MOA 010
Contents
1. 15 7 3 1 D p t d s anticorps anti cible a 15 7 3 2 Premi re E 16 7 3 3 D p t des anticorps conjugu Ss 16 7 3 4 D uxi me s rie et 16 7 3 5 Montage des lames color es 16 Da UNS DURS eee ie me E teinte 16 8 1 E EE EE 16 8 1 1 Lame t moin positif EE 16 8 1 2 Lame t moin motos 16 62 EE 17 8 3 Interpr tation et formulation des r sultats 17 8 3 1 Statut des Rte a a Eet 17 8 3 2 D nombrement de bact rtes u 17 8 4 Confirmation de la pr sence de la bact rie d tect e 18 9 limination des mat riels susceptibles d tre contaminants a 18 10 Conservation des reliquats de mat riels upltsgs 18 Immunofluorescence METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionla Technique d Immunofluorescence indirecte LISTE DES DOCUMENTS OFFICIELS APPELES PAR LA METHODE BIBLIOGRAPHIE SUCCINCTE ANNEXE I Qualification des r actifs s rologiques pour IF ANNEXE D nombrement de bact ries 24 Immunofluorescence Page 4 sur 4 METHODE OFFICIELLE D A2. 10 cellules par millilitre d extrait en fonction du nombre de champs ou diam tres observ s cf annexe Il 8 3 Interpr tation et formulation des r sultats 8 3 1 Statut des chantillons Le test d immunofluorescence est lt n gatif gt pour tous les chantillons dans lesquels aucune bact rie fluorescence vive et morphologiquement typique n a t trouv e Le test d immunofluorescence est lt positif pour tous les chantillons dans lesquels ont t observ es des bact ries caract ristiques En fonction des couples bact rie matrice il peut tre recommand d analyser avec un second antiserum anti cible d un autre fournisseur par exemple si disponible et pr alablement qualifi les chantillons pour lesquels le r sultat d un premier test IF est positif ou suspect 8 3 2 D nombrement de bact ries Il est possible avec la technique IF de proc der une estimation de la charge bact rienne des extraits analys s Pour cela se r f rer l annexe Il Pour certains couples bact rie matrice le d nombrement peut tre exig en cas de positif Se reporter aux m thodes sp cifiques Immunofluorescence Page 17 sur 17 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionia Technique d Immunofluorescence indirecte 8 4 Confirmation de la pr sence de la bact rie d tect e En raison des risques de faux positifs avec la technique IF indirecte une confirmation par une technique autre isolement sur mi
3. au FITC sous immersion un grossissement compris entre x 500 et x 1000 8 1 1 Lame t moin positif La lame t moin positif doit tre observ e en premier Des bact ries de morphologie et de taille typiques des cellules recherch es bien marqu es par le fluorochrome doivent tre observ es Si les extraits pr sentent une r action anormale ou de mauvaise qualit il faut consid rer que la coloration n est pas correcte et recommencer la s rie d analyses partir du point 7 2 Si la coloration est de bonne qualit il doit tre proc d la lecture de la lame t moin n gatif 8 1 2 Lame t moin n gatif Dans les extraits correspondant au x t moin s n gatif s aucune bact rie caract ristique ne doit tre marqu e par la fluoresc ine Lorsque les t moins sont conformes la lecture des lames chantillons peut tre r alis e Immunofluorescence Page 16 sur 16 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionla Technique d Immunofluorescence indirecte 8 2 Lames chantillons Pour chaque puits il faut observer successivement et au minimum diam tre de spot complet 4du pourtour du puits En cas de suspicion positivit ou de doute l observation sera tendue plusieurs diam tres pourtour complet du puits Les bact ries fluorescentes pr sentant une morphologie typique taille et forme sont recherch es les contours de la bact rie doivent tre visibles et avoi
4. plusieurs m thodes officielles Pour faciliter leur harmonisation et leur mise jour ils sont rassembl s dans des recueils sp cifiques consid r s comme faisant partie int grante des m thodes officielles Les m thodes officielles appellent alors ces documents sp cifiques en donnant leur code tel que repris dans les recueils Limites impos es aux laboratoires agr s ou reconnus Le minist re charg de l agriculture peut proposer ou imposer aux laboratoires agr s ou reconnus de stopper l analyse une certaine tape pr cis e dans la m thode officielle et le cas ch ant de transmettre le mat riel n cessaire la poursuite de l analyse dans un autre laboratoire agr ou de r f rence Il est la responsabilit de chaque laboratoire de veiller suivre les contraintes d finies son p rim tre d agr ment ou de reconnaissance et par les exigences du minist re chantillonnage et chantillon L chantillonnage est de la responsabilit des pr leveurs et ses modalit s sont d finies par ailleurs L chantillon re u est r put tre homog ne en l tat de sa r ception Par contre il n est pas forc ment repr sentatif du lot d o il provient et le laboratoire ne pourra en aucune fa on attester du caract re repr sentatif au sens de la statistique Le laboratoire peut tre amen s parer l chantillon re u en sous chantillons pour les besoins de l analyse il s agit alors
5. r frig rateur 56 et EMT 46 cong lateur lt 18 C cong lateur froid intense lt 65 Obligations r glementaires et limites de responsabilit La mise en uvre des m thodes officielles s applique sans pr judice des r glementations fran aises et communautaires ou des exigences normatives auxquelles doivent se soumettre les laboratoires circulation d tention manipulation des organismes nuisibles d tention des substances r glement es bonnes pratiques de laboratoire sant et s curit au travail mesures de confinement agr ment des laboratoires d claration la commission de g nie g n tique Dans un certain nombre de cas les m thodes peuvent appeler l attention des lecteurs sur des risques potentiels li s par exemple la dangerosit de certains produits ou la rupture du confinement Ces mises en garde ne sont destin es qu aider les lecteurs et n ont vocation ni tre exhaustives ni se substituer aux exigences r glementaires existantes Toute personne physique ou morale constatant la pr sence sur un v g tal une partie de v g tal ou un produit d origine v g tale d un organisme nuisible r glement l obligation den faire d claration aupr s des services r gionaux de l alimentation des directions r gionales de l agriculture de l alimentation et de la for t Immunofluorescence Page 6 sur 6 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionl1a Technique d Immunof
