Diplôme Gouy
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1. Il a t galement tabli une sous classification selon la fonction r nale stade A cr atin mie lt 175 mol l stade B cr atin mie gt 175 umol l Quel que soit le stade l existence d une insuffisance r nale aggrave de mani re importante le pronostic 1 6 3 Chimioth rapie La monochimioth rapie utilise l association de Melphalan et de Prednisone et est prescrite chez les patients g s de plus de 65 ans Bergsagel 2003 Le taux de r ponse est de 40 60 mais avec EPHE Banque de Monographies SVT 11 une dur e moyenne de survie de 30 mois La _ polychimioth rapie couple diff rentes mol cules VAD VBAP VMCP ou VBMCP Harousseau 2002 Ils permettent d obtenir de meilleurs taux de r ponse qu avec la monochimioth rapie mais la m diane de survie reste de l ordre de 3 ans L interf ron alpha am liore le taux de r ponse et la dur e de r mission Grosbois 2002 mais pas la survie du patient La chimioth rapie forte dose suivie d une ou deux autogreffe s de cellules souches p riph riques est favorable chez les patients jeunes Le taux de r ponse compl te est de 30 50 et la survie est am lior e L allogreffe de la moelle osseuse chez les personnes g es de moins de 50 ans entra ne une forte mortalit initiale par rapport l autogreffe de cellules souches p riph riques Harousseau 2002 mais permettrait peut tre l obtention de gu risons 1 6 42. Trimorreau F Accard A Harousseau JL Bataille R High incidence of translocations t 11 14 q13 q32 and t 4 14 p16 q32 in patients with plasma cell malignancies Cancer Res 1998 EPHE Banque de Monographies SVT 23 58 24 5640 5 Avet Loiseau H Brigaudeau C Morineau N Talmant P Lai J L Daviet A Li JY Praloran V Rapp MJ Harousseau JL Facon T Bataille R High incidence of cryptic translocations involving the Ig heavy chain gene in multiple myeloma as shown by fluorescence in situ hybridization Genes Chromosomes Cancer 1999a 24 1 9 15 Avet Loiseau H Facon T Daviet A Godon C Rapp MJ Harousseau JL Grosbois B Bataille R Intergroupe Francophone du Myelome 14q32 translocations and monosomy 13 observed in monoclonal gammopathy of undetermined significance delineate a multistep process for the oncogenesis of multiple myeloma Cancer Res 1999b 59 18 4546 50 Avet Loiseau H Minvielle S Mellerin MP Mangrangeas F Bataille R 14q32 chromosomal translocations a hallmark of plasma cell dyscrasias Hematol J 2000 1 5 292 4 Avet Loiseau H Gerson F Magrangeas F Minvielle S Harousseau JL Bataille R Intergroupe Francophone du Myelome R arrangements of c myc oncog ne are present in 15 of primary human multiple myeloma tumors Blood 2001 98 10 3082 3086 Avet Loiseau H Facon T Grosbois B Magrangeas F Rapp MJ Harousseau JL Minvielle S Bataille R Intergroupe Fra
3. immunoglobuline Les parties variables du BCR sont le support de la diversit du r pertoire B EPHE Banque de Monographies SVT 15 Chacun des domaines variables VL et VH poss de 3 zones hypervariables ou r gions d terminant la compl mentarit CDR La r gion situ e entre les domaines CH1 et CH2 des cha nes H ou r gion charni re assure la flexibilit de la mol cule Les zones situ es entre les domaines sont des sites de clivage pour les enzymes prot olytiques L action de la papa ne sur la mol cule d IgG lib re deux fragments Fab L VHCHI monovalents et un fragment Fc dim re des domaines CH2 CH3 R villard 1998 3 2 Le g ne codant les immunoglobulines L ensemble des segments g niques participant la synth se des cha nes lourdes des immunoglobulines est chez l homme sur le chromosome 14 en 14q32 Le locus GH s tend sur 1350 kb La synth se d une cha ne lourde n cessite l intervention de quatre types de g nes un segment VH variable un segment DH de diversit un segment JH de jonction et un segment CH qui code la partie constante Chez l homme il existe 87 segments VH appartenant 7 familles VH Le nombre de VH fonctionnels varie de 46 50 selon les haplotypes par suite d un polymorphisme all lique avec insertion ou d l tion d une r gion de 80 kb 30 40 des segments VH sont des pseudog nes par suite de mutations ponctuelles ou de d l tions R villard
4. Autres m dicaments Les bisphosphonates inhibent la r sorption osseuse et permettent de diminuer les complications osseuses et les effets ost olytiques Le thalidomide poss de des propri t s antiangiog niques des effets immunomodulateurs effet anti TNF diminution de l expression des mol cules d adh sion et une action antitumorale directe en induisant l apoptose et l arr t du cycle cellulaire en phase G1 Le PS341 est un nouveau m dicament encore en phase d essai Il inhibe le prot asome et ainsi diminue la d gradation des prot ines intracellulaires dont IkB Cette forte quantit de IKB libre peut se lier NFkB et va l inhiber Le PS341 r gule galement des prot ines r gulatrices du cycle cellulaire comme P53 et P21 2 LE LYMPHOME FOLLICULAIRE 2 1 D finition Le lymphome folliculaire est une tumeur maligne lymphoide B dont l architecture reproduit celle des follicules secondaires des organes lymphoides p riph riques dont ils d rivent C est une prolif ration maligne monoclonale d rivant des cellules B des centres germinatifs des follicules lympho des Les lymphomes folliculaires forment un groupe homog ne de lymphomes non hodgkiniens LNH par leurs caract ristiques morphologiques immunologiques et mol culaires EPHE Banque de Monographies SVT 12 Les follicules tumoraux sont constitu s de cellules B matures dont la morphologie et le ph notype immunologique sont tr s voisins de ceu
5. M kel TP Alitalo K Peltonen L Palotie A Visual mapping by fiber FISH Genomics 1995 30 1 31 6 Heiskanen M Kallioniemi O Palotie A Fiber FISH experiences and a refined protocol Genet Anal 1996a 12 5 6 179 84 Heiskanen M Peltonen L Palotif A Visual mapping by high resolution FISH Trends Genet 1996b 12 10 379 82 Herrick J Bensimon A Imaging of single DNA molecule applications to high resolution genomic studies Chromosome Res 1999 7 6 409 23 Herrick J Michalet X Conti C Schurra C Bensimon A Quantifying single gene copy number by measuring fluorescent probe lengths on combed genomic DNA Proc Natl Acad Sci U S A 2000 97 1 222 7 Ho JP Brown RD Pelka GJ Basten A Gibson J Joshua DE Illegitime switch recombiaisons are present in approximately half of primary myeloma tumpors but do not relate to know prognostic indicators or survival Blood 2001 97 2 490 495 Janssen JW Vaandrager JW Heuser T Jauch A Kluin PM Geelen E Bergsagel PL Kuelh WM Drexler HG Otsuki T Bartram CR et Schuuring E Concurrent activation of a novel putative transforming gene myeov and cyclin D1 in a subset of multiple myeloma cell lines with t 11 14 q13 q32 Blood 2000 95 8 2691 2698 Kaplan JC Delpech M Biologie mol culaire et m decine de la biologie la clinique 2 me Ed M decine Sciences Flammarion edition 1993 p 150 62 Kaplan JC et Szajnert MF Chromosom
6. 1998 Chaque segment VH est pr c d par une courte s quence dite s quence leader L s par e du segment V par un court intron excis lors de la maturation de l ARN messager Les segments D sont au nombre de 27 les segments J sont au nombre de 6 et les r gions C sont au nombre de 9 codant chacun des isotypes Ils sont regroup s sur environ 200 kb et s organisent dans l ordre suivant du t lom re au centrom re Cu d Cy3 Cyl Cal Cy2 Cy4 Ce et ca2 Kaplan et al 1993 Chaque segment CH sauf C et les pseudogenes est pr c d d une s quence S ou switch constitu e de s quences pentam res r p titives en tandem 1 3 kb situ e 1 2 kb enamont Il y a galement des r gions switch non conventionnelles appel es s qui se localisent en amont des r gions d ye et yg Bergsagel et al 1996 Des s quences stimulatrices appel es enhancer E se situent dans l intron entre les g nes J et Cm en 5 al et a2 Ces s quences sont tissus sp cifiques et permettent la r gulation des g nes des Ig Kaplan et al 1993 Ces enhancers pourraient se comporter comme des LCR Locus Control Region EPHE Banque de Monographies SVT 16 c est dire qu ils pourraient stimuler la transcription de g nes tr s loign s 3 3 Diff renciation ind pendante de l antig ne Dans l esp ce humaine la moelle osseuse repr sente la fois le si ge de l h matopo se et le site de diff renciation initiale de
