TP53/RARA DNA-FISH Probe h14-015 VC s wF
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1. est une marque enregistr e de Fisherbrand Pr paration des r actifs Remarque Utiliser de l eau distill e pour la pr paration de toutes les solutions m res et de toutes les solutions de travail S rie d thanol 70 85 et 100 Pr parer des dilutions vol vol d thanol 100 et d eau distill e Conserver TA HCI 0 01N acide chlorhydrique Ajouter 0 5 mL de HCI 1N 49 5 mL d eau distill e Conserver TA Pr chauffer la solution 37 C dans un bain marie avant usage Solution m re de pepsine 0 4 4 mg mL Dissoudre 100 mg de pepsine dans 25 mL de HCL 0 2N Conserver des aliquots de 500 uL 20 C Formald hyde 1 Ajouter 12 5 mL de formaline 10 4 formaldehye 37 mL de PBS 1X Ajouter 500 uL de MgCl 100X Conserver 4 C jusqu une semaine SSC 0 5X Citrate de sodium salin Tween 20 0 1 Ajouter 25 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 974 mL d eau distill e Bien m langer en tour noyant Conserver TA PBS 1X solution saline dans un tampon phosphate M langer 100 mL de PBS 10X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver TA SSC 2X M langer 100 mL de SSC 20X et 900 mL d eau distill e Ajuster le pH 7 0 Conserver temp rature ambiante TA SSC 2X Tween 20 0 1 Ajouter 100 mL de SSC 20X et 1 mL de Tween 20 899 mL d eau distill e Bien m langer en tournoyant Conserver TA MgCl 100X Chlorure de magnesium dans PBS 1X Ajouter 50 uL de2. Lavage post hybridation Remarque sur la proc dure Eviter de faire s cher la lame avant que le lavage soit fini 1 Pr chauffer les solutions de SSC 2X Tween 20 0 1 et de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C 2 Retirer la colle de caoutchouc de la lame l aide de pinces 3 Tremper bri vement la lame dans la solution de SSC 2X TA Retirer la lamelle couvre objet 4 Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 2X Tween 20 0 1 45 C 5 Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C 6 Rincer bri vement la lame dans de l eau distill e Laisser s cher la lame l air libre l abri de la lumi re directe 8 Appliquer 20 uL de DAPI Antifade la zone hybrid e et recouvrir d une lamelle couvre objet 25 x 25 mm N Proc dure pour section FFPE Remarque Produit pr t l emploi Ne pas reconstituer ni diluer Pour usage professionnel uniquement Seul un e technologiste familiaris e avec les m thodes de cytog n tique et form e la technique FISH peut r aliser le test Tout l quipement doit tre talonn avant la r alisation du test Le tissu vis correspond des sections FFPE de 4 5 um d paisseur Les lames doivent tre pr par es conform ment aux directives des m thodes cytog n tiques standards du laboratoire r alisant le test Pr paration des lames Remarque sur la proc dure Simultan ment aux coupes s r
3. la lumi re jusqu la date de p remption Conservation des lames Conserver les lames hybrid es a 20 C l abri de la lumi re Remarque Ces conditions de conservation s appliquent la fois aux produits non ouverts et ouverts Le nombre de cycles de gel d gel ne doit pas d passer le nombre de tests recommand s par flacon Conserver dans le flacon d origine Les flacons conserv s dans d autres conditions peu vent ne pas offrir de performance optimale et par cons quent affecter les r sultats du test Manipulation Tous les r actifs doivent tre manipul s comme s ils taient capables de trans mettre des agents infectieux Apr s usage tout le mat riel doit tre limin conform ment la loi nationale en vigueur Manipuler tous les r actifs et lames contenant des fluorophores en clairage r duit afin d viter toute d t rioration du signal fluorescent Avertissements et mises en garde Lire le mode d emploi avant toute utilisation Tout transport ou conservation impropre peut d truire ou d t riorer la perfor mance du produit En cas de r ception d emballage ou de flacon endommag de d faillance du dispositif apr s utilisation conforme au mode d emploi ou de blessure de l utilisateur contacter le fabricant Tout flacon endommag doit tre limin conform ment la loi nationale en vigueur et aucun essai ne doit tre r alis partir d un tel r actif Manipuler tous le
