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CgAnalyze Kit

1. Problema Posibles causas Acci n correctora Uno o m s No se han a adido uno o varios 1 Prueba no v lida Repita la prueba calibradores reactivos o se han a adido en la fuera de secuencia incorrecta rango Pipeteado incorrecto 2 Prueba no v lida Repita la prueba Valores de Temperatura temporizaci n o 1 Compruebe que el tiempo y la control fuera pipeteado incorrecto los temperatura sean correctos Consulte de rango reactivos no se han mezclado Mala precisi n a continuaci n Repita la prueba Contaminaci n cruzada de los 2 Pipetear con cuidado controles Diluci n incorrecta 3 Repita la prueba La v a ptica no est limpia 4 Compruebe que no haya suciedad ni burbujas en los pocillos Limpie el fondo de la placa y vuelta a tomar la lectura Resultados No se han a adido uno o varios 1 Compruebe el procedimiento en blanco de reactivos o se han a adido en la Compruebe si hay reactivo sin usar todas las secuencia incorrecta Repita la prueba pruebas Placa recubierta inactiva 2 Compruebe si hay humedad visible en los pocillos sin usar Limpie el fondo de la placa y vuelta a tomar la lectura Resultados Tamp n o reactivos 1 Compruebe la turbidez o el mal olor de en amarillo contaminados todas las soluciones de todas las Soluci n de lavado contaminada 2 Use un recipiente limpio Compruebe la pruebas calidad de la soluci n de agua usada para prepararla Diluci n incorrecta del suero 3
2. A CAL1 CAL5 P1 B CAL1 CAL5 P1 C CAL2 CAL6 P2 D CAL2 CAL6 P2 E CAL3 H etc F ICAL3 H G CAL4 IL H GAL4 IL Incubate for 60 minutes After sample incubation Wash three 3 times with 300 uL washing solution well filling and emptying the wells each time After the last wash empty the wells by tapping the microtitre plate on an absorbent tissue K2378 E 23 0196 07DA Adding conjugate Add 100 uL conjugate to each well Incubate for 30 minutes After conjugate incubation Wash as before Adding substrate solution Add 100 uL substrate TMB to each well incubate in the dark for 15 minutes The incubation time may be shortened to 10 minutes if maximum Optical Density OD exceeds 3 0 at high temperatures or if an automated method is applied Adding stop solution Add 100 uL stop solution to each well Read the absorbance at 450 nm within 2h on a microplate reader Read at 620 nm as a reference wavelength Calculations Construct a calibrator curve by plotting the OD against the ng mL values of the six calibrators The six calibrators provided have values of 0 ng mL for calibrator 1 36 ng mL for calibrator 2 180 ng mL for calibrator 3 540 ng mL for calibrator 4 1080 ng mL for calibrator 5 1800 ng mL for calibrator 6 respectively Read the values of Low and High Controls and the patient samples from the curve Values greater than the highest calibrator val
3. CZNIE DO DIAGNOSTYKI N VITRO PODSUMOWANIE I OBJA NIENIE Chromograniny i sekretograniny stanowi rodzin unikalnych kwa nych bia ek kt re s przechowywane jednocze nie z neurotransmiterami i hormonami peptydowymi w m zgu oraz rozproszonym uk adzie neuroendokrynnym Winkler H 8 Fischer Colbrie R 1992 Pod wzgl dem strukturalnym bia ka te s produktami r nych gen w ale og lnie maj pewne cechy wsp lne takie jak obfito kwa nych reszt aminokwasowych oraz kilka par zasadowych aminokwas w stanowi cych potencjalne miejsca rozszczepiania potranslacyjnego Chromograniny s przechowywane i uwalniane jednocze nie z neuropeptydami i hormonami w kom rkach neuroendokrynnych w ca ym organizmie Sugerowano rol chromogranin w generowaniu ziaren hormonalnych i pakowaniu hormon w Ponadto chromograniny mog by rozszczepiane na mniejsze fragmenty kt re mog wykazywa aktywno ci biologiczne takie jak inhibicja uwalniania hormon w wazodylatacja i dzia anie przeciwdrobnoustrojowe Stridsberg M 2000 Guzy pochodzenia neuroendokrynnego zazwyczaj wyst puj przy zwi kszonych st eniach chromograniny A w surowicy osoczu O Connor DT Deftos LJ 1986 Guzy neuroendokrynne pochodz z kom rek neuroendokrynnych a typowe guzy neuroendokrynne to rakowiaki barwiaki nerwiaki zarodkowe drobnokom rkowy rak p uc gruczolaki przytarczyc guzy przysadki oraz guzy wysepek trzustkowych i obejmuj zespo y MEN1 i MEN2 O
4. B hem t to prvn inkubace se chromogranin A nav e na monoklon ln protil tku na povrchu jamky Po promyt kter m se odstran nenav zan materi l se p id druh monoklon ln protil tka zna en k enovou peroxid zou HRP kter slou k detekci chromograninu A nav zan ho na jamku Po 30minutov inkubaci se jamky znovu promyj p id se barevn substr t a inkubuje se V voj zbarven se zastav za 15 minut a zbarven se zm pomoc spektrofotometru Zbarven je p mo m rn mno stv chromograninu A nav zan ho na jamku Mno stv chromograninu se stanov porovn n m vznikl ho zbarven se vzorky kalibr tor Kalibr tor obsa en v souprav je syntetick peptid kter odpov d chromograninu A Peptidov kalibr tor je vytvo en tak aby zp soboval stejnou odpov jako purifikovan nativn fragment chromograninu A Stridsberg M a kol 1993 Stridsberg a kol 1995 61 K2378 E 23 0196 07DA VAROV N A UPOZORN N Pro diagnostick pou it in vitro Testovac reagencie neobsahuj dn sou sti lidsk ho s ra s analyzovan mi vzorky plazmy pacient je v ak nutno zach zet opatrn proto e mohou p en et infek n agens Americk st ediska pro kontrolu a prevenci nemoc Centers for Disease Control and Prevention a n rodn zdravotn stavy National Institutes of Health doporu uj aby se s potenci ln infek n mi l tkami zach zel
5. Mean Measured Calculated Concentration Concentration ng mL Dilution Corrected Recovery Mean Measured Calculated Concentration Concentration ng mL Dilution Corrected Recovery K2378 E 23 0196 07DA Corrective action TROUBLESHOOTING Problem Possible causes One or more 1 One or more reagents not added calibrators or added in wrong seguence out of range 1 Test invalid Repeat test 2 Improper pipetting 2 Test invalid Repeat test Control 1 Incorrect temperature timing 1 Check that the time and temperature values out of or pipetting reagents not was correct See Poor precision below range mixed Repeat test 2 Cross contamination of controls 2 Pipette carefully 3 Improper dilution 3 Repeat test 4 Optical pathway not clean 4 Check for dirt or air bubbles in the wells Wipe bottom of the plate and reread All test 1 One or more reagents not added 1 Recheck procedure Check for unused results blank or added in wrong sequence reagent Repeat test 2 Coated plate inactive 2 Check for obvious moisture in unused wells Wipe bottom of the plate and reread All test 1 Contaminated buffers or 1 Check all solutions for turbidity or foul results reagents smell yellow 2 Wash solution contaminated 2 Use clean container Check quality of water solution used to prepare 3 _ Improper dilution of serum 3 Repeat test Maximum OD 1 Too high incu
6. Di Bartolomeo M Seregni E and Bombardieri E Chromogranin A neuron specific enolase carcinoembryonic antigen and hydroxyindole acetic acid evaluation in patient with neuroendocrine tumours Cancer 1999 86 858 865 Eriksson B berg K and Stridsberg M Tumour markers in neuroendocrine tumours Digestion 2000 62 33 38 O Connor D T and Deftos L J Secretion of chromogranin A by peptide producing endocrine neoplasms New England Journal of Medicine1986 314 1145 1151 Stridsberg M Hellman U Wilander E Lundqvist G Hellsing K and berg K Fragments of chromogranin A are present in the urine of patients with carcinoid tumours Development of a specific radioimmunoassay for chromogranin A and its fragments Journal of Endocrinology 1993 139 329 337 Stridsberg M berg K Li A Engstr m U and Lundqvist G Measurements of chromogranin A chromogranin B secretogranin chromogranin C secretogranin II and pancreastatin in plasma and urine from patients with carcinoid tumours and endocrine pancreatic tumours Journal of Endocrinology 1995 144 49 59 Stridsberg M Measurements of chromogranins and chromogranin related peptides by immunological methods Advanced Experimental and Medical Biology 2000 482 319 327 Winkler H and Fischer Colbrie R The chromogranin A and B The first 25 years and future perspectives Neuroscience 1992 49 497 528 34 K2378 E 23 0196 07DA
7. L H CAL4 L Inkubujte po dobu 60 minut Po inkubaci vzorku Vzorky t ikr t 3 promyjte 300 uL prom vac ho roztoku na jednu jamku jamky v dy napl te a vypr zdn te Po posledn m promyt jamky vypr zdn te a vyklepejte mikrotitra n desti ku o absorp n materi l P id n konjug tu Do ka d jamky p idejte 100 uL konjug tu Inkubujte po dobu 30 minut Po inkubaci konjug tu Promyjte stejn jako po p edchoz m kroku P id n roztoku substr tu P idejte 100 uL substr tu TMB do ka d jamky a inkubujte v temnu po dobu 15 minut Inkuba n dobu Ize zkr tit na 10 minut pokud maxim ln optick denzita OD p ekro hodnotu 3 0 p i vysok ch teplot ch nebo p i pou it automatizovan metody P id n zastavovac ho roztoku Do ka d jamky p idejte 100 uL zastavovac ho roztoku Za 2 hodiny ode t te absorbanci p i vlnov d lce 450 nm na te ce mikrodesti ek Ode t te absorbanci p i vlnov d lce 620 nm referen n vlnov d lka V po ty Sestrojte kalibra n k ivku vynesen m optick denzity proti hodnot m ng mL pro est kalibr tor Hodnoty pro dodan ch est kalibr tor jsou 0 ng mL pro kalibr tor 1 36 ng mL pro kalibr tor 2 180 ng mL pro kalibr tor 3 540 ng mL pro kalibr tor 4 1080 ng mL pro kalibr tor 5 1800 ng mL pro kalibr tor 6 Ode t te z k ivky hodnoty pro kontrolu s n zkou a s vysokou hodnotou koncent
8. Measurements of chromogranin A chromogranin B secretogranin chromogranin C secretogranin II and pancreastatin in plasma and urine from patients with carcinoid tumours and endocrine pancreatic tumours Journal of Endocrinology 1995 144 49 59 Stridsberg M Measurements of chromogranins and chromogranin related peptides by immunological methods Advanced Experimental and Medical Biology 2000 482 319 327 Winkler H and Fischer Colbrie R The chromogranin A and B The first 25 years and future perspectives Neuroscience 1992 49 497 528 58 K2378 E 23 0196 07DA LA SPIEGAZIONE DI SIMBOLI Antigene pozzetti sensibilizzati L Diluente o z c Tampone di coniugato CONJ HRP coniugato conc 100x Tampone di lavaggio concentrato 20x Cromogeno TMB Substrato Soluzione di stop soluzione di acido solforico O gt F g Mm lt o Calibratore liofilizzato CONTROL Controllo basso liofilizzato CONTROL conmo aye Y O Controllo alto liofilizzato 59 K2378 E 23 0196 07DA O Lotto No Numero di catalogo Utilizzare entro B E Limiti di temperatura Rischio biologico la Leggere le istruzioni per l uso lt U Dispositivo medico diagnostico in vitro Produttore Attenzione AE Contenuto sufficiente per 96 test N TN Conform
9. Repita la prueba El OD Temperatura de incubaci n 1 Reduzca el tiempo de incubaci n para el m ximo es demasiado alta uso de m todo sustrato elevado autom tico supera 3 0 Mala CV de entrega de la pipeta 1 Compruebe la calibraci n de la pipeta precisi n superior al 5 Use una t cnica reproducible La muestra o los reactivos no se 2 Mezcle bien pero con suavidad todos los han mezclado lo suficiente o no reactivos y equilibrar a la temperatura est n equilibrados a la ambiente temperatura ambiente La adici n del reactivo tarda 3 Desarrolle una t cnica uniforme y mucho inconsistencia en los consistente y use un dispositivo con intervalos de tiempo varias puntas o un dispensador autom tico para reducir el tiempo La v a ptica no est limpia 4 Compruebe que no haya burbujas en los pocillos Limpie el fondo de la placa y vuelta a tomar la lectura 33 K2378 E 23 0196 07DA 5 Lavado no consistente burbujas 5 Compruebe que todos los pocillos se atrapadas gueda soluci n de llenen y aspiren uniformemente Vierta lavado en los pocillos l guido por encima del nivel de reactivo en el pocillo Despu s del ltimo lavado vac e los pocillos golpeando la placa sobre un tejido absorbente 6 Pipeteado incorrecto 6 Evite burbujas de aire en las puntas de la pipeta REFERENCIAS 1 Bajetta E Ferrari L Martinetti A Celio L Procopio G Artale S Zilembo N
10. Rozcie czalnik Bufor koniugatu CONJ 100X o o z c Koniugat HRP stezony 100x 20x koncentrat buforu p ucz cego Roztw r TMB roztw r substratu Kwas siarkowy 0 5 molowy roztw r zatrzymujacy O d r lt o Liofilizowany kalibrator CONTROL Liofilizowana kontrola niska CONTROL H LYO Liofilizowana kontrola wysoka 85 K2378 E 23 0196 07DA O Numer partii Numer katalogowy Termin przydatno ci do u ytku s lt EO 8 o Ograniczenie temperatury 30 Zagro enie biologiczne la 6 Skonsultowa si z instrukcj u ycia lt U Wyr b medyczny do diagnostyki in vitro Producent Ostrze enie o E o o Wystarcza na 96 test w M AN Zgodno z dyrektyw 98 79 WE w sprawie wyrob w medycznych u ywanych do diagnozy in vitro 86 K2378 E 23 0196 07DA CgAnalyze Kit PORTUGUES UTILIZACAO PREVISTA O kit de CgAnalyze um ensaio de imunoabsorc o ligada a enzima ELISA para a detecc o e quantificagao da cromogranina A em plasma ou soro humano Os resultados do ensaio podem ser utilizados para ajudar a diagnosticar os tumores neuroend crinos TNEs secretores de cromogranina A como por exemplo feocromocitomas e carcin ides O ensaio destina se a ser utilizado em pacientes com sinais e sintomas consistentes com os TNEs Nao se destina a fa
11. es de acreditac o Consultar o NCCLS C24 A que cont m informac es de orientac o sobre as pr ticas apropriadas de controlo da qualidade Efeito gancho Nao se observa qualquer efeito gancho ao analisar concentrac es de cromogranina A de at 360 000 ng ml ou 10 000 nmol l ou 116 000 U L LIMITAC ES Nao foram detectadas interfer ncias quando se adicionou bilirrubina F 208 mg l bilirrubina C 200 mg l hemoglobina hemol tica 4 84 g l ou quilo 1430 FTU s amostras de plasma O n vel de cromogranina A do paciente individual n o pode ser utilizado por si pr prio como medida da gravidade da doenca N o se deve contar com a an lise como base nica das decis es a tomar sobre a terapia m dica a an lise serve para ser utilizada em combinac o com os sintomas cl nicos e os resultados de outras an lises dispon veis 91 K2378 E 23 0196 07DA Interfer ncia Os indiv duos a receber anticorpos de rato anti humanos para tratamento ou diagn stico ou os pacientes que tenham de outra forma sido expostos a imunoglobulina do rato poder o produzir HAMA anticorpos anti rato humanos Estes anticorpos podem interferir com os ensaios que utilizem anticorpos monoclonais de rato e podem dar resultados falsamente elevados Resultados previstos Recomenda se que cada laborat rio estabeleca uma amplitude de refer ncia com amostras normalmente utilizadas pois as varia es no manuseamento das amostras podem afectar os re
12. falscher 1 Uberpr fen ob Zeit und Temperatur werte Zeitablauf korrekt waren Siehe Schlechte auBerhalb oder falsch pipettiert Reagenzien Pr zision weiter unten des nicht gemischt Test wiederholen Messbereichs 2 Kreuzkontamination der 2 Sorgf ltig pipettieren Kontrollen 3 Falsche Verd nnung 3 Test wiederholen 4 Strahlengang nicht sauber 4 Auf Verschmutzung oder Luftblasen in den Kavit ten pr fen Unterseite der Platte abwischen und erneut ablesen Alle Test 1 Es wurden ein oder mehrere 1 Testablauf berpr fen Auf nicht ergebnisse Reagenzien nicht verwendetes Reagenz berpr fen ohne oder in der falschen Reihenfolge Test wiederholen Farbent hinzugef gt wicklung 2 Beschichtete Platte inaktiv 2 Auf sichtbare Feuchtigkeit in nicht benutzten Kavit ten pr fen Unterseite der Platte abwischen und erneut ablesen Alle Test 1 Kontaminierte Puffer oder 1 Alle L sungen auf Tr bung oder fauligen ergebnisse Reagenzien Geruch pr fen gelb 2 Waschl sung kontaminiert 2 Sauberen Behalter verwenden Uberprifen Sie die Qualitat des Wassers mit der die L sung hergestellt wurde 3 Falsche Serumverd nnung 3 Test wiederholen Maximale OD 1 Zu hohe 1 Inkubationstemperatur f r Substrat ist erh ht Inkubationstemperaturen Auto senken ber 3 0 matisiertes Verfahren angewendet Schlechte 1 VK der Pipettenabgabe 1 Pipettenkalibrierung berpr fen Pr zision ber 5 Mit reproduzierbarer Technik ar
13. neuron specific enolase carcinoembryonic antigen and hydroxyindole acetic acid evaluation in patient with neuroendocrine tumours Cancer 1999 86 858 865 2 Eriksson B berg K and Stridsberg M Tumour markers in neuroendocrine tumours Digestion 2000 62 33 38 3 O Connor D T and Deftos L J Secretion of chromogranin A by peptide producing endocrine neoplasms New England Journal of Medicine 1986 314 1145 1151 4 Stridsberg M Hellman U Wilander E Lundavist G Hellsing K and berg K Fragments of chromogranin A are present in the urine of patients with carcinoid tumours Development of a specific radioimmunoassay for chromogranin A and its fragments Journal of Endocrinology 1993 139 329 337 5 Stridsberg M Oberg K Li Q Engstr m U and Lundqvist G Measurements of chromogranin A chromogranin B secretogranin chromogranin C secretogranin II and pancreastatin in plasma and urine from patients with carcinoid tumours and endocrine pancreatic tumours Journal of Endocrinology 1995 144 49 59 6 Stridsberg M Measurements of chromogranins and chromogranin related peptides by immunological methods Advanced Experimental and Medical Biology 2000 482 319 327 7 Winkler H and Fischer Colbrie R The chromogranin A and B The first 25 years and future perspectives Neuroscience 1992 49 497 528 22 K2378 E 23 0196 07DA L EXPLICATION DE SYMBOLES E Antig ne pl
14. neuron specific enolase carcinoembryonic antigen and hydroxyindole acetic acid evaluation in patient with neuroendocrine tumours Cancer 1999 86 858 865 Eriksson B berg K and Stridsberg M Tumour markers in neuroendocrine tumours Digestion 2000 62 33 38 O Connor D T and Deftos L J Secretion of chromogranin A by peptide producing endocrine neoplasms New England Journal of Medicine 1986 314 1145 1151 Stridsberg M Hellman U Wilander E Lundqvist G Hellsing K and berg K Fragments of chromogranin A are present in the urine of patients with carcinoid tumours Development of a specific radioimmunoassay for chromogranin A and its fragments Journal of Endocrinology 1993 139 329 337 Stridsberg M berg K Li A Engstr m U and Lundqvist G Measurements of chromogranin A chromogranin B secretogranin chromogranin C secretogranin II and pancreastatin in plasma and urine from patients with carcinoid tumours and endocrine pancreatic tumours Journal of Endocrinology 1995 144 49 59 Stridsberg M Measurements of chromogranins and chromogranin related peptides by immunological methods Advanced Experimental and Medical Biology 2000 482 319 327 Winkler H and Fischer Colbrie R The chromogranin A and B The first 25 years and future perspectives Neuroscience 1992 49 497 528 84 K2378 E 23 0196 07DA OBJA NIENIE SYMBOLI Antygen p ytka powlekana L
15. o utilizar um congelador livre de gelo pois poder permitir gue as amostras passem por v rios ciclos de congelamento e descongelamento degradando assim o anticorpo As amostras que sejam incorrectamente armazenadas ou sejam sujeitas a m ltiplos ciclos de congelamento e descongelamento podem originar resultados falsos COMPONENTES DO KIT E ARMAZENAGEM DOS REAGENTES Uma armac o com 96 pocos fechada dentro de um pacote de pel cula metalizada com um pacote dessecante Seis frascos com calibradores liofilizados contendo Cromogranina A humana em diluente CAL 1 0 ng ml diluente CAL 2 36 ng ml CAL 3 180 ng ml CAL 4 540 ng ml CAL 5 1080 ng ml CAL 6 1800 ng ml Um frasco com controlo baixo liofilizado L de cor verde Um frasco com controlo alto liofilizado H de cor vermelha 30 ml de Diluente DIL contendo anticorpos de cromogranina A marcados com biotina de cor vermelha Pronto a utilizar 150 ul de conjugado CONJ contendo anticorpos de cromogranina A marcados com HRP Concentrado 100 vezes 15 ml de tamp o conjugado de cor azul Pronto a utilizar 15 ml de substrato TMB Pronto a utilizar 15 ml de solu o de paragem 0 5m H2SO Pronto a utilizar 2 x 35 ml de solu o de lavagem concentrada 20 vezes Antes de utilizar Dissolver cuidadosamente os calibradores e controlos liofilizados em 300 ul de gua destilada Depois de utilizados os calibradores e os controlos reconstitu d
16. pacient s atrofickou gastritidou a pacient podstupuj c ch l bu inhibitory protonov pumpy 66 K2378 E 23 0196 07DA FUNK N CHARAKTERISTIKY Tabulka 1 Klinick senzitivita a specificita Klinick senzitivita Celkem bylo analyzov no 107 klinicky charakterizovan ch vzork heparinov plazmy N sleduj c tabulka je shrnut m v sledk Skupina onemocn n Celkov Pozitivn Negativn Senzitivita po et gt 3 0 nmol L lt 3 0 nmol L ECL 4 3 1 75 EPT 30 19 11 63 FGC 10 7 3 70 LC 9 4 5 44 MGC 47 28 19 60 NE Diff 6 2 4 33 Paragangliom 1 0 100 ECL Enterochromafinn tumory EPT Endokrinn tumor pankreatu FGC Karcinoid horn sti tr vic trubice LC Karcinoid plic MGC Karcinoid st edn sti st eva NE Diff Neurokrinn diferenciace Specificita Bylo testov no 126 vzork plazmy s heparinem od zjevn zdrav ch d rc krve t chto 126 vzork bylo negativn ch 126 126 100 95 Cl 97 1 100 95 interval spolehlivosti Cl byl vypo ten p esnou metodou Tabulka 2 P esnost mezi testy byla stanovena testov n m esti odli n ch vzork v osmi replik tech p i t ech samostatn ch p le itostech 1 2 3 4 5 6 Sa NANO 150 209 316 486 838 1212 a 140 108 283 417 806 698 eu 9 5 9 9 10 6 Tabulka 3 P esnost v r mci testu byla stanovena testov n m esti odli
