sign comme le tube DAL Ajoutez 585 ul de Tampon de dilution de librairie au tube DAL Ajoutez 6 ul de Contr le interne PhiX de 20 pM au tube DAL Pipettez de haut en bas 3 a 5 fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total Transf rez 9 ul du PAL dans le tube DAL contenant Tampon de dilution de librairie Pipettez de haut en bas 3 5 fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total M langez le tube DAL sous agitateur vortex une vitesse maximale Centrifugez le tube DAL 1 000 x g a 20 C pendant 1 minute Incubez le tube DAL sur un bloc chauffant 9

Notice d`accompagnement de la trousse - Support

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