PathoDx Chlamydia Culture Confirmation Kit [FR]
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1. chantillons du transport de la technique de culture des tissus et de a pr paration des lames 2 Le kit PathoDx Chlamydia Culture Confirmation a t test uniquement pour une utilisation lors de la d tection et de l identification de Chlamydia dans des cultures de tissus 3 Aucune donn e n est disponible concernant les performances du kit PathoDx Chlamydia sur des chantillons de patients recueillis pendant ou apr s un traitement antibiotique 4 Les monocouches cellulaires doivent demeurer humides toutes les tapes de la proc dure de confirmation par culture 5 Le r actif de travail R actif de confirmation de la chlamydia est pr t l emploi et est optimis pour d tecter les esp ces connues de Chlamydia Une dilution ou toute autre alt ration du r actif de travail peut provoquer une perte de sensibilit 6 Ce test ne permet pas de diff rencier les esp ces de Chlamydia ou les s rovars de Chlamydia trachomatis 11 CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE Essais cliniques Les valuations cliniques ont t men es dans deux laboratoires ind pendants pour comparer les performances du kit PathoDx Chlamydia Culture Confirmation celles du C trachomatis Culture Confirmation Test MicroTrak Chaque site d investigation a analys des chantillons cliniques n ayant pas t diagnostiqu s auparavant mis en culture cellulaire monocouche McCoy 35 C Les monocouches ont ensuite t fix es color2. PathoDx Chlamydia Culture Confirmation Kit FR R62210 REF 1 DOMAINE D APPLICATION PathoDx Chlamydia Culture Confirmation est un test d immunofluorescence con u pour la d tection et l identification du genre Chlamydia apr s prolif ration dans une culture de tissus 2 RESUME ET EXPLICATION DU TEST Les chlamydiae sont les agents tiologiques les plus courants dans les maladies sexuellement transmissibles Les chlamydiae sont des organismes intracellulaires obligatoires non mobiles dont les parois cellulaires sont similaires celles des bact ries Gram n gatif Le genre Chlamydia se divise en trois esp ces C trachomatis C psittaci et C pneumoniae qui ont tous en commun un antig ne de type lipopolysaccharide LPS 15 C trachomatis provoque des infections graves et souvent asymptomatiques chez l homme Chez la femme il est souvent responsable de la cervicite ou de la maladie inflammatoire pelvienne MIP 3 chez l homme de lur trite non gonococcique et de l pididymite 2 ainsi que de la conjonctivite inclusions et de la pneumonie chez le nouveau n 1 C psittaci est essentiellement un agent pathog ne animal mais il peut provoquer des infections chez l homme g n ralement suite une exposition des esp ces aviaires infect es C pneumoniae est une esp ce r cemment d crite comme responsable d infections respiratoires aigu s notamment la pneumonie Les chla
3. es et examin es conform ment aux proc dures indiqu es dans les notices PathoDx et MicroTrak correspondantes Au total 250 chantillons cliniques ont t analys s Sur le site num ro un 87 chantillons pr lev s au niveau du col de l ut rus et 13 chantillons pr lev s au niveau de l ur tre ont t recueillis sur un couvillon chez 100 adolescents ayant une vie sexuelle active g s de 12 20 ans Parmi ces 100 adolescents la pr valence d infection aux chlamydiae tait de 24 Sur le site num ro deux 98 et 52 chantillons ont t pr lev s chez des adultes respectivement au niveau du col de l ut rus et de l ur tre Parmi ces 150 adultes la pr valence de l infection aux chlamydiae tait de 39 Les r sultats combin s des deux sites apparaissent ci dessous Dans l ensemble le test PathoDx tait sensible 100 et sp cifique 100 Sp cificit Pour tablir la r activit sp cifique du genre du r actif de confirmation de la chlamydia PathoDx des esp ces connues du genre Chlamydia notamment C psittaci et les 15 s rovars connus de C trachomatis ont t test s Toutes les esp ces de Chlamydia ont pr sent une coloration la fluoresc ine Afin de v rifier la sp cificit du kit PathoDx Chlamydia Culture Confirmation des organismes bact riens fongiques et viraux ont t test s pour d terminer la r activit crois e voir tableau ci dessous Les micro organi
