Référence Qualité - Plateforme Métabolisme Métabolome
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1. Plateforme M tabolisme M tabolome de l IFR87 B timent 630 IBP Universit Paris Sud XI 91405 Orsay cedex France Une m thode DP Data Processing de calcul des indices de r tention appelant la table pr c dente Retention Index Method est cr e et appliqu e Zi LECO ChromaTOF optimized for Pegasus 4D Database Files DPMethod View Window Instrument Help 4 ulas eel 51 slm a E Database ECOCOCECCOCOCCOCOCCOUOE at Processing Method RI Ai Data Processing DP Methods F5 On EtalonnageAvril2008 Select the task or tasks you wish to perform from the list below Baseline computes baseline Peak Find finds peaks above the baseline Library Search identifies all peaks found Calculate Area Height computes the area height of peaks without a calibration Retention Index Method Classifications Quantify computes the area height and concentration of peaks with a calibration Compare compares a sample to a reference Semi Quantification computes concentration based on another analvtes calibration curve zi For Help press F1 15 02 2010 11 03 59 Peak Galactonolactone contains 2 of the analytes in calibration MRSSHalter0110 WorkStation IV 6 ETAPE 3 Application du Module de R f rence Standard Le fichier MRSversionx xis sert recalculer les Temps de R tention des m tabolites avant d appliquer le module de r f rence Un mode d emploi est indiqu dans la feuille Recalcul TR MRS2. Plateforme M tabolisme M tabolome www ibp u psud fr pmm Plateforme M tabolisme M tabolome IFR87 B timent 630 IBP Universit Paris Sud XI 91405 Orsay cedex France R f rence Qualit PROCEDURE _ PMM PCRE4_PO3006 201005 M thode de traitement des donn es GC TOF MS SOMMAIRE DIFFUSION I OBJECT ET DOMAINE D APPLICATION Comit ex cutif Il REFERENCES I TERMES ABREVIATIONS ET DEFINITIONS Direction IV SECTIONS DE PROTOCOLE IV 1 CONTACT Responsable qualit IV 2 PRINCIPE DE LA METHODE IV 3 MATERIELS NECESSAIRES Ing nieurs IV 4 ETAPE 1 Traitement de base IV 5 ETAPE 2 Calcul des indices de r tention Techniciens IV 6 ETAPE 3 Application du Module de R f rence Standard Th sards IV 7 ETAPE 4 V rification des identifications et des quantifications IV 8 ETAPE 5 Calcul des ratios et des moyennes V CHANGEMENT DU PROTOCOLE VI ANNEXES R dacteur Date Lecteurs Approbateurs Visa M TCHERKEZ M TCHERKEZ MME MICARD 12099 Mie MAUVE Melle MAUVE Indice Version Nature de l volution Responsable de Date l volution 1 Plateforme M tabolisme M tabolome de l IFR87 B timent 630 IBP Universit Paris Sud XI 91405 Orsay cedex France I OBJECT ET DOMAINE D APPLICATION Traitement des donn es GC TOF MS Il REFERENCES Cette m thode de traitement de donn es fait suite e au protocole d injection des chantillons en GC TO
3. Pour modifier la langue par d faut des programmes Office il suffit de se r f rer au lien suivant Utilisation d une autre langue http office microsoft com fr fr excel CH100648301036 aspx Dans excel il est vivement recommand d utiliser galement par d faut le point comme s parateur d cimal Dans le cas contraire les nombres non entiers copi s depuis ChromaTOF ne seront pas reconnus en tant que tels Le choix de ce s parateur d cimal peut tre appliqu en modifiant dans le panneau de configuration les Options r gionales et linguistiques Options r gionales Personnaliser Contenu du r pertoire MRSx x 5 x est la version la plus r cente du Module de R f rence Standard Localisation Clementine 129 175 60 22 Nom du r pertoire Partage Caro MRSx login metabolome password plateforme Le r pertoire BDDIR_IBP_ avr09 se place sous le dossier NISTMS Le r pertoire MRSS5 doit tre restaur dans ChromaTOF A la restauration choisir References ModUnivTRrecalc MRSx Le fichier MRSversionx xls sert recalculer les Temps de R tention des m tabolites avant d appliquer le module de r f rence Un mode d emploi est indiqu dans la feuille Recalcul TR MRS Les formules de calcul sont compatibles avec toutes les versions d excel Les fichiers verifinteg30Echx xis et verifinteg100Echx xis servent aux v rifications d int gration et aux calculs de ratio et de moyennes IV 4 ETAPE 1 Tr
