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PowerPlex(R) S5 System Technical Manual (Francais)

1. 55 8 Dans la colonne BioLIMS Project s lectionnez 3100 Projectl dans le menu d roulant 9 Dans la colonne Dye set jeu de marqueurs s lectionnez Z dans le menu d roulant Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux tats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 13 avec logiciel de collecte des donn es Version 1 0 1 ou 1 1 suite CQ 5 B D tection des fragments amplifi s l aide de l analyseur g n tique ABI PRISM 3100 A Promega 10 11 12 15 14 15 16 i 18 Si vous utilisez le logiciel de collecte de donn es version 1 0 1 ou 1 1 de l ABI PRISM 3100 s lectionnez GeneScan36 POP4PowerPlexS5 3kV_11secs_1200 dans le menu d roulant de la colonne Run Module 1 Pour recueillir les donn es sans faire une analyse automatique s lectionnez No Selection pas de s lection dans la colonne Analysis Module 1 Les param tres de l analyse peuvent tre appliqu s apr s la collecte des donn es et en cours d analyse des donn es l aide du logiciel d analyse GeneScan S lectionnez OK Ce nouveau registre de plaque s affichera dans le tableau des registres de plaque en attente a la page de configuration de la plaque du logiciel de collecte de donn es Placez les chantillons
2. chelle all lique Promega recommande l utilisation du logiciel GeneMapper ID pour l analyse des r ac tions PowerPlex Dans le cas du logiciel GeneMapper ID version 3 2 s assurer de s lectionner la m thode d analyse HID Ceci peut tre v rifi en ouvrant la m thode d analyse l aide du g rant GeneMapper puis en s lectionnant l onglet G n ral Le type d ana lyse ne peut pas tre chang Si la m thode n est pas HID il faut la supprimer et cr er une nouvelle m thode d analyse Causes et commentaires Le logiciel Genotyper n a pas t install S assurer que le logiciel Genotyper version 2 5 Macintosh ou version 3 6 ou ult rieure Windows NT est install Version incorrecte du logiciel Genotyper Le macro PowerTyper S5 ne fonctionne pas avec les versions du logiciel Genotyper ant rieures la version 2 5 Le fichier a t corrompu en cours de t l chargement T l charger nouveau Les fichiers de l chantillon d chelle all lique n ont pas t identifi s S assurer que les colonnes d info sur les chantillons ou de la couleur de chaque piste comportant le m lange d chelle all lique PowerPlex S5 contiennent le mot ladder Le macro utilise le mot ladder pour identifier les fichiers d chan tillons contenant l chelle all lique Toutes les couleurs de marqueurs n ont pas t import es Pour le logiciel Genotyper versions 2 5 et 3 5 ou ult rieu
3. 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux Etats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 24 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 3 Dans le menu File fichier s lectionnez Import importer et importez les C fichiers de projet ou d chantillons GeneScan analyser Importez les couleurs gt des marqueurs bleu vert et rouge blue green red Remarque pour s lectionner les couleurs des marqueurs a importer s lectionnez Set Preferences dans le menu Edit 4 Double cliquez sur le macro Check ILS Les macros sont indiqu s au coin inf rieur gauche de la fen tre active Une fen tre de graphiques s affichera o le standard interne internal lane standard ILS 600 appara tra en rouge Faites d filer vers le bas pour visualiser et confirmer que les tailles des fragments du standard interne sont correctes Si n cessaire d finissez nouveau les fragments du standard interne et r analysez les chantillon l aide du logiciel GeneScan Remarque le logiciel utilise un seul chantillon d chelle pour d terminer la taille des all les Le macro utilise le premier chantillon d chelle import pour l attribution des all les 5 Double cliquez sur le macro POWER Le macro POWER identifie les all les de l chelle et calcule les d calages offsets de tous les locus Ce processus peut pre
4. Protocole de cycle thermique 96 C pendant 2 minutes puis 94 C pendant 30 secondes 60 C pendant 2 minutes 72 C pendant 90 secondes pendant 30 cycles puis 60 C pendant 45 minutes Trempe a 4 C En cas d utilisation du thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 utiliser l option de m thode vitesse de rampe 9600 3 Une fois le protocole de cycles thermiques achev stockez les chantillons 20 C dans une bo te l abri de la lumi re Remarques 1 Le stockage des chantillons amplifi s une temp rature de 4 C ou plus lev e peut produire des produits de d gradations 2 Un pr cipit peut se former au cours de l amplification Ce pr cipit n a pas d effet sur les performances en aval de l analyse ou de l lectrophor se capillaire Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 8 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 5 Configuration de l instrument et pr paration des chantillons 5 A D tection des fragments amplifi s l aide de l analyseur g n tique ABI PRISM 3100 ou 3100 Avant avec le logiciel de collecte des donn es Version 2 0 et de l analyseur g n tique Applied Biosystems 3130 ou 3130xl avec le logiciel de collecte des donn es Version 3 0 Mat riel fournir par l utilisateur e
5. es Version 2 0 et de l analyseur g n tique Applied Biosystems 3130 ou 3130xl avec le logiciel de collecte des donn es Version 3 0 suite 4 Ajoutez 1 ul d chantillon amplifi ou 1 ul de m lange d chelle all lique Recouvrez les puits des septums adapt s Remarques 1 Les limites de d tection des appareils pouvant varier il peut tre n cessaire d augmenter ou de r duire la dur e ou le voltage d injection ou la quantit de produit m lang au cocktail de charge Utilisez le Module Manager g rant du module dans le menu des outils pour modifier la dur e de l injection ou le voltage dans le module d ex cution 2 Un pr cipit peut se former au cours de l amplification Ce pr cipit n a pas d effet sur les performances en aval de l analyse ou de l lectrophor se capillaire 5 Centrifugez bri vement la plaque pour liminer les bulles d air des puits si n cessaire 6 D naturez les chantillons 95 C pendant 3 minutes puis refroidissez imm dia tement sur de la glace ou dans un bain d eau glac e pendant 3 minutes D naturez les chantillons juste avant de les charger sur l appareil Pr paration de l appareil Reportez vous au manuel de l appareil pour obtenir les instructions concernant le nettoyage des blocs de pompes l installation du r seau de capillaires l ex cution d un calibrage spatial et le chargement de polym re dans la seringue de r serve Analysez le
6. langer au vortex pendant 5 10 secondes avant de le placer dans les tubes ou plaques de r action 7 B Logiciel d analyse GeneMapper ID Sympt mes Causes et commentaires All les non d termin s Pour l analyse des chantillons l aide du logiciel GeneMapper ID les param tres de l analyse et les standards de taille doivent tous deux tre r gl s sur le type d analyse Basic or Advanced de base ou avanc S ils sont diff rents cela provoquera une erreur Figure 9 Trop peu des fragments du standard interne ILS 600 ont t d finis S assurer de d finir au moins un fragment de l ILS 600 plus petit que le pic le plus petit de l chantillon ou de l chelle all lique et au moins un fragment de l ILS 600 plus grand que le pic le plus grand de l chantillon ou de l chelle all lique e M LL lll E Table Setting Eric deraut Into Raw Data EPT Data gt ENE Sample Information Sample File CRE_1 2h_H03_2004 06 17 fsa Sample Origin Fath G Private Technical Service GI data geneticaiCRE 172h HOS 2004 06 17 fsa Status Message Changed size standard from ils80500adv to ILS600 Classic File Source Disk media Error Message TE E a Ta ah data geneticaiCcRE 17h HOS 2004 06 17 sa Either Panel Slee Standard or Analysis Method was invalid Current Settings Sample Type Sample Figure 9 Message d erreur affich par le logiciel GeneMapper ID lorsqu
7. lec tionnez Ladder chelle Sample chantillon ou Negative Control contr le n gatif Chaque dossier du projet doit contenir au moins une chelle indiqu e en tant que telle pour permettre un g notypage correct 3 Dans la colonne Analysis Method s lectionnez la m thode d analyse cr e plus haut 4 Dans la colonne Panel s lectionnez PowerPlex_55_Panels Il s agit du panel set que vous avez import la Section 6 A e N 5 Dans la colonne Size Standard s lectionnez le standard de taille cr la section Cr ation d un standard de taille 6 Si vous analysez des donn es provenant d un analyseur g n tique ABI PRISM 310 assurez vous que le fichier de matrice appropri est bien s lectionn dans la colonne Matrix 7 S lectionnez Analyze analyser bouton en fl che verte pour d marrer l analyse des donn es Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux tats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 21 Promega 6 C Analyse des chantillons l aide du logiciel GeneScan et des syst mes d exploitation PC 1 Analyse des donn es l aide du logiciel d analyse GeneScan 2 Examinez les donn es brutes d une ou de plusieurs s rie s d chantillons Mettez en surbrilla
8. pendant 5 10 secondes avant de le placer dans les tubes ou plaques de r action Poche d air form e au fond du puits Utiliser une pipette pour limi ner la poche d air ou centrifuger bri vement avant le cycle thermique Centrifuger les chantillons avant de les injecter dans l appareil d EC Concentration lev e en sels ou pH alt r Si l ADN matrice est stock dans du tampon TE qui n est pas au pH 8 0 ou qui contient une con centration plus lev e en EDTA le volume de l ADN ne doit pas d passer 20 du volume total de la r action Les r sidus de K Na Mg ou d EDTA provenant de l ADN peuvent avoir un impact n gatif sur la PCR Un changement de pH peut galement inhiber la PCR Stocker l ADN dans du tampon TE 10 mM Tris HCl pH 8 0 0 1 mM EDTA ou de l eau sans nucl ase Probl mes du thermocycleur de la plaque ou des tubes Consulter les protocoles du cycle thermique a la Section 4 B Nous n avons pas test d autres tubes ou plaques de r action ou thermocycleurs Cali brer le bloc chauffant du thermocycleur si n cessaire Concentration des amorces trop basse Utiliser la concentration d amorces recommand e M langer le m lange d amorces PowerPlex S5 10X Primer Pair au vortex pendant 15 secondes avant l emploi Echantillons pas enti rement d natur s D naturer les chantillons la chaleur pendant la dur e recommand e puis refroidir sur de la glace ou dans un bain d eau glac e imm diatem
9. 1 Pr parez un cocktail de charge en combinant et en m langeant le standard interne Internal Lane Standard 600 et le formamide Hi Di comme suit 0 5 ul ILS 600 x nb d injections 9 5 ul formamide Hi Di x nb d injections Remarque le volume de standard interne utilis dans le cocktail de charge peut tre augment ou r duit pour ajuster l intensit des pics des standards de taille La hauteur optimale des pics pour le fragment de 100 bases du standard interne est de 500 1000 RFU Si les pics sont trop bas nous vous recommandons de modifier le m lange de formamide standards internes de fa on ce qu il contienne 1 0 ul d ILS 600 et 9 0 ul de formamide Hi Di Si les pics sont trop hauts nous vous recommandons de modifier le m lange de formamide standards internes de fa on ce qu il contienne 0 25 ul d ILS 600 et 9 75 ul de formamide Hi Di 2 M langez au vortex pendant 10 15 secondes 3 Pipetez 10 ul du m lange de formamide standard interne dans chaque puits Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux tats Unis R vis 8 12 R f TMD021 Page 9 Promega 5 A D tection des fragments amplifi s l aide de l analyseur g n tique ABI PRISM 3100 ou 3100 Avant avec le logiciel de collecte des donn
10. 150 160 170 180 130 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 C 80 30 100 110 120 130 140 150 160 170 180 130 200 210 220 230 240 250 260 270 280 230 300 310 320 2000 7612TA Figure 7 Le syst me PowerPlex S5 Un seul ADN matrice 250 pg a t amplifi l aide du syst me PowerPlex S5 Les produits de l amplification ont t d tect s l aide d un analyseur g n tique Applied Biosystems 3130 1 avec une injection de 5 secondes 3 kV Les r sultats ont t analys s avec le logiciel GeneMapper ID version 3 2 Panel A Un lectroph rogramme des pics des locus marqu s la fluoresc ine Am log nine D18551 et D851179 Panel B Un lectroph rogramme des pics des locus marqu s la JOE THO1 et FGA Panel C Un lectroph rogramme des fragments du standard interne 600 compris entre 80 et 300 pb A AMEL DS D8 1179 70 80 90 400 110 120 130 14 150 160 170 180 4190 200 20 220 230 240 250 260 270 280 290 300 Figure 8 Le m lange d chelle all lique du syst me PowerPlex S5 Le m lange d chelle all lique du syst me PowerPlex S5 a t analys l aide d un analyseur g n tique Applied Biosystems 3130x avec une injection de 5 secondes 3 kV Les r sultats ont t analys s avec le logiciel GeneMapper ID version 3 2 Panel A Les composants de l chelle all lique marqu s la fluoresc ine Panel B Les composants de l chelle all lique marqu s la JOE Prom
11. Les produits du b gayement s observent souvent une distance d une unit r p t e en dessous du vrai pic de l all le et parfois de deux unit s en dessous ou d une unit au dessus du vrai pic de l all le Les all les ayant un nombre plus lev d unit s r p t es ont tendance pr senter un pourcentage plus lev de b gayement La pr sentation et l intensit du b gayement peuvent tre l g rement diff rentes d un jeu d amorces l autre pour le m me locus En outre d autres pics d art facts peuvent s observer dans certains des locus du syst me PowerPlex S5 Des produits faible intensit peuvent tre pr sents aux positions n 2 et n 2 deux bases en dessous et au dessus du vrai pic de l all le respectivement de certains locus tels que D18551 Un ou plusieurs pics suppl mentaires qui ne sont pas directement li s l amplification peuvent s observer une position plus petite de 11 bases pour les all les THO1 de 1 base pour les all les FGA et de 1 ou 8 bases pour les all les d am log nine Ces pics suppl mentaires peuvent se produire en cas de pics amplifi s particuli rement intenses signal lev ou grande quantit de matrice de formamide polym re ou capillaire de mauvaise qualit ou de d naturation inefficace Un ou plusieurs pics suppl mentaires qui ne sont pas directement li s a l amplification peuvent s observer 73 pb dans le canal de fluo resc in