17. pnych test w Zak cenia Nie zaobserwowano zak ce po dodaniu do pr bek osocza bilirubiny F 208 mg l bilirubiny C 200 mg l hemoglobiny hemolitycznej 4 84 g l lub ch onki 1430 FTU Osoby otrzymuj ce w celu leczenia lub diagnostyki mysie przeciwcia a przeciwludzkie lub pacjenci nara eni w inny spos b na immunoglobuliny mysie mog wytwarza ludzkie przeciwcia a przeciwmysie ang human anti mouse antibodies HAMA Przeciwcia a te mog zak ca oznaczenia wykorzystuj ce mysie przeciwcia a monoklonalne i mog powodowa wyniki fa szywie podwy szone Wyniki oczekiwane Zaleca si aby ka de laboratorium okre li o w asny zakres referencyjny dla powszechnie stosowanych pr bek poniewa na wyniki mog wp ywa r nice w post powaniu z pr bkami Zaleca si przestrzeganie cis ej procedury pracy takiej jak opisana powy ej Podane ni ej warto ci s wskazaniem oczekiwanego zakresu referencyjnego i obliczone jako 97 5 percentyl 126 pr bek osocza heparynowego krwiodawc w 63 m czyzn i 63 kobiet Zakres referencyjny st enia chromograniny A w osoczu heparynowym lt 108 ng ml lub 3 0 nmol l lub 35 U I Granica wykrywania Granica wykrywania tego oznaczenia wynosi 19 ng ml lub 0 54 nmol l lub 6 U I Jest to najni sze wykrywalne st enie kt re r ni si od zera z prawdopodobie stwem 95 Oznacza to e a do tego punktu mo na uzyska wiarygodne pomiary nawet na pr bkach ujemn
18. przekracza 3 0 S aba 1 CV pipety podaj cej Sprawdzi kalibracj pipety precyzja wy sze ni 5 U y powtarzalnej techniki 2 Pr bka lub odczynniki nie s Wymiesza delikatnie ale dok adnie wystarczaj co wymieszane lub wszystkie odczynniki i doprowadzi je do nie s doprowadzone do temperatury pokojowej temperatury pokojowej 3 Dodawanie odczynnika trwa o Opracowa jednorodn technik zbyt d ugo niesp jno odst p w i stosowa urz dzenie wieloko c wkowe lub dozownik automatyczny w celu skr cenia czasu 82 K2378 E 23 0196 07DA cie ka optyczna nie jest czysta 4 P ukanie niejednorodne 5 uwi zione p cherzyki powietrza roztw r p ucz cy pozosta w studzienkach Nieprawid owe pipetowanie 6 Sprawdzi wyst powanie p cherzyk w powietrza w studzienkach Wytrze sp d p ytki i ponownie odczyta Sprawdzi czy wszystkie studzienki s wype nione i jednorodnie zasysane Dozowa ciecz powy ej poziomu odczynnika w studzience Po ostatnim p ukaniu opr ni studzienki stukaj c p ytk do mikromiareczkowania w chusteczk poch aniaj c Unika p cherzyk w powietrza w ko c wkach pipety 83 K2378 E 23 0196 07DA PI MIENNICTWO 15 20 21 Bajetta E Ferrari L Martinetti A Celio L Procopio G Artale S Zilembo N Di Bartolomeo M Seregni E and Bombardieri E Chromogranin A
19. sendo os tumores neuroend crinos tipicos tumores carcin ides feocromocitomas neuroblastomas cancros de c lula peguena do pulm o adenomas hiperparatir ides tumores da pituit ria e tumores das ilhotas pancre ticas e incluem os s ndromes MEN1 e MEN2 Este grupo inclui ainda os diferentes s ndromes tumorais neuroend crinos nomeadamente os gastrinomas insulinomas glucagonomas somatostatinomas PPomas e os tumores neuroend crinos n o funcionais Eriksson B et al 2000 Nestes tumores a cromogranina A demonstrou ser o melhor marcador circulante Bajetta E et al 1999 Princ pio da CgAnalyze Kit Numa placa de diluic o em separado diluem se as amostras do paciente os calibradores e os controlos 5 vezes em diluente O material dilu do ent o transferido para as pocos de microtitulac o e incubado a temperatura ambiente durante 60 minutos Durante esta primeira incubac o um anticorpo monoclonal captura a cromogranina A e fixa a a superf cie do poco Depois de lavar para remover o material n o ligado adiciona se um segundo anticorpo monoclonal marcado com peroxidase de r bano HRP horseradish peroxidase para detectar a cromogranina A ligada ao poco Depois de incubar durante 30 minutos lavam se de novo os pocos e adiciona se Ihes um substrato de cor incubando se a seguir os pocos O desenvolvimento da cor deve ser interrompido passados 15 minutos medindo se ent o a cor num espectro fot metro A cor directamente
20. 0 100 ECL Enterochromaffin like Tumours EPT Endocrine pancreas Tumour FGC Foregut carcinoid LC Lung carcinoid MGC Midgut carcinoid NE Diff Neurocrine differentiation Specificity 126 Heparin plasma samples from apparently healthy blood donors were assayed 126 samples were negative 126 126 100 The 95 confidence interval CI was calculated using the exact method 95 Cl 97 1 100 Table 2 Inter assay precision was determined by testing six different samples in eight replicates at three separate occasions 1 2 3 4 5 6 Mean value ng mL 150 209 316 486 838 1212 SD 14 0 10 8 28 3 41 7 80 6 69 8 CV 9 5 9 9 10 6 Table 3 Intra assay precision was determined by testing six different samples in eight replicates at one occasion 1 2 3 4 5 6 Mean value ng mL 156 214 335 502 868 1255 SD 6 4 11 3 10 4 23 3 42 8 101 4 CV 4 5 3 5 5 8 K2378 E 23 0196 07DA Table 4 Batch to batch variation was determined by testing six different samples in eight replicates on three different batches 1 2 3 4 5 6 Mean value ng mL 145 205 309 459 794 1165 SD 9 6 7 8 22 9 38 5 69 2 78 1 CV 7 4 7 8 9 7 Table 5 Dilution recovery was determined by testing five serial dilutions for three different samples Mean Measured Calculated Concentration Concentration ng mL Dilution Corrected Recovery
21. Des t moins suppl mentaires pourront tre test s conform ment aux directives ou exigences r glementaires locales f d rales ou nationales ou manant d organismes d accr ditation Consulter la norme NCCLS C24 A pour y consulter les directives relatives aux pratiques de contr le qualit Effet de crochet On n a pas constat d effet de crochet lors de l analyse des concentrations de chromogranine A jusqu 360 000 ng ml ou 10 000 nmol l 116 000 U L LIMITATIONS Le niveau de chromogranine A du patient individuel ne peut pas lui seul tre consid r repr sentatif de la gravit de la maladie II n est pas prudent de se fier uniquement ce test pour prendre des d cisions th rapeutiques cliniques Il devra plut t tre utilis en parall le avec les sympt mes cliniques et les r sultats d autres analyses disponibles 17 K2378 E 23 0196 07DA Interf rencell n a pas t d tect d interf rence lorsque des chantillons de plasma ont t caract ris s par de la bilirubine F 208 mg l de la bilirubine C 200 mg l de l h moglobine h molytigue 4 84 g l ou du chyle 1430 FTU Les personnes recevant des anticorps anti humain de souris a des fins de traitement ou de diagnostic ou les patients ayant t autrement expos s a de l immunoglobuline de souris sont susceptibles de produire des anticorps humains anti souris HAMA Ces anticorps sont susceptibles d interf rer avec des dosages int grant des anti
22. Mancata aggiunta di uno o piu Ricontrollare la procedura Controllare il test vuoti reagenti oppure aggiunta nella reagente inutilizzato sequenza errata Ripetere il test Piastra rivestita inattiva Controllare l umidit evidente nei pozzetti inutilizzati Pulire il fondo e ripetere la lettura Risultati dei Tamponi o reagenti contaminati Controllare la torbidit o l odore test gialli sgradevole delle soluzioni Contaminazione della soluzione Utilizzare un contenitore pulito di lavaggio Controllare la qualit della soluzione in acqua utilizzata per la preparazione Diluizione del siero non corretta Ripetere il test Il massimo Temperature di incubazione Ridurre il tempo di incubazione per il DO risulta troppo alte utilizzo del metodo substrato elevato automatizzato supera 3 0 Scarsa CV fornitura pipetta maggiore del Controllare la taratura della pipetta precisione 5 Utilizzare una tecnica riproducibile Campioni o reagenti non sufficientemente miscelati o non bilanciati a temperatura ambiente Durata eccessiva dell aggiunta di reagenti intervalli di tempo non coerenti Percorso ottico non pulito Lavaggio non coerente bolle intrappolate soluzione di lavaggio residua nei pozzetti Miscelare i reagenti con cautela ma accuratamente e bilanciare la temperatura ambiente Sviluppare una tecnica uniforme coerente e utilizzare un dispositivo a pi puntali o un distributore automatico per ridurre il tempo C
23. R VZORK Pro soupravu CgAnalyze Kit se doporu uje pou t s rum i plasmu s EDTA nebo heparinem Se vzorky zach zejte jako s potenci ln infek n m materi lem Vzorky se separuji odst ed n m a lze je skladovat p i teplot 2 8 C po dobu nejv e 7 dn Del skladov n vzork je mo n p i teplot ch 20 C nebo ni ch Vzorky mohou b t t ikr t zmrazeny a rozmrazeny ani by do lo ke zhor en jejich kvality Nepou vejte mrazni ku typu frost free proto e v t by mohly vzorky opakovan proch zet zmrazen m a rozmrazen m a mohlo by doj t k rozkladu protil tek V sledky stanoven p i pou it nespr vn skladovan ch vzork nebo vzork kter byly v cekr t zmrazeny a rozmrazeny mohou b t sporn SOU STI SOUPRAVY A SKLADOV N REAGENCI Jedna desti ka s 96 jamkami zataven ve f lii a v such m balen est lahvi ek s lyofilizovanymi kalibratory obsahuj c ch lidsk chromogranin A v edic m roztoku CAL 1 O ng mL edic roztok CAL 2 36 ng mL CAL 3 180 ng mL CAL 4 540 ng mL CAL 5 1080 ng mL CAL 6 1800 ng mL Jedna lahvi ka s lyofilizovanou kontrolou s n zkou koncentrac analytu Low control L zelen barva 62 K2378 E 23 0196 07DA Jedna lahvi ka s lyofilizovanou kontrolou s vysokou koncentrac analytu High control H erven barva 30 mL edic roztok Diluent DIL obsahuj c protil tky proti chromograninu A zna
24. a la placa de muestras Los calibradores el control bajo el control alto y el plasma del paciente deben diluirse en 50 uL de plasma 200 uL de diluyente Mezclar bien pipeteando arriba y abajo antes de transferir 100 ul por duplicado a la placa de prueba de acuerdo con el siguiente diagrama 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CAL1 CAL5 P1 B CAL1 CAL5 P1 C GAL2 CAL6 P2 D CAL2 CAL6 P2 E CAL3 H etc F CAL3 H G CAL4 IL H CAL4 L Incubar durante 60 minutos Despu s de la incubacion de la muestra Lavar tres 3 veces con 300 ul de soluci n de lavado pocillo llenando y vaciando los pocillos cada vez Despu s del ltimo lavado vac e los pocillos golpeando la placa sobre un tejido absorbente Adici n de conjugado A ada 100 ul de conjugado a cada pocillo Incube durante 30 minutos Despu s de la incubaci n del conjugado Lave como antes Adici n de soluci n sustrato A ada 100 uL de sustrato TMB a cada pocillo e incube a oscuras durante 15 minutos El tiempo de incubaci n puede reducirse a 10 minutos si el DO m ximo supera 3 0 a altas temperaturas o si se utiliza un m todo automatizado Adici n de la soluci n de parada A ada 100 ul de soluci n de parada a cada pocillo Lea la absorbancia a 450 nm a las 2 horas en un lector de microplacas Lea a 620 nm como longitud de onda de referencia C lculos Construya una curva calibrado
25. berg K and Stridsberg M Tumour markers in neuroendocrine tumours Digestion 2000 62 33 38 O Connor D T and Deftos L J Secretion of chromogranin A by peptide producing endocrine neoplasms New England Journal of Medicine 1986 314 1145 1151 Stridsberg M Hellman U Wilander E Lundavist G Hellsing K and berg K Fragments of chromogranin A are present in the urine of patients with carcinoid tumours Development of a specific radioimmunoassay for chromogranin A and its fragments Journal of Endocrinology 1993 139 329 337 Stridsberg M Oberg K Li Q Engstr m U and Lundovist G Measurements of chromogranin A chromogranin B secretogranin chromogranin C secretogranin II and pancreastatin in plasma and urine from patients with carcinoid tumours and endocrine pancreatic tumours Journal of Endocrinology 1995 144 49 59 Stridsberg M Measurements of chromogranins and chromogranin related peptides by immunological methods Advanced Experimental and Medical Biology 2000 482 319 327 Winkler H and Fischer Colbrie R The chromogranin A and B The first 25 years and future perspectives Neuroscience 1992 49 497 528 71 K2378 E 23 0196 07DA VYSV TLEN SYMBOL Antigen pota en desti ka L edic roztok Konjug tov pufr o o z c CONJ 100X Konjug t s HRP 100x konc Promyvac pufr 20x koncentrovany Roztok TMB roztok subs
26. contengono componenti del siero umano ma il plasma del paziente analizzato dovra essere manipolato come potenziale trasmettitore di agenti infettivi Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie e gli Istituti nazionali di sanita consigliano di manipolare i potenziali agenti infettivi a livello di biosicurezza 2 La maggior parte delle soluzioni in kit contengono ProClin 300 come conservante Non pipettare per bocca n consentire il contatto di reagenti o campioni di pazienti con la pelle I reagenti contenenti ProClin 300 possono essere irritanti Evitare il contatto con pelle e occhi In caso di contatto risciacquare con abbondante acqua La soluzione di arresto contiene acido solforico 0 5 M Non consentire il contatto del reagente con la pelle Le concentrazioni di cromogranina A in un determinato campione con dosaggi di diversi produttori possono variare in base alle differenze nei metodi di dosaggio e nella specificita dei reagenti rifiuti devono essere trattati come pericolosi Le schede dei dati di sicurezza per tutti i componenti pericolosi contenuti in questo kit sono disponibili a richiesta presso Dako Denmark A S Attenzione Contiene ProClin 300 Miscela di 5 chloro 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 247 500 7 and 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 220 239 6 3 1 H317 Puo provocare una reazione allergica cutanea P264 Lavare accuratamente le mani dopo l uso P280 Indossare guanti i
27. controls should be diluted 5x in diluent at each test occasion The amount of conjugate needed for each analysis should be diluted 100x before use 10uL conjugate 990 uL conjugate buffer per strip Remaining diluted conjugate shall be discarded Wash solution should be diluted 20x before use Dilute 10 mL of the 20x concentrated wash solution in 190 mL distilled water When stored at 2 8 C the diluted wash solution is stable until the date of expiration of the kit The rest of the reagents in the kit are ready for use Remove only the number of wells needed for testing reseal the aluminium packaging carefully Materials or equipment required but not provided Microplate reader with 450 nm filter Reference wavelength is 620 nm 300 uL well dilution plate for dilution of calibrator patient samples and controls Precision pipettes with disposable tips Automatic microtitre plate washer absorbent tissue tubes and a timer PROCEDURE All solutions should be used at room temperature Incubate all steps at room temperature 20 30 C Sample dilution and incubation Dilute all samples 5x in a separate dilution plate before transferring to test plate Calibrators Low Control High Control and patient plasma should all be diluted 50 uL plasma 200 uL diluent Mix thoroughly by pipetting up and down before transferring 100 pL in duplicate to the test plate according to the diagram below 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
28. de solution de lavage concentr e 20 fois Avant emploi Les t moins et calibrateurs lyophilis s devront tre d licatement dissous dans 300 pl d eau distill e Apr s l emploi les t moins et calibrateurs reconstitu s devront tre entrepos s a une temp rature de 20 C ou inf rieure Les t moins et calibrateurs pourront tre soumis 3 cycles de cong lation d cong lation sans d t rioration Les autres r actifs du kit devront tre entrepos s une temp rature comprise entre 2 et 8 Gi Les t moins et calibrateurs reconstitu s devront tre dilu s 5 fois dans du diluant Voccasion de chaque test La quantit de conjugu n cessaire chaque analyse devra tre dilu e 100 fois avant Vemploi 10 ul de conjugu 990 ul de conjugu tampon par bande Jeter le reste de conjugu dilu La solution de lavage devra tre dilu e 20 fois avant emploi Diluer 10 ml de la solution de lavage concentr e 20x dans 190 ml d eau distill e Lorsqu elle est entrepos e a une temp rature comprise entre 2 et 8 C la solution de lavage dilu e reste stable jusqu a la date de p remption du kit Le reste des r actifs du kit sont pr ts l emploi Enlever uniquement le nombre de puits n cessaires l analyse en prenant soin de refermer soigneusement l emballage en aluminium Mat riels ou quipements n cessaires non fournis Lecteur de microplaque avec filtre de 450 nm Longueur d onde de r f rence 620 nm Plaque de
29. hohen Kontrolle sowie der Patientenproben aus der Kurve ab Werte ber dem h chsten Kalibrator m ssen entweder als gt 1800 ng ml angegeben oder mit Assay Verd nnungspuffer verd nnt und erneut getestet werden In diesem Fall muss der Verd nnungsfaktor in die Berechnung der Chromogranin A Konzentration mit einbezogen werden Bitte beachten Sie dass f r den Fall dass Kalibrator 1 oder 6 auBerhalb des Messbereichs liegen der Test ung ltig ist und wiederholt werden muss 40 K2378 E 23 0196 07DA Zur Vereinfachung k nnen die Konzentrationen in mg ml nmol l oder U L berechnet werden Alle Einheiten sind in der Tabelle unten angegeben F r diese Umrechnung wurde das Molekulargewicht des nativen Fragments von Chromogranin A 36kDa verwendet Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 Beispiel E 2 500 Konzentration q Kalibrator ng m nmol L U L Extinktion 1 L S 1000 1 0 0 0 0 094 ose 2 36 1 1 2 0 209 dn 0 36 180 540 1080 1800 3 180 5 58 0 678 o 2 se 174 e ss 4 540 15 174 1 599 5 1080 30 348 2 259 Chromogranin A molt 6 1800 50 581 2 735 Chromogranin A U L Eine Probe mit einem Extinktionswert von 1 272 wird auf der X Achse mit einem Wert von 367 ng ml bzw 10 2 nmol l bzw 118 U L Chromogranin A abgelesen In diesem Beispiel wurde die Kurve mit einer 4 Parameter Logistic erstellt Wichtig Die Kurve ist als Beispiel gedacht und darf nich
30. hypophysaires et les tumeurs des ilots de Langherans y compris les syndromes MEN1 et MEN2 Elles comptent galement les diff rents syndromes des tumeurs neuroendocrines notamment les gastrinomes insulinomes glucagonomes somatostatinomes PPomes et tumeurs pancr atigues neuroendocrines non fonctionnelles Eriksson B et al 2000 2000 Pours ces tumeurs la chromogranine A s est av r e tre le meilleur margueur circulant Bajetta E et al 1999 Principe du dosage CgAnalyze Kit Les chantillons patient calibrateurs et t moins sont dilu s 5 fois dans du diluant dans des plagues de dilution s par es La mat riel dilu est transf r sur les puits de microtitrage et incub a temp rature ambiante pendant 60 minutes Au cours de cette premiere incubation un anticorps monoclonal capture la chromogranine A a la surface du puits Suite a un lavage destin a supprimer la matiere non li e on ajoute un second anticorps monoclonal marqu a la peroxydase de raifort HRP pour d tecter la chromogranine A li e au puits Apres une incubation de 30 minutes les puits sont a nouveau lav s et un substrat color est ajout et incub La coloration est interrompue au bout de 15 minutes et on mesure la couleur dans un spectrophotometre La couleur est directement proportionnelle a la guantit de chromogranine A li e au puits La guantit de chromogranine est d termin e au moyen d une comparaison avec la coloration des chantillons de
31. in Folienverpackung mit Trockenmittel verschweiBt Sechs Fl schchen lyophilisierte Kalibratoren mit humanem Chromogranin A in Verd nnungspuffer CAL 1 0 ng ml Verd nnungspuffer CAL 2 36 ng mlL CAL 3 180 ng ml CAL 4 540 ng ml CAL 5 1080 ng ml CAL 6 1800 ng ml Ein Fl schchen lyophilisierte Kontrolle niedrig LC gr ne Farbe Ein Fl schchen lyophilisierte Kontrolle hoch HC rote Farbe 30 ml Verd nnungspuffer DIL mit Biotin markierten Antik rpern gegen Chromogranin A rot Gebrauchsfertig 150 ul Konjugat CONJ mit HRP markierten Antik rpern gegen Chromogranin A 100fach konzentriert 15 ml Konjugatpuffer blau Gebrauchsfertig 15 ml Substrat TMB Gebrauchsfertig 15 ml Stoppl sung 0 5 M H SO Gebrauchsfertig 2x 35 ml Waschl sung 20fach konzentriert Vor Gebrauch Lyophilisierte Kalibratoren und Kontrollen sorgf ltig in 300 ul destilliertem Wasser aufl sen Nach Gebrauch die rekonstituierten Kalibratoren und Kontrollen bei 20 C oder darunter lagern Kalibratoren und Kontrollen k nnen ohne Ver nderung 3 mal eingefroren und wieder aufgetaut werden Alle anderen Reagenzien des Kits bei 2 8 C lagern Rekonstituierte Kalibratoren und Kontrollen f r jeden Testlauf mit Verd nnungspuffer 5fach verd nnen Die f r jede Analyse erforderliche Menge Konjugat vor Gebrauch 100fach verd nnen 10 ul Konjugat 990 ul Konjugatpuffer je Streifen Ubrig gebliebenes Konjugat muss verwo
32. inhibiteurs de la pompe protons 18 K2378 E 23 0196 07DA CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE Tableau 1 Sp cificit et sensibilit clinique Sensibilit clinique Un total de 107 chantillons de plasma h parin avec caract risation clinique ont t analys s Le tableau ci dessous r capitule les r sultats obtenus Nombre Positif N gatif Dar Groupes pathologiques total gt 3 0 nmol l lt 3 0 nmol l MS ECL 4 3 1 75 TEP 30 19 11 63 FGC 10 7 3 70 CP 9 4 5 44 MGC 47 28 19 60 Diff NE 6 2 4 33 Paraganglionnaire 1 1 0 100 ECL Tumeurs a cellules ent rochromaffine like TEP Tumeur endocrine pancr atigue FGC Garcinoide de l intestin ant rieur CP Garcinoide du poumon MGC Carcinoide de l intestin moyen Diff NE Diff renciation neurocrine Sp cificit Sur les 126 chantillons de plasma h parin analys s provenant de donneurs apparemment sains 126 taient n gatifs 126 126 100 IC de 95 97 1 100 L intervalle de confiance IC de 95 a t calcul selon la m thode exacte Tableau 2 La pr cision inter dosages a t d termin e en testant six chantillons diff rents en huit r plicats et en trois occasions distinctes 1 2 3 4 5 6 Valeur moyenne ng ml 150 209 316 486 838 1212 S 14 0 10 8 28 3 41 7 80 6 69 8 CV 9 5 9 9 10 6 Tableau 3 La pr cision intradosage a t d termin e en testant six chanti