7. Sur le chromosome 14q32 les points de cassure se produisent soit dans la r gion JH cause d erreurs lors des mutations somatiques soit dans une r gion switch du fait de probl me lors de la commutation isotypique Sur le chromosome 11 les points de cassure sont dispers s sur environ 300 kb centrom rique par rapport CCNDI sans pr f rence pour le MTC Major Translocation Cluster Bergsagel 2001 Janseen et al 2000 La translocation t 4 14 p16 q32 est retrouv e chez environ 15 20 des patients et 23 des lign es de MM Moreau 2000 Avet Loiseau donn es personnelles Le g ne FGFR3 Fibroblast Growth Factor Receptor 3 est un oncog ne de la famille des r cepteurs de type tyrosine kinase et intervient dans la prolif ration la diff renciation et la migration des fibroblastes il n est pas exprim dans les plasmocytes normaux Le gene MMSET Multiple Myeloma SET domain code un facteur de transcription exprim dans les tissus embryonnaires croissance rapide Pratt 2002 et intervient dans le remodelage de la chromatine Les points de cassures sur 4p16 sont t lom riques par rapport au g ne MMSET dans les introns ou les premiers exons en 5 de ce g ne Sur le der 4 les r gions VDJ jusqu l enhancer Em du g ne des IGH sont juxtapos es aux exons centrom riques du proto oncogene MMSET D autre part le der 14 est obtenu par juxtaposition de FGFR3 et d un enhancer fort situ en 3 du g n
8. ce qui entra ne une d r gulation des g nes JGH et BCL2 et une hyperexpression de la prot ine BCL2 Cet v nement principal prolonge la vie cellulaire par blocage du processus d apoptose donc joue un r le dans l agressivit du lymphome la diss mination et la r sistance aux th rapies Des anomalies cytog n tiques secondaires sont galement observ es comme le r arrangement de l oncog ne C MYC qui est retrouv dans 8 des cas tudi s par Yano et al en 1992 D autres anomalies sont aussi impliqu es comme la mutation de P53 la d l tion du chromosome 9p21 p16 et p15 les d l tions de 6q ainsi que les r arrangements des locis de BCL 6 en 3q27 et BCL 3 en 19q13 Lerner et Burns 2003 La translocation t 8 9 q24 p13 semble galement intervenir dans la pathogen se du lymphome folliculaire Nacheva et al 1993 2 4 Diagnostic clinique biologique et cytog n tique EPHE Banque de Monographies SVT 13 Le diagnostic est souvent port apr s plusieurs mois voire plusieurs ann es d volution et il est r v l en g n ral par un syndrome polygangionnaire Le diagnostic de lymphome folliculaire se fait partir d une biopsie d un ganglion lymphatique et par l observation de nodules ou follicules constitu s de cellules B n oplasiques sur l ensemble du ganglion Une augmentation du taux de la b2 microglobuline s rique est au del de 3mg l dans 35 des Cas En cytog n tique on cons
9. mais aussi 9p13 12p11 12p13 et Xq28 Avet Loiseau 1999 EPHE Banque de Monographies SVT 10 1 6 Traitements 1 6 1 Facteurs pronostiques Plusieurs facteurs sont consid r s comme de mauvais pronostic pour le MM gt Age lev gt Le taux de b2 micoglobuline sup rieur 6mg L est de tr s mauvais pronostic il existe une corr lation lin aire entre ce taux et la survie Anderson et al 2002 Le taux de CRP Existence d une amylose Le type d Ig le MM IgA pr sente un mauvais pronostic Vv Vv V WV Anomalies cytog n tiques la d l tion du chromosome 13 et la translocation t 4 14 seraient de mauvais pronostic Par comparaison la translocation t 11 14 serait de bon pronostic car les plasmocytes porteurs de la t 11 14 seraient moins prolif rants que les plasmocytes non porteurs de la t 11 14 Les patients qui n ont ni une t 4 14 ni t 11 14 auraient une survie interm diaire plus ou moins longue selon la pr sence de la d l tion du chromosome 13 Fonseca 2002 Moreau 2002 Fassas 2002 Keats 2003 1 6 2 Le classification de Durie et Salmon La classification de Durie et Salmon tente de corr ler un certain nombre de param tres cliniques courants la masse tumorale Cette classification ainsi que le dosage deb2 microglobuline et la d l tion du chromosome 13 sont utilis s pour d cider de la mise en place du traitement Les patients des stades II et III sont syst matiquement trait s
10. provoquent une instabilit chromosomique D autres mutations sont alors observ es comme le d r glement des oncog nes ras N RAS et K RAS Bezieau et al 2001 Ces mutations sont rencontr es dans 40 des cas et provoquent l ind pendance des cellules IL6 et le blocage des ph nom nes d apoptose gt La phase fulminante ou acc l r e Jusqu cette phase les plasmocytes restent intra m dullaires un envahissement extra m dullaire caract rise la progression de la maladie Le g ne suppresseur de tumeur p53 est mut dans 5 10 des cas et emp che l apoptose des plasmocytes Avet Loiseau donn es personnelles Bataille et al 1997 Hallek et al 1998 Des translocations secondaires plus complexes et parfois ind pendantes du g ne JGH sont d tect es comme la d r gulation du g ne C MYC positionn en 8q24 qui serait impliqu dans l immortalisation du clone tumoral Les anomalies chromosomiques sont plus EPHE Banque de Monographies SVT 8 complexes les insertions sont souvent non totales et trois chromosomes diff rents peuvent intervenir Il semblerait que ces translocations secondaires ne soient pas les cons quences d erreurs lors des remaniements d ADN de la diff renciation des cellules B Bergsagel 2000 Plus r cemment un autre mod le d oncogen se des plasmocytes a t propos par l quipe de Avet Loiseau en 2002 Ce mod le repose sur la corr lation entre les anomalies g n
11. r ponse immune B primaire laissent place des immunoglobulines d une nouvelle classe IgG IgA ou plus rarement IgE Le switch fait intervenir des processus d l tionnels au niveau de r gions homologues appel es zones switch ou s quences S Ces r gions constitu es d environ 10 kb sont situ es 1 2 kb en 5 de chacune des r gions constantes sauf la r gion C et les pseudog nes Il se produit une recombinaison somatique entre la s quence S du g ne u et l une des s quences S des g nes codant la partie constante des autres isotypes y a L ADN entre ces deux s quences est alors d l t sous forme de boucle d excision figure 12 La partie constante de l immunoglobuline se trouve ainsi associ e au complexe VDJ d j form Le switch ne modifie donc pas la sp cificit de l immunoglobuline pour l antig ne puisque seule la r gion constante est modifi e Cette recombinaison est donc un switch l gitime qui s effectue entre deux r gions switch et constitue une r gion switch hybride Ces deux v nements mol culaires mutations somatiques et commutation isotypique sont probablement l origine des cassures et des translocations chromosomiques notamment entre un chromosome porteur de g ne d immunoglobuline et un chromosome porteur d un proto oncog ne Un switch ill gitime qui se caract rise par l intervention d une seule r gion switch peut galement engendrer des translocat