6. ment d une unit exemple le version vic devient v2a La m thode ainsi modifi e est consid r e comme une nouvelle m thode Une am lioration est une modification mineure qui apporte des pr cisions utiles ou pratiques reformule les propos pour les rendre plus clairs ou plus pr cis rectifie des erreurs b nignes En cas d am lioration le num ro de version reste le m me mais la lettre associ e est incr ment e exemple la version vic devient vid La m thode ainsi am lior e n est pas consid r e comme une nouvelle m thode Cette m thode officielle d analyse est la premi re version concernant la technique d immunofluorescence Les modifications et am liorations list es ci dessous sont celles apport es par rapport aux m thodes officielles sur la base desquelles elle a t tablie cf origine de la m thode Modifications Modification des modalit s de qualification des lots d antisera utilis s Correction de la formule de calcul de d nombrements de bact ries Am liorations Mise en forme de la m thode et modification du pr ambule selon un sch ma harmonis commun l ensemble des nouvelles m thodes Apport de pr cisions et compl ments sur le mode op ratoire Retrait des d finitions de ce document pour les int grer dans un glossaire g n ral Retrait des compositions de solutions pour les int grer dans un r pertoire g n ral Nota bene les am liorations de pure forme y compr
7. conforme aux attentes Des proc d s de pr paration de t moin positif peuvent tre sp cifiques certaines m thodes couples h tes pathog nes dilutions de suspension bact rienne sans dilution d extrait concentration centrifugation et dilutions etc Dans ce cas ils se substituent ceux d crits ici gt Te Afin d viter toutes contaminations il est imp ratif de pr parer s par ment les chantillons analyser et NE les t moins positifs ceci implique notamment des lieux de stockage et de pr paration s par s Extrait Dilution Dilution Dilution non 1 10 1 100 1 1000 dilu ou O O Identification R p tition 2 G O O Sch ma 2 Exemple plan de lame t moin positif 6 2 Lames t moin n gatif La lame validant l absence de contamination de la solution de mac ration peut tre r alis e soit partir du tampon de mac ration soit avec un chantillon v g tal de statut confirm n gatif Dans ce cas l chantillon n gatif lt de r f rence gt est extrait avec les chantillons tester 7 Etapes de l analyse 7 1 Extraction partir des chantillons Se r f rer aux m thodes officielles sp cifiques 7 2 D p t et fixation des chantillons 7 2 1 D p t des chantillons sur lames Chaque lame clairement identifi e doit comporter un seul chantillon afin d viter tout risque d inter contaminations II doit tre d pos successivement l
8. des versions de la m thode Immunofluorescence Page 2 sur 2 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOAO10WersioniiaTechnique dImmunofluorescence indirecte SOMMAIRE 10 SR KEN E 10 3 Pr sentation sch matique de la d tection 10 Produits GEES 12 43 L eSQnHSePQ E 12 4 1 1 Choix du fournisseur par le laboratoire utilisateur 12 4 1 2 Contr les effectu s par le laboratoire utilisateur 12 4 2 Ethanol 95 GL non d natut is 12 4 3 Tampon de rin age et de dilution d antisera sieste 12 44 Soluti n de bl u ENEE 12 4 5 Solution de glyc rine tamponn e au phosphate 13 40 aa ennemie ua 13 5 _ et mat riel eege 13 Sls Gros m at rneli E 13 52 Petit mat riel ee 13 6 Contr les et t moins r f rences de lecture 13 6 1 Lames t moin TE E 13 6 2 La mes t moin n g tif EE 14 GE E EE 14 7 1 Extraction partir des 14 7 2 D p t et fixation des chantillons 14 7 2 1 D p t des chantillons sur lames a 14 7 2 2 Fixation des E CT 15 7 3 Coloration par immunofluorescence indirecte
9. objets susceptibles d tre soumis analyse Les particularit s des objets soumis essais nature stade physiologique et la taille des chantillons sont d finies dans les notes de services publi es par le minist re charg de l agriculture ou dans les m thodes officielles Les sp cifications techniques relatives l analyse proprement dite sont pr cis es dans les m thodes officielles par matrice h te pathog ne Grandeur de l objet soumis analyse Les d lais maxima entre la r ception de l chantillon et le d but effectif de l analyse sont d finis dans les m thodes officielles sp cifiques voire dans les notes de services publi es par le minist re charg de l agriculture Pr caution s particuli re s prendre La temp rature et autres conditions de conservation des chantillons sont d finies dans les m thodes officielles sp cifiques voire dans les notes de services publi es par le minist re charg de l agriculture 3 Pr sentation sch matique de la d tection La pr sente m thode rappelle des exigences g n rales concernant les r actifs et les consommables le mat riel les contr les et t moins n cessaires pour la mise en uvre d une analyse par immunofluorescence IF indirecte Elle pr sente ensuite les prescriptions techniques respecter et appelle l attention des utilisateurs sur les points cl de chaque tape constitutive de indirecte La technique d crite ci apr
10. rienne d une suspension e 1 fixation de l extrait bact rien contenant l antig ne X sur lame Ajout d anticorps anti X ces immunoglobulines sont produits en injectant l antig ne X un animal Y lapin en g n ral e 2 les anticorps anti X se fixent sp cifiquement sur X e 3 ajout d anticorps d un animal Z anti anticorps de Y ces anticorps tant coupl s un marqueur fluorescent Ces anticorps sont en g n ral des anticorps de ch vre anti immunoglobulines de lapin fix s une mol cule de fluoresc ine e 4 les anticorps de Z ch vre anti Y se fixent sp cifiquement sur les anticorps Y lapin anti X e 5 observ e sous lumi re ultraviolette la fluoresc ine fix e met une fluorescence en vert et permet de localiser la substance X Sch ma 1 Principe g n ral de l immuno luorescence adapt de Philippe Denoulet Roger Prat universit Pierre et Marie Curie http www snv jussieu fr vie L int r t principal de cette technique est qu elle permet un diagnostic et une identification rapides dans le cas de bact ries difficilement isolables sur milieux de culture elle est parfois utilis e en d pistage rapide par contre le r sultat ne donne pas en principe d indication en terme de viabilit du pathog ne d tect et la technique ne permet pas d isoler la bact rie mise en vidence De mani re g n rale les anticorps tant dirig s sp cifiquement contre une bact rie donn e