4. Une m thode DP Data Processing appliquant le module de r f rence standard MRSx est utilis e Elle permet de rechercher dans chaque chromatogramme l ensemble des m tabolites pr sents dans notre base de donn es et pour lesquels l identification a t v rifi e Param tres de la m thode DP utilisant le module de r f rence Comparaison Seuil de masse 50 Module de r f rence utilis MRSx Zi LECO ChromaTOF optimized for Pegasus 4D Database Files DP Method View Window Instrument Help Database Aj Data Processing DP Methods n EtalonnageAvril2008 Select the task or tasks you wish to perform from the list below Baseline computes baseline Peak Find finds peaks above the baseline Library Search identifies all peaks found Calculate rea Height computes the area height of peaks without a calibration Retention Index Method Classifications Quantify computes the area height and concentration of peaks with a calibration Compare compares a sample to a reference Semi Quantification comoutes concentration based on another analvtes calibration curve For Help press F1 15 02 2010 11 03 59 Peak Galactonolactone contains 2 of the analytes in calibration MRSSHalter01 10 WorkStation IV 7 ETAPE 4 V rification des identifications et des quantifications Les fichiers verifinteg30echx xis et verifinteg100echx xis sont utilis s pour traiter une s rie pouvant aller respectivement jusqu
5. 30 ou 100 chantillons Les premiers onglets du fichier sont pr vus pour contenir la liste de compos s trouv s par MRSx Peak Table dans chaque chromatogramme Le premier onglet B se rapporte au blanc r alis lors du protocole d extraction Les onglets suivants 1 2 se rapportent aux chantillons successifs Il est donc pr f rable de nommer les chantillons d un projet donn en les num rotant partir de 1 PCRE4_PO3005 M thode de traitement des donn es GC TOF MS version 1 Page 5 7 Plateforme M tabolisme M tabolome de l IFR87 B timent 630 IBP Universit Paris Sud XI 91405 Orsay cedex France Le fichier verifinteg xls contient galement un onglet Poids qui doit tre compl t pour permettre de renormaliser par rapport au poids de chaque chantillon Cet onglet donne aussi un mode d emploi du fichier Verifinteg xis gt Dans Chromatof d cocher l affichage des contaminants et v rifier que l ordre des colonnes correspond au m me ordre que celui du fichier verifinteg xls gt Pour chaque chromatogramme traiter o copier la Peak table par la commande Copy Selection o coller dans un onglet de veriflnteg xis o classer par ordre croissant de la colonne Quantification L onglet BilanAires donne pour chaque m tabolite laire mesur e dans chaque chromatogramme L onglet BilanCorrections redonne pour chaque m tabolite l aire mesur e dans chaque chromatogramme Toutes
6. les corrections sont effectu es dans cet onglet A chaque fois qu une aire est corrig e la case correspondante appara t en jaune Par d faut les aires nulles sont mises en vidence par une case orang e La colonne Commentaire peut tre compl t e pour sp cifier diff rentes remarques Par exemple gt trop pr sent dans blanc lorsque les aires sont mises 0 pour les chantillons parce qu elles sont du m me ordre de grandeur que celle trouv e dans le blanc gt identification incertaine lorsque les aires sont mises O pour les chantillons parce que l identification du m tabolite est incertaine gt QM 86 pr f rable lorsque l on veut sugg rer une modification du MRSx gt QM 86 lorsque l on a modifi l ion servant la quantification gt Afin d am liorer le Module de R f rence Standard 3 nouveaux onglets ont t ajout s BilanMatch permet de savoir combien de fois chaque m tabolite a t trouv par le MRSx et calcule le match moyen lorsqu un m tabolite est trouv BilanRI calcule l indice de r tention moyen trouv Pour chaque m tabolite trouv par le MRSx BilanUM d termine le nombre d chantillons pour lesquels la masse unique UM correspond la masse utilis e pour la quantification QM S il existe une UM diff rente de QM et plus fr quente elle est calcul e IV 8 ETAPE 5 Calcul des ratios et des moyennes Le fichier verifinteg xis permet d automatiser les tapes suiv
