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Facteurs prédictifs de réponse aux thérapies ciblées anti

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1. Consommer aussi chaque jour d autres aliments contenant des fibres tels que les aliments c r aliers peu transform s et les l gumes secs e Satisfaire les besoins nutritionnels par une alimentation quilibr e et diversifi e sans recourir aux compl ments alimentaires Allaitement e Pour le b n fice de la m re et de l enfant allaiter son enfant e Allaiter si possible de fa on exclusive et id alement jusqu l ge de 6 mois Viandes rouges et charcuteries e Limiter la consommation de viandes rouges moins de 500 g par semaine Pour compl ter les apports en prot ines il est conseill d alterner avec des viandes blanches du poisson des ufs et des l gumineuses e Limiter la consommation de charcuteries en particulier celles tr s grasses et ou tr s sal es En cas de consommation de charcuteries afin de diminuer le risque de cancers r duire autant que possible la taille des portions et la fr quence de consommation Sel et aliments sal s e Limiter la consommation de sel en r duisant la consommation d aliments transform s sal s charcuteries fromages et l ajout de sel pendant la cuisson ou dans l assiette Compl ments alimentaires base de b ta carot ne Ne pas consommer de compl ments alimentaires base de b ta carot ne e Sauf cas particuliers de d ficiences et sous le contr le d un m decin la consommation de compl ments alimentaires n est pas recom mand e
2. Isabelle BERTRAND Microbiologie environnementale Michel BOISBRUN scccceeeseeeees Chimie th rapeutique Fran ois BONNEAUX Chimie th rapeutique Ariane BOUDIER nos Chimie Physique C dric BOURA RRR Physiologie Jean Claude CHEVIN ooccccccononononnncnnnns Chimie g n rale et min rale SO CLARO Tao Chimie analytique Jo l COULO Na ro ro Biochimie S bastien DADE Bio informatique Dominique DECOLIN Chimie analytique B atrice DEMORE Pharmacie clinique Jo l DUCOURNEAU Biophysique audioproth se acoustique Florence DUMARCAY Chimie th rapeutique Francois DUPU Sinai Pharmacologie Rapha l DUVALU Microbiologie clinique B atrice FAIVRE coooncocicnccconoconicconnconcnnnnncnnnnos H matologie G nie Biologique Adel FA Zac carita Biophysique acoustique Luc FERRAR oesi os Toxicologie St phane GIBAUD occcccnonoccccncninnnnnnns Pharmacie clinique Parente Sandra Juin 2010 Page 5 sur 128 Thierry HUMBERT cocccnocononccccnnnonnnnns Chimie organique Fr d ric JORAND ccooocoooccccncnonnonnnnnnnos Sant et environnement Olivier JOUBERT Toxicologie s curit sanitaire Francine KEDZIEREWICZ 0000 Pharmacie gal nique Alexandrine LAMBERT ss ccccceeeeeees Informatique Biostatistiques Faten MERHI SOUSSI H matologie biologique Christophe MERLIN n se Microbiologie en
3. soit on observe une perte d expression de PTEN dans les tumeurs L absence de la prot ine PTEN est observ e dans 30 des cancers colorectaux Thomas 2004 Parente Sandra Juin 2010 Page 77 sur 128 Pour d montrer le r le pr dictif de r ponse aux traitements monoclonaux Frattini et son quipe Frattini 2007 ont montr que l absence de cette prot ine peut tre consid r e comme un facteur pr dictif de r sistance aux traitements par c tuximab Frattini a r alis une tude sur 27 patients atteints de CCRm 11 patients pr sentent une perte de la prot ine PTEN et aucune r ponse au traitement par anticorps anti EGFR La prot ine PTEN t dos es sur les 16 autres patients 10 d entre eux sont r pondeurs au traitement Les 6 autres sont non r pondeurs au traitement par anti EGFR 4 6 pr sentent une mutation KRAS tableau 5 De m me que pour BRAF la valeur pr dictive de r ponse au traitement est controvers e laurent Puig 2009 Laurent Puig montre seulement un effet sur la suivie globale de PTEN et lui attribue plut t une valeur pronostic Tableau 5 Tableau r capitulatif de la r ponse de 27 patients au traitement par anti EGFR Frattini 2007 Patient sans PTEN Patient avec PTEN 11 16 R ponse au traitement 0 10 Pas de r ponse au 11 6 traitement Parente Sandra Juin 2010 Page 78 sur 128 gt EGFR by FISH on primary tumour NT Ghromosome7 EGFR
4. Bull Cancer 2004 91 303 315 Parente Sandra Juin 2010 Page 116 sur 128 Parker S Tony Tong Sherry Bolden Phyllis A Wingo Cancer Statistics CA Cancer J clin 1997 47 5 27 Parkin DM Bray F Ferlay J Pisani P Estimating the world cancer burden GLOBOCAN 2000 Inst J Cancer 2001 94 153 156 Park JG Park YJ Wlijnen JT Vasen H Gene environnement interaction in hereditary nonpolyosis colorectal cancer with implications for diagnosis and genetic testing Int J Cancer 1999 82 516 519 Perkins G Li vre A Ramacci C M atchi T de Reynies A Emile JF et al Additional value of EGFR downstream signaling phosphoprotein expression to KRAS status for response to anti EGFR antibodies in colorectal cancer Int J Cancer 2010 Prenen H De Schutter J Jacobs B De Roock W Biesmans B Claes B et al PIK3CA mutations are not a major determinant of resistance to the Epidermal Growth Factor Receptor inhibitor cetuximab in metastatic colorectal cancer Clin Cancer Res 2009 15 3184 3188 Perez Soler R Can rash associated with HER1 EGFR inhibittion be used as a marker of traetment outcome Oncology 2003 17 33 38 P rez Soler R Delord JP Halpern A Kelly K Krueger J Sureda BM et al HER1 EGFR Inhibitor Associated Rash Future Directions for Management and Investigation Outcomes from the HER1 EGFR Inhibitor Rash Management Forum Oncologist 2005 10 345 356 Prin Mathieu C Aguilar P B n MC
5. D exercer dans l int r t de la sant publique ma profession avec conscience et de respecter non seulement la l gislation en vigueur mais aussi les r gles de l honneur de la probit et du d sint ressement De ne jamais oublier ma responsabilit et mes devoirs envers le malade et sa dignit humaine en aucun cas je ne consentirai utiliser mes connaissances et mon tat pour corrompre les m urs et favoriser des actes criminels Que les hommes m accordent leur estime si je suis fid le mes promesses Que je sois couvert d opprobre et m pris de mes confr res si jy manque Parente Sandra Juin 2010 Page 8 sur 128 LA FACULTE N ENTEND DONNER AUCUNE APPROBATION NI IMPROBATION AUX OPINIONS EMISES DANS LES THESES CES OPINIONS DOIVENT ETRE CONSIDEREES COMME PROPRES A LEUR AUTEUR Parente Sandra Juin 2010 Page 9 sur 128 REMERCIEMENTS A mon directeur de th se et pr sident du jury Monsieur le professeur Jean Louis Merlin Merci pour votre aide votre disponibilit et tous vos bons conseils Que se travail soit le t moignage de ma reconnaissance et de mon profond respect Merci Mme Demor et Mme Kaminsky pour avoir accept d tre membre de ce jury Merci mes ma tres de stage officinaux et mon ma tre de stage hospitalier ainsi que toutes leurs quipes Je vous suis reconnaissante du savoir et de l art de la pharmacie que vous avez su me transmettre Merci pour tous ces
6. Faure G Kolopp Sarda MN Anticorps monoclonaux anticorps th rapeutiques Revue Fran aise des Laboratoires 2003 357 31 39 S Samowitz WS Albertsen H Sweeney C Herrick J Caan BJ Anderson KE et al Association of Smoking CpG Island Methylator Phenotype and V600E BRAF Mutations in Colon Cancer J Natl Cancer Inst 2006 98 1731 1738 Schneider Merck T Lammerts van Bueren JJ Berger S Rossen K van Berkel PH Derer S Beyer T et al Human lgG2 antibodies against epidermal growth factor receptor effectively trigger antibody dependent cellular cytotoxicity but in contrast to IlgG1 only by cells of myeloid lineage J Immunol 2010 184 512 520 Parente Sandra Juin 2010 Page 117 sur 128 Segaert S Van CE Clinical signs pathophysiology and management of skin toxicity during therapy with epidermal groth factor receptor inhibitors Ann Oncol 2005 16 1425 1433 Siena S Sartore Bianchi A Di Nicolantonio F Balfour J Bardelli A Biomarkers Predicting Clinical Outcome of Epidermal GrowthFactor Receptor Targeted Therapy in Metastatic Colorectal J Nat Cancer Inst 2009 101 1308 1324 Souglakos J Philips J Wang R Marwah S Silver M Tzardi M et al Prognostic and predictive value of common mutations for treatment response and survival in patients with metastatic colorectal cancer Br J Cancer 2009 101 465 472 Spano JP Vignot S R cepteurs de l EGF dans les cancers colorectaux ciblage et
7. H matologie Oculaire auditif SURVEILLANCE Mol cules en cause Oxaliplatine 5 fluoro uracile 5 fluoro uracile Oxaliplatine 5 fluoro uracile Irinot can panitumumab Oxaplatine oxaliplatine raltitrexed Oxaliplatine C tuximab Panitumumab Bevacizumab Oxaliplatine Oxaliplatine panitumumab Apr s un traitement curatif il faut pouvoir e D celer les r cidives e Traiter les complications e Prendre en charges les s quelles e Faciliter la r insertion socioprofessionnelle Parente Sandra Juin 2010 Pr vention Protocole anti m tique lop ramide Remise en tat de la dentition et bains de bouche Port de casque r frig rant R versible Hyperhydratation avant et apres la chimioth rapie Emollients viction solaire toilette avec un pain dermatologique Surveillance tensionnelle Erythopo tine G CSF fer transfusion Hydratation occulaire Page 46 sur 128 PARTIE II Les th rapies cibl es Anti EGFR Parente Sandra Juin 2010 Page 47 sur 128 l QU EST CE QUE L EGFR 1 Structure EGFR ou Epidermal Growth Factor R ceptor est une glycoprot ine transmembranaire de 170 kDA pr sente la surface des cellules Il appartient la famille des HER Les r cepteurs HER sont compos s d une portion extracellulaire avec un domaine de glycosylation du ligand d un domaine transmembranaire et d une r gion intracellulaire activit tyrosine kinase figure
8. Hybidromas screened for io antibody production 3 Antibody producing hybridomas cloned Monoclonal antibodies isolated for cultivation Figure 21 La production des anticorps monoclonaux Parente Sandra Juin 2010 Page 59 sur 128 Les Ac monoclonaux ont une nomenclature sp cifique qui permet de conna tre leur origine Tous les anticorps monoclonaux finissent par mab La syllabe juste avant le mab d finit la source figure 22 Si la terminaison est e umab c est un Ac monoclonal humain e zumab c est un Ac monoclonal humanis e ximab c est un Ac monoclonal chim rique e momab c est un Ac monoclonal murin La pathologie est identifi e par la syllabe avant la source par tu pour tumeur USAN Un anticorps chim rique est caract ris par un Fab murin et un Fc humain C est le cas du c tuximab Un anticorps humanis se caract rise par la pr sence de r gions hypervariables de souris ou de rat a la place de celles humaines C est le b vacizumab Un anticorps humain n a aucun domaine murin C est le panitumumab Evolution chronologique de lhumanisation des anticorps monocionaux th rapeutiques Fragments murins N 4 Fragments humains Ac murins Ac chim riques Ac humanises Ac humains momab ximab zumab umab Humanisation Immunog nes Moins immunog nes Figure 22 Evolution chronologique des anticorps monoclonaux Prin Mathieu 2003 Paren
9. aliser cette partie j ai effectu un stage au sein de la plateforme L obtention d un r sultat fiable dans un d lai compatible avec l instauration du traitement repose sur la collaboration entre le clinicien le pathologiste et le laboratoire de g notypage KRAS figure 33 Parente Sandra Juin 2010 Page 84 sur 128 Pathologiste Demande de Envoi des chantillons g notypage KRAS Etapei SRE tumoraux au laboratoire de g notypage Etape 3 Laboratoire r alisant le g notypage iii Transmission des r sultats aux intervenants i et renvoi du bloc au laboratoire d anatomopathologie Figure 33 Interaction entre le prescripteur le pathologiste et le laboratoire La tumeur a t pr alablement fix e au formol Le pathologiste re oit les demandes de g notypage KRAS des cliniciens annexe 2 Il d sarchive les pr l vements tumoraux du patient c est dire qu il r cup re les anciens pr l vements et s lectionne les blocs repr sentatifs de la tumeur Enfin il exp die le bloc avec le compte rendu la plateforme de g notypage Les techniciens du CAV re oivent un bloc de paraffine contenant le tissu analyser provenant soit de la tumeur primitive soit des m tastases Bibeau 2009 Ce bloc est d coup au microtome en ruban de 5 micron d paisseur figure 34 Figure 34 Microtome et ruban de paraffine Parente Sandra Juin 2010 Page 85 sur 128 Une partie du ruban est d pos e sur une lame pui
10. de 2 cha nes l g res identiques L ou Light et de 2 cha nes lourdes identiques H ou Heavy Les 2 cha nes lourdes sont li es entre elles par des ponts disulfures et chaque cha ne lourde est li e par un pont disulfure une chaine l g re figure 16 Alzari 1988 Au niveau des cha nes L il existe 2 domaines VL et CL et pour la cha ne H il y a un domaine VH et plusieurs domaines CH Sur les domaines VH et VL se trouvent les CDR Complementary Determining Region figure 17 Ce sont des zones hypervariables Ces zones sont s par es par des r gions charpentes FR Framework qui sont des zones plus conserv es CDR et FR forment le paratope reconnaissant l Ag Parente Sandra Juin 2010 Page 54 sur 128 5 5 oe h inge region H H Key features of the protein structure of human lgS immunoglobulin molecules Expert Reviews in Molecular Medicine 211999 Cambridge University Fresa Figure 17 Les diff rents domaines d un anticorps 2 Liaison Ag Ac Lorsque l Ac se fixe l Ag figure 18 la combinaison des deux forme un immun complexe L interaction Ag Ac implique plusieurs types de forces Novotny 1992 e Electrostatique e Hydrog ne e Van der Walls e Hydrophobe Parente Sandra Juin 2010 Page 55 sur 128 N Antig ne lier Ps si Anticorps 19G Figure 18 Repr sentation de l interaction antig ne anticorps 3 Action Les Ac permettent la destruction des Ag Notamment apr
11. de Pharma Le Pr sident de l Universits Henri Poi N i de l Universit Henri Poincar Nancy 1 Pa ey Pour le Pr sident et par Dgation La Vice Pr sidente du Consell es de la Vie Universitaire Parente Sandra Juin 2010 Page 127 sur 128 N d identification TITRE Diagnostic mol culaire des cancers colorectaux m tastasiques Facteurs pr dictifs de r ponse aux th rapies cibl es anti EGFR et organisation du g notypage KRAS en Lorraine Th se soutenue le 17 juin 2010 par PARENTE Sandra RESUME Avec environ 30 000 nouveaux cas par an le cancer colorectal est un probl me majeur de sant publique en France C est le deuxi me cancer le plus meurtrier apr s celui des poumons dans les pays occidentaux Le d pistage joue un r le fondamental dans la d tection pr coce de ce cancer La chirurgie et la chimioth rapie sont les deux strat gies th rapeutiques utilis es en cas de cancer colorectal Et selon le stade de la maladie l une ou l autre ou les deux serviront prendre en charge le patient L arsenal th rapeutique mis la disposition du clinicien voluer r cemment avec l apparition des th rapies cibl es notamment anti EGFR c tuximab et panitumumab Ces th rapies sont utilis es en cas de cancer colorectal m tastasique pr sentant une tumeur non mut e au niveau du g ne KRAS Le traitement du cancer devient ainsi un traitement propre l tat pathologique de cha
12. m decins g n ralistes et des chirurgiens Ils repr sentent 18 5 28 E oncologue E gastro ent rologue h Autres Parente Sandra Juin 2010 Page 102 sur 128 Les soignants sont en majorit des professionnels du secteur public ou des PSPH E Priv E PSPH h Public b Nos changes Avez vous facilement eu acc s nos coordonn es t l phoniques et de t l copie En cas de n cessit avez vous pu nous joindre facilement par t l phone Les soignants disent avoir eu tr s facilement acc s aux coordonn es t l phoniques et de t l copie M me en cas de n cessit il a tait facile de joindre la plateforme par t l phone E OUI E NON Lors d entretiens t l phoniques avez vous obtenu les renseignements attendus La plateforme a su r pondre aux questions des professionnels La feuille de prescription du g notypage KRAS vous convient elle Un exemple de la fiche de prescription du g notypage KRAS est visible en annexe 2 Il n y a rien redire sur la feuille du g notypage KRAS Parente Sandra Juin 2010 Page 103 sur 128 c Les d lais Vos demandes de g notypages KRAS sont elles trait es dans des d lais satisfaisants Si non quel serait le d lai maximal que vous souhaiteriez voir respecter Les trois quart des professionnels estiment que leur demande de g notypage est trait e dans des d lais satisfaisants Ceux restants ne sont pas satisfaits du
13. ne un ph notype R plication Error RER positif associ une instabilit microsatellitaire MSI Les cellules tumorales exprimant ce ph notype sont donc instables Le diagnostic mol culaire du syndrome de Lynch est bas sur l analyse des g nes touch s par la mutation g ne MSH2 g ne MLH1 g ne MSH6 Park 1999 Les patients porteurs de la mutation peuvent d velopper un cancer du colon et du rectum un cancer de l endom tre de l estomac de l ovaire de l uroth lium ou des voies biliaires Olschwang 2004 b PAF Elle se caract rise par une multitude de polypes diss min es sur le colon et le rectum La transmission est autosomique dominante dans le cas du g ne APC localis au chromosome 5 et autosomique r cessive dans le cas du g ne MYH Deux formes de PAF existent e La forme typique o APC une p n trance de 100 e La forme att nu e o APC ou MYH ont une p n trance inf rieur a 100 Parente Sandra Juin 2010 Page 29 sur 128 La PAF se manifeste par plus de 100 ad nomes coliques Mais la maladie peut tre att nu e si le nombre de polype est compris entre 10 et 100 Ill PREVENTION SECONDAIRE Selon l OMS la pr vention secondaire vise la d tection pr coce des maladies dans le but de les d couvrir un stade o elles peuvent tre trait es Dans le cas du cancer le d pistage consiste d tecter son stade le plus pr coce gu rison 9 fois sur 10 un stade ou d