11. s permet de r v ler la pr sence de bact ries phytopathog nes dans des organes v g taux Immunofluorescence Page 10 sur 10 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionla Technique d Immunofluorescence indirecte L immunofluorescence est une technique s rologique bas e sur la r action antig ne anticorps r v l e gr ce un second anticorps sp cifique du premier et coupl un fluorochrome sch ma 1 Elle s applique toute bact rie pour laquelle il existe un antiserum L observation des extraits color s se fait l aide d un microscope pifluorescence sous huile immersion Cette m thode est qualitative Cependant un d nombrement de bact ries cibles peut tre effectu sur la base d un champ isol de microscope ou d un diam tre complet du puits annexe 11 Le r sultat de cette technique tant bas sur la reconnaissance visuelle des bact ries morphologie formes de division localisation et intensit de la fluorescence la comp tence du personnel charg des lectures est critique La technique d immunofluorescence peut tre r alis e pour identifier une culture bact rienne pure elle se r alise alors sur suspensions bact riennes environ 10 10 cellules mL pour d tecter et identifier une bact rie au sein d une matrice v g tale elle se r alise alors la suite d un proc d d extraction la bact rie des tissus v g taux pour estimer la concentration bact
12. 10 20 1 3 10 45 28 10 21 1 3 10 46 29 10 22 1 4 10 47 29 10 23 1 4 10 48 3 0 10 24 1 5 10 49 3 1 10 25 1 6 10 50 21107 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionta Technique d Immunofluorescence indirecte Pour toute demande caract re scientifique et technique relative ce document le point de contact national d sign par le minist re charg de l agriculture est le laboratoire national de r f rence concern Laboratoire national de la protection des v g taux 7 rue Jean Dixm ras 49044 ANGERS cedex 01 Inpv sdqpv dqal aqriculture gouv fr Ce document est dit par Minist re de l alimentation de l agriculture et de la p che Direction g n rale de l alimentation Service de la pr vention des risques sanitaires de la production primaire Sous direction de la qualit et de la protection des v g taux 251 rue de Vaugirard 75732 PARIS Cedex 15 www agriculture gouv fr aupr s de qui toute autre correspondance peut tre adress e Immunofluorescence Page 25 sur 25
13. 6 Rat B 1984 Technique de d tection de Corynebacterium michiganense dans les semences de tomate In Report on the First International Workshop on Seed Bacteriology pp 35 37 ISTA Zurich CH Immunofluorescence Page 20 sur 20 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionta Technique d Immunofluorescence indirecte ANNEXE I QUALIFICATION DES REACTIFS SEROLOGIQUES POUR IF Les antisera sont des r actifs cl dans les analyses d immunofluorescence 115 doivent faire l objet de v rifications contr les avant et pendant leur emploi 1 lors de changement de lot d antiserum v rification dans la continuit que le nouveau lot est aussi performant que le pr c dent d termination de la dilution d emploi 2 en cours d emploi v rification r guli re de la dilution d emploi 3 lors de changement d antiserum v rification que les crit res de performance de la m thode ne sont pas alt r s I D termination ou v rification de la dilution d emploi 1 1 D finition de la dilution d emploi La dilution d emploi est d finie comme la plus grande dilution plus faible concentration donc du r actif donnant une r action positive intense optimale avec une suspension bact rienne contenant une quantit connue d antig nes en g n ral 10 10 cellules mL d une souche homologue celle recherch e et en utilisant le conjugu FITC une dilution donn e Les antisera sont en g n ral commercialis s avec u
14. CIELLE D ANALYSE MOA010 versionta Technique d Immunofluorescence indirecte ii r aliser des analyses en comparant les r sultats obtenus avec le nouvel antiserum et celui pr conis ou celui utilis pr c demment en suivant les pr conisations de la m thode officielle sp cifique h te pathog ne ou tout autre document officiel Dans ce cas le contr le se fera sauf impossibilit li e au volume d analyses a minima sur 10 chantillons de routine ou de statut connu test s en double et deux gammes de dilution de souches de r f rence Ces donn es sont soumises validation par le laboratoire national de r f rence pour les nouveaux antisera ou ceux diff rents de ceux pr conis s par la m thode officielle L antiserum est valid par le LNR lorsque les crit res de performance sensibilit sp cificit seuils de d tection dilution d emploi attendus sont atteints Tout r sultat discordant pourra le cas ch ant donner lieu une confirmation par le LNR afin de d terminer si la discordance observ e est erron e ou non Immunofluorescence Page 23 sur 25 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE 0 10 versionta Technique d Immunofluorescence indirecte ANNEXE Il DENOMBREMENT DE BACTERIES 1 COMPTAGE SUR UN DIAMETRE COMPLET 1 1 Formule g n rale nxrzrxDxGxK 4xix V Avec N nombre de cellules fluorescentes typiques millilitre d extrait concentr D diam tre du spot mm V volume de la goutt