12. 0 La m diane de survie est de l ordre de deux trois ans avec traitement mais son volution est tr s variable selon les cas Pratt 2002 Le MM est aujourd hui encore incurable En France le MM est responsable de 1 des d c s par cancer et provoque la mort d environ 2000 personnes par an Facon 1997 1 3 Etiologie L tiologie du MM est encore aujourd hui inconnue et aucun facteur de pr disposition n a t d couvert Il a t observ deux sortes de MM chez l homme Chez environ un patient sur trois on diagnostique d abord une gammapathie monoclonale d origine ind termin e ou MGUS caract ris e par une Ig monoclonale sans autres signes cliniques du MM principalement les l sions osseuses Dans les autres cas les patients pr sentent un MM de novo sans apparition d une MGUS au pr alable Avet Loiseau et al 2002 Certains facteurs de risque ont t avanc s comme l exposition des hydrocarbures et des produits radioactifs Des facteurs g n tiques favorisants semblent galement exister comme le montrent les rares formes familiales ou une plus grande incidence dans la population noire toutefois ce facteur g n tique n est pas identifi 1 4 Oncogen se L oncogen se du my lome multiple est complexe et n est pas compl tement connue Les plasmocytes prolif rent lentement dans la moelle osseuse ils sont d pendants de facteurs de croissance dont l interleukine 6 IL 6
13. Hematol Educ Program 2001 157 77 Drexler HG Matsuo Y Malignant hematopoietic cell lines in vitro models for the study of multiple myeloma and pasma cell leukemia Leukemia Research 2000 24 681 703 Erdel M Hubalek M Lingenhel A Kofler K Duba HC Utermann G Counting the repetitive kringle IV repeats in the gene encoding human apolipoprotein a by fiber FISH Nat Genet 1999 21 4 357 8 Fabris S Storlazzi CT Baldini L Nobili L Lombardi L Maiolo AT Rocchi M Neri A Heterogeneous pattern of chromosomal breakpoints involving the MYC locus in multiple myeloma Genes Chromosomes Cancer 2003 37 3 261 9 Facon T Traitement conventionnel du my lome multiple H matologie 1997 3 245 55 Fassas AB Spencer T Sawyer J Zangari M Lee CK Anaissie E Muwalla F Morris C Barlogi CB Tricot G Both hypodiploidy and deletion of chromosome 13 independently confer poor prognosis in multiple myeloma Br J Haematol 2002 118 4 1041 7 Feuillard J et Rapha l M Diff renciation lymphocytaire B et lymphomes B p riph riques H matologie 2000 6 345 59 Flanagran JG et Rabbitts TH Arrangement of human immunoglobulin heavy chain constant region implies evolutionary duplication of a segment containing g e et a genes Nature 1982 300 23 30 709 713 Fonseca R Blood EA Oken MM Kyle RA Dewald GW Bailey RJ Van Wier SA Henderson KJ Hoyer JD Harrington D Kay NE Van Ness B Greipp PR My
14. JL Bataille R Avet Loiseau H EPHE Banque de Monographies SVT 26 Intergroupe Francophone du my lome Recurrent 14q32 translocations determine the prognosis of multiple myeloma especially in patients receiving intensive chemotherapy Blood 2002 100 5 1579 83 Nacheva E Dyer MJS Fischer P Stranks G Heward JM Marcus RE Grace C Karpas A C myc translocations in de novo B cell lineage acute leukemias with t 14 18 cell lines Karpas 231 and 353 Blood 1993 82 1 231 240 Pratt G Molecular aspects of multiple myeloma Mol Pathol 2002 55 5 273 83 R villard JP Immunologie 3 me Ed De Boeck Universit ed 1998 Rosenberg C Florijn RJ Van de Rijke FM Blonden LA Raap TK Van ommen GJ Den Dunnen JT High resolution DNA fiber fish on yeast artificial chromosomes direct visualization of DNA replication Nat Genet 1995 10 4 477 9 Senger G Jones TA Fidlerova H Sanseau P Trowsdale J Duff M Sheer D Released chromatin linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization Hum Mol Genet 1994 3 8 1275 80 Shou Y Martelli ML Gabrea A Qi Y Brents LA Roschke A Dewald G Kirsch RI Bergsagel PL Kuehl WM Diverse karyotypic abnormalities of the c myc locus associated with emyc dysregulation and tumor progression in multiple myeloma Proc Natl Acad Sci USA 2000 97 1 228 33 Siebert R Matthiesen P Harder S Zhang Y Borowski A Z hle Jenisch R Metzke
15. MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Pr sent par Nad ge GOUY Pour l obtention du dipl me de l Ecole Pratique des Hautes Etudes ANALYSE DES REMANIEMENTS DU GENE C MYC DANS LES LYMPHOPATHIES B PAR HYBRIDATION IN SITU EN FLUORESCENCE SUR FIBRES D ADN Soutenu le 15 Octobre 2004 devant le jury suivant Pr Bernard MIGNOTTE Pr sident Pr St phane RICHARD Rapporteur Mr Bruno CANQUE Examinateur Pr Herv AVET LOISEAU Examinateur Laboratoire de G n tique Oncologique EPHE Directeur Pr St phane RICHARD Facult de M decine Paris Sud e mail stephane richard kb u psud fr 63 rue Gabriel P ri Laboratoire de cytog n tique h matologie Directeur Pr Herv AVET LOISEAU 8 quai Moncousu C H U de Nantes e mail havetloiseau chu nantes fr 44093 NANTES Cedex ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE ANALYSE DES REMANIEMENTS DU GENE C MYC DANS LES LYMPHOPATHIES B PAR HYBRIDATION IN SITU EN FLUORESCENCE SUR FIBRES D ADN EPHE Banque de Monographies SVT 1 Nad ge GOUY RESUME Le my lome multiple et le lymphome folliculaire sont deux lymphopathies B malignes qui se ract risent par une accumulation monoclonale de cellules B Pour le my lome multiple la prolif ration anormale de plasmocytes au niveau de la moelle osseuse iccompagne en g n ral d un pic d immunoglob
16. S Joos S Weber Matthiesen K Grote W et Schlegelberger B Application of interphase fluorescence in situ hybridation for the detection of the Burkitt translocation t 8 14 q24 q32 in B cell lymphomas Blood 1998 91 3 984 990 Solal C ligny P Brousse N Ferme C Gisselbrecht C Reyes F Coiffier B Lymphomes lymphomes non hogkiniens maladie de Hodgkin 3 me Ed Edition Frison Roche 1997 p 171 189 Vaandrager JW Kleiverda JK Schuuring E Kluin Nelemans JC Raap AK Kluin PM Cytogenetics on released DNA fibers Verh Dtsch Ges Pathol 1997 81 306 11 Vaandrager JW Schuuring E Kluin Nelemans HC Dyer MJ Raap AK Kluin PM DNA fiber fluorescence in situ hybridization analysis of immunoglobulin class switching in B cell neoplasia aberrant CH gene rearrangements in follicle center cell lymphoma Blood 1998 92 8 2871 2878 Vanasse GJ Concannon P Willerford DM Regulated genomic instability and neoplasia in the lymphoid lineage Blood 1999 94 12 3997 4010 Wilson PC De Bouteiller O Liu YJ Potter K Banchereau J Capra JD Pascual V Somatic hypermutation introduces insertions and deletions into immunoglobulin V genes J Exp Med 1998 187 1 59 70 EPHE Banque de Monographies SVT 27
17. ans certaines lign es de MM et pr sente chez 15 des patients Avet Loiseau et al 2001 On a pu observer diff rentes translocations t 8 14 dans le MM La plus couramment observ e place C MYC ainsi que la partie distale du chromosome 8 en 5 des g nes de la r gion constante des chaines lourdes des immunoglobulines Les deux sites sont joints de sorte que les directions de transcription soient oppos es en subissant ou non unetranslocation du premier exon Les g nes d anticorps pr sentent des exclusions all liques ce qui signifie que seuls les g nes de cha ne lourde de l un des deux chromosomes sont utilis s Le g ne C MYC est transloqu au niveau du locus non fonctionnel ce qui explique que les cellules seraient capables de synth tiser des anticorps La plupart des points de cassure sur le chromosome 14 se produisent au sein des r gions de commutation se trouvant devant les s quences qui codent pour les r gions constantes des chaines lourdes m a ou g alors que les points de cassure pr s de C MYC sont tr s parpill s Dans le MM les oncog nes comme C MYC sont souvent transloqu s aux loci des g nes des anticorps Les g nes des anticorps sont transcriptionnellement actifs dans les cellules B ce qui pourrait constituer un aspect essentiel de leur r le d activateur de C MYC Les translocations dans les tumeurs de cellules B r sultent d erreurs de recombinaison au cours des r arrangements des g nes des immunog