4. m lang s de grands volumes d eau Il est pr f rable d utiliser des canalisations sans cuivre et sans plomb 2 chantillons cliniques Les pr cautions de s curit adapt es doivent tre respect es lors de la manipulation et du traitement des chantillons cliniques car ils peuvent contenir des organismes vivants pathog nes Les bonnes pratiques de laboratoire doivent tre suivies lors de la manipulation des cultures pouvant contenir des virus infectieux 3 D chets St riliser tous les d chets avant de les jeter en suivant les proc dures propres au laboratoire et les r glementations locales 4 Pr sence du colorant bleu Evans dans le r actif Bien que le produit soit en concentrations inf rieures celles qui requi rent qu on le classe comme canc rog ne viter tout contact avec la peau PRECAUTIONS D ANALYSE Ce produit ne doit pas tre utilis si 1 la couleur du r actif a chang 2 la date de p remption est d pass e ou 3 s il pr sente d autres signes de d t rioration 6 PRELEVEMENT CONSERVATION ET TRANSPORT DES ECHANTILLONS Pr l vement et culture des chantillons Pr lever les chantillons du patient de mani re appropri e selon le site anatomique infect les placer dans un milieu de transport adapt et les envoyer au laboratoire pour analyse Le milieu de transport ne doit pas inhiber la croissance de Chlamydia spp ou des cellules en culture Inoculer une monocouche d
5. 2 17 Laboratory Update Isolation of Chlamydia trachomatis in Cell Culture 1980 U S Dept H H S CDC 80 109 18 Rothermel C P et al 1989 Abstracts of the 89 Annual Meeting of the American Society for Microbiology ASM Washington D C CONDITIONNEMENT R622 0kcsnin enana 100 tests kit L gende des symboles Num ro de r f rence Limite de temp rature Code de lot A utiliser avant le PathoDx est une marque de commerce d pos e de Remel Inc ATCC est une marque de commerce d pos e d American Type Culture Collection MicroTrak est une marque de commerce d pos e de PLC de Biotech de trinit IFU X7784 r vis Novembre 2012 ml Remel Europe Ltd Clipper Boulevard West Crossways Dartford Kent DA2 6PT UK Pour obtenir une assistance technique contacter le distributeur local
6. Amener le r actif temp rature ambiante entre 15 et 28 C avant utilisation et bien m langer en retournant doucement le flacon Les anticorps monoclonaux sont pr ts l emploi Aucune dilution suppl mentaire n est n cessaire CONFIRMATION R actif de confirmation de la chlamydia Un flacon compte gouttes en plastique contenant 5 5 ml d anticorps monoclonaux murins purifi s marqu s la fluoresc ine du contre colorant bleu d Evans un inhibiteur de coloration non sp cifique et 0 098 d azide de sodium dans une solution tampon stabilis e avec des prot ines MOUNTING FLUID Fluide de montage Un flacon compte gouttes en plastique contenant 5 0 ml de liquide de montage compos de glyc rol tamponn avec 0 01 d azide de sodium comme conservateur 5 PRECAUTIONS ET RESTRICTIONS D EMPLOI Les r actifs sont destin s exclusivement au diagnostic in vitro R serv un usage professionnel Pour obtenir des informations sur les composants potentiellement dangereux se r f rer la fiche de s curit fournie par le fabricant et l tiquetage du produit INFORMATIONS DE SECURITE f azide de sodium moins de 0 1 a t ajout aux r actifs comme agent antibact rien Pour pr venir laccumulation d azides m talliques explosifs dans les canalisations en plomb et en cuivre les r actifs ne doivent tre d vers s dans le syst me d gouts que s ils sont dilu s et