15. MINIST RE DE L ALIMENTATION DE L AGRICULTURE ET DE LA P CHE TECHNIQUE D IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE METHODE OFFICIELLE D ANALYSE R f MOA 010 version 1a O Se METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionta Technigue dImmunofluorescence indirecte Droits de reproduction et Copyright Le pr sent document est sous sa forme lectronique mis gratuitement la disposition des usagers du minist re charg de l agriculture en tant que m thode Le pr sent document est la propri t du minist re charg de l Agriculture toute reproduction qu elle soit totale ou partielle ne peut tre effectu e qu la condition expresse que la source soit cit e Dates de validit du pr sent document Le pr sent document a valeur de m thode officielle compter de sa date de publication indiqu e ci apr s Il remplace alors de facto toute version ant rieure Cependant et sauf indication contraire explicite la version pr c dente peut encore tre utilis e pendant une dur e maximale de 15 mois compter de la date de publication de la nouvelle version afin de tenir compte des cycles d accr ditation auxquels sont soumis les laboratoires de r f rence agr s et reconnus officiellement Ce document tant susceptible d volution il est de la responsabilit exclusive des utilisateurs de v rifier r guli rement qu ils disposent bien de la derni re version Le tableau ci dessous r capitule l historique
16. NALYSE MOA010 versionl1a Technique d Immunofluorescence indirecte PREAMBULE Objet des m thodes officielles Les m thodes officielles au sens du d cret 2006 7 du 4 Janvier 2006 sont les m thodes valid es par le minist re charg de l agriculture pour l utilisation dans le cadre des actes officiels relevant de ses services plans de contr le et de surveillance contr les l importation et l exportation Ces m thodes concernent le diagnostic la d tection ou l identification d organismes nuisibles aux cultures d organismes envahissants ou d organismes g n tiquement modifi s pour le domaine d application pr cis dans la m thode Ces m thodes servent de m thodes publi es au sens de la norme ISO 17025 pour l accr ditation des laboratoires par le COFRAC Glossaire abr viations et documents connexes Afin de limiter les probl mes d interpr tation des termes employ s le vocabulaire utilis dans les m thodes officielles du minist re charg de l agriculture est issu des normes guides ou glossaires nationaux ou internationaux appropri s AFNOR ISO Le glossaire GLO 001 reprend les principales d finitions L attention des lecteurs est attir e sur le fait que les termes int gr s au glossaire ne sont en r gle g n rale pas sp cifiquement rep r s dans le corps des m thodes officielles Certains documents composition de milieux et tampons peuvent tre communs
17. a pipette dans chaque puits un volume appropri d extrait v g tal en fonction du diam tre des spots par exemple un volume de 40LL est pr conis dans des puits de diam tre 8 mm Le volume d poser est pr cis dans les m thodes sp cifiques de m me des dilutions d chantillon peuvent tre exig es et seront d pos es sur la m me lame sch ma Dans le cas d analyse avec des sous chantillons semences par exemple ceux correspondant un m me chantillon sont d pos s sur la m me lame sch ma 3b NB ll peut tre r alis une r p tition de chaque d p t Immunofluorescence Page 14 sur 14 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionta Technique d Immunofluorescence indirecte Sch ma 3a Exemple de plan de lame pour analyse d un chantillon avec dilutions Extrait 1 10 1 100 Identification de l chantillon Sch ma 3b Exemple de plans de lame pour analyse avec sous chantillons sous ch sous ch sous ch Identification de l chantillon 7 2 2 Fixation des extraits Apr s d p t des extraits les lames sont laiss es s cher soit l air libre soit l aide d un quipement adapt incubateur lames ou enceinte ventil e Apr s s chage les d p ts sont fix s en les couvrant d thanol 95 GL en les laissant s cher soit l air libre soit l aide d un quipement adapt par exemple incubateur lames Ke Il est possible d int
18. autre ou d un r actif cl par un autre conform ment aux prescriptions du LNR et transmettent le dossier d valuation correspondant au LNR pour validation de cette modification Toute autre modification qui n a pas d incidence pr visible sur le r sultat doit n anmoins faire l objet d une documentation apportant la preuve qu elle n interf re effectivement pas avec le r sultat Cette documentation est tenue en permanence disposition du LNR Le minist re charg de l agriculture peut souhaiter faire profiter l ensemble des laboratoires r alisant des analyses officielles des avantages que peuvent repr senter les m thodes d riv es et alternatives qui lui sont propos es en int grant certaines modifications l occasion d une r vision de la m thode officielle Le laboratoire l origine de l am lioration est dans ce cas cit dans la m thode officielle Consid rations d ordre m trologique Afin d all ger la lecture des m thodes officielles seules les valeurs cibles des grandeurs mesur es sont indiqu es dans le corps du texte en unit s du syst me international ou unit s d riv es Les erreurs maximales tol r es EMT prendre en consid ration sont donn es dans le tableau ci apr s dans le cas contraire des sp cifications sont pr cis es dans le texte des m thodes Volume Volume lt 10 mL 10 Volume gt 10 EMT 5 EMT 0 3 u Temperature incubateur EMT
19. d une simple division et non d un r el sous chantillonnage au sens de la statistique et le laboratoire n a pas de ce fait tre accr dit pour l chantillonnage Modification des m thodes officielles Sur le principe seules les m thodes officielles peuvent tre utilis es dans le cas d analyses officielles sans aucune modification N anmoins et afin que les laboratoires puissent mieux utiliser leurs ressources et valoriser leur exp rience la possibilit leur est laiss e d utiliser des m thodes d riv es ou alternatives ou de remplacer un r actif cl la condition expresse que le LNR ait valid la modification Une m thode d riv e r sulte de modifications de port es limit es appliqu es la m thode officielle par exemple remplacement d une proc dure d extraction de l ADN par une autre utilisation d un appareil de pr paration de l chantillon diff rent de celui pr vu dans la m thode officielle Une m thode alternative s appuie sur des principes ou des technologies diff rentes de celles d crites dans les m thodes officielles il s agit r ellement d une autre m thode Un r actif cl est un r actif directement impliqu dans la reconnaissance des organismes recherch s Immunofluorescence Page 5 sur 5 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOAO10Wersioniatechnique dImmunofluorescence indirecte Les laboratoires agr s valuent les cons quences de la modification d une m thode par une