14. tre corr l e l efficacit du traitement dans le CCR et le carcinome pidermoide de la t te et du cou Van Cutsem 2004 La s v rit du la r action cutan e est class e en grade tableau 6 Tableau 6 Les effets secondaires cutan s des traitements par anti EGFR Effet secondaire Grade 1 Grade 2 Grade 3 Grade 4 Grade 5 Atteinte des ongles Koilonychie changements Perte partielle ou compl te Interf re avec les AVJ de coloration d formations de l ongle douleur du lit de Pongle Photosensibilit Eryth me non douloureux Eryth me douloureux Interf re avec les AVJ L ger ou localis Intense ou tendu Intense ou tendu Dermatite interf re avec les AVJ g n ralis e exfoliative ulc rative ou bulleuse Rash desquamation Maculaire ou papulaire ou Eruption maculaire ou Erythrodermie ryth me sans sympt mes papulaire ryth me g n ralis e ou associ s prurigineux ou associ ruption maculaire d autres sympt mes papulaire ou Desquamation localis e ou pustuleuse autres l sions couvrant Desquamation couvrant moins de 50 de la plus de 50 de la surface corporelle surface corporelle Rash accompagn de douleur d figuration ulc rations ou desquamation Le rash serait d l inhibition de HER1 au niveau de la peau Perez Soler 2005 En effet HER1 est exprim au niveau des k ratinocytes des follicules pileux de l piderme des glandes s bac es et crines Au
15. Ac monoclonal cahier scientifique AMGEN 2 Structure Le panitumumab est un anticorps monoclonal de la sous classe de l immunoglobuline G humaine produit partir d une lign e de mammif re CHO C est un anticorps enti rement humain 3 Mode d administration L administration se fait par perfusion intraveineuse l aide d une pompe perfusion 4 Pharmacodynamie Le panitumumab se lie avec une grande affinit EGFR humain inhibant ainsi l autophosphorylation du r cepteur La fixation EGFR entra ne e L internalisation de r cepteur e L inhibition du d veloppement cellulaire e L induction de l apoptose e Diminution d IL 8 et du facteur de croissance endoth lial vasculaire 5 Utilisation Vectibix est indiqu en monoth rapie pour le traitement des patients avec un cancer colorectal m tastatique exprimant EGFR et un KRAS non mut apr s chec des protocoles de chimioth rapie a base de fluoropyrimidine 5 FU oxaliplatine et irinot can Parente Sandra Juin 2010 Page 65 sur 128 Une tude internationale incluant 463 patients atteint de cancer colorectal m tastatique apr s chec des protocoles contenant de l oxaliplatine et de l irinot can a montr que le taux de progression de la maladie chez les patients trait s par panitumumab en association avec les soins palliatifs a t r duit de 40 par rapport des patients en soins palliatifs seul Le taux de survie est
16. En cas de n cessit avez vous pu nous joindre facilement par t l phone O Oui J Non 5 Lors d entretiens t l phoniques avez vous obtenu les renseignements attendus Oui Non 6 La feuille de prescription du g notypage KRAS vous convient elle J Oui O Non Si non quelles modifications souhaiteriez vous y voir apport es 7 Vos demandes de g notypage KRAS sont elles trait es dans des d lais satisfaisants O Oui 1 Non Si non quel serait le d lai maximal que vous souhaiteriez voir respect es Parente Sandra Juin 2010 Page 122 sur 128 8 En cas de retard d analyse avez vous t inform des probl mes rencontr s et du retard envisag O Oui 7 Non Si non comment pr f reriez vous tre inform O T l phone O Fax 9 Etes vous satisfait de la pr sentation du compte rendu d analyse O Oui O Non Si non quelles modifications souhaiteriez vous y apporter oer rere errr eerie reer errr EEE EEE EEE EEE EEE EE EE TT EE LE LEE LEE LITTLE IA TITI III rr I LITE LIT IT ET TETE 10 Pour les oncologues Estimez vous tre toujours en possession des r sultats de g notypage KRAS en temps utile pour pouvoir prendre les d cisions th rapeutiques T Oui Non Si non ce retard a t il une influence directe sur votre choix th rapeutique Oui O Non Si oui de quelle nature O Changement de strat gie th rapeutique Retard dans l instauration d une th rapie cibl e an
17. Evaluation de la chimioth rapie L efficacit du traitement est valu e sur le plan clinique et sur l imagerie apr s 3 mois de traitement Si le traitement a t efficace et que la taille de la tumeur a diminu e la chirurgie est alors envisageable Si malgr le traitement la tumeur a progress e il faut changer de protocole Parente Sandra Juin 2010 Page 44 sur 128 d Surveillance de la chimioth rapie Avant chaque cycle de chimioth rapie un bilan standard est effectu Il comprend e Examen clinique tat g n ral infection e H mogramme pour rechercher une neutrop nie une an mie ou une thrombop nie e Examens compl mentaires bas s sur l valuation de la fonction r nale et h patique En fonction de ces r sultats la cure peut tre report e e Effets ind sirables Les mol cules utilis es en chimioth rapie vont agir sur la tumeur mais galement sur les cellules saines Il en d coule des effets ind sirables qui peuvent affecter la qualit de vie du patient et entrainer dans certain cas l arr t du protocole de chimioth rapie tableau 4 Les effets ind sirables observ s d pendent des mol cules utilis es Parente Sandra Juin 2010 Page 45 sur 128 Tableau 4 Effets ind sirables de mol cules utilis es en chimioth rapie et pr vention Naus es vomissements diarrh e Mycose buccale Troubles neurosensoriels Alop cie Insuffisance r nale Rash Hypertension art rielle
18. Les ganglions distances du colon et du rectum sont galement analys s Extension m tastatiques Une m tastase est une tumeur maligne secondaire issue d un cancer primitif Les m tastases pulmonaires et h patiques sont fr quentes Mais l os et le cerveau peuvent galement tre touch s Si la pr sence de m tastases est Parente Sandra Juin 2010 Page 37 sur 128 av r e leurs traitements sont laiss s l valuation du praticien En effet il devra se poser la question de savoir si leurs traitements sont indispensables et quelles en seront les cons quences pour le patient Deux classifications existent e TNM figure 8 e STADE figure 9 Tumeur primitive T Carcinome in situ tumeur intra pith liale ou envahissant la Tis lamina propria intra muqueuse sans extension la sous muqueuse travers la muscularis mucosae T1 La tumeur envahit la sous muqueuse sans la d passer 12 La tumeur envahit la musculeuse sans la d passer La tumeur envahit travers la musculeuse la sous s reuse sans T3 atteinte du rev tement m soth lial et le tissu p ricolique non p riton alis ou le tissu p rirectal TA La tumeur perfore le p ritoine visc ral et ou envahit les organes de voisinage Ganglions r gionaux N Si les ganglions lymphatiques examin s sont n gatifs mais que le nombre habituellement r s qu n est pas atteint classer pNO NO Pas d ad nopathie r gionale m tastatiqu
19. Localisation des mutations KRAS KRAS et traitement Parente Sandra Juin 2010 Page 73 sur 128 Une tude Li vre 2008 a recherch chez 89 patients trait s pour un cancer colorectal m tastasique la mutation KRAS Ces patients taient trait s par c tuximab 26 des 89 patients ont r pondu au c tuximab et n taient pas porteur de la mutation La mutation KRAS a t retrouv e au niveau de la tumeur de 24 patients et le traitement n avait pas fonctionn La mutation KRAS entraine donc la r sistance au c tuximab Li vre A et son quipe Li vre 2008 ont observ que les patients sans mutation KRAS vivent d une mani re g n rale plus longtemps que les patients avec une tumeur portant la mutation KRAS La survie sans progression et la survie globale sont plus lev e 31 4 semaines vs 10 1 semaines et 14 3 mois vs 10 1 mois respectivement figure 28 gt Nonmutated 1 00 TE Mutated 0 75 0 50 0 25 Estimated Probability of Survival P 0001 0 20 40 60 80 100 Time weeks Wesks o 20 40 60 80 No at risk KRAS nonmutated 64 39 14 4 3 KRAS mutated 24 7 2 0 0 w 1 00 Nonmutated Mutated P 026 Estimated Probability of Survival e g r 0 10 20 30 Time months Months 0 6 12 16 24 No at risk KRAS nonmutated 64 53 24 12 3 KRAS mutated a 1 6 0 0 Figure 28 Repr sentation de la survie sans progression A et de la survie globale B en foncti
20. V Cayre A Le Corre D Buc E et al KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab J Clin Oncol 2008 26 374 379 M Mandel JS Church TR Bond JH Ederer F Geisser MS Mongin SJ et al The effect of fecal occult blood screening on the incidence of colorectal cancer N Engl J Med 2000 343 1603 1607 Meert AP Martin B Verdebout JM Paesmans M Lothaire P Bosschaerts T et al Corr lation entre l expression d EGF R dans les biopsies et les pi ces chirurgicales des cancers bronchiques Rev Mal Respir 2003 20 347 53 Miyakura Y Sugano K Konishi F Ichikawa A Maekawa M Shitoh K et al Extensive methylation of hMLH1 promoter region predominates in proximal colon cancer with microsatellite instability Gastroenterology 2001 121 1300 1309 Moscatello DK Holgado Madruga M Emlet DR Montgomery RB and Wong AJ Constitutive activation of phosphatidylinositol 3 kinase by a naturally occurring mutant epidermal growth factorreceptor J Biol Chem 1998 273 200 206 N Novotny J Sharp K Electrostatic fields in antibodies and antibody antigen complexes Prog Biophys Mol Biol 1992 58 203 204 O Olschwang S Bonaiti C Feingold J Fr bourg T Grandjouan S Lasset C et al Identification and management of HNPCC syndrome hereditary non polyposis colon cancer hereditary predisposition to colorectal and endometrial adenocarcinomas
21. caract ristique qui est objectivement mesur e c est dire avec une pr cision et une reproductibilit suffisante et valu e comme un indicateur du processus biologique du processus pathog n tique ou de la r ponse pharmacologique lors d une th rapeutique C est un param tre caract risant un tat physique un tat pathologique l volution d une maladie ou la r ponse un traitement Le biomarqueur tumoral est donc une caract ristique de la tumeur PIPAM 2009 Les biomarqueurs pr dictifs en canc rologie sont utilis s pour permettent entre autre la s lection des patients avec un profil mol culaire particulier apte r pondre une certaine th rapeutique Le fait que le biomarqueur s exprime est une condition n cessaire mais pas suffisante pour que le traitement fonctionne ou pas Le biomarqueur id al doit tre e Mesur avec pr cision et reproductibilit e Sensible e Sp cifique de la maladie e Son tude doit tre simple e Acc s facile aux tissus le contenant Parmi les facteurs pr dictifs de r ponse au traitement utilis s dans le cas du cancer colorectal la mutation du g ne KRAS est la plus tudi e D autres facteurs existent comme e Le nombre de copies du g ne EGFR e PI3KCA PTEN BRAF e Amphir guline et epir guline e Polymorphisme du r cepteur Fc gamma propre a chaque patient Parente Sandra Juin 2010 Page 69 sur 128 2 Les marqueurs biologiques a Marqueur biologiq
22. d lai et voudraient le voir rapport en moyenne 13 jours E OUI E NON En cas de retard d analyse avez vous t inform des probl mes rencontr s et du retard envisag Si non comment pr f reriez vous tre inform Sur 28 r ponses il y a eu 6 absentions Sur les 22 restants 41 estiment avoir t inform s du retard E OUI E NON h NR La majorit des participants pr fererait tre inform par fax puis par mail ou t l phone Parente Sandra Juin 2010 Page 104 sur 128 Etes vous satisfait de la pr sentation du compte rendu d analyse Si non quelles modifications souhaiteriez vous y apporter Le compte rendu d analyse est satisfaisant mais pourrait tre am lior en y inscrivant le pourcentage de cellules tumorales et saines Pour les oncologues Estimez vous tre toujours en possession des r sultats de g notypage KRAS en temps utile pour pouvoir prendre les d cisions th rapeutiques Cette question n tait destin e qu aux oncologues au nombre de 15 Il y a eu 24 r ponses dont 2 professionnels ont manifest ne pas vouloir s exprimer 50 des professionnels sont en possession des r sultats pour prendre les d cisions en cons quence Si non ce retard a t il une influence directe sur votre choix th rapeutique Le retard influence le choix th rapeutique avec un retard dans l instauration d un traitement cibl e anti EGFR Parente Sandra Juin 2010 P
23. et de AREG sont en concentration plus importante au niveau des tumeurs KRAS non mut L quipe a montr qu il existe une corr lation entre la probabilit de r ponse au traitement et la concentration en pir guline et amphir guline c Les voies de signalisation de l EGFR KRAS Description Les 3 g nes Ras H ras N ras et K ras appartiennent la superfamille des prot ines de liaison au GTP Le g ne KRAS est situ sur le bras court du chromosome 12 12p11 22 C est un oncog ne isol a partir du Kristen rat sarcoma Virus Il code pour une prot ine de 21 KDa la prot ine Ras Cette prot ine intervient dans la cascade des signaux intracellulaires allant de la surface de la cellule au noyau lors de la fixation de EGF son r cepteur EGFR Action normale La prot ine Ras appartient la voie des MAP Kinase RAS RAF MEK ERK Elle r gule l expression des g nes lors de la diff renciation cellulaire et lors de la croissance cellulaire La prot ine Ras est li e au GTP quand elle est activ e et au GDP quand elle est inactive La fixation du ligand sur son r cepteur entraine l activation de la prot ine Ras en Ras GTP Ce complexe est rapidement inactiv en Ras GDP Parente Sandra Juin 2010 Page 72 sur 128 L activit de la prot ine est troitement r gul e par le GEPs Guanine Exchange Protein et la GAPs GTP ase activation protein GAPs exerce une r gulation n gative sur Ras tandis que GE
24. galement augment Amado 2008 figure 26 100 Treatmentgroup Events N jan 90 Panit B8SC 115 124 93 123 BSC alone 114 1129 96 73 80 HR 0 45 95 Cl 0 34 to 0 59 a 70 2 Stratified log rank P lt 0001 4 60 Cc S 50 LL o 40 eS q o a 20 o 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 20 32 24 26 38 40 42 44 46 48 50 52 Time weeks Figure 26 Effet du panitumumab sur la survie sans progression par rapport un traitement palliatif Amodo 2008 6 Posologie Vectibix est diluer dans une solution de chlorure de sodium Nacl 0 9 La dose se d termine en fonction du poids corporel du patient soit 6mg kg La concentration finale ne devant pas d passer 10 mg ml 7 Effets ind sirables Il peut se produire e Une r action dermatologique d intensit l g re mod r e alop cie rash e Affections respiratoires toux dyspn e e Affection oculaire conjonctivite croissance des cils larmoiement s cheresse prurit e Diarrh e Parente Sandra Juin 2010 Page 66 sur 128 e Fatigue e Trouble du m tabolisme et de la nutrition hypomagn sie d shydratation e C phal e Parente Sandra Juin 2010 Page 67 sur 128 PARTIE HI Les facteurs pr dictifs de r ponses aux traitements anti EGFR Parente Sandra Juin 2010 Page 68 sur 128 l QU EST CE QU UN BIOMARQUEUR 1 D finition D apr s la d finition de la NIH un biomarqueur est une
25. patients pour le locus 122GT 12 4 6 8 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 Cycles Figure 42 Repr sentation la sonde FAM de l ensemble des patients pour le locus 122GT On constate sur la figure 42 que le profil des courbes des patients se rapproche de celui du t moin non mut On peut dire qu il n y a pas de tumeurs mut es au codon 12 en 122GT e Analyse d un locus pour un patient donn Exemple patient 12 et locus 122 GT Par la sonde VIC on voit que l amplification est correcte et gr ce la sonde FAM on voit que le patient 12 a un profil se rapprochant du t moin mut en 122 GT Le patient a donc une tumeur mut e pour le g ne KRAS figure 43 et 44 Parente Sandra Juin 2010 Page 94 sur 128 Fluorescence History K12 PATIENT 12 K22 T moin mut K23 T moin non mut K24 Eau L12 PATIENT 12 L22 T moin mut L23 T moin non mut L24 Eau Fluorescenc j 4 6 8 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 Cycles Figure 43 Repr sentation la sonde VIC d une tumeur mut e KRAS Fluorescence History K12 PATIENT 12 K22 T moin mut K23 T moin non mut K24 Eau L12 PATIENT 12 L22 T moin mut L23 T moin non mut L24 Eau Fluorescence 465 510 222 NN 0022000000000 12 4 6 8 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 Cycles Figure 44 Repr sentation la sonde FAM d une tumeur mut e KRA
26. professionnels de sant de la r gion Lorraine dont des oncologues des gastro ent rologues des m decins g n ralistes et des anatomopathologistes 1 Etat des lieux L unit de biologie des tumeurs re oit les chantillons tumoraux inclus dans de la paraffine suite aux demandes de g notypage KRAS venant de professionnels de sant appartenant diff rent domaine m dical Le d lai pour l analyse du g notypage donn par le CAV est de 15 jours en moyenne Si l analyse est concluante et apr s contr le des r sultats le CAV envoie le compte rendu du r sultat au prescripteur Celui ci pourra alors mettre en place le traitement le plus adapt au patient Si l analyse n est pas concluante la plateforme refait l analyse et si le r sultat n est toujours pas interpr table un second bloc est demand l anatomopathologiste Le r sultat ne peut pas tre rendu si la zone s lectionn e contient peu de cellules tumorales ou si ADN n est pas en concentration suffisante Ce deuxi me cas allonge le d lai des 15 jours d analyses car un nouveau bloc de paraffine sera demand au pathologiste La figure 33 r sume les interactions entre l oncologue la pathologiste et la plateforme 2 Statistiques de l activit du service de juin 2008 d cembre 2009 De juin 2008 d cembre 2009 le CAV a analys 844 blocs pour le g notypage KRAS Parmi ces 844 blocs de paraffine 3 24 844 pr sentaient un ADN d grad et n on