7. coccus aureus Cowan Staphylococcus epidermidis PN 5204 Streptococcus agalactiae 090R Streptococcus pyogenes ATCC 10389 12 BIBLIOGRAPHIE 1 Beem M O and E M Saxon 1977 N Engl J Med 296 306 310 2 Bowie W R W San Pin E R Alexander J Floyd P S Forsyth H M Pollock J L Lin T M Buchanan and K K Holmes 1977 J Clin Invest 59 735 742 3 Brunham R C I W Maclean B Binns and R W Peeling 1985 J Infect Dis 152 1275 1282 4 Curran J W 1980 Amer J Obstet Gynecol 138 848 851 Hammerschlag M R M Anderda D Z Semine D McComb and W M McCormack 1979 Pediatrics 64 142 148 6 uo C S P Wand B B Wentworth and J T Grayston 1972 J Infect Dis 125 665 668 F rieg N R and J G Holt 1984 Bergey s Manual of Systematic Bacteriology Vol 1 Williams and Wilkins Baltimore MD 8 Paavonen J et al 1978 J Clin Invest 59 735 742 9 Ripa K T and P Mardh 1977 J Clin Microbiol 6 328 331 10 Sabet S F J Simmons and H D Caldwell 1984 J Clin Microbiol 20 217 222 11 Sawicki L 1980 Lab Man 18 11 42 47 12 Schachter J 1978 N Engl J Med 298 428 435 490 495 540 549 13 Schachter J and H D Caldwell 1980 Ann Rev Microbiol 34 285 309 14 Sierra M F et al 1988 Lab Med 19 311 314 15 Thompson S E and A E Washington 1983 Epidemiologic Rev 5 96 123 16 Westrom L 1980 Amer J Obstet Gynecol 138 880 89
8. e cellules McCoy ou HeLa 229 avec l chantillon du patient selon une m thode approuv e 111 La coloration peut tre effectu e 48 heures apr s l inoculation En compl ment de chaque lot d chantillons de patients il est recommand de traiter les cellules infect es par la Chlamydia et les cellules en culture non infect es comme contr les positif et n gatif Les chantillons peuvent tre conserv s entre 2 et 8 C pendant 24 heures maximum apr s le pr l vement sans perte cons quente du pouvoir infectieux Pour de meilleurs r sultats il est recommand de traiter les chantillons imm diatement Une conservation de plus de 24 heures requiert une temp rature ne d passant pas 70 C Au cours du transport conserver l chantillon la m me temp rature que celle utilis e pour la conservation 7 PROCEDURE MATERIEL FOURNI Le kit Chlamydia Culture Confirmation R62210 permet la r alisation de 100 tests voir Contenu du kit MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI 1 Microscope fluorescence avec le syst me de filtre adapt l isothiocyanate de fluoresc ine longueur d onde d excitation maximum 490 nm mission maximum 520 nm objectifs grossissants de 100X et de 400 500X Eau d min ralis e ou PBS 0 05 M Gros couvillons en coton ou en polyester pour nettoyer l exocol 4 couvillons de pr l vement st riles qui n inhibent pas la prolif ration de Chlamydia spp Mil
9. ect es comme contr les positif et n gatif respectivement afin de v rifier les performances du microscope du syst me de culture et des r actifs Les r sultats du test sont acceptables uniquement si les cellules de culture infect es par la Chlamydia contiennent elles aussi des inclusions apparaissant en fluorescence vert brillant par rapport une monocouche contre color e en rouge fonc et si les cellules non infect es ne pr sentent pas d inclusions vert brillant 9 INTERPRETATION R sultats positifs Les cultures fix es et color es qui sont positives aux chlamydiae contiennent des inclusions qui apparaissent en fluorescence vert pomme contre des cellules en monocouche contre color es en rouge fonc La taille des inclusions varie en fonction des conditions de culture et du s rovar La pr sence d une inclusion suffit donner un r sultat positif Des exemples d inclusions de chlamydiae color es la fluoresc ine peuvent tre consult s dans les publications scientifiques Cependant selon les anticorps monoclonaux marqu s la fluoresc ine le motif de fluorescence peut varier R sultats n gatifs Les cultures fix es sont consid r es comme n gatives lorsqu aucune inclusion vert brillant n est d tect e dans la monocouche de cellules contre color es en rouge fonc 10 LIMITES 1 La d tection des Chlamydiae dans les chantillons mis en culture d pend de la qualit du pr l vement des