20. de la pr paration est faible avec localement des cellules bien marqu es aux endroits o la population bact rienne est moins dense Tableau 1 exemple de dilutions des r actifs anticorps et conjugu FITC en immunofluorescence Dilution de l antiserum 1 100 1 200 1 400 1 800 1 1600 1 3200 1 6400 Dilution du conjugu 1 50 1 100 1 200 1 400 1 800 aucune fluorescence Le nombre de indique l intensit de la fluorescence Dans l exemple ci dessus la dilution d emploi recommand e de l antiserum sera de 1 400 et celui du conjugu de 1 200 Immunofluorescence Page 21 sur 25 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionta Technique d Immunofluorescence indirecte Remarque Pour certains agents pathog nes des exigences de dilution d emploi sont pr cis es dans les m thodes officielles II Validation dans la continuit Lorsqu il s agit uniquement de v rifier la qualit d un nouveau lot de fabrication d un antiserum m me fournisseur utilis pour des analyses de d pistage en tant qu utilisateur le contr le se fera sur chantillons de routine pris au hasard de statut inconnu ou sur 3 chantillons de statut connu 2 positifs et un n gatif test s en parall le avec le nouveau et l ancien lot d antiserum les antisera tant utilis s leur dilution d emploi d termin e au pr alable et Sur une gamme de dilution 5 dilutions pr par e partir d un chantillon de sta
21. e d pos sur le spot mL n nombre de cellules recens es sur un diam tre Et relatifs au microscope utilis coefficient du champ d pend du type d oculaire et varie de 8 24 K coefficient du tube 1 ou 1 25 G grossissement de l objectif 40 100 1 2 Formules calcul es tableau 2 Sur la base de cet exemple le seuil technique de d tection est donc de 630 bact ries par mL bas sur la visualisation d une bact rie sur un diam tre pour un microscope donn 25 et K 1 2 COMPTAGE SUR CHAMPS ISOLES APPENDICE 4 DE L ARRETE DU 6 DECEMBRE 1994 J O DU 5 FEVRIER 1995 c D2 G2 K2 N PC o c nombre de cellules fluorescentes typiques compt es champ F facteur de dilution de l extrait concentr Immunofluorescence Page 24 sur 25 gt Tableau 2 Exemple de comptage sur un diam tre complet Les valeurs ci dessus sont donn es pour i 25 G 100 K 1 D 8 mm V 0 04 mL n N n N 1 6 3 10 26 1 6 10 2 1 3 10 27 1 7 10 3 1 9 10 28 1 8 10 4 2 5 10 29 1 8 10 5 3 1 10 30 1 9 10 6 3 8 10 31 1 9 10 7 4 4 10 32 20107 8 5 0 10 33 20 10 9 5 6 10 34 24110 10 6 3 10 35 23107 11 6 9 10 36 23 10 12 7 5 10 37 23 10 13 8 2 10 38 24 10 14 8 8 10 39 24 10 15 9 4 10 40 25 10 16 1 0 10 41 26 10 17 1 1 10 42 26 10 18 11140 43 27 10 19 1 2 10 44 28
22. er de la solution d anticorps conjugu s au FITC dilu dans le tampon PBS 0 01 M pH 7 2 ou quivalent Il peut tre ajout du Bleu Evans en solution m re 1 dans la pr paration du conjugu une dilution de 1 300 Puis ils sont laiss s incuber temp rature ambiante et l obscurit pendant environ 30 minutes sauf pr conisations contraires du fournisseur en prenant les mesures n cessaires pour que la solution d pos e ne s che pas application d un couvercle papier humidifi 7 3 4 Deuxi me s rie de rin ages Rincer et laver comme pr c demment 7 3 2 7 3 5 Montage des lames color es Les pr parations sont recouvertes de glyc rine tamponn e ou tout autre liquide de montage adapt liquide de type r sine puis d une lamelle Les lames sont conserv es jusqu la lecture l abri de la lumi re et au frais Cependant les lames mont es doivent tre observ es au microscope pifluorescence dans les meilleurs d lais Celles fix es avec une r sine ne sont lisibles qu apr s polym risation r alis e en conditions sp cifi es respecter les prescriptions du fabricant En cas d utilisation de la glyc rine tamponn e une conservation de longue dur e est possible apr s lutage de la lame et de la lamelle avec une r sine type vernis ongles 8 R sultats 8 1 Validation des r sultats Les lames sont observ es au microscope pifluorescence en utilisant un filtre adapt
23. errompre l analyse ce niveau pendant quelques jours il convient alors de stocker les lames dans des conditions adapt es 4 par exemple 7 3 Coloration par immunofluorescence indirecte 7 3 1 D p t des anticorps anti cible Les puits sont couverts de la solution d antiserum dilu e dans le tampon la dilution d emploi annexe 1 raison d un volume gal au volume de l extrait analyser d pos Puis ils sont laiss s incuber temp rature ambiante pendant environ 30 minutes sauf pr conisations contraires du fournisseur en prenant les mesures n cessaires pour que la solution d pos e ne s che pas application d un couvercle papier humidifi Immunofluorescence Page 15 sur 15 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionla Technique d Immunofluorescence indirecte 7 3 2 Premi re s rie de rin ages L exc s d antiserum est limin en rin ant soigneusement les lames avec le tampon PBS 0 01 M pH 7 2 ou quivalent Les rin ages sont r alis s par lavages rapides ou par incubation dans le PBS A la fin du dernier rin age le tampon exc dentaire est limin avec soin en secouant la lame et ou en absorbant l exc s de liquide d licatement la surface des lames l aide d un papier absorbant Certaines m thodes peuvent pr coniser l utilisation de PBS tween 7 3 3 D p t des anticorps conjugu s Les puits sont couverts avec un volume gal au volume de l extrait analys
24. erv pendant une dur e minimale de 12 mois sauf pour les parties ventuellement transmises un autre laboratoire agr ou de r f rence qui est alors transf r e la charge de conservation des reliquats Le laboratoire national de r f rence peut demander que tout ou partie de ces reliquats lui soient transmis aux frais des laboratoires agr s ou reconnus dans le cadre des missions qui lui sont confi es Immunofluorescence Page 18 sur 18 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionl1a Technique d Immunofluorescence indirecte LISTE DES DOCUMENTS OFFICIELS APPELES PAR LA METHODE REMERCIEMENTS Le LNPV remercie pour leur relecture et leurs commentaires les laboratoires suivants LDA 22 LDA 59 GEVES SNES Immunofluorescence Page 19 sur 19 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionia Technique d Immunofluorescence indirecte BIBLIOGRAPHIE SUCCINCTE Directive 2006 63 CE de la Commission du 14 juillet 2006 modifiant les annexes Il VII la directive 98 57 CE du Conseil concernant la lutte contre Ralstonia solanacearum Smith Yabuuchi et al Directive 2006 56 CE de la Commission du 12 juin 206 modifiant les annexes de la directive 93 85 CEE du Conseil concernant la lutte contre le fl trissement bact rien de la pomme de terre Letonturier P 1996 Abr g d Immunologie g n rale Masson Paris OEPP EPPO 2010 EPPO standards PM 7 97 Immunofluorescence test Bulletin OEPP EPPO Bulletin 39 413 41