18. asesossosssasoosese 35 4 2 Culture cellulaire des clones sssesesseneeeneeneeeeneneneeeneesennse 37 4 3 Extraction des sondes ssenseeseneeeneneneneeneeneseense 38 4 4 Marquage des SOMES si ciisscsessssectscesesdsvassscsssassentsssssssescss suas veecsoac setsossssdsvosssost cessesasss 38 5 LA TECHNIQUE DE BIBER BIS Hp at nee no tetes 39 5 1 Pr paration des blocs d agarose contenant l ADN ssseseeneenenseees 39 5 2 Pr paration d s lames cece cossdecccoasaseccecedessscesescvaseouctesevacs coccosnsosesesdssasesdscecessse 39 5 3 Hy bridation in sitt sccscscscssscssscsossteonssecssscetosesscavsssecsssvactocs seasiseusseasssebsassoesbeasesassectessscee 40 5 3 1 Pr cipitation et d naturation des sondes 40 5 3 2 D naturation des fibres d ADN fix es sur la lame 40 5 33 Etape d hybtidati n 5 252 00e eine en te tn ne eee hd 41 2 34 Lavaces des lames shirts mater A 41 5 3 5 R v lation par les anticorps 41 5 3 0 Lectur par imagerl 4tsse hate en nan nel ennemis Cesnen ete cay 42 5 3 7 R capitulatif du mode d emploi 43 6 LES AUTRES METHODES D HYBRIDATION rss 44 6 1 Technique de FISH classique sur noyaux interphasiques ou sur m taphases 44 6 2 Technique de peinture de ChrOMOSOMEG csscsessssescsssccsssccsccsccescscssssscssscesscees 44 RESULTATS ET INTERPRETATION 1 ETABLISSEMENT DES CODES BARRES 45 2 ETUDES DES LIGNEES CELLULAIRES DE MM 49 2 1 Les lign es cellulaires
19. de MM avec une insertiON ssssesssssessosreensosseososerossesencee 49 2 11 a Nene JIN essentiel intl trs ets a enteiss ae n 50 2 12 Ca en e OPMP ere es tn tee reine ein entente 52 2 13 La hien e KMS 12 5 erte foci cee A AEA tent eb dea E EER 54 2 2 Les lign es cellulaires de MM avec une translocation ssssenesessesseeseeenese 56 2 21 Teal gn e AMOR i Sener T ne Mn Ne eh 56 2 22 La lon e SKMME T5 208 an pen E en nat a 59 223 ka lien esKARPAS 620 seit oie nn ee eee ea ei Sn 62 2 24 L lign e KMS Isnin sia ne ne RS canis oh austeasteabeskgaeet tenant 65 Qs Dede ee SNES LA a E 5 eee An EE E en dak Seed duce Anne tte EN tete 67 EPHE Banque de Monographies SVT 3 ETUDES DES PATIENTS ATTEINTS DE MM 71 4 ETUDES DES LIGNEES DE LYMPHOME FOLLICULAIRE ET DU PATIENT 76 4 1 La lign e KARPAS 231 viiccccsccsocsctescccssicecestcscateecoteceoess sotvesesossesssonsvuesvasveneesasdecceseesoecuse 76 4 1 1 Technique de peinture de chromosomes 76 4 1 2 Technique de FISH classique 76 4 1 3 Technique de Fiber FISH Forrer manne me in en gia a ieia Ee 78 4 2 La lign e KARPAS 3534 erronee ieceres ko aroos esseen ets konsesi ooer ess sse ere esren este 79 4 2 1 Technique de peinture de chromosomes 79 4 2 2 Technique de FISH classique 79 4 2 3 Technique de Fiber FISH ss 81 4 3 Patient atteint de lymphome folliculaire ssssssessssseesssesesesesse 82 4 3 1 Tech
20. e lev de r arrangements non fonctionnels Elles sont tent es sur l un des deux all les pris au hasard Si le r arrangement VDJ est productif une cha ne u fonctionnelle est synth tis e et son expression la surface de la cellule inhibe les r arrangements sur l autre all le et initie les recombinaisons des cha nes l g res Le second all le n est alors pas recombin et ne pourra tre exprim Ce ph nom ne appel exclusion all lique explique pourquoi chaque cellule pr B ne synth tise qu un seul type de cha ne lourde y Au contraire si le r arrangement est abortif une nouvelle recombinaison est tent e sur le deuxi me all le Si le r arrangement VDJ n est fonctionnel sur aucun des deux all les la cellule est limin e par apoptose Lassoued et al 1995 Kaplan et Delpech 1993 R villard 1998 EPHE Banque de Monographies SVT 17 D s qu une cha ne lourde u fonctionnelle est synth tis e la recombinaison au niveau des g nes des cha nes l g res est ensuite effectu e K puis en cas d chec L ensemble des segments codant les cha nes est situ sur le chromosome 2 et pour les cha nes sont situ s sur le chromosome 22 Contrairement aux g nes codant les cha nes lourdes il n y a pas de segment D La recombinaison s effectue entre l un des segments V pris au hasard et l un des segments J pris au hasard Le complexe V J ainsi form est ensuite associ l unique segmen
21. e CHa2 de IGH induisant une hyperexpression de FGFR3 La translocation t 14 16 q23 q11 est retrouv e chez 5 chez des patients avec un MM et dans EPHE Banque de Monographies SVT 20 20 25 des lign es cellulaires de MM Chesi et al 1998 Avet Loiseau donn es personnelles L oncog ne C MAF est un facteur de transcription impliqu dans la diff renciation et la prolif ration cellulaire Dans la translocation t 14 16 on retrouve des particularit s observ es dans la t 4 14 Les r arrangements avec d autres partenaires inconnus sont observ s dans 44 des MM Avet Loiseau et al 2002 5 LES GENES C MYC ET PAXS 5 1 G n ralit s sur g ne C MYC Chez l homme le proto oncog ne C MYC se localise sur le bras long du chromosome 8 la bande q24 et s tend sur 5 000 paires de bases Le g ne poss de 3 exons le premier exon d environ 550 paires de bases est la r gion non traduite de ARNm alors que les deux autres codent une phosphoprot ine nucl aire de 439 acides amin s Kaplan et Szajnert 1985 Le g ne C MYC code un facteur de transcription appartenant la famille des prot ines basic helix loop helix leucine zipper ou bHLH LZ dont le domaine basique reconna t une s quence sp cifique d ADN CACGTG le domaine HLH LZ permettant une homo ou une h t rodim risation Le g ne C MYC est d fini comme un immediate early gene autrement dit un g ne rapidement r gul lorsque les cellule
22. e lymphome folliculaire Des anomalies chromosomiques provoquent des dysfonctionnements au niveau de g nes cellulaires normaux jouant des r les importants dans la diff renciation cellulaire Dans le my lome multiple le g ne qui code la partie constante des cha nes lourdes des immunoglobulines Ig est tr s souvent r arrang avec diff rents partenaires dont l oncog ne C MYC La majorit des r arrangements entre chromosomes implique les zones switch situ es en amont de la plupart des g nes de la r gion constante des Ig Deux types de switch ont t mis en vidence Bergsagel et al 1996 Ho 2001 Y Le switch l gitime a lieu entre deux zones switch Sm et Sg Se ou Sa Cette tape peut se d rouler sur le m me chromosome ou plus rarement entre deux switch sur deux chromosomes homologues Y Le switch ill gitime n implique qu une seule zone switch qui s associe avec des r gions autres lors de translocation d insertion de d l tion ou d inversion Les proc d s d association du g ne C MYC la r gion codant les Ig et les points de cassure sont multiples Le g ne C MYC est ainsi d r gul par sa juxtaposition avec une r gion du locus des Ig Une particularit du lymphome folliculaire est la pr sence de remaniements cytog n tiques impliquant la r gion de C MYC par le biais de la translocation t 8 9 La technique de Fiber FISH pourrait lucider certains v nements mol culaires a
23. e mutations somatiques correspond des mutations al atoires des r gions variables un taux d environ 1 1000 paires de bases Il en r sulte une augmentation de l affinit de l immunoglobuline pour l antig ne Bakkus et al 1992 Vanasse et al 1999 Avet Loiseau et al 2000 Ces mutations somatiques sont localis es dans une r gion d environ 1 5 kb en aval du promoteur Diff rents m canismes ont t impliqu s substitutions de nucl otides silencieuses ou non insertions ou d l tions de nucl otides Goossens et al 1998 Wilson et al 1998 Feuillard EPHE Banque de Monographies SVT 18 et al 2000 Les mutations somatiques des r gions variables des g nes des immunoglobulines apparaissent au stade centroblaste et ont lieu uniquement au sein du centre germinatif La diff renciation du centroblaste en centrocyte est caract ris e par un arr t de prolif ration et par la rencontre avec l antig ne pr sent par la cellule dendritique folliculaire qui permet de s lectionner positivement les centrocytes les cellules ayant une immunoglobuline de faible affinit pour l antig ne ou non fonctionnelle du fait de mutations somatiques non fonctionnelles meurent par apoptose les autres poursuivent leur diff renciation et subissent le ph nom ne de commutation isotypique Au cours de la commutation isotypique ou switch les IgM synth tis es et s cr t es par le lymphocyte B caract ristiques de la