4. MgCl2 1M a 450 uL de PBS 1X Proc dure Standard for FISH Remarque Produit pr t l emploi Ne pas reconstituer ni diluer Pour usage professionnel uniquement Seul e un e technologiste m dical e familiaris e avec les m thodes de cytog n tique et form e la technique FISH peut r aliser le test Tout l quipement doit tre talonn avant la r alisation du test Le tissu vis est du sang p riph rique et la moelle osseuse Les lames doi vent tre pr par es conform ment aux directives des m thodes cytog n tiques standards du laboratoire r alisant le test Pr paration des lames Toutes les lames fra chement pr par es doivent tre vieillies pendant 1 heure et demie 45 50 C avant l hybridation Si l hybridation n a pas lieu le m me jour que la pr paration conserver les lames 4 C ou 20 C Les lames avec des cellules cytoplasme visible peuvent n cessiter un pr trai tement l aide d un enzyme prot olytique du type pepsine voir pr traite ment facultatif la pepsine Pr traitement facultatif des lames la pepsine 1 Pr chauffer 50 mL de HCI 0 01N 37 C 2 Ajouter 10 15 uL de solution m re de pepsine 0 4 aux 50 mL de HCI 0 01N pr chauff s et incuber la lame pendant 5 10 min 37 C dans la pepsine Remarque sur la proc dure Certains sp cimens peuvent n cessiter des temps de digestion plus longs dans la pepsine 3 Laver deux fois la lame
5. RA sera r duit Dans les cellules avec d l tion interstitielle du chromosome 17 dans lesquelles le locus 7P53 est perdu et le locus RARA conserv on observera un signal rouge TP53 et deux signaux verts RARA Recommendations and limitations Ce produit a t optimis pour tre utilis sur des lames pr par es partir de sp cimens de sang p riph rique et de moelle osseuse et FFPE confor m ment aux m thodes cytog n tiques courantes Le fabricant garantit que ce produit r pond aux caract ristiques de performance analytique sensibilit sp cificit reproductibilit et intervalle de validit tablies sur du sang p riph rique normal ou des tissus pr vus Chaque nouveau lot de sonde DNA FISH doit tre test pour la sp cificit du locus sur un sp cimen de sang p riph rique normal et sur le tissu pr vu pour v rifier la bonne performance du r actif Il incombe au labo ratoire d tablir les intervalles de validit l aide de sp cimens de controle positifs et n gatifs du tissu pr vu L utilisation de filtres aux caract ristiques spectrales autres que celles sp cifi es peut affecter n gativement la force du signal Par exemple le fluorophore rouge est visible travers un filtre orange mais les signaux apparaissent faibles La technique FISH sur m taphase est recommand e pour caract riser les variantes et les patrons de signaux anormaux atypiques Le test FI
6. SH est consid r comme une adjonction la cytog n tique classique caryotype Les r sultats de ces tests doivent tre interpr t s dans la totalit du contexte des ant c dents cliniques du patient Aucune d cision m dicale ne peut tre prise en se fondant uniquement sur les r sultats du test FISH Glossaire des symboles Num ro de lot Dispositif m dical de diagnostic in D Risques biologiques vitro REF Num ro de catalogue 4N Conserver l abri de la lumi re du A Attention consulter la documenta soleil tion d accompagnement M Fabricant CE Marquage CE de conformit X Limite sup rieure de temp rature Y Contient suffisamment pour 10 tests Utiliser avant le Bibliographie 1 Bertheau P et al Pathobiology Review 2008 75 2 132 9 2 Doak S H et al Br J Cancer 2003 89 9 1729 35 3 D hner H et al J Mol Med Review 1999 77 2 266 81 4 Schoch C et al Genes Chromosomes Cancer 2002 35 1 20 9 5 Silveira C G et al Leuk Res 2009 33 1 19 27 6 Carlebach M et la Cancer Genet Cytogenet 2000 117 1 57 60 Cancer Genetics Italia S r l Viale Luigi Majno 17 20122 Milano Italia wWwWw cancergeneticsitalia com support cancergeneticsitalia com DNA FISH Probe fabriqu e dans la communant europ enne par Cancer Genetics Italia S r l 2012 Cancer Genetics Italia S r l Version 05 31 12
7. TP53 RARA DNA FISH Probe Sonde d num ration bicolore 14 015 CE Mode d emploi JC 6 Usage pr vu La sonde DNA FISH TP53 RARA de Cancer Genetics Italia est con ue pour d tecter la perte du g ne 7P53 sur le chromosome 17p13 par rapport au mar queur t moin RARA sur le chromosome 17q21 par hybridation in situ en fluorescence FISH Fluorescence in situ hybridization Le g ne TP53 est un g ne suppresseur de tumeur bien caracteris fl La del TP53 est commune dans une grande vari t de tumeurs solides et de tumeurs malignes h matologiques y compris les n oplasmes cellules B les troubles my lo de telles que la leuc mie my lo de aigu et le syndrome my lodysplasique BI La d l tion du g ne TP53 est associ e un stade avanc de la maladie une survie r duite et une r sistance au traitement de diverses pathologies tumorales Er TP53 TP53 RARA RARA r t lom re 5 E 3 sL wooo 3 t lom re ss 226 kb 233 kb 472 kb Repr sentation sch matique de la sonde DNA FISH TP53 RARA Les barres horizontales rouges et vertes indiquent les zones couvertes par les sondes approximativement l chelle NCBI Build 36 1 Hg18 2006 La sonde TP53 rouge tiquet e directement couvre la totalit du g ne La sonde RARA verte tiquet e directement s hybride la zone entourant le locus et sert de t moin Conservation l arriv e conserver le produit 20 C l abri de