10. et ou les corps l mentaires dans des monocouches cellulaires 48 heures apr s l inoculation d un chantillon clinique Les anticorps monoclonaux marqu s la fluoresc ine reconnaissent les deux prot ines majeures de membrane externe MOMP de tous les s rovars de C trachomatis et les lipopolysaccharides LPS de Chlamydia sp cifiques au genre Lorsque le conjugu d anticorps est ajout une lamelle de protection contenant des cellules de culture tissulaire fix es l thanol le r actif se lie de mani re sp cifique aux inclusions de chlamydiae pr sentes dans les cellules Une tape de lavage permet d liminer le conjugu d anticorps non li Lorsque la lamelle de protection color e est examin e au microscope fluorescence de grosses inclusions brillantes de couleur vert pomme sont observ es dans les cellules infect es sur un fond de cellules contre color es en rouge 4 REACTIFS CONTENU DU KIT Chlamydia Culture Confirmation Kit 1 R actif de confirmation de la chlamydia 100 tests R62210 1 flacon compte gouttes bouchon turquoise 1 flacon compte gouttes bouchon noir EA Mode d emploi 1 2 Fluide de montage R62230 DESCRIPTION PREPARATION POUR UTILISATION ET CONDITIONS DE CONSERVATION RECOMMANDEES Se r f rer galement au paragraphe Pr cautions et restrictions d emploi 8C 2 C Conserverentre2et8 C Ne pasutiliser apr sla date de p remption indiqu e sur l emballage
11. ieu de transport pour Chlamydia Milieu d isolement de Chlamydia contenant du cycloheximide Tubes shell vial verre 1 77 gramme D ON m um Cellules McCoy ou HeLa 229 pour les chantillons de patients et comme contr les positif et n gatif recommand 9 Centrifugeuse 10 thanol 95 qualit r actif 11 Pince 12 Lames de microscope 13 Lamelles de protection 12 mm de diam tre 14 Papier buvard pour les lames 15 B cher ou jarre de Coplin pour rincer les lamelles de protection 16 Incubateur 37 C 17 Chambre humide PROCEDURE DU TEST Enlever le milieu des flacons inocul s et ajouter imm diatement de l thanol 95 en quantit compl tement la pendant 1 suffisante pour recouvrir monocouche Laisser 10 minutes Aspirer l thanol et retirer les lamelles de protection l aide de la pince Poser la tranche de la lamelle de protection sur du papier buvard pour enlever l exc s d thanol Placer la lamelle de protection cellules vers le haut sur une lame de microscope propre et tiquet e Les lamelles de protection doivent tre color es dans les 24 heures Si la coloration ne peut tre effectu e dans ce d lai conserver la lamelle de protection dans un tube shell vial avec de l thanol 70 C reposer Coloration Les monocouches cellulaires doivent demeurer humides toutes les tapes de la proc dure Le r actif de confirmation de la chlamydia doit tre stoc
12. k temp rature ambiante 15 28 C avant utilisation Bien m langer le r actif de confirmation de la chlamydia avant utilisation en retournant doucement le flacon Ajouter une goutte de r actif de confirmation de la chlamydia sur les cellules fix es Ne pas ajouter de r actif sur une monocouche compl tement s che toujours r humidifier les cellules avec du PBS ou de l eau d min ralis e avant d ajouter le r actif pour garantir que la monocouche sera compl tement recouverte Placer les lames dans une chambre humide et laisser incuber pendant 30 minutes 37 C Ne pas laisser l anticorps s cher sur la lamelle de protection sous peine d obtenir une coloration non sp cifique l aide de la pince bien rincer les lamelles de protection en les agitant pendant 10 15 secondes dans un b cher ou une jarre de Coplin rempli d eau d min ralis e ou de PBS Poser la tranche de la lamelle de protection sur du papier buvard pour enlever l exc s d humidit Ajouter une goutte de fluide de montage sur une lame de microscope propre Retourner la lamelle de protection et la placer cellules vers le bas sur le liquide de montage Enlever les bulles d air Examiner les lames imm diatement apr s coloration l aide d un microscope fluorescence Examiner les monocouches au grossissement de 100X et confirmer la morphologie au grossissement de 400X 500X S il est n cessaire de retarder la lecture conserver les