27. s avoir fix par le Fc la cellule immunitaire les Ac par le Fab peuvent fixer l Ag La formation de l immun complexe la surface de la cellule immunitaire destructrice va d clencher une s rie d action conduisant l limination de l Ag Parmi ces actions il ya ADCC et la destruction de l Ag par le compl ment a ADCC L Ac se fixe sur la cellule d truire La cellule NK Natural Killer va fixer l Ac grace aux r cepteurs pour le Fc sa surface FcyRIll A partir de la l attaque cytotoxique par le NK est d clench e La cellule NK contient dans son cytoplasme des enzymes perforine et granzyme Ces enzymes sont lib r es en pr sence de Ag et vont entrainer la perm abilit de l Ag et conduire sa destruction figure 19 Lanier 1986 Parente Sandra Juin 2010 Page 56 sur 128 Target Cell Cancer Cell Antibody Fc Receptor T Lysis o by ADCC Toxicity Effector Cell NK cell amp Monocyte Figure 19 M canisme de l ADCC b Lyse cellulaire par le compl ment Le compl ment circule sous forme d un complexe prot ique inactif dans le plasma La fixation de l Ig G sur l Ag va permettre d activer le compl ment qui se fixera sur l Ac C est la voie classique d activation du compl ment Une cascade de r actions s ensuit pour permettre la lyse des prot ines du compl ment et donc leur activation Esser 1991 figure 20 Parente Sandra Juin 2010 Page 5
28. utilis es dans le cancer colorectal m tastasique r f Oncolor Carol et Oncolie 2009 M tastases op rables M tastases potentiellement res cables M tastases inop rables ou plusieurs sites m tastasiques palliatifs Contre indication au 5 FU FOLFOX FOLFOX B vacizumab FOLFIRI B vacizumab FOLFOXIRI FOLFOX C tuximab FOLFIRI C tuximab FOLFIRINOR FOLFIRI Bevacizumab FOLFIRI C tuximab FOLFOXIRI FOLFOX C tuximab FOLFOX 4 ou FOLFOX 7 XELOX FOLFIRI LV5FU2 Cap citabine XELIRI IRINOX TOMOX Une r valuation du traitement au bout de 2 3 mois est syst matiquement r alis e Cette r valuation sera suivie soit d un changement de th rapeutique le panitumumab a AMM en traitement de gene ligne soit d une chirurgie La progression sous 5 FU irinot can oxaliplatine cetuximab et panitumumab entraine l entr e en soins palliatif apr s accord du patient R f rentiel Oncolor Carol et Oncolie 2009 Parente Sandra Juin 2010 Page 43 sur 128 M tastases synchrones Bilan de r secabilit TDM thoraco abdo pelvien Morpho TEP si l intervention est envisageable l issue du scanner Options ex r se d embl e ou diff r e Si chirurgie h patique bilan pr op ratoire TDM3D volum trie clairance au vert d indocyanine Opti Loblrerole Figure 11 Arbre d cisionnel dans le cadre de m tastases synchrones R f rentiel Oncolor Carol et Oncolie 2009 c
29. 05 par cancer selon le sexe Hill 2008 26 Figure 2 R sum des recommandations pour la pr vention primaire des cancers fiche rep re INCa 2009 28 Figure 3 HemoccUlt lili Eine me RAR ne En ARR Dee het eee 31 Figure 4 Mode d emploi de l Hemoccult II pour les patients 32 Figure 5 R sultat positif de la recherche de sang dans les selles ooococonoooonanocnnononnaananonnnononnann anno nconnnnnannns 33 Figure 6 R sultat n gatif de la recherche de sang dans les selles 33 Figure 7 Strat gie mise en place suite au d pistage de masse du cancer colo rectal Canc roguide 2007 34 Figure 8 Classification TNM r f rentiel Oncolor Carol et Oncolie 2009 38 Figure 9 Classification en stade r f rentiel Oncolor Carol et Oncolie 2009 39 Figure 10 Arbre d cisionnel dans le cas de m tastases m tachrones R f rentiel Oncolor Carol et Oncolie 2009 atii lea M ane ed ele nan den een ren aaa ra nm ere nan ann de Se tte lente ln oar 44 Figure 12 Structure du r cepteur VEGF inner 48 Figure 13 Les ligands de r cepteurs HER 50 Figure 14 Repr sentation des 2 voies principales de signalisation cellulaire Cahier scientifique Merck 51 Figure 15 Expression de I EGFR dans diff rents types de cancer 52 Figure 16 Structure de base d un anticorps issus 54 Figure 17 Les diff rents domaines d un anticorps 55 Figure 18 Repr sentation de l interacti
30. 10 Page 109 sur 128 Une enqu te de satisfaction a t envoy e par le laboratoire 180 professionnels de sant lorrains Cette enqu te met en avant le r le primordial de la collaboration entre les cliniciens les anatomopathologistes et le laboratoire qui s av re tre un l ment cl dans la prise en charge optimale du patient canc reux Suite cette enqu te et dans le cadre de l optimisation de la prise en charge du patient le CAV a optimis l approche technique utilis e pour r duire ses temps d analyse Parente Sandra Juin 2010 Page 110 sur 128 GLOSSAIRE DE CHIMIOTHERAPIE LV5FU standard Acide folinique en perfusion 200mg m2 5 fluoro uracile en bolus 400mg m2 5 fluoro uracile en perfusion 600mg m2 FUFOL Acide folinique en bolus 20mg m2 5 fluoro uracile 350mg m2 en perfusion lente FOLFOX 4 Acide folinique en perfusion 200mg m2 5 fluoro uracile en bolus 400mg m2 5 fluoro uracile en perfusion 600mg m2 oxaliplatine 85mg m2 FOLFOX 7 Acide folinique en perfusion 400 mg m2 5 fluoro uracile en perfusion 1200 mg m2 oxaliplatine 130 mg m2 FOLFOXIRI Acide folinique 5 fluoro uracile oxaliplatine irinot can FOLFOX c tuximab Acide folinique 200 mg m2 5 fluoro uracile en bolus 400 mg m2 5 fluoro uracile 600 mg m2 oxaliplatine 85 mg kg c tuximab FOLFOX b vacizumab Acide folinique 200 mg m2 5 fluoro uracile en bolu
31. 12 Domaines Extracellulaire t CR1 L2 CR2 gt Milieu extra cellulaire QI eee 04 O Transmembranaire 606 60 EL EEE Cytoplasme e me Tyrosine kinase C terminal Figure 12 Structure du r cepteur l EGF Parente Sandra Juin 2010 Page 48 sur 128 L EGFR est un monom re sous forme inactive Il se dim rise quand il est activ par un ligand Wells 1999 Les r cepteurs HER sont compos s de 4 membres ErbB1 EGFR activit tyrosine kinase ErbB2 HER2 activit tyrosine kinase ErbB3 HER2 d pourvue d activit tyrosine kinase ErbB4 HER4 activit tyrosine kinase Chaque membre fixe un ligand diff rent 2 Localisation EGFR est exprim au niveau des cellules pith liales de la peau foie intestin poumon pancr as Son expression normale est de 40000 100000 r cepteurs cellule 3 Ligand Les ligands capables de fixer EGFR sont figure 13 EGF H parin binding EGF TGF alpha Amphir guline B tacelluline Epir guline Jost 2000 Parente Sandra Juin 2010 Page 49 sur 128 Ligands R cepteurs Figure 13 Les ligands de r cepteurs HER 4 M canisme d action Quand le ligand se fixe sur le r cepteur celui ci se dim rise L internalisation du complexe r cepteur ligand intervient suivi de l autophosphorylation de la Tk intracellulaire La transduction du signal en intracellulaire est activ e figure 14 Elle e
32. 4 RE LU ET TER Et T E A ae 35 REQUENA 35 OA Diagnostics ann einen O 36 Ll Cl CE dave acetoeedestuteds xapesunsictesesne nas weasy doce ouasaanwentesteectamex tances dedeeaexesueuce 36 2 COMOSEO Ble ES AR Re TE A CESSE nuh ace Eee ni fe 36 3 Autres EXAMENS sn Mn AAA 37 a A inaa oee ae E EE OE i Eei 37 b Magere enerne ath a A e A E E RA 37 E Cas LIONS de T 37 Parente Sandra Juin 2010 Page 11 sur 128 V Les trate MOE toiles 39 SE GG A LE RL a ENEO Ea Ea 40 Ze Radioth rapie di 40 3 Chimioth rapie papi NN A NE E NE nanas 40 a Cancer colorectal non m tastatique cccnnoncccncnooonccnnonanannncnnnanocnncnnnonccnnnnnnns 40 p Cancer MetastatQUe ii A nie nes 41 c Evaluation de la chimioth rapie ss 44 d Surveillance de la chimioth rapie ss 45 e Eff ts ind sirabl s ss aidants tence EE EEEE E E eE 45 Via Surveillance iii RS nn indiens 46 PARTIE M sinus nie senc cado 47 l Qu est ce qu EGER sisi ee rires 48 Te SPACE A ee nig Sei cick veins eae en Re eee 48 Za L ca lsatioN ces RS dota 49 Be gandissa E a ise eee etal 49 4 M canisme da acia ciedad 50 O O EE 51 Ge inhibition da EE SN Rite 51 7 EGFR au niveau de la cellule tumorale Vs 52 Il Rappel sur les anticorps monoclonaux ssssssssssesssoosssscossssssoosssscossseseosssssoose 53 Ls UU A en Weeks cu bien net Ne 53 2 LAUSANA AC e a E E hante 55 Dic SVC TION Spats tecceceetatesars Gree ntutecasaru A tn sath AE 56 E 56 b Lyse cellulaire p
33. 5 5 mo 7 7 mo gt Median 8 6 mo 7 2 mo k 95 CI 40t07 4 7 1 to 12 0 95 CI 6 5t09 5 5 6 t0 7 4 Log rank P 0009 HR 0 448 0 276 to 0 727 E Log rank P 1655 HR 1 404 0 867 to 2 271 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 Time months Time months No of patients at risk No of patients at risk Mutant 52 42 28 17 11 3 1 Mutant 47 38 35 23 11 5 2 Wild type 61 55 45 31 20 16 4 Wild type 73 56 45 30 13 5 2 Figure 25 Repr sentation de la survie sans progression en fonction du traitement c tuximab FOLFOX 4 A versus FOLFOX 4 B et en fonction de la mutation KRAS tude OPUS Bokemeyer 2009 Il peut s utiliser en monoth rapie apr s chec d un traitement base d oxaliplatine et d irinot can 6 Posologie G n ralement une dose initiale de 400mg m2 est administr e Puis les doses hebdomadaires sont de 250mg m2 7 Effets ind sirables Les effets ind sirables d coulent de la nature du produit et de son m canisme d action L Erbitux peut provoquer e Affection oculaire conjonctivite e Affection cutan e et sous cutan e prurit rash acn iforme s cheresse cutan e desquamation Ces affections disparaissent l arr t du traitement Parente Sandra Juin 2010 Page 64 sur 128 e Affection respiratoire IV PANITUMUMAB VECTIBIX 1 Pr sentation Vectibix ou panitumumab est pr sent sous forme d une solution st rile pour perfusion la concentration de 20mg ml C est un
34. 7 Strat gie mise en place suite au d pistage de masse du cancer colo rectal Canc roguide 2007 2 D pistage des populations a risques Les populations a risque sont exclues des campagnes de d pistage de masse La coloscopie est le moyen de d pistage de premier recours chez ces personnes Il y a 2 types de groupes risques A risque lev quand il y a des ant c dents familiaux une maladie de Crohn ou une rectocolite h morragique A risque tr s lev quand il y a une HNPCC ou une PAF Parente Sandra Juin 2010 Page 34 sur 128 a Risque lev Ant c dents de cancers colorectaux C est a dire un cas au premier degr de parent avant 60 ans ou plusieurs cas au premier degr quelque soit l ge ou une personne atteinte d un cancer colorectal avant 50 ans Dans ce groupe la coloscopie est r alis e partir de 45 ans ou 5 ans avant l ge du diagnostic du cas index Maladie de Crohn ou Rectocolite h morragique La coloscopie est r alis e tous les 2 a 3 ans b Risque tr s lev Le risque pour ces personnes est tr s lev car dans 80 95 des cas il y a apparition d un cancer colorectal 70 ans Le d pistage est r alis sur les membres de la famille d un sujet tr s risque HNPCC La coloscopie est pratiqu e tous les 2 ans partir de 20 25 ans ou 5 ans avant l ge du diagnostic le plus pr coce dans la famille Un examen gyn cologique est galement r alis sy
35. 7 sur 128 Figure 20 Les diff rentes tapes de l activation du compl ment Les derni res prot ines activ es du compl ment C6 C7 C8 et C9 forme le CAM complexe d attaque membranaire figure 20 formant un pore dans la membrane de l Ag entrainant ainsi sa destruction 4 Fabrication En 1975 Kohler et Milstein inventent une technique qui permet la production en quantit importante d Ac monoclonaux figure 21 Les anticorps monoclonaux sont capables de reconna tre un seul type de motif antig nique Parente Sandra Juin 2010 Page 58 sur 128 M thode Injection de l Ag d int r t chez un rongeur Immunisation de celui ci et production de lymphocytes B contre l Ag inject Pr l vement des lymphocytes B Ajout de cellules tumorales pour former un hybridome Multiplication de l hybridome et production de l Ac recherch en quantit Or les Ac monoclonaux provenant d un rongeur ont un fragment Fc sp cifique de leur esp ce et donc diff rent de l homme Inject s chez l homme ces Ac seront rapidement d truits car reconnus comme non soi Il a donc fallut les perfectionner pour leur application en th rapeutique humaine Immunization of mouse to stimulate antibody Tumor cells are production growen in tissue culture Antibody forming cells isolated from spleen Antibody forming cells are fused with cultivated tumor cells to form hybridomas I Rise hrs ces
36. BOND bowel oncology antibody C CAM complexe d attaque membranaire CAV centre Alexis Vautrin de Nancy CCR cancer colorectal CRYSTAL c tuximab combined with irinotecan in first line therapy for metastatic colorectal cancer CCRm cancer colorectal m tastatique Parente Sandra Juin 2010 Page 18 sur 128 CL domaine constante de la cha ne l g re d un anticorps CH domaine constant de la cha ne lourde de l anticorps CDR complementary determining region D dNTP d soxyribonucleotide triphosphate E EGFR epidermal growth factor receptor EGF epidermal growth factor EREG pir gulline F Fab fragment antigen binding Fc fragment crystallizable FR framework G GAPs GTP ase activation protein GEPs guanine exchange protein GTP guanosine triphosphate GDP guanosine diphosphate G CSF granulocyte colony stimuling factor H HNPCC Heriditary NonPolyposis Colorectal Cancer ou syndrome de Lynch Parente Sandra Juin 2010 Page 19 sur 128 HER human epidermal growth factor INCa Institut National du Cancer lg immunoglobuline K KRAS Kristen ras sarcoma 2 viral oncogene homologue L LDH lactate d shydrog nase M MAP Kinase mitogen actived protein kinase MMR mis match repair Morpho TEP tomographie a mission de positons MOKAECM valuation de la d tection des mutations de l oncog ne KRAS pour le traitement par les anticorps anti EGFR des patients porteurs d un cancer colore
37. Ci Monsieur 1 Madame Nom acia rs pests e Date de naissance e Motivation de la demande Q Ciblage du traitement 1 Autre raison e Pr l vement concern par le g notypage Q Tumeur primitive Qi Colon Q M tastase Q H patique Ld Rectum 0 Pulmonaire Q Autre e Type de pr l vement A Biopsie 1 Pi ce op ratoire e Traitement s ant rieur s au pr l vement T Aucun Q Chimioth rapie T Radioth rapie Merci de bien vouloir r aliser une identification du statut mutationnel du g ne K Ras Nom du m decin demandeur du test e Signature du m decin demandeur du test Cachet regex Parente Sandra Juin 2010 Page 126 sur 128 DEMANDE D IMPRIMATUR Date de soutenance 17 jule 2010 DIPLOME D ETAT DE DOCTEUR EN PHARMACTE pr sent par PARENTE Sandra Vu Sujet Diagnostic mol culaire des cancers colorectaux Nancy le 7 mat 2010 m tastesiques facteurs pr dictifs de r ponse aux mii EGFR et organisation du g setypage KRAS en Loraine Le Pr sident dus Jury Le Directeur de Thise Jury Pr sident M Jez Louis MERLIN Professeur Direciene M Jean Lonis MERLIN Professeur M Jean Louis Merlin Jgs Mine B atrice DEMORE Ma tre de conf rence la facalt de pharmacies de Nancy Mme Marie Christine KAMINSKY onoslogue m dical as Centre Alexis Vautrin de Nancy Vu el approav Nancy le 17 MAI 2010 Nancy le 21 of loo Doyen de la Facult
38. Il est conseill de satisfaire les besoins nutritionnels par une alimentation quilibr e et diversifi e sans recourir aux compl ments alimentaires Figure 2 R sum des recommandations pour la pr vention primaire des cancers fiche rep re INCa 2009 Il est toutefois difficile d laborer une nutrition anti cancer Une alimentation quilibr e la lutte contre le surpoids ainsi que la pratique d une activit physique r guli re sont les 3 points favoriser pour pr venir une maladie quel qu elle soit Fiches rep res INCa 2009 Parente Sandra Juin 2010 Page 28 sur 128 2 Facteurs h r ditaires 5 des cancers colorectaux sont pr disposition g n tique Le syndrome de LYNCH ou HNPCC Hereditary NonPolyposis Colorectal Cancer ainsi que la polypose ad nomateuse familiale PAF nomm syndrome de Gardner en font partis a HNPCC Ce syndrome est d fini cliniquement par les crit res d Amsterdam II de 1999 suivant Au moins 3 sujets atteints de cancer appartenant au spectre troit du syndrome HNPCC et histologiquement prouv unis 2 2 par un lien de parent au 1 degr sur 2 g n rations un des cancers au moins s tant r v l avant l ge de 50 ans La transmission du g ne mut de HNPCC est autosomique dominante Les mutations affectent des g nes du syst me de r paration de l Acide d soxyribonucl ique ADN g ne Mis Match Repair MMR L inactivation du syst me MMR entra
39. NA mis match repair est d ficient La d ficience est prouv e par l instabilit microsatellitaire Le MMR est alt r dans 10 15 des CCR par mutation du g ne hMLH1 Samowitz 2006 et Miyakura 2001 La mutation BRAF est plus fr quente quand les tumeurs montrent une instabilit des microsatellites et pour des patients au stade III du CCR PI3K PTEN Lorsque le ligand se fixe sur le r cepteur la voie Ras MAPK n est pas la seule tre activ e La voie PI3K PTEN AKT l est galement PI3KCA est un oncog ne Elle permet la transformation du phosphatidyl inositol 2 biphosphate PIP2 inactif en phosphatidyl inositol 3 phosphate PIP3 actif qui activera AKT Une mutation du g ne codant cette prot ine entrainerait une r sistance aux traitements par anti EGFR Au contraire de toutes ces tudes Prenen et al Prenen 2009 et Siena Siena 2009 ont d montr que la mutation de PI3KCA seule n est pas suffisante pour conclure la r sistance aux traitements monoclonaux PTEN phosphatase and tensin homolog est une prot ine suppresseur de tumeur cod e par un g ne localis sur le chromosome 10 Elle permet par sous activit de phosphatase de passer du PI3P au PI2P Elle participe la r gulation du cycle cellulaire en emp chant les cellules de se diviser trop rapidement et de fa on incontr l e inhibition de l activation AKT permettant l action de la p53 Le g ne de cette prot ine peut soit tre mut