12. Peak Window Size s pts Slope Threshold Baseline Window 51 pts ape Thresho Peak Start joo Size Calling Method Peak End C 2nd Order Least Squares 3rd Order Least Squares O Cubic Spline Interpolation Local Southern Wdethod O Global Southern Method Factory Defaults 7483TA Figure 3 L onglet D tecteur de pics Promega Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux tats Unis R vis 8 12 R f TMD021 Page 19 CQ 6 B Cr ation d une m thode d analyse l aide du logiciel GeneMapper ID suite A Cr ation d un standard de taille Promega 1 S lectionnez Tools outils puis GeneMapper Manager g rant de GeneMapper S lectionnez l onglet Size Standard standard de taille S lectionnez New nouveau S lectionnez Basic or Advanced de base ou avanc Figure 4 La m thode d analyse s lectionn e doit correspondre celle cr e plus haut S lectionnez OK Dans la fen tre Size Standard Editor diteur des standards de taille saisissez un nom descriptif par ex 60 350 ILS Adv Figure 5 Pour la couleur du marqueur de standard de taille Size standard dye choisissez le rouge red Saisissez les tailles des fragments du standard interne
13. Polynomial Degree B Peak Window Size fis Pts Slope Threshold for bo Peak Start Slope Threshold for bo Peak End 7329TA Figure 6 la fen tre des param tres de l analyse Le point de d part de la plage d analyse qui peut varier est d fini la Section 6 C ou 6 D tape 2 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 22 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 6 Attribuez un nouveau standard de taille S lectionnez un fichier d chantillons C puis mettez en surbrillance la fl che c t du standard de taille S lectionnez A define new d finir nouveau Attribuez les pics des standards de taille tel qu indiqu dans la Figure 11 de la Section 9 C Stockez les standards de taille Promega dans le dossier Size Standards sous C AppliedBio Shared Analysis Sizecaller SizeStandards Remarque avec les dur es d ex cution recommand es dans ce manuel tous les fragments du standard interne ILS 600 ne seront pas d tect s Marquez tous les fragments pr sents Pour une d termination pr cise de la taille le fragment de 350 pb doit tre d tect Si celui ci est pr sent des fragments de plus grande taille peuvent galement tre marqu s 7 Appliquez le fichier de standards de taille aux chantillons puis a
14. bloc chauffant bain marie ou thermocycleur e glace pil e ou bain d eau glac e e centrifuge compatible avec les plaques a 96 puits e c nes de pipettes r sistants aux a rosols e r seau de capillaire 3100 ou 3130 36 cm e polym re performance optimis e POP 4 pour le 3100 ou le 3130 e tampon d analyse g n tique 10X avec EDTA e plaque optique MicroAmp 96 puits et septums e formamide Hi Di Applied Biosystems r f 4311320 e Standards de matrice PowerPlex 3100 3130 r f DG4650 La qualit du formamide est d importance critique Utilisez du formamide Hi Di ayant une conductivit de moins de 100 uS cm Congelez le formamide en aliquotes 20 C Des cycles multiples de cong lation d cong lation ou le stockage a long terme a 4 C peuvent provoquer une d gradation du formamide Si la conductivit du formamide est de plus de 100 uS cm il peut contenir des ions qui entrent en comp tition avec l ADN pendant l injection ce qui provoque des pics plus bas et une sensibilit r duite Une dur e d injection prolong e peut ne pas augmenter le signal Q Attention le formamide est un irritant et un t ratog ne vitez l inhalation et le contact avec la peau Lisez l tiquette d avertissement et prenez les pr cautions appropri es lors de la manipulation de cette substance Portez toujours des gants et des lunettes protect rices pour le travail avec le formamide Pr paration des chantillons
15. commentaires C Migration de l chelle all lique diff rente L chelle all lique et le m lange de paires d amorces n taient pas v de celle de l chantillon compatibles S assurer que l chelle all lique provient du m me syst me que le m lange de paires d amorces Promega Formamide de mauvaise qualit N utiliser que du formamide Hi Di lors de l analyse des chantillons Migration des chantillons l g rement chang e au cours d une s rie d C comportant de nombreux chantillons Ceci peut tre d des changements de temp ratures ou de la colonne d EC au fil du temps Utiliser une injection diff rente de l chelle all lique pour la d termi nation des tailles D s quilibres de la hauteur des pics ADN matrice insuffisant Utiliser la quantit recommand e d ADN matrice Des effets stochastiques peuvent se produire lorsque des faibles quantit s de matrice sont amplifi s Probl mes divers d quilibre D congeler le m lange de paires d amorces 10X et le Master Mix 5X compl tement puis passer au vortex pendant 5 10 secondes avant l emploi Ne pas centrifuger le m lange de paires d amorces 10X apr s l avoir m lang Calibrer les thermocycleurs et pipettes r guli rement ADN matrice impur Des inhibiteurs potentiellement pr sents dans les chantillons de m decine l gale peuvent provoquer une perte ou un d s quilibre d all les M lange d amplification par PCR pas m lang fond M
16. compris entre 60 et 350 pb Section 9 C Figure 11 Remarque avec les dur es d ex cution recommand es dans ce manuel tous les fragments du standard interne ILS 600 ne seront pas d tect s Marquez tous les fragments pr sents Pour une d termination pr cise de la taille le fragment de 350 pb doit tre d tect Si celui ci est pr sent des fragments de plus grande taille peuvent galement tre marqu s S lectionnez OK Select Dye and Analysis Method Classic Dye Select Sample 5725TA Figure 4 La fen tre de s lection du marqueur et de la m thode d analyse Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 20 Imprim aux tats Unis R vis 8 12 F Size Standard Editor o Size Standard Description Promega Hame 0 350 ILS Adv Description Size Standard Dye Size Standard Table Size in Basep airs 41 275 0 42 300 0 13 525 0 14 350 0 Figure 5 L diteur des standards de taille 7484TA Traitement des donn es des chantillons 1 _Importez les fichiers d chantillons dans un nouveau projet tel que d crit dans le tutoriel des analyses d identification humaine du logiciel GeneMapper ID d Applied Biosystems 2 Dans le menu d roulant de la colonne Sample Type type d chantillon s
17. dans l appareil et fermez les portes de l appareil Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 15 Promega 5 C D tection des fragments amplifi s l aide de l analyseur g n tique ABI PRISM 310 suite Pr paration de l appareil Reportez vous au manuel de l analyseur g n tique ABI PRISM 310 pour obtenir les instruc tions concernant le nettoyage des blocs de pompes l installation des capillaires le cali brage de l chantillonneur automatique et le chargement de polym re dans la seringue l 2 Lancez le logiciel de collecte des donn es sur l ABI PRISM 310 Pr parez un tableur d chantillons GeneScan tel que d crit dans le manuel de l utilisateur de l analyseur g n tique ABI PRISM 310 Saisissez les informations appropri es aux chantillons dans la colonne sample info information sur les chantillons Pour les rang es contenant l chelle all lique PowerPlex 55 ajoutez le mot ladder chelle dans la colonne d info des marqueurs bleu et vert Cette information doit tre saisie pour l analyse correcte des donn es avec le macro PowerTyper 55 Cr ez une nouvelle liste d injection GeneScan S lectionnez le tableur d chantillons appropri e l aid
18. m lange de paires d amorces 10X car cela peut entra ner une s dimentation des amorces au fond du tube 2 D terminez le nombre de r actions effectuer Ceci doit comprendre les r actions de contr les positifs et n gatifs Ajoutez une ou deux r actions ce nombre pour tenir compte des erreurs de pipetage Bien que cette approche gaspille une petite quantit de chaque r actif elle permet de garantir que vous aurez assez de m lange d amplification PCR pour tous les chantillons En outre elle garantit que chaque r action contient un m lange d amplification identique 3 Pour chaque r action placez un tube d amplification de 0 2 ml sur un portoir et marquez le de fa on appropri e Vous pouvez galement utiliser une plaque MicroAmp marqu e de fa on appropri e Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 6 Imprim aux tats Unis R vis 8 12 4 Ajoutez le volume final de chaque r actif indiqu au Tableau 1 dans un tube st rile C de 1 5 ml de couleur ambr e M langer doucement A Le Tableau 1 indique le volume de chaque composant par r action Une fiche de Promega calcul de la quantit n cessaire de chaque composant du m lange d amplification PCR est fournie a la Section 9 D Tableau 5 Remarque au cours de tests effectu s ch
19. n 670231 et d autres brevets en attente attribu s au Baylor College of Medicine Houston Texas Les brevets concernant le processus de PCR de fondation brevets europ ens n 201 184 et 200 362 ont expir le 28 mars 2006 Aux Etats Unis les brevets prot geant le processus de PCR de fondation ont expir le 29 mars 2005 b Ce produit est vendu en vertu de contrats de licence avec USB Corporation Le prix d achat de ce produit inclut des droits limit s non transf rables en vertu du d p t de brevet am ricain de num ro de s rie 11 171 008 appartenant USB Corporation permettant l utilisation de la quantit de ce produit strictement n cessaire la pratique des revendications dudit brevet uniquement pour les activit s des utilisateurs finaux dans les domaines de la recherche sur les sciences de la vie et l analyse pour la m decine l gale du mat riel g n tique li ou obtenu en cons quence d enqu tes criminelles ou sur des lieux de catastrophes et men e soit par ou au nom d une entit gouvernementale soit pour l utilisation dans ou la pr paration de proc dures judiciaires ainsi que la compilation et l indexation des r sultats d une telle analyse et l analyse dans le but de la d ter mination de la filiation le domaine d application pour la m decine l gale et l identit g n tique Le domaine d application pour la m decine l gale et l identit g n tique exclut sp cifiquement le typage des tissus as
20. ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 35 C 8 R f rences eo 1 Promega 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Edwards A et al 1991 DNA typing with trimeric and tetrameric tandem repeats Polymorphic loci detection systems and population genetics In The Second International Symposium on Human Identification 1991 Promega Corporation 31 52 Edwards A et al 1991 DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats Am J Hum Genet 49 746 56 Edwards A et al 1992 Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups Genomics 12 241 53 Warne D et al 1991 Tetranucleotide repeat polymorphism at the human actin related pseudogene 2 actbp2 detected using the polymerase chain reaction Nucleic Acids Res 19 6980 Ausubel F M et al 1993 Unit 15 The polymerase chain reaction In Current Protocols in Molecular Biology Vol 2 Greene Publishing Associates Inc and John Wiley and Sons NY Sambrook J Fritsch E F and Maniatis T 1989 Chapter 14 In vitro amplification of DNA by the polymerase chain reaction In Molecular Cloning A Laboratory Manual Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor New York PCR Technology Principles and Application
21. vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Imprim aux tats Unis R vis 8 12 Page 32 Sympt mes Causes et commentaires C Standard de taille pas identifi Pics suppl mentaires dans le standard de taille en mode avanc correctement Figure 10 suite Ouvrir l diteur size match correspondance des tailles Mettre le pic suppl mentaire en surbrillance s lectionner Edit puis delete Promega size label supprimer l annotation de taille S lectionner auto adjust sizes auto ajustement des tailles L lectrophor se n a pas dur assez longtemps et les pics de grande taille de l ILS n ont pas t captur s Certains des pics de l ILS 600 d finis dans le standard de taille n ont pas t d tect s au cours de l lectrophor se e Cr er un nouveau standard de taille utilisant les fragments du contr le interne pr sents dans l chantillon e R injecter les chantillons et prolonger la dur e de l lectrophor se Pics du standard de taille absents Si les pics se situent en dessous du seuil diminuer le seuil dans la m thode d analyse du canal rouge pour inclure les pics Si la qualit de certains pics est mauvaise red finir les standards de taille en omettant ces pics Message d erreur Either panel size Le standard de taille et la m thode d analyse n taient pas au m me standard or analysis method is inva
22. 130x1 Les standards de matrice PowerPlex 310 r f DG4640 ne peuvent pas tre utilis s pour cr er une matrice sur ces appareils Pour obtenir des protocoles et informations suppl mentaires sur la standardisation des matrices reportez vous au Bulletin technique n TBD021 des standards de matrice PowerPlex 310 fourni avec le produit DG4640 Pour obtenir des protocoles et informations suppl mentaires sur le calibrage spectral reportez vous au Bulletin technique n TBD022 des standards de matrice PowerPlex 3100 3130 fourni avec le produit DG4650 Ces manuels sont disponibles sur demande aupr s de Promega ou en ligne www promega com tbs Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux tats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 5 Protocoles d amplification de l ADN l aide du syst me PowerPlex S5 Mat riel fournir par l utilisateur e Thermocycleur Applied Biosystems 2720 ou GeneAmp PCR System 9600 9700 ou 2400 Applied Biosystems e microcentrifugeuse e tubes r action MicroAmp de 0 2 ml ou plaque r action optique MicroAmp 96 puits Applied Biosystems e tubes microcentrifugation de 1 5 ml ambr s Fisher r f 05 402 26 e c nes de pipettes r sistants aux a rosols Section 9 F En g n ral entre 0 25 et 0 5 ng d AD
23. E 4q28 HUMFIBRA g ne la cha ne Complexe alpha du fibrinog ne humain TIC 25 TH01 JOE 11p15 5 HUMTH01 g ne de la tyrosine AATG 25 hydroxylase humaine Le rapport du mois d ao t 1997 26 27 de Commission sur l ADN de l International Society for Forensic Haemo genetics ISFH d cr te que 1 Pour les locus STR au sein de g nes codants le brin sens sera utilis et le motif de s quence r p t e d fini selon le premier nucl otide possible en 5 d un motif r p t et 2 Pour les locus STR non associ s aux g nes codants la premi re entr e dans une banque de donn es ou la premi re description dans un article original sera utilis e 2L am log nine n est pas un STR mais ce locus pr sente une bande de 103 bases sp cifique au chromosome X et une bande de 109 bases sp cifique au chromosome Y FL fluoresc ine JOE 6 carboxy 47 5 dichloro 27 7 dimethoxyfluoresc ine Tableau 3 Informations sp cifiques l chelle all lique du syst me PowerPlex S5 Plage de taille des constituants de l chelle Nombres d unit s r p t es des constituants de Locus STR Marqueur all lique bases l chelle all lique D8S1179 FL 208 252 7 18 D18551 FL 123 199 8 10 10 2 11 13 13 2 14 27 Am log nine FL 103 109 X Y FGA JOE 148 270 Tole eo 192 20 2 212122222792 24 24 2 25 25 2 26 30 31 2 43 2 44 2 45 2 46 2 TH01 JOE 93 132 4 9 9 3 10 11 13 3 Lorsqu un standard interne comme I