13. lames apr s montage entre 2 et 8 C et l obscurit Pour des meilleurs r sultats les lames doivent tre lues dans les 24 heures Noter que sur les lames portant un conjugu marqu la fluoresc ine la couleur s affaiblit lorsqu elles sont expos es la lumi re Laisser les lames atteindre la temp rature ambiante avant lecture Proc dure de coloration optionnelle des lamelles de protection dans les tubes shell vial Etape 1 Suivre l tape 1 de la proc dure de fixation comme indiqu ci dessus Aspirer l thanol apr s 10 minutes Ajouter du r actif de confirmation de la chlamydia environ 3 4 gouttes en quantit suffisante pour couvrir la lamelle de protection Reboucher le tube shell vial et incuber pendant 30 minutes 37 C Laver la lamelle de protection deux fois l eau d min ralis e ou distill e ou dans du PBS 0 05 M Ajouter une goutte de liquide de montage sur une lame de microscope propre l aide de la pince enlever la lamelle de protection du tube shell vial Poser la tranche de la lamelle de protection sur du papier buvard pour enlever l exc s d humidit et la placer cellules vers le bas sur le liquide de montage Suivre l tape 5 de la proc dure de coloration comme indiqu ci dessus Etape 2 8 CONTROLE QUALITE En compl ment de chaque lot d chantillons de patients il est recommand de traiter les cellules infect es par la Chlamydia et les cellules en culture non inf
14. mydiae se propagent en cultures de tissus gr ce un traitement chimique des cultures cellulaires visant optimiser la sensibilit des cellules h tes pour l infection Actuellement plusieurs m thodes diagnostiques sont disponibles pour d tecter C trachomatis dans des chantillons cliniques Les tests immunoenzymatiques et par immunofluorescence permettent de d tecter les antig nes de chlamydiae directement dans les chantillons cliniques Les cultures cellulaires infect es par les chlamydiae peuvent tre color es avec des anticorps conjugu s l iode au colorant Giemsa ou la fluoresc ine 1 14 Les chlamydiae existent sous deux formes un type de cellule infectieuse appel e corps l mentaire et un type de cellule reproductive appel corps r ticul Le cycle de croissance des chlamydiae commence par l attachement et l entr e des corps l mentaires dans le cytoplasme des cellules h tes Les corps l mentaires subissent alors des modifications morphologiques et forment des corps r ticul s non infectieux qui se divisent par fission binaire ce qui constitue les inclusions Les corps r ticul s continuent se condenser et se r organiser pour se transformer finalement en corps l mentaires lib r s par lyse cellulaire 191213 3 PRINCIPE DE LA METHODE Le kit PathoDx Chlamydia Culture Confirmation utilise des anticorps murins monoclonaux conjugu s la fluoresc ine pour colorer les inclusions
15. smes ont t mis en culture dans un bouillon et 10 ul d une suspension contenant 1 x 10 unit s formant colonie par millilitre ou sur des monocouches cellulaires infect es par un virus avec une multiplicit d infection MOI inf rieure 0 01 ils ont ensuite t fix s sur une lame conform ment la proc dure indiqu e dans le pr sent document Aucun des organismes test s n a montr de r activit crois e Souche ATCC 17904 166 Nelson CA Micro organisme Acinetobacter baumannii Candida albicans Candida tropicalis PN 1164 Cytom galovirus AD169 Enterococcus faecalis PN 1120 Escherichia coli ATCC 29194 Haemophilus influenzae Type A AANEN 1217 Virus Herpes Simplex type I Maclntyre Virus Herpes Simplex type Il MS Klebsiella pneumoniae 33495 Lactobacillus acidophilus PN 1126 Lactobacillus casei PN 1078 Moraxella osloensis PN 1339 ATCC 33530 ATCC 23114 Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis Neisseria gonorrhoeae PN 1138 Neisseria gonorrhoeae PN 1177 Neisseria gonorrhoeae PN 1282 ATCC 13077 ATCC 13090 ATCC 13102 ATCC 13113 Neisseria meningitidis Groupe A Neisseria meningitidis Groupe B Neisseria meningitidis Groupe C Neisseria meningitidis Groupe D Neisseria sicca PN 1101 Proteus mirabilis ATCC 25933 Proteus vulgaris PN 1062 Pseudomonas aeruginosa PN 1280 Salmonella minnesota R595 Salmonella typhi ATCC 6539 ATCC 14028 ATCC 12598 Salmonella typhimurium Staphylo
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