40. Nancy Universit Y Universit H enri Poincar AVERTISSEMENT Ce document est le fruit d un long travail approuv par le jury de soutenance et mis disposition de l ensemble de la communaut universitaire largie Il est soumis la propri t intellectuelle de l auteur Ceci implique une obligation de citation et de r f rencement lors de l utilisation de ce document D autre part toute contrefa on plagiat reproduction illicite encourt une poursuite p nale gt Contact SCD Nancy 1 theses sante scd uhp nancy fr Code de la Propri t Intellectuelle articles L 122 4 Code de la Propri t Intellectuelle articles L 335 2 L 335 10 http www cfcopies com V2 leg leg_droi php http www culture gouv fr culture infos pratiques droits protection htm UNIVERSITE HENRI POINCARE NANCY 1 2010 FACULTE DE PHARMACIE Diagnostic mol culaire des cancers colorectaux m tastatiques Facteurs pr dictifs de r ponse aux th rapies cibl es anti EGFR et organisation du g notypage KRAS en Lorraine THESE Pr sent e et soutenue publiquement Le 17 juin 2010 pour obtenir Le Dipl me d Etat de Docteur en Pharmacie Par Sandra PARENTE N e le 26 avril 1983 Thionville 57 Membres du Jury Pr sident M MERLIN Jean Louis Professeur Unit de Biologie des Tumeurs centre Alexis Vautrin Juges Mme DEMORE B atrice Ma tre de Conf rences Facult de Pharmacie Mme KAMINSKY Marie Christine Oncologue m dic
41. Ps r gule positivement Ras Action anormale La mutation du g ne KRAS est impliqu e dans 30 des cancers Elle est retrouv e au niveau du cancer colorectal dans 50 des cas dans les cancers du poumon 25 50 du pancr as et de la thyro de La mutation intervient sur les codons 12 et 13 essentiellement pour le cancer colorectal Il s agit d une mutation affectant un nucl otide Trois mutations sont majoritairement recherch es car leur incidence est d environ 75 G35A G35T G38A figure 27 Elles transforment la glycine en valine ou en acide aspartique La prot ine ainsi mut e devient r sistante la r gulation n gative du GAPs Elle est donc perp tuellement active et la transduction du signal est faite en permanence ind pendamment de la fixation du ligand sur son r cepteur La cellule acquiert une capacit importante de prolif ration Fr quence des mutations KRAS chez les patients atteints de CCR Donn es extraites de l tude RASCAL Il et du catalogue des mutations soma tiques oncogenes COSMIC institut Sanger Mutation KRAS Acide amin A incidence Aspartate G12D G35A 32 5 Valine G12V G35T eat 22 5 Cyst ine 6120 l G34T 8 8 Codon 12 a os ee S rine G12s G34A 7 6 Alanine 6124 6350 64 Arginine 812 Ge 09 Codon 13 Aspartate G130 BRA 19 5 Autres codons E o o 1 8 DS SSSR Figure 27
42. S 3 PCR HRM a Principe Parente Sandra Juin 2010 Page 95 sur 128 Cette technique repose sur l int gration de ADN amplifi par PCR d un fluorochrome intercalant L augmentation de temp rature programm e entra ne une d naturation de certains fragments du brin d ADN domaines de fusion Cette d naturation provoque l limination du fluorochrome et induit donc une baisse de fluorescence puis son extinction totale lorsque la d naturation est compl te A une s quence d ADN donn e correspond donc pour une mont e en temp rature standard une signature lumineuse sp cifique repr sent e par une courbe de fusion Si la s quence d ADN analys e comporte des mutations ou des d l tions la signature change r v lant ainsi l existence d un autre profil voire d une anomalie figure 45 1007 s gt i y VD a 75 Ok E Double stranded DNA Single stranded DNA z s ds DNA random coils aee one S e A o Son 25 as o i i E i 0 f 76 79 82 Tm 88 91 Temperature C Figure 45 Principe de la PCR HRM b Analyse Les r sultats sont obtenus en 1 heure Gr ce a cette technique on saura si la tumeur est porteuse de la mutation mais sans l identifier La PCR HRM commence par la pr paration du MIX e MgcCI2 e Amorce sens e Amorce anti sens Parente Sandra Juin 2010 Page 96 sur 128 e Master mix contenant une mol cule fluorescente e Eau Une certai
43. Vessie Enc phale Thyro de Hodgkin Lymphome non hodgkinien My lome Leuc mies Autres Tous cancers CIM10 C00 C14 C32 C15 C16 C18 C21 C26 0 C22 C23 C24 C25 C33 C34 C43 C50 C53 x C55 C54 1 x C55 C56 C57 0 C57 4 C61 C62 C64 C66 C68 C67 C70 C72 C73 C81 C82 C85 C96 C88 C90 C91 C95 Hommes 4 699 3 258 3 045 8 887 5 457 499 4192 21 901 799 201 9 099 102 2 438 3 585 1 644 132 166 2 221 1375 2 929 12 149 88 778 Femmes 668 1 789 8 001 1 882 725 3 857 5 949 713 11 308 1578 1 384 3 338 1330 1126 283 263 108 2 038 1341 2 433 8111 60 104 _ CIM10 classification internationale des maladies dixi me r vision Figure 1 Tableau r capitulatif du nombre de d c s en 2005 par cancer selon le sexe Hill 2008 C est la troisi me tumeur maligne la plus diagnostiqu e dans le monde d apr s l tude GLOBOCAN Parkin 2001 et le deuxi me cancer le plus meurtrier apr s celui des poumons dans les pays occidentaux Parker 1997 C est la tumeur du tube digestif la plus fr quente Parente Sandra Juin 2010 Page 26 sur 128 Il PREVENTION PRIMAIRE Selon la d finition de Organisation Mondiale de la Sant OMS la pr vention primaire est l ensemble des moyens mis en uvre pour emp cher l apparition d un trouble d une pathologie ou d un sympt me Dans le cas de ce cancer la pr ven
44. age 105 sur 128 E OUI E NON h SUSPEND E CHANGEMENT E RETARD E NR Pensez vous que le g notypage KRAS devrait tre anticip Si oui a quel moment souhaiteriez vous que le g notypage KRAS soit r alis A 92 le g notypage KRAS devrait tre anticip et pour une majorit des m decins au moment du diagnostic E DIAGNOSTIC E SYMPTOME 5 Analyse de l enqu te a Vous Le taux de r ponse est de 40 180 soit environ 22 Parente Sandra Juin 2010 Page 106 sur 128 Parmi les prescripteurs potentiels la majorit exerce en tant qu oncologue suivi par les gastro ent rologues b Nos changes L acc s la plateforme que se soit par fax ou t l phone est facilit Les professionnels estiment avoir acc s aux renseignements quand ils en ont besoin La plateforme joue donc correctement son r le d acteur actif au sein de la triade clinicien pathologiste laboratoire La communication est un l ment qu il tait important d valuer parce qu elle permet d assurer une qualit dans le trajet de la demande de g notypage KRAS c Les d lais De la prescription la communication des r sultats il doit y avoir en th orie 15 jours 75 des personnes interrog es sont satisfaites des d lais de traitement du g notypage KRAS 25 de personnes sont non satisfaites des d lais dont 6 sont oncologues et 1 gastro ent rologue En moyenne le d lai propos par les oncologues est de 12 jour
45. al au centre Alexis Vautrin Parente Sandra Juin 2010 UNIVERSITE Henri Poincar Nancy 1 FACULTE DE PHARMACIE DOYEN Francine PAULUS Vice Doyen Francine KEDZIEREWICZ Pr sident du Conseil de la P dagogie Bertrand RIHN Commission de la Recherche Christophe GANTZER Mobilit ERASMUS et Communication Francine KEDZIEREWICZ Hygi ne S curit Laurent DIEZ Responsable de la fili re Officine Francine PAULUS Responsables de la fili re Industrie Isabelle LARTAUD Jean Bernard REGNOUF de VAINS Responsable du Coll ge d Enseignement Jean Michel SIMON Pharmaceutique Hospitalier DOYEN HONORAIRE Chantal FINANCE Claude VIGNERON Parente Sandra Juin 2010 Page 2 sur 128 PROFESSEURS EMERITES Jeffrey ATKINSON Marie Madeleine GALTEAU G rard SIEST Claude VIGNERON PROFESSEURS HONORAIRES Roger BONALY Th r se GIRARD Maurice HOFFMANN Michel JACQUE Lucien LALLOZ Pierre LECTARD Vincent LOPPINET Marcel MIRJOLET Fran ois MORTIER Maurice PIERFITTE Janine SCHWARTZBROD Louis SCHWARTZBROD Parente Sandra Juin 2010 MAITRES DE CONFERENCES HONORAIRES G rald CATAU Jocelyne COLLOMB Bernard DANGIEN Marie Claude FUZELLIER Fran oise HINZELIN Marie Andr e IMBS Marie H l ne LIVERTOUX Jean Louis MONAL Dominique NOTTER Marie France POCHON Anne ROVEL Maria WELLMAN ROUSSEAU ASSISTANT HONORAIRE Marie Catherine BERTHE Annie PAVIS ENSEIGNANTS PROFESSEURS Gills AULAGNER c seccc
46. ancer 2002 94 1593 1611 Hill C Doyon F The frequency of cancer in France mortality trends since 1950 and summary of the report on the causes of cancer Bull Cancer 2008 95 5 10 Hirsch FR Varella Garcia M Bunn PA Di Maria MV Veve R Bremmes RM et al Epidermal growth factor receptor in non small cell lung carcinomas correlation between gene copy number and protein expression and impact on prognosis J Clin Oncol 2003 21 3798 807 J Jacobs B De Roock W Piessevaux H et al Amphiregulin and Epiregulin mRNA expression in primary tumors predicts outcome in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab J Clin Oncol 2009 27 5068 5074 Jost M Kari C Rodeck U The EGF receptor an essential regulator of multiple epidermal functions Eur J Dermatol 2000 10 505 510 K Khambata Ford S Garrett CR Meropol NJ Basik M Harbison CT Wu S et al Expression of epiregulin and amphiregulin and K ras mutation status predict disease control in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab J Clin Oncol 2007 25 3230 3237 L Lanier LL Phillips J H Evidence for three types of human cytotoxic lymphocyte Immunol Today 1986 7 132 Parente Sandra Juin 2010 Page 115 sur 128 Lecomte T Les polyposes coliques r le de l endoscopie et de la chromoendoscopie Pour quels patients demander un conseil g n tique Acta endoscopica 2006 36 473 474 Li vre A Bachet JB Boige
47. ant car elle va confirmer ou non le diagnostic www e cancer fr Dans 30 des cas la coloscopie d tecte un polype qui peut tre retir vitant ainsi qu il ne devienne canc reux un jour Un cancer est d couvert dans 10 des cas INCa 2008 Parente Sandra Juin 2010 Page 36 sur 128 3 Autres examens Ceux ci permettent de voir une ventuelle extension a Examen biologique Il consiste en un dosage des ACE Antig ne Carcino embryonnaire fait syst matiquement lors du bilan initial d un cancer colorectal Evaluation de la fonction r nale clairance la cr atinine h patique Dosage des plaquettes NFS Num ration Formule Sanguine et bilan lipidique LDH Lactate deshydrog nase b Imagerie Le bilan initial pr voit une chographie h patique et une radiographie pulmonaire ou un scanner thoraco abdo pelevien L imagerie va permette de localiser les m tastases c Classifications Si le diagnostic de cancer est pos le praticien va valuer l extension ou non de la maladie gr ce toutes ces analyses A partir de l la tumeur sera class e a un certain stade et une strat gie th rapeutique adapt e sera mise en place Plusieurs extensions sont valu es Extension locor gionale C est dire en profondeur au sein de l pith lium et si l extension affecte des organes environnant Extension lymphatique Il est possible que les ganglions p ri coliques ou p ri rectaux soient affect s
48. ar le compl ment ss 57 Parente Sandra Juin 2010 Page 12 sur 128 A FAMA ON RE a 58 II C tuximab Erbitix ii nuits 61 A n nn rt non nn dent e is 61 De NCTM CC AR ce oat Na ae a Nan a airs BN ea 61 3 Mode d aciminis Era long en A ieee Liebe Oe AA ans 61 A PRARMVACOAY MANNS sxe sec seat nn nae ees 62 A e ct Meath ol Riera mot ad ned A Gea a 62 6 POSOlO BIC a Koei ee ne eee 64 Ta Elets INGESIPADISS coria lalola dra citas 64 IV Panitumumab vectibix0 ooonmmmmmmmmms 65 1 PRESENTACION a a cl 65 Ze NUCA ra 65 3 Mode ANUIES das 65 A KPRAFMACO na M D ARS RE EE Se ue 65 CPU EL HN did 65 A AO 66 Ze EPOtSINGESIPA DIOS tido 66 PARTIE Misc ida 68 l Qu est ce qu un biomarqueur sssssssssssossssssesssessoossssoossssseoosssscosssessosssssoose 69 Le EG FUP OE RES E els heres A tete 69 2 Les marqueurs biologiques sistema Rohit anes 70 a Marqueur biologique de la cible EGFR UUUU 70 bs Les ligands del ES PR edanean ia Ea bois 71 c Les voies de signalisation de l EGFR 72 d TOXiCit e cutan ss ee E E E E a E 79 Parente Sandra Juin 2010 Page 13 sur 128 PARTIE IN Esteban dote AAA AAA patate AAA 81 L Pr sentation de INC ui da dba 82 ll Dela biopsie l analyse insiste inner tica daba 84 Me analyst ini ari 88 T MIP CE A Cr EE Am E A nt catia 88 ds A A LA 1 acca ceived ace eax cabo vce uie ce eaten Vee vaec a a cea ene nae 88 DADAS ES 90 6 Exemple de r sultat
49. bons moments pass s ensemble Merci la facult de Pharmacie de Nancy pour l enseignement de qualit de mes 6 ann es d tude Je d die cette th se mes parents J esp re que vous serez fiers de moi Avec tout mon amour A J r mie et L ticia mon fr re ma s ur vous comptez beaucoup pour moi Je vous souhaite le meilleur pour l avenir A Julien mon pr sent et mon futur Merci A toute ma famille et ma nouvelle famille pour son soutien Merci pour vos encouragements et votre compr hension A mes disparus A tous ceux qui n ont jamais cru en moi vous m avez donn la force de me battre J La v ritable culture celle qui est utile est toujours une synth se entre le savoir accumul et l inlassable observation de la vie Francesco Alberoni Parente Sandra Juin 2010 Page 10 sur 128 Table des mati res RemerciementEs inicia iii nine SE Ea NI S aS nine 10 Listes des abreviatiOns i 18 el ESS RS nn S 23 PARTIE asii a Oc 25 l Epid miologie iia id nn te nie 26 ll Pr vention primalre ivi id 27 1 Facteurs nutritionnels et comportementaux o oooccccccononcccnononononcconanononcconncnonnnnnns 27 25 Facteurs h r ditaires o o este 29 dy TAINO Cut Re ne Coan ae tater ket nee ent 29 De o A E E aa 29 Il Pr vention secondaire ln 30 1 D pistage dans la population g n rale occcconcccnccnooccccnononannnononanccnncnonancncnnonnns 30 2 D pistage des populations risques 3
50. boratoire Nature Exp rimentale o i Bibliographique o M Jean Louis MERLIN Professeur Th me o Th mes 1 Sciences fondamentales 2 Hygi ne Environnement 3 M dicament 4 Alimentation Nutrition 5 Biologie 6 Pratique professionnelle Parente Sandra Juin 2010 Page 128 sur 128
51. cahier VERTIBIX e Canc roguide 2007 e HAS Guide ALD n 30 2008 e INCa Bilan national de l activit des plateformes hospitali res de g n tique mol culaire des cancers en 2008 2009 e INCa D pistage organis du cancer colorectal 2008 e INCa Fiches rep re nutrition et pr vention des cancers 2009 e INCa Guide de r f rence Les traitements du cancer du c lon 2010 e INCa Les traitements du cancer du c lon 2010 e Kaufman Howard Wadler Scott Antman Karen Molecular targeting in oncology 2008 e Merck Cahier ERBITUX e Oncolor Carol et Oncolie R f rentiel r gionaux de bonnes pratiques en canc rologie digestive 2009 e PIPAM P le Interministriel de prospective et d anticipation des mutations conomiques R flexion prospective autour des biomarqueurs 2009 Parente Sandra Juin 2010 Page 120 sur 128 SITES INTERNET CONSULT S e http www ama assn org e http www e cancer fr Oncolor e www inserm fr thematiques cancer dossier cancer colorectal e http www oncoprof net e http www who int fr Parente Sandra Juin 2010 Page 121 sur 128 ANNEXE 1 ENQUETE DE SATISFACTION PLATEFORME REGIONALE LORRAINE DE GENOTYPAGE KRAS i Vous tes C Oncologue _ Anatomopathologiste O Secr taire LAURE Brasa 2 Vous exercez dans le secteur O Priv Public 3 Avez vous facilement eu acc s nos coordonn es t l phoniques et de t l copie O Oui Non 4
52. ceeeeeseeees Pharmacie clinique Alain BAGREL cane Biochimie Jean Claude BLOCK ccccconnnonccccncnnnnnn Sant publique Christine CAPDEVILLE ATKINSON Pharmacologie cardiovasculaire Chantal FINANCE Virologie Immunologie Pascale FRIANT MICHEL Math matiques Physique Audioproth se Christophe GANTZER Microbiologie environnementale Max AENR Msn Dr et Botanique Mycologie Jean Yves JOUZEAU Bioanalyse du m dicament Pierre LABRUDE same Physiologie Orthop die Maintien domicile Isabelle LARTAUD Pharmacologie cardiovasculaire Dominique LAURAIN MATTAR Pharmacognosie Brigitte LEININGER MULLER Biochimie Pierre LEROY remets Chimie physique g n rale Philippe MAINCENT oossoo Pharmacie gal nique Alain MARSURA UN Chimie th rapeutique Patrick MENU immense Physiologie Jean Louis MERLIN Biologie cellulaire oncologique Jean Bernard REGNOUF de VAINS Chimie th rapeutique Bertrand RIHN cocccccnnncnncnnnnnnnnnnn Biochimie Biologie mol culaire Jean Michel SIMON Economie de la sant l gislation pharmaceutique Parente Sandra Juin 2010 Page 4 sur 128 MAITRES DE CONF RENCES Sandrine BANAS cccoooooccccncnonanannnonon ns Parasitologie Mariette BEAUD 00oooooocioncoococccnnnnnnononos Biologie cellulaire Emmanuelle BENOIT osooso Communication et sant