24. Etats Unis R vis 8 12 Mise en place de l amplification C y Section 4 A Cycle thermique g Section 4 B GeneAmp PCR System 9700 GeneAmp PCR System 9600 GeneAmp PCR System 2400 Applied Biosystems 2720 Configuration de l instrument et pr paration des chantillons Section 5 Applied Biosystems 3130 ou 3130x ABI PRISM 3100 ou 3100 Avant Genetic Genetic Analyzer avec logiciel de collecte Analyzer avec logiciel de collecte des donn es des donn es Version 3 0 Version 2 0 Section 5 A Section 5 A ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer avec ABI PRISM 310 Genetic Analyzer logiciel de collecte des donn es Version Section 5 C 1 0 1 ou 1 1 Section 5 B Analyse des donn es Section 6 Logiciel GeneMapper ID Logiciel GeneScan et Logiciel GeneScan et Versions 3 1 et 3 2 systemes d exploitation PC systemes d exploitation Macintosh Figure 1 Vue d ensemble du protocole du syst me PowerPlex S5 2 Composants du produit et conditions de stockage Produit Conditionnement Ref PowerPlex S5 System 100 r actions DC6951 Non pr vu pour le diagnostic m dical Le produit DC6951 contient assez de r actifs pour 100 r actions de 25 ul chacune Comprend Bo te des composants de pr amplification tiquette bleue 500 ul PowerPlex S5 5X Master Mix 250 ul PowerPlex S5 10X Primer Pair Mix m lange de paires d amorces 25 ul 2800M Control DNA 10 ng ul 5 x 1250 ul Eau de qualit amplification Boite des co
25. G4650 Reportez vous la section 9 F pour les informations au sujet des commandes Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux Etats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 4 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 3 Avant de commencer C A 3 A Pr cautions L application des m thodes de typage bas es sur la PCR a la m decine l gale ou aux tudes de cas de paternit n cessite des tudes de validation et des mesures de contr le de la qualit d passant le cadre de ce manuel 9 11 La qualit de l ADN purifi ainsi que des l g res modifications des tampons de la force ionique des concentrations des amorces du choix du thermocycleur et des conditions des cycles thermiques peuvent influencer la r ussite de la PCR Nous vous sugg rons d adh rer la lettre aux proc dures recommand es d amplification et de d tection de la fluorescence L analyse des STR bas e sur PCR est susceptible la contamination par de tr s petites quantit s d ADN humain non matrice Des pr cautions extr mes doivent tre prises pour viter la contamination crois e lors de la pr paration des chantillons d ADN de la manipulation des paires d amorces de la mise en place des r actions d amplification et de l analyse des produits de l amplification Les r actifs et le mat riel utilis s avant l amplification
26. ILS 600 est utilis les tailles calcul es des composants de l chelle all lique peuvent tre diff rentes de celles indiqu es dans le tableau Ce ph nom ne se produit en raison des s quences diff rentes des composants de l chelle all lique et des constituants de l ILS pouvant entra ner des diff rences de migration Le marqueur fluorescent affecte galement la migration des all les L am log nine n est pas un STR mais ce locus pr sente une bande de 103 bases sp cifique au chromosome X et une bande de 109 bases sp cifique au chromosome Y Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 38 Imprim aux tats Unis R vis 8 12 Tableau 4 D termination par le syst me PowerPlex S5 des all les dans des ADN matrices C standards couramment disponibles A ADN matrices standards Promega Locus STR K562 9947 A 9948 2800M D851179 12 12 15 1 49 14 15 D18551 15 16 15 19 15 18 16 18 Am log nine X X X X X Y X Y FGA 21 24 23 24 24 26 20 23 TH01 93 90 8 95 6 95 6 9 3 1Des informations sur les souches 9947A 9948 et K562 sont disponibles au site locus umdnj edu nigms La souche K562 est disponible aupr s de l American Type Culture Collection www atcc org Manassas VA tats Unis Des information au sujet de l utilisation des ADN 9947A
27. Mandrekar P et al 2007 Introduction to Maxwell 16 low elution volume configuration for forensic casework Profiles in DNA 10 2 10 12 Des r f rences suppl mentaires sur les STR se trouvent au site www promega com geneticidentity Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 37 Promega 9 Annexe 9 A Avantages de l utilisation des locus inclus dans le syst me PowerPlex S5 Les locus inclus dans le syst me PowerPlex 55 Tableaux 2 et 3 ont t choisis pour comprendre quatre des sept locus ENFSI actuels 12 24 et quatre des locus CODIS actuels En outre le locus de l am log nine est inclus au syst me PowerPlex S5 pour permettre l identification du sexe de chaque chantillon Le tableau 4 pr sente les all les du syst me PowerPlex S5 observ s dans des ADN matrices standards couramment disponibles Tableau 2 Informations sp cifiques aux locus du syst me PowerPlex S5 Localisation Locus GenBank et S quence r p t e Locus STR Marqueur chromosomique d finition du locus 55 D851179 FL 8q S O Complexe TCTA 25 D18551 IE 18q21 3 HUMUT574 AGAA 25 Am log nine FL Xp22 1 22 3 et Y HUMAMEL g ne du S O chromosome Y humain codant pour une prot ine semblable a l am log nine FGA JO
28. Manuel Technique PowerPlex 5 System MODE D EMPLOI DES PRODUITS DC6951 ET DC6950 IMPRIM AUX TATS UNIS R VIS 8 12 R f TMD021 PowerPlex 55 System O Toute la documentation technique est disponible sur Internet l adresse www promega com tbs Veuillez consulter ce site Internet pour v rifier que vous utilisez la version la plus jour de ce manuel technique Si vous avez des questions sur l utilisation de ce syst me veuillez contacter le service technique de Promega Adresse lectronique genetic promega com Lo Pon AE E E EE T 2 2 Composants du produit et conditions de stockage J 3 Avant de COTES iieiea 5 fC 6 5 0219 1500 ter ements D D Standardisation de la matrice ou calibraoe Sb Gtral nie 5 4 Protocoles d amplification de l ADN l aide du syst me PowerPlex 55 6 A Miseni place de TAMPHACANON 22 aa aoaie 6 B Creen aea nE E E ere ae one ets 8 5 Configuration de l instrument et pr paration des chantillons oes eeseseeeeseeseestenesnesneeneens 9 A D tection des fragments amplifi s l aide du ABI PRISM 3100 ou 3100 Avant Genetic Analyzer avec logiciel de collecte des donn es Version 2 0 et du Applied Biosystems 3130 ou 3130xl Genetic Analyzer avec logiciel de collecte des donn es Version 3 0 4 T B D tection des fragments amplifi s l aide du ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer avec logiciel de collecte des donn es Version 1 0 1 ou 1 1 12 C D tection des fragments am
29. N matrice sont amplifi s dans un volume de r action de 25 ul en suivant les protocoles d crits ci dessous Des pics satur s peuvent tre pr sents en cas d utilisation d une quantit de matrice en exc s de la quantit recommand e Si vous utilisez des quantit s lev es de matrice r duisez la quantit d ADN de matrice ou le nombre de cycles 25 28 cycles Le syst me PowerPlex 55 est optimis pour le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 Des protocoles d amplification sont fournis pour les thermocycleurs Applied Biosystems 2720 et GeneAmp PCR Systems 9600 et 2400 4 A Mise en place de l amplification L utilisation de gants et de c nes de pipettes r sistants aux a rosols est vivement recommand e pour viter la contamination crois e Gardez tous les r actifs de pr amplification et de post amplification dans des pi ces s par es Pr parez les r actions d amplification dans un local r serv cet effet Utilisez de l quipement et des fournitures r serv es la mise en place de l amplification Une attention m ticuleuse est essentielle pour permettre une amplification r ussie OD Un guide de d pannage de l amplification est fourni la Section 7 A 1 D congelez enti rement le Master Mix PowerPlex S5 5X le m lange de paires d amorces PowerPlex S5 10X et l ADN 2800M Remarque m langez chaque tube de r actif au vortex pendant 15 secondes avant chaque utilisation Ne centrifugez pas le
30. PowerPlex 55 5X Master Mix PowerPlex S5 10X Primer Pair Mix eau de qualit amplification et ADN 2800M sont fournis dans une bo te s par e et doivent tre stock s part des composants utilis s apr s l amplification PowerPlex S5 Allelic Ladder Mix et Internal Lane Standard 600 Il faut toujours utiliser une r action de contr le n gatif sans matrice pour d tecter une contamination ventuelle des r actifs Nous vous recommandons vivement d utiliser des gants et des c nes de pipettes r sistants aux a rosols par ex les c nes ARTS Section 9 F 3 B Standardisation de la matrice ou calibrage spectral La cr ation d un fichier de matrice appropri est essentielle pour l valuation des syst mes multicolores l aide des analyseurs ABI PRISM 310 3100 et 3100 Avant et Applied Biosystems 3130 et 3130x1 Une matrice doit tre cr e pour chaque appareil individuel Les standards de matrice PowerPlex 310 r f DG4640 sont requis pour la standardisation de la matrice de l analyseur g n tique ABI PRISM 310 Pour des r sultats optimaux les standards de matrice PowerPlex 3100 3130 r f DG4650 ne doivent pas tre utilis s pour la cr ation d une matrice sur l analyseur g n tique ABI PRISM 310 Les standards de matrice PowerPlex 3100 3130 r f DG4650 sont requis pour la standardisation de la matrice des analyseurs g n tiques ABI PRISM 3100 et 3100 Avant et Applied Biosystems 3130 et 3
31. S5 suite 9 Cr ez le tableau appropri en s lectionnant le macro PowerTable tableau complet Make Allele Table faire un tableau des all les ou Make Vertical Table faire un tableau vertical Les trois formats de tableaux sont illustr s ci dessous L option PowerTable permet d afficher jusqu quatre all les par fichier d chantillons Des informations suppl mentaires comme le signal du pic bas ou du pic lev sont aussi inclues Les options Allele Table et Vertical Table ne comprennent que deux all les par locus Si plus de deux all les sont pr sents dans un locus les all les identifi s les plus petits sont inclus Le format Allele Table affiche les cat gories locus en colonnes alors que le format Vertical table affiche les cat gories en rang es Ces tableaux peuvent tre personnalis s pour s adapter aux besoins Pour enregistrer les donn es des tableaux mettez en surbrillance Export to File exporter vers fichier dans le menu d roulant Table puis enregistrez le tableau au nom et l emplacement voulu Le fichier enregistr peut tre visualis et analys dans Microsoft Excel Format PowerTable Info Commentaire Over Faible Satura Annot Rang e chant chant Cat gorie Pic 1 Pic 2 Pic3 Pic 4 flow Signal tion modifi e modifi e Format Allele Table Info Cat gorie Cat gorie Cat gorie Cat gorie Cat gorie Cat gorie Cat gori
32. aque puits Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 12 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 4 Ajoutez 1 ul d chantillon amplifi ou 1 ul de m lange d chelle all lique C Recouvrez les puits des septums adapt s A Remarques Promega 1 Les limites de d tection des appareils pouvant varier il peut tre n cessaire d augmenter ou de r duire la dur e de l injection ou la quantit de produit m lang au cocktail de charge Utilisez le Module Manager g rant du module dans le menu des outils pour modifier la dur e de l injection ou le voltage dans le module d ex cution 2 Un pr cipit peut se former au cours de l amplification Ce pr cipit n a pas d effet sur les performances en aval de l analyse ou de l lectrophor se capillaire 5 Centrifugez bri vement la plaque pour liminer les bulles d air des puits si n cessaire 6 D naturez les chantillons 95 C pendant 3 minutes puis refroidissez imm dia tement sur de la glace ou dans un bain d eau glac e pendant 3 minutes D naturez les chantillons juste avant de charger l appareil Pr paration de l appareil Reportez vous au manuel de l analyseur g n tique ABI PRISM 3100 pour obtenir les instructions concernant le nettoyage des blocs de pompes l
33. cs des standards de taille tel qu indiqu dans la Figure 11 de la Section 9 C Stockez les standards de taille dans le dossier Size Standards Remarque avec les dur es d ex cution recommand es dans ce manuel tous les fragments du standard interne ILS 600 ne seront pas d tect s Marquez tous les fragments pr sents Pour une d termination pr cise de la taille le fragment de 350 pb doit tre d tect Si celui ci est pr sent des fragments de plus grande taille peuvent galement tre marqu s 7 Appliquez le fichier de standards de taille aux chantillons puis analysez les fichiers des chantillons Reportez vous a la Section 6 E pour plus d informations sur l utilisation du Macro PowerTyper 55 et du logiciel Genotyper Pour des renseignements compl mentaires sur le logiciel d analyse GeneScan reportez vous au guide de l utilisateur du logiciel GeneScan Analyse des chantillons l aide du logiciel Genotyper et du Macro PowerTyper S5 Pour faciliter l analyse des donn es g n r es par le syst me PowerPlex 55 nous avons cr un fichier permettant l attribution automatique des g notypes l aide du logiciel Genotyper Apr s l amplification des chantillons leur d tection l aide de l analyseur g n tique ABI PRISM 310 ou 3100 l aide du logiciel de collecte des donn es version 1 0 1 ou 1 1 et leur analyse l aide du logiciel GeneScan les fichiers d chantill
