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Notice d`accompagnement du test de la fibrose - Support

1. HET F508del 2143delT 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET s ssam w sde sjmjmj m o o ww s OA ICI II A IA es m 00 w m 00 43 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Nom bre dl ae on concordants wi G n Con Cort de g Ne o a positifs variants n gatifs type sauvage E N es An o an notype rat s d chan typ Variants d ap d aucun dance dance dance el til d chantillon L de 1 iti P global illon els appels ositive n gative obale Site Site Site Site Site Site typage ER ES i g par P R 3 i 3 3 site o s um 00 lo ww wo o m AO lo ww we o ls w en A o www o 0 lo ln ARBRE w e e o oo oo o o m JEA E HET s o maen O w ee e o ooo o o m son amwen AAA 44 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC 45 Nom iiL aa vor ne concordants ed Coh e E R Nja e al positifs variants n gatifs type sauvage e Ne dor de or e d chan Pci Variants d ap 2a d aucun dance dance dance tillon pels Site Site Site Site Site Site pags appels decia ena aaia pa i gt 3 i 7 3 site an AA IEEE E tn IAE SR IAEA B FSOSdEL HED FSOSdEL HED B 621 1G gt T A455E HET B 1812 1 SAGA BED SAGA BED 100 ENEA U s o msn o a em mm 0 o a EEE CE EN SE B R117H F508del HET TG 10 100 T 9 TG
2. 2 400 x g 20 C pendant 10 minutes REMARQUE Veillez ce que tout liquide soit vid apr s la centrifugation R p tez la centrifugation si n cessaire Extension ligature des oligonucl otides li s Proc dure 1 2 3 Ajoutez 45 ul de m lange extension ligation chaque puits d chantillon de la plaque filtrante Scellez la plaque filtrante avec une feuille d aluminium adh sive puis posez le couvercle Incubez le FPU dans l incubateur pr chauff 37 C pendant 45 minutes Amplification de la PCR Pr paration 1 2 Pr parez une nouvelle solution 0 05 N NaOH D terminez les primers d indexage utiliser selon le graphique de plaque imprim partir de Gestionnaire de listes de travail Illumina Ramenez le m lange ma tre PCR et les primers d indexage appropri es la temp rature ambiante M langez chaque tube d congel puis centrifugez bri vement les tubes Pr voyez une nouvelle plaque PCR 96 puits ci apr s d nomm e la plaque AMP Ajoutez des primers d indexage a la plaque AMP comme suit a Ajoutez 4 ul des primers d indexage s lectionn es A A501 H A508 au puits appropri dans une colonne de la plaque AMP b Mettez au rebut les bouchons blancs d origine et utilisez des bouchons blancs neufs c Ajoutez 4 ul des primers d indexage s lectionn es 1 A701 12 A712 la rang e appropri e de la plaque AMP Les extr mit s doivent tre chang es apres chaque ran
3. Le r sultat du g notype est rapport comme HOM lorsqu un chantillon est identifi comme homozygote et seul l all le mutant est d tect pour l chantillon Si aucun variant n est identifi pour un chantillon le rapport indique No panel variants are detected Aucun variant de panel n a t d tect 3 Le rapport des tests fournit des renseignements relatifs au taux de d finition d chantillon pour chaque chantillon Le taux d appel est calcul comme suit nombre de positions r gions de variants qui correspondent un seuil de valeur de confiance pr d finie divis par nombre total de positions r gions interrog es Pour des chantillons n cessitant des signalements conditionnels les variants suppl mentaires interrog s sont galement pris en compte dans le calcul du taux d appel Tout variant pr sentant une valeur de confiance pr d finie inf rieure au seuil est rapport comme un Aucun appel Il est recommand de r p ter l chantillon 4 Un r sultat d chantillon est consid r comme tant valide uniquement si le taux d appel est gt 99 Si le taux d appel est inf rieur 99 la performance est rapport e comme Fail Echec et l chantillon doit tre r p t REMARQUE Si le taux d appel d chantillon est lt 50 la performance est rapport e comme Fail chec et la mention Sample Failed chec de l chantillon est indiqu e sur le rapport Aucun r