33. la cromogranina A si dimostrata essere il miglior marcatore presente in circolo Bajetta E et al 1999 Principio di CgAnalyze Kit Campioni calibratori e controlli sono diluiti 5x nel diluente su una piastra di diluizione separata Il materiale diluito viene trasferito su pozzetti di microtitolazione e incubato a temperatura ambiente per 60 minuti Durante la prima incubazione un anticorpo monoclonale attira la cromogranina A sulla superficie del pozzetto Dopo il lavaggio per rimuovere il materiale non legato si aggiunge un secondo anticorpo monoclonale marcato con perossidasi di rafano HRP per rilevare la cromogranina A legata al pozzetto Dopo l incubazione per 30 minuti i pozzetti vengono lavati nuovamente e si aggiunge un substrato di colore che viene incubato Lo sviluppo cromatico viene interrotto dopo 15 minuti e il colore viene misurato nello spettrometro Il colore direttamente proporzionale alla quantit di cromogranina A legata al pozzetto La quantit di cromogranina determinata dal confronto con lo sviluppo cromatico dei campioni del calibratore Il calibratore nel kit un peptide sintetico corrispondente alla cromogranina A Il calibratore peptide previsto fornisce una risposta equivalente a un frammento originale depurato di cromogranina A Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 49 K2378 E 23 0196 07DA AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per uso diagnostico in vitro reagenti del dosaggio non
34. neoplasms New England Journal of Medicine 1986 314 1145 1151 4 Stridsberg M Hellman U Wilander E Lundavist G Hellsing K and Oberg K Fragments of chromogranin A are present in the urine of patients with carcinoid tumours Development of a specific radioimmunoassay for chromogranin A and its fragments Journal of Endocrinology 1993 139 329 337 5 Stridsberg M Oberg K Li A Engstr m U and Lundqvist G Measurements of chromogranin A chromogranin B secretogranin chromogranin C secretogranin II and pancreastatin in plasma and urine from patients with carcinoid tumours and endocrine pancreatic tumours Journal of Endocrinology 1995 144 49 59 6 Stridsberg M Measurements of chromogranins and chromogranin related peptides by immunological methods Advanced Experimental and Medical Biology 2000 482 319 327 7 Winkler H and Fischer Colbrie R The chromogranin A and B The first 25 years and future perspectives Neuroscience 1992 49 497 528 46 K2378 E 23 0196 07DA ERKL RUNG DER SYMBOLE Antigen beschichtete Platte DIL Verd nnungspuffer o o z c Konjugatpuffer CONJ 100X Konjugat HRP 100fach konz Waschpuffer 20fach Konzentrat BUF WASH 2ox SUBS TMB Substratl sung Schwefelsaure 0 5 M Stoppl sung O d r Mm lt o Lyophilisierter Kalibrator CONTROL LYO Lyophilisierte Kontrolle niedri
35. ou ajout s dans le calibrateurs mauvais ordre hors plage 2 Pipetage incorrect 2 Test non valable Recommencer le test Valeurs 1 Temp rature temporisation 1 V rifier que la temporisation et la t moins hors ou pipetage incorrects R actifs temp rature taient correctes Voir plage non m lang s Pr cision m diocre ci dessous Recommencer le test 2 Gontamination crois e des 2 Pipeter soigneusement t moins 3 Dilution inappropri e 3 Recommencer le test 4 Chemin optique sale 4 V rifier s il y a des salet s ou bulles d air dans les puits Essuyer la base et lire nouveau Tous les 1 Unou plusieurs r actifs non 1 Rev rifier la proc dure V rifier en cas r sultats ajout s ou ajout s dans le de r actif inutilis de test sont mauvais ordre Recommencer le test blancs 2 Plaque enduite inactive 2 V rifier en cas d humidit vidente dans les puits inutilis s Essuyer la base de la plaque et lire nouveau Tous les 1 Tampons ou r actifs contamin s 1 V rifier toutes les solutions en cas de r sultats de turbidit ou d odeur naus abonde test 2 Solution de lavage contamin e 2 Utiliser un r cipient propre V rifier la sont jaunes qualit de la solution aqueuse utilis e dans la pr paration 3 Dilution de s rum inappropri e 3 Recommencer le test Le seuil 1 Temp rature d incubation trop 1 R duire la dur e d incubation du substrat maximal de lev e recours une m th
36. pensado para realizar despistaje en una poblaci n sana El an lisis deben realizarlo profesionales de laboratorio debidamente formados PARA USO EN DIAGN STICO IN VITRO RESUMEN Y EXPLICACI N Las cromograninas y las secretograninas constituyen una familia de prote nas con una acidez exclusiva que se conservan conjuntamente con neurotransmisores y hormonas peptidicas en el cerebro y el sistema neuroendocrino difuso Winkler H amp Fischer Colbrie R 1992 Estructuralmente estas prote nas son productos de diferentes genes pero comparten algunas propiedades globales como la abundancia de residuos amino cidos cidos y varios pares de amino cidos b sicos como posiciones posibles para la rotura postraduccional Las cromograninas se conservan conjuntamente y se liberan conjuntamente con neurop ptidos y hormonas en las c lulas neuroendocrinas en todo el cuerpo Se ha sugerido un papel de las cromograninas en la generaci n de gr nulos hormonales y en el empaquetamiento de hormonas Adem s las cromograninas se pueden romper en fragmentos m s peque os que pueden mostrar actividades biol gicas como inhibici n de la liberaci n de hormonas vasodilataci n y efectos anti microbiol gicos Stridsberg M 2000 Los tumores de origen neuroendocrino habitualmente presentan un aumento de los niveles s ricos plasm ticos de cromogranina A O Connor DT Deftos LJ 1986 Los tumores neuroendocrinos proceden de las c lulas neuroendocrinas y
37. pronto all uso Estrarre soltanto il numero di pozzetti necessario al test risigillando con cura la confezione di alluminio Materiali o attrezzature richieste ma non fornite Lettore per micropiastra con filtro 450 nm Lunghezza d onda di riferimento 620 nm Piastra di diluizione 300 uL pozzetto per diluizione di calibratore campioni del paziente e controlli Pipette di precisione con puntali monouso Lavatore automatico di piastre per microtitolazione tessuto assorbente provette e timer PROCEDURA Tutte le soluzioni devono essere utilizzate a temperatura ambiente Incubare in tutte le fasi a temperatura ambiente 20 30 C 51 K2378 E 23 0196 07DA Diluizione e incubazione dei campioni Diluire i campioni 5x in una piastra di diluizione separata prima del passaggio alla piastra di prova Diluire calibratori controllo basso controllo alto e plasma del paziente in 50 uL di plasma 200 uL di diluente Miscelare con cura pipettando verso l alto e verso il basso prima di trasferire 100uL in duplicato alla piastra di prova seguendo la tabella riportata sotto 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A GAL1 CAL5 P1 B CAL1 CAL5 P1 C GAL2 CAL6 P2 D CAL2 CAL6 P2 E CAL3 H ecc F CAL3 H G CAL4 IL H CAL4 L Incubare per 60 minuti Dopo l incubazione dei campioni Lavare tre 3 volte con soluzione di lavaggio 300 uL pozzetto riempiendo
38. rents peuvent varier en raison des diff rences entre les m thodes de dosage et la sp cificit des r actifs Manipuler et g rer tous les d chets en tant que d chets dangereux On peut se procurer les fiches de donn es de s curit relatives a tous les constituants dangereux inclus dans le coffret sur demande aupres de Dako Denmark A S Attention Contient ProClin 300 Masse de r action de 5 chloro 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 247 500 7 and 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 220 239 6 3 1 H317 Peut provoquer une allergie cutan e P264 Se laver soigneusement les mains apres manipulation P280 Porter des gants de protection des v tements de protection un quipement de protection des yeux du visage P302 352 ENCAS DE CONTACT AVEC LA PEAU laver abondamment a Veau et au savon P333 313 En cas d irritation ou d ruption cutan e consulter un m decin PRELEVEMENT DE SPECIMENS Il est recommand d utiliser le dosage CgAnalyze Kit sur du plasma h parin EDTA s rum Le manipuler comme potentiellement susceptible de transmettre des agents infectieux Les chantillons sont s par s par centrifugation et peuvent tre conserv s une temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant un maximum de 7 jours Si les sp cimens doivent tre gard s plus longtemps les entreposer des temp ratures de 20 ou inf rieures Les chantillons pourront tre soumis 3 cycles de cong lation d cong lation
39. sans d t rioration 14 K2378 E 23 0196 07DA Ne pas utiliser de cong lateur sans givre tant donn que ce genre de cong lateur est susceptible d exposer les sp cimens a des cycles de cong lation et d cong lation cons cutives et de d grader l anticorps Les chantillons incorrectement entrepos s ou ayant t expos s a plusieurs cycles de cong lation et d cong lation cons cutives sont susceptibles de produire des r sultats erron s ELEMENTS DU KIT ET ENTREPOSAGE DES REACTIFS Un cadre avec 96 puits herm tiguement emball dans une pochette m tallis e avec sachet anti humidit Six flacons de calibrateurs lyophilis s contenant de la chromogranine A humaine dans du diluant GAL 1 0 ng ml diluent CAL 2 36 ng ml CAL 3 180 ng ml CAL 4 540 ng ml CAL 5 1080 ng ml CAL 6 1800 ng ml Un flacon de t moin bas lyophilis marqu L pour low de couleur verte Un flacon de t moin haut lyophilis marqu H pour high de couleur rouge 30 ml de diluant DIL contenant des anticorps a la chromogranine A marqu s a la biotine de couleur rouge Pret a l emploi 150 uL de conjugu CONJ contenant des anticorps la chromogranine A marqu s la HRP Concentr 100 fois 15 ml de tampon conjugu de couleur bleue Pr t l emploi 15 ml de substrat de TMB Pr t l emploi 15 ml de solution d arret 0 5 M H2SO4 Pr t l emploi 2 x 35 ml
40. tabella seguente NET Numero Positivo Negativo ES Gruppi dimalattie totale gt 3 0 nmol L lt 3 0 nmol L ns ECL 4 3 1 75 EPT 30 19 11 63 FGC 10 7 3 70 LC 9 4 5 44 MGC 47 28 19 60 NE Diff 6 2 4 33 Paraganglioma 1 1 0 100 ECL Tumori tipo enterocromaffina EPT Tumore endocrino del pancreas FGC Garcinoide del foregut LC Garcinoide del polmone MGC Carcinoide del midgut NE Diff Differenziazione neurocrina 54 K2378 E 23 0196 07DA Specificita Sono stati dosati 126 campioni di plasma eparinico di donatori di sangue apparentemente sani 126 campioni sono risultati negativi 126 126 100 95 Cl 97 1 100 L intervallo di confidenza Cl del 95 stato calcolato con il metodo esatto Tabella 2 La precisione interdosaggio stata determinata da test su sei diversi campioni in otto replicati in tre diversi casi 1 2 3 4 3 6 Valore medio ng mL 150 209 316 486 838 1212 SD 14 0 10 8 28 3 41 7 80 6 69 8 CV 9 5 9 9 10 6 Tabella 3 La precisione intradosaggio stata determinata da test su sei diversi campioni in otto replicati in tre diversi casi 1 2 3 4 5 6 Valore medio ng mL 156 214 335 502 868 1255 SD 6 4 11 3 10 4 23 3 42 8 101 4 CV 4 5 3 5 5 8 Tabella 4 La variazione tra lotti stata determinata da test su sei diversi campioni in otto replicati in tre diversi casi 1 2 3
41. translational cleavage Chromogranins are co stored and co released with neuropeptides and hormones in the neuroendocrine cells throughout the body A role for chromogranins in the generation of hormonal granules and package of hormones has been suggested Furthermore chromogranins can be cleaved into smaller fragments which can display biological activities such as inhibition of hormonal release vasodilatation and anti microbiological effects Stridsberg M 2000 Tumours of neuroendocrine origin usually present with increased serum plasma levels of chromogranin A O Connor DT Deftos LJ 1986 The neuroendocrine tumours are derived from the neuroendocrine cells and typical neuroendocrine tumours are carcinoid tumours pheochromocytomas neuroblastomas small cell lung cancers hyperparathyroid adenomas pituitary tumours and pancreatic islet tumours and including the MEN1 and MEN2 syndromes This also includes the different neuroendocrine tumour syndromes namely the gastrinomas insulinomas glucagonomas somatostatinomas PPomas and the non functioning neuroendocrine tumours Eriksson B et al 2000 For these tumours chromogranin A has been shown to be the best circulating marker Bajetta E et al 1999 Principle of CgAnalyze Kit In a separate dilution plate patient samples calibrators and controls are diluted 5x in Diluent The diluted material is transferred to the microtitre wells and incubated at room temperature for 60 minutes
42. 1 2 3 4 5 6 Mittelwert ng ml 156 214 335 502 868 1255 SA 6 4 11 3 10 4 23 3 42 8 101 4 VK 4 5 3 5 5 8 Tabelle 4 Prazision von Charge zu Charge wurde durch Testen sechs verschiedener Proben in achtfachem Ansatz mit drei verschiedenen Chargen bestimmt 1 2 3 4 5 6 Mittelwert ng ml 145 205 309 459 794 1165 SA 9 6 7 8 22 9 38 5 69 2 78 1 VK 7 4 7 8 9 7 43 K2378 E 23 0196 07DA Tabelle 5 Wiederfindung der Verd nnung wurde durch Testen von 5 Reihenverd nnungen von 3 verschiedenen Proben bestimmt vieni Errechnete Verd nnungs Probe Verd nnung ER tration Konzentration bereinigte 96 Wiederfindung 1 5 1 10 1 20 1 40 1 80 Mittelwert gemessene Konzentration Errechnete Verd nnungs Konzentration bereinigte 96 Wiederfindung Probe Verd nnung 1 2 1 5 1 10 1 20 1 40 1 80 Mittelwert gemessene Konzentration ng ml Errechnete Verd nnungs Konzentration bereinigte 96 Wiederfindung Probe Verd nnung 1 5 1 10 3 1 20 1 40 1 80 44 K2378 E 23 0196 07DA FEHLERSUCHE Problem M gliche Ursachen Abhilfema nahme Ein Kalibrator 1 Es wurden ein oder mehrere 1 Test ung ltig Test wiederholen oder mehrere Reagenzien nicht au erhalb oder in der falschen Reihenfolge des hinzugef gt Messbereichs 2 Falsches Pipettieren 2 Test ung ltig Test wiederholen Kontroll 1 Falsche Temperatur
43. 10 minutos se a OD m xima exceder 3 0 a altas temperaturas ou se for utilizado um m todo automatizado Adic o da soluc o de paragem Adicionar 100 ul de soluc o de lavagem a cada poco Fazer a leitura da absorv ncia a 450 nm no prazo de 2 horas num leitor de micro placas Ler a 620 nm como comprimento de ondas de refer ncia C lculos Tracar uma curva de calibrac o projectando para tal a informac o de sa da OD contra os valores em ng ml dos seis calibradores Os seis calibradores fornecidos t m os valores 0 ng ml para o calibrador 1 36 ng ml para o calibrador 2 180 ng ml para o calibrador 3 540 para o calibrador 4 1080 ng ml para o calibrador 5 e 1800 ng ml para o calibrador 6 respectivamente Ler os valores dos controlos Baixo e Alto bem como as amostras do paciente a partir da curva 90 K2378 E 23 0196 07DA Os valores mais elevados do gue o valor do calibrador mais elevados devem ser registados como sendo gt 1080 ng ml ou devem ser mais dilu dos com diluente de ensaios e novamente analisados Neste caso a compensac o para a diluic o deve ser feita no c lculo da concentrac o de cromogranina A Atenc o ao facto de gue no caso dos valores do calibrador 1 ou do calibrador 6 se enguadrarem fora da amplitude a an lise deve ser considerada inv lida e deve ser repetida Por uma questao de conveni ncia as concentrac es podem ser calculadas em ng ml em nmol l ou em U L Todas as unidades s o apresentada
44. 2 CAL2 CAL6 P2 CAL3 H usw CAL3 H CAL4 L TOTMUOOU gt CAL4 L 60 Minuten inkubieren Nach der Probeninkubation Dreimal mit 300 ul Waschl sung Kavit t waschen daf r die Kavit ten jedes Mal f llen und dekantieren Nach dem letzten Waschen die Kavit ten durch Klopfen die Mikrotiterplatte auf saugf higen Zellstoff leeren Konjugat hinzuf gen In jede Kavit t 100 ul Konjugat pipettieren 30 Minuten inkubieren Nach Konjugatinkubation Wie oben beschrieben waschen Substratl sung hinzuf gen In jede Kavit t 100 ul Substrat TMB hinzuf gen und im Dunkeln 15 Minuten inkubieren Die Inkubationszeit kann auf 10 Minuten verk rzt werden wenn bei hohen Temperaturen die maximale OD 3 0 berschreitet oder bei Verwendung automatisierter Verfahren Stoppl sung hinzuf gen In jede Kavit t 100 ul Stoppl sung pipettieren Die Extinktion innerhalb von 2 Stunden bei 450 nm mit einem Leseger t f r Mikrotiterplatten ablesen Bei 620 nm als Referenzwellenl nge ablesen Berechnungen Zeichnen Sie eine Kalibrationskurve indem Sie die OD gegen die ng ml Werte der sechs Kalibratoren auftragen Die sechs mitgelieferten Kalibratoren haben folgende Werte 0 ng ml fur Kalibrator 1 36 ng ml f r Kalibrator 2 180 ng ml f r Kalibrator 3 540 ng ml f r Kalibrator 4 1080 ng ml f r Kalibrator 5 und 1800 ng ml f r Kalibrator 6 Lesen Sie die Werte der niedrigen und
45. 30 FTU nebyla zji t na dn interference Pacienti kter m byly z diagnostick ch i l ebn ch d vod pod ny my protil tky proti lidsk m protil tk m nebo pacienti kte se setkali s my m imunoglobulinem jinak mohou vytv et lidsk anti my protil tky HAMA Tyto protil tky mohou interferovat s testy pou vaj c mi my monoklon ln protil tky a mohou v st ke stanoven fale n zv en ch hladin O ek van v sledky Doporu uje se aby si ka d laborato stanovila vlastn referen n rozsah za pou it b n ch vzork proto e odchylky p i zpracov n vzork mohou ovlivnit v sledky Je nutn p esn dodr ovat postup manipulace se vzorky kter je doporu en v e N e uveden hodnoty p edstavuj o ek van referen n rozsah a byly vypo t ny jako 97 5 percentil ze 126 vzork heparinov plazmy od d rc krve 63 mu a 63 en Referen n rozsah hladiny chromograninu A v heparinov plazm lt 108 ng mL nebo 3 0 nmol L nebo 35 U L Mez detekce detekovatelnou koncentraci kter se s 95 pravd podobnost bude li it od nuly Znamen e a po tuto hodnotu jsou m en spolehliv a to i pro negativn vzorky V po et byl prov d n podle pokyn NCCLS v dokumentu EP17 A svazek 24 slo 34 Zv en hladin chromograninu A bez souvislosti s tumory Zv en hladiny chromograninu A Ize zjistit u pacient se sn enou funkc ledvin
46. 4 5 6 Valore medio ng mL 145 205 309 459 794 1165 SD 9 6 7 8 22 9 38 5 69 2 78 1 CV 7 4 7 8 9 7 55 K2378 E 23 0196 07DA Tabella 5 II recupero di diluizione stato calcolato testando cinque diluizioni seriali di tre campioni diversi Concentrazione Campione Diluizione misurata media Concentrazione Campione misurata media 2 Concentrazione Campione misurata media ng ml 3 56 Concentrazione calcolata ng ml Concentrazione calcolata ng ml Concentrazione calcolata ng ml di recupero di diluizione corretta di recupero di diluizione corretta di recupero di diluizione corretta K2378 E 23 0196 07DA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI Problema Possibili cause Azione correttiva Uno o piu Mancata aggiunta di uno o piu Test nullo Ripetere il test calibratori reagenti oppure aggiunta nella fuori limiti sequenza errata Pipettamento non corretto Test nullo Ripetere il test Valori di Temperatura tempistica o Controllare che tempo e temperatura controllo pipettamento non corretto siano corretti Vedere Scarsa fuori limiti reagenti non miscelati precisione sotto Ripetere il test Contaminazione incrociata dei Pipettare attentamente controlli Diluizione non corretta Ripetere il test Percorso ottico non pulito Controllare la presenza di sporcizia o bolle d aria nei pozzetti Pulire il fondo e ripetere la lettura Risultati dei
47. A nmol L Chromogranin A U L Pr bka z warto ci absorbancji 1 272 b dzie odczytywana na osi X jako maj ca 367 ng ml lub 10 2 nmol l lub 118 U I chromograniny A W tym przypadku zastosowano dopasowanie czteroparametrowej krzywej logistycznej Wa ne Krzywa stanowi przyk ad i nie nale y jej stosowa do interpretacji rzeczywistych pr bek pacjent w 78 K2378 E 23 0196 07DA Kontrola jako ci Warto OD dla kalibratora 1 powinna by lt 0 15 Warto OD dla kalibratora 6 powinna by gt 1 0 Warto ci kontroli niskiej i wysokiej patrz certyfikat serii Kontrole s przeznaczone do monitorowania znacznej wady odczynnika Je eli dowolne warto ci kontroli nie s w swych odpowiednich zakresach test nale y uzna za niewa ny i powt rzy go Zgodnie z wytycznymi lub wymogami przepis w lokalnych stanowych i lub federalnych lub organizacji akredytuj cych mo na zbada dodatkowe kontrole Wytyczne dotycz ce odpowiednich przepis w KJ patrz NCCLS C24 A Efekt wysokiej dawki Efektu wysokiej dawki nie obserwowano podczas badania st e chromograniny A maksymalnie do 360 000 ng ml lub 10 000 nmol l lub 116 000 UN OGRANICZENIA St enia chromograniny A danego pacjenta nie mo na stosowa jako miary ci ko ci choroby Nie mo na polega na te cie jako jedynej podstawie do decyzji odno nie terapii klinicznej nale y go stosowa w po czeniu z objawami klinicznymi i wynikami innych dost
48. During this first incubation a monoclonal antibody captures the chromogranin A to the surface of the well After washing to remove unbound material a second horseradish peroxidase HRP labelled monoclonal antibody is added to detect the chromogranin A bound to the well After incubation for 30 minutes the wells are washed again and a colour substrate is added and incubated The colour development is stopped after 15 minutes and the colour measured in a spectrophotometer The colour is directly proportional to the amount of chromogranin A bound to the well The amount of chromogranin is determined by comparison with the colour development of the calibrator samples The calibrator in the kit is a synthetic peptide corresponding to chromogranin A The peptide calibrator is set to give a response equal to a purified native fragment of chromogranin A Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 K2378 E 23 0196 07DA WARNINGS AND PRECAUTIONS For in vitro diagnostic use The assay reagents contain no human serum components but the patient plasmas analysed should be handled as if capable of transmitting infectious agents The Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health recommend that potentially infectious agents be handled at the Biosafety Level 2 Most of kit solutions contain ProClin 300 as a preservative Never pipette by mouth or allow reagents or patient sample to come into contact with skin Re