53. ces enzymes sp cifiques des zones tudier Page 89 sur 128 Une fois la digestion r alis e et les fragments d ADN obtenus il faut les s parer par lectrophor se L ADN est d pose la cathode et va migrer sous l influence d un champ lectrique vers l anode La migration est d autant plus importante que le fragment d ADN est petit Les fragments d ADN sont ensuite r v l s et analys s b Analyse Le travail se fait sous la hotte mix o l on va pr parer les tubes patients et 4 tubes t moins Le travail s effectue sous la hotte pour ne pas contaminer ADN La premi re PCR commence par la pr paration du MIX compos de e Tampon PCR 10 e MgCl2 e dNTP e Solution Q e Amorce sens e Amorce anti sens e Hot Star Taq PCR e Eau Dans chaque tube on donne 23 microlitres de mix 2 microlitres d ADN tester ou t moin Les tubes sont plac s en thermocycleur Eppendorf pour 3 heures Les tubes t moins sont compos s d ADN extrait de lign es cellulaires de cancers coliques humains e 1avec le codon 13 mut Ce sont les cellules lovo e 1avec le codon 12 mut Ce sont les cellules SW620 e Zlavecnile codon 12 ni le codon 13 mut s Ce sont les cellules WiDr wt e 1necontient que de l eau A lissu des 3 heures il y a ajout des enzymes de restrictions Bst XI pour le codon 12 et Xcml pour le codon 13 Ces enzymes vont couper l ADN amplifi en des sites sp cifiques C est la premi re digestion La deuxi m
54. ctal m tastatiques MSI instabilit microsatellitaire N NFS num ration formule sanguine NK natural killer O OMS organisation mondiale de la sant P PAF Polypose ad nomateuse familiale ou syndrome de Gardner PCR polymerase chain reaction Parente Sandra Juin 2010 Page 20 sur 128 PCR RFLP polymerase chai reaction restriction fragment length polymorphism PCR HRM polymerase chain reaction high reaction melt PI3K phosphatidylinositol 3 kinase PI3P phosphatidylinostol 3 phosphate PI2P phosphatidylinositol 2 phosphate PTEN phosphatase and tensin homolog RER replication error S STIC soutien aux technologies innovantes et co teuses TDM tomodensitom trie TGF transforming growth factor TK tyrosine kinase TNM propagation de la maladie sur le site de la tumeur primitive T envahissement ganglionnaire N et pr sence de m tastases M a distance de la tumeur primitive V VEGF vascular endothelial growth factor VH domaine variable de la chaine constante VL domaine variable de la chaine l g re Parente Sandra Juin 2010 Page 21 sur 128 W WCRF world cancer research fund Parente Sandra Juin 2010 Page 22 sur 128 INTRODUCTION Le cancer colorectal est un probl me majeur de sant publique C est la deuxi me cause de d c s par cancer en France juste apr s le cancer des poumons La prise en charge du patient canc reux est difficile Elle est d pendante
55. d action commune entre op rateurs publics et priv s e La participation des actions europ ennes et internationales Tous les ans l INCa publie un rapport d activit En 2006 l INCa a labellis les plateformes de g n tique mol culaire et a mis en place un programme de d veloppement des plateformes hospitali res de g n tique somatique des cancers 28 plateformes labellis es sont r parties sur l ensemble du territoire figure 32 C est un projet national cr pour donner acc s aux traitements innovants l ensemble des patients d une r gion quelque soit l tablissement o il est pris en charge Les plateformes r gionales doivent tre capable de r pondre la demande de g notypage KRAS avec une s curit maximale et dans un d lai compatible avec l instauration du traitement Blons 2009 Un rapport d activit est rendu chaque ann e l INCa qui en fera une synth se nationale INCa 2009 Il existe pas ce jour de techniques de r f rence de norme qualit ou de contr le externe de qualit Chaque plateforme s est donc organis e selon ses moyens La mise en place de recommandations g n rales de contr le qualit sont des objectifs du projet national STIC MOKAECM coordonn es par le professeur Pierre Laurent Puig HEGP paris Parente Sandra Juin 2010 Page 83 sur 128 Figure 32 Plateformes de g n tique mol culaire des cancers INCa 2009 Il DE LA BIOPSIE A L ANALYSE Pour r
56. du stade de la maladie de l tat g n ral du patient notamment un stade pr coce la chirurgie pourra suffire la r mission du patient Mais dans de nombreux cas il faudra recourir la chimioth rapie Celle ci peut tre Curative Adjuvante a la chirurgie N oadjuvante la chirurgie Palliative Les traitements innovants rentrent dans le cadre d une chimioth rapie Ce sont des traitements a la carte ne s utilisant qu a certaines conditions et que pour certains types de cancer Ces th rapies d pendent des alt rations cellulaires pr sentent dans le tissu tumoral Deux types de th rapies cibl es sont utilis s dans le cas d une chimioth rapie pour un CCRm Le b vacizumab interagit avec le r cepteur au VEGF et le c tuximab et le panitumumab avec le r cepteur l EGF La condition n cessaire au bon fonctionnement des th rapies cibl es anti EGFR est la pr sence d une tumeur non mut e au niveau du g ne KRAS Ce n est pas le cas du B vacizumab qui peut tre utilis quelque soit le statut KRAS de la tumeur L valuation de cette mutation est fondamentale dans la prise en charge th rapeutique du patient Le c tuximab et le panitumumab sont les seuls anticorps anti EGFR ayant l AMM pour ce cancer et sous cette condition D autres facteurs pr dictifs de r ponse a ces traitements sont en cours d tudes D s 2006 l Institut National du Cancer INCa a lab lis 28 plateformes a
57. e N1 p 3 ad nopathies r gionales m tastatiques N2 la ou plus ad nopathies r gionales m tastatiques Nx Les ad nopathies r gionales ne peuvent tre valu es Nombre minimum de ganglions examin s 12 M tastases M MO Absence de m tastase M tastases distance l atteinte des ganglions iliaques externes ou M1 jiliaques communs de m me que l atteinte des ganglions non r gionaux est consid r e comme M1 Mx Statut m tastatique inconnu Figure 8 Classification TNM r f rentiel Oncolor Carol et Oncolie 2009 Parente Sandra Juin 2010 Page 38 sur 128 V e ml I Stade 1 II Stade IIa a Stade 11b a a a Stade III Stade Illa T1 T2 Ni MO Stade Ib 13 14 Nt MO o Stade IIc Tx N2 MO Stade IV TousT Tous N M1 Figure 9 Classification en stade r f rentiel Oncolor Carol et Oncolie 2009 LES TRAITEMENTS Le traitement est d fini en accord avec le patient Il va d pendre de la localisation du stade de l histologie et de l tat g n ral du patient Diff rents traitements sont mis en place selon l objectif vis qui est Soit un traitement curatif Soit un traitement palliatif Le traitement choisit doit permettre d viter les complications et de pr server la qualit de vie du patient Si le cancer est limit au colon ou rectum et qu il n y a pas de m tastase ni d envahissement ganglionnaire la chirurgie es
58. e PCR est lanc e pour une dur e de 16 heures Les morceaux d ADN vont tre amplifi s et une seconde digestion sera effectu e Parente Sandra Juin 2010 Page 90 sur 128 A la fin de cette PCR on obtient un ADN mut compos de 2 segments ou un ADN non mut compos de 3 morceaux L ADN des patients et les t moins sont plac sur un gel d agarose pour une migration A l issue de cette migration on verra si des mutations sont pr sentes ou non sur les codons 12 et 13 c Exemple de r sultat Recherche de mutations sur le codon 12 N Digestion enzymatique par Bst XI z m l d a sstseesare 595 5 2 v a 1361 a mat WIDH a 2 Y E Ma Non mute Recherche de mutations sur le codon 13 Digestion enzymatique par Xcm yzg TRN Figure 39 R sultat de PCR RFLP Sur la figure 39 on peut voir qu aucun patient ne pr sente une tumeur mut e sur le codon 13 car seul le t moin Lovo migrer Par contre sur le codon 12 9 tumeurs sont mut es 2 Taqman a Principe La sonde Taqman est sp cifique de la s quence amplifier Elle est marqu e par un fluorophore en 5 reporter et en 3 quencher Parente Sandra Juin 2010 Page 91 sur 128 Quand le reporter met de la fluorescence celle ci est att nu e par le quencher proximit Si la sonde est d grad e l intensit de la fluorescence est augment e Cette intensit est proportionnelle au produit de PCR Au cours de la p
59. e cancer du c lon et du rectum m tastatique les mol cules ayant AMM sont les anti EGFR 7 EGFR au niveau de la cellule tumorale Le r cepteur est surexprim dans de nombreux types de cancers tels que le cancer colorectal le cancer bronchique non petites cellules et le cancer pidermo de de la t te et du cou Le cancer colorectal surexprime l EGFR dans 60 80 des cas figure 15 Cancer colorectal Carcinome pidermoide de la t te et du cou 60 80 95 100 Cancer du poumon 40 80 Cancer du sein Cancer de l ovaire 35 70 14 91 Cancer du rein 50 90 Figure 15 Expression de l EGFR dans diff rents types de cancer Au niveau des cellules normales l activit de l EGFR est parfaitement contr l e Ce n est plus le cas dans les cellules tumorales o il est surexprim gt 100000 le r cepteur est dim ris et l activit tyrosine kinase provoque en permanence la phosphorylation de la tyrosine Parente Sandra Juin 2010 Page 52 sur 128 Cette surexpression entraine pour la cellule tumorale e Une inhibition de l apoptose e L angiog n se pour la croissance de la tumeur et des m tastases par apport d oxyg ne et des nutriments e La motilit de la tumeur e M tastase La surexpression du r cepteur n est pas le seul m canisme observ au niveau de la cellule tumorale En effet on remarque galement qu il y a une augmentation de la conce
60. e et donc la diffusion des m tastases sont interrompus En plus du blocage du domaine de liaison le cetuximab induit l internalisation de l EGFR La disponibilit du r cepteur est alors diminu e Enfin en se fixant sur l EGFR sa r gion Fc recrute des cellules de l immunit et d clenche l ADCC et la lyse ou phagocytose de la cellule tumorale 5 Utilisation Le c tuximab est indiqu dans le traitement du cancer colorectal m tastatique avec un g ne KRAS non mut de type sauvage Il s utilise en association avec une chimioth rapie L tude Bond Cunningham 2004 a montr une efficacit plus importante de l association c tuximab irinot can par rapport au c tuximab seul 22 5 contre 10 8 La survie sans progression est sup rieure figure 23 75 y Cetuximab plus irinotecan 75 x lt A Cetuximab 50 ii T DUT 25 i Waite er Patients Surviving a Cetuximab plus irinotecan SE Cetuximab amp 0 0 25 5 0 7 5 10 0 125 15 0 17 5 Overall Survival Time months Time to Progression months Figure 23 Repr sentation de la survie sans progression A et de la survie globale B de l tude BOND Cunningham 2004 Parente Sandra Juin 2010 Page 62 sur 128 L tude CRYSTAL a galement montr le gain de r ponse lors de l association de cet anti EGFR avec un protocole FOLFIRI par rapport a un protocole FOLFIRI seul figure 24 C Wild Type KRAS Population Cetuximab
61. enerale2000 g03_Depistage Index index_dp11 htm Le patient d pose une petite quantit de selles de la taille d une lentille sur un papier avec trois ronds impr gn s de ga ac Le patient doit pr lever deux endroits diff rents Le pr l vement est fait sur trois selles successives Donc le patient renverra 3 plaquettes au laboratoire Le sang n est pas mis en permanence dans les selles faire 3 pr l vements 2 endroits diff rents augmente les chances d en trouver figure 4 Parente Sandra Juin 2010 Page 31 sur 128 DANS LES SELLES Vous avez maintenant la lettre d ADECA 75 avec E Votre m decin vous a remis vos tiquettes personnalis es Ouvrez le test il contient ine fiche d identification l enveloppe T pour le laboratoire trois plaquettes gt CAED O 800 10 50 32 et une enveloppe Hemoccult le test Hemoccult six batonnets en carton la fiche d identification une pochette de protection Installez un sac sur la cuvette Collez une etiquette et refermez l abattant des WC Avec le batonnet pr levez D posez l chantillon sur sur chacune pour le coincer un chantillon de selle le cadre A de la plaquette des trois plaquettes NB P pren L chantillon ne doit pas tre eh doi plus gros qu un grain de riz Figure 4 Mode d emploi de l Hemoccult II pour les patients Le papier est envoy au laboratoire o il est r hydrat Vient ensuite l ajout d une solution alcoolique oxyg n e Une r action positive se
62. erficielles peuvent tre n gatives alors que celles en profondeur de la tumeur surexprime le r cepteur Une autre m thode utilis e est l hybridation in situ Elle recherche l amplification du gene de l EGFR La grande majorit des tudes ont montr une corr lation entre le nombre de copies de l EGFR d termin es par hybridation in situ et la r ponse Khambata Ford 2007 La PCR quantitative sert galement l analyse Parente Sandra Juin 2010 Page 70 sur 128 Valeur pr dictive de EGFR Pour qu un patient puisse recevoir un traitement par c tuximab il fallait que le marquage immunohistochimique affecte 1 des cellules tumorales Cette notion est devenue obsol te car il a t d montr que des tumeurs colorectales ne surexprimant pas l EGFR pouvaient r pondre un traitement par anticorps anti EGFR Chung 2005 Par contre le nombre de copie d EGFR est un facteur pronostique des cancers du poumon non petites cellules Hirsch 2003 En effet il y a une corr lation entre le nombre de copie d EGFR et la r ponse aux inhibiteurs de tyrosine kinase Polymorphisme des r cepteurs Fc gamma Le c tuximab et le panitumumab sont deux AC se fixant sur l EGFR par leur partie Fab Le fragment Fc tant libre pour recruter les cellules notamment de l ADCC Le fragment Fc de l Ac interagit avec le r cepteur ce fragment au niveau de la cellule immunitaire Ce r cepteur est de type Fc gamma et un polymor
63. gene i Eusomy marked polysomy amplification No cetuximab Cetuximab PTEN f PIN PTEN PTEN K Ras wt ees mut K Ras mut HER wt e A Sa a Response Resistance Figure 31 Algorithme de r ponse au c tuximab en fonction du statut de KRAS PTEN et de l EGFR Frattini 2007 Le Centre Alexis Vautrin de Nancy a tudi en collaboration avec l h pital europ en les phosphoprot ines des 2 voies principales de signalisation intracellulaire pMEK pERK1 2 pAKT pP70S6K et pGSK3beta sur les tumeurs de 42 patients trait s par anti EGFR panitumumab ou c tuximab Apres dosage et recherche des mutations il a t observ que la r sistance au traitement est li e au niveau d expression de pP70S6k Le haut niveau d expression de cette phosphoprot ine est associ ind pendamment du statut KRAS a une survie globale diminu e Perkins 2010 d Toxicit cutan Les anticorps anti EGFR ont de nombreux effets ind sirables Les r actions cutan es et sous cutan es ruptions rash acn iformes s cheresse cutan e prurit desquamation atteinte ungu al Perz Soler 2003 et Segaert 2005 Ces effets touchent approximativement les 3 4 des patients sous Erbitux mais ils restent peu s v res dans 85 des cas Parente Sandra Juin 2010 Page 79 sur 128 Ces r actions apparaissent habituellement au cours de 2 ou 3 premi res semaines de traitement Ces r actions semblent tre d pendantes de la dose et
64. gure 47 Repr sentation Normalized melting curves Le patient en vert suit le profil du t moin non mut violet B3 PATIENT 3 B22 T moin mut B23 T moin non mut C3 PATIENT 3 C22 T moin mut C23 T moin non mut Relative Signal Difference 775 78 78 5 79 79 5 80 80 5 81 81 5 82 825 83 835 Temperature C Figure 48 Repr sentation Normalized and temp shifted difference plot Le patient en vert se situe pres du t moin non mute Parente Sandra Juin 2010 Page 98 sur 128 Mut Le patient 12 a pour les deux repr sentations figure 49 et 50 un profil se rapprochant du t moin mut On peut conclure un profil patient mut Relative Signal 100 000 30 00 80 00 70 001 60 00 50 00 40 00 30 00 20 00 10 000 0 001 C22 T moin mut C23 T moin non mut Normalized Melting Curves C12 PATIENT 12 B22 T moin mut 623 T moin non mut de NN NS 1 AN N k 73 745 8 80 5 81 815 82 825 83 835 Temperature C Figure 49 Repr sentation Normalized melting curves Le patient en orange se rapproche du t moin mut en rouge Normalized and Temp Shifted Difference Plot B22 T moin mut B23 T moin non mut C12 PATIENT 12 C23 T moin non mut 79 795 80 805 81 815 82 825 83 835 Temperature C Figure 50 Rep
65. icolantonio 2008 ont r alis une tude bas e sur l hypoth se que si KRAS est sauvage la mutation de BRAF est un facteur pr dictif de r ponse au traitement monoclonal Sur 113 patients 34 ont une tumeur portant la mutation KRAS et 79 ont le type sauvage Sur les 79 patients KRAS sauvage 11 pr sentent une mutation de BRAF au niveau de l all le V600E Ces 11 patients ne r pondaient pas au traitement par anticorps anti EGFR Par contre apr s administration d un inhibiteur de BRAF la sensibilit aux anti EGFR est retrouv e La mutation de BRAF est donc un facteur pr dictif de r ponse au traitement par anti EGFR Les mutations de KRAS et de BRAF sont exclusives La valeur pr dictive de BRAF comme facteur de r ponse au traitement est une notion controvers e D autres tudes comme celles de Laurent Puig Laurent Puig Parente Sandra Juin 2010 Page 76 sur 128 2009 n attribue pas de valeur pr dictive a ce marqueurs mais plut t une tr s forte valeur pronostic quant la survie sans progression et la survie globale Il a galement t d montr que les patients avec une tumeur BRAF mut e on un risque de progression de la maladie plus important que les patients avec une tumeur BRAF sauvage La mutation de BRAF est l aussi un facteur pronostic de la maladie Souglakos 2009 Enfin la mutation de cette prot ine est retrouv e chez les patients avec un CCRm o le syst me de r paration de l ADN MMR D