4. en ordre de haut en bas couvercle plaque filtrante collier d adaptateur et plaque MIDI Lavez au pr alable la membrane de la plaque filtrante comme suit a Ajoutez 45 ul de tampon de lavage rigoureux chaque puits 16 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC b Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez 2 400 x g a 20 C pendant 5 minutes Proc dure 1 Retirez la plaque HYB du bloc chauffant et centrifugez a 1 000 x g a 20 C pendant 1 minute 2 Transf rez le volume total environ 55 ul de chaque chantillon aux puits correspondants de la plaque filtrante 3 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez 2 400 x g 20 C pendant 5 minutes 4 Lavez la plaque filtrante comme suit a Ajoutez 45 ul de tampon de lavage rigoureux chaque puits d chantillon b Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez 2 400 x g 20 C pendant 5 minutes 5 R p tez le lavage comme d crit l tape pr c dente k REMARQUE Si le tampon de lavage ne s goutte pas compl tement centrifugez encore 2 400 x g 20 C jusqu ce que tout le liquide ait disparu 5 10 minutes suppl mentaires 6 Jetez tout liquide circulant contenant du formamide puis r assemblez la FPU 7 Ajoutez 45 ul de tampon de lavage universel chaque puits d chantillon 8 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez
5. et la g n ration de fichiers VCF contenant des renseignements sur les variants CFTR des positions sp cifiques dans le g nome de r f rence e D multiplexage il s agit de la premi re tape de l analyse secondaire si la feuille d chantillons r pertorie plusieurs chantillons et si l analyse pr sente des lectures d index Le d multiplexage s pare les donn es d chantillons regroup s bas es sur les index de s quence unique qui ont t ajout s au cours de l tape d amplification de PCR e G n ration de fichiers FASTO apr s le d multiplexage MiSeq Reporter g n re des fichiers interm diaires au format FASTO qui est un format texte utilis pour repr senter des s quences Les fichiers FASTO contiennent les lectures pour chaque chantillon ainsi que les scores de qualit l exclusion des lectures provenant de tout amplifiat qui n est pas pass par le filtre e Alignement l alignement compare les s quences par rapport la r f rence pour identifier une relation entre les s quences et attribue un score en fonction des r gions de similarit Les lectures align es sont crites dans des fichiers au format BAM MiSeq Reporter utilise un algorithme de Smith Waterman par bande qui effectue des alignements de s quence locaux pour identifier les r gions similaires entre deux s quences e Appel des variants cette tape enregistre des variants simple nucl otide SNV des insertions et des d l tio
6. galement t rapport es Tableau 16 Pr cision du test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx pour 1506V 1507V et F508C Appels positifs variants Variant Nombre Appels total y chantillons 3 n gatifs Concordance Concordance Concordance nom d appels par Echantillons PR Echantillons type positive n gative globale courant variant cliniques de lign e synth tiques sauvage cellulaire 8 36 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC ableau 17 Pr cision du test a 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx pour les variants PolyTG PolyT G notype N d chantillons N d chantillons de lign e N d chantillons N de rat s de N d aucun Pr cision PolyTGPolyT cliniques cellulaire synth tiques typage appels en TG T 7 TG 11 1 7 2 0 0 0 1 50 37 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC G notype PolyTGPolyT TG 11 T 7 TG 12 T 5 TG 11 T 7 TG 12 T 7 TG 11 T 9 TG 12 T 7 TG 12 T 7 TG 12 T 7 Total N d chantillons N d chantillons de lign e cliniques cellulaire 2 0 37 3 3 0 2 2 448 Les chantillons n ont pas t r analys s A L un des r sultats discordants provient de l tude de reproductibilit Le r sultat Poly TG PolyT pour l chantillon est concordant sur tous les 18 r plicats mais