49. ENTO Todas as soluc es devem ser empregadas temperatura ambiente Incubar todas as etapas temperatura ambiente 20 a 30 C 89 K2378 E 23 0196 07DA Diluic o e incubac o das amostras Diluir todas as amostras 5 vezes numa placa de diluic o em separado antes de transferir para a placa da an lise Os calibradores controlo baixo controlo alto e plasma do paciente devem ser dilu dos a raz o de 50 ul de plasma para 200 ul de diluente Misturar muito bem pipetando para cima e para baixo antes de transferir 100 ul em duplicado para a placa da an lise conforme o diagrama apresentado a seguir 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CAL1 CAL5 P1 B CAL1 CAL5 P1 C CAL2 CAL6 P2 D CAL2 CAL6 P2 E CAL3 H Etc F CAL3 H G CAL4 L H CAL4 L Incubar durante 60 minutos Ap s a incubac o da amostra Lavar tr s 3 vezes com 300 ul de soluc o de lavagem por poco enchendo e esvaziando os pocos de cada vez Ap s a ltima lavagem esvaziar os pocos dando ligeiras pancadas com a placa em tecido absorvente Adic o de conjugado Adicionar 100 ul de conjugado a cada poco Incubar durante 30 minutos Ap s a incubac o do conjugado Lavar tal como indicado anteriormente Adic o da soluc o de substrato Adicionar 100 ul de substrato TMB a cada poco incubar em lugar escuro durante 15 minutos O tempo de incubac o pode ser diminu do para
50. Los dem s reactivos en el kit deben conservarse a 2 8 C Los calibradores y controles reconstituidos deben diluirse en diluyente 5x para cada prueba La cantidad de conjugado necesaria para cada an lisis debe diluirse 100x antes de usar 10 uL de conjugado 990 uL de tamp n de conjugado por tira Debe desecharse el conjugado diluido sobrante La soluci n de lavado debe diluirse 20x antes de su uso Diluya 10 ml de la soluci n de lavado concentrada 20x en 190 ml de agua destilada Cuando se conserva a 2 8 C la soluci n de lavado diluida es estable hasta la fecha de caducidad del kit El resto de los reactivos del kit est n listos para usarlos Extraiga s lo el n mero de pocillos necesarias para las pruebas volviendo a cerrar el paquete de aluminio cuidadosamente Materiales o equipo necesarios pero no suministrados Lector de microplacas con filtro de 450 nm Longitud de onda de referencia 620 nm Placa de diluci n de 300 ul pocillo para la diluci n del calibrador muestras del paciente y controles Pipetas de precisi n con puntas desechables Lavador autom tico de placas de microt tulos tejido absorbente tubos y un temporizador PROCEDIMIENTO Todas las soluciones deben usarse a temperatura ambiente Incube todos los pasos a temperatura ambiente 20 30 C 27 K2378 E 23 0196 07DA Diluci n e incubaci n de la muestra Diluya todas las muestras 5x en una placa de diluci n separada antes de transferirlas
51. O Instruction for Use CgAnalyze Kit Enzyme immunoassay for detection of chromogranin A Microtitration 96 wells Store the kit at 2 8 C For in vitro diagnostic use only CE Document No E 23 0196 07DA March 2014 CgAnalyze Kit English Frangais Espafiol Deutsch Italiano pagina Cesky strana Poski strona Portugu s pagina K2378 Y 96 K2378 E 23 0196 07DA CgAnalyze Kit ENGLISH INTENDED USE The CgAnalyze Kit is an enzyme linked immunosorbent assay ELISA for detection and quantitation of chromogranin A in human plasma or serum The results of the assay may be used as an aid in the diagnosis of chromogranin A secreting neuroendocrine tumours NETS such as phaeochromocytomas and carcinoids The assay is intended for use in patients with signs and symptoms consistent for NETS It is not intended for screening a healthy population The analysis should be performed by trained laboratory professionals FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE SUMMARY AND EXPLANATION Chromogranins and secretogranins constitute a family of uniguely acidic proteins that are co stored with neurotransmitters and peptide hormones in the brain and the diffuse neuroendocrine system Winkler H 8 Fischer Colbrie R 1992 Structurally these proteins are products of different genes but share some overall properties such as an abundance of acidic amino acid residues and several pairs of basic amino acids as potential positions for post
52. a nieprawdziwe wyniki SK ADNIKI ZESTAWU I PRZECHOWYWANIE ODCZYNNIK W Jedna ramka z 96 studzienkami szczelnie zamkni tymi w opakowaniu foliowym z pakietem osuszaj cym Sze fiolek z liofilizowanymi kalibratorami zawieraj cymi ludzk chromogranin A w rozcie czalniku CAL 1 0 ng ml rozcie czalnik CAL 2 36 ng ml CAL 3 180 ng ml CAL 4 540 ng ml CAL 5 1080 ng ml CAL 6 1800 ng ml Jedna fiolka z liofilizowana kontrol nisk L kolor zielony Jedna fiolka z liofilizowan kontrol wysok H kolor czerwony 30 ml rozcie czalnika DIL zawieraj cego znakowane biotyn przeciwcia a przeciwko chromograninie A kolor czerwony Gotowy do u ycia 150 ul koniugatu CONJ zawieraj cego znakowane HRP przeciwcia a przeciwko chromograninie A St one 100x 15 ml buforu koniugatu kolor niebieski Gotowy do u ycia 15 ml substratu TMB Gotowy do u ycia 15 ml roztworu zatrzymujacego 0 5M H SO4 Gotowy do u ycia 2 x 35 ml roztworu p ucz cego st one 20x Przed u yciem Liofilizowane kalibratory i kontrole powinny by ostro nie rozpuszczone w 300 ul wody destylowanej Rekonstytuowane kalibratory i kontrole powinny by po u yciu przechowywane w temperaturze 20 C lub ni szej Kalibratory i kontrole mog przechodzi trzy cykle zamra ania rozmra ania bez pogorszenia jako ci Inne odczynniki w zestawie powinny by przechowywane w temperaturze 2 8 C Rekonstytuowane k
53. a wszystkich sk adnik w niebezpiecznych zawartych w tym zestawie s dost pne na danie w firmie Dako Denmark A S Ostrze enie Zawiera ProClin 300 Masa reakcyjna 5 chloro 2 metylo 4 izotiazolino 3 onu nr WE 247 500 7 i 2 metylo 4 izotiazolino 3 onu nr WE 220 239 6 3 1 H317 Mo e powodowa reakcj alergiczn sk ry P264 Dok adnie umy r ce po u yciu P280 Stosowa r kawice ochronne odzie ochronn ochron oczu ochrone twarzy P302 352 W PRZYPADKU DOSTANIA SI NA SK R Umy du ilo ci wody z myd em P333 313 W przypadku wyst pienia podra nienia sk ry lub wysypki Zasi gn porady zg osi si pod opiek lekarza POBIERANIE PR BKI Zestaw CgAnalyze jest zalecany do pr bek surowicy osocza pobieranego na EDTA heparyne Traktowa jako zdolne do przenoszenia czynnik w zaka nych Pr bki s rozdzielane przez wirowanie i mog by przechowywane w temperaturze 2 8 C przez maksymalnie 7 dni Je eli pr bki b d przechowywane przez d u szy czas nale y je przechowywa w temperaturze 20 C lub ni szej Pr bki mog przechodzi trzy cykle zamra ania rozmra ania bez pogorszenia jako ci Nie nale y u ywa zamra arki bezszronowej poniewa mo e ona poddawa pr bki cyklom zamra ania rozmra ania niszcz c przeciwcia a Pr bki kt re s nieprawid owo 75 K2378 E 23 0196 07DA przechowywane lub s poddawane wielu cyklom zamra ania rozmra ania mog daw
54. agents containing ProClin 300 may be irritating Avoid contact with skin and eyes In case of contact flush with plenty of water The stop solution contains 0 5 M sulphuric acid Do not allow the reagent to get into contact with the skin The concentrations of chromogranin A in a given specimen determined with assays from different manufacturers can vary due to differences in assay methods and reagent specificity All the waste should be handled as hazardous wastes Material safety data sheets for all hazardous components contained in this kit are available on reguest from Dako Denmark A S IL CONJ 100X Warning Contains ProClin 300 Reaction mass of 5 chloro 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 247 500 7 and 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 220 239 6 3 1 H317 May cause an allergic skin reaction P264 Wash hands thoroughly after handling P280 Wear protective gloves protective clothing eye protection face protection P302 352 IF ON SKIN Wash with plenty of soap and water P333 313 If skin irritation or rash occurs Get medical advice attention SPECIMEN COLLECTION The CgAnalyze Kit is recommended for serum EDTA Heparin plasma Handle as if capable of transmitting infectious agents The samples are separated by centrifugation and can be stored at 2 8 C up to 7 days If samples are to be kept for longer periods store at 20 C or colder Samples may go through three freeze thaw cycles without deterior
55. alibratory i kontrole powinny by przed ka dym badaniem rozcie czane 5x Ilo koniugatu potrzebnego do ka dej analizy powinna by przed u yciem rozcie czona 100x 10 ul koniugatu 990 ul buforu koniugatu na pasek Pozosta y bufor nale y odrzuci Roztw r p ucz cy powinien by przed u yciem rozcie czony 20x Rozcie czy 10 ml st onego 20x roztworu p ucz cego w 190 ml wody destylowanej W przypadku przechowywania w temperaturze 2 8 C rozcie czony roztw r pluczacy jest stabilny do up ywu daty wa no ci zestawu Pozosta e odczynniki w zestawie s gotowe do u ycia Wyj tylko liczb studzienek potrzebn do badania i ostro nie ponownie zamkn aluminiowe opakowanie Materia y lub sprz t wymagany ale niedostarczony Czytnik mikrop ytek z filtrem 450 nm Referencyjna d ugo fali to 620 nm 300 ul studzienke p ytki rozcie cze w celu rozcie czania kalibratora pr bek pacjenta i kontroli Precyzyjne pipety z ko c wkami jednorazowymi Automatyczna p uczka do p ytki do mikromiareczkowania chusteczki poch aniaj ce prob wki i stoper PROCEDURA Wszystkie roztwory powinny by stosowane w temperaturze pokojowej Inkubowac wszystkie etapy w temperaturze pokojowej 20 30 C Rozcie czanie i inkubacja pr bek Przed przeniesieniem na p ytk testow rozcie czy wszystkie pr bki 5x w oddzielnej p ytce do rozcie cze Kalibratory kontrol nisk kontrol wysok i osocze pacj
56. alo de confianza IC del 95 se calcul usando el m todo exacto Tabla 2 La precisi n entre ensayos se determin estudiando seis pruebas diferentes en ocho r plicas en tres ocasiones distintas 1 2 3 4 5 6 Valor medio ng mL 150 209 316 486 838 1212 DE 14 0 10 8 28 3 41 7 80 6 69 8 CV 9 5 9 9 10 6 Tabla 3 La precisi n entre ensayos se determin estudiando seis pruebas diferentes en ocho r plicas en una ocasi n 1 2 3 4 5 6 Valor medio ng mL 156 214 335 502 868 1255 DE 6 4 11 3 10 4 23 3 42 8 101 4 CV 4 5 3 5 5 8 31 K2378 E 23 0196 07DA Tabla 4 La variaci n entre lotes se determin estudiando seis muestras distintas en ocho r plicas en tres lotes diferentes 1 2 3 4 5 6 Valor medio ng mL 145 205 309 459 794 1165 DE 9 6 7 8 22 9 38 5 69 2 78 1 CV 7 4 7 8 9 7 Tabla 5 La recuperaci n de diluci n se determin estudiando cinco diluciones seriadas para tres muestras diferentes de recuperaci n corregida por diluci n Concentraci n Concentraci n media medida calculada ng mL de recuperaci n corregida por diluci n Concentraci n A Concentraci n media medida calculada ng mL 96 de recuperaci n corregida por diluci n Concentraci n Concentraci n media medida calculada ng mL 32 K2378 E 23 0196 07DA SOLUCI N DE PROBLEMAS
57. aque rev tue DIL Diluant o o z c Tampon conjugu CONJ 100X Conjugu de HRP concentr 100x 3 i gt o I N x 0 Tampon de lavage concentr 20x U Solution de TMB substrat Acide sulfurique 0 5 M solution d arr t O d n r lt o Calibrateur lyophilis CONTROL LYO T moin bas lyophilis CONTROL H LYO T moin haut lyophilis 23 K2378 E 23 0196 07DA O Num ro de lot Num ro de catalogue Date de p remption so po A o Seuils de temp ratures Risque biologique ej Lire le mode d emploi lt U Dispositif m dical de diagnostic in vitro Fabricant Attention o JE Contenu suffisant pour 96 tests M TX Conform ment a la directive europ enne 98 79 CE relative aux dispositifs m dicaux de diagnostic in vitro 24 K2378 E 23 0196 07DA Cg Analyze Kit ESPA OL USO PREVISTO El Kit CgAnalyze es un ensayo inmunoabsorbente vinculado con enzimas ELISA para la detecci n y cuantificaci n de la cromogranina A en el plasma o suero humano Los resultados del ensayo pueden usarse como ayuda para el diagn stico de tumores neuroendocrinos TNE que segregan cromogranina A como feocromocitomas y carcinoides El ensayo est pensado para su uso en pacientes con indicios y s ntomas que coincidan con TNE No est
58. ation Do not use a frost free freezer because it may allow the specimens to go through freeze thaw cycles and degrade antibody Samples that are improperly stored or are subjected to multiple freeze thaw cycles may yield spurious results KIT COMPONENTS AND STORAGE OF REAGENTS One frame with 96 wells sealed in a foil pack with a dry pack Six vials with lyophilised calibrators containing human Chromogranin A in diluent CAL 1 0 ng mL diluent CAL 2 36 ng mL CAL 3 180 ng mL CAL 4 540 ng mL CAL 5 1080 ng mL CAL 6 1800 ng mL One vial with lyophilised Low control L green colour One vial with lyophilised High control H red colour 30 mL Diluent DIL containing biotin labelled antibodies to Chromogranin A red colour Ready to use 150 uL Conjugate CONJ containing HRP labelled antibodies to Chromogranin A 100x concentrated K2378 E 23 0196 07DA 15 mL Conjugate buffer blue colour Ready to use 15 mL Substrate TMB Ready to use 15 mL Stop solution 0 5M H2SO4 Ready to use 2x 35 mL Wash solution 20x concentrated Before use Lyophilised calibrators and controls should be carefully dissolved with 300 uL distilled water After use the reconstituted calibrators and controls should be stored at 20 C or lower Calibrators and controls may go through three freeze thaw cycles without deterioration Other reagents in the kit should be stored at 2 8 C Reconstituted calibrators and
59. bation 1 Reduce the incubation time for is elevated temperatures use of automated substrate exceeds 3 0 method Poor 1 Pipette delivery CV 1 Check calibration of pipette precision higher than 5 Use reproducible technique 2 Sample or reagents not mixed 2 Mix all reagents gently but thoroughly sufficiently or not equilibrated and equilibrate to room temperature to room temperature 3 Reagent addition taking too long 3 Develop consistent uniform technique inconsistency in timing intervals and use multi tip device or auto dispenser to decrease time 4 Optical pathway not clean 4 Check for air bubbles in the wells Wipe bottom of the plate and reread 5 Washing not consistent trapped 5 Check that all wells are filled and bubbles wash solution left aspirated uniformly Dispense liquid in the wells above level of reagent in well After the last wash empty the wells by tapping the plate on an absorbent tissue 6 Improper pipetting 6 Avoid air bubbles in pipette tips K2378 E 23 0196 07DA REFERENCES 1 Bajetta E Ferrari L Martinetti A Celio L Procopio G Artale S Zilembo N Di Bartolomeo M Seregni E and Bombardieri E Chromogranin A neuron specific enolase carcinoembryonic antigen and hydroxyindole acetic acid evaluation in patient with neuroendocrine tumours Cancer 1999 86 858 865 Eriksson B berg K and Stridsberg M Tumour markers in neuroendocrine
60. beiten 2 Serum oder Reagenzien nicht 2 Alle Reagenzien sanft aber gr ndlich ausreichend gemischt oder nicht mischen auf Raumtemperatur und auf Raumtemperatur bringen 3 Hinzugeben des Reagenzes 3 Eine einheitliche Technik erstellen dauert zu lange und Multipette oder Auto Zeitintervalle nicht einheitlich dispenser verwenden um Zeit zu sparen 4 Strahlengang nicht sauber 4 Kavit ten auf Luftblasen berpr fen Unterseite der Platte abwischen und erneut ablesen 45 K2378 E 23 0196 07DA 5 Uneinheitliches Waschen 5 berpr fen ob alle Kavit ten eingeschlossene gleichm Big gef llt und Luftblasen Waschl sung in abgesaugt werden Fl ssigkeit Kavit ten in den Kavit ten ber Reagenzienspiegel abgeben Nach dem letzen Waschen die Kavit ten auf saugf higes Papier gut abklopfen 6 Falsches Pipettieren 6 Luftblasen in der Pipettenspitze vermeiden LITERATUR 1 Bajetta E Ferrari L Martinetti A Celio L Procopio G Artale S Zilembo N Di Bartolomeo M Seregni E and Bombardieri E Chromogranin A neuron specific enolase carcinoembryonic antigen and hydroxyindole acetic acid evaluation in patient with neuroendocrine tumours Cancer 1999 86 858 865 2 Eriksson B Oberg K and Stridsberg M Tumour markers in neuroendocrine tumours Digestion 2000 62 33 38 3 O Connor D T and Deftos L J Secretion of chromogranin A by peptide producing endocrine
61. bejmuje to tak e r ne zespo y guz w neuroendokrynnych czyli guzy gastrynowe insulinomy glukagonomy i somatostatynomy objawowe wyspiaki wydzielaj ce polipeptyd trzustkowy i inne niefunkcjonalne guzy neuroendokrynne Eriksson B et al 2000 W przypadku tych guz w wykazano e chromogranina A jest najlepszym markerem kr eniowym Bajetta E et al 1999 Zasada zestawu CgAnalyze Na oddzielnych p ytkach rozcie cze pr bki pacjenta kalibratory i kontrole s rozcie czane 5x w rozcie czalniku Rozcie czony materia jest przenoszony na studzienki do mikromiareczkowania i inkubowany przez 60 minut w temperaturze pokojowej Podczas tej pierwszej inkubacji przeciwcia o monoklonalne wychwytuje na powierzchni studzienki chromogranin A Po przemywaniu w celu usuni cia niezwi zanego materia u dodawane jest drugie przeciwcia o znakowane peroksydaz chrzanow ang horseradish peroxidase HRP w celu wykrywania chromograniny A zwi zanej do studzienki Po inkubacji przez 30 minut studzienki s ponownie przemywane dodawany jest substrat barwny i nast puje inkubacja Po 15 minutach reakcja barwna jest zatrzymywana i barwa jest oznaczana w spektrofotometrze Barwa jest wprost proporcjonalna do ilo ci chromograniny A zwi zanej do studzienki Ilo chromograniny A jest oznaczana przez por wnanie z barw w pr bkach kalibratora 74 K2378 E 23 0196 07DA Kalibrator w zestawie to peptyd syntetyczny bedacy odpowiednikiem ch
62. bilida p e total gt 3 0 nmol l lt 3 0 nmol l de ECL 4 3 1 75 EPT 30 19 11 63 FGC 10 7 3 70 LC 9 4 5 44 MGC 47 28 19 60 NE Diff 6 2 4 33 Paraganglioma 1 1 0 100 ECL Tumores do tipo enterocromafina EPT Tumor pancre tico end crino FGC Carcin ide do intestino anterior LC Garcin ide pulmonar MGC Carcindide do intestino m dio NE Diff Diferencia o neur crina Especificidade Analisaram se 126 amostras de plasma heparina de doadores de sangue aparentemente saud veis e 126 das amostras deram resultados negativos 126 126 100 95 CI 97 1 100 O intervalo de confianga IC de 95 foi calculado por meio do m todo exacto Quadro 2 A precisao entre an lises foi determinada por meio de an lises feitas a seis amostras diferentes em oito r plicas e em tres ocasi es diferentes 1 2 3 4 5 6 Valor m dio ng ml 150 209 316 486 838 1212 SD 14 0 10 8 28 3 41 7 80 6 69 8 CV 9 5 9 9 10 6 Quadro 3 A precis o em cada an lise foi determinada por meio de an lises feitas a seis amostras diferentes em oito r plicas e uma ocasiao 1 2 3 4 5 6 Valor m dio ng ml 156 214 335 502 868 1255 SD 6 4 11 3 10 4 23 3 42 8 101 4 CV 4 5 3 3 5 8 93 K2378 E 23 0196 07DA Quadro 4 A variac o de lote para lote foi determinada por meio de an lises feitas a seis amostras diferentes em tr s lotes diferentes 1 2 3 4 5 6 Valor m di
63. calibrage 13 K2378 E 23 0196 07DA Le calibrateur du kit est un peptide synth tigue correspondant a la chromogranine A Le calibrateur peptide est concu pour donner une r ponse gale a celle d un fragment natif purifi de chromogranine A Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 Mises en garde et pr cautions d emploi A utiliser en diagnostic in vitro Les r actifs du dosage ne contiennent pas d l ments de s rum humain mais lors de la manipulation des plasmas de patient analys s il sera n cessaire de consid rer ces derniers comme potentiellement susceptibles de transmettre des agents infectieux Les centres de contr le et pr vention des pathologies et les instituts nationaux concern s par les affaires de sant conseillent de manipuler les agents potentiellement infectieux selon le niveau 2 de bios curit La plupart des solutions du kit contiennent l agent de conservation ProClin 300 Ne jamais pipeter a la bouche ou laisser des r actifs ou chantillons de patients entrer en contact avec la peau Les r actifs contenant de la ProClin 300 sont potentiellement irritants Eviter tout contact avec la peau et les yeux En cas de contact rincer abondamment a l eau La solution d arr t contient de l acide sulfurique 0 5 M Ne pas laisser le r actif entrer en contact avec la peau Les concentrations de chromogranine A d un sp cimen donn d termin es par dosages en provenance de fabricants diff
64. centrations peuvent tre calcul es en ng ml nmol l ou U L Toutes les unit s figurent dans le tableau ci dessous Le poids mol culaire du fragment natif de chromogranine A 36kDa a t utilis pour la conversion Stridsberg M et al 1993 Stridsberg M et al 1995 Exemple 3 000 Calibrateur Conc nrailon Absorbance 5 sona ng mL nmol L U L A 1 0 0 0 0 094 o 2 36 1 12 0 209 i 3 180 5 58 0 678 RE 4 540 15 174 1 599 01 5 s o E 5 1080 30 348 2 259 GD B i 6 1800 50 581 2 735 Chromogranin A ng ml Chromogranin A nmol L Chromogranin A U L Un chantillon ayant une valeur d absorbance de 1 272 appara tra sur l abscisse comme ayant 367 ng ml ou 10 2 nmol L ou 118 U L de chromogranine A Dans cet exemple un ajustement de courbe logistique 4 param tres a t appliqu Important Cette courbe est pr sent e titre d exemple et ne doit pas tre utilis e pour l interpr tation des vrais chantillons de patients Contr le qualit La DO du calibrateur 1 doit tre 0 15 La DO du calibrateur 6 doit tre 21 0 Voit le certificat de lot pour ce qui concerne les valeurs du t moin haut et du t moin bas Les t moins sont destin s surveiller les risques de d faillance importante des r actifs Si l une quelconque des valeurs t moins ne se trouve pas dans sa plage respective le test devra tre consid r comme non valable et devra tre recommenc