66. igure 29 Mode d action du c tuximb Erbitux quand le g ne KRAS est de type sauvage eococcccococcnoconnncconananonns 75 Figure 30 Perturbation entrain e par un KRAS mut cccccesssssccsecessessscsceseceseessaseceseceseeseaseassecsceeseuseasseeseseeeaaes 76 Figure 31 Algorithme de r ponse au c tuximab en fonction du statut de KRAS PTEN et de l EGFR Frattini LOOT A OA E NARA 79 Figure 32 Plateformes de g n tique mol culaire des cancers INCa 2009 ccoooooconocuccnoconanononacanononanononanonocn 84 Figure 33 Interaction entre le prescripteur le pathologiste et le laboratoire 85 Figure 34 Microtome et ruban de paraffine ss 85 Figure 35 La lame etle bloc ni anni iria etes etes ts e aaa Aita daa cuire rase ead ir san ee 86 Figure 36 Correspondance entre la zone cercl e par l anatomopathologiste et le bloc 86 Figure S7AKITQIAGEN 0 A a AR eg oe eet 87 Fig re 38 Principe de la PCR A a a aid 89 Eigure 39 R sultat de POR RELP cc cccccccccutsesedeotecscatenredeccesecusaundacdsddadecendeasoessscdenntacseds coed cndeeaadtadnessadeuncaasdedeen dances 91 Figure 40 Principe de la sonde Tagman eee 92 Figure 41 Repr sentation la sonde VIC de l ensemble des patients pour le locus 122GT 94 Figure 42 Repr sentation la sonde FAM de l ensemble des patients pour le locus 122GT 94 Figure 43 Repr sen
67. implication th rapeutique Bull cancer 2007 94 171 6 Spano JP Qu est ce qu une th rapie cibl e Le point de vue du clinicien Bull cancer 2007 94 111 4 T Thomas SM Grandis JR Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of EGFR inhibitors under clinical investigation Cancer Treat Rev 2004 30 255 268 V Van Cutsem E K hne CH Hitre E Zaluski J Chang Chien CR Makhson A et al Cetuximab and chemotherapy as initial treatment for metastatic colorectal cancer N Engl J Med 2009 360 1408 17 Van Cutsem E Mayer R Gold P Correlation of acne rash and tumor response with cetuximab monotherapy in patients with colorectal cancer refractory to both irinotecan and oxaliplatine Eur J Cancer 2004 279 85 86 Voldborg BR Damstrup L Spang Thomsen M and Poulsen HS Epidermal growth factor receptor EGFR and EGFR mutations function and possible role in clinical trials Ann Oncol 1997 8 1197 1206 Parente Sandra Juin 2010 Page 118 sur 128 W Wells A EGF receptors Int J Biochem Cell Biol 1999 31 637 643 Z Zhang W Gordon M Schultheis AM Yang DY Nagashima F Azuma M et al FCGR2A and FCGR3A polymorphisms associated with clinical outcome of epidermal growth factor receptor expressing metastatic colorectal cancer patients treated with single agent cetuximab J Clin Oncol 2007 25 3712 3718 Parente Sandra Juin 2010 Page 119 sur 128 OUVRAGES CONSULT S e AMGEN
68. is par coloscopie TDM thoraco abdo pelvien ou par morpho TEP Si la tumeur est r secable la chirurgie peut tre r alis e dans un premier temps puis pourra intervenir la chimioth rapie adjuvante ou inversement Dans le cas d une tumeur non r secable la chimioth rapie est commenc e le plus t t possible suivi d une valuation du traitement figure 10 M tastases synchrones Non M tastases m tachrones Bilan de r s cabilit coloscopie TDM thoraco abdo pelvien morpho TEP si l intervention est envisageable l issue des 2 premiers examens Non Figure 10 Arbre d cisionnel dans le cas de m tastases m tachrones R f rentiel Oncolor Carol et Oncolie 2009 M tastases synchrones Un bilan de r secabilit est galement effectu La tumeur op rable est retir e de suite ou ult rieurement Plusieurs sch mas th rapeutiques sont possibles e Chirurgie de la tumeur primitive et des m tastases au cours de la m me op ration e Chirurgie de la tumeur suivie d une chimioth rapie et chirurgie des m tastases Dans tous les cas une chimioth rapie adjuvante peut tre envisag e Les m tastases synchrones non r secables demandent l valuation du statut KRAS Une chimioth rapie est r alis e avec r valuation de l op rabilit au bout de 2 3 mois figure 11 Le tableau 3 r sume les mol cules utilis es Parente Sandra Juin 2010 Page 42 sur 128 Tableau 3 Mol cules
69. la Fc Rllla Polymorphisms and KRAS Mutations on the Clinical Outcome of Patients With Metastatic Colorectal Cancer Treated With Cetuximab Plus Irinotecan JCO 2009 27 1122 1129 Bibeau F Frugier H Denouel A Sabourin J C Boissiere Michot F Technical considerations for KRAS testing in colorectal cancer The pathologist s point of view Bull Cancer 2009 96 15 22 Blons H Laurent Puig P Aspect technique de la d termination du statut KRAS dans le cancer colorectal et mise en place en France Point de vue du biologiste Bull Cancer 2009 96 47 55 Busam KJ Capodieci P Motzer R et al Cutaneous side effects in cancer patients treated with the antiepidermal growth factor receptor antibody C225 Br J Dermatol 2001 144 1169 1176 C Ciardiello F Tortora G A novel approach in the treatment of cancer targeting the epidermal growth factor receptor Clin Cancer Res 2001 7 2958 2970 Parente Sandra Juin 2010 Page 113 sur 128 Chung KY Shia J Kemeny NE Shah M Schwartz GK Tse A et al Cetuximab shows activity in colorectal cancer patients with tumors that do not express the epidermal growth factor receptor by immunohistochemistry J Clin Oncol 2005 23 1803 10 Cunningham D Humblet Y Siena S Khayat D Bleiberg H Santoro A et al Cetuximab Monotherapy and Cetuximab plus Irinotecan in Irinotecan Refractory Metastatic Colorectal Cancer N Engl J Med 2004 351 337 345 D Di Nicolantonio F Marti
70. ne quantit de mix est m lang l ADN patient et t moin Le m lange est ensuite d pos dans une plaque 384 puits et la plaque est mise dans l appareil analyse c Exemple de r sultat NON mut La repr sentation des courbes de fusion montre que l amplification pour ce puit est correcte car elle a la m me allure le m me niveau de fluorescence que pour les t moins mut et non mut figure 46 Melting Curves B3 PATIENT 3 B22 T moin mut B23 T moin non mut C3 PATIENT 3 C22 T moin mut C23 T moin non mut 144 611 a 134 6114 SES 124 6114 114 6114 o oD a Fluorescence 465 510 pos Ez 66 68 7 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 g2 94 Temperature C Figure 46 Courbe d amplification Parente Sandra Juin 2010 Page 97 sur 128 Les repr sentations normalized melting curves et normalized and temp shifted diff rence plot sont interpr t es ensemble pour conclure une mutation ou non du g ne KRAS Ici le patient a un profil se rapprochant pour les 2 repr sentations de celui du t moin non mut figure 47 et 48 On conclut donc un patient non mut par la technique de la PCR HRM B3 PATIENT 3 B22 T moin mut B23 T moin non mut C3 PATIENT 3 C22 T moin mut C23 T moin non mut Relative Signal 75 18 185 B 75 60 605 F s5 82 65 8 835 Temperature C Fi
71. ni M Molinari F Sartore Bianchi A Arena S Saletti P et al Une forme sauvage de BRAF est n cessaire a la r ponse au panitumumab ou au c tuximab dans le cancer colorectal m tastatique J Clin Oncol 2008 26 5705 5712 E Esser A F Big MAC attack complement proteins cause leaky patches Immunol Today 1991 12 316 318 F Faivre J Dancourt V Le d pistage du cancer colorectal certitudes et questions Gastroenterol Clin Biol 2002 26 86 93 Frattini M Saletti P Romagnani E Martin V Molinari F Ghisletta M et al PTEN loss of expression predicts cetuximab efficacy in metastatic colorectal cancer patients Br J Cancer 2007 97 1139 1145 G Gentile M S Vasu C Green A Murillo G Das Gupta T Constantinou A et al Targeting colon cancer cells with genistein 17 1A immunoconjugate Bull Cancer 2003 22 955 959 Grandjouan S Surveillance des sujets a risque tres lev de cancer colorectal polyposes cancer colique h r ditaire sans polypose Acta Endoscopica 2002 32 633 654 Parente Sandra Juin 2010 Page 114 sur 128 Guldenfels IC Brian on S Houot O Junod B Deschamps J P Comparaison du rapport co t efficacit de deux tests de d pistage des tumeurs colo rectales dans un centre d examen de sante Acta Endoscopica 1990 20 27 32 H Herbst R Shin D Monoclonal Antibodies to Target Epidermal Growth Factor Receptor Positive Tumors A New Paradigm for Cancer Therapy Cancer C
72. niveau cutan il a pour r le de stimuler la prolif ration des k ratinocytes assurer leur survie leur mobilit r guler leur diff renciation et favoriser la gu rison des plaies Apr s analyse du rash sur des patients trait s par c tuximab Busam et al Busam 2001 ont conclu que le rash est caract ris par une p rifolliculite ou une folliculite sans origine infectieuse Le m canisme est encore m connu mais des hypoth ses ont t mises La r action serait li e l inflammation due au d blocage des chimiokines Parente Sandra Juin 2010 Page 80 sur 128 PARTIE IV Organisation du g notypage KRAS en Lorraine Enqu te de satisfaction Parente Sandra Juin 2010 Page 81 sur 128 Nous avons vu pr c demment que lors d un cancer du colon m tastatique le patient n est pas soign avec les m mes th rapeutiques selon que la tumeur est porteuse ou non de la mutation KRAS Le Centre Alexis Vautrin de Nancy organise le g notypage KRAS en Lorraine dans le cadre de l activit de la plateforme r gionale de g n tique mol culaire des tumeurs de l INCa PRESENTATION DE L INCA L INCa a t cr e par la loi de sant publique du 9 ao t 2004 dans le cadre du plan cancer Il est plac sous la tutelle des minist res charg s de la recherche et de la sant L INCa permet d instaurer une politique nationale Il couvre tous les domaines de la lutte contre le cancer Le but de cet instit
73. ntration des ligands une diminution de l activit de la phosphatase inhibant l activit Tk donc de PTEN une diminution du turnover du r cepteur et une mutation de l EGFR Il RAPPEL SUR LES ANTICORPS MONOCLONAUX Les anticorps Ac sont des immunoglobulines lg fabriqu es par le syst me immunitaire capable de reconna tre et de se fixer sur une structure chimique compl mentaire de la leur appel e antig ne Ag Nous n tudierons ici que les anticorps monoclonaux anti EGFR utilis s dans le traitement des cancers colorectaux c tuximab Erbitux et panitumumab Vectibix Ce sont des anticorps de type lgG1 pour le c tuximab et IgG2 pour le panitumumab 1 Structure Tous les Ac sont des prot ines Les Ac ont 3 segments e 2 segments Fab Fragment Antibody Binding e 1segment Fc Fragment Constant Le segment Fab est une structure variable d un Ac l autre Il est compl mentaire de l Ag Le segment Fc est identique pour tous les Ac d une m me esp ce Il se fixe sur des r cepteurs membranaires au niveau des cellules immunitaires Parente Sandra Juin 2010 Page 53 sur 128 site antig nique Cha ne lourde Pont disulfure r gion variable ek zones hyper variables Cha ne l g re MOLECULE r gion C 1MMUHO constante GLOBULINE site de fixation a certains r cepteurs membranalres Figure 16 Structure de base d un anticorps Chaque Ac est compos
74. olym risation l activit 5 vers 3 de la Taq polym rase d grade la sonde et l intensit de la fluorescence augmente figure 40 ORS R Reporter Polymerization Q Quencher Forward Primer Reverse Primer Strand Displacement 5 Polymerization Completed 5 3 5 Figure 40 Principe de la sonde Taqman b Analyse Cette technique donne des r sultats rapidement Parmi toutes les mutations possibles sur les codons 12 et 13 les 7 mutations les plus fr quemment recherch es sont Parente Sandra Juin 2010 Page 92 sur 128 e 6surle codon 12 o 121 6GA GC GT o 122 GAGC GT e 1 surle codon 13 o 132 GA Tout d abord il y a pr paration du MIX e Genotyping mix e Assay mix e Eau Puis d p t dans chaque puits de 5 microlitres de Mix et 1 microlitre d ADN patient ou t moin La machine fait 45 cycles La sonde VIC permet de voir l amplification et la sonde FAM la mutation c Exemple de r sultat On peut soit analyser une mutation soit faire l analyse pour chaque patient et chaque locus d Analyse d un locus pour l ensemble des patients exemple 122 GT La repr sentation des profils patients par la sonde VIC montre que l amplification est correcte le r sultat par la sonde FAM peut donc tre analys figure 41 Parente Sandra Juin 2010 Page 93 sur 128 Fluorescence 533 580 Cycles Figure 41 Repr sentation la sonde VIC de l ensemble des
75. ommation d alcool afin de r duire le risque de can cers limiter la consommation autant que possible tant en termes de quantit s consomm es que de fr quence de consommation En cas de difficult envisager un accompagnement et ventuellement une prise en charge Les enfants et les femmes enceintes ne doivent pas consommer de boissons alcoolis es Surpoids et ob sit e Maintenir un poids normal IMC entre 18 5 et 25 kg m Pour pr venir le surpoids et l ob sit pratiquer au moins 5 jours par semaine au moins 30 minutes d activit physique d intensit mod r e comparable la marche rapide ou pratiquer 3 jours par semaine 20 minutes d activit physique d intensit lev e comparable au jogging et limiter les activit s s dentaires ordinateur t l vision consommer peu d aliments forte densit nerg tique et privi l gier les aliments faible densit nerg tique tels que les fruits et l gumes Surveiller le poids de fa on r guli re une fois par mois Pour les sujets pr sentant un surpoids IMC gt 25 kg m une ob sit IMC gt 30 kg m ou une prise de poids rapide et impor tante l ge adulte un accompagnement et ventuellement une prise en charge sont envisager Fruits et l gumes Consommer chaque jour au moins 5 fruits et l gumes vari s quelle que soit la forme crus cuits frais en conserve ou surgel s pour atteindre au minimum 400 g par jour
76. on antig ne anticorps 56 Figure 19 M canisme del AD GG cavscaccs inner iaioa reia Eaa Ee sucre su d fis ess enr EE E odo vend e serie teste ne da desea said 57 Figure 20 Les diff rentes tapes de l activation du compl ment anno ncnnnnnnnnnns 58 Figure 21 La production des anticorps monoclonaux 59 Figure 22 Evolution chronologique des anticorps monoclonaux Prin Mathieu 2003 60 Figure 23 Repr sentation de la survie sans progression A et de la survie globale B de l tude BOND Cunningham 2004 A net anim the ANG A A iaa 62 Figure 24 Impact du traitement c tuximab FOLFIRI vs FOLFIRI seul sur des tumeurs non mut es KRAS tude CRYSTAL et repr sentation de la survie sans progression C et de la survie globale D Van Cutsem 2009 63 Figure 25 Repr sentation de la survie sans progression en fonction du traitement c tuximab FOLFOX 4 A versus FOLFOX 4 B et en fonction de la mutation KRAS tude OPUS Bokemeyer 2009 64 Parente Sandra Juin 2010 Page 16 sur 128 Figure 26 Effet du panitumumab sur la survie sans progression par rapport un traitement palliatif Amodo Figure 27 Localisation des mutations KRAS es 73 Figure 28 Repr sentation de la survie sans progression A et de la survie globale B en fonction de la pr sence ou l absence de mutation KRAS Li vre 2008 74 F
77. on de la pr sence ou l absence de mutation KRAS Li vre 2008 Benvenuti et al ont galement conclu une r ponse n gative du c tuximab ou panitumumab en pr sence de mutations KRAS Benvenuti 2007 En l absence de mutation KRAS KRAS sauvage figure 29 Le ligand se lie sur la partie extracellulaire Il s ensuit la phosphorylation du domaine tyrosine kinase en intracellulaire et l activation de la cascade de transduction du Parente Sandra Juin 2010 Page 74 sur 128 signal Si la fixation du ligand est emp ch e par le c tuximab ou le panitumumab la phosphorylation ne se fait pas Ligands e g TGFA 3 4 Erbitux LA i EN Ras normale e g VEGF A ES Angiogen se 3 ie Q a M tastases Survie Prolif ration Figure 29 Mode d action du c tuximb Erbitux quand le g ne KRAS est de type sauvage En pr sence de mutations KRAS figure 30 Les anticorps anti EGFR se lient tr s sp cifiquement l EGFR pour le bloquer Lorsque la prot ine RAS est mut e elle est constamment activ e ind pendamment de la fixation du ligand La fixation des anticorps n a aucun effet sur la signalisation Parente Sandra Juin 2010 Page 75 sur 128 e g VEGF 2 Angiogen se os t M tastases Survie Prolif ration Figure 30 Perturbation entrain e par un KRAS mut BRAF La prot ine BRAF est une s rine thr onine kinase C est l effecteur principal de KRAS Di Nicolantonio et al Di N
78. options s offrent vous Soit l envoi du bloc directement au centre effectuant le g notypage Soit la pr paration de 3 5 copeaux de 10 microns ventuellement apr s macrodissection du bloc pour liminer les zones non tumorales d poser dans des tubes type nalg ne et acheminer rapidement au centre responsable du g notypage e Date de r ception de la demande e Pr l vement Q frais congel M inclus en paraffine __Identit du pr l vement v rifi e 0 gt e Pr sence de cellules canc reuses en quantit suffisante autorisant la r alisation du test K Ras 1 oui 3 non lt AOU MOSS caras sas Attention tous fixateurs possibles sauf liquide de Bouin et autre fixateur base d acide picrique examen non r alisable si le pr l vement a t au contact du liquide de Bouin Date de transmission du pr l vement au laboratoire responsable du g notypage mol culaire liso e Nom du pathologiste e Signature du pathologiste Cachet Realisation du g notypage K Ras e Date de r ception de la demande e Technique utilis e CY PCR quantitative I s quen age direct e Remarques e Date du r sultat e R sultat transmis au m decin demandeur le Parente Sandra Juin 2010 Page 125 sur 128 Demande de g notypage K Ras du cancer colorectal FICHE DE SUIVI Partie r serv e au demandeur du g notypage K Ras