7. 12 DS INEA ICI E CIA CN ES N 15038347 R v AFRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC G notype Variants d chantillon Nom bre total d ap pels par site Appels concordants positifs variants Site 1 Site 2 Site 3 Appels concordants n gatifs type sauvage Site 1 Site 2 Site 3 Con cor dance positive Con cor dance n gative Ce Con cor dance globale CFTR dele2 3 F508del N Pan d chan el y tillon B 865 B 87 B 88 B 89 B 90 B 91 B 92 HET F508del 1898 1G gt A HET 15 F508del 2143delT HET 3905insT HET 394delTT HET F508del HET Total 810 810 810 810 810 810 810 74556 12 12 12 12 12 12 6 6 6 2209 12 12 12 798 798 810 798 804 804 804 797 798 810 798 804 804 804 221182 798 798 810 798 804 804 804 N de N rates d aucun de 1 typage appels 0 1s 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 273 L emplacement de type sauvage correspondant au variant N1303K pour un r plicat a abouti a un aucun appel en raison d une couverture insuffisante Un r plicat des chantillons 5 et 75 avait un d bit d appel de 0 Un examen approfondi indique que des chantillons n ont peut tre pas t ajout s a la plaque d chantillons avant la pr para
8. 1645A gt C 500 1 499 100 100 c 1645A gt C m 00 33 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Appels positifs variants Nomb Eon Appels Ned No Concor Concor Concor A o A e de o Variant Type de 5 Echan Echan n gatifs 3 dance dance dance Nom d ADNc d appels Echan rat s de d aucun EN MANE nom courant variant En tillons tillons de tillons type typage anels positive n gative globale P lign e synth sauvage il a variant cliniques cellulaire tiques Oow ammo m ao o an o ooo m IMEI AAN 2585delT 2622 1G gt A 100 34 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Appels positifs variants Nombre 1 A 7 Variant Type de tota chan Echan a Nom d ADNc d appels Echan P k nom courant variant eN tillons tillons de tillons E lign e synth variant cliniques cellulaire tiques Appels P A Concor Concor Concor OA N de N n gatifs A dance dance dance rat s de d aucun ee ne type pare boots positive n gative globale sauvage il 0 0 0 W1204X c 3612G gt A 4005 1G gt A Q1313X 4382delA 35 N 15038347 R v AFRA m 00 Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSegDx MC Appels positifs variants dira Appels Concor Concor Concor 5 total
9. A712 AGGAGTGG Mode d emploi MiSeqDx Pr paration de la feuille d chantillons 1 Dans l cran de bienvenue de Gestionnaire de listes de travail Ilumina IWM s lectionnez Create Worklist Cr er la liste de travail 2 Dans le champ Test Type Type de test s lectionnez Test de la FK 139 variants 3 Dans le champ Worklist Name Nom de la liste de travail saisissez un nom pour la feuille d chantillon Si l identifiant du code barres de la cartouche de r actifs alphanum rique est utilis pour le nom de la feuille d chantillon le Logiciel d exploitation MiSeq MOS trouve automatiquement la feuille d chantillons Si vous utilisez un autre nom pour la feuille d chantillons le bouton Browse Parcourir situ dans le logiciel d exploitation MiSeq MOS peut tre utilis afin de trouver la feuille d chantillons appropri e 4 Facultatif Entrez une description pour identifier l analyse 5 Assurez vous que la date correspond la date de d but de l analyse 6 S lectionnez Next Suivant Saisir les renseignements d chantillonnage 1 Dans l onglet Table Tableau ou l onglet Plate Plaque saisissez les renseignements suivants pour chaque puits d chantillon Janvier 2014 N 15038347 R v FRA 15 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC 5 a Identifiant de l chantillon saisissez un seul identifiant d chantillon b Index 1 et Index 2 sp cifiez adaptateur qui sera