65. co stock es avec les neurotransmetteurs et les hormones peptidigues dans le cerveau et le syst me neuroendocrinien diffus Winkler H 8 Fischer Colbrie R 1992 D un point de vue structurel ces prot ines sont les produits de diff rents g nes mais elles disposent de certaines propri t s globales communes telles gu une abondance de r sidus d acides amin s et plusieurs paires d acides amin s de base servant de positions potentielles pour le clivage post translationnel Les chromogranines sont co stock es et co lib r es avec les neuropeptides et les hormones des cellules endocrines dans l ensemble de l organisme L un des r les des chromogranines peut r sider dans la production de granules hormonaux et il a t question d empaquetage d hormones Qui plus est les chromogranines peuvent tre cliv es en fragments de taille inf rieure susceptibles de pr senter des activit s biologigues telle que l inhibition de la lib ration hormonale la vasodilatation et des effets anti microbiologigues Stridsberg M 2000 Les tumeurs d origine endocrinienne saccompagnent g n ralement de niveaux de chromogranine A lev s dans le s rum et le plasma O Connor DT Deftos LJ 1986 Les tumeurs neuroendocrines sont d riv es des cellules neuroendocrines et les tumeurs neuroendocrines typiques sont les carcinoides les ph ochromocytomes les neuroblastomes les cancers bronchiques a petites cellules les ad nomes parathyroidiens les tumeurs
66. corps monoclonaux de souris et de fausser les niveaux a la hausse R sultats pr vus Il est conseill a chaque laboratoire d tablir sa propre plage de r f rence avec des chantillons commun ment utilis s tant donn que les variations de manipulation sont susceptibles d influer sur les r sultats De strictes pratigues routini res de manipulation d chantillons devront tre observ es conform ment aux recommandations ci dessus Les valeurs indiqu es ci dessous donnent une indication de la plage de r f rence pr vue et sont calcul es pour correspondre au percentile 97 5 de 126 chantillons de donneurs de sang 63 hommes et 63 femmes Niveau de plage de r f rence de la chromogranine A lt 108 ng mL ou 3 0 nmol ou 35 U L Limite de d tection La limite de d tection de ce dosage est de 0 19 ng ml ou 0 54 nmol L ou 6 U L II s agit de la concentration d tectable la plus basse sup rieure z ro avec une probabilit de 95 Cela signifie que des analyses peuvent tre fiablement r alis es jusqu a ce minimum meme sur des chantillons n gatifs Le calcul a t effectu conform ment a la directive NCCLS EP17 A vol 24 n 34 Hausses de la chromogranine A non associ es a une tumeur Des hausses des niveaux de chromogranine A peuvent tre not es chez des patients a la fonction r nale d ficiente les patients atteints de gastrite atrophique et les patients suivant un traitement continu de m dicaments
67. e Pheochromozytome Neuroblastome kleinzellige Lungenkarzinome Parathyroidadenome Hypophysentumor Prostatakarzinome und Inselzelltumore des Pankreas sowie das MEN1 und MEN2 Syndrom Hierzu geh ren ebenfalls die verschiedenen neuroendokrinen Tumorsyndrome wie die Gastrinome Insulinome Glucagonome Somatostatinome PPome und die nicht funktionellen neuroendokrinen Tumore Eriksson B u a 2000 Chromogranin A hat sich f r diese Tumore als der beste im Blut zirkulierende Marker erwiesen Bajetta E u a 1999 Prinzip des CgAnalyze Kit In einer separaten Verd nnungsplatte werden Patientenproben Kalibratoren und Kontrollen 5fach mit Verdiinnungspuffer verd nnt Das verd nnte Material wird dann in den Mikrotiterplatten bertragen und bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubiert Bei dieser ersten Inkubation bindet ein monoklonaler Antik rper das Chromogranin A an die Kavitatenoberfliche Nach einem Waschschritt zum Entfernen nicht gebundenen Materials wird ein zweiter mit Meerrettichperoxidase markierter monoklonaler Antik rper hinzugef gt der das in der Kavit t gebundene Chromogranin A detektiert Nach einer Inkubation von 30 Minuten werden die Kavit ten noch einmal gewaschen ein Farbsubstrat hinzugef gt und inkubiert Die Farbentwicklung wird nach 15 Minuten gestoppt und die Farbintensit t in einem Spektralfotometer gemessen Die Farbintensit t ist direkt proportional zu der Menge in der Kavit t gebundenen Chromogranin A Quantifi
68. e diferentes fabricantes podem variar devido as diferencas entre m todos de an lise e a especificidade dos reagentes Todos os residuos devem ser manuseados como se fossem residuos perigosos As fichas dos dados de seguranca do material relativas a todos os componentes perigosos incluidos neste kit est o disponiveis sob pedido junto da Dako Denmark A S Atenc o Cont m ProClin 300 A reacc o de massa 5 chloro 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 247 500 7 and 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 220 239 6 3 1 H317 Pode provocar uma reacc o al rgica cut nea P264 Lavar as m os cuidadosamente ap s manuseamento P280 Usar luvas de protecc o vestu rio de protecc o protecc o ocular protecc o facial P302 352 SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE lavar com sabonete e gua abundantes P333 313 Em caso de irritac o ou erupgao cut nea consulte um m dico RECOLHA DA AMOSTRA Recomenda se o CgAnalyze Kit para soro EDTA plasma heparina Manusear como se tivesse a capacidade de transmitir agentes infecciosos Evitar utilizar amostras que sejam ict ricas lip micas ou hemolizadas As amostras s o separadas por centrifugac o e podem ser armazenadas a 2 8 C durante um m ximo de 7 dias Se for necess rio armazenar as amostras durante per odos mais longos armazenar a 20 C ou menos As amostras podem passar por 3 ciclos de congelamento descongelamento sem se deteriorarem 88 K2378 E 23 0196 07DA N
69. e di cromogranina A Si osservi che qualora il calibratore 1 o il calibratore 6 risulti fuori dai limiti il test essere considerato nullo e quindi ripetuto 52 K2378 E 23 0196 07DA Per praticita le concentrazioni possono essere calcolate in ng ml nmol l o U L Tutto le unita sono riportate nella tabella qui di seguito Per la conversione stato utilizzato il peso molecolare del frammento originale di cromogranina A 36kDa Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 Esempio 3 000 E Calibratore Concentrazione Ass rbanza 2500 ng ml nmol l U L ER 1 0 0 0 0 094 EM 2 36 1 12 0 209 Haus 3 180 5 58 0 678 0 500 4 540 15 174 1 999 S 0 36 180 540 1080 1800 5 1080 30 348 2 259 oi s va 248 sel 6 1800 50 581 2 735 Chromogranin A ng mL Chromogranin A nmol L Chromogranin A U L Un campione con un valore di assorbanza di 1 272 sara letto sull asse X come avente 367 ng mL o 10 2 nmol L o 118 U L di cromogranina A In quest esempio stato applicato uno schema con curva logistica a 4 parametri Importante la curva illustrata a titolo esemplificativo e non deve essere usata per la reale interpretazione dei campioni del paziente Controllo qualit La DO per il calibratore 1 deve essere 0 15 La DO per il calibratore 6 deve essere 1 0 Per i valori dei comandi alti e bassi vedere la certificazione del lotto Scopo dei controlli monitorar
70. e handling may affect results A strict sample handling routine as recommended above should be followed The values given below are an indication of the expected reference range and calculated as the 97 5 percentile of 126 blood donor heparin plasma samples 63 men and 63 women Reference range Heparin plasma level of chromogranin A lt 108 ng mL or 3 0 nmol L or 35 U L Limit of Detection The limit of detection of this assay is 19 ng mL or 0 54 nmol L or 6 U L This is the lowest detectable concentration that differs from zero with a probability of 95 It means that reliable measurements can be done even on negative samples down to this point The calculation was done according to NCCLS guideline EP17 A vol 24 no 34 Non tumour associated increases of chromogranin A Increased levels of chromogranin A can be found in patients with decreased renal function patients with atrophic gastritis and patients with ongoing treatments with proton pump inhibitory drugs K2378 E 23 0196 07DA PERFORMANCE CHARACTERISTICS Table 1 Clinical sensitivity and specificity Clinical sensitivity A total of 107 Heparin plasma samples with clinical characterisation were assayed The following table summarises the results Disease groups Total OSC Negative Sensitivity number gt 3 0 nmol L lt 3 0 nmol L ECL 4 3 1 75 EPT 30 19 11 63 FGC 10 7 3 70 LC 9 4 5 44 MGC 47 28 19 60 NE Diff 6 2 4 33 Paragangliom 1
71. e il danno sostanziale del reagente Se un valore qualsiasi dei controlli non si trova nei rispettivi limiti il test deve essere considerato nullo e quindi ripetuto I controlli supplementari si possono testare secondo le linee guida o i requisiti delle disposizioni locali statali e o federali o di organismi accreditanti Per le linee guida sulle corrette pratiche di CQ fare riferimento a NCCLS C24 A Effetto gancio Non stato riscontrato alcun effetto gancio durante i test su concentrazione di cromogranina A fino a 360 000 ng mL o 10 000 nmol L o 116 000 U L LIMITAZIONI Il solo livello di cromogranina A del singolo paziente non pu essere utilizzato per valutare la gravit della malattia Il test non deve essere considerato l unico fondamento per prendere decisioni sulla terapia clinica ma usato in combinazione con i sintomi clinici e i risultati di altri test disponibili Interferenza Non stata rilevata alcuna interferenza quando i campioni di plasma sono stati combinati con bilirubina F 208 mg l bilirubina C 200 mg l emoglobina emolitica 4 84 g l o chilo 1430 FTU pazienti che ricevono anticorpi antiumani a scopo di trattamento o diagnosi oppure i pazienti altrimenti esposti a immunoglobulina del topo possono produrre anticorpi umani antitopo HAMA che possono interferire con i dosaggi quando si utilizzano anticorpi monoclonali del topo e provocare falsi livelli elevati 53 K2378 E 23 0196 07DA Risultat
72. e svuotando ogni volta i pozzetti Dopo l ultimo lavaggio svuotare i pozzetti picchiettando la piastra su un tessuto assorbente Aggiunta del coniugato Aggiungere 100 uL di coniugato in ciascun pozzetto Incubare per 30 minuti Dopo l incubazione del coniugato Lavare come sopra Aggiunta della soluzione di substrato Aggiungere 100 uL di substrato TMB in ciascun pozzetto incubare al buio per 15 minuti Il tempo di incubazione pu essere ridotto a 10 minuti se la DO massima supera il 3 0 ad alte temperature o in caso di utilizzo di un metodo automatizzato Aggiunta della soluzione di arresto Aggiungere 100 uL di soluzione di arresto in ciascun pozzetto Leggere l assorbanza a 450 nm in 2 ore su un lettore per micropiastra Leggere a 620 nm come lunghezza d onda di riferimento Calcoli Costruire una curva del calibratore tracciando le DO rispetto ai valori ng mL dei sei calibratori sei calibratori forniti hanno rispettivamente valori pari a 0 ng mL per il calibratore 1 36 ng mL per il calibratore 2 180 ng mL per il calibratore 3 540 ng mL per il calibratore 4 1080 ng mL per il calibratore 5 1800 ng mL per il calibratore 6 Leggere i valori dei comandi alti e bassi e i campioni del paziente dalla curva valori superiori al valore massimo del calibratore dovranno essere registrati come gt 1800 ng mL o ulteriormente diluiti con diluente e ridosati In questo caso il diluente deve essere compensato nel calcolo della concentrazion
73. el anticuerpo Las muestras que se conserven inadecuadamente o se sometan a m ltiples ciclos de congelaci n descongelaci n pueden dar resultados falsos 26 K2378 E 23 0196 07DA COMPONENTES DEL KIT Y CONSERVACI N DE LOS REACTIVOS Un marco con 96 pocillos sellado en un paguete de l mina de aluminio con un paguete seco Seis viales con calibradores liofilizados gue contienen cromogranina A humana en diluyente CAL 1 0 ng mL diluyente CAL 2 36 ng mL CAL 3 180 ng mL CAL 4 540 ng mL CAL 5 1080 ng mL CAL 6 1800 ng mL Un vial con control bajo L liofilizado color verde Un vial con control alto H liofilizado color rojo 30 ml de diluyente DIL que contiene anticuerpos marcados con biotina de la cromogranina A color rojo Listo para usar 150 ul de conjugado CONJ que contiene anticuerpos marcados con HRP de la cromogranina A Concentraci n 100x 15 ml de tamp n de conjugado color azul Listo para usar 15 ml de sustrato TMB Listo para usar 15 ml de soluci n de parada 0 5 M H2SO Listo para usar 2x 35 ml de soluci n de lavado concentrada 20x Antes de su uso Los controles y calibradores liofilizados deben disolverse cuidadosamente con 300 ul de agua destilada Despu s de su uso los controles y calibradores reconstituidos deben conservarse a 20 C o menos Los calibradores y controles pueden someterse a tres ciclos de congelaci n descongelaci n sin deteriorarse
74. en biotinem erven barva P ipraveno k okam it mu pou it 150 uL konjug t Conjugate CONJ obsahuj c protil tky proti chromograninu A zna en HRP 100x koncentrovan 15 mL konjug tov pufr Conjugate buffer modr barva P ipraveno k okam it mu pou it 15 mL substr t TMB P ipraveno k okam it mu pou it 15 mL zastavovac roztok 0 5M H2SO4 P ipraveno k okam it mu pou it 2x 35 mL prom vac roztok 20x koncentrovan P ed pou it m Lyofilizovan kalibratory a kontroly se opatrn rozpust ve 300 uL destilovan vody Po pou it je t eba rekonstituovan kalibratory a kontroly skladovat p i teplot 20 C nebo ni Kalibr tory a kontroly mohou b t t ikr t zmrazeny a rozmrazeny ani by do lo ke zhor en jejich kvality Ostatn reagencie v souprav je t eba skladovat p i teplot 2 8 C P i ka d m proveden testu je t eba rekonstituovan kalibr tory a kontroly 5x z edit edic m roztokem Mno stv konjug tu pot ebn pro ka dou anal zu je t eba p ed pou it m 100x z edit 10 uL konjug tu 990 uL konjug tov ho pufru na jeden strip Zb vaj c z ed n konjug t je t eba zlikvidovat Prom vac roztok je t eba p ed pou it m 20x z edit Z e te 10 mL 20x koncentrovan ho prom vac ho roztoku 190 mL destilovan vody P i uchov v n p i teplot 2 8 C je z ed n prom vac roztok stabiln a do data exspirace s
75. ended to monitor for substantial reagent failure If any of the control values are not within their respective ranges the test should be considered invalid and should be repeated Additional controls may be tested according to guidelines or requirements of local state and or federal regulations or accrediting organisations Refer to NCCLS C24 A for guidance on appropriate QC practices Hook effect No hook effect is observed when testing chromogranin A concentrations up to 360 000 ng mL or 10 000 nmol L or 116 000 U L LIMITATIONS The individual patient s chromogranin A level cannot alone be used as a measure of disease severity The test should not be relied upon as the sole basis of decisions on clinical therapy but should be used in combination with clinical symptoms and the results of other available tests Interference No interference was detected when plasma samples were spiked with bilirubin F 208 mg L bilirubin C 200 mg L haemolytic haemoglobin 4 84 g L or chyle 1430 FTU Individuals receiving mouse anti human antibodies for treatment or diagnosis or those patients who have been otherwise exposed to mouse immunoglobulin may produce human anti mouse antibodies HAMA These antibodies can interfere with assays using mouse monoclonal antibodies and may cause falsely elevated levels Expected results It is recommended that each laboratory establishes a reference range with samples commonly used since variations in sampl
76. enfunktion atropher Gastritis und bei Patienten die mit Protonenpumpenhemmer therapiert werden auftreten LEISTUNGSEIGENSCHAFTEN Tabelle 1 Klinische Sensitivit t und Spezifit t Klinische Sensitivit t Es wurden insgesamt 107 Heparinplasmaproben mit klinischen Eigenschaften getestet Die folgende Tabelle fasst die Ergebnisse zusammen Gesamt Positiv Negativ RE Krankheitsgruppen menge gt 3 0 nmol l lt 3 0 nmol l LR ECL 4 3 1 75 EPT 30 19 11 63 FGC 10 7 3 70 LC 9 4 5 44 MGC 47 28 19 60 NE Diff 6 2 4 33 Paragangliom 1 1 0 100 ECL Enterochromaffin like Zell Tumore EPT Endokriner Pankreastumor FGC Forgut Karzinoid LC Lungenkarzinoid MGC Midgut Karzinoid NE Diff Neurokrine Differenzierung 42 K2378 E 23 0196 07DA Spezifitat 126 Heparinplasmaproben von anscheinend gesunden Blutspendern wurden getestet 126 Proben waren negativ 126 126 100 95 CI 97 1 100 Der 95 Vertrauensbereich Cl wurde mit der exakten Methode errechnet Tabelle 2 Inter Assay Prazision wurde durch Testen sechs verschiedener Proben in achtfachem Ansatz in drei verschiedenen Testl ufen bestimmt 1 2 3 4 5 6 Mittelwert ng ml 150 209 316 486 838 1212 SA 14 0 10 8 28 3 41 7 80 6 69 8 VK 9 5 9 9 10 6 Tabelle 3 Intra Assay Prazision wurde durch Testen sechs verschiedener Proben in achtfachem Ansatz in einem Testdurchlauf bestimmt
77. enta nale y 76 K2378 E 23 0196 07DA rozcie czy za pomoc 50 ul osocza 200 pl rozcie czalnika Dok adnie wymiesza pipetuj c do g ry i w d przed przeniesieniem 100 ul w powt rzeniu na p ytk testow zgodnie ze schematem poni ej 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CAL1 CAL5 P1 B CAL1 CAL5 P1 C CAL2 CAL6 P2 D CAL2 CAL6 P2 E CAL3 H itd F CAL3 H G CAL4 L H CAL4 L Inkubowa przez 60 minut Po inkubacji pr bki P uka trzy 3 razy za pomoc 300 pl roztworu ptuczacego studzienke za ka dym razem nape niaj c i opr niaj c studzienki Po ostatnim p ukaniu opr ni studzienki stukaj c p ytk do mikromiareczkowania w chusteczk pochtaniajaca Dodawanie koniugatu Do ka dej prob wki doda 100 ul koniugatu Inkubowa przez 30 minut Po inkubacji koniugatu P uka jak wcze niej Dodawanie roztworu substratu Do ka dej studzienki doda 100 ul substratu TMB inkubowa w ciemno ci przez 15 minut Czas inkubacji mo na skr ci do 10 minut je eli maksymalna g sto optyczna ang Optical Density OD przekracza 3 0 przy g rnych warto ciach temperatury lub je eli stosowana jest metoda automatyczna Dodawanie roztworu zatrzymuj cego Do ka dej prob wki doda 100 ul roztworu zatrzymuj cego W ci gu 2 godzin odczyta absorbancj na czytniku mikrop ytek przy 450 nm Odczyta przy 620 nm ref
78. ente de cero con una probabilidad del 95 Significa gue es posible realizar mediciones fiables incluso en muestras negativas hasta este punto El c lculo se ha realizado de acuerdo con las orientaciones de NCCLS EP17 A vol 24 n 34 Aumentos de cromogranina A no relacionados con tumores Es posible observar aumentos en los niveles de cromogranina A en pacientes con una funci n renal disminuida en pacientes con gastritis atr fica y en pacientes sometidos a tratamiento con f rmacos inhibidores de la bomba de protones 30 K2378 E 23 0196 07DA CARACTERISTICAS FUNCIONALES Tabla 1 Sensibilidad y especificidad cl nicas Sensibilidad cl nica Se ensay un total de 107 muestras de plasma heparinizado con caracterizaci n cl nica The following table summarises the results N mero Positivo Negativo NR Grupos de enfermedad total 53 0 nmol L lt 3 0 nmol L wc TEC 4 3 1 75 TPE 30 19 11 63 CIA 10 7 3 70 CP 9 4 5 44 CIM 47 28 19 60 Dif NE 6 2 4 33 Paraganglioma 1 1 0 100 TEC Tumores de tipo enterocromaf nico TPE Tumor del pancreas endocrino CIA Garcinoide del intestino anterior CP Carcinoide de pulm n CIM Garcinoide del intestino medio Dif NE Diferenciaci n neuroendocrina Especificidad Se analizaron 126 muestras de plasma heparinizado de donantes de sangre aparentemente sanos 126 muestras fueron negativas 126 126 100 95 Cl 97 1 100 El interv
79. erencyjn d ugo fali Obliczenia Skonstruowa krzyw kalibracyjn wykre laj c OD wobec warto ci ng ml sze ciu kalibrator w Sze dostarczonych kalibrator w ma warto ci odpowiednio O ng mL dla kalibratora 1 36 ng ml dla kalibratora 2 180 ng ml dla kalibratora 3 540 ng ml dla kalibratora 4 1080 ng ml dla kalibratora 5 1800 ng mL dla kalibratora 6 Odczyta z krzywej warto ci kontroli niskiej i wysokiej oraz pr bek pacjenta Warto ci wy sze od najwy szej warto ci kalibratora powinny by zg aszane jako gt 1800 ng ml lub dalej rozcie czane za pomoc rozcie czalnika oznaczenia i ponownie oznaczane W tym przypadku nale y dokona kompensacji rozcie czenia podczas oblicze st enia chromograniny A Prosz zwr ci uwag je eli warto ci kalibratora 1 lub kalibratora 6 s poza zakresem test nale y uzna za niewa ny i powt rzy go 77 K2378 E 23 0196 07DA Dla wygody obliczenia st enia mo na przeprowadzi w ng ml nmol l lub U l Jednostki podano w poni szej tabeli Do konwersji zastosowano mas molekularn natywnego fragmentu chromograniny A 36 kDa Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 Kalibrator Stezenie Absorbancj NA ng ml nmol l U I A 5 w 1 0 0 0 0 094 a 2 36 1 12 0 209 o 3 180 5 58 0 678 is 4 540 15 174 1 599 NM 5 1080 30 348 2 259 an gt 6 1800 50 581 2 735 edu m Chromogranin A ng mL Chromogranin
80. este proteine sono il prodotto di geni differenti ma posseggono alcune propriet in comune come l abbondanza di aminoacidi con residui acidi e la presenza di alcune coppie di aminoacidi con residui basici che sono i siti potenziali per taglio post trascrizionale Le cromogranine sono immagazzinate e secrete insieme ai neuropeptidi e agli ormoni dalle cellule neuroendocrine di tutto organismo per esse stato suggerito il ruolo di responsabili della formazione dei granuli contenenti gli ormoni immagazzinati Inoltre le cromogranine possono essere suddivise in frammenti pi piccoli in grado di esercitare attivit biologiche come Vinibizione della liberazione di certi ormoni la vasodilatazione e l azione anti batterica Stridsberg M 2000 I tumori di origine neuroendocrina di solito presentano livelli circolanti aumentati di cromogranina A nel siero e nel plasma O Connor DT Deftos LJ 1986 tumori neuroendocrini derivano da cellule neuroendocrine tumori tipici sono i tumori carcinoidi i feocromocitomi i neuroblastomi i tumori polmonari a piccole cellule gli adenomi iperparatiroidei i tumori ipofisari i tumori delle isole pancreatiche e le sindromi MEN 1 e MEN 2 In questi tumori sono compresi differenti sindromi da tumori neuroendocrini come i gastrinomi gli insulinomi i glucanomi i somatostatinomi i tumori secernenti il polipeptide pancreatico e i tumori neuroendocrini non secernenti Eriksson B et al 2000 Per questi tumori