25. ier la capacit des antisera d tecter diff rentes souches d une m me bact rie cible inclusivit et ne pas d tecter les diff rents pathovars sous esp ces ou autres sp cificit Pour v rifier en tant que laboratoire utilisateur la qualit d un antiserum nouveau ou diff rent de celui pr conis dans la m thode officielle 2 m thodes sont possibles i r aliser les analyses en utilisant des t moins de r f rence positifs et n gatifs si possible avec du mat riel v g tal contamin et sain trait s selon les prescriptions de la m thode officielle dans ce cas il convient de r aliser minima l valuation sur 7 chantillons contenant la cible chantillons naturellement ou artificiellement contamin s ou souches en suspension 7 chantillons ne contenant pas la cible dont 3 chantillons sains matrice v g tale non contamin e par la cible et 4 chantillons contamin s avec des organismes non cibles ou des organismes non cibles mis en suspension organismes proches g n tiquement ou issus de la flore saprophyte de la m me matrice 2 gammes de dilutions 5 dilutions par gamme de souches cibles en suspension afin d valuer le seuil de d tection les deux antisera tant utilis s leur dilution d emploi d termin e au pr alable La liste des souches tester peut tre d termin e par le laboratoire national de r f rence Immunofluorescence Page 22 sur 25 METHODE OFFI
26. illons et celle des lames t moins sera quant elle r alis e en m me temps avec les m mes r actifs et dans les m mes conditions 6 1 Lames t moin positif La proc dure de pr paration des lames t moin positif est la suivante Une souche de r f rence est tal e st rilement sur une bo te de Petri contenant du milieu de culture favorable la croissance de la bact rie et en incubation une temp rature adapt e pendant le temps n cessaire la croissance des colonies Apr s incubation la culture bact rienne est pr lev e et mise en suspension dans de l extrait de v g tal sain Pr parer ensuite une gamme de dilution au 1 10 1 100 et au 1 1000 afin d obtenir une gamme d approximativement 107 107 cellules mL et la d poser directement dans les puits puis fixer selon les conditions du point 7 2 Immunofluorescence Page 13 sur 13 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionia Technique d Immunofluorescence indirecte Une s rie de lames t moins peut tre pr par e l avance et conserv e dans des conditions permettant d assurer la validation de la coloration par immunofluorescence r frig rateur ou cong lateur Quand cela est possible il peut galement tre pr par des t moins positifs partir d extraits contamin s Avant toute utilisation en routine le test d immunofluorescence est appliqu l une des lames t moins de la s rie pr par e afin de v rifier que le r sultat obtenu est
27. is les corrections grammaticales ou orthographiques ne sont pas reprises dans cette synth se des modifications Immunofluorescence Page 9 sur 9 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionla Technique d Immunofluorescence indirecte DESCRIPTION DE LA METHODE 1 Objet La pr sente m thode fixe les principes g n raux de r alisation des analyses de d pistage ou d identification des bact ries nuisibles pour les v g taux l aide de la technique d immunofluorescence IF indirecte Les m thodes officielles sp cifiques par matrice et organisme pathog ne ou d faut les fournisseurs de r actifs s rologiques fixent les exigences sp cifiques compl mentaires mettre en uvre pour la r alisation pratique des analyses notamment la nature et la pr paration de l chantillon pour analyse la nature et la r alisation de la prise d analyse l extraction des antig nes fragmentation broyage mac ration les modes de conservation du mat riel v g tal et de l extrait Des consignes particuli res peuvent galement fixer les conditions ou l ments pouvant influer sur la qualit des r sultats 2 Domaine d application Objets susceptibles d tre soumis analyse Toutes les analyses de d pistage ou d identification des organismes pathog nes pour les v g taux faisant appel la technique d immunofluorescence indirecte sont concern es par la pr sente m thode Limitations relatives aux
28. les antisera permettent habituellement d obtenir une bonne sensibilit de d tection des bact ries L immunofluorescence peut donc tre utilis e en d pistage ie de s parer les chantillons potentiellement non contamin s de ceux qui sont susceptibles d tre contamin s par la bact rie recherch e Cependant il peut exister d autres bact ries pathog nes et ou saprophytes pr sentes sur le v g tal analys avec lesquelles l antiserum r agit Cette r action est commun ment appel e r action crois e La confirmation des r sultats doit tre effectu e conform ment au sch ma de d tection d crit dans la m thode sp cifique Immunofluorescence Page 11 sur 11 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionla Technique d Immunofluorescence indirecte 4 Produits et consommables En r gle g n rale le manipulateur doit veiller l absence dans l eau produits et consommables utilis s de contamination d inhibiteur ou de tout autre l ment pouvant interf rer sur le r sultat par l utilisation de produits et consommables appropri s Les recommandations des fournisseurs concernant les conditions de stockage avant utilisation seront suivies ainsi que la conservation en cours d utilisation d faut le laboratoire d finira les conditions qu il jugera les plus optimales 4 1 Les antisera anticorps anti cible et anticorps conjugu s FITC 4 1 1 Choix du fournisseur par le laboratoire utilisateur Les anti