34. ction des pics de pics B I G R Min Peak Half Width largeur min demi pics 2 pts Size Call Range Min 60 plage de tailles attribu es Max 350 Size Calling Method Local Southern Method m thode d attribution de la taille Split Peak Correction None aucune correction des pics doubles Les options de lissage doivent tre optimis es dans les laboratoires individuels 2Les seuils des amplitudes de pics sont les hauteurs minimales des pics que le logiciel consid rera comme un pic Les valeurs des seuils des amplitudes de pics sont g n ralement comprises entre 50 et 200 REU et doivent tre d termin es dans chaque laboratoire individuel Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux tats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 23 Promega 6 D Analyse des chantillons l aide du logiciel GeneScan et des syst mes d exploitation 6 E Macintosh suite 4 Les param tres d analyse peuvent tre enregistr s dans le dossier Params 5 Appliquez le fichier des param tres d analyse enregistr s aux chantillons 6 Attribuez un nouveau standard de taille S lectionnez un fichier d chantillons puis mettez en surbrillance la fl che c t du standard de taille et s lectionnez define new d finir nouveau Attribuez les pi
35. dans l appareil et fermez les portes de l appareil Rep rez le registre de plaque en attente que vous venez de cr er puis cliquez une seule fois sur son nom Une fois le registre de plaque mis en surbrillance cliquez sur le sch ma de plaque correspondant a la plaque sur l chantillonneur automatique qui contient vos chantillons amplifi s afin de lier la plaque au registre de plaque Une fois que le registre de plaque est li la plaque le sch ma de plaque passe du jaune au vert le registre de plaque passe du tableau des registres de plaque en attente au tableau des registre de plaque li es et le bouton Run Instrument d marrer l appareil est activ Cliquez sur le bouton Run Instrument de la barre de menu pour d marrer l analyse des chantillons Surveillez le progr s de l lectrophor se en observant les fen tres run ex cuter status tat array r seau et capillaries capillaires du logiciel de collecte des donn es Chaque injection prendra environ 35 minutes 5 C D tection des fragments amplifi s l aide de l analyseur g n tique ABI PRISM 310 Mat riel fournir par l utilisateur bloc chauffant bain marie ou thermocycleur r gl 95 C capillaires 310 47 cm x 50 um polym re performance optimis e POP 4 pour le 310 tampon d analyse g n tique 10X avec EDTA tubes chantillons et septums c nes de pipettes r sistants aux a rosols formamide Hi Di Applied Biosyste
36. distributeur Promega local coordonn es disponibles au site www promega com worldwide ou par courriel genetic promega com Internal Lane Standard 600 standard interne Le standard interne Internal Lane Standard ILS 600 contient 22 fragments d ADN d une taille de 60 80 100 120 140 160 180 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 550 et 600 bases Figure 11 Dans le cas des analyses PowerPlex 55 seuls les fragments de l ILS 600 en dessous de 350 pb doivent tre d tect s Chaque fragment est marqu la carboxy X rhodamine CXR et peut tre d tect s par ment en pr sence de mat riel amplifi du syst me PowerPlex 55 L ILS 600 est con u pour tre utilis dans chaque injection de EC pour augmenter la pr cision des analyses l aide du syst me PowerPlex S5 600 60 80 120 140 160 180 225 250 275 325 350 375 425 450 475 400 200 O 5751TA Figure 11 Standard interne Internal Lane Standard 600 Un lectroph rogramme des fragments du standard interne 600 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 40 Imprim aux tats Unis R vis 8 12 9 D Pr paration du m lange d amplification PCR pour le syst me PowerPlex S5 Une fiche de calcul de la quantit n cessaire de chaque composant d
37. e 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux tats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 1 Description Les locus STR short tandem repeat microsatellites sont des l ments de s quence r p t es courtes de 3 a7 paires de bases 1 4 Ces r p titions sont largement distribu es dans le g nome humain tout entier et constituent une riche source de marqueurs hautement poly morphiques pouvant tre d tect s par amplification en chaine par polym rase PCR 5 8 Les all les des locus STR se diff rencient par le nombre de copies de la s quence r p t e comprise dans la r gion amplifi e et se distinguent l un de l autre apr s s paration par lectrophor se l aide d une d tection radioactive fluorescente ou par coloration l argent Le syst me PowerPlex 55 amp 9 permet la co amplification et la d tection de cing locus quatre locus STR et l am log nine savoir D851179 D18551 am log nine FGA et TH01 Une amorce sp cifique pour chacun des locus Am log nine D18551 et D851179 est marqu e la fluoresc ine FL et une amorce sp cifique pour chacun des locus TH01 et FGA est marqu e la 6 carboxy 47 5 dichloro 2 7 dim thoxy fluoresc ine JOE Les cing locus sont amplifi s simultan ment dans un seul tube et analys s en une seule injection Le syst me PowerPlex S5 est compatible avec les analyseurs suivants ABI PRISM 310 3100 et 3100 Avant et Ap
38. e Cat gorie chant All le 1 All le 2 All le 1 All le 2 All le 1 All le 2 All le 1 All le 2 Format Vertical Table Pour enregistrer les donn es analys es allez au menu File fichier et s lectionnez Save as enregistrer sous Le macro PowerTyper est un fichier de Genotyper et peut tre remplac par erreur si Save enregistrer est utilis au lieu de Save as enregistrer sous 6 F Contr les 1 Examinez les r sultats du contr le n gatif Le contr le n gatif ne doit pr senter aucun produit d amplification 2 Examinez les r sultats de la r action du contr le positif d ADN 2800M Comparez les tailles des r p titions all liques de l ADN de contr le avec l chelle all lique sp cifique du locus Les attributions attendues des all les de l ADN 2800M sont indiqu es au Tableau 4 Section 9 A Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 26 Imprim aux tats Unis R vis 8 12 6 G R sultats C Des r sultats repr sentatifs du syst me PowerPlex S5 sont pr sent s dans la Figure 7 P m Le m lange d chelle all lique PowerPlex S5 est pr sent dans la Figure 8 g Art facts et b gayement Les bandes de b gayement sont des art facts courants d amplification associ s l analyse des STR
39. e Web de Promega l adresse wWWW promega com g eneticidtools panels_bins 2 Saisissez vos coordonn es puis s lectionnez GeneMapper ID version 3 2 S lectionnez Submit envoyer 3 S lectionnez le lien PowerPlex S5 Panels amp Bin Sets puis enregistrez le fichier Zip sur votre ordinateur 4 Ouvrez les fichiers a l aide du programme Windows WinZip puis enregistrez les fichiers d compress s un emplacement connu de votre ordinateur Importation des fichiers panels et bins Ces instructions suivent peu pr s celles du tutoriel du logiciel Applied Biosystems GeneMapper ID pages 1 4 1 Chargez le logiciel d analyse GeneMapper ID version 3 2 2 S lectionnez Tools outils puis Panel Manager g rant des panels 3 Mettez en surbrillance l ic ne du Panel Manager dans la fen tre sup rieure gauche volet de navigation 4 S lectionnez File fichier puis Import Panels importer les panels 5 Acc dez aux fichiers panel et bin enregistr s S lectionnez PowerPlex S5 Panels ID3 2x txt 6 Dans le volet de navigation mettez en surbrillance le dossier PowerPlex_S5_Panels que vous venez d importer 7 S lectionnez File fichier puis Import Bin sets importer les bin sets 8 Acc dez aux fichiers panel et bin enregistr s S lectionnez PowerPlex_S5_Bins_ID3 2x txt puis Import importer 9 Au bas de la fen tre du g
40. e du menu d roulant S lectionnez le module GS STR POP4 1ml F l aide du menu d roulant Changez la dur e d injection la valeur appropri e et la dur e de l ex cution 23 minutes R glez les param tres restants comme indiqu ci dessous Inj Secs 2 5 Inj kV 15 0 Run kV 15 0 kV au cours de l ex cution Run C 60 temp au cours de l ex cution Run Time 23 dur e de l ex cution Il est possible que vous deviez optimiser la dur e de l injection pour les appa reils individuels Nous recommandons une dur e d injection comprise entre 2 et 5 secondes Remarque la migration des fragments peut varier l g rement au cours d une longue ex cution sur l analyseur g n tique ABI PRISM 310 Ce ph nom ne est vraisemblablement d des changements de temp ratures ou de la colonne Lors de l analyse d un grand nombre d chantillons il peut tre utile d injecter une chelle all lique plusieurs fois au cours de l ex cution pour faciliter le g notypage correct des chantillons S lectionnez le fichier de matrice appropri Section 3 B Pour analyser les donn es automatiquement s lectionnez la case auto analyze ainsi que les param tres d analyse et standards de taille appropri s Reportez vous au manuel de l utilisateur de l analyseur g n tique ABI PRISM 310 pour obtenir des informations sp cifiques concernant ces options Une fois le plateau des chantillons charg et
41. e et 72 76 pb dans le canal de JOE Reportez vous la Section 7 pour plus d informations sur la mani re de minimiser ces art facts Si d sir les filtres de begayement peuvent tre modifi s dans les panel et bin sets de PowerPlex pour le logiciel GeneMapper IDe version 3 2 ou le macro PowerTyper Veuillez contacter le service technique de Promega genetic promega com pour assistance au sujet de ces modifications Remarques 1 Des hauteurs de pics en dehors de la plage lin aire de l appareil peuvent cr er des pics d art facts provoqu s par une saturation de l appareil surcharge de l chan tillon Il est possible que des bavures pics d interf rence d une couleur l autre soient visibles Des signaux satur s peuvent galement appara tre sous forme de deux pics pics doubles 2 Si la hauteur des pics ne se situe pas dans la plage de d tection lin aire de l ap pareil le taux de pics de b gayement par rapport aux vrais pics augmente et l attribution des all les peut tre difficile interpr ter L quilibre des hauteurs de pics peut galement tre moins uniforme Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 27 Promega 6 G R sultats suite A 80 30 100 110 120 130 140
42. e les types d analyse des param tres d analyse et des standards de taille sont diff rents Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux tats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 31 CQ 7 B Logiciel d analyse GeneMapper ID suite A Sympt mes Causes et commentaires Promega All les non d termin s suite L lectrophor se n a pas dur assez longtemps et les pics de grande taille de l ILS n ont pas t captur s Certains des pics de l ILS 600 d finis dans le standard de taille n ont pas t d tect s au cours de l lectrophor se e Cr er un nouveau standard de taille utilisant les fragments du contr le interne pr sents dans l chantillon R injecter les chantillons et prolonger la dur e de l lectrophor se All les hors chelle L chelle all lique utilis e provient d une diff rente s rie que les chantillons R analyser les chantillons l aide d une chelle all lique de la m me s rie Le logiciel GeneMapper ID exige que l chelle all lique soit import e du m me dossier que l chantillon S assurer que l chelle all lique est bien dans le m me dossier que l chantillon Cr er un nouveau projet et r analyser tel que d crit la Section 6 B ou 6 C Le fichier panel s lectionn pour l analyse ne correspond pas au s
43. e sensibilit r duite Une dur e d injection prolong e peut ne pas augmenter le signal Attention le formamide est un irritant et un t ratog ne vitez l inhalation et le contact avec la peau Lisez l tiquette d avertissement et prenez les pr cautions appropri es lors de la manipulation de cette substance Portez toujours des gants et des lunettes protectrices pour le travail avec le formamide Pr paration des chantillons 1 Pr parez un cocktail de charge en combinant et en m langeant le standard interne Internal Lane Standard 600 et le formamide Hi Di comme suit 0 5 ul ILS 600 x nb d injections 9 5 ul formamide Hi Di x nb d injections Remarque le volume de standard interne utilis dans le cocktail de charge peut tre augment ou r duit pour ajuster l intensit des pics des standards de taille La hauteur optimale des pics pour le fragment de 100 bases du standard interne est de 500 1000 RFU Si les pics sont trop bas nous vous recommandons de modifier le m lange de formamide standards internes de fa on ce qu il contienne 1 0 ul d ILS 600 et 9 0 ul de formamide Hi Di Si les pics sont trop hauts nous vous recommandons de modifier le m lange de formamide standards internes de fa on ce qu il contienne 0 25 ul d ILS 600 et 9 75 ul de formamide Hi Di 2 M langez au vortex pendant 10 15 secondes 3 Pipetez 10 ul du m lange de formamide standard interne dans ch
44. ega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 28 Imprim aux tats Unis R vis 8 12 7613TA 7 D pannage C Pour toute question qui ne serait pas trait e ci dessous veuillez consulter une succursale ou un distributeur Promega local Les coordonn es de ceux ci sont disponibles au site www promega com Adresse lectronique Promega genetic promega com 7 A Amplification et d tection des fragments Sympt mes Causes et commentaires Pics d all les estomp s ou absents ADN matrice impur En raison de la faible quantit de matrice utilis e ce probl me se pose rarement Selon la proc dure d extraction de l ADN utilis e et la source de l chantillon des inhibiteurs peuvent tre pr sents dans l chantillon d ADN ADN matrice insuffisant Utiliser la quantit recommand e d ADN matrice augmenter la dur e ou le voltage d injection augmenter le nombre de cycles ou le volume de l chantillon amplifi au cours de la pr paration des chantillons Activit insuffisant de l enzyme Utiliser la quantit recommand e de PowerPlex S5 5X Master Mix et m langer le Master Mix 5X au vortex avant l emploi Programme d amplification incorrect V rifier le programme d amplification M lange d amplification PCR pas m lang fond M langer au vortex
45. en 3 S assurer d effectuer l tape d longation de 45 minutes 60 C apr s le cycle thermique Section 4 B Bruit de fond lev Diminuer la dur e de l injection Voir la Section 5 Art facts li s EC pointes Des petites variations de voltage ou des cristaux d ur e passant dans le rayon du laser peuvent provoquer des pointes ou pics inattendus Les pointes s observent parfois dans une seule couleur mais sont souvent identifi es facilement par leur pr sence dans plus d une couleur R injecter les chantillons pour confirmer Art facts li s EC contaminants Les contaminants dans l eau utilis e dans l appareil ou pour diluer le tampon de l analyseur g n tique 10X peuvent provoquer des pics dans les canaux bleu et vert Utiliser de l eau st rilis e en autoclave changer les flacons et le r servoir de tampon de lavage Quantit excessive d ADN L amplification de gt 1 ng de matrice peut engendrer un grand nombre de bandes de b gayement et d autres art facts Pics d interf rence ou bavures Des pics d interf rence peuvent se produire lorsque la hauteur des pics est trop lev e ou si une matrice incorrecte ou de mauvaise qualit a t ajout e aux chantillons e Dans le cas de l analyseur g n tique ABI PRISM 310 cr er une nouvelle matrice puis l appliquer aux chantillons Dans le cas des analyseurs g n tiques ABI PRISM 3100 et 3100 Avant ou Appl