8. Une stringence sup pl mentaire peut tre obtenue en augmentant la dur e de lavage et ou la tem p rature jusqu 65 C Accessoires pour microscope Objectifs Un objectif 10X est adapt au balayage de la zone cible Un grossissement sup rieur s av re n cessaire pour l analyse des signaux et doit avoir lieu avec un objectif immersion huile 63X ou 100X Huile d immersion L huile d immersion doit tre adapt e la microscopie en fluorescence Lampe Une lampe mercure de 100 watts avec une dur e de vie maximale de 200 heures est recommand e Remplacer la lampe avant qu elle ne d passe les 200 heures Filtres recommand s Fluorophore Excitation mission ax Verte DAPI Suite la page suirante Visualisation et interpr tation des signaux Le signal doit tre visualis l aide d un microscope pifluorescence qui p des filtres appropri s Remarque sur la proc dure Les signaux peuvent tre diff rents plans focaux c est pourquoi il est important de focaliser vers le haut et vers le bas des sp ci mens afin de s assurer du comptage de tous les signaux Dans la m taphase diplo de normale et dans les noyaux en interphase la sonde DNA FISH TP53 RARA g n re deux signaux rouges et deux verts correspondant aux deux chromosomes 17 normaux Dans les cellules avec d l tion de la totalit d un chromosome 17 le nom bre de signaux rouges TP53 et verts RA
9. i es utilis es pour l analyse FISH une ou des coupe s doivent tre pr par es pour coloration l h matoxyline et l osine H amp E 1 Les coupes pour essai FISH doivent tre mont es sur des lames Plus en rob es 2 Cuire les lames sur la nuit 12 18 heures 55 C avant l hybridation Utilise sous 3 jours Pr traitement des lames r aliser sous une hotte aspiration 1 D paraffiner la lame dans 3 bains de CitriSolv de 10 min chacun TA Remarque sur la proc dure Les bocaux de CitriSolv peuvent tre utilis s deux fois Toutefois le troisi me bocal doit contenir du r actif encore inutilis 2 D shydrater la lame en l incubant dans deux bains d thanol 100 de 5 min chacun TA S cher l air peut rester a TA pendant plusieurs heures Remarque sur la proc dure La lame peut tre conserv e s che TA pendant plus ieurs heures Incuber la lame dans du HCI 0 2N pendant 20 min TA 4 Rincer la lame dans un bain d eau distill e pendant 1 min TA et 2 bains de SSC 2X de 5 min chacun TA 5 Incuber la lame dans une solution de NaSCN 1M pr chauff e pendant 10 min 80 C Remarque sur la proc dure Certain types de tissus tel le tissue mammaire n ces sitent un temps d incubation plus long 30 60 minutes 6 Rincer la lame dans un bain d eau distill e et 2 bains de SSC 2X de 5 min chacun TA 7 Mettre la lame soit dans une chambre humide ou dans un Thermob
10. ne plaque chauffante temp rature contr l e 5 Incuber pendant 12 18 heures dans une chambre humidifi e 37 C l abri de toute lumi re directe Lavage post hybridation Remarque sur la proc dure Ne pas laisser la lame s cher avant la fin des lavages 1 1 Retirer la colle de caoutchouc de la lame l aide de pinces 2 Tremper la lame dans la solution SSC 2X TA et retirer la lamelle couvre objet 3 Laver la lame pendant 2 x 5 min dans une solution de SSC 2X Tween 20 0 1 45 C Rincer la lame en la trempant dans de l eau distill e Laisser s cher la lame l air libre l abri de la lumi re directe 6 Appliquer 20 uL de DAPI antifade la zone hybrid e et recouvrir d une lamelle couvre objet 25 x 25 mm Remarque sur la proc dure Selon la fixation l ge de la coupe et les conditions de pr traitement on peut apercevoir un bruit de fond vert Si le bruit de fond vert est excessif ou interf re avec l attribution de score les lames peuvent tre re lav es de mani re plus stringente U Avant le relavage retirer l antifade en enlevant la lamelle couvre objet et en proc dant au lavage en deux changements de solution SSC 2X Tween 20 0 1 de 5 min chacun avec agitation TA Proc der imm diatement au relavage ne pas laisser la lame s cher La stringence peut tre accrue en ajoutant une tape de lavage de 2 x 5 min dans une solution de SSC 0 5X Tween 20 0 1 45 C