81. g CONTROL H LYO Lyophilisierte Kontrolle hoch 47 K2378 E 23 0196 07DA O Chargen Nummer Katalog Nummer Verfallsdatum gt ga 8 o Temperaturbereich 30 Biologische Gefahrdung ej Gebrauchsanweisung beachten lt U In vitro Diagnostikum Hersteller Achtung o JE Inhalt ausreichend f r 96 Tests M M Konform mit Richtlinie 98 79 EG zu In vitro Diagnostika 48 K2378 E 23 0196 07DA CgAnalyze Kit ITALIANO USO PREVISTO Il Kit CgAnalyze un dosaggio immunoassorbente legato ad enzima ELISA per il rilevamento e la quantificazione degli anticorpi di cromogranina A nel siero e nel plasma umano risultati del dosaggio possono essere utilizzati come aiuto nella diagnosi di cromogranina A nella secrezione di tumori neuroendocrini NET quali feocromocitomi e carcinoidi Il dosaggio inteso per l utilizzo in pazienti con segni e sintomi coerenti con i NET Non amp previsto per lo screening su una popolazione sana L analisi deve essere eseguita da professionisti di laboratorio esperti PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO RIEPILOGO E SPIEGAZIONE Le cromogranine e le secretogranine costituiscono una famiglia di sole proteine acide immagazzinate insieme ai neurotrasmettitori e agli ormoni peptidici nell encefalo e nel sistema neuroendocrino diffuso Winkler H amp Fischer Colbrie R 1992 Qu
82. h dniach 1 2 3 4 5 6 beoe SEDNA 150 209 316 486 838 1212 140 108 283 417 806 698 w 9 5 9 9 10 6 Tabela 3 Precyzja wewnatrzoznaczeniowa zosta a oznaczona poprzez badanie sze ciu r nych pr bek w o miu powt rzeniach w jednym dniu 1 2 3 4 5 6 156 214 335 502 868 1255 Warto rednia cen 6 4 113 104 1233 428 101 4 c 4 5 3 5 5 8 80 K2378 E 23 0196 07DA Tabela 4 Zmienno mi dzy partiami zosta a oznaczona poprzez badanie sze ciu r nych pr bek w o miu powt rzeniach dla trzech r nych partii 1 2 3 4 5 6 a srednia 145 205 309 459 794 1165 SB 9 6 7 8 229 385 692 78 1 HAT 7 4 7 8 9 7 Tabela 5 Odzysk rozcienczenia oznaczono poprzez badanie pi ciu rozcie cze seryjnych trzech r nych pr bek St enie 2 We mierzone dla St enie obliczone 29044 Pr bka Rozcienczenie n skorygowany o redniej AE A rozcie czenie Ste enie odzysk Pr bka mierzone dla skorygowany o redniej ng ml rozcie czenie 2 St enie Pr bka Rozcie czenie mierzone dla skorygowany o redniej ng ml rozcie czenie 3 81 K2378 E 23 0196 07DA ROZWIAZYWANIE PROBLEM W Problem Mo liwe przyczyny Dziatanie naprawcze Jeden lub 1 Nie dodano jednego lub wi cej Test niewa ny Powt rzy test wi cej odczynnik w lub dodano je w kalibrator w
83. haque puits Incuber pendant 30 minutes Apr s incubation du conjugu Laver selon les instructions ci dessus Ajout de la solution de substrat Ajouter 100 ul de substrat de TMB chaque puits et incuber dans l obscurit pendant 15 minutes La dur e d incubation peut tre ramen e 10 minutes si la DO maximum est sup rieure 3 0 haute temperature ou si on appliqu une methode automatis e Ajout de la solution d arret Ajouter 100 ul de solution d arr amp t chaque puits Lire l absorbance a 450 nm sur un lecteur de microplaque dans les 2 heures Lire une longueur d onde de r f rence de 620 nm Calculs laborer une courbe de calibrateur en reportant la DO par rapport aux valeurs ng ml des six calibrateurs Les six calibrateurs fournis ont respectivement des valeurs de 0 ng ml pour le calibrateur 1 1 36 ng ml pour le calibrateur 2 180 ng ml pour le calibrateur 3 540 ng ml pour le calibrateur 4 1080 ng ml pour le calibrateur 5 1800 ng ml pour le calibrateur 6 Lire les valeurs du t moin bas et du t moin haut ainsi que les chantillons patient a partir de la courbe 16 K2378 E 23 0196 07DA Les valeurs sup rieures a la valeur de calibrateur la plus lev e devront tre relev es comme tant gt 1800 ng ml ou davantage dilu es avec du diluant de dosage et r analys es Dans ce cas il faudra compenser la dilution dans le cadre du calcul de la concentration de chromogranine A Par commodit les con
84. herheitsdatenbl tter sind f r alle in diesem Testkit enthaltenen gef hrlichen Bestandteile auf Anfrage von Dako Denmark A S erh ltlich CONJ 100X Achtung Enth lt ProClin 300 Reaktionsmasse aus 5 chloro 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 247 500 7 and 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 220 239 6 3 1 H317 Kann allergische Hautreaktionen verursachen P264 Nach Gebrauch die Hande griindlich waschen P280 Schutzhandschuhe Schutzkleidung Augenschutz Gesichtsschutz verwenden P302 352 BEI HAUT KONTAKT Mit sehr viel Seife und Wasser waschen P333 313 Im Falle einer Hautreizung oder ausschlags Arztlichen Rat einholen bzw zur Kenntnis bringen PROBENENTNAHME F r das CgAnalyze Kit wird Serum EDTA Heparinplasma empfohlen Proben als potenziell infekti s handhaben Die Proben k nnen nach dem Zentrifugieren und Abseren bei 2 8 C bis zu 7 Tage gelagert werden Falls die Proben eine l ngere Zeit aufbewahrt werden sollen bei 20 C oder k lter lagern Proben k nnen ohne Ver nderung 3 mal eingefroren und wieder aufgetaut werden Keinen Gefrierschrank mit No Frost System verwenden da die Proben dort Auftau Einfrier Zyklen unterworfen sein k nnen welche die Antik rper abschw chen Proben die nicht richtig gelagert oder mehrfachen Auftau Einfrier Zyklen unterworfen sind k nnen falsche Ergebnisse ergeben 38 K2378 E 23 0196 07DA KITKOMPONENTEN UND REAGENZIENLAGERUNG Ein Rahmen mit 96 Kavit ten
85. i attesi E consigliabile che ogni laboratorio stabilisca i limiti di riferimento con i campioni comunemente usati in guanto le variazioni nella manipolazione dei campioni stessi possono compromettere i risultati Seguire una procedura di movimentazione dei campioni rigorosa come riportato sopra valori di seguito riportati sono indicativi dei limiti di riferimento attesi e calcolati come 97 5 percentile di 126 campioni di donatori di sangue di plasma eparinico 63 uomini e 63 donne Livello di cromogranina nei limiti di riferimento lt 108 ng mL o 3 0 nmol L o 35 U L Limite di rilevazione Il limite di rilevazione del dosaggio pari a 19 ng mL o 0 54 nmol L o 6 U L Si tratta della concentrazione minima rilevabile diversa da zero con una probabilit del 95 Ci significa che si possono effettuare misurazioni affidabili persino su campioni negativi fino a questo punto Il calcolo stato eseguito secondo le linee guida NCCLS EP17 A vol 24 n 34 Incrementi di cromogranina A non associati a tumore L incremento dei valori di cromogranina A si pu riscontrare in pazienti con funzionalit renale ridotta con gastrite atrofica e sottoposti a trattamento con farmaci inibitori di pompa protonica CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI Tabella 1 Sensibilit e specificit clinica Sensibilit clinica Sono stati dosati in totale 107 campioni di plasma eparinico con caratterizzazione clinica risultati sono riportati in sintesi nella
86. ie Anzeichen und Symptome eines NETs aufweisen vorgesehen Es nicht f r das Screening einer gesunden Population gedacht Die Untersuchung darf nur von ausgebildetem Laborpersonal durchgef hrt werden NUR ZUR IN VITRO DIAGNOSTIK ZUSAMMENFASSUNG UND ERLAUTERUNG Chromogranine und Sekretogranine bilden eine Familie einzigartiger saurer Proteine die zusammen mit Neurotransmittern und Peptidhormonen im Gehirn und dem diffusen neuroendokrinen System gespeichert sind Winkler H amp Fischer Colbrie R 1992 Diese Proteine stammen strukturell von verschiedenen Genen haben aber einige allgemeine Eigenschaften wie beispielsweise eine Reihe saurer Aminosaurereste und mehrere Paare basischer Aminosauren als m gliche Orte posttranslationaler Spaltung gemeinsam Chromogranine werden zusammen mit Neuropeptiden und Hormonen in den neuroendokrinen Zellen des ganzen K rpers gespeichert und sezerniert Es wird vermutet dass eine Rolle des Chromogranins in der Bildung hormoneller Granula und Hormongruppen besteht Zudem k nnen Chromogranine in kleinere Fragmente gespalten werden die biologische Aktivitaten wie Hemmung der Hormonsekretion Vasodilatation und antimikrobielle Wirkungen entwickeln k nnen Stridsberg M 2000 Tumore neuroendokrinen Ursprungs gehen normalerweise mit erh hten Serum IPlasmaspiegeln von Chromogranin A einher O Connor DT Deftos LJ 1986 und stammen von neuroendokrinen Zellen ab Typische neuroendokrine Tumore sind Karzinoid
87. it alla direttiva 98 79 CE relativa ai dispositivi medico diagnostici in vitro 60 K2378 E 23 0196 07DA CgAnalyze Kit ESKY POU IT V SOULADU S UR EN M Souprava CgAnalyze je heterogenn enzymov imunoanal za enzyme linked immunosorbent assay ELISA kter slou k detekci a kvantitativn mu stanoven chromograninu A v lidsk plazm nebo s ru V sledky tohoto stanoven Ize pou t jako pom cku p i ur ov n diagn zy neuroendokrinn ch tumor NET secernuj c ch chromogranin A jako jsou feochromocytomy a karcinoidy Tento test je ur en pro pacienty se zn mkami a p znaky sv d c mi pro p tomnost NET Nen ur en ke screeningov mu vy et ov n zdrav populace Anal zu by m li prov d t vy kolen laboratorn pracovn ci PRO DIAGNOSTICK POU IT IN VITRO SOUHRN A VYSV TLEN Chromograniny a sekretograniny jsou skupinou jedine n ch kysel ch protein kter jsou ukl d ny spolu s neurotransmitery a peptidov mi hormony v mozku a difuzn m neuroendokrinn m syst mu Winkler H 8 Fischer Colbrie R 1992 Struktur ln jsou tyto proteiny produkty odli n ch gen maj v ak spole n n kter obecn vlastnosti jako je nap klad vysok pod l kysel ch aminokyselinov ch zbytk a n kolik p r z sadit ch aminokyselin kter se nal zaj na pozic ch vhodn ch pro potenci ln posttransla n t pen Chromograniny jsou ukl d ny a uvol ov ny spo
88. l color es directamente proporcional a la cantidad de cromogranina A unida al pocillo La cantidad de cromogranina se determina mediante una comparaci n con el desarrollo del color de las muestras de calibrador 25 K2378 E 23 0196 07DA El calibrador del kit es un p ptido sint tico correspondiente a la cromogranina A El calibrador del p ptido se ajusta para tener una respuesta igual a un fragmento purificado y nativo de cromogranina A Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para uso diagn stico in vitro Los reactivos de ensayo no contienen componentes de suero humano pero el plasma de paciente analizado debe manejarse como si pudiera transmitir agentes infecciosos Los centros para el control y la prevenci n de enfermedades y los institutos nacionales de salud recomiendan que los agentes potencialmente infecciosos se manipulen en un nivel 2 de bioseguridad La mayoria de las soluciones del kit contienen ProClin 300 como conservante Nunca pipetee con la boca ni permita gue los reactivos o la muestra del paciente entren en contacto con la piel Los reactivos gue contienen ProClin 300 pueden ser irritantes Evite el contacto con la piel y los ojos En caso de contacto enjuague con una cantidad abundante de agua La soluci n de parada contiene cido sulf rico 0 5 M Evitar el contacto del reactivo con la piel Las concentraciones de cromogranina A en una muestra dada determinado
89. la 1 Nespr vn teplota na asov n 1 Zkontrolujte Ze as a teplota byly m hodnotu nebo pipetov n reagencie spr vn Viz Nedostate n p esnost mimo rozsah nebyly prom ch ny n e Opakujte test 2 Zkfizen kontaminace kontrol 2 Pipetujte pe liv 3 Nespr vn ed n 3 Opakujte test 4 Optick dr ha nen ist 4 Zkontrolujte zda v jamk ch nen p tomna ne istota nebo bublinky vzduchu Ot ete dno desti ky a opakujte ten V echny testy 1 Nebyla p id na nejm n jedna 1 Znovu zkontrolujte postup Prov te maj pr zdn reagencie nebo chybn po ad nepou it reagencie v sledky p id n Opakujte test 2 PotaZen desti ka nen aktivn 2 Zkontrolujte zda v nepou it ch jamk ch nen vlhkost Ot ete dno desti ky a opakujte ten V echny testy 1 Kontaminovan pufry nebo 1 Zkontrolujte v echny roztoky zda nen maj lut reagencie p tomen z kal nebo z pach v sledky 2 Kontaminovany promyvaci 2 Pou ijte istou n dobku Zkontrolujte roztok kvalitu vodn ho roztoku pou it ho pro p pravu 3 Nespr vn na ed n s ra 3 Opakujte test Maxim ln 1 P li vysok teploty 1 Zkra te dobu inkubace pro substr t OD je inkubace pou it automatick zv ena metody vy ne 3 0 Nedostate n 1 CV pipetov n 1 Zkontrolujte kalibraci pipety p esnost je vy ne 5 Pou ijte reprodukovatel
90. laca e ler novamente Todos os 1 Um ou mais reagentes nao 1 Verificar de novo o procedimento resultados foi foram adicionados Verificar se existe reagente por utilizar dos testes em ou foi foram adicionados na Repetir a an lise branco sequ ncia incorrecta 2 Placa revestida inactiva 2 Verificar se existe humidade nos po os n o utilizados Limpar o fundo da placa e ler novamente Todos os 1 Tamp es ou reagentes 1 Examinar todas as solu es procura resultados contaminados de turbidez ou um mau aroma dos testes 2 Solu o de lavagem 2 Empregar um recipiente limpo Verificar amarelos contaminada a qualidade da solu o aquosa utilizada na prepara o 3 Diluic o inadequada do soro 3 Repetir a an lise OD m xima 1 Temperaturas de incuba o 1 Diminuir o tempo de incuba o do est elevada muito elevadas utiliza o de substrato excede 3 0 m todo automatizado Pouca 1 OV de administra o de pipeta 1 Verificar a calibra o da pipeta precis o mais de 5 Empregar a t cnica reproduz vel 2 Amostra ou reagentes n o 2 Misturar todos os reagentes cuidadosa suficiente misturados ou n o mas completamente equilibrados temperatura e equilibrar temperatura ambiente ambiente 3 Adi o do reagente demasiado 3 Desenvolver uma t cnica uniforme demorada inconsist ncia nos consistente e utilizar um dispositivo com intervalos de cronometragem v rias pontas ou um auto administrador para red
91. le n s neuropeptidy a hormony v neuroendokrinn ch bu k ch nal zaj c ch se po cel m t le kolem chromogranin je patrn vytv en granul obsahuj c ch hormony a kombinace hormon Chromograniny Ize d le t pit na men fragmenty kter maj biologick inky jako je inhibice uvol ov n hormon vasodilatace a antimikrobiologick inky Stridsberg M 2000 Tumory neuroendokrinn ho p vodu se zpravidla vyzna uj zv en mi hladinami chromograninu A v s ru plazm O Connor DT Deftos LJ 1986 Neuroendokrinn tumory jsou odvozeny od neuroendokrinn ch bun k typick neuroendokrinn tumory jsou karcinoidn tumory feochromocytomy neuroblastomy malobun n karcinomy plic adenomy p t tn ch t l sek tumory podv sku mozkov ho a tumory Langerhansov ch ostr vk pankreatu v etn syndromu MEN1 a MEN2 Pat mezi n rovn r zn syndromy zp soben neuroendokrinn mi tumory konkr tn gastrinomy inzulinomy glukagonomy somatostatinomy PPomy a nefunk n mi neuroendokrinn mi tumory Eriksson B a kol 2000 U t chto tumor bylo prok z no e chromogranin A je nejlep m markerem v krevn m ob hu Bajetta E a kol 1999 Princip soupravy CgAnalyze Na samostatn edic desti ce se edic m roztokem 5x z ed vzorky pacient kalibr tory a kontroly Z ed n materi l se p enese do mikrotitra n ch jamek a inkubuje po dobu 60 minut p i laboratorn teplot
92. llons diff rents en huit r plicats et en une occasion 1 2 3 4 5 6 Valeur moyenne ng ml 156 214 335 502 868 1255 S 6 4 11 3 10 4 23 3 42 8 101 4 CV 4 5 3 5 5 8 19 K2378 E 23 0196 07DA Tableau 4 La variation inter lots a t d termin e en testant six chantillons diff rents en huit r plicats sur trois lots diff rents 1 2 3 4 5 6 Valeur moyenne ng ml 145 205 309 459 794 1165 S 9 6 7 8 22 9 38 5 69 2 78 1 CV 7 4 7 8 9 y Tableau 5 La lin arit au test de dilution a t d termin e en testant cinq dilutions en s rie pour trois chantillons diff rents Concentration ie chantillon Moyenne Concentanan a mesur e calcul e ng ml p Allan ng ml s EE 1 1540 1 10 756 770 yo oec BY 9 1 40 eg O Jos AD Concentration Rendement corrig Echantillon moyenne Er A par rapport la mesur e ng ml 9 dilution we 2 266 Ts wm eo me s f Concentration Conceniration Rendement corrig Echantillon moyenne calcul e ng ml par rapport la mesur e ng ml g dilution ao 65 646 97 tro 292 a M two 14 12 89 20 K2378 E 23 0196 07DA RESOLUTION DES PROBLEMES COURANTS Probleme Causes possibles Action corrective Un ou 1 Unou plusieurs r actifs non 1 Test non valable Recommencer le test plusieurs ajout s
93. m x T E O gt o O z O m o W o o D Antigeno placa recubierta S L Diluyente o o z E Tamp n de conjugado CONJ Conjugado HRP 100x de conc gt 7 I N x 0 Tamp n de lavado concentrado 20x U Soluci n TMB soluci n substrato cido sulf rico 0 5 molar soluci n de parada O gt F E r lt o Calibrador liofilizado CONTROL Control bajo liofilizado CONTROL H LYO Control alto liofilizado 35 K2378 E 23 0196 07DA LOT N mero de lote m N mero de cat logo Fecha de caducidad Sr L mites de temperatura ar Riesgo biol gico Consulte las instrucciones de uso Producto sanitario para diagn stico in vitro Fabricante Atensi n Ok GE o Contenido suficiente para 96 pruebas M M La conformidad con la Directiva 98 79 CE sobre productos sanitarios para diagn stico in vitro 36 K2378 E 23 0196 07DA CgAnalyze Kit DEUTSCH VERWENDUNGSZWECK Das Kit CgAnalyze ist ein enzymgebundener Immunosorbent Test ELISA zum Nachweis und zur Quantifizierung des Chromogranin A im menschlichen Plasma oder Serum Die Testergebnisse k nnen f r die Diagnose von Chromogranin A sezernierenden neuroendokrinen Tumoren NETS wie Pheochromozytome und Karzinoide herangezogen werden Das Assay ist fur Patienten d
94. microtitrage de 300 ul puits pour la dilution du calibrateur des chantillons patient et des t moins Pipettes de pr cision embouts jetables Laveur automatique de plaques de microtitrage papier absorbant tubes et minuteur 15 K2378 E 23 0196 07DA TECHNIQUE Toutes les solutions doivent tre utilis es a temp rature ambiante Incuber toutes les tapes a temp ratures ambiante 20 309 Dilution et incubation des chantillons Diluer 5 fois tous les chantillons dans une plague de dilution s par e avant de les transf rer sur la plague d analyse Les calibrateurs le t moin bas L le t moin haut H et le plasma de patient devront tous tre dilu s a raison de 50 ul plasma 200 ul de diluant M langer soigneusement en pipetant vers le haut et le bas avant de transf rer 100ul en duplicata dans la plague d analyse et conform ment au diagramme ci dessous 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A GAL1 CAL5 P1 B CAL1 CAL5 P1 C GAL2 CAL6 P2 D CAL2 GAL6 P2 E CAL3 H etc F CAL3 H G GAL4 IL H CAL4 L Incuber pendant 60 minutes Apr s l incubation de l chantillon Laver trois 3 fois avec 300 ul de solution de lavage puits en remplissant et en vidant les puits chaque fois Apr s le dernier lavage vider les puits en tapotant la microplaque sur du papier absorbant Ajout du conjugu Ajouter 100 ul de conjugu c
95. n ch vzork v osmi replik tech p i jedn p le itosti 1 2 3 4 5 6 La hodnota 156 214 335 502 868 1255 E 64 1113 104 1233 428 1014 A 4 5 3 5 5 8 67 K2378 E 23 0196 07DA Tabulka 4 P esnost mezi d vkami byla stanovena testov n m esti odli n ch vzork v osmi replik tech p i t ech r zn ch p le itostech 1 2 3 4 5 6 En hodnota 145 205 309 459 794 1165 Ms 96 78 229 385 692 781 w 7 4 7 8 9 7 Tabulka 5 V t nost ve vztahu k ed n byla stanovena testov n m p ti s riov ch ed n t ech r zn ch vzork St edn nam en koncentrace Vypo tan Korekce koncentrace zohled uj c ed n v t nosti St edn nam en koncentrace ng mL 1134 Vypo tan Korekce koncentrace zohled uj c ed n ng mL v t nosti 7 8 139 St edn nam en koncentrace ng mL 1293 1 10 3 1 20 Vypo tan Korekce koncentrace zohled uj c ed n ng mL v t nosti 92 1 40 1 80 68 K2378 E 23 0196 07DA E EN POT Probl m Mo n p iny N pravn opat en Jeden nebo 1 Nebyla p id na nejm n jedna 1 Neplatn test Opakujte test v ce reagencie nebo chybn po ad kalibr tor je p id n mimo rozsah 2 Nespr vn pipetov n 2 Neplatn test Opakujte test Kontro
96. naci n con los s ntomas cl nicos y los resultados de otras pruebas disponibles 29 K2378 E 23 0196 07DA Interferencia No se detectaron interferencias cuando se inacularon muestras de plasma con bilirrubina F 208 mg L bilirrubina C 200 mg L hemoglobina hemolitica 4 84 g L o quilo 1430 FTU Las personas gue reciben anticuerpos de rat n antihumanos para tratamiento o diagn stico o aquellos que se han expuesto de alg n otro modo a la inmunoglobulina de rat n pueden producir anticuerpos humanos antirrat n HAMA Estos anticuerpos pueden interferir en los ensayos gue usen m s anticuerpos monoclonales de rat n y ocasionar niveles elevados falsos Resultados esperados Se recomienda que cada laboratorio establezca un rango de referencia con las muestras que utilice normalmente ya que las variaciones en la manipulaci n de las muestras pueden afectar a los resultados Debe seguirse una estricta rutina de manipulaci n de las muestras como se recomienda m s arriba Los siguientes valores son una indicaci n del rango de referencia esperado y se calculan como el percentil 97 5 de 126 muestras de plasma heparinizado de donantes de sangre 63 hombres y 63 mujeres Nivel de plasma heparinizado del rango de referencia de la cromogranina A lt 108 ng mL o 3 0 nmol L o 35 U L L mite de detecci n El l mite de detecci n de este ensayo es de 19 ng mL o 0 54 nmol L o 6 U L Es la menor concentraci n detectable difer