29. lieux test biologique PCR est recommand e pour certains couples matrice pathog ne Cette confirmation est effectu e au sein du m me laboratoire ou dans un laboratoire de r f rence conform ment aux sch mas de d tection et aux m thodes sp cifiques officiels 9 limination des mat riels susceptibles d tre contaminants Le laboratoire doit mettre en uvre des mesures prenant en compte les risques li s aux mat riels susceptibles d tre contaminant pour garantir l absence de diss mination de l organisme nuisible dans l environnement 10 Conservation des reliquats de mat riels utilis s Sauf mention contraire explicite ou impossibilit technique av r e les laboratoires doivent conserver les reliquats pertinents nature quantit et qualit de mat riel soumis analyse dans des conditions appropri es garantissant leur int grit jusqu au moins le dixi me jour ouvrable suivant l envoi au demandeur d un rapport d analyse concluant la non mise en vidence de l organisme recherch d lai impos est destin laisser le temps au demandeur de l analyse de contester le r sultat aupr s du laboratoire ce qui prolonge la conservation du reliquat jusqu l issue de la contestation et ventuellement de demander une analyse contradictoire Dans le cas de mise en vidence de l organisme recherch et sauf indications plus pr cises dans la m thode l ensemble des reliquats pertinents doit tre cons
30. luorescence indirecte Les conditions de mise en uvre des m thodes officielles ainsi que la qualit des r actifs cl utilis s sont susceptibles de modifier la qualit des r sultats obtenus avec les m thodes officielles Ces deux derniers aspects rel vent de la responsabilit des laboratoires utilisateurs Le minist re charg de l agriculture ne saurait tre tenu pour responsable dans le cas de mises en uvre inad quates volontaires ou non des m thodes officielles Revue des m thodes officielles amendement et modification Une consultation publique est organis e en tant que de besoin avant la publication des m thodes officielles Le document de travail est mis disposition sur le site du minist re en charge de l agriculture pendant une p riode de deux mois au cours de laquelle les visiteurs sont invit s faire conna tre leurs remarques commentaires et suggestion et signaler toute erreur omission ou impr cision Les m thodes officielles sont par ailleurs revues p riodiquement l initiative du minist re charg de l agriculture ou du laboratoire national de r f rence chaque modification le code de la m thode change comme indiqu au chapitre principales modifications par rapport la version pr c dente Les usagers sont galement invit s faire conna tre dans les meilleurs d lais leurs remarques commentaires et suggestions et signaler toute erreur omission ou impr cision consta
31. ne dilution d emploi recommand e souvent appel e titre Cependant la dilution optimale d emploi peut varier en fonction des conditions locales d utilisation du r actif Il est donc recommand de v rifier la dilution d emploi de chaque antiserum avant emploi En raison de l volution possible de cette dilution d emploi dans le temps le laboratoire doit d finir une proc dure de v rification r guli re des antisera reconnaissant l antig ne du conjugu et fixer une p riode de validit maximum 1 an 1 2 D termination de la dilution d emploi d un r actif par immunofluorescence Sur une lame multi puits pour IF d poser la gamme d une suspension bact rienne donn e 10 1092 et la fixer r aliser une s rie de dilutions de l antiserum et du conjugu qualifier tableau 1 les d terminations des dilutions d emploi de l antiserum et du conjugu peuvent tre r alis es s par ment r aliser la coloration par immunofluorescence aux diff rentes concentrations _ observer chaque puits color sous microscope pifluorescence et noter l intensit de la fluorescence par des signes NB Dans ces conditions il est possible de mettre en vidence sans confusion des populations de bact ries inf rieures ou gales 10 cellules mL Pour des quantit s de bact ries sup rieures des diff rences dans lhomog n it de la fluorescence sont observ es l intensit de la fluorescence g n rale
32. osition r pertoire des recettes REP 001 4 6 Huile immersion Elle devra tre adapt e au type et la marque de microscope utilis 5 Appareillage et mat riel Pour la mise en uvre d analyses d immunofluorescence indirecte les mat riels et appareillages n cessaires la r alisation de la m thode sont des appareillages courant de laboratoire de microbiologie et notamment la liste ci dessous La lecture des lames au microscope s effectue l obscurit 5 1 Gros mat riel microscope quip pour les observations en pifluorescence autoclave pour la fabrication des tampons et milieux incubateur bact riologique pour l incubation des souches bact riennes t moins r frig rateur cong lateur balance d exactitude adapt e incubateur de lames facultatif 5 2 Petit mat riel de laboratoire et ou mat riel usage unique prouvettes tubes flacons pipettes automatiques et c nes st riles correspondants James multi puits de diam tre 8 mm de pr f rence et lamelles couvre objets bec type bunsen ou hotte flux laminaire pHm tre 6 Contr les et t moins r f rences de lecture Pour chaque s rie d analyses pr parer une lame t moin positif et une lame t moin n gatif destin es v rifier que la manipulation est conforme La pr paration des lames t moins peut tre r alis e l avance La coloration des lames chant
33. r une forme quivalente celles du t moin positif Cependant une lame t moin positif r alis e avec une souche en croissance sur milieu nutritif peut avoir des bact ries de taille sup rieure celles pr sente dans un extrait v g tal De plus en pr sence d une forte concentration de bact ries cibles la fluorescence peut tre dilu e et donc moins intense Dans ce cas il est conseill de recommencer l immunofluorescence apr s dilution de l extrait afin de mieux visualiser les cellules Les crit res de reconnaissance des bact ries cibles sont la forme de la bact rie en particulier les formes de division si elles sont pr sentes la taille de la bact rie la qualit de la coloration de la bact rie fluorescence intense et continue de la paroi bact rienne Si l chantillon contient des bact ries ayant une morphologie caract ristique une fluorescence conforme celles ci peuvent tre d nombr es sur un minimum de 10 champs microscopiques ou sur un diam tre du puits de mani re valuer leur concentration N par millilitre d extrait concentr non dilu annexe 11 NB La lecture peut s av rer d licate tant donn les limites inh rentes aux tests d immunofluorescence des bact ries autres que la bact rie cible morphologiquement atypiques peuvent tre fluorescentes et donc g ner la lecture seuil technique de d tection de l immunofluorescence est de l ordre de 10