46. eneScan Utiliser le param tre d analyse de lissage l ger light smoothing du GeneScan Les tailles des all les de l chelle all lique en paires de bases sont en dehors de la plage de cat gorie d finie S assurer que l attribution des tailles des fragments du standard interne est correcte D finir nouveau les fragments du standard interne et r analyser les chan tillon l aide du logiciel GeneScan Comparer la taille de l all le le plus petit de l chelle all lique avec les plages de taille en paires de bases indiqu es dans les cat gories du m me all le Si n cessaire augmenter la plage de d part de la cat gorie dans la fen tre de cat gorie gt 6 pb et enregistrer le macro sous un autre nom Les pics de l chelle all lique taient trop hauts entra nant l attribu tion de pics de b gayement comme des pics d all les Utiliser une dur e d injection plus courte diminuer la quantit d chelle all lique utilis e ou r analyser l chantillon d chelle all lique avec des seuils d amplitude de pics plus lev s dans les param tres d analyse de GeneScan Les donn es de l chelle all lique n taient pas compatibles avec le fichier PowerTyper utilis Confirmer que le fichier du macro PowerTyper correspond l chelle all lique utilis e La fen tre des graphiques ou le tableau Les macros n ont pas t ex cut s dans le bon ordre Utiliser l option des all les n affiche pa
47. ent avant IEC Mauvaise injection d EC pics ILS 600 galement touch s R injecter l chantillon V rifier si la seringue fuit V rifier si le laser est sous tension Utilisation de formamide de mauvaise qualit N utiliser que du formamide Hi Di lors de l analyse des chantillons Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux Etats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 29 7 A Amplification et d tection des fragments suite Sympt mes Pics suppl mentaires visibles dans un ou dans tous les canaux de couleurs Pr cipit observ dans les chantillons apr s l amplification Causes et commentaires Contamination avec un autre ADN matrice ou de l ADN pr alable ment amplifi La contamination crois e peut poser des probl mes Utiliser des c nes de pipettes r sistants aux a rosols et changer souvent de gants chantillons pas enti rement d natur s D naturer les chantillons la chaleur pendant la dur e recommand e puis refroidir sur de la glace ou dans un bain d eau glac e imm diatement avant l C Art facts de l amplification des STR L amplification des syst mes de STR par PCR peut provoquer des art facts sous forme de pics de taille plus petite d une base par rapport l all le en raison de l ajout incomplet du r sidu A
48. es bulles ne sont pas retir es des r sultats in gaux peuvent tre obtenus Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 7 Promega 4 B Cycle thermique d amplification Les appareils d amplification et de d tections peuvent varier Il peut tre n cessaire d optimiser les protocoles y compris le nombre de cycles et la dur e de l injection pour chaque appareil de laboratoire Des tests men s chez Promega ont indiqu que 30 cycles sont ad quats pour 0 25 0 5 ng d ADN purifi Augmentez le nombre de cycles 32 34 cycles pour am liorer la sensibilit si des faibles quantit s d ADN matrice sont utilis s Vous pouvez diminuer le nombre de cycles si une quantit plus importante de matrice est ajout e aux r actions Dans le cas de r actions contenant 2 1 ng d ADN le nombre de cycles peut tre r duit 25 28 cycles Une validation interne doit tre effectu e 1 Placez les tubes ou la plaque MicroAmp dans un thermocycleur 2 Ex cutez les protocoles recommand s ci dessous pour les thermocycleurs GeneAmp PCR System 9600 9700 et 2400 et Applied Biosystems 2720 Pour les informations sur d autres mod les de thermocycleurs veuillez contacter le service technique de Promega par courriel genetic promega com
49. es de r sultats S lec tionnez l onglet G n ral et saisissez un nom S lectionnez l onglet Analysis analyse puis s lectionnez GeneMapper Generic dans la liste d roulante du type d analyse 5 Placez les chantillons dans l appareil et fermez les portes de l appareil 6 Dans Spectral Viewer affichage spectral confirmez que le jeu de marqueurs F est activ puis r glez le calibrage actif appropri pour le jeu de marqueurs F 7 Dans run scheduler planificateur de la s rie rep rez le registre de plaque que vous venez de cr er aux tapes 3 et 4 puis cliquez une seule fois sur son nom pour le mettre en surbrillance 8 Une fois le registre de plaque mis en surbrillance cliquez sur le sch ma de plaque correspondant la plaque sur l chantillonneur automatique qui contient vos chantillons amplifi s 9 Une fois que le registre de plaque est li la plaque le sch ma de plaque passe du jaune au vert et la fl che verte Run Instrument d marrer l appareil est activ e 10 Cliquez sur la fl che verte Run Instrument de la barre de menu pour d marrer l analyse des chantillons 11 Surveillez le progr s de l lectrophor se en observant les fen tres run ex cuter view visualiser array r seau ou capillaries capillaires du logiciel de collecte des donn es Chaque injection prendra environ 35 minutes Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madis
50. et 9948 comme ADN matrices standards sont pr sent es la r f rence 28 Nous avons s lectionn les amorces avec soin pour viter ou minimiser les art facts y compris ceux associ s l ADN polym rase Tag tels que les d rapages au niveau des r p titions et l ajout d un nucl otide terminal Les d rapages au niveau des r p titions 29 30 parfois appel s bandes n 4 b gayements ou bandes d ombre sont provoqu s par la perte d une unit r p t e au cours de l amplification de l ADN et ou par des variations somatiques de l ADN L tendue de cet art fact d pend principale ment du locus et de la s quence d ADN amplifi e L ajout d un nucl otide terminal 31 32 se produit lorsque l ADN polym rase Taq ajoute un nucl otide en g n ral l ad nine aux extr mit s 3 des fragments d ADN amplifi s ind pendamment de la matrice L efficacit de cette r action varie selon la s quence des amorces Ainsi une bande d art fact plus courte d une base par rapport la taille attendue c d manquant l ajout terminal s observe parfois Nous avons modifi les s quences des amorces et ajout une tape d extension finale de 45 minutes 60 C 33 au protocole d amplification pour favoriser l ajout du nucl otide terminal et rendre celui ci essentiellement complet lorsque la quantit recommand e d ADN matrice est utilis e La pr sence d all les microvariants des all les q
51. ex sets for the amplification of polymorphic short tandem repeat loci silver stain and fluorescent detection BioTechniques 20 882 9 23 Jones D A 1972 Blood samples Probability of discrimination J Forensic Sct Soc 12 355 9 24 Brenner C and Morris J W 1990 In Proceedings from the International Symposium on Human Identification 1989 Promega Corporation 21 53 25 Griffiths R et al 1998 New reference allelic ladders to improve allelic designation in a multiplex STR system Int J Legal Med 111 267 72 26 B r W et al 1997 DNA recommendations Further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems Int J Legal Med 110 175 6 27 Gill P et al 1997 Considerations from the European DNA Profiling Group EDNAP concerning STR nomenclature Forensic Sci Int 87 185 92 28 Fr geau CJ et al 1995 Characterization of human lymphoid cell lines GM9947 and GM9948 as intra and interlaboratory reference standards for DNA typing Genomics 28 184 97 29 Levinson G and Gutman G A 1987 Slipped strand mispairing A major mechanism for DNA sequence evolution Mol Biol Evol 4 203 21 30 Schlotterer C and Tautz D 1992 Slippage synthesis of simple sequence DNA Nucleic Acids Res 20 211 5 31 Smith J R et al 1995 Approach to genotyping errors caused by nontemplated nucleotide addition by Tag DNA polymerase Genome Res 5 312 7 32 Ma
52. ez Promega nous avons trouv que les r actions peuvent rester temp rature ambiante jusqu 4 heures apr s la mise en place avant d effectuer les cycles thermiques sans effet n gatif sur les r sultats de l amplification Tableau 1 M lange d amplification PCR pour le syst me PowerPlex 55 Composant du m lange d amplification PCR Volume par r action Eau de qualit amplification un volume final de 25 0 ul PowerPlex S5 5X Master Mix 5 0 ul PowerPlex S5 10X Primer Pair Mix 2 5 ul ADN matrice 0 25 0 5 ng jusqu 17 5 ul volume total de r action 25 ul D abord ajouter l eau de qualit amplification au m lange d amplification PCR puis ajouter le PowerPlex S5 5X Master Mix et le m lange de paires d amorces PowerPlex S5 10X La matrice sera ajout e l tape 7 Stocker les ADN matrices dans de l eau de qualit amplification ou du tampon TE 10 mM Tris HCl pH 8 0 0 1 mM EDTA Si l ADN matrice est stock dans du tampon TE qui n est pas au pH 8 0 ou qui contient une concentration plus lev e en EDTA le volume de l chan tillon d ADN utilis ne doit pas d passer 20 du volume final de la r action L efficacit et la qualit de l amplification par PCR peuvent varier fortement en fonction de changements du pH provoqu par l ajout de Tris HCl de la concentration en magn sium disponible en raison de sa ch lation par EDTA ou d autres inhibiteurs de la PCR pouvant tre pr sents en
53. faibles quantit s selon la source de l ADN matrice et la proc dure d extraction utilis e 5 M langez au vortex le m lange d amplification pendant 5 10 secondes D Remarque si le m lange d amplification n est pas suffisamment m lang au vortex une mauvaise amplification des d s quilibres de la hauteur des pics et des pics suppl mentaires dans une plage de 50 80 pb peuvent subvenir 6 Pipetez le volume appropri de m lange d amplification dans chaque tube de r action 7 Pipetez ensuite l ADN matrice 0 25 0 5 ng pour chaque chantillon dans le tube qui contient le m lange d amplification correspondant 8 Pour le contr le positif d amplification vortexer le tube d ADN contr le 2800M puis diluer un aliquote de mani re obtenir 0 5 ng dans le volume final d ADN choisi Pipeter 0 5 ng d ADN contr le 2800M dilu dans un tube de r action contenant le m lange d amplification PCR Remarque Pour stocker l ADN de contr le 2800M dilu diluer l ADN 0 5ng yl dans le tampon TE 4 avec 20ng ml de glycog ne et conserver 4 C Ne pas stocker les dilutions effectu es dans l eau 9 Pour le contr le n gatif d amplification pipetez de l eau de qualit amplification au lieu d ADN matrice dans un tube de r action contenant le m lange d amp lification PCR OD liminez les bulles d air pr sentes au fond des tubes en pipetant avec soin ou en centrifugeant bri vement les tubes ou plaques Si l
54. ga Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 10 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 3 Dans le g rant du protocole cr ez un registre de plaque comme d crit dans le C manuel de l utilisateur de l appareil Dans la bo te de dialogue qui s affiche A s lectionnez GeneMapper Generic dans le menu d roulant Application puis s lectionnez le type de plaque appropri 96 puits Ajoutez les donn es Promega dans les fen tres du propri taire et de l op rateur puis s lectionnez OK Remarque si vous souhaitez effectuer une analyse automatique des donn es des chantillons reportez vous au manuel de l utilisateur de l appareil pour les instructions 4 Dans les champs appropri s du registre de plaque GeneMapper saisissez les noms des chantillons Faites d filer vers la droite Dans la colonne des groupes de r sultats 1 s lectionnez le groupe de r sultats souhait Dans la colonne des protocoles 1 de l appareil s lectionnez le protocole que vous avez cr l tape 2 Assurez vous que cette information est pr sente pour chaque rang e qui contient un nom d chantillon S lectionnez OK Remarque pour cr er un nouveau groupe de r sultats s lectionnez New nouveau dans le menu d roulant de la colonne des group
55. gnuson V L et al 1996 Substrate nucleotide determined non templated addition of adenine by Taq DNA polymerase Implications for PCR based genotyping BioTechniques 21 700 9 33 Walsh P S Fildes N J and Reynolds R 1996 Sequence analysis and characterization of stutter products at the tetranucleotide repeat locus vWA Nucleic Acids Res 24 2807 12 34 Moller A Meyer E and Brinkmann B 1994 Different types of structural variation in STRs HumFES FPS HumVWA and HumD21S11 Int J Leg Med 106 319 23 35 Brinkmann B Moller A and Wiegand P 1995 Structure of new mutations in 2 STR systems Int J Leg Med 107 201 3 36 Mandrekar P V Krenke B E and Tereba A 2001 DNA IQ The intelligent way to purify DNA Profiles in DNA 4 3 16 37 Krenke B E et al 2005 Development of a novel fluorescent two primer approach to quantitative PCR Profiles in DNA 8 1 3 5 38 Greenspoon S and Ban J 2002 Robotic extraction of sexual assault samples using the Biomek 2000 and the DNA IQ System Profiles in DNA 5 1 3 5 39 McLaren B Bjerke M and Tereba A 2006 Automating the DNA IQ System on the Biomek 3000 Laboratory Automation Workstation Profiles in DNA 9 1 11 13 40 Cowan C 2006 The DNA IQ System on the Tecan Freedom EVO 100 Profiles in DNA 9 1 8 10 41 Bjerke M et al 2006 Forensic application of the Maxwell 16 Instrument Profiles in DNA 9 1 3 5 42
56. i comme suit 1 0 ul ILS 600 x nb d injections 24 0 ul formamide Hi Di x nb d injections Remarque le volume de standard interne utilis dans le cocktail de charge peut tre augment ou r duit pour ajuster l intensit des pics des standards de taille Si les pics sont trop bas nous vous recommandons de modifier le m lange de formamide standards internes de fa on ce qu il contienne 0 5 ul d ILS 600 et 24 5 ul de formamide Hi Di 2 M langez au vortex pendant 10 15 secondes 3 Combinez 25 0 ul du cocktail de charge pr par 1 0 ul d chantillon amplifi ou 1 0 ul de m lange d chelle all lique PowerPlex S5 Remarques 1 Les limites de d tection des appareils pouvant varier il peut tre n cessaire d augmenter ou de r duire la dur e de l injection ou la quantit de produit m lang au cocktail de charge 2 Un pr cipit peut se former au cours de l amplification Ce pr cipit n a pas d effet sur les performances en aval de l analyse ou de l lectrophor se capillaire 4 D naturez les chantillons et l chelle en chauffant 95 C pendant 3 minutes puis refroidissez imm diatement sur de la glace ou dans un bain d eau glac e pendant 3 minutes D naturez les chantillons juste avant de les charger 5 Placez les tubes dans le plateau de l chantillonneur automatique appropri 48 ou 96 tubes 6 Placez le plateau de l chantillonneur automatique