97. ndumenti protettivi Proteggere gli occhi il viso P302 352 IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE lavare abbondantemente con acqua e sapone P333 313 In caso di irritazione o eruzione della pelle consultare un medico RACCOLTA DEI CAMPIONI La CgAnalyze Kit consigliata per il siero EDTA plasma eparinico Manipolare come potenziale trasmettitore di agenti infettivi campioni vengono separati per centrifugazione e possono essere conservati fino a 7 giorni a 2 8 C Se devono essere conservati per periodi pi lunghi mantenere i campioni a 20 C o a temperature inferiori campioni possono essere sottoposti a 3 cicli di congelamento scongelamento senza deteriorarsi Non utilizzare un congelatore anti sbrinamento in quanto i campioni potrebbero essere sottoposti a cicli di congelamento scongelamento con conseguente degrado degli anticorpi campioni non correttamente conservati o soggetti a pi cicli di congelamento scongelamento possono provocare risultati spuri 50 K2378 E 23 0196 07DA COMPONENTI DEL KIT E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI Un telaio con 96 pozzetti sigillate in una busta dry pack di alluminio Sei flaconi con calibratori contenenti cromogranina A umana in diluente CAL 1 0 ng mL diluente CAL 2 36 ng mL CAL 3 180 ng mL CAL 4 540 ng mL CAL 5 1080 ng mL CAL 6 1800 ng mL Un flacone con controllo basso liofilizzato L colore verde Un flacone con controllo alto liofilizzato H colore ross
98. nou metodu 2 Vzorky nebo reagencie nebyly 2 V echny reagencie jemn ale d kladn dostate n prom ch ny nebo prom chejte a vytemperujte na vytemperov ny na laboratorn laboratorn teplotu teplotu 3 P id n reagencie p li dlouho 3 Vytvo te konzistentn a uniformni trv nekonzistentn intervaly techniku asov n ke zkr cen doby pou ijte za zen s v ce pi kami nebo automatick d vkova 4 Optick dr ha nen ist 4 Zkontrolujte zda v jamk ch nejsou bublinky vzduchu Ot ete dno desti ky a opakujte ten 69 K2378 E 23 0196 07DA Prom v n nen konsistentn 5 Zkontrolujte Ze v echny jamky jsou zachycen bublinky v jamk ch napln ny a nas v n je stejnom rn Do zb v prom vac roztok v ech jamek nad vkujte roztok do v e p esahuj c hladinu reagencie Po posledn m promyt jamky vypr zdn te a vyklepejte desti ku o absorp n materi l Nespr vn pipetov n 6 Zabra te p tomnosti bublinek v pipetovac pi ce 70 K2378 E 23 0196 07DA LITERATURA 8 Bajetta E Ferrari L Martinetti A Celio L Procopio G Artale S Zilembo N Di Bartolomeo M Seregni E and Bombardieri E Chromogranin A neuron specific enolase carcinoembryonic antigen and hydroxyindole acetic acid evaluation in patient with neuroendocrine tumours Cancer 1999 86 858 865 Eriksson B
99. o 30 mL di diluente DIL contenente anticorpi marcati biotina con cromogranina A di colore rosso Pronto all uso 150 uL di coniugato CONJ contenente anticorpi marcati HRP con cromogranina A Concentrazione 100x 15 mL di tampone di coniugato di colore blu Pronto all uso 15 mL di substrato TMB Pronto all uso 15 mL di soluzione di arresto 0 5M H2SO4 Pronto all uso 2 x 35 mL di soluzione di lavaggio concentrata 20x Prima dell uso controlli e i calibratori liofilizzati dovranno essere sciolti con cautela in 300 uL di acqua distillata Dopo l uso i controlli e i calibratori ricostituiti saranno conservati a 20 Coa temperature inferiori controlli e i calibratori possono essere sottoposti a 3 cicli di congelamento scongelamento senza deteriorarsi Gli altri reagenti del kit dovranno essere conservati a 2 8 C controlli e i calibratori ricostituiti dovranno essere diluiti 5x in diluente a ogni test La quantit di coniugato necessaria per ogni analisi dovr essere diluita 100x prima dell uso 10uL di coniugato 990 uL di tampone di coniugato per striscia Il coniugato diluito residuo dovr essere gettato La soluzione di lavaggio dovr essere diluita 20x prima dell uso Diluire 10 mL di soluzione di lavaggio concentrata 20x in 190 ml di acqua distillata Se conservata a 2 8 C la soluzione di lavaggio diluita stabile fino alla data di scadenza indicata sul kit Il residuo di reagenti nel kit
100. o ng ml 145 205 309 459 794 1165 SD 9 6 7 8 22 9 38 5 69 2 78 1 CV 7 4 7 8 9 7 Quadro 5 A recuperac o da diluic o foi determinada por meio de an lises feitas a cinco diluic es em s rie de tr s amostras diferentes Concentrac o m dia medida de Recuperac o corrigida da diluic o Concentrac o calculada ng ml Concentrac o m dia medida nmol l de Recuperac o corrigida da diluic o Concentrac o calculada nmol l Concentrac o m dia medida ng ml de Recuperac o corrigida da diluic o Concentrac o calculada ng ml 94 K2378 E 23 0196 07DA RESOLUC O DE PROBLEMAS Problema Causas poss veis Acc o de correcc o Um ou mais 1 Um ou mais reagentes nao 1 An lise inv lida Repetir a an lise calibradores foi foram adicionados ou fora da foi foram adicionados na amplitude segu ncia incorrecta 2 Pipetagem inadequada 2 An lise inv lida Repetir a an lise Valores de 1 Temperatura cronometragem ou 1 Verificar se o tempo e a temperatura controlo fora pipetagem incorrectas reagentes estavam correctos Consultar Pouca da amplitude n o misturados precis o abaixo Repetir a an lise 2 Gontaminac o cruzada dos 2 Pipetar cuidadosamente controlos 3 Diluic o inadequada 3 Repetir a an lise 4 Via ptica n o limpa 4 Verificar se os po os cont m impurezas ou bolhas de ar Limpar o fundo da p
101. o podle z sad biologick bezpe nosti rovn 2 V t ina roztok v souprav obsahuje jako konzerva n l tku ProClin 300 Nikdy nepipetujte sty ani nedovolte aby reagencie nebo vzorky pacient p i ly do styku s k Reagencie obsahuj c ProClin 300 mohou p sobit dr div Zabra te kontaktu s k a o ima P i p padn m kontaktu omyjte zasa en m sto velk m mno stv m vody Zastavovac roztok obsahuje 0 5M kyselinu s rovou Zabra te kontaktu t to reagencie s k Koncentrace chromograninu A v p slu n m vzorku stanoven pomoc test r zn ch v robc se m e li it vzhledem k rozd l m v testovac ch metod ch a specificit reagencii S ve ker m odpadem je nutno zach zet jako s nebezpe n m odpadem Bezpe nostn listy ke v em nebezpe n m slo k m obsa en m v t to souprav na po d n poskytne spole nost Dako Denmark A S Varov n Obsahuje ProClin 300 Reak n sm s se slo kami 5 chlor 2 methyl 4 isothiazolin 3 on slo EC 247 500 7 a 2 methyl 4 isothiazolin 3 on slo EC 220 239 6 3 1 H317 M e vyvolat alergickou ko n reakci P264 Po manipulaci d kladn omyjte ruce P280 Pou vejte ochrann rukavice ochrann od v ochrann br le obli ejov t t P302 352 PRI STYKU S K Omyjte velk m mno stv m vody a m dla P333 313 P i podr d n k e nebo vyr ce Vyhledejte l ka skou pomoc o et en ODB
102. ode DO est automatis e d pass sup rieur 3 0 Pr cision 1 OV de d bit de pipette 1 V rifier l talonnage de la pipette m diocre sup rieur 596 Utiliser la technique reproductible 2 chantillon ou r actifs non 2 M langer tous les r actifs d licatement suffisamment m lang s ou non mais compl tement et laisser stabiliser stabilis s temp rature temp rature ambiante ambiante 3 Ajout du r actif durant trop 3 D velopper une technique uniforme et longtemps incoh rence dans les coh rente et utiliser des dispositifs intervalles de temporisation plusieurs embouts ou pipeteurs automatiques pour raccourcir les d lais 4 Chemin optique sale 4 V rifier s il y a des bulles d air dans les puits Essuyer la base de la plaque et lire nouveau 21 K2378 E 23 0196 07DA 5 Lavage incoh rent bulles 5 V rifier que tous les puits sont remplis et Pi g es solution de lavage aspir s uniform ment Verser le liguide restant dans les puits Pour qu il arrive au dessus du niveau de r actif dans le puits Apres le dernier lavage vider compl tement les puits en tapotant la microplaque sur du papier absorbant 6 Pipetage incorrect 6 Eviter les bulles d air dans les embouts de pipettes REFERENCES 1 Bajetta E Ferrari L Martinetti A Celio L Procopio G Artale S Zilembo N Di Bartolomeo M Seregni E and Bombardieri E Chromogranin A
103. ontrollare la presenza di bolle d aria nei pozzetti Pulire il fondo della piastra e ripetere la lettura Controllare che i pozzetti vengano riempiti e aspirati in modo uniforme Distribuire il liquido sopra il livello di reagenti nel pozzetto Dopo l ultimo lavaggio svuotare i pozzetti picchiettando la striscia su un tessuto assorbente 57 K2378 E 23 0196 07DA 6 Pipettamento non corretto 6 Evitare le bolle d aria nei puntali delle pipette RIFERIMENTI 1 Bajetta E Ferrari L Martinetti A Celio L Procopio G Artale S Zilembo N Di Bartolomeo M Seregni E and Bombardieri E Chromogranin A neuron specific enolase carcinoembryonic antigen and hydroxyindole acetic acid evaluation in patient with neuroendocrine tumours Cancer 1999 86 858 865 Eriksson B berg K and Stridsberg M Tumour markers in neuroendocrine tumours Digestion 2000 62 33 38 O Connor D T and Deftos L J Secretion of chromogranin A by peptide producing endocrine neoplasms New England Journal of Medicine 1986 314 1145 1151 Stridsberg M Hellman U Wilander E Lundqvist G Hellsing K and berg K Fragments of chromogranin A are present in the urine of patients with carcinoid tumours Development of a specific radioimmunoassay for chromogranin A and its fragments Journal of Endocrinology 1993 139 329 337 Stridsberg M berg K Li A Engstr m U and Lundovist G
104. os devem ser armazenados a 20 C ou menos Os calibradores e os controlos podem passar por 3 ciclos de congelamento descongelamento sem se deteriorarem Os restantes reagentes do kit devem ser armazenados a 2 8 C Os calibradores e controlos reconstitu dos devem ser dilu dos 5 vezes em diluente de cada vez que se efectuar um teste A quantidade de conjugado necess ria para cada an lise deve ser dilu da 100 vezes antes de ser utilizada 10 ul de conjugado 990 ul de tamp o conjugado por tira O resto de conjugado dilu do deve ser descartado A soluc o de lavagem deve ser dilu da 20 vezes antes de cada utilizac o Diluir 10 ml da soluc o de lavagem concentrada 20 vezes em 190 ml de gua destilada Quando armazenada a uma temperatura de 2 8 C a soluc o de lavagem dilu da permanece est vel at ao fim do prazo de validade do kit Os restantes reagentes do kit est o prontos para serem utilizados Remover apenas o n mero de pocos necess rio para a an lise voltando a fechar cuidadosamente o pacote de pel cula met lica Materiais ou equipamento necess rios mas n o fornecidos Leitor de micro placas com filtro de 450 nm Comprimento de onda de refer ncia 620 nm 300 ul por poco em placa de diluic o para diluic o do calibrador amostras de pacientes e controlos Pipetas de precis o com pontas descart veis Lavador de placas de microtitulac o autom ticos tecido absorvente tubos e um cron metro PROCEDIM
105. oupravy Zbytek reagenci v souprav je p ipraven k okam it mu pou it Odd lte p esn po et jamek kter pot ebujete pro test a znovu pe liv uzav ete aluminiov balen Vy adovan materi ly nebo vybaven kter nejsou sou st balen te ka mikrodesti ek s filtrem s vlnovou d lkou 450 nm Referen n vlnov d lka je 620 nm Redici desti ka s jamkami o objemu 300 uL pro ed n kalibr toru pacientsk vzorky a kontroly P esn pipety s jednor zov mi pi kami Automatick prom vac jednotka pro mikrotitra n desti ky absorp n materi l zkumavky a asova POSTUP V echny roztoky je nutno pou vat p i laboratorn teplot V echny kroky zahrnuj c inkubaci prov d jte p i laboratorn teplot 20 30 C ed n a inkubace vzork Z e te v echny vzorky 5x na samostatn edic desti ce a pot je p eneste na testovac desti ku Kalibr tory kontrola s n zkou koncentrac analytu kontrola s vysokou koncentrac analytu a pacientova plazma se z ed 50 uL plazmy 200 uL edic ho roztoku D kladn promichejte nas t m do pipety a vypu t n m p ed duplicitn m p enesen m 100 uL na testovac desti ku podle n e uveden ho sch matu 63 K2378 E 23 0196 07DA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CAL1 CAL5 P1 B CAL1 CAL5 P1 C CAL2 CAL6 P2 D CAL2 CAL6 P2 E CAL3 H atd F CAL3 H G CAL4
106. proporcional a guantidade de cromogranina A ligada ao poco A guantidade de cromogranina determinada por comparac o com o desenvolvimento de cor das amostras do calibrador 87 K2378 E 23 0196 07DA O calibrador incluido no kit um p ptido sint tico que corresponde a cromogranina A o calibrador de p ptido encontra se regulado de forma a dar uma reacc o semelhante a um fragmento nativo e purificado de cromogranina A Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 AVISOS E PRECAUC ES Para utilizac o diagn stica in vitro Os reagentes do ensaio nao cont m componentes de soro humano mas os plasmas de pacientes analisados devem ser manuseados como se tivessem a capacidade de transmitir agentes infecciosos Os Centros para Controlo e Prevenc o de Doencas e os Institutos Nacionais de Sa de recomendam que os agentes potencialmente infecciosos sejam processados ao nivel 2 de seguranca biol gica A maior parte das solug es do kit cont m ProClina 300 como produto conservante Nunca pipetar com a boca nem permitir que os reagentes ou a amostra do doente entrem em contacto com a pele Os reagentes contendo ProClina 300 podem ser irritantes Evitar o contacto com a pele e os olhos Em caso de contacto lavar com muita gua A soluc o de paragem cont m 0 5m de cido sulfurico Nao permitir que o reagente entre em contacto com a pele As concentrag es de cromogranina A numa dada amostra determinada com ensaios d
107. ra representando la DO frente a los valores de nmol l de los seis calibradores Los seis calibradores incluidos tienen valores de 0 ng mL para el calibrador 1 36 ng mL para el calibrador 2 180 ng mL para el calibrador 3 540 ng mL para el calibrador 4 1080 ng mL para el calibrador 5 y 1800 ng mL para el calibrador 6 respectivamente Lea los valores de los controles bajo y alto y las muestras del paciente a partir de la curva Los valores mayores que el valor del calibrador superior deben indicarse como gt 1 800 ng mL o diluirse m s con el diluyente del ensayo y volver a analizarse En este caso debe tenerse en cuenta la compensaci n de la diluci n en el c lculo de la concentraci n de cromogranina A En caso de que los valores del calibrador 1 o el calibrador 6 est n fuera de rango la prueba no se considerar v lida y deber repetirse 28 K2378 E 23 0196 07DA Para mayor comomdidad las concentraciones pueden calcularse en ng mL nmol L o U L Todas las unidades se indican en la tabla siguiente El peso molecular del fragmento nativo de cromogranina A 36kDa se us para la convesi n Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 Calibrador Concentraci n Absorbancia QUO ng mL nmol L U L Bisio 1 0 0 0 0 094 p 1 500 2 36 1 12 0 209 A 3 180 5 58 0 678 3 m 4 540 15 174 1 599 0 000 5 1080 30 348 2 259 o 1 5 15 E e 6 1800 50 581 2 735 ii Chromogranin A ng mL Ch
108. race analytu a vzorky pacient Hodnoty vy ne nejvy hodnoty kalibr toru by m ly b t uv d ny jako gt 1800 ng mL nebo by takov vzorky m ly b t d le na ed ny a znovu analyzov ny V takov m p pad je t eba p i v po tu koncentrace chromograninu A kompenzovat ed n Pamatujte pokud jsou hodnoty kalibr toru 1 nebo kalibr toru 6 mimo rozsah test by m l b t prohl en za neplatn a zopakov n 64 K2378 E 23 0196 07DA Jako jednotku pro v po et koncentrace Ize zvolit ng mL nmol L nebo U L Jednotky jsou uvedeny v tabulce n e Pro p epo t n byla pou ita molekulov hmotnost nativn ho fragmentu chromograninu A 36kDa Stridsberg M a kol 1993 Stridsberg a kol 1995 Kalibr tor Koncentrace Absorbance ng mL nmol L U L 1 0 0 0 0 094 2 36 1 12 0 209 3 180 5 58 0 678 4 540 15 174 1 599 5 1080 30 348 2 259 6 1800 50 581 2 735 3 000 2 500 2 000 1 500 1 000 Abs 450nm 620nm 0 500 0 000 0 36 180 540 1080 1800 01 5 15 30 50 0 12 58 174 348 581 Chromogranin A ng mL Chromogranin A nmol L Chromogranin A U L Pro vzorek s hodnotou absorbance 1 272 bude na ose X ode tena koncentrace 367 ng mL nebo 10 2 nmol L nebo 118 U L chromograninu A V tomto p kladu byla pou ita ty parametrov logistick k ivka D le it Tato k ivka je pouze p kladem a nesm b t pou ita k interpretaci sku
109. rfen werden Vor Gebrauch die Waschl sung 20fach verd nnen Daf r 10 ml der 20fach konzentrierten Waschl sung in 190 ml destilliertem Wasser verd nnen Die verd nnte Waschl sung ist bei einer Lagerung bei 2 8 C bis zum Verfallsdatum des Kits haltbar Alle anderen Reagenzien des Kits sind gebrauchsfertig Entnehmen Sie nur die Anzahl Kavit ten die zum Testen ben tigt werden Die Aluminiumverpackung wieder sorgf ltig verschlie en Nicht mitgelieferte aber erforderliche Materialien bzw Ger te Leseger t f r Mikrotiterplatten mit Filter 450 nm Referenzwellenl nge 620 nm 300 ul Kavit t Verd nnungsplatte zur Verd nnung von Kalibratoren Patientenproben und Kontrollen Pr zisionspipetten mit Einmalspitzen Automatischer Mikrotiterplattenwascher saugf hige Papiert cher R hrchen und ein Kurzzeitwecker VERFAHREN Alle L sungen m ssen Raumtemperatur haben Alle Schritte bei Raumtemperatur 20 30 C inkubieren 39 K2378 E 23 0196 07DA Probenverd nnung und Inkubation Vor dem Ubertragen auf die Testplatte alle Proben in einer separaten Verd nnungsplatte 5fach verd nnen Kalibratoren niedrige und hohe Kontrolle sowie Patientenplasma wie folgt verd nnen 50 ul Plasma 200 ul Verd nnungspuffer Mit der Pipette gut mischen und nach der Tabelle unten im Doppelansatz je 100 ul in die Testplatte bertragen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CAL1 CAL5 P1 CAL1 CAL5 P1 CAL2 CAL6 P
110. romogranin A nmol L Chromogranin A U L Una muestra con un valor de absorbancia de 1 272 se leer en el eje X como con 367 ng mL o 10 2 nmol 0 118 U L de cromogranina A En este ejemplo se ha aplicado una curva log stica de 4 par metros Importante La curva es un ejemplo y no debe usarse para la interpretaci n real de la muestra de un paciente Control de calidad La DO para el calibrador 1 debe ser lt 0 15 La DO del calibrador 6 debe ser gt 1 0 Los valores de los controles alto y bajo consulte el certificado del lote Los controles est n pensados para vigilar un fracaso sustancial de un reactivo Si cualquiera de los valores de control no est dentro de su intervalo respectivo la prueba debe considerarse no v lida y debe repetirse Podr an estudiarse controles adicionales de acuerdo con las directrices o requisitos de las normas locales estatales y o federales o las organizaciones de acreditaci n Consulte el documento NCCLS C24 A para orientaci n sobre pr cticas adecuadas de CC Efecto de gancho No se ha observado efecto de gancho en ensayos de concentraciones de cromogranina A hasta 360 000 ng mL o 10 000 nmol L o 116 000 U L LIMITACIONES El nivel de cromogranina A de un determinado paciente no debe usarse por s solo como medida de la intensidad de la enfermedad No se debe utilizar la prueba como nica base para la toma de decisiones en el tratamiento cl nico sino que debe utilizarse en combi
111. romograniny A Kalibrator peptydowy jest ustawiony tak aby dawa odpowied r wn oczyszczonemu natywnemu fragmentowi chromograniny A Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 OSTRZE ENIA I RODKI OSTRO NO CI Wy cznie do diagnostyki in vitro Odczynniki oznaczenia nie zawieraj sk adnik w pochodzenia ludzkiego ale analizowane osocza pacjent w powinny by traktowane jako zdolne do przenoszenia czynnik w zaka nych O rodki ds zwalczania i zapobiegania chorobom ang Centers for Disease Control and Prevention oraz Krajowe instytuty ds zdrowia ang National Institutes of Health zalecaj aby czynniki potencjalnie zaka ne traktowa przy poziomie bezpiecze stwa biologicznego 2 Wi kszo roztwor w zestawu zawiera ProClin 300 jako rodek konserwuj cy Nigdy nie pipetowa ustami i nie dopu ci aby odczynniki lub pr bki pacjenta zetkn y si ze sk r Odczynniki zawieraj ce ProClin 300 mog dzia a dra ni co Unika kontaktu ze sk r i oczami W przypadku kontaktu sp uka du ilo ci wody Roztw r zatrzymuj cy zawiera 0 5 M kwasu siarkowego Nie dopuszcza aby odczynniki zetkn y si ze sk r St enia chromograniny A w danej pr bce badanej za pomoc test w r nych producent w mog r ni si ze wzgl du na r nice metod test w oraz swoisto odczynnik w Wszystkie odpady nale y traktowa jako odpady niebezpieczne Karty charakterystyki dl
112. rper der Maus erhalten haben oder Patienten die auf andere Weise gegen Immunglobine der Maus exponiert waren k nnen humane Anti Maus Antik rper HAMA bilden Diese Antik rper k nnen 41 K2378 E 23 0196 07DA Tests die monoklonale Antik rper von der Maus verwenden st ren und falsch erh hte Werte verursachen Erwartete Ergebnisse Es wird empfohlen dass jedes Labor mit den am h ufigsten verwendeten Proben seinen eigenen Referenzbereich erstellt da Unterschiede in der Probenhandhabung die Ergebnisse beeinflussen k nnen Es sollte wie oben beschrieben eine konseguente Handhabung der Proben eingehalten werden Die unten angegebenen Werte sind ein Hinweis auf den erwarteten Referenzbereich und wurden als das 97 5 Percentil von 126 Proben von Blutspendern 63 M nner und 63 Frauen errechnet Referenzbereich von Chromogranin A Heparinplasma lt 108 ng ml bzw lt 3 0 nmol l bzw lt 35 U L Nachweisgrenze Die Nachweisgrenze dieses Assays betr gt 19 ng ml bzw 0 54 nmol l bzw 6 U L Das ist die kleinste nachweisbare Konzentration die mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 von null abweicht Das bedeutet dass bis zu diesem Messpunkt sogar bei negativen Proben zuverl ssige Messungen erzielt werden k nnen Die Berechnung wurde gemaB der NCCLS Richtlinie EP17 A Vol 24 No 34 durchgef hrt Tumorunabhangige Erh hung des Chromogranin A Erh hte Chromogranin A Spiegel k nnen bei Patienten mit eingeschr nkter Nier