24. eloma and the t 11 14 q13 32 evidence for a biologically defined unique subset of patients Blood 2002 99 10 3735 41 Gabrea A Bergsagel PL Chesi M Shou Y Kuehl WM Insertion of excised IgH switc sequences causes overexpression of cyclin D1 in a myeloma tumor cell Mol Cell 1999 3 1 119 123 Goossens T Klein U Kuppers R Frequent occurrence of deletions and duplications during somatic hypermutation implications for oncogene translocations and heavy chain disease Proc Natl Acad Sci U S A 1998 95 5 2463 8 Grosbois B Decaux O Azais I Facon T Avet Loiseau H Current treatment strategies for multiple myeloma Eur J Internal Med 2002 13 2 85 95 Hallek M Bergsagel PL Anderson KC Multiple myeloma increasing evidence for a multistep transformation process Blood 1998 91 1 3 21 Hanamura I Iida S Akano Y Hayani Y Kato M Miuri K Harada S Banno S Wakita A Kiyoi H Naoe T Shimizu S Sonta SI Nitla M Taniwaki M Ueda R Ectopic expression of MAFB gene in human myeloma cells carrying 14 20 q32 q11 chromosomal translocations Jpn J Cancer Res 2001 92 6 638 44 EPHE Banque de Monographies SVT 25 Heiskanen M Karhu R Hellsten E Peltonen L Kallioniemi OP Palotie A High resolution mapping using fluorescence in situ hybridization to extended DNA fibers prepared from agarose embedded cells Biotechniques 1994 17 5 928 929 Heiskanen M Hellsten E Kallioniemi OP
25. es des switch participent ces remaniements Dans les lign es et ez les patients on constate une grande h t rog n it au niveau de la localisation des points de cassure de rt et d autre des exons de C MYC dans la r gion 8q24 Le lymphome folliculaire est caract ris par une prolif ration monoclonale des cellules B des atres germinatifs des follicules lymphoides Le r arrangement mol culaire le plus r current est la nslocation t 14 18 mais d autres r arrangements comme la translocation t 8 9 sont galement observ s ns les deux KARPAS 231 et 353 ainsi que chez un patient Dans ces trois cas de figure les points de ssure se localisent proches des genes C MYC et PAX5 impliquant potentiellement ces deux g nes dans mcogen se du lymphome folliculaire MOTS CLES My lome Multiple Lymphome Folliculaire Fiber FISH Immunoglobuline Switch C MYC PAXS ADIE VATIONS 22h ciel ht cate iat aes A ne A E AR NAIA Re Sea bea eb Roe 1 Introductions aeee e MR One 2 GENERALITES IEE MYELOME MUDBTIPLE reiteranta einen dated tt et fete aie aden 3 DoE TIC AIDAT i PPE O E oeeeedavoaceskestsvussonecansracnseuassnesessess 3 1 2 Epid miologie ssaber cesscetceestoncbecesssteSeccssbcectocer seed sets deaneicasensccesccccssagebestesveettecesasssees 3 TiS ea CU SE E EE E EE TE A TTET 4 VA ONCOGENES E EE EE E EEEN EEEE 4 1 5 Diagnostic clinique biologique et cytog n tique sossosscsoesossosseesescssesocsossossossossoee 7 1 5 1 Man
26. es et cancer le paradigme du lymphome de Burkitt M decine Sciences 1985 p 17 23 Keats JJ Reiman T Maxwell CA Taylor BJ Laratt LM Mant MJ Belch AR et Pilarski LM In multiple myeloma t 4 14 p16 q32 is an adverse prognostic factor irrespective of FGFR3 expression Blood 2003 101 4 1520 9 Kuipers J Vaandrager JW Weghuis DO Pearson PL Scheres J Lokhorst HM Clevers H Bast BJ Fluorescence in situ hybridization analysis shows the frequent occurrence of 14q32 3 rearrangements with involvement of immunoglobulin switch regions in myeloma cell lines Cancer Genet Cytogenet 1999 109 2 99 107 Lassoued K Benlagha K G nes impliqu s dans la diff rentiation et le d veloppement du lymphocyte B H matologie 1995 6 477 88 Lerner RE et Burns LJ Tranformed lymphoma an Achilles heel of non hodgkin s lymphoma Bone Marrow Transplanta 2003 31 531 537 Liu YJ Arpin C De Bouteiller O Guret C Blanchereau J Martinez Valdez H Lebecque S Sequential triggering of apoptosis somatic mutation and isotype switch during germinal center development Semin Immunol 1996 8 3 169 77 Michalet X Ekong R Fougerousse F Rousseaux S Schurra C Hornigold N Van Slegtenhorst M Wolfe J Povey S Beckmann JS et Bensimon A Dynamic molecular combing stretching the whole human genome for high resolution studies Science 1997 277 5331 1518 23 Moreau P Facon T Leleu X Morineau N Harousseau
27. fournis par le micro environnement tumoral Le my lome est EPHE Banque de Monographies SVT 7 une maladie cin tique de croissance tumorale lente avec un temps de doublement long la phase initiale Selon Bergsagel et son quipe en 2001 on peut consid rer trois tapes dans l volution du MM gt La phase initiale Le premier v nement est le dysfonctionnement de certains oncog nes par leur juxtaposition avec l enhancer du g ne IGH plus rarement avec IGL Ces translocations semblent se produire lors des r arrangements VDJ lors des hypermutations somatiques ou lors de la commutation isotypique Des erreurs lors de remaniements d ADN peuvent entra ner des translocations chromosomiques des d l tions des insertions ou des mutations ponctuelles Kuipers et al 1999 Ces translocations sont donc tr s pr coces au cours de l oncogen se elles interviendraient donc dans l immortalisation d une cellule plasmocytaire mais ne seraient pas suffisantes pour la rendre maligne De plus ces translocations primaires sont pr sentes dans les MGUS alors que les translocations secondaires sont rares ou absentes du MGUS Ces translocations primaires simples et r ciproques comptent principalement trois partenaires pour le g ne des IgH le g ne CCNDI qui code la cycline D1 11q13 les genes FGFR3 et MMSET 4p16 et le gene C MAF 16q23 gt La phase secondaire chronique dite active Tous ces remaniements g n tiques
28. iation ind pendante de l antig ne sssssseseeeseeeeeeneenesse 18 3 4 Diff renciation d pendante de l antig ne sssssssseeseeeeneeesses 20 4 RAPPELS SUR LES TRANSLOCATIONS DANS LE MM 22 5 EES GENES C MYC Et PAXS rruen anaa a e aE a aa oue i entar nets 24 5 1 G n ralit s sur le g ne C MYC esseseesccsocsoesosoososeoseeseesocsocoocoocoosoososeossesoesocsocsocsoesssss 24 5 2 G n ralit s sur le g ne PAX5 essessesoesocsocsossosoososeoseessesocsocoocoocoosoososeoseessesoesocsocssesseso 25 5 3 Remaniements mol culaires de C MYC et PAXS meremennnnnnenene 25 3 3 1 Le MY lome Multiple etant ste mine entente elven tie ete 25 2 5 2 Le Lymphome folliculaire ss 27 MATERIEL ET METHODES 1 CRITERE DE CHOIX DE LA METHODE DE FIBER FISH 28 2 LES LIGNEES CELLULAIRES DES LYMPHOPATHIES B 30 2 1 Caract ritiques des lign es de My lome Multiple sssseseessesssenensnoses 30 2 2 Caract ritiques des lign es de Lymphome Folliculaire sssssssessssess 32 3 LES PATIENTS ETUDIES EPHE Banque de Monographies SVT 3 1 Caract ritiques des patients tudi s atteints de My lome Multiple 34 3 2 Caract ritiques du patient tudi atteint de Lymphome Folliculaire 35 4 PREPARATION DES SONDES esse 35 4 1 Caract ritiques des SOMGES ccssscsrssescsssssesessssecssvassosssessscesencesassasssscs
29. ifestations cliniques 7 EPHE Banque de Monographies SVT 2 1 5 2 Manifestations biologiques 7 1 5 3 R arrangements cytog n tiques 8 1 6 Traitements ccccsccccscssscscssscsccsssssssessssscsscsencessssnscsscssscssssessesesesssesssessncssssencsseseoes 9 1 6 1 Fact urs pronostiques 5 5 eiser a iaeo rE E Ao RERE S TAR ERITYI ERREKEN ERRER 9 1 6 2 Classification de Durie et Salmon 10 1 6 37 Chimioth rapie essene r e E E KE EE a el ENEE 11 1 6 2 Autres M dICAMENTS ses aep e raneren esane E KEE EEEE IENKEAR tres sa 11 2 LE LYMPHOME FOLLICULAIRE iii 12 ZAM D finition gs caceisessscnsedtaa ca caeqasieesscqessicdasceesauen se casvesausssoees nanas die Ntn ets 12 2 2 Epid CrniOlo Qi vicsesccecaccvsetecceasccascsssesecsersvocdsncecsvdecssccsensstcssessecessucdesesansssesvavsesdsvesencens ceste 12 2 3 QNCORETESE E E E EAE EE AEE E A EE 13 2 4 Diagnostic clinique biologique et cytog n tique e sescsscsocsossossossoesossessesessessesose 13 PASA BT E A E A L TA 14 2 Sl Facteurs Pronostiques rire n e e sl edn ieee ERE EE E Mek REE ae 14 2 52 Traitement Sone Mn EEE A ee E E a 14 3 LE GENE DES IMMUNOGLOBULINES cc ccccccccesssssseeeeeceseeeesecssnaaeeeceseaaeeeeeneaaas 16 3 1 Structure des immunoglobulines sessssseesseeeesesesse 16 3 2 Le g ne codant les immunoglobulines sssssesesssesesseeseeneneeseneeneeenesnss 17 3 3 Diff renc