57. ied Biosystems 3130 et 3130xl effectuer un nouveau calibrage spectral et r injecter les chantillons e La sensibilit peut varier selon les appareils Optimiser les conditions d injection Voir la Section 5 Le stockage a long terme des chantillons amplifi s dans le formamide peut entrainer leur d gradation R p ter la pr paration des chantillons avec du nouveau formamide Le polym re d EC a d pass sa date d expiration ou a t stock a temp rature ambiante pendant plus d une semaine Effectuer un entretien des appareils quotidiennement ou hebdomadairement tel que recommand par le fabricant M lange d amplification par PCR pas m lang fond M langer au vortex pendant 5 10 secondes avant de le placer dans les tubes ou plaques de r action Poche d air form e au fond du puits Utiliser une pipette pour limi ner la poche d air ou centrifuger bri vement avant le cycle thermique Un pr cipit peut se former suite la d naturation thermique de la prot ine utilis e pour le d marrage chaud Ce pr cipit n a pas d effet sur les performances en aval de l amplification ou de l lectrophorese capillaire Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 30 Imprim aux tats Unis R vis 8 12 Sympt mes Causes et
58. installation du r seau de capillaires l ex cution d un calibrage spatial et le chargement de polym re dans la seringue de r serve 1 Lancez le logiciel de collecte des donn es sur l ABI PRISM 3100 2 Changez la dur e d ex cution du module GeneScan36_POP4DefaultModule 1200 secondes 3 Changez le voltage d injection 3 kV 4 Changez la dur e de l injection 11 secondes Remarque la sensibilit peut varier selon les appareils La dur e et le voltage d in jection peuvent tre ajust s dans le g rant du module La plage sugg r e de dur e d injection est de 3 22 secondes et celle du voltage d injection est de 1 3 kV 5 Enregistrez le module sous un nouveau nom par ex GeneScan36_POP4PowerPlexS5_3kV_11secs_1200 Utilisez celui ci comme module initial pour toutes les ex cutions 6 Ouvrez un nouveau registre de plaque Attribuez un nom la plaque puis s lec tionnez GeneScan S lectionnez la taille de la plaque 96 puits S lectionnez Finish terminer 7 Remplissez le tableur du registre de plaque des puits que vous avez charg s Saisissez les informations appropri es dans les colonnes du nom des chantillons et des infos sur les marqueurs Pour les chantillons d chelle all lique ajoutez le mot ladder chelle dans la colonne d info des marqueurs bleu et vert Cette information doit tre saisie pour l analyse correcte des donn es avec le macro PowerTyper
59. ire R serv la recherche N est pas destin une utilisation dans le cadre de proc dures de diagnostic Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 42 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 Cones de pipettes r sistants aux a rosols ART Aerosol Resistant Tips Conditionnement Produit Volume c nes paquet R f ART 10 Ultramicro Pipet Tip 0 5 10 ul 960 DY1051 ART 20E Ultramicro Pipet Tip 0 5 10 ul 960 DY1061 ART 20P Pipet Tip 20 ul 960 DY1071 ART GEL Gel Loading Pipet Tip 100 ul 960 DY1081 ART 100 Pipet Tip 100 ul 960 DY1101 ART 100E Pipet Tip 100 ul 960 DY1111 ART 200 Pipet Tip 200 ul 960 DY1121 ART 1000E Pipet Tip 1000 pl 800 DY1131 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux tats Unis R vis 8 12 R f TMD021 Page 43 Les locus STR font l objet du brevet am ricain n RE 37 984 du brevet allemand n DE 38 34 636 C2 et d autres brevets attribu s au Max Planck Gesellschaft zur Forderung der Wissenschaften e V Allemagne Le d veloppement et l utilisation des locus STR sont prot g s par le brevet am ricain n 5 364 759 le brevet australien
60. is 8 12 R f TMD021 Page 41 9 F Produits associ s Syst mes STR multiplex fluorescents Produit Conditionnement R f PowerPlex 16 System 100 r actions DC6531 400 r actions DC6530 PowerPlex 16 BIO System 100 r actions DC6541 400 r actions DC6540 PowerPlex Y23 System 90 r actions DC2305 200 r actions DC2320 PowerPlex ES System 100 r actions DC6731 400 r actions DC6730 Non pr vu pour le diagnostic m dical Composants associ s Produit Conditionnement R f PowerPlex Matrix Standards 310 50 ul chaque marqueur DG4640 PowerPlex Matrix Standards 3100 3130 25 ul chaque marqueur DG4650 2800M Control DNA 25 ul DD7101 500 ul DD7251 9947A DNA 250 ng DD1001 Internal Lane Standard 600 150 ul DG1071 Eau de qualit amplification 6 250 ul 5 x 1 250 ul DW0991 Non pr vu pour le diagnostic m dical Pour usage en laboratoire Syst mes de pr paration des chantillons Produit Conditionnement R f DNA IQ System 100 r actions DC6701 400 r actions DC6700 Differex System 50 chantillons DC6801 200 chantillons DC6800 Maxwell 16 Instrument 1 appareil AS2000 DNA IQ Reference Sample Kit for Maxwell 16 48 pr parations AS1040 DNA IQ Casework Sample Kit for Maxwell 16 48 pr parations AS1210 Plexor HY System 200 d terminations DC1001 800 d terminations DC1000 Slicprep 96 Device paquet de 10 V1391 Non pr vu pour le diagnostic m dical Pour usage en laborato
61. le bulletin de l utilisateur 10 S lectionnez l onglet Peak Detector d tecteur de pics Nous recommandons l utilisation des param tres indiqu s la Figure 3 Remarque pour la plage d analyse s lectionnez full range plage enti re ou partial range plage partielle Si vous utilisez une plage partielle choisissez une plage d analyse appropri e en fonction des donn es Choisissez un point de d part apr s le pic des amorces et juste avant le premier pic d fini du standard interne pour faciliter la d termination de la taille du standard interne 11 S lectionnez l onglet Peak Quality qualit des pics Vous pouvez modifier les param tres de qualit des pics Remarque pour les tapes 11 et 12 reportez vous au manuel de l utilisateur du GeneMapper ID pour plus d informations 12 S lectionnez l onglet Quality Flags Signalement de la qualit Vous pouvez galement modifier ces param tres 13 S lectionnez OK pour enregistrer vos param tres Analysis Method Editor HID General Allele Peak Detector Peak Quality Quality Flags Peak Detection Algorithm Ranges Peak Detection Analysis izi Feak Amplitude Thresholds Full Range W Partial Siz B 400 Riu Start Pt 2300 Start Size 60 ln no 100 Stop Pty 10000 Stop Size 350 2 100 Smoothing and Baselining Min Peak Half Width 2 pt Smoothing O Hone Light Polynomial Degree la O He awy
62. lele frequencies for fourteen STR loci of the PowerPlex 1 1 and 2 1 Multiplex Systems and Penta D locus in Caucasians African Americans Hispanics and other populations of the United States of America and Brazil J Forensic Sci 46 736 61 Lins A M et al 1998 Development and population study of an eight locus short tandem repeat STR multiplex system J Forensic Sci 43 1168 80 Puers C et al 1993 Identification of repeat sequence heterogeneity at the polymorphic STR locus HUMTH01 AATG n and reassignment of alleles in population analysis using a locus specific allelic ladder Am J Human Genet 53 953 8 Hammond H et al 1994 Evaluation of 13 short tandem repeat loci for use in personal identification applications Am J Hum Genet 55 175 89 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 36 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 20 Bever R A and Creacy S 1995 Validation and utilization of commercially available STR a multiplexes for parentage analysis In Proceedings from the Fifth International Symposium on Human A Identification 1994 Promega Corporation 61 8 Promega 21 Sprecher C J et al 1996 A general approach to analysis of polymorphic short tandem repeat loci BioTechniques 20 266 76 22 Lins A M et al 1996 Multipl
63. les portes ferm es s lectionnez Run ex cuter pour d marrer le syst me d lectrophor se capillaire EC Surveillez le progr s de l lectrophor se en observant les fen tres des donn es brutes et de l tat Pour chaque chantillon cela prendra environ 35 minutes pour la mise en marche de la pompe de la seringue l injection de l chantillon et l lectrophor se Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 16 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 6 Analyse des donn es C 6 A PowerPlex Panel et Bin Sets avec GeneMapper ID Version 3 2 Pour faciliter l analyse des donn es g n r es par le syst me PowerPlex S5 nous avons cr des fichiers de panels et bins permettant l attribution automatique des g notypes l aide du logiciel GeneMapper ID version 3 2 Nous recommandons aux utilisateurs du logiciel GeneMapper ID version 3 2 de suivre le tutoriel des analyses d identification humaine du logiciel GeneMapper ID d Applied Biosystems pour apprendre l utilisation correcte du logiciel Nous recommandons aux utilisateurs du logiciel GeneMapper ID version 3 1 de se mettre au niveau la version 3 2 D marrage 1 Obtenez les fichiers de panels et bins appropri s utiliser avec le logiciel GeneMapper ID au sit
64. lid mode Classic classique vs Basic or Advanced de base ou le panel le standard de taille ou la avanc S assurer que les deux fichiers sont r gl s au m me mode m thode d analyse est non valide soit classique soit de base ou avanc Aucuns all les attribu s mais pas de Un panel n a pas t s lectionn pour l chantillon Dans la colonne du message d erreur panel s lectionner le panel set appropri pour le syst me STR utilis Aucun standard de taille n a t s lectionn S lectionner le standard de taille appropri dans la colonne des standards de taille Le standard de taille n a pas t d fini correctement ou des pics taient absents Red finir le standard de taille pour n inclure que les pics pr sents dans l chantillon Une interruption pr coce de l analyse ou des courtes dur es d lectrophor se provoquent l absence des pics les plus grands de l chelle Ceci entraine le signalement en rouge de la qualit de l chelle et aucune taille d all le n est attribu e Message d erreur Both the Bin Set used Le bin set attribu la m thode d analyse peut avoir t supprim in the Analysis Method and the Panel Dans le g rant du GeneMapper s lectionner l onglet Analysis must belong to the same Chemistry Kit Methods et ouvrir la m thode d analyse appropri e Choisir l onglet le bin set utilis dans la m thode All les puis s lectionner le cor
65. mations suppl mentaires relatives la licence peuvent tre obtenues en contactant le Service du d veloppement des affaires Business Development Department Stratagene California 11011 North Torrey Pines Road La Jolla CA 9203 tats Unis 2008 Promega Corporation Tous droits r serv s Maxwell Plexor and PowerPlex sont des marques d pos es de Promega Corporation Differex DNA IQ PowerTyper et Slicprep sont des marques de commerce de Promega Corporation ABI PRISM GeneMapper GeneScan Genotyper et MicroAmp sont des marques d pos es d Applera Corporation ART est une marque d pos e de Molecular Bio Products Inc Biomek est une marque d pos e de Beckman Coulter Inc FTA est une marque d pos e de Flinders Technologies Pty Ltd sous licence de Whatman Freedom EVO est une marque d pos e de Tecan AG Corporation GenBank est une marque d pos e de I U S Dept of Health and Human Services D partement de la Sant et des Services sociaux des Etats Unis GeneAmp est une marque d pos e de Roche Molecular Systems Inc Hi Di et POP 4 sont des marques de commerce d Applera Corporation Macintosh est une marque d pos e d Apple Computer Inc Microsoft Windows et Windows NT sont des marques d pos es de Microsoft Corporation Les produits peuvent tre prot g s par des brevets en instance ou d pos s ou peuvent pr senter certaines restrictions Veuillez visiter notre site Internet pour de plus amples informa
66. mposants de post amplification tiquette beige 25 ul PowerPlex S5 Allelic Ladder Mix m lange d chelle all lique 150 pl Internal Lane Standard ILS 600 standard interne 1 Protocole Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux Etats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 3 Composants du produit et conditions de stockage suite Produit Conditionnement R f PowerPlex S5 System 400 r actions DC6950 Non pr vu pour le diagnostic m dical Le produit DC6951 contient assez de r actifs pour 400 r actions de 25 ul chacune Comprend Bo te des composants de pr amplification tiquette bleue 4 x 500 pl PowerPlex S5 5X Master Mix 4 x 250 ul PowerPlex S5 10X Primer Pair Mix m lange de paires d amorces 25 ul 2800M Control DNA 10 ng ul 10 x 1250 ul Eau de qualit amplification Boite des composants de post amplification tiquette beige 4x 25 ul PowerPlex S5 Allelic Ladder Mix m lange d chelle all lique 4 x 150 ul Internal Lane Standard ILS 600 standard interne 1 Protocole Le m lange d chelle all lique PowerPlex S5 Allelic Ladder Mix est exp di dans un sac scell individuel Apr s ouverture ce composant doit tre plac dans la bo te de post amplification L eau de qualit amplification est exp di e dans un sac scell indi
67. ms r f 4311320 Standards de matrice PowerPlex 310 r f DG4640 glace pil e ou bain d eau glac e Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 14 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 O La qualit du formamide est d importance critique Utilisez du formamide Hi Di ayant C une conductivit de moins de 100 uS cm Congelez le formamide en aliquotes 20 C A Des cycles multiples de cong lation d cong lation ou le stockage a long terme a 4 C peuvent provoquer une d gradation du formamide Si la conductivit du formamide est Promega de plus de 100 uS cm il peut contenir des ions qui entrent en comp tition avec l ADN pendant l injection ce qui provoque des pics d amplitude plus basse et une sensibilit r duite Une dur e d injection prolong e peut ne pas augmenter le signal Attention le formamide est un irritant et un t ratog ne vitez l inhalation et le contact D avec la peau Lisez l tiquette d avertissement et prenez les pr cautions appropri es lors de la manipulation de cette substance Portez toujours des gants et des lunettes protec trices pour le travail avec le formamide Pr paration des chantillons 1 Pr parez un cocktail de charge en combinant le standard interne Internal Lane Standard 600 et le formamide Hi D