34. sera sont des r actifs cl des analyses par immunofluorescence Lorsque l information est disponible le laboratoire doit choisir le fournisseur en fonction des crit res de performance des r actifs eux m mes ou de la capacit des r actifs atteindre les crit res de performance de la m thode officielle lorsqu ils sont pr cis s ex sensibilit sp cificit et titre minimum Le laboratoire national de r f rence peut pr coniser ou d conseiller l usage de certains antisera apr s valuation de la capacit du fournisseur donner des informations concernant l identification le stockage le mode d emploi ex dilution d emploi et les contr les qualit internes de ses r actifs Lorsque l information n est pas disponible le laboratoire utilisateur veillera qualifier ses r actifs cf annexe l Les r actifs s rologiques doivent tre utilis s en respectant les pr conisations du fabricant en ce qui concerne les conditions d utilisation Des recommandations sur le titre ou la dilution d emploi peuvent tres d finies par le laboratoire de r f rence ou le fournisseur 4 1 2 Contr les effectu s par le laboratoire utilisateur Le laboratoire utilisateur doit proc der au contr le de la qualit des antisera en tant que r actif cl lorsqu il utilise a une nouvelle source d antiserum antiserum de fournisseur diff rent ou un antiserum diff rent de celui pr conis dans la m thode officielle ou une anne
35. t es Immunofluorescence Page 7 sur 7 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionl1a Technique d Immunofluorescence indirecte ORIGINE DE LA METHODE La pr sente m thode a t labor e par l unit de bact riologie de la station d Angers du Laboratoire National de la Protection des v g taux sur la base des anciennes m thodes sp cifiques BV 06 01a et BH 06 01a des directives 2006 63 CE et 2006 56 CE ainsi que de la fiche technique sur l immunofluorescence de OEPP PM 7 97 Le travail de relecture et de r vision a t effectu par le p le lt D veloppement de m thodes et analyses gt du LNPV Immunofluorescence Page 8 sur 8 METHODE OFFICIELLE D ANALVSE MOAO10Wersioniiatechnique dImmunofluorescence indirecte PRINCIPALES MODIFICATIONS PAR RAPPORT A LA VERSION PRECEDENTE Une modification concerne des parties cl ou le fond m me de la m thode officielle dont la prise en compte est susceptible d am liorer significativement la port e ou le r sultat de la m thode d analyse Sa prise en compte peut n cessiter des adaptations importantes c est pourquoi un d lai est en r gle g n rale accord pour que les laboratoires de r f rence agr s ou officiellement reconnus l int grent dans leur processus d analyses Dans certains cas clairement pr cis s une modification peut n cessiter une prise en compte imm diate par les laboratoires En cas de modification majeure le num ro de version est incr
36. tut positif connu ou Sur une gamme de dilution d une souche remise en suspension dans du tampon de mac ration ou Sur une gamme de dilution d une souche dilu e dans de l extrait v g tal Ces tests visent v rifier l absence de diff rence entre les lots sur le contr le du bruit de fond absence d interaction entre l antiserum et la matrice et le seuil de d tection obtenu par le nouveau lot d antiserum Lorsqu il s agit de v rifier la qualit d un nouveau lot de fabrication d un antiserum m me fournisseur utilis pour des analyses d identification en tant qu utilisateur le contr le se fera a minima sur 5 souches cibles et 5 souches non cibles certaines tant proches g n tiquement d autres tant des bact ries isol es des m mes matrices Ces tests visent v rifier l inclusivit et la sp cificit de l antiserum Le nouveau lot d antiserum est valid par le laboratoire utilisateur lorsque tous les r sultats obtenus entre le nouveau lot d antiserum et le pr c dent sont concordants Pour les tests effectu s pour les analyses de d pistage le seuil de d tection minimum devrait se situer entre 10 et 10 ufc mL Validation d un nouvel En principe les antisera sont dirig s sp cifiquement contre une bact rie donn e Cependant il peut exister d autres bact ries pr sentes sur le v g tal analys avec lesquelles l antiserum r agit II convient donc de v rif
37. xe de la m thode officielle b un nouveau lot de fabrication d antiserum en cours d utilisation intervalles pr d finis ou autant que de besoin en ce qui concerne la dilution d emploi Ces contr les seront r alis s pr alablement la mise en uvre des analyses conform ment aux dispositions de l annexe l 4 2 thanol 95 GL non d natur Il sert fixer l extrait bact rien ou v g tal sur lame pr alablement au test d immunof luorescence Ce produit tant inflammable il doit tre tenu loign des sources de chaleur et des flammes nues 4 3 Tampon de rin age et de dilution d antisera Suivre les prescriptions des m thodes d analyses sp cifiques En l absence de pr cisions utiliser du PBS 0 01 M pH 7 2 dont la composition et la pr paration sont donn es dans le r pertoire des recettes REP 001 4 4 Solution de bleu Evans Le r actif conjugu avec l isothiocyanate de fluoresceine FITC peut tre utilis avec un contre marqueur type bleu d Evans Ce produit colore en rouge les fragments de v g taux augmentant le contraste composition r pertoire des recettes REP 001 Immunofluorescence Page 12 sur 12 METHODE OFFICIELLE D ANALYSE MOA010 versionl1a Technique d Immunofluorescence indirecte 4 5 Solution de glyc rine tamponn e au phosphate La solution de glyc rine tamponn e peut tre remplac e par un liquide de montage type r sine adapt l immunofluorescence comp
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