10. Samples Charger les chantillons Transf rez l aide de la pipette 600 ul des librairies d chantillons dans le r servoir Load Samples Charger les chantillons Prenez soin d viter de toucher l opercule lors de la distribution de l chantillon V rifiez qu il n y ait pas de bulles d air dans le r servoir apr s le chargement de l chantillon S il y a des bulles d air tapotez doucement la cartouche sur le banc pour vacuer les bulles Passez directement la configuration de l analyse depuis l interface du logiciel d exploitation MiSeq MOS Interpr tation de r sultats 1 2 Le test 139 variants de fibrose kystique MiSeqDx Illumina est con u pour d tecter les 139 variants du CFTR y compris ceux recommand s par l ACMG Tableau 2 Le rapport des tests r pertorie les noms d chantillons et le g notype pour chaque variant d tect pour un chantillon Tous les chantillons sont interrog s pour les 134 variants provoquant la fibrose kystique et le variant R117H recommand par l ACMG seuls les all les ayant subi une mutation sont r pertori s dans le rapport des tests 22 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Le variant PolyTG PolyT est rapport uniquement si la variation R117H est identifi e pour un chantillon Pour les patients pr sentant un variant R117H des tests suppl mentaires doivent tre effectu s pour d terminer si u
11. cliniques et de laboratoire disponibles Ce test n est pas indiqu pour le d pistage n onatal pour les tests de diagnostic f tal pour les tests pr implantatoires ou des fins de diagnostic autonome Le test est destin tre utilis sur l instrument Illumina MiSeqDx R sum et explication du test Description clinique La fibrose kystique FK est l un des troubles g n tiques les plus courants du monde occidental et le trouble autosomique r cessif mortel le plus r pandu au sein de la population blanche non hispanique La FK influe sur la viscosit des s cr tions de mucus et affecte l pith lium des voies respiratoires le pancr as l intestin le syst me h patobiliaire l appareil g nital masculin et les glandes sudoripares entra nant une maladie complexe touchant diff rents organes 6 les poumons sont le premier syst me organique associ la morbidit et la mortalit s Dans de nombreux cas un d ficit nutritionnel laisse pr sager une progression de l atteinte des poumons li e la FK Un point cl des efforts d intervention actuels est le diagnostic pr coce par le biais d un d pistage n onatal L individu a ainsi acc s aux soins des son plus jeune ge et l volution de la maladie peut tre mieux contr l et7 M me si le sexe influe sur les chances de survie l esp rance de vie m diane tant plus lev e chez les hommes que chez les femmes l esp rance de vie m diane gl
12. dans le MiSeqDx pour le s quencage l aide de la chimie SBS S quen age La chimie SBS utilise une m thode bas e sur des terminateurs r versibles pour d tecter des bases simple nucl otide mesure qu elles sont int gr es aux brins d ADN croissants Pendant chaque cycle de s quen age un seul triphosphate de d oxynucl otide ANTP marqu par fluorescence est ajout la cha ne d acide nucl ique L tiquette du nucl otide sert de terminateur pour la polym risation Ainsi apr s chaque incorporation de dNTP le marqueur fluorescent est imag pour identifier la base puis enzymatiquement cliv e pour permettre l incorporation du nucl otide suivant tant donn que les quatre dNTP li s des terminateurs r versibles A G T C sont tous pr sents comme mol cules seules et s par es la comp tition naturelle minimise le biais li l incorporation Les d finitions des bases sont effectu es directement partir des mesures d intensit de signal pendant chaque cycle de s quen age Le r sultat final est le s quen age base par base Analyse des donn es MiSeq Reporter traite les d finitions des bases g n r es pendant l analyse primaire et fournit des renseignements sur chaque chantillon en fonction des renseignements sp cifi s sur la feuille d chantillons appel e analyse secondaire L analyse secondaire comprend le d multiplexage la g n ration de fichiers FASTO l alignement l appel des variants