68. nalysez les fichiers des chantillons Reportez vous a la Section 6 E pour plus d informations sur l utilisation du Macro PowerTyper S5 et du logiciel Genotyper Pour des renseignements compl mentaires sur le logiciel d analyse GeneScan reportez vous au guide de l utilisateur du logiciel GeneScan 6 D Analyse des chantillons l aide du logiciel GeneScan et des syst mes d exploitation Macintosh 1 Analysez les donn es l aide du logiciel d analyse GeneScan 2 Examinez les donn es brutes d une ou de plusieurs s rie s d chantillons Mettez en surbrillance le nom du fichier de l chantillon puis s lectionnez raw data donn es brutes dans le menu Sample chantillon D placez le curseur de fa on ce que le r ticule soit sur la ligne de base droite du grand pic des amorces avant le premier pic rouge des standards internes Utilisez les coordonn es de l abs cisse valeur X affich es dans le coin inf rieur gauche de la fen tre comme position de d part dans les param tres d analyse 3 Les param tres d analyse recommand s sont les suivants Analysis Range Start d but D fini l tape 2 plage d analyse Stop 10 000 Data Processing Baseline ligne de base Case coch e traitement des donn es Multicomponent multicomposant Case coch e Smooth Options lissage Light l ger Peak Detection Peak Amplitude Thresholds seuils des amplitudes d te
69. nce le nom du fichier de l chantillon puis s lectionnez raw data donn es brutes dans le menu Sample chantillon D placez le curseur de fa on ce que le r ticule soit sur la ligne de base droite du grand pic des amorces avant le premier pic rouge des standards internes Utilisez les coordonn es de l abscisse valeur X affich es dans le coin inf rieur gauche de la fen tre comme position de d part dans les param tres d analyse 3 Les param tres d analyse recommand s sont indiqu s dans la Figure 6 4 Les param tres d analyse peuvent tre enregistr s dans le dossier Params qui se trouve dans la plupart des ordinateurs sous C AppliedBio Shared Analysis Sizecaller Params p Appliquez le fichier des param tres d analyse enregistr s aux chantillons PowerPlex 5 Analysis gsp m Analysis Range m Size Call Range Full Range Full Range This Range Data Points This Range Base Pairs Start Min fo Stop fioooo Max Esd m Data Processing Size Calling Method 2nd Order Least Squares Smooth Options 31d Order Least Squares None r Light Cubic Spline Interpolation C Heavy Local Southern Method Global Southern Method m Peak Detection Baselining Peak Amplitude Thresholds BaseLine Window Size B foo Y foo i Pts G f100 R 00 m Auto Analysis Only gt Size Standard Min Peak Half Width Pts
70. ndre quelques minutes Une fois termin une fen tre de graphiques s ouvrira affichant les chelles all liques par ex D851179 D18551 Am log nine etc En g n ral les chelles all liques contiennent des fragments de taille correspon dant de nombreux all les du locus Les tailles de l chelle all lique et les unit s r p t es sont indiqu es au Tableau 3 Section 9 A L analyse l aide des logiciels GeneScan et Genotyper permet la d termination des all les en comparant les fragments des chantillons amplifi s avec les chelles all liques et les standards internes Lorsqu un standard interne est utilis les tailles calcul es des composants de l chelle all lique peuvent tre diff rentes de celles indiqu es dans le tableau Ceci est d aux diff rences de migration en raison des diff rences de s quences entre les fragments de l chelle all lique et des fragments du standard interne et ne doit pas soulever d inqui tudes 6 Double cliquez sur le macro Allelic Ladders chelles all liques Une fen tre de graphiques s ouvrira affichant les chelles all liques bleues fluoresc ine savoir Am log nine D18551 et D851179 et les chelles all liques bleues JOE savoir TH01 Confirmez que les attributions des all les de l chelle all lique ont t effectu es correctement Figure 8 dans la Section 6 G Remarque le logiciel utilise un seul chantillon d chelle pour d te
71. on WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 11 Promega 5 B D tection des fragments amplifi s l aide de l analyseur g n tique ABI PRISM 3100 avec logiciel de collecte des donn es Version 1 0 1 ou 1 1 Mat riel fournir par l utilisateur e bloc chauffant bain marie ou thermocycleur r gl 95 C e glace pil e ou bain d eau glac e e c nes de pipettes r sistants aux a rosols e centrifuge compatible avec les plaques a 96 puits e r seau de capillaire 3100 36 cm e polym re performance optimis e POP 4 pour le 3100 e tampon d analyse g n tique 10X avec EDTA e plaque optique MicroAmp a 96 puits et septums pour le 3100 e formamide Hi Di Applied Biosystems r f 4311320 e Standards de matrice PowerPlex 3100 3130 r f DG4650 La qualit du formamide est d importance critique Utilisez du formamide Hi Di ayant une conductivit de moins de 100 u5 cm Congelez le formamide en aliquotes 20 C Des cycles multiples de cong lation d cong lation ou le stockage long terme 4 C peuvent provoquer une d gradation du formamide Si la conductivit du formamide est de plus de 100 uS cm il peut contenir des ions qui entrent en comp tition avec l ADN pendant l injection ce qui provoque des pics d amplitude plus basse et un
72. ons peuvent tre import s dans le programme Genotyper et analys s l aide du Macro PowerTyper 55 Le macro PowerTyper peut tre t l charg partir du site Web de Promega l adresse www promega com geneticidtools Le Macro PowerTyper 55 est utilis en association avec le logiciel Macintosh Genotyper version 2 5 et le logiciel Windows NT Genotyper version 3 6 ou ult rieure Le logiciel Genotyper doit tre install dans votre ordinateur avant de pouvoir utiliser le Macro PowerTyper Assurez vous que la colonne sample info info des chantillons sur ordinateurs Macintosh ou la colonne color info info des couleurs sur syst mes d exploitation Windows NT porte bien le mot ladder chelle Le macro utilise le mot ladder pour identifier le ou les fichier s d chantillons contenant l chelle all lique Il est possible d ajouter ou de modifier l info des chantillons apr s leur importation dans le macro PowerTyper Mettez un chantillon en surbrillance puis s lectionnez show dye lanes window afficher la fen tre marqueur pistes dans le menu Views affichages 1 T l chargez le macro PowerTyper S5 partir du site Web de Promega 2 Lancez le logiciel Genotyper puis le macro PowerTyper 55 Pour toute question sur le logiciel Genotyper reportez vous au guide de l utilisateur du logiciel d analyse Genotyper Promega Corporation
73. plied Biosystems 3130 et 3130x Les protocoles pr sent s dans le pr sent manuel ont t test s par Promega Corporation Les appareils d amplification et de d tections peuvent varier Il peut tre n cessaire d optimiser les protocoles y compris le nombre de cycles et la dur e de l injection ou le volume de charge pour chaque appareil de laboratoire Une validation interne doit tre effectu e Le syst me PowerPlex 55 offre tout le mat riel n cessaire l amplification des r gions STR partir d ADN g nomique purifi Ce manuel comporte un protocole pour l utilisation du syst me PowerPlex 55 l aide des thermocycleurs 2720 et GeneAmp PCR system 9600 9700 et 2400 d Applied Biosystems ainsi que des protocoles d crivant la s paration des produits de l amplification et la d tection du mat riel s par Figure 1 Les protocoles d crivant l utilisation des appareils de d tection de la fluorescence doivent tre obtenus aupr s des fabricants de ceux ci Des informations sur d autres syst mes STR fluorescents de Promega et sur la d tection par coloration l argent de fragments de STR amplifi s sont disponible sur demande aupr s de Promega ou en ligne www promega com Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 2 Imprim aux
74. plifi s l aide du ABI PRISM 310 A a errr eerste errr te remy 14 0 Analyse SO terre ete er eet errr v A PowerPlex Panel et Bin Sets avec GeneMapper ID Version 32 T B Cr ation d une m thode d analyse l aide du logiciel GeneMapper ID 18 C Analyse des chantillons l aide du logiciel GeneScan et desoysto mes d XPIGIA tion PE srcane soa Faas raoa E EERE SEE EEA a 22 D Analyse des chantillons l aide du logiciel GeneScan el des syst mes d exploitation Macintoshi suissa ion 0 ne 23 E Analyse des chantillons l aide du logiciel Genotyper SOC sO POSER RS ae en E ete rey errr ra ee renee 24 COS a E pgs cncabw beads aceasta T N ncaa 26 Ri RN eh ee peeping acon 27 Di AA ee terete ced areata cect dee 29 A ap lihican Onret detect OM es ADMIN et ur 29 De Logiciel analyse serie a et D eccone ine i e een 31 Ce MOa OWT PR de ns 34 D PRE IC A N A E eh E 36 Dy ANERE reran r A nr en unie 38 A Avantages de l utilisation des locus inclus dans le syst me PowerPlex 55 38 B M thodes d extraction et de quantification de VADN ann 40 C Internal Lane Standard 600 standard interne ennemies 40 D Pr paration du m lange d amplification PCR pour le syst me PowerPlex 55 41 E Composition des tampons Cl SOLOS 8 a nicreaet cart auc a 41 p Podine aaO I S o na A a con 42 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phon
75. r HID General Allele Peak Detector Peak Quality Quality Flags Bin Set PouerPlex_ Bins_ID3 2 x w Use makerspecific stutter ratio if available 4 Maker Repeat Type Cut off Value MWinusA Ratio Winus Distance Minus Stutter Ratio Minus Stutter Distance From Ta Plus Stutter Ratio Plus Stutter Distance Amelogenin Cutott Range Filter Factory Defaults Cancel 7482TA Figure 2 L onglet All le S lectionnez le bin set PowerPlex_S5_Bins_ID3 2x Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 18 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 9 Saisissez les valeurs indiqu es la Figure 2 pour filtrer correctement les pics de b gayement lorsque les syst mes PowerPlex sont utilis s Pour une explication de l utilisation correcte de ces param tres et de leurs effets reportez vous au bulletin de l utilisateur d Applied Biosystems intitul Installation Procedures and New Features for GeneMapper ID Software 3 2 Proc dures d installation et nouvelles fonctionnalit s du logiciel GeneMapper ID 3 2 ainsi qu au guide de l utilisateur du logiciel d analyse d identification humaine GeneMapper ID Version 3 1 Remarque certains de ces param tres ont t optimis s et sont diff rents des param tres recommand s dans
76. rant des panels s lectionnez Apply appliquer puis OK La fen tre du g rant des panels se fermera automatiquement Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 17 Promega 6 B Cr ation d une m thode d analyse l aide du logiciel GeneMapper ID Ces instructions suivent peu pr s celles du tutoriel du logiciel Applied Biosystems GeneMapper ID pages 1 11 1 S lectionnez Tools outils puis GeneMapper Manager g rant de GeneMapper 2 S lectionnez l onglet de la m thode d analyse 3 S lectionnez New nouveau une nouvelle bo te de dialogue de m thode d analyse s affichera 4 S lectionnez HID puis OK Remarque si l option HID n est pas affich e vous n avez pas le logiciel GeneMapper ID Contactez Applied Biosystems 5 Saisissez un nom descriptif pour la m thode d analyse par ex PowerPlexS5 advanced 6 S lectionnez l onglet All le Figure 2 7 S lectionnez le bin set correspondant au Syst me PowerPlex PowerPlex_S5_Bin_ID3 2x 8 Assurez vous que la case Use marker specific stutter ratio if available Utiliser le taux de b gayement sp cifique au marqueur si disponible est coch e Analysis Method Edito
77. rect bin set d analyse et le panel doivent appartenir au m me kit de chimie Ligne de base sensiblement lev e e Mauvais calibrage spectral des analyseurs g n tiques ABI PRISM 3100 et 3100 Avant ou Applied Biosystems 3130 et 3130x1 Effectuer un nouveau calibrage spectral puis r injecter les chantillons e Matrice de mauvaise qualit pour l analyseur g n tique ABI PRISM 310 Recommencer et optimiser la matrice Utilisation de la m thode d analyse classique L utilisation du mode d analyse classique pour les chantillons peut provoquer des lignes de bases comportant plus de bruit que lors de l analyse l aide du mode de base ou avanc Il est recommand d utiliser les m thodes du mode avanc pour l analyse et les standards de taille Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 33 7 B Logiciel d analyse GeneMapper ID suite Sympt mes Une barre rouge s affiche au cours de l analyse des chantillons et le message d erreur suivant appara t lorsque les donn es sont affich es Some selected sample s do not contain analysis data Those sample s will not be shown un ou plusieurs des chantillons s lectionn s ne contiennent aucune donn e d analyse Ces chantillons ne seront pa
78. res r gler les pr f rences dans le menu Edit pour importer les couleurs bleu vert et rouge Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 34 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12 Sympt mes Causes et commentaires C Message d erreur Could not complete La hauteur du pic d un ou de plusieurs all les du fichier de l chelle amp the Run Macro command because the _all lique tait en dessous de 150 RFU Les cat gories des chelle labeled peak could not be found la all liques sont d finies comme ayant un pic de 150 RFU de hauteur au Promega commande Ex cuter Macro n a pas minimum Si la hauteur des pics de l chelle all lique est en dessous abouti parce qu aucun pic marqu n a t de 150 RFU le logiciel sera incapable d identifier les pics d all les trouv Recommencer l chelle all lique en utilisant une quantit plus lev e d chantillon ou une dur e d injection plus longue pour obtenir des pics au dessus de 150 RFU Des pointes d EC dans l chelle all lique ont t identifi s comme all les par le macro Utiliser une injection diff rente de l chelle all lique Les all les TH01 9 3 et 10 n ont pas t s par s lors de l utilisation du param tre d analyse de lissage fort heavy smoothing du logiciel G