79. phisme variation entre les individus de la s quence des g nes existe Fc gamma RIla et Fc gamma Rilla Bibeau et son quipe Bibeau 2009 ont montr que la r ponse au traitement par c tuximab tait meilleure si le r cepteur est de type Fc gamma Rllla 131 H H ou Fc gamma Rlla 158 v v Le polymorphisme joue un r le pronostic dans le CCRm trait par c tuximab La survie sans progression de la maladie est sup rieure Zhang et al ont men une tude en 2007 sur 39 patients trait s uniquement par c tuximab Ils ont observ que selon le polymorphisme de ce r cepteur la survie sans progression tait diff rente Tr s r cemment il a t d montr que les lg G de type Il comme le panitumumab ne d clenche l ADCC qu au niveau de la lign e my lo de Schneider Merck 2010 b Les ligands de EGFR Parente Sandra Juin 2010 Page 71 sur 128 L pir guline ou EREG fixe ErbB et ErbB4 et l amphir guline ou AREG fixe ErbB1 Une tude a t r alis e sur 110 patients avec un cancer colorectal m tastatique trait s par c tuximab en monoth rapie L analyse des biopsies a montr que les patients pour lesquels la concentration en epir guline et amphir guline est lev e r pondent mieux au c tuximab Khambata ford 2007 Jacobs Jacobs 2009 a galement r alis e une tude sur 220 patients trait s pour un CCRm par une association de c tuximab et d irinot can Jacobs a observ que les ARNm de EREG
80. plus te FOLFIRI AN Les FOLFIRI alone Probability of Progression free Survival o 0 2 4 6 3 10 12 14 16 Progression free Survival mo No at Risk Cetuximab plus 172 151 FOLFIRI FOLFIRI alone 176 146 121 97 65 29 10 3 126 101 71 42 26 16 6 D Wild Type KRAS Population 08 aN 0 7 de 0 6 DE Cetuximab plus eee FOLFIRI alone i Probability of Overall Survival o D 0 2 0 1 0 0 0 6 12 18 24 30 36 Overall Survival mo No at Risk Cetuximab plus 172 155 129 110 83 27 5 FOLFIRI FOLFIRI alone 176 160 125 98 72 24 7 Figure 24 Impact du traitement c tuximab FOLFIRI vs FOLFIRI seul sur des tumeurs non mut es KRAS tude CRYSTAL et repr sentation de la survie sans progression C et de la survie globale D Van Cutsem 2009 Enfin l tude OPUS montre le gain d efficacit de l association c tuximab FOLFOX 4 par rapport au FOLFOX 4 seul Bokemeyer 2009 figure 25 Parente Sandra Juin 2010 Page 63 sur 128 KRAS Population Cetuximab FOLFOX 4 10 KRAS Population FOLFOX 4 ae o e Mutant eee Wild type ee Mutant vee Wild type o 5 0 8 v 5 0 8 ws ae oa S S o 0 6 6 0 6 pa oS A e me D 04 Mutant 5 x 0 4 Mutant Wild type 2 2 No of pts 52 61 O S No of pts 47 73 Progr 39175 0 30 422 FE Progr 26 55 3 48 65 8 a 2 Cens 13 25 0 31 50 8 a 0 2 Cens 21144 7 25 34 2 0 2 Median
81. qualit car il pourra b n ficier du traitement qui lui est le plus adapt Mais ce retard peut tre mal v cu par le patient d j fragilis par la maladie Tout en respectant les recommandations de INCa c est dire un diagnostic de cancer colorectal m tastatiques le g notypage devrait tre anticip au moment du diagnostic Cela permettra d instaurer rapidement le traitement Parente Sandra Juin 2010 Page 108 sur 128 CONCLUSION Le cancer colorectal est le deuxi me cancer le plus meurtrier apr s celui des poumons dans les pays occidentaux Le d pistage de masse de la population g n rale est une n cessit pour tenter de diminuer la mortalit due ce cancer en France La mesure 14 du plan cancer 2009 2013 pr voit de lutter contre les in galit s d acc s et de recours au d pistage Une coloscopie est r alis e apr s un r sultat positif l Hemoccult II ainsi qu un bilan complet du patient comprenant un examen biologique une chographie h patique une radiographie pulmonaire En fonction des r sultats de ces analyses la maladie sera class e en stade et une th rapeutique adapt e sera instaur e La prise en charge du cancer colorectal m tastatique a volu gr ce l apparition des th rapies cibl es notamment celles anti EGFR en 2008 La survie globale et la survie sans progression ont t am lior es Le c tuximab et le panitumumab sont deux anticorps monoclonaux anti EGFR ayant une AMM pou
82. que cycle l ADN est dupliqu L amplification se fait par une suite de r plication de la matrice ADN a double brin Les amorces choisies sont sp cifiques de la zone d int r t La premi re tape est la d naturation de l ADN double brin par une temp rature de 95 C A cette temp rature les liaisons faibles qui relient les 2 brins d ADN se rompent Intervient ensuite l hybridation des amorces sur chacune des 2 cha nes par appariement compl mentaire des bases Et enfin l longation a partir des amorces permet de former 2 copies d ADN L longation se fait par ajout de dNTP sous l action de l ADN polym rase a une temp rature de 72 C figure 38 Parente Sandra Juin 2010 Page 88 sur 128 MATERIEL DI vis e DEPART S quence f vis e iu ADN Chaleur 4 Refroidissement A Prolongement des amorces S quence Il y Y Y 1 ii MULTI ADN polym rase A A A A A A A Amorces boya 1 IK Cycle 2 Cycle 3 Figure 38 Principe de la PCR Parente Sandra Juin 2010 La PCR RFLP utilise des enzymes de restriction appel es endonucl ases de restriction Ce sont des enzymes qui coupent l ADN en des sites sp cifiques nomm s site de restriction Ces sites correspondent une courte s quence sp cifique selon l enzyme utilis e La digestion est r alis e apr s une premi re PCR L ADN issu de la PCR est incub en pr sence de
83. que patient Pour permettre l acc s ces analyses l ensemble de la population fran aise l Institut National du Cancer INCa mis en place d s 2006 des plateformes r gionales de g n tique tumorale En Lorraine cette plateforme est commune au CHU et au Centre R gional de Lutte contre le Cancer Alexis Vautrin Dans les cancers colorectaux c est l Unit de Biologie des Tumeurs au centre Alexis Vautrin de Nancy qui centralise la recherche de mutations KRAS Cette organisation repose sur la mise en place d un r seau collaboratif entre les cliniciens prescripteurs les anatomopathologistes et le laboratoire de g notype dont la performance conditionne directement la qualit des analyses en termes de d lai de rendu de r sultats Entre juin 2008 et d cembre 2009 ce sont plus de 800 cas de cancers colorectaux qui ont t analys s au Centre Alexis Vautrin pour l ensemble de la r gion lorraine Fin 2009 une enqu te diligent e par l Unit de Biologie des Tumeurs a t diffus e afin de conna tre son niveau d efficience Cette enqu te dont les r sultats sont analys s dans cette th se met en vidence l extr me importance des d lais de rendu des r sultats pour une prise en charge optimale du patient canc reux MOTS CLES KRAS EGFR c tuximab panitumumab cancer colorectal anticorps monoclonaux g notypage facteurs pr dictifs de r ponse aux traitements Directeur de th se Intitul du la
84. r sentation Normalized and temp shifted difference plot Le patient Parente Sandra Juin 2010 en orange a le m me profil que le t moin mute violet Page 99 sur 128 4 Avantages et inconv nient de chaque m thode Comme nous l avons dit pr c demment il n existe pas de recommandations g n rales pour le g notypage KRAS La plateforme du CAV utilise 3 techniques dont les avantages et les inconv nients tableau 7 sont r sum s dans le tableau ci dessous Tableau 7 Avantages et inconv nients des diff rentes m thodes utilis es par le CAV Dur e moyenne Avantages Inconv nients PCR RFLP 3 jours Technique sensible D tection de toute variation g n tique au niveau de l amplicon Identification de la mutation par une autre technique ADN dig r Haut risque de contamination Parente Sandra Juin 2010 PCR Taqman 2 heures Technique sensible Rendu des r sultats Rapide D tection d une seule mutation par r action de Nancy unit de biologie des tumeurs 2009 PCR HRM 2 heures Technique sensible D tection de toute variation g n tique au niveau de l amplicon Rendu des r sultats rapide Identification de la mutation par une autre technique Page 100 sur 128 IV ENQU TE DE SATISFACTION Dans l esprit d valuation et de rechercher de la qualit unit de biologie des tumeurs a envoy une enqu te de satisfaction annexe 180
85. r le cancer colorectal m tastatique sans mutation KRAS de la tumeur Alternativement le b vacizumab qui est un anticorps anti VEGF peut tre prescrit que la tumeur soit mut e KRAS ou non La recherche de la mutation KRAS est devenue un test important dans la prise en charge du patient C est le seul facteur pr dictif de r ponse au traitement par anticorps monoclonaux anti EGFR valid Mais l utilisation de ces mol cules ne garanti pas la r ussite du traitement car de nombreuses tudes ont montr que d autres facteurs seraient susceptible d intervenir comme BRAF PI3K PTEN ou encore l expression du r cepteur l EGF De plus en relation avec un polymorphisme germinal des r cepteurs Fc gamma chaque patient poss de un g notype qui lui est propre susceptible d influer galement dans la r ponse aux anticorps monoclonaux Le g notypage KRAS est organis en Lorraine par l unit de biologie des tumeurs du centre Alexis Vautrin de Nancy La demande de g notypage est envoy e par le clinicien au pathologiste Celui ci apr s d sarchivage des pr l vements tumoraux ant rieurs va analyser le bloc de paraffine incluant une partie de la tumeur pour d finir la zone o il y a plus de 50 de cellules tumorales Le laboratoire r alise analyse de l ADN tumoral de cette zone au moyen de trois techniques Entre la prescription du g notypage et du rendu des r sultats il s coule en moyenne 15 jours Parente Sandra Juin 20
86. s 400 mg m2 5 fluoro uracile 600 mg m2 oxaliplatine 85 mg m2 b vacizumab 5mg kg XELOX oxaliplatine a 130 mg m2 cap citabine a 1000 mg m2 FOLFIRI Acide folinique 180 mg m2 5 fluoro uracile en bolus 400 mg m2 5 fluoro uracile 1200 mg m2 irinot can 180 mg m2 XELIRI irinot can 240 mg m2 cap citabine 1000mg m2 IRINOX irinot can oxaliplatine TOMOX raltitrexed 3 mg m2 oxaliplatine 130 mg m2 Parente Sandra Juin 2010 Page 111 sur 128 FOLFIRINOX Acide folinique 180mg m2 5 fluoro uracile en bolus 400mg m2 5 fluoro uracile 1200mg m2 irinot can 180mg m2 oxaliplatine 180mg m2 Parente Sandra Juin 2010 Page 112 sur 128 BIBLIOGRAPHIE A Alzari PM Lascombe M Poljak RJ Three dimensional structure of antibodies Annu Rev Immunol 1988 6 555 580 Amado RG Wolf M Peeters M Van Cutsem E Siena S Freeman DJ et al Wild Type KRAS is required for Panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer J Clin Oncol 2008 26 1626 1634 B Benvenuti S Sartore Bianchi A Di Nicolantonio F Zanon C Moroni M Veronese et al Oncogenic activation of the RAS RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti Epidermal Growth Factor Receptor antibody therapies Cancer Res 2007 67 2643 2648 Bibeau F Lopez Crapez E Di Fiore F Thezenas S Ychou M Blanchard F Lamy A et al Impact of Fc Rl
87. s aa 91 Ln VAN dia 91 A 91 bi A RS he UE RS ea se AN e nanas 92 Cs Exemple de s ss saines tue textes E AEN AE TEEN ne 93 d Analyse d un locus pour l ensemble des patients exemple 122 GT 93 e Analyse d un locus pour un patient donn Exemple patient 12 et locus 122 GT 94 Be PERRA Mi dana 95 de PUN a o 95 Di Analyse snertne a A E EE nn A ttes 96 coy Exemple de P ster E ia aseo 97 4 Avantages et inconv nient de chaque m thode 100 IV Enqu te de satisfaction ci 101 T Etatdes leia 101 2 Statistiques de l activit du service de juin 2008 d cembre 2009 101 Bie Questionnaire A ne RC et eevee 102 4 Enqu te aupr s de 180 professionnels de sant VU 102 Parente Sandra Juin 2010 Page 14 sur 128 Ds Nosechanpesscala sario tintin antenne die 103 6 A O O 104 5 Analyse de Fenquete sii Vite lis 106 O 106 Bu INOS CCA NES rats 107 G Les A A A OA 107 d D lais t ONncolOgues cui an 108 CONCIOSION iii A a ii 109 Glossaire de chimioth rapie sssssssssosssesesosssscosssssscossssoossssseosssssoossssssosssssosssss 111 Bibllo rape A E u tennis soiree tanetn ardt 113 OUVEABES CONSUME seems rando A im ceases 120 Sites internet consult s ii iite 121 Annexe A O ist nest t tiens 122 ANNEXE Zi trenien rennes a tenseur tie rene tent 125 Parente Sandra Juin 2010 Page 15 sur 128 Table des figures Figure 1 Tableau r capitulatif du nombre de d c s en 20
88. s contre 13 jours si l on consid re tous les participants 53 des m decins ont t inform s des probl mes quand il y a un retard Le CAV a pris des mesures pour r duire le temps d analyse En effet Taqman et la PCR HRM sont maintenant les deux techniques de routine Comme il a t vu pr c demment ces techniques n cessitent peu de temps d analyse 2 heures environ Au del de ces limites la diminution du d lai entre la prescription de l analyse et l instauration du traitement ne sera possible que si le clinicien et le pathologiste y participent galement de mani re active Le fax et le mail notamment crypt pour plus de s curit et de confidentialit serait un bon moyen de pallier au retard dans la communication des r sultats Parente Sandra Juin 2010 Page 107 sur 128 d D lais et oncologues 9 oncologues sur 15 sont satisfaits du d lai des 15 jours Parmi ceux ci 6 sont en possession des r sultats lors du choix de la th rapeutique A contrario les 6 autres sont non satisfaits du d lai et ne sont jamais en possession des r sultats en temps voulu Une am lioration des d lais s impose donc pour la plateforme nanc enne D une fa on g n rale les oncologues font le choix d un retard dans la prise en charge du patient s ils n ont pas de r sultats Le retard dans le rendu de l analyse influence l instauration du diagnostic mais pas le choix de la mol cule La prise en charge du patient reste de
89. s un fixateur est appliqu Enfin la lame est color e l h matoxyline osine safran figure 35 Figure 35 La lame et le bloc La lame est ensuite transmise au m decin anatomopathologiste de la plateforme pour qu il identifie une zone contenant plus de 50 de cellules tumorales La zone d int r t est cercl e avec un marqueur figure 36 pra Figure 36 Correspondance entre la zone cercl e par l anatomopathologiste et le bloc Parente Sandra Juin 2010 Page 86 sur 128 S il y a plus de 50 de cellules tumorales le test est consid r comme fiable Bibeau 2009 Sinon les cellules saines peuvent interf rer et il y a un risque de conclure un r sultat faux n gatif Apr s cerclage les techniciens vont pr lever la zone la plus tumorale du bloc par rapport aux r sultats de l anatomopathologiste C est la macro dissection Le technicien fera 6 rubans de 10 microns et placera les chantillons tumoraux dans un tube Eppendorf o l ADN sera extrait kit QIAGEN QlAamp DNA FFPE tissue figure 37 Making improvements in life possible AACN te mnt e dde oe ad erm ay Figure 37 Kit QIAGEN Parente Sandra Juin 2010 Page 87 sur 128 Hl L ANALYSE Le CAV recherche la mutation du gene KRAS mut a partir de 3 techniques PCR RFLP PCR HRM TAQMAN 1 PCR RFLP a Principe La PCR Polymerase Chain Reaction permet d amplifier les segments d ADN d int r t d limit s par des amorces A cha
90. st essentiellement assur e par 2 voies e Ras raf MEK ERK voie des MAP kinase e PI3K PTEN AKT Herbst 2002 Parente Sandra Juin 2010 Page 50 sur 128 Ligand cm Cytoplasme Prolif ration Maturation A M tastase Survie Apoptose Angiogen se Figure 14 Repr sentation des 2 voies principales de signalisation cellulaire Cahier scientifique Merck 5 R le L activation de l EGFR entraine e L angiog n se l activation de EGFR entraine la production de VEGF e L apoptose e La prolif ration cellulaire e La diff renciation cellulaire Ciardiello 2001 et Jost 2000 6 Inhibition de l EGFR L inhibition du r cepteur l EGF peut tre r alis e par Kaufman 2008 Parente Sandra Juin 2010 Page 51 sur 128 e Anticorps monoclonaux de type lg G qui vont bloquer la progression du cycle et induire l apoptose c tuximab paniytumumab e Petites mol cules qui vont inhiber l activit tyrosine kinase Tarceva Iressa y Glivec e Vaccin anti EGFR e Oligonucl otides anti sens e Immunoconjugu EGF genist ine qui est un composant du soja Gentile 2003 e Toxine l EGF est fusionn a une toxine comme celle du Pseudomonas aeruginosa Ciardiello 2000 Mais d apr s les nombreuses tudes r alis es les anticorps monoclonaux et les mol cules anti tyrosine kinase sont les moyens d inhibition de l EGFR les plus utilis es Ciardiello 2000 Dans l
91. st matiquement a partir de 30 ans Une gastroscopie est pratiqu e si un cancer gastrique a t diagnostiqu dans la famille ainsi qu un examen urologique Grangjouan 2002 PAF Si le patient souffre d une PAF att nu e la coloscopie est faite tous les ans a partir de 30 ans chez les sujets apparent s Lecomte 2006 Une endoscopie est r alis e tous les ans a partir de 12 ans Parente Sandra Juin 2010 Page 35 sur 128 IV DIAGNOSTIC Le probl me du diagnostic se pose apr s un d pistage positif ou si les patients pr sentent des sympt mes intestinaux 1 Clinique Un examen clinique complet est effectu Il consiste en un examen de l abdomen toucher pelvien palpation des aires ganglionnaires et valuation de l tat g n ral Guide ALD HAS n 30 Les signes d appels d un cancer colorectal sont e Saignement dans les selles e Douleurs abdominales ne c dant pas un traitement symptomatique e An mie e Amaigrissement e Alternance diarrh e constipation e Occlusion intestinale www inserm fr thematiques cancer dossier cancer colorectal 2 Coloscopie Le but du diagnostic est de r v ler la pr sence d anomalies pr n oplasiques Gr ce a la coloscopie la tumeur devient visible Un morceau de celle ci est pr lev e biopsie en vue d une analyse A partir de cet examen une strat gie th rapeutique et un suivi adapt seront mis en place La coloscopie est un l ment diagnostic import