7. F MS PCRE_PO3005 e la proc dure de r cup ration des donn es PCR _PO7055 lll TERMES ABREVIATIONS ET DEFINITIONS GC Gas chromatography Chromatographie gazeuse MS Mass Spectrometry Spectrom trie de masse TOF Time Of Flight temps de vol GC TOF MS Spectrom trie de masse avec analyseur temps de vol Chromatographie gazeuse QM Masse utilis e pour la quantification des compos s Quant Mass MRS Module de R f rence Standard coupl Il constitue une biblioth que priv e de m tabolites dont l identification a t v rifi e et valid e par la plateforme et qui sont caract ris s par un spectre de masse un indice de r tention une QM Son application permet de rechercher et quantifier dans un chantillon donn tous les m tabolites r f renc s par ce module IV SECTIONS DE PROTOCOLE IV 1 CONTACT Pilote proc d Fran oise Gilard poste 5 33 95 mail francoise gilard u psud fr IV 2 PRINCIPE DE LA METHODE Cette m thode s applique aux donn es brutes obtenues avec le GC TOF MS pour une s rie d chantillons dun m me projet et pour le blanc r alis lors du protocole d extraction Elle a pour but l identification et la quantification de tous les m tabolites pr sents dans les chantillons sans priori sur la nature des compos s rechercher Elle est bas e sur l utilisation gr ce au logiciel ChromaTOF d un module de r f rence standard qui constitue une base
8. aitement de base Le traitement de base des chromatogrammes inclut e la recherche de pics apex e l identification par recherche dans les librairies de spectres e le calcul d aire et de hauteur sous le pic pour quantifier chaque compos Pour appliquer ce traitement il est n cessaire de cr er et d appliquer une m thode DP Data Processing avec les param tres suivants la correction de la ligne de base et le lissage du chromatogramme PCRE4_P03005 M thode de traitement des donn es GC TOF MS version 1 Page 3 7 Plateforme M tabolisme M tabolome de l IFR87 B timent 630 IBP Universit Paris Sud XI 91405 Orsay cedex France Zi LECO ChromaTOFS optimized for Pegasus 4D Database Files DPMethod View Window Instrument Help Database Ai EMEN E e e e e e e e e E E Data Processing Method Basic S5 PW3 SAN5 Total Lib 0 i S ti Data Processing DP Methods Select the task or tasks you wish to perform from the list below M Baseline computes baseline Name v Peak Find finds peaks above the baseline Al Basic 55 PW3 S NS Total Lib Areas M Library Search identifies all peaks found Ai BasicModeleFra V Calculate Area Height computes the area height of peaks without a calibration AlibSearchFraa f Retention Index Method x F Classifications A BasicModeleFraMod lt For Help press F1 15 02 2010 11 03 59 Peak Galactonolactone contains 2 of th
9. antes du traitement des donn es Une fois les corrections effectu es dans BilanCorrections l onglet BilanRatioRibitol calcule les ratio au ribitol V rifier toujours que la formule utilis e est correcte v rifier les num ros de ligne des cellules Pour chaque m tabolite l onglet BilanMoinsB calcule la diff rence entre le ratio au ribitol mesur dans l chantillon et dans le blanc Si le r sultat est n gatif il est remplac par une valeur seuil tr s faible Cette valeur correspond une aire de 500 divis e par laire maximale du ribitol dans les chantillons L onglet BilanPoids rapporte les r sultats obtenus dans BilanMoinsB au poids initial de chaque chantillon qui doit tre pr cis dans l onglet Poids La colonne Max calcule le ratio