11. pendant 5 min dans une solution PBS 1X tem p rature ambiante TA 4 Incuber la lame pendant 5 min dans du formald hyde 1 TA 5 Laver la lame pendant 5 min dans une solution PBS 1X TA 6 D shydrater la lame dans de l thanol 70 85 et 100 TA pendant 1 min chacun 7 Laisser s cher la lame l air libre Remarque sur la proc dure V rifier la morphologie de l chantillon l aide d un microscope contraste de phase avant l hybridation Ne pas hybrider en cas de compromission de la morphologie nucl aire Suite la page suirante Proc dure Standard for FISH D naturation hybridation de la sonde DNA FISH 1 Vortexer bri vement la sonde DNA FISH et centrifuger le tube dans une microcentrifugeuse pendant 30 secondes 2 Appliquer 10 uL de sonde DNA FISH sur la zone cible sur la lame et la recouvrir d une lamelle couvre objet 22 x 22 mm Remarque sur la proc dure Prendre soin d viter toute formation de bulles d air Des lamelles couvre objets plus petites ou plus grandes peuvent tre utilis es en fonction du changement proportionnel de volume de la sonde DNA FISH 3 Sceller soigneusement les bords de la lamelle couvre objet l aide de colle de caoutchouc 4 Co d naturer la lame et la sonde DNA FISH pendant 3 min 80 C sur une plaque chauffante temp rature control e 5 Incuber pendant 12 18 heures dans une chambre humidifi e 37 C l abri de toute lumi re directe
12. rite Couvrir la zone cible avec au moins 100 mL de pepsine 0 4 garder la lame en cours d incubation dans des conditions humides Ne pas laisser l chantillon se dess cher 8 Incuber pendant 10 min 37 C Remarque sur la proc dure Cette dur e peut devoir tre ajust e en fonction des conditions de fixation et de l ge de la coupe 9 Rincer la lame pendant 5 min dans de l eau distill e TA Rincer la lame en deux bains de SSC 2X de 5 min chacun TA Plonger bri vement dans de l eau distill e et s cher l air Incuber la lame dans du formol neutre tamponn 10 pendant 15 min TA Rincer la lame en 2 changements de SSC 2X de 5 min chacun TA Plonger bri vement dans de l eau distill e et s cher l air Ww 11 12 13 D naturation hybridation de la sonde DNA FISH 1 Vortexer la sonde DNA FISH pendant 2 3 secondes et centrifuger le tube dans une microcentrifugeuse 2 Appliquer 10 uL de sonde DNA FISH la zone cible sur la lame et la recou vrir d une lamelle couvre objet 22 x 22 mm Remarque sur la proc dure Prendre soin d viter toute formation de bulles d air Des lamelles couvre objets plus petites ou plus grandes peuvent tre utilis es en fonction du changement proportionnel de volume de la sonde DNA FISH 3 Sceller soigneusement les bords de la lamelle couvre objet l aide de colle de caoutchouc 4 Co d naturer la lame et la sonde DNA FISH pendant 5 min 90 C sur u
13. s r actifs avec soin et porter un quipement de protection in dividuelle appropri Le formamide la solution saline de citrate de sodium SSC Saline Sodium Citrate et le dod cyl sulfate de sodium SDS peuvent avoir des effets t ratog nes et mutag nes viter toute inhalation ingestion ou contact avec la peau Le DAPlestunirritant Consulter le Material Safety Data Sheet MSDS du produit pour les informations concernant la s curit R actif fourni Sonde DNA FISH pr te l emploi 100 uL par flacon 10 tests Un test est d fini comme suffisant pour une aire de 22mm x 22mm Sonde tiquet e au fluorophore pour le locus TP53 rouge et au fluoro phore pour le locus RARA vert pr m lang e avec de l ADN bloquant et un tampon d hybridation formamide sulfate de dextran SSC et SDS R actifs et mat riel n cessaire mais non fournis Equipements Reactifs Bocal coplin Microtube centrifuger tanol 100 Lamelles couvre objets 0 5 mL PBS 10X 22x22 e 25x25 Micropipettes 1 200 mL HCIIN Microscope pifluores Parafilm MgCl 1M cence pH m tre NaOH 1M Pinces Lames plus NaSCN 1M Hotte aspirante Colle de caoutchouc SSC 20X Gants Plateau pour lames Formaline 10 Chambre humidifi e Thermom tre calibr DAPI et Antifade Huile d immersion 37 C to 80 C Eau distill e Incubateur Plaque chauffante Pepsine Lampe mercure 100 watts Bain marie 20 Tween Microcentrifugeuse Citrisolv
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