30. ions chromosomiques des d l tions des insertions ou des inversions Bergsagel et al 1996 Les centrocytes sauv s de l apoptose se diff rencient soit en plasmoblastes soit en cellules B m moire Les plasmoblastes finissent leur diff renciation dans la moelle osseuse ou dans la lamina propria de l intestin Les cellules B m moire s accumulent dans la zone marginale des follicules EPHE Banque de Monographies SVT 19 4 RAPPELS SUR LES TRANSLOCATIONS DANS LE MM Les r arrangements du chromosome 14q32 sont retrouv s dans 60 75 des MM au diagnostic ou en rechute avec diff rents partenaires Ces translocations ont pour cons quence la d r gulation d un oncog ne Avet Loiseau et al 2002 Les translocations t 11 14 et t 4 14 sont r ciproques et d montrent la possibilit que le g ne IGH puisse d r guler en m me temps un ou deux oncog nes La translocation t 11 14 q13 q32 est retrouv e chez 16 des patients atteints de MM et 25 31 de lign es de MM Bergsagel 2001 Avet Loiseau et al 2002 Bergsagel 2003 L oncog ne CCNDI qui code la cycline D1 intervenant dans le cycle cellulaire au niveau de GIS est hyperexprim le gene MYEOV peut galement tre d r gul Chesi 2000 Le g ne CCNDI1 se trouve juxtapos l enhancer Ea des IGH sur le der 14 alors que le g ne MYEOV reste sur le der 11 associ l enhancer Em en 5 ou l enhancer Ea en 3 figure 13 Janssen 2000
31. lobulines Les points de cassure se trouvent au niveau des signaux de recombinaison soit des s quences heptam re nonam re qui participent au r arrangement des r gions J soit aux s quences de type switch Ces m mes signaux se retrouvent au voisinage du g ne C MYC soit en amont soit en aval et sont source d erreur pour la recombinase Toutefois d autres types de translocations pourraient impliquer le processus de mutation somatique Au lieu de joindre deux segments d un g ne d anticorps ils joignent un proto oncog ne un EPHE Banque de Monographies SVT 22 g ne IGH Cette explication pourrait rendre compte de translocations intervenant pendant la commutation du locus de chaine lourde Le g ne C MYC s exprime de fa on anormale soit franchement lev e soit un taux mod r mais permanent la diff rence des cellules normales o il ne s exprime que dans une fen tre troite du cycle cellulaire entre GO et Gl On constate diff rents m canismes qui semblent d clencher l v nement activateur de C MYC Le premier exon peut tre exclu et donc provoquer une activation incontr l e cet exon paraissant jouer un r le essentiel dans la r gulation de l expression de C MYC par son propre produit auto inhibition Sinon une cis activation peut se produire par le rapprochement d un enhancer de la r gion du switch des g nes des cha nes lourdes des Ig Un autre m canisme peut tre l a
32. ncophone du Myelome Oncogenesis of multiple myeloma 14q32 and 13q chromosomal abnormalities are not randomly distributed but correlate with natural history immunological features and clinical presentation Blood 2002 99 6 2185 91 Bakkus MH Heirman C Van Riet I Van Camp B Thielemans K Evidence that multiple myeloma Ig heavy chain VDJ genes contain somatic mutations but show no intraclonal variation Blood 1992 80 9 2326 35 Bataille R Harousseau JL Multiple myeloma N Engl J Med 1997 336 23 1657 64 Bergsagel PL Chesi M Nardini E Brents LA Kirby SL Kuelh WM Promiscuous translocations into immunoglobulin heavy chain switch regions in multiple myeloma Proc Natl Acad Sci USA 1996 93 24 13931 6 Bergsagel DE Wong O Bergsagel PL Alexanian R Anderson K Kyle RA Raabe GK Benzene and multiple myeloma appraisal of the scientific evidence Blood 1999 94 4 1174 82 Bergsagel PL Kuehl WM Chromosome translocations in multiple myeloma Oncogene 2001 20 40 5611 22 Bergsagel PL Chemotherapy of multiple myeloma Melphalan 40 years old and still going strong Biol Blood Marrow Transplant 2003 9 1 2 3 Bergsagel PL Prognostic factors in multiple myeloma It s in the genes Clin Cancer Res 2003 9 2 533 534 Bezieau S Devilder MC Avet Loiseau H Mellerin MP Puthier D Pennarun E Rapp MJ Harousseau JL Moisan JP Bataille R High incidence of N and K Ras activating mutati
33. nique de peinture de chromosomes 82 4 3 2 Technique de FISH classique 82 DISCUSSION miiba enere aoe e a e 84 CONCLUSION vaesena art e a e 92 ANNEXE noae R E T Sondes 93 BIBLIOGRAPHIE rps casnstiinogia ti cen denasnseassnneltansarittesinnadabuunncasgnaeuiceapamatneeay an 95 ABREVIATIONS Ac Anticorps ADN Acide d soxyribonucl ique ARN Acide ribonucl ique BAC Bacterial Artificial Chromosome CCND 1 Cycline D1 CH partie constante du g ne des cha nes lourdes des immunoglobulines DAPI 6 diamidino 2 ph nylindole EDTA Acide thyl ne diamine t trac tique FGFR3 Fibroblast Growth Factor Receptor 3 FISH Fluorescence In Situ Hybridization FITC Isothiocyanate de fluoresc ine Ig Immunoglobuline IGH Cha ne lourde des immunoglobulines IL 6 Interleukine 6 kb Kilobase s LF Lymphome folliculaire Mb M gabase s MM My lome Multiple MTC Major Translocation cluster PAC P1 Artificial Chromosome PBS Phosphate Buffered Saline PCL Leuc mie plasmocytaire SB Southern Blot SSC Sodium Saline Citrate EPHE Banque de Monographies SVT TE Tris EDTA TN Tris NaCl TNB Tris Nacl Blocking reagent TNT Tris NaCl Tween 20 VH Partie variable du g ne des immunoglobulines YAC Yeast Artificial Chromosome INTRODUCTION Les lymphopathies B malignes regroupent toutes les pathologies caract ris es par une accumulation de cellules pr B B ou plasmocytaires dont le my lome multiple et l
34. ons in multiple myeloma and primary plasma cell leukemia at diagnosis Hum Mutat 2001 18 3 212 24 Borson ND Lacy MQ et Wettstein PJ Altered mRNA expression of Pax5 and Blimp 1 in B cells in multiple myeloma Blood 2002 100 13 4629 4639 Brunner RM Goldammer T Furbass R Vanselow J Schwerin M Genomic organization of the bovine aromatase encoding gene and a homologous pseudogene as revealed by DNA fiber FISH Cytogenet Cell Genet 1998 82 1 2 37 40 Brunning RD McKenna RW Atlas of tumor athology Tumors of the bone marrow Armed Forces Institute of Pathology 1994 third serie fascicule 9 323 351 EPHE Banque de Monographies SVT 24 Chesi M Nardini E Brents LA Schrock E Ried T Kuehl WM Bergsagel PL Frequent translocation t 4 14 p16 3 q32 3 in multiple myeloma is associated with increased expression and activating mutations of fibroblast growth factor receptor 3 Nat Genet 1997 16 3 260 4 Chesi M Bergsagel PL Shonukan OO Martelli ML Brents LA Chen T Schrock E Ried T Kuehl WM Frequent dysregulation of the c maf proto oncogene at 16q23 by translocation to an Ig locus in multiple myeloma Blood 1998 91 12 4457 63 Chesi M Kuehl WM Bergsagel PL Recurrent immunoglobulin gene translocations identify distinct molecular subtypes of myeloma Ann Oncol 2000 11 Suppl 1 131 135 Dalton WS Bergsagel PL Kuehl WM Anderson KC Harousseau JL Multiple myeloma Hematology Am Soc
35. pparition de mutations ponctuelles si geant dans et autour du premier exon Ces v nements peuvent d sensibiliser le premier exon vis vis de facteurs trans r gulateurs ou cis r gulateurs ou encore de stabiliser la dur e de vie normalement br ve du messager 5 3 2 Le lymphome folliculaire La translocation t 14 18 est d tect e dans au moins 85 des lymphomes folliculaires Le g ne C MYC joue galement un r le dans le lymphome folliculaire surtout la phase de transformation car il peut tre d r gul par sa juxtaposition avec le locus des JGH ou des JGL sur le chromosome 14 D ot l action synergique de la d r gulation des g nes BCL 2 et C MYC Nacheva et al 1993 Il a t galement observ que la r gion 9q13 qui contient le g ne PAXS est d l t e dans certains lymphomes Lerner 2003 La translocation t 8 9 q24 1 p13 3 a t mise en vidence dans deux lign es de lymphome folliculaire par Nacheva et son quipe en 1993 mais les points de cassure et les m canismes sont encore obscurs L objectif principal de ce travail est de caract riser les r arrangements mol culaires de C MYC dans ces deux mod les de lymphopathies B BIBLIOGRAPHIE Anderson K C Shaughnessy J D Barlogie B Harousseau J L Roodman G D Multiple myeloma Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2002 214 40 Avet Loiseau H Li JY Facon T Brigaudeau C Morineau N Maloisel F Rapp MJ Talmant P