maximal obtenu pour chaque compos S il est nul le compos est absent Le tri des m tabolites est effectu dans l onglet BilanSansStds Dans cet onglet la colonne STD notifie les standards qui seront limin s des R sultats alcanes AABA ribitol La colonne A PCRE4_PO3005 M thode de traitement des donn es GC TOF MS version 1 Page 6 7 Plateforme M tabolisme M tabolome de l IFR87 B timent 630 IBP Universit Paris Sud XI 91405 Orsay cedex France supp gt renvoie vrai si le compos est un standard ou s il est absent On filtre les r sultats conserver par filtre automatique faux sur la colonne A s
10. de donn es de m tabolites caract ris s par leur indice de r tention et leur spectre de masse L identification des compos s contenus dans cette base a t v rifi e Cette base de donn es est r guli rement mise jour Les compos s identifi s sont quantifi s en mesurant l abondance d un ion fragment ou mol culaire de masse QM int gration du pic chromatographique sur le courant ionique de l ion choisi Les aires obtenues sont normalis es par rapport l talon interne Adonitol ou ribitol et au poids des chantillons ayant servi l extraction Des calculs de moyennes et carts types sont r alis s dans Excel PCRE4_PO3005 M thode de traitement des donn es GC TOF MS version 1 Page 2 7 Plateforme M tabolisme M tabolome de l IFR87 B timent 630 IBP Universit Paris Sud XI 91405 Orsay cedex France Contenu du mode op ratoire Etape 1 Traitement de base Etape 2 Calcul des indices de r tentions Etape 3 Application du module de r f rence standard Etape 4 V rification des identifications et des quantifications Etape 5 Calcul des ratios et des moyennes IV 3 MATERIELS NECESSAIRES Logiciels ChromaTOF version 2 22 NISTMS version 2008 et Excel La langue d entr e par d faut du PC doit tre le fran ais Dans le cas contraire le tri par ordre alphab tique dans les tableaux excel risque d tre modifi et cela peut entra ner des erreurs dans les formules de calcul
11. e analytes in calibration MRSSHalter0110 WorkStation Quantify computes the area height and concentration of peaks with a calibration 1 D tection des pics Ligne de base 0 25 Lissage du chromatogramme 5 points Largeur attendue des pics 3 sec Nombre maximum de pics inconnus d tecter 1000 Rapport Signal Bruit S N 5 Identification des pics Nombre de propositions 10 Poids mol culaire minimum autoris 0 Poids mol culaire maximum autoris 1000 Seuil de masse 50 Similarit minimale 750 Librairies utilis es NIST mainlib et replib 2008 BDD _IBPdec05 BDD _IBPoct07 BDD _IBPnovO7 GolmAnnotee POL_FA_NIST Calcul des aires Masse unique IV 5 ETAPE 2 Calcul des indices de r tention La valeur moyenne du temps de r tention de chaque alcane est relev e pour la s rie d chantillons tudi es Elle est not e dans une table d indices de r tention de ChromaTOF Retention Index Method avec le format suivant Name Absolute R T s Retention Index Verification Masses 1 C10 1000 0 85 2 C15 1500 0 85 3 C18 1800 0 85 4 C19 1900 0 85 5 C22 2200 0 85 6 C28 2800 0 85 7 C32 3200 0 85 8 C36 3600 0 85 Pour rappel m z 85 est un ion fragment caract ristique de tous les alcanes et son affichage permet de situer facilement les alcanes dans un chromatogramme PCRE4_PO3005 M thode de traitement des donn es GC TOF MS version 1 Page 4 7
12. upp Ces r sultats sont copi s et coll s dans l onglet ResultatsBruts par collage sp cial des valeurs L onglet histoMoy contient un exemple de formule pour calculer les moyennes et les carts types pour des s ries de 3 r pliquats V CHANGEMENT DU PROTOCOLE Ce protocole devra tre compl t par une ETAPE 6 Mise en forme des r sultats bruts qui d crira la cr ation des histogrammes et le contenu du compte rendu une ETAPE 7 Analyse statistique une ETAPE 8 Archivage des donn es VI ANNEXES PCRE4_PO3005 M thode de traitement des donn es GC TOF MS version 1 Page 7 7
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