79. rminer la taille des all les Le macro utilise le premier chantillon d chelle import pour l attri bution des all les Si le macro POWER est ex cut une deuxi me fois le logiciel utilisera la deuxi me chelle si le macro POWER est ex cut une troisi me fois le logiciel utilisera la troisi me chelle etc jusqu ce que toutes les chelles du projet soient utilis es Si une chelle all lique n est pas analys e ou si de nombreux all les en dehors de l chelle sont identifi s dans les chantillons ceux ci doivent tre r analys s l aide d une autre chelle du projet 7 Double cliquez sur le macro Display Fluorescein Data afficher les donn es de fluoresc ine pour afficher le marqueur bleu de toutes les injections d chan tillons pistes Faites d filer vers le bas pour visualiser et modifiez au besoin 8 Double cliquez sur le macro Display JOE Data afficher les donn es de JOE pour afficher le marqueur vert de toutes les injections d chantillons pistes Faites d filer vers le bas pour visualiser et modifiez au besoin Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux Etats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 25 Promega 6 E Analyse des chantillons l aide du logiciel Genotyper et du Macro PowerTyper
80. s chantillons comme d crit dans le manuel de l utilisateur de l analyseur g n tique ABI PRISM 3100 ou 3100 Avant avec le logiciel de collecte des donn es Version 2 0 ou de l analyseur g n tique Applied Biosystems 3130 ou 3130xI avec les exceptions ci dessous 1 Dans le Module Manager g rant du module s lectionnez New nouveau S lectionnez Regular normal dans le menu d roulant Type puis s lectionnez HIDFragmentAnalysis36_POP4 dans le menu d roulant Template matrice Confirmez que la dur e d injection est de 5 secondes et que le voltage d injection est de 3 kV Changez la dur e de l ex cution 1200 secondes Donnez un nouveau nom a votre module d ex cution puis s lectionnez OK Remarque la sensibilit peut varier selon les appareils La dur e et le voltage d injection peuvent tre ajust s dans le g rant du module La plage sugg r e de dur e d injection est de 3 15 secondes et celle du voltage d injection est de 1 5 KV 2 Dans le Protocol Manager g rant du protocole s lectionnez New nou veau Tapez un nom pour votre protocole S lectionnez Regular normal dans le menu d roulant Type puis s lectionnez le module d ex cution que vous avez cr plus haut dans le menu d roulant Run Module module d ex cution Enfin s lectionnez F dans le menu d roulant Dye Set jeu de marqueurs S lectionnez OK Prome
81. s affich s Message d erreur apr s avoir tent d importer des fichiers panels et bins Unable to save panel data java SQLEException ORA 00001 unique constraint IFA CKP_NNN violated impossible d enregistrer les donn es de panel java SQLEException ORA 00001 contrainte unique IFA CKP_NNN non respect e Des pics de l chelle all lique sont marqu s hors chelle 7 C Macro PowerTyper S5 Sympt mes Le fichier ne s ouvre pas dans votre ordinateur Message d erreur Could not complete the Run Macro command because no dye lanes are selected la commande Ex cuter Macro n a pas abouti parce qu aucun marqueur piste n est s lectionn Causes et commentaires Si aucun des chantillon n avait de matrice attribu e au moment de l analyse avec l analyseur g n tique ABI PRISM 310 aucune donn e ne sera affich e Appliquer un fichier de matrice au cours de l analyse l aide du logiciel GeneMapper ID et r analyser Un conflit existait entre diff rents sets de fichiers panels et bins Supprimer tous les panels et bins puis les r importer dans un ordre diff rent Le logiciel GeneMapper ID n a pas t utilis ou les param tres de l analyse de microsatellites ont t utilis s la place des param tres d analyse HID Le logiciel GeneMapper n utilise pas les m mes algorithmes que le logiciel GeneMapper ID et ne peut pas corriger les diff rences de tailles de l
82. s for DNA Amplification 1989 Erlich H A ed Stockton Press New York NY PCR Protocols A Guide to Methods and Applications 1990 Innis M A et al eds Academic Press San Diego CA Presley L A et al 1992 The implementation of the polymerase chain reaction PCR HLA DQ alpha typing by the FBI laboratory In The Third International Symposium on Human Identification 1992 Promega Corporation 245 69 Hartmann J M et al 1991 Guidelines for a quality assurance program for DNA analysis Crime Laboratory Digest 18 44 75 Revised Validation Guidelines Scientific Working Group on DNA Analysis Methods SWGDAM 2004 Forensic Science Communications 6 obtenu sur internet le 3 d cembre 2007 l adresse www fbi gov hq lab fsc backissu july2004 standards 2004 03_standards02 htm Moos M and Gallwitz D 1983 Structure of two human f actin related processed genes one of which is located next to a simple repetitive sequence EMBO J 2 757 61 Polymeropoulos M H et al 1992 Tetranucleotide repeat polymorphism at the human B actin related pseudogene H beta Ac psi 2 ACTBP2 Nucleic Acids Res 20 1432 Schneider H R et al 1998 ACTBP2 nomenclature recommendations of GEDNAP Int J Leg Med 111 97 100 Department of Serology of the medical faculty at the Heinrich Heine University of Duesseldorf SE33 population statistics www uni duesseldorf de WWW MedFak Serology SE33b htm Levedakou E et al 2001 Al
83. s toutes les de filtre macro POWER ou POWER 20 donn es Les trois couleurs de marqueurs n ont pas toutes t import es Pour le logiciel Genotyper versions 2 5 et 3 5 ou ult rieures r gler les pr f rences dans le menu Edit pour importer les couleurs bleu vert et rouge Le macro Check ILS affiche une Les trois couleurs de marqueurs n ont pas toutes t import es Pour fen tre de graphique vide le logiciel Genotyper versions 2 5 et 3 5 ou ult rieures r gler les pr f rences dans le menu Edit pour importer les couleurs bleu vert et rouge Pics hors chelle Migration des chantillons l g rement chang e au cours d une s rie d C comportant de nombreux chantillons Ceci peut tre d des changements de temp ratures ou de la colonne d EC au fil du temps Utiliser une injection diff rente de l chelle all lique pour la d termi nation des tailles avec le macro PowerTyper S5 Ne pas utiliser la premi re injection d une nouvelle colonne pour l chantillon d chelle La taille des all les en paires de bases tait incorrecte parce que des tailles erron es ont t attribu es aux fragments du standard interne V rifier si les fragments du standard interne ont t correctement attribu s R analyser l chantillon l aide du logiciel GeneScan et red finir les fragments du standard interne Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num
84. soci aux proc dures de greffe ou d autres proc dures m dicales Des informations suppl mentaires relatives la licence peuvent tre obtenues en contactant USB Corporation 26111 Miles Road Cleveland OH 44128 tats Unis Ce produit est vendu en vertu de contrats de licence avec Stratagene Le prix d achat de ce produit inclut des droits limit s non transf rables en vertu des brevets am ricains no 5 449 603 5 605 824 5 646 019 et 5 773 257 appartenant Stratagene permettant l utilisation de la quantit de ce produit strictement n ces saire la pratique des revendications dudit brevet uniquement pour les activit s des utilisateurs finaux dans les domaines de la recherche sur les sciences de la vie et l analyse pour la m decine l gale du mat riel g n tique li ou obtenu en cons quence d enqu tes criminelles ou sur des lieux de catastrophes et men e soit par ou au nom d une entit gouvernementale soit pour l utilisation dans ou la pr paration de proc dures judiciaires ainsi que la compilation et l indexation des r sultats d une telle analyse et l analyse dans le but de la d termination de la filiation le domaine d application pour la m decine l gale et l identi fication g n tique Le domaine d application pour la m decine l gale et l iden tit g n tique exclut sp cifiquement le typage des tissus associ aux proc dures de greffe ou d autres proc dures m dicales Des infor
85. st me a t utilis pour isoler et quantifier l ADN provenant de types d chantillons de routine y compris des couvillons buccaux des taches sur papier FTAS et du sang liquide En outre de l ADN a t isol a partir d chantillons d tudes de cas comme des tissus des chantillons d agres sion sexuelle apr s extraction diff rentielle et des taches sur mat riaux de support Le syst me DNA IQ a t test en association avec les syst mes PowerPlex pour garantir un processus simplifi Reportez vous la section 9 F pour les informations au sujet des commandes Pour les applications n cessitant la quantification de l ADN sp cifique humain le syst me Plexor HY r f DC1001 DC1000 a t d velopp 37 Reportez vous la section 9 F pour les informations au sujet des commandes Le syst me DNA IQ a t compl tement automatis sur les appareils suivants Beckman Coulter Biomek 2000 Laboratory Automation Workstation 38 Biomek 3000 Laboratory Automation Workstation 39 et Tecan Freedom EVO Liquid Handler 40 De plus le kit d chantillons de r f rence DNA IQ Reference Sample Kit pour Maxwell 16 r f AS1040 et le kit d chantillons d tude de cas DNA IQ Casework Sample Kit pour Maxwell 16 sont galement disponibles 41 42 Pour des rensei gnements sur l auto matisation des proc d s de laboratoire sur postes de travail automatis s adressez vous une succursale ou un
86. tions Tous les prix et toutes les caract ristiques sont sujets modification sans avis pr alable Les d clarations relatives aux produits sont sujettes modification Veuillez contacter le service technique de Promega ou consulter le catalogue en ligne de Promega pour obtenir les informations les plus r centes sur les produits Promega Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com R f TMD021 Page 44 Imprim aux Etats Unis R vis 8 12
87. u m lange d amplification PCR est fournie au Tableau 5 D terminez le nombre de r actions effectuer Ceci doit comprendre les r actions de contr les positifs et n gatifs Ajoutez une ou deux r actions ce nombre pour tenir compte des erreurs de pipetage Multipliez le volume ul par r action par le nombre total de r actions pour obtenir le volume final du m lange d amplification PCR ul Tableau 5 M lange d amplification PCR pour les r actions du syst me PowerPlex 55 Composant du m lange Volume pars Nombre de z Volume d amplification PCR r action r actions final ul Eau de qualit amplification ul x PowerPlex 55 5X Master Mix 5 0 ul x PowerPlex S5 10X Primer Pair Mix 2 5 ul x Par tube volume d ADN matrice 0 25 0 50 ng jusqu 17 5 ul x volume total de r action 25 x Le volume total du m lange d amplification PCR et de l ADN matrice doit tre 25 pl 9 E Composition des tampons et solutions Tampon TE 10 mM Tris HCl 0 1 mM EDTA pH 8 0 2 21 Tris base 0 037 EDTA Na EDTA 2H 0 Dissoudre le Tris base et l EDTA dans 900 ml d eau d ionis e Ajuster le pH 8 0 avec de l HCT Ajuster le volume final 1 litre avec de l eau d ionis e Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R v
88. ui diff rent l un de l autre par des tailles ne correspondant pas la longueur des r p titions complique l interpr tation et l attribu tion des all les Il semble y avoir une corr lation entre un haut degr de polymorphisme une tendance aux microvariants et un taux accru de mutations 34 35 FGA et D18551 comportent de nombreux microvariants relativement courants Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 Etats Unis Num ro vert aux tats Unis 800 356 9526 T l phone 1 608 274 4330 Fax 1 608 277 2516 www promega com Imprim aux Etats Unis R f TMD021 R vis 8 12 Page 39 Promega 9 B 9 C 1 200 1 000 800 M thodes d extraction et de quantification de l ADN Le syst me DNA IQ r f DC6700 est un syst me d isolement et de quantification de l ADN sp cifiquement con u pour les chantillons de m decine l gale et de tests de pater nit 36 Ce syst me innovant utilise des particules paramagn tiques pour pr parer de fa on pratique et efficace des chantillons purs pour les analyses STR et peut tre utilis pour extraire l ADN d chantillons de taches ou de liquides tels que le sang et les solu tions La r sine DNA IQ limine les inhibiteurs de la PCR et les contaminants souvent pr sents dans les chantillons d tudes de cas Dans le cas des chantillons plus abondants le syst me DNA IQ produit une quantit constante d ADN total Le sy
89. viduel Apr s ouverture ce composant doit tre plac dans la bo te de pr amplification Conditions de stockage Stocker tous les composants sauf le contr le d ADN 2800M entre 30 C et 10 C dans un cong lateur anti givre Conservez le contr le d ADN 2800M entre 2 et 10 C Le m lange de paires d amorces PowerPlex S5 10X le m lange d chelle all lique PowerPlex S5 et le standard interne 600 sont sensibles la lumi re et doivent tre stock s l abri de celle ci Nous vous recommandons express ment de stocker s par ment les r actifs de pr amplification et de post amplification et de les utiliser part avec des pipettes portoirs de tubes etc diff rents Le Macro PowerTyper 55 utiliser avec le logiciel Genotyper peut tre t l charg au site www promega com geneticidtools Les fichiers de panels et bins appropri s utiliser avec le logiciel GeneMapper ID peuvent tre obtenus au site Web de Promega l adresse www promega com geneticidtools panels_bins Des standards de matrice sont n cessaires pour la configuration initiale de la matrice de s par ation des couleurs Les standards de matrice sont vendus s par ment et sont disponibles pour les analyseurs suivants ABI PRISM 310 Genetic Analyzer PowerPlex Matrix Standards 310 R f DG4640 et ABI PRISM 3100 et 3100 Avant et Applied Biosystems 3130 et 3130x Genetic Analyzers PowerPlex Matrix Standards 3100 3130 R f D
90. yst me STR utilis Attribuer le fichier panel correspondant au syst me utilis pour l amplification L chelle all lique n a pas t identifi e comme telle dans la colonne du type d chantillon Un type d analyse incorrect a t choisi comme m thode d analyse S assurer d utiliser le type d analyse HID Le standard interne n a pas t identifi correctement dans l chantillon Red finir manuellement les tailles des fragments du standard de taille de l chantillon Standard de taille pas identifi Le point de d part de la plage partielle choisie la Section 6 B tait correctement Figure 10 incorrect Ajuster le point de d part des donn es dans la m thode d analyse Une plage complete peut galement tre utilis e pour l analyse foeon oade Aad Pousmectentt LEa 310A Tic ct 30 a 03 Run Fodera meg l S OR TN zj m Conditionnement Eck Yew Tool seo TT Faas eu g Size Matohes Size Calling Cura a Qualit Sizing Quality 0 0 Ovenide S0 ABO a El m x E A I ja m A E me L E a jm A E e no epin Pee a Power ENIA MSN TRE LETRAR Fir ii E 3 Figure 10 Un exemple de mauvaise attribution des fragments du standard par le logiciel GeneMapper ID Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison WI 53711 5399 tats Unis Num ro

PowerPlex(R) S5 System Technical Manual (Francais)

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