36. rurgicale ou la chimioth rapie qui est compos e de l association de cyclophosphamide vincristine et prednisone puis administr e en g n ral en situation adjuvante apr s radioth rapie gt Pour les formes diss min es stade 3 et 4 Il y a diff rents traitements l abstention de faible masse tumorale la radioth rapie la monochimioth rapie la polychimioth rapie avec un cocktail de type CHOP l irradiation corporelle totale et l interf ron a Pour les lymphomes indolents il n y a pas de chimioth rapie curative et la r mission compl te est rarement obtenue L introduction r cente du Rituximab anti CD20 humanis modifie la prise en charge th rapeutique actuelle 3 LE GENE DES IMMUNOGLOBULINES 3 1 Structure des immunoglobulines Les lymphocytes B poss dent une immunoglobuline membranaire appel e BCR form e de quatre cha nes polypeptidiques identiques deux deux deux cha nes l g res L k ou et deux cha nes lourdes H u y1 y2 y3 y4 al a2 e Les cha nes L sont form es de deux domaines un domaine variable distal VL et un domaine constant proximal CL Les cha nes H comportent un domaine N terminal variable VH et 3 y a ou 4 u domaines constants CH L association des parties variables d une cha ne lourde et d une cha ne l g re constitue le site de liaison pour l antig ne Le type de la cha ne lourde d finit la classe et la sous classe de l
37. s lymphocytes B Le premier stade de diff renciation correspond aux recombinaisons qui aboutissent la constitution d un g ne de cha ne lourde u fonctionnel puis la synth se de la cha ne correspondante Le pr curseur le plus immature engag dans la diff rentiation B est le lymphocyte pro B A ce stade les segments DH et JH sont r arrang s Cette premi re recombinaison se produit entre l un des segments DH pris au hasard et l un des segments JH pris au hasard Le lymphocyte pro B passe au stade pr B apr s une deuxi me recombinaison qui met bout a bout un segment VH pris au hasard et le complexe D J r sultant de la premi re recombinaison Ces deux recombinaisons n cessitent l intervention de deux g nes Recombination Activating Gene 1 et 2 RAG J et RAG 2 qui codent pour des recombinases La recombinase produit du g ne RAG J a une activit d endonucl ase et de ligase Elle reconna t deux s quences constitu es chacune d un heptam re et d un nonam re situ es en 3 des segments V en 3 et 5 des segments D et en 5 des segments J Les deux heptam res et les deux nonam res s associent permettant de mettre bout bout les segments DH et JH puis les segments VH et le complexe D J L ADN interm diaire est limin par d l tion sous forme de boucle d excision Le produit du g ne RAG2 amplifie d un facteur 1000 l activit de RAG 1 Ces recombinaisons somatiques comportent un nombr
38. s passent d une phase quiescente GO une phase de croissance Cependant l expression de c myc persiste au cours des phases Gl S G2 et M La surexpression de emyc favorise la transition G1 S et la progression dans le cycle cellulaire mais va galement inhiber certains processus de diff renciation cellulaire donc provoque la mort par apoptose 5 2 G n ralit s sur le g ne PAX5 Le g ne PAXS se situe dans la r gion q13 du chromosome 9 et couvre 200 713 paires de bases il est constitu en 10 exons Pax5 1 PaxS 10 Il code un facteur de transcription BSAP B cell specific activator protein cette prot ine est form e de 391 acides amin s Ce facteur de transcription joue un r le dans l h matopo se humaine et principalement exprim dans les premi res tapes du d veloppement des cellules B Cette prot ine r gule la prolif ration et la diff renciation des cellules B ainsi que le maintien de EPHE Banque de Monographies SVT 21 l identit des cellules B PAXS joue galement un r le dans le d veloppement neural et la spermatog n se 5 3 Remaniements mol culaires de C MYC et PAX5 5 3 1 Le my lome multiple La d r gulation du g ne C MYC peut tre due des translocations mettant les s quences codantes du g ne C MYC sous la d pendance de r gions r gulatrices activatrices des g nes des immunoglobulines Ces cas se traduisent par des translocations t 8 314 t 8 22 et t 2 8 observ es d
39. s patients Le taux de b2 micoglobuline s rique est fr quemment lev valeur normale chez l adulte de 1 0 2 5 mg L Une accumulation de plasmocytes est observ e sur le my logramme qui pr sente un envahissement de la moelle osseuse par des cellules plasmocytaires Si le pourcentage de plasmocytes souvent anormaux est sup rieur 10 ce crit re est en faveur d un MM Mais cet argument doit s ajouter une immunoglobuline monoclonale ou des l sions squelettiques 1 5 3 R arrangements cytog n tiques L analyse cytog n tique permet d tablir la pr sence d anomalies r currentes num riques et structurales On constate les gains principalement des chromosomes impairs 3 5 7 9 11 15 19 et 21 ainsi on obtient des clones hyperdiplo des Des pertes touchent pr f rentiellement le chromosome 13 ce qui entra ne une monosomie du 13 et plus rarement les chromosomes 8 14 et X chez la femme On constate des anomalies structurales au niveau du chromosome 1 des r arrangements du chromosome 14q32 une d l tion du chromosome 13q14 dans 43 des MM au diagnostic ou en rechute Avet Loiseau 2002 des r arrangements du chromosome 14q32 avec des chromosomes partenaires 11q13 4p16 16q32 8q24 etc Le r arrangement du 14q32 se d roule avec beaucoup de g nes partenaires diff rents figures 4 et 5 1p13 1p21 3p11 6p21 6p25 7q11 7q32 11q23 12q24 13q22 16q24 18q21 21q22 et22q11 Bergsagel 1996
40. ssoci s a l apparition des ces deux lymphopathies B chez l homme GENERALITES 1 LE MYELOME MULTIPLE 1 1 D finition Le my lome multiple ou maladie de Kahler est une prolif ration intra m dullaire maligne de cellules plasmocytaires au niveau de la moelle osseuse sous forme nodulaire et parfois diffuse Ce d veloppement d un clone de plasmocytes tumoraux est responsable d une destruction osseuse d une inhibition de l h matopo se normale et parfois d une insuffisance m dullaire Le MM s accompagne d une s cr tion d immunoglobulines monoclonales parfois responsable de manifestations r nales neurologiques et d amylose 1 2 Epid miologie EPHE Banque de Monographies SVT 6 L incidence du MM dans les pays occidentaux est de 3 4 pour 100 000 habitants par an Le nombre de cas nouveaux par an est en augmentation constante Grosbois et al 2002 et repr sente entre 2000 et 2500 malades par an en France Le MM repr sente 1 des tumeurs malignes et 10 des h mopathies Cette pathologie est deux fois plus commune chez les Afro am ricains que chez les Caucasiens Brunning et al 1994 Une sensible pr disposition masculine montre que 1 1 1 5 hommes sont affect s pour une femme L incidence augmente avec l ge avec une m diane 70 ans au moment du diagnostic Le MM est rarement diagnostiqu chez les individus de moins de 35 ans moins de 2 ont moins de 40 ans et 3 ont plus de 8