92. t donc pas pu tre analys s 334 blocs avaient une mutation KRAS Cette mutation portait essentiellement sur le codon 12 274 334 Le CAV a utilis les trois techniques d crites pr c demment durant cette p riode mais 15 analyses ont conclues des r sultats discordants entre les techniques La Parente Sandra Juin 2010 Page 101 sur 128 PCR RFLP a montr le plus fort pourcentage d erreur 53 des cas discordants contre 33 pour Taqman et 13 pour la PCR HRM Suite cette valuation d activit Taqman et la PCR HRM ont t retenues pour l analyse de routine Ces 2 techniques demandent moins de temps de pr paration et d analyse 3 Questionnaire Le questionnaire annexe 1 permet d valuer l activit du CAV pour le g notypage KRAS Un questionnaire a t envoy 180 m decins Au 12 f vrier il y a 28 retours de questionnaire au CAV soit 40 r ponses de m decins Deux cabinets compos s de plusieurs m decins 14 ont r pondu de mani re coll giale notre questionnaire Dans cette tude nous ne prenons en compte que le nombre de retour et non le nombre exact de m decins 1 cabinet 1 retour 4 Enqu te aupr s de 180 professionnels de sant a Vous Vous tes Vous exercez La majorit des professionnels de sant ayant r pondu au questionnaire sont les oncologues 54 15 28 suivi par les gastro ent rologues 28 8 28 Les autres soignants sont les anathomopathologistes internes
93. t pratiqu e pour retirer la partie atteinte La chimioth rapie est effectu e si la tumeur est agressive Parente Sandra Juin 2010 Page 39 sur 128 Si des cellules canc reuses ont atteints un ou plusieurs ganglions lymphatiques proches du c lon et qu il n y a pas de m tastases la chirurgie sera compl t e d une chimioth rapie adjuvante Enfin si le cancer a atteints d autres organes deux chirurgies peuvent tre r alis es Une pour la tumeur primitive et une pour les m tastases La chimioth rapie est r alis e soit entre les deux chirurgies soit en traitement principal si la chirurgie n est pas envisageable INCa 2010 1 Chirurgie C est la r section colique et le curage ganglionnaire La chirurgie est l indication premi re pour les formes compliqu es occlusion ou perforation ou s il y a des m tastases R f rentiel Oncolor Carol et Oncolie 2009 2 Radioth rapie Ce n est pas une indication de routine La radioth rapie consiste en l administration de la dose minimale efficace de rayons sur les zones traiter en pargnant les tissus sains environnant Elle est utilis e pour un cancer du rectum 3 Chimioth rapie a Cancer colorectal non m tastatique Le patient peut tre op r si la tumeur n est pas tr s tendue On parle alors de r section chirurgicale o une partie du c lon ou du rectum sera retir e A cette r section est associ un curage ganglionnaire tableau 1 Paren
94. tation la sonde VIC d une tumeur mut e KRAS 95 Figure 44 Repr sentation la sonde FAM d une tumeur mut e KRAS ccccnonocionnncnnononoaannnonononnnnnnnnnonncnnnannnnns 95 Figure 45 Principe de la PCR HRM ccccsscsessscccecssssnsansececsessnesaesesecsessnssasaesecesssneseaaesecscssnesanaesececsenaaasaeaesecsenaeanaes 96 Figure 46 Courbe d amplification iii 97 Figure 47 Repr sentation Normalized melting curves Le patient en vert suit le profil du t moin non mut VION Ot ses hives nn ri a ee en alta date id 98 Figure 48 Repr sentation Normalized and temp shifted difference plot Le patient en vert se situe pr s du TOMDIN NON MULE aii A A aia 98 Figure 49 Repr sentation Normalized melting curves Le patient en orange se rapproche du t moin mut CRIOUD Er ii irc A E AOE E anse EE TET EE oe dde dede nd 99 Figure 50 Repr sentation Normalized and temp shifted difference plot Le patient en orange a le m me profil que le t moin Mute violet iii 99 Parente Sandra Juin 2010 Page 17 sur 128 LISTES DES ABREVIATIONS Ac anticorps ACE antig ne carcino embryonnaire ADCC antibody dependent cellular cell Cytotoxicit m diation cellulaire d pendante des anticorps AICR american institute for cancer research Ag antig ne AMM autorisation de mise sur le march AND acide d soxyribonucl ique AREG amphir gulline ARN acide ribonucl ique
95. te Sandra Juin 2010 Page 40 sur 128 Tableau 1 Traitement selon le stade du cancer colorectal r f Oncolor Carol et Oncolie 2009 Stade Chirurgie seule r section chirurgical et curage ganglionnaire Stade Il La chimioth rapie adjuvante n est pas recommand e s il n y a pas de facteur de mauvais pronostic La chirurgie seule est recommand e Stade Ill La chimioth rapie adjuvante est recommand e Les stades et II d un cancer du rectum peuvent tre trait s par radioth rapie endor ctale ou par chirurgie Comme vu dans le tableau pr c dent la chimioth rapie adjuvante est pr conis e pour le stade ll facteurs de risque associ s ou au Stade III de la maladie Les mol cules utilis es sont d crites dans le tableau 2 Tableau 2 Protocole de chimioth rapie utilis en fonction du stade de la maladie r f rentiel Oncolor Carol et Oncolie 2009 Chimioth rapie de Stade II Chimioth rapie de stade III Acide folinique 5 FU en 12 cycles FOLFOX LV5FU2 Cap citabine Acide folinique 5 FU en 6 cycles FUFOL LV5FU2 5 FU en continu 5 FU Acide folinique 5 FU Oxaliplatine FUFOL FOLFOX b Cancer m tastatique La chimioth rapie et la chirurgie dans un second temps sont a envisager pour tous les patients Les b n fices et les effets ind sirables devront tre discut s avec le patient M tastases m tachrones Parente Sandra Juin 2010 Page 41 sur 128 Un bilan de r secabilit est r al
96. te Sandra Juin 2010 Page 60 sur 128 C TUXIMAB ERBITIX 1 Pr sentation Erbitux ou c tuximab est un anticorps monoclonal pr sent sous forme d une solution st rile pour perfusion intra veineuse la concentration de 5mg ml 2 Structure Le cetuximab est un Ac monoclonal chim rique de la sous classe des immunoglobulines G de type I Il est dirig contre EGFR humain Sa structure de base est identique a tous les Ac c est dire qu il est compos de liaisons covalentes et non covalentes et de 4 chaines polypeptidiques e 2 lourdes de 449 acides amin s chacune e 2 l g res de 214 acides amin s chacune 3 Mode d administration C est une solution st rile administrer par voie intraveineuse l aide d une e Seringue lectrique e Pompe a perfusion e Perfusion par gravit a d bit r gul Il est soit pr t a l emploi ou a diluer dans du Nacl 9g l Aucun autre diluant ne doit tre utilis Parente Sandra Juin 2010 Page 61 sur 128 Patients Free of Progression 4 Pharmacodynamie Gr ce sa fraction Fab le c tuximab se lie sp cifiquement au r cepteur avec une affinit de 5 10 fois sup rieure celle des ligands endog nes bloquant ainsi leur fixation au r cepteur Le r cepteur bloqu ne peut plus exprimer son activit tyrosine kinase et de ce fait la cascade de transduction du signal est inhib e La signalisation cellulaire la diff renciation l angiog n s
97. tecter des ventuelles l sions pr canc reuses et cela avant que la personne n en ressente les sympt mes Le d pistage peut r sulter d une demande individuelle spontan e ou priv e Mais il peut galement se faire dans le cadre d une action collective de sant publique 1 D pistage dans la population g n rale L incidence su CCR est r duite gr ce au d pistage par le test Hemoccult II ou test au ga ac figue 3 Mandel 2000 Le principe de ce test est de mettre en vidence la pr sence d un saignement occulte dans les selles Quand il y a du sang dans les selles la pr sence de p roxydase est r v l e C Guldenfels 1990 D pister la population g n rale est tres important car dans 80 des cas ce cancer apparait chez des sujets n appartenant a aucun groupe a risque Ce test est r alis tous les 2 ans chez des sujets entre 50 et 74 ans asymptomatiques D apr s une tude cas t moin il permet une r duction de 40 de la mortalit par cancer colorectal chez les sujets participants au d pistage par rapport aux non participant Faivre 2002 La sensibilit de HEMOCCULT se situe entre 50 et 60 pour les cancers D o l important de le r aliser tous les 2 ans La sp cificit est de 98 INCa 2008 Hemoccult est remis par le m decin au patient qui l enverra au laboratoire Parente Sandra Juin 2010 Page 30 sur 128 Figure 3 Hemoccult II Comment se d roule Hemoccult http www oncoprof net G
98. ti EGFR 11 Pensez vous que le g notypage KRAS devrait tre anticip O Oui C Non Si oui a quel moment souhaiteriez vous que le g notypage KRAS soit r alis Au diagnostic D s les premiers signes cliniques pronostiques d un risque d volution m tastatique Parente Sandra Juin 2010 Page 123 sur 128 12 Pour les anatomopathologistes du secteur priv Etes vous satisfait des modalit s de d fraiement du d sarchivage des blocs Oui Non 13 Ce questionnaire peut demeurer anonyme si vous le souhaitez N anmoins pour envisager de personnaliser notre relation vous pouvez nous indiquer vos coordonn es NO rra ARANA ANTRO PO AA AAA ARA TNA A o A O E O EE A A A scree Nous vous remercions d avoir compl t ce questionnaire et de nous permettre ainsi d valuer et d am liorer la qualit de notre service Parente Sandra Juin 2010 Page 124 sur 128 ANNEXE 2 Demande de g notypage K Ras du cancer colorectal FICHE DE SUIVI YY Recommandations destin es au pathologiste S lectionnez un bloc tumoral repr sentatif de la tumeur de pr f rence un bloc de la r section chirurgicale plut t que la biopsie initiale ou un bloc provenant d une ex r se chirurgicale d une localisation m tastatique Un pourcentage d au moins 50 de cellules tumorales est souhaitable En de le r sultat ne sera valid qu en cas de mutation de K Ras av r e pour viter de faux n gatifs Ensuite 2
99. tion primaire consiste a trouver des facteurs de risque entra nant la maladie 1 Facteurs nutritionnels et comportementaux La World Cancer Research Fund WCRF et l American Institute for Cancer Research AICR ont fait une tude sur l influence de la nutrition comprenant l activit physique et l alimentation sur la survenue de cancer Ces conclusions ont t reprises par INCa Institut National du Cancer dans une fiche rep re dat e du 24 juillet 2009 figure 2 Parente Sandra Juin 2010 Page 27 sur 128 RECOMMANDATIONS POUR LA PR VENTION PRIMAIRE DES CANCERS Activit physique e Limiter les activit s s dentaires ordinateur t l vision e Chez l adulte pratiquer au moins 5 jours par semaine au moins 30 minutes d activit physique d intensit mod r e comparable la marche rapide ou pratiquer 3 jours par semaine 20 minutes d activit physique d intensit lev e comparable au jogging e Chez l enfant et l adolescent pratiquer un minimum de 60 minutes par jour d activit physique d intensit mod r e lev e sous forme de jeux d activit s de la vie quotidienne ou de sport Boissons alcoolis es e La consommation d alcool est d conseill e quel que soit le type de boisson alcoolis e vin bi re spiritueux Ne pas inciter les personnes abstinentes une consommation d al cool r guli re m me mod r e car toute consommation d alcool r guli re est risque En cas de cons
100. traduit par une coloration bleue figure 5 et 6 Parente Sandra Juin 2010 Page 32 sur 128 Dome Bockman Sous nc NO blue color means a no hidden blood f amp present in this 3 A 3 in E Blue i strip validates test results 38 Saz Fullorten regen 8 462678 Figure 6 R sultat n gatif de la recherche de sang dans les selles Apr s une r action positive une coloscopie sera r alis e Faivre 2002 figure 7 Certaines personnes sont exclues du d pistage par Hemoccult comme les sujets avec des sympt mes digestifs les sujets risque lev ceux ayant eu une coloscopie depuis mois de 5 ans et ceux atteints d une maladie grave extra intestinale Parente Sandra Juin 2010 Page 33 sur 128 Cible Sujets de 50 74 ans sans facteur de risque et asymptomatiques Test H moccult 11 Y b Yy Selle n Sellen 2 Selle n 3 y _ Y y lor rearti gt i r cel ae pa Papier r actif Papier r actif Papier r actil impr gn impr gn impr gn de ga ac de gaiac de ga ac y y Y Application d un chantillon de chaque selle sur chaque papier impr gn l aide d une spatule M Centre sp cialis Adjonction d une solution alcoolique d eau oxyg n e y 7 Y Test n gatif Sensibilit de 50 60 Test positil Y Yy H moccult 2 ans Coloscopie de d pistage 10 de cancers 20 de polypes gt 1 cm Figure
101. u niveau national pour donner acc s aux th rapies innovantes a tous les patients En Lorraine la plateforme est commune au CHU et au Centre R gional de Lutte contre le Cancer Alexis Vautrin et le g notypage KRAS est organis par l unit de biologie des tumeurs du Centre Alexis Vautrin de Nancy Pour permettre une prise en charge optimale du patient la collaboration entre le clinicien qui prescrit le g notypage l anatomopathologiste qui analyse les blocs incluant une partie de la tumeur et le laboratoire qui recherche la mutation KRAS est primordiale Afin d valuer son degr d efficience l unit de biologie des tumeurs a envoy un questionnaire de Parente Sandra Juin 2010 Page 23 sur 128 satisfaction 180 professionnels de sant de Lorraine Nous en pr sentons et analysons les r sultats dans cette th se Parente Sandra Juin 2010 Page 24 sur 128 PARTIE G n ralit s Parente Sandra Juin 2010 Page 25 sur 128 EPIDEMIOLOGIE En 2005 149000 d c s par cancer ont t r pertori s en France avec une r partition in gale selon le sexe 89000 chez les hommes contre 60000 chez les femmes Le cancer colorectal entraina la mort de 8900 hommes et de 8000 femmes Hill 2008 figure 1 Localisation Bouche pharynx amp larynx CEsophage Estomac C lon et rectum Foie V sicule Pancr as Poumon M lanome Sein Col ut rin Endom tre Ovaire Prostate Testicule Rein
102. ue de la cible EGFR Expression de l EGFR L expression d EGFR est parfaitement contr l e au niveau des cellules normales Ce n est plus le cas au niveau des cellules tumorales o l on observe une surexpression du r cepteur sa dim risation ainsi qu une activation de la tyrosine kinase Cette surexpression est pr sente dans 60 80 des cancers colorectaux Elle est associ e un pronostic n gatif Plusieurs strat gies visent bloquer ce r cepteur e Anticorps monoclonaux e Inhibiteur de l activit tyrosine kinase e Vaccin anti EGFR e Oligonucl otides antisens Diverses techniques ont t employ es afin de mettre en vidence l expression de EGFR ainsi que pour quantifier son niveau de surexpression L immunohistochimie est la m thode la plus utilis e Elle permet de mettre en vidence la prot ine EGFR la surface des cellules partir de coupes tissulaires Spano 2007 Cette technique consiste en un marquage de l EGFR au moyen d un anticorps dirig contre le domaine extracellulaire Le marquage obtenu est membranaire Meert 2003 Cette technique pose le probl me de la reproductibilit et de la d termination des valeurs seuils Toutefois un score immunohistochimique quantitatif permet l valuation de l expression de l EGFR dans les tumeurs colorectales O aucune expression 3 expression forte Enfin il faut faire attention aux faux n gatifs En effet les cellules tumorales les plus sup
103. ut est de diminuer la mortalit par cancer en France et d am liorer la qualit de vie des personnes atteintes d un cancer q p En agissant pour Mieux pr venir les cancers par action sur les facteurs de risques et en d veloppant le d pistage Diagnostiquer le plus t t possible les cancers Garantir l acces aux soins de grande qualit pour tous dans le respect du principe d quit Rendre plus accessible les innovations et les progr s Rechercher les moyens les plus efficaces pour pr venir diagnostiquer traiter les cancers Pour r aliser leurs objectifs l INCa produit des expertises la demande du minist re anticipe les probl matiques diffuse les recommandations de bonnes pratiques et r alise des campagnes d information aupr s du grand public L article L3321415 2 du 9 ao t 2004 relative la politique de sant publique fixe les missions de l INCa savoir L observation et l valuation de la lutte contre le cancer La d finition des bonnes pratiques et des conditions n cessaires la qualit de la prise en charge des malades L information du public et des professionnels Parente Sandra Juin 2010 Page 82 sur 128 e La r alisation de toutes les expertises sur les questions relatives la canc rologie e La participation la formation des professionnels e La mise en uvre et le financement d action de recherche et de d veloppement en canc rologie e Le d veloppement
104. vironnementale et mol culaire Blandine MOREAU ceeeseeeeeeeeeees Pharmacognosie Maxime MOURER ceeseeeeeeeeeeeee Pharmacochimie supramol culaire Francine PAULUS Informatique Christine PERDICAKIS s0eeeeee Chimie organique Caroline PERRIN SARRADO 006 Pharmacologie Virginie PICHON sssr Biophysique Anne SAP Nucia Pharmacie gal nique Marie Paule SAUDER Mycologie Botanique Nathalie THILLY ooononnnccccnnnnnnnonnnnos Sant publique Gabriel TROCKLE cooonnooccnnncnnnnnonnnns Pharmacologie Marie No lle VAULTIER Biodiversit v g tale et fongique Mohamed ZAIOUUUN Biochimie et Biologie mol culaire Colette ZINUTTI Pharmacie gal nique PROFESSEUR ASSOCIE Anne MAHEUT BOSSER S miologie Parente Sandra Juin 2010 Page 6 sur 128 PROFESSEUR AGREGE Christophe COCHAUD coocccccccccoccnnnnnnnnss Anglais Biblioth que Universitaire Sant Lionnois Pharmacie Odontologie Anne Pascale PARRET Directeur Parente Sandra Juin 2010 Page 7 sur 128 SERMENT DES APOTHICAIRES Je jure en pr sence des ma tres de la Facult des conseillers de l ordre des pharmaciens et de mes condisciples honorer ceux qui m ont instruit dans les pr ceptes de mon art et de leur t moigner ma reconnaissance en restant fid le leur enseignement

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