113. s fragments Journal of Endocrinology 1993 139 329 337 5 Stridsberg M Oberg K Li A Engstr m U e Lundqvist G Measurements of chromogranin A chromogranin B secretogranin chromogranin C secretogranin II and pancreastatin in plasma and urine from patients with carcinoid tumours and endocrine pancreatic tumours Journal of Endocrinology 1995 144 49 59 6 Stridsberg M Measurements of chromogranins and chromogranin related peptides by immunological methods Advanced Experimental and Medical Biology 2000 482 319 327 7 Winkler H and Fischer Colbrie R The chromogranin A and B The first 25 years and future perspectives Neuroscience 1992 49 497 528 96 K2378 E 23 0196 07DA EXPLICAC O DOS SIMBOLOS Antig nio placa revestida DIL Diluente o o z c Tamp o conjugado CONJ 100X HRP conjugado conc 100 vezes 3 gt o I N x 0 Tamp o de lavagem concentrado 20x U Soluc o TMB soluc o substrato cido sulf rico 0 5 molar soluc o de paragem Calibrador liofilizado CONTROL Controlo baixo liofilizado CONTROL H LYO Controlo alto liofilizado 97 K2378 E 23 0196 07DA O N mero do lote N mero de cat logo Utilizar at s lt EO 8 o Limite de temperatura Risco biol gico is Consultar as instruc es de utilizac o lt U Disposi
114. s con ensayos de diferentes fabricantes pueden variar debido a las diferencias en los m todos de ensayo y la especificidad de los reactivos Todos los residuos deben manipularse como residuos peligrosos Pueden solicitarse a Dako Dinamarca A S las hojas de datos de seguridad del material para todos los componentes peligrosos contenidos en este kit CONJ 100X Atenci n Contiene ProClin 300 Masa de reacci n de 5 chloro 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 247 500 7 and 2 methyl 4 isothiazolin 3 one EC no 220 239 6 3 1 H317 Puede provocar una reacci n al rgica en la piel P264 L vese bien las manos despu s de manipular P280 Llevar guantes prendas gafas m scara de protecci n P302 352 ENCASO DE CONTACTO CON LA PIEL Lavar con agua y jab n abundantes P333 313 En caso de irritaci n o erupci n cut nea Consultar a un m dico RECOGIDA DE MUESTRAS El CgAnalyze Kit se recomienda para plasma con suero EDTA heparina Manipule como si fuera capaz de transmitir agentes infecciosos Las muestras se separan mediante centrifugaci n y se pueden conservar a 2 8 durante hasta 7 d as Si las muestras se van a conservar durante per odos m s largos conservar a 20 C o m s fr o Las muestras pueden someterse a tres ciclos de congelaci n descongelaci n sin deteriorarse No utilice un congelador sin escarcha porque puede permitir a las muestras pasar por ciclos de congelaci n descongelaci n y degradar
115. s na tabela abaixo Utilizou se para a convers o o peso molecular do fragmento de origem da cromogranina A 36 kDa Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 3 000 2 500 E Calibrador ng ONA UIL Absorvencia i A 1 0 0 0 0 094 1000 2 36 1 12 0 209 lt 0300 3 180 5 58 0 678 s d 4 540 15 174 1 599 o IN 5 1080 30 348 2 259 6 1800 50 581 2 735 ER Chromogranin A nmol L Chromogranin A U L Uma amostra com um valor de absorvencia de 1 272 apresentar no eixo X o valor de 367 ng ml ou 10 2 nmol l ou 118 U L de cromogranina A Aplicou se neste exemplo um ajuste a curva logistica de 4 parametros Importante A curva um exemplo e n o deve ser utilizada para efectuar a interpretac o efectiva de amostras dos pacientes Controlo da Qualidade A informac o de saida OD do calibrador 1 deve ser lt 0 15 A informac o de saida OD do calibrador 6 deve ser gt 1 0 Para determinar os valores dos controlos Baixo e Alto consultar o certificado do lote Os controlos servem para monitorizar casos de falha consider vel do reagente No caso de quaisquer dos valores de controlo nao se enquadrarem dentro das suas respectivas amplitudes a an lise deve ser considerada inv lida e deve ser repetida Podem analisar se controlos adicionais de acordo com as directrizes ou reguisitos dos regulamentos locais regionais e ou nacionais ou das organizac
116. solution Lyophilised calibrator Lyophilised Low control Lyophilised High control 11 K2378 E 23 0196 07DA O Batch code Catalogue number Use by date so EO 8 o Temperature limitation 30 Biological risk la 6 Consult instructions for use lt U In vitro diagnostic medical device Manufacturer Warning o E o o Contains sufficient for 96 tests M TN Conformity to 98 79 EC on In Vitro Diagnostic Medical Device Directive 12 K2378 E 23 0196 07DA Cg Analyze Kit FRANCAIS INDICATIONS Le Kit CgAnalyze est un dosage avec immunoadsorbant lie a une enzyme ELISA concu pour la d tection et la quantification de la chromogranine A dans le plasma ou le s rum humain Les r sultats du dosage peuvent tre utilis s pour aider au diagnostic des tumeurs neuroendocrines TNE s cr tant de la chromogranine A telles que les ph ochromocytomes et les carcinoides Le dosage est indiqu chez les patients pr sentant des signes et sympt mes correspondant aux TNE II n est pas indigu pour le d pistage des populations saines La r alisation de cette analyse est exclusivement r serv e aux professionnels de laboratoire qualifi s A UTILISER EN DIAGNOSTIC IN VITRO RESUME ET EXPLICATION Les chromogranines et les s cr togranines constituent une famille de prot ines particuli rement acides qui sont
117. son tumores neuroendocrinos t picos los tumores carcinoides los feocromocitomas los neuroblastomas los c nceres de pulm n de c lulas peque as los adenomas hiperparatiroideos los tumores hipofisarios y los tumores de los islotes pancre ticos incluyendo los s ndromes MEN1 y MEN2 Esto incluye tambi n los diferentes s ndromes de tumores neuroendocrinos como los gastrinomas los insulinomas los glucagonomas los somatostatinomas los PPomas y los tumores neuroendocrinos no funcionantes Eriksson B et al 2000 Para todos los tumores neuroendocrinos se ha demostrado que la cromogranina A es el mejor marcador circulante Bajetta E et al 1999 Principios de funcionamiento de CgAnalyze Kit Se diluyen 5x en diluyente en una placa de diluci n los calibradores los controles y las muestras del paciente El material diluido se transfiere a los pocillos de microt tulos y se incuban a temperatura ambiente durante 60 minutos Durante esta primera incubaci n un anticuerpo monoclonal captura la cromogranina A en la superficie del pocillo Despu s del lavado para eliminar el material no unido se a ade un segundo anticuerpo monoclonal marcado con peroxidasa de r bano HRP para detectar la cromogranina A unida al pocillo Despu s de 30 minutos de incubaci n se lavan de nuevo los pocillos antes de a adir e incubar un sustrato de color El desarrollo del color se detiene despu s de 15 minutos y el color se mide en un espectrofot metro E
118. sultados Deve adoptar se uma rotina muito estrita para manuseamento das amostras conforme recomendado acima Os valores abaixo indicados servem como indicac o da amplitude de refer ncia prevista e calculada como sendo o 97 5 percentil de 126 amostras de plasma heparinizado de doadores de sangue 63 homens e 63 mulheres N vel da amplitude de refer ncia da cromogranina A lt 108 ng ml ou 3 0 nmol l ou 35 U L Limite de Detecc o O limite de detecc o deste ensaio de 19 ng ml ou 0 54 nmol l ou 6 U L Esta concentrac o a mais baixa detect vel que difere de zero com uma probabilidade de 95 Isto significa que se podem tirar medidas fi veis at este ponto m nimo mesmo em amostras negativas O c lculo foi efectuado de acordo com a directriz EP17 A vol 24 n 34 do NCCLS Aumento da cromogranina A n o associado presenca de um tumor Pode verificar se um aumento do n vel de cromogranina A em pacientes com uma diminuic o da func o renal pacientes com gastrite atr fica e pacientes em tratamento cont nuo com f rmacos inibidores da bomba de prot es 92 K2378 E 23 0196 07DA CARACTERISTICAS DE DESEMPENHO Quadro 1 Sensibilidade clinica e especificidade Sensibilidade cl nica Analisaram se ao todo 107 amostras de plasma heparina com caracterizac o cl nica O quadro que se segue apresenta um resumo dos resultados Cabos de desncas N mero Positivo Negativo Sensi
119. t f r die Auswertung von Patientenproben verwendet werden Qualitatskontrolle Die OD f r Kalibrator 1 muss lt 0 15 liegen Die OD f r Kalibrator 6 muss gt 1 0 liegen F r die Werte der niedrigen und hohen Kontrolle siene Chargenzertifikat Die Kontrollen dienen zur Uberwachung von Reagenzienversagen erheblicher Natur Sollten sich Kontrollwerte auBerhalb ihres entsprechenden Bereichs befinden ist der Test ung ltig und muss wiederholt werden Zus tzliche Kontrollen k nnen nach den Richtlinien oder Vorschriften regionaler und oder staatlicher Verordnungen bzw von Zulassungsorganisationen analysiert werden Siehe NCCLS C24 A f r Informationen ber entsprechende Verfahren zur Qualit tskontrolle Hook Effekt Beim Testen von Konzentrationen Chromogranin A bis zu 360 000 ng ml bzw 10 000 nmol l 116 000 U L konnte kein Hook Effekt beobachtet werden EINSCHR NKUNGEN Der Chromogranin A Spiegel eines einzelnen Patienten alleine kann nicht als Ma der Krankheitsschwere gelten F r eine klinische Therapie darf dieser Test alleine keine Entscheidungsgrundlage bilden sondern muss immer zusammen mit klinischen Symptomen und Ergebnissen anderer verf gbarer Tests gesehen werden Interferenz Bei Versetzen von Plasmaproben mit Bilirubin F 208 mg l Bilirubin C 200 mg l h molytischem Hamoglobin 4 84 g l oder Chylus 1430 FTU wurden keine Interferenzen festgestellt Personen die zur Behandlung oder Diagnose Anti Human Antik
120. te n ch vzork pacient 65 K2378 E 23 0196 07DA Kontrola kvality OD pro kalibr tor 1 by m la b t lt 0 15 OD pro kalibr tor 6 by m la b t gt 1 0 Hodnoty pro kontrolu s n zkou a s vysokou hodnotou koncentrace analytu jsou uvedeny v certifik tu ar e Tyto kontroly slou ke zji t n zda nedo lo k v znamn mu selh n reagencie Pokud jak koli hodnota n kter z kontrol nen v p slu n m rozmez test je nutn pova ovat za neplatn a zopakovat Podle pokyn nebo po adavk m stn ch st tn ch a nebo feder ln ch p edpis i akredita n ch organizac mohou b t testov ny i dal kontroly Pokyny k p slu n m postup m kontroly kvality uv d dokument NCCLS C24 A inek vysok koncentrace tzv Hook efekt P i testov n koncentrac chromograninu A do 360 000 ng mL nebo 10 000 nmol L nebo 116 000 U L nebyl pozorov n dn inek vysok koncentrace Hook efekt OMEZEN Samotn hladina chromograninu A nem e b t u jednotliv ch pacient pou v na jako m tko z va nosti onemocn n Na tento test nelze spol hat jako na jedin podklad p i rozhodov n o klinick l b ale mus b t pou v n v kombinaci s daji o klinick ch p znac ch a v sledky jin ch dostupn ch test Interference U vzork plazmy s p davkem bilirubinu F 208 mg L bilirubinu C 200 mg L hemolytick ho hemoglobinu 4 84 g L nebo chylu 14
121. tivos m dicos para diagn stico in vitro Fabricante Atenc o JE o Cont m o suficiente para 96 testes M M Conformidade com In Vitro Diagnostic Directive 98 79 EC Diretiva de Dispositivos M dicos E EURO DIAGNOSTICA AB Lundav gen 151 SE 212 24 Malm Sweden Phone 46 40 53 76 00 Fax 46 40 43 22 88 E mail info eurodiagnostica com www eurodiagnostica com 98
122. tr tu Kyselina s rov 0 5mol rn zastavovac roztok O d r lt o Lyofilizovan kalibr tor CONTROL Lyofilizovan kontrola s n zkou koncentrac analytu CONTROL H LYO Lyofilizovan kontrola s vysokou koncentrac analytu 72 K2378 E 23 0196 07DA O K d ar e Katalogov slo Datum pou itelnosti so EO 8 o Teplotn omezen 30 Biologick rizika la 6 Viz n vod k pou it lt U Diagnostick zdravotnick prost edek in vitro V robce Varov n do E o Obsah dosta uje pro 96 test M M Shoda se sm rnic 98 79 ES o diagnostick ch zdravotnick ch prost edc ch in vitro 73 K2378 E 23 0196 07DA Zestaw CgAnalyze POLSKI PRZEZNACZENIE Zestaw CgAnalyze to test immunoenzymatyczny ang enzyme linked immunosorbent assay ELISA do wykrywania i oznaczania ilo ciowego chromograniny A w ludzkim osoczu i surowicy Wyniki testu mog by stosowane we wspomaganiu diagnostyki guz w neuroendokrynnych ang neuroendocrine tumour NET wydzielania chromograniny A takich jak barwiaki i rakowiaki Test jest przeznaczony do stosowania u pacjent w z objawami podmiotowymi i przedmiotowymi NET Nie jest ono przeznaczone do bada przesiewowych populacji zdrowej Analiza powinna by wykonywana wy cznie przez przeszkolony personel laboratoryjny WY
123. tumours Digestion 2000 62 33 38 O Connor D T and Deftos L J Secretion of chromogranin A by peptide producing endocrine neoplasms New England Journal of Medicine 1986 314 1145 1151 Stridsberg M Hellman U Wilander E Lundavist G Hellsing K and berg K Fragments of chromogranin A are present in the urine of patients with carcinoid tumours Development of a specific radioimmunoassay for chromogranin A and its fragments Journal of Endocrinology 1993 139 329 337 Stridsberg M Oberg K Li A Engstr m U and Lundqvist G Measurements of chromogranin A chromogranin B secretogranin chromogranin C secretogranin II and pancreastatin in plasma and urine from patients with carcinoid tumours and endocrine pancreatic tumours Journal of Endocrinology 1995 144 49 59 Stridsberg M Measurements of chromogranins and chromogranin related peptides by immunological methods Advanced Experimental and Medical Biology 2000 482 319 327 Winkler H and Fischer Colbrie R The chromogranin A and B The first 25 years and future perspectives Neuroscience 1992 49 497 528 10 K2378 E 23 0196 07DA EXPLANATION OF SYMBOLS Antigen coated plate DIL Diluent o o z c Conjugate buffer CONJ 100X Conjugate HRP 100x conc 3 gt o I N x 0 Wash buffer 20x concentrate U Solution TMB substrate solution Sulphuric Acid 0 5 molar stop
124. ue should be reported as gt 1800 ng mL or diluted further with assay diluent and re assayed In this case the compensation for the dilution must be made in the calculation of the chromogranin A concentration Please note in the event of calibrator 1 or calibrator 6 values are out of range the test should be considered invalid and repeated For convenience concentrations can be calculated in ng mL nmol L or U L Units are given in the table below The molecular weight of the native fragment of chromogranin A 36kDa was used for the conversion Stridsberg M et al 1993 Stridsberg et al 1995 Calibrator Concentration Absorbance 2500 ng mL nmol L U L 5 1 0 0 0 0 094 om 2 36 1 12 0 209 oo 3 180 5 58 0 678 a 4 540 15 174 1 599 ye 5 1080 30 348 2 259 o E 6 1800 50 581 2 735 en u T Chromogranin A ng mL Chromogranin A nmol L Chromogranin A U L 1800 581 A sample with an absorbance value of 1 272 will read on the X axis as having 367 ng mL or 10 2 nmol L or 118 U L of chromogranin A In this example a four parameter logistic curve fit has been applied Important The curve is an example and should not be used for actual patient sample interpretation K2378 E 23 0196 07DA Quality Control The OD for calibrator 1 should be be lt 0 15 The OD for calibrator 6 should be gt 1 0 The values of Low and High controls see lot certificate The controls are int
125. uzir o per odo de tempo 4 Via ptica n o limpa 4 Verificar se os po os cont m bolhas de ar Limpar o fundo da placa e ler novamente 95 K2378 E 23 0196 07DA 5 Lavagem n o consistente bolhas 5 Verificar se todos os po os est o cheios presas solu o de lavagem e se foram uniformemente aspirados permaneceu dentro dos po os Administrar o l quido acima do n vel de reagente no po o Ap s a ltima lavagem esvaziar os po os batendo com a placa em papel absorvente 6 Pipetagem inadequada 6 Evitar a forma o de bolhas de ar nas pontas das pipetas REFER NCIAS 1 Bajetta E Ferrari L Martinetti A Celio L Procopio G Artale S Zilembo N Di Bartolomeo M Seregni E e Bombardieri E Chromogranin A neuron specific enolase carcinoembryonic antigen and hydroxyindole acetic acid evaluation in patient with neuroendocrine tumours Cancer 1999 86 858 865 2 Eriksson B Oberg K e Stridsberg M Tumour markers in neuroendocrine tumours Digestion 2000 62 33 38 3 O Connor D T e Deftos L J Secretion of chromogranin A by peptide producing endocrine neoplasms New England Journal of Medicine 1986 314 1145 1151 4 Stridsberg M Hellman U Wilander E Lundqvist G Hellsing K e berg K Fragments of chromogranin A are present in the urine of patients with carcinoid tumours Development of a specific radioimmunoassay for chromogranin A and it
126. ych Obliczenia przeprowadzono zgodnie z wytycznymi dokumentu EP17 A tom 24 nr 34 NCCLS Niezwi zane z guzami wzrosty st enia chromograniny A Podwy szone st enia chromograniny A mog wyst powa u pacjent w o obni onej czynno ci nerek z zanikowym zapaleniem o dka i u pacjent w z trwaj cym leczeniem za pomoc inhibitor w pompy protonowej 79 K2378 E 23 0196 07DA CHARAKTERYSTYKA ANALITYCZNA Tabela 1 Czu o i swoisto kliniczna Czu o kliniczna Oznaczono charakterystyk kliniczn cznie 107 pr bek osocza heparynowego Wyniki zebrano w poni szej tabeli Grupy chorobowe Liezba Dodatnie Ujemne Czu o py ca kowita gt 3 0 nmol l lt 3 0 nmol l ECL 4 3 1 75 EPT 30 19 11 63 FGC 10 7 3 70 LC 9 4 5 44 MGC 47 28 19 60 NE Diff 6 2 4 33 Przyzwojak 1 1 0 100 ECL Guzy enterochromafino podobne EPT Guzy endokrynne trzustki FGC Rakowiak przedniej cz ci prajelita LC Rakowiak p uca MGC Rakowiak jelita rodkowego NE Diff R nicowanie neurokrynne Swoisto Oznaczono 126 pr bek osocza heparynowego od zdrowych krwiodawc w 126 pr bek by o ujemnych 126 126 100 95 CI 97 1 100 95 przedzia ufno ci ang confidence interval CI obliczono wykorzystuj c metod cis Tabela 2 Precyzja miedzyoznaczeniowa zosta a oznaczona poprzez badanie sze ciu r nych pr bek w o miu powt rzeniach w trzech r nyc
127. z ej kolejno ci jest poza zakresem 2 _ Nieprawid owe pipetowanie Test niewa ny Powt rzy test Warto ci 1 Nieprawid owa temperatura Sprawdzi czy czas i temperatura byty kontroli poza czasy lub pipetowanie prawid owe Patrz S aba precyzja zakresem odczynniki nie s poni ej wymieszane Powt rzy test 2 Zanieczyszczenie krzy owe Uwa nie pipetowa kontroli 3 Nieprawid owe rozcie czenie Powt rzy test 4 cie ka optyczna nie jest czysta Sprawdzi wyst powanie zabrudze lub p cherzyk w powietrza w studzienkach Wytrze sp d p ytki i ponownie odczyta Wszystkie 1 Nie dodano jednego lub wi cej Ponownie sprawdzi procedur testy odczynnik w lub dodano je w Sprawdzi pod k tem niezu ytych daj wynik z ej kolejno ci odczynnik w pusty Powt rzy test 2 Nieaktywna p ytka powlekana Sprawdzi czy w nieu ywanych p ytkach nie ma wilgoci Wytrze sp d p ytki i ponownie odczyta Wszystkie 1 Zanieczyszczone bufory lub Sprawdzi wszystkie odczynniki pod testy odczynniki katem zmetnienia lub nieprzyjemnego daja wyniki zapachu te 2 Zanieczyszczony roztw r U y czystego pojemnika Sprawdzi p ucz cy jako roztworu wodnego u ytego do przygotowywania 3 Nieprawid owe rozcie czenie Powt rzy test surowicy Maksymalne 1 Zbyt wysokie temperatury Zmniejszy czas inkubacji substratu OD jest inkubacji u ycie metody podwy szone zautomatyzowanej
128. zer o rastreio de uma populac o saud vel A an lise deve ser efectuada por pessoal de laborat rio com a devida formac o PARA UTILIZAGAO DIAGN STICA IN VITRO RESUMO E EXPLICACAO As cromograninas e as secretograninas constituem uma familia de proteinas singularmente acidas que s o armazenadas em conjunc o com os neurotransmissores e as hormonas p ptidas no c rebro e sistema neuroend crino difuso Winkler H e Fischer Colbrie R 1992 Estruturalmente estas prote nas s o produtos de diferentes genes mas t m em comum algumas propriedades gerais como uma abundancia de residuos cidos de amino cidos bem como v rios pares de amino cidos b sicos como posic es potenciais para a clivagem p s translacional As cromograninas s o co armazenadas e co libertadas com os neurop ptidos e com as hormonas nas c lulas neuroend crinas espalhadas pelo corpo Uma das fung es das cromograninas a gerac o de granulos hormonais tendo j sido sugerido o empacotamento de hormonas Al m disso as cromograninas podem ser clivadas resultando em fragmentos mais peguenos gue podem exibir actividades biol gicas como a inibic o da libertac o hormonal a vasodilatac o e efeitos anti microbiol gicos Stridsberg M 2000 Os tumores de origem neuroend crina apresentam se normalmente com niveis mais elevados de cromogranina A no soro plasma O Connor DT Deftos LJ 1986 Os tumores neuroend crinos s o derivados das c lulas neuroend crinas
129. ziert wird das Chromogranin durch den Vergleich mit der Farbentwicklung der Kalibratorproben 37 K2378 E 23 0196 07DA Der Kalibrator des Kits ist ein synthetisches Peptid dass dem Chromogranin A entspricht Der Peptidkalibrator ist so eingestellt dass seine Reaktion der eines gereinigten nativen Fragments Chromogranin A entspricht Stridsberg M u a 1993 Stridsberg u a 1995 WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN In vitro Diagnostikum Die Assay Reagenzien enthalten keine Humanserumkomponenten doch m ssen die Patientenplasmen wie potenziell infekti ses Material behandelt werden Die Centers for Disease Control and Prevention und das National Institutes of Health empfehlen potenziell infekti se Materialien nach Biosafety Level 2 zu behandeln Die meisten Kit L sungen enthalten als Konservierungsmittel ProClin 300 Niemals mit dem Mund pipettieren oder Reagenzien bzw Patientenproben mit der Haut in Ber hrung bringen ProClin 300 haltige Reagenzien k nnen reizend sein Kontakt mit Haut und Augen vermeiden Bei eventuellem Kontakt mit viel Wasser sp len Die Stoppl sung enthalt 0 5 M Schwefels ure Hautkontakt mit dem Reagenz vermeiden Die Konzentrationen Chromogranin A bestimmter Proben die mit Tests anderer Hersteller bestimmt wurden k nnen aufgrund unterschiedlicher Testmethoden und Reagenzienspezifit t voneinander abweichen Samtlicher Abfall ist als gef hrlicher Abfall zu behandeln Sic

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