41. t C qui ne contient pas d intron A la diff rence des g nes codant les cha nes x il existe au moins 6 segments C diff rents chacun tant pr c d d un seul segment J qui lui est propre Les m canismes de recombinaison et de synth se impliqu s pour les cha nes l g res sont les m mes que ceux des cha nes lourdes Le premier r arrangement fonctionnel bloque les suivants Le lymphocyte B diff renci n exprime qu un seul segment recombin VH DH JH et une seule cha ne l g re dans deux tiers des cas ou dans un tiers des cas Il quitte alors la moelle osseuse et migre dans la pulpe rouge de la rate ou dans les organes lymphoides secondaires Le lymphocyte B circulant mature coexprime sa surface IgM et IgD par un m canisme d pissage alternatif 3 4 Diff renciation d pendante de l antig ne Dans le centre germinatif des tissus lymphoides le lymphocyte B poursuit sa diff rentiation sous l action de cytokines en troite collaboration avec les cellules T et les cellules dendritiques folliculaires qui vont lui permettre de devenir sp cifique d un antig ne La maturation du lymphocyte B lors de la r ponse immune B secondaire correspond des modifications morphologiques immunoph notypiques et mol culaires Deux v nements mol culaires les mutations somatiques et la commutation isotypique sont l origine des modifications au niveau des g nes des immunoglobulines Le ph nom ne d
42. t se localisent principalement au niveau du squelette axial rachis c tes et bassin Les plasmocytes d truisent l os par s cr tion de facteurs solubles qui activent les ost oclastes p ri tumoraux Une insuffisance r nale est caus e par la n phrotoxicit des cha nes l g res Des complications neurologiques sont la cons quence de la compression m dullaire Le syndrome d hyperviscosit est le r sultat de la concentration trop l v e et des propri t s biochimiques des immunoglobulines L hypercalc mie est li e l importance de l ost olyse et ses principales manifestations cliniques sont digestives neurologiques cardio vasculaires et m taboliques EPHE Banque de Monographies SVT 9 L amylose due l infiltration des tissus exemple rein ou foie par des substances amylo des 1 5 2 Manifestations biologiques Un pic d immunoglobuline monoclonale peut tre d tect par lectrophor se et immunofixation des prot ines s riques et urinaires chez environ 80 des patients atteints de MM Dans ce cas le taux des autres classes d Ig est abaiss Environ 55 des MM sont IgG 25 sont IgA 15 sont des my lomes cha nes l g res et 5 restant sont constitu s de variants rares La vitesse de s dimentation est souvent tr s augment e et peut d passer 100 mm la premi re heure Elle peut tre normale dans les MM cha ne l g re et non s cr tant Une an mie est constat e chez 65 de
43. tate la translocation t 14 18 mais galement des anomalies structurales gain d une partie du 18 et du 8 gain des chromosomes entiers X 7 et 2 perte d une partie du 6 et du 17 2 5 Traitements 2 5 1 Facteurs pronostiques Il a t tabli une liste de facteur de mauvais pronostic NES RMS SR RS Age sup rieur 60 70 ans Sexe masculin Lymphome folliculaire grandes cellules Architecture folliculaire et diffuse Index prolif ratif lev Pr sence de certaines anomalies g n tiques Plus d une localisation extraganglionnaire Tumeur de diam tre sup rieur 7 10 cm Infiltration m dullaire importante An mie Augmentation des LDH s riques Augmentation de la b2 microglobuline s rique 2 5 2 Les traitements Le traitement d pend de l ge du stade localis ou diss min du stade tabli selon la classification de Ann Arbor et de l importance de la masse tumorale EPHE Banque de Monographies SVT 14 gt Pour les formes localis es stade 1 et 2 La radioth rapie exclusive sur l aire ganglionnaire atteinte a t longtemps le traitement de r f rence Le taux de rechute locale est inf rieur 10 et la survie sans rechute 10 ans apr s radioth rapie exclusive des stades localis s est d environ 50 Les facteurs d chec du traitement sont l ge des sympt mes B le stade de la maladie et l importance du volume tumorale On utilise galement l ex r se chi
44. tiques 14q32 et d l tion du 13 le type d Ig et les sous types des cha nes l g res et le diagnostic clinique Les translocations 14q32 repr sentent l v nement le plus pr coce de l oncogen se du MM principalement avec les partenaires 4p16 11q13 et 16q23 Ces translocations utilisent le plus souvent les zones switch lors de la commutation isotypique et favorisent une instabilit chromosomique La d l tion du chromosome 13 serait le deuxi me v nement qui succ derait pr f rentiellement aux t 4 514 et t 14 16 Dans cette tude 25 des patients ne pr sentent aucun r arrangement du 14q32 Les translocations t 4 14 t 14 16 et certaines t 11 14 provoquent un MM de novo chez les patients Au contraire les patients n exprimant pas de r arrangement du 14q32 ou un r arrangement avec des partenaires plus rares d veloppent un stade interm diaire de MGUS avant apparition d un MM 1 5 Diagnostic clinique biologique et cytog n tique 1 5 1 Manifestations cliniques Le diagnostic du MM se fait le plus souvent chez un patient symptomatique L infiltration tumorale peut int resser la rate le foie les ganglions le plus souvent sans retentissement clinique Dans les autres cas les douleurs osseuses une alt ration de l tat g n ral ou la d couverte d anomalies biologiques sont les circonstances habituelles du diagnostic Les douleurs osseuses sont pr sentent au diagnostic dans 70 des cas e
45. uline monoclonale et de l sions osseuses Les analyses tog n tiques montrent de multiples anomalies chromosomiques de nombre ou de structure Le g ne codant ur les cha nes lourdes des immunoglobulines en 14q32 est r arrang dans la plupart des lign es et dans 60 15 des patients De nombreux partenaires du chromosome 14q32 ont t identifi s Les plus courants sont r gion 11q13 codant pour la cycline D1 la r gion 4p16 impliquant le g ne FGFR3 et la r gion 16q24 ntenant le g ne C MAF Les r arrangements avec ces trois partenaires sont pr coces dans l oncogen se du v lome multiple Par contre l oncog ne C MYC positionn en 8q24 est d r gul par les enhancers de la zion constante des immunoglobulines lors d un stade plus tardif de l oncogen se du my lome multiple La expression de la prot ine c myc participe l immortalisation des cellules La technique d hybridation in u en fluorescence sur fibres d ADN ou Fiber FISH permet de visualiser les remaniements chromosomiques de localiser les points de cassure au niveau des deux chromosomes partenaires avec une grande pr cision majorit des r arrangements comme les translocations les insertions les d l tions et les inversions plique une r gion switch situ e en amont de la plupart des g nes de la r gion constante des munoglobulines Dans les lign es de MM poss dant une insertion ou une translocation t 8 14 les zones itch mais galement des r gions loign
46. x des cellules centro folliculaires normales Au niveau de leur architecture on note un d veloppement exag r des centres germinatifs aux d pens de la couronne lymphocytaire du manteau qui se trouve tr s r duite voire absente Parfois dit indolent le lymphome folliculaire a une volution lente mais in luctable 2 2 Epid miologie Le lymphome folliculaire repr sente 20 30 des lymphomes non hodgkiniens en Europe et aux Etats Unis L incidence est en augmentation dans les pays d velopp s En France on diagnostique environ 2000 nouveaux cas par an L ge m dian lors du diagnostic de ce lymphome est de 54 ans et une pr pond rance masculine est constat e avec 1 27 hommes pour une femme On observe une incidence plus faible dans l ethnie asiatique avec moins de 10 de lymphome folliculaire en Asie La survie m diane est de 9 ans Au fur et mesure de l volution du lymphome folliculaire le taux de r ponse au traitement diminue la dur e de r ponse est de plus en plus br ve et la quasi totalit des malades d c de de leur h mopathie B Les facteurs de risques sont le plus souvent inconnus 2 3 Oncogen se Les v nements au cours de l oncogen se du lymphome folliculaire restent encore inconnus mais diff rents r arrangements mol culaires sont rep r s lors de la transformation histologique du lymphome folliculaire La translocation t 14 18 q32 q21 est d tect e chez 75 85 des patients
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