13. des r actifs ou une trace de voile apparente montrant une contamination microbienne ne pas utiliser les r actifs 6 Les r actifs tampon d hybridation tampon de lavage rigoureux et diluant de normalisation de librairie peuvent former des pr cipit s ou des cristaux visibles Avant l utilisation secouez vigoureusement l aide d un agitateur vortex puis inspectez visuellement pour s assurer qu il n y ait aucune pr cipit e 7 Suivez la lettre les meilleures pratiques suivantes lors de la manipulation de billes de nettoyage PCR et billes de librairie Les billes ne doivent jamais tre congel es Laissez les billes atteindre la temp rature ambiante Imm diatement avant l utilisation secouez vigoureusement l aide d un agitateur vortex jusqu ce que ce soit bien suspendu et que la couleur apparaisse homog ne M langez bien l chantillon apr s que les billes ont t ajout es en pipettant de haut en bas 10 fois Un agitateur peut tre utilis pour bien m langer les chantillons Incubez le m lange bille chantillon temp rature ambiante pendant la dur e totale indiqu e Suivez les instructions lorsque vous utilisez un brin magn tique Attendez que la solution soit claire avant d aspirer Gardez la plaque sur le support magn tique lorsque vous aspirez doucement le surnageant en prenant soin de ne pas d ranger les billes s par es 8 La plaque d amplification de PCR peut rester sur la platine therm
14. discordant avec le s quen age bidirectionnel Sanger Le nombre total d chantillons pour le variant PolyTG PolyT est de 448 car tous les chantillons synth tiques n 52 ont t con us en m langeant des plasmides lin aris s avec un chantillon de lign e cellulaire sur deux qui faisaient partie de l tude de reproductibilit Comme le rapport du variant PolyTG PolyT pour ces chantillons synth tiques suppl mentaires entra nerait un rapport exc dentaire du variant ces chantillons synth tiques ont t exclus de cette analyse 38 N 15038347 R v FRA N d chantillons synth tiques 0 0 N de rat s de typage 0 0 N d aucun appels 0 0 Pr cision en 100 100 100 100 98 44 Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Reproductibilit La reproductibilit du systeme pour fibrose kystique MiSeqDx a t d termin e par une tude en insu utilisant trois sites d essai et deux op rateurs sur chaque site Deux panels bien caract ris s de 46 chantillons chacun ont t analys s par chacun des op rateurs sur chaque site pour un total de 810 appels par site Ces panels contenaient un m lange d ADN g nomique issu des lign es cellulaires lymphoblastiques ayant des variants connus dans le gene CFTR ainsi que du sang d leucocyt enrichi de lign es cellulaires lymphoblastiques ayant des variants connus dans le g ne CFTR Les chantillons de san
15. le rapport des tests indiquent que les donn es correspondant cette position de variant ne respectent pas les seuils de s quen age d finis Les variants portant la d signation No Call Aucun appel ne doivent pas tre rapport s sauf si les tests r p t s produisent des valeurs respectant les seuils d finis et ne sont plus d sign s comme No Call Aucun appel proc durales Illumina exige qu un chantillon d ADN commande positive et un commande n gative NTC ou aucune commande de mod le soient inclus dans chaque analyse qui est d finie comme une s rie d chantillons trait s en parall le L chantillon d ADN de contr le positif doit tre un chantillon correctement caract ris pr sentant un ou plusieurs variants CFTR connus Illumina recommande l utilisation d un contr le de type sauvage Le contr le de type sauvage doit tre ex cut comme un chantillon et ne doit pas remplacer le contr le positif ou n gatif Avant de commencer le test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx extrayez et quantifiez l ADN Toute m thode d extraction d ADN valid e peut tre utilis e Quantifiez l ADN l aide d un spectrophotom tre V rifiez que le A260 A280 de l chantillon d ADN est gt 1 5 Normalisez l chantillon d ADN sur 50 ng ul Chaque chantillon n cessite 5 ul d ADN g nomique 250 ng au total D bit d chantillons et repr sentation d index Pour le test 139 variants de
16. s dans la plaque d HYBRIDATION Suivez la disposition de la plaque g n r e pour une s lection appropri e des puits 3 Ajoutez 5 ul de pool d oligonucl otides a 139 variants de fibrose kystique tous les puits contenant l ADN g nomique 4 Ajoutez 40 ul de tampon d hybridation chaque chantillon dans la plaque d HYBRIDATION Pipettez doucement vers le haut et le bas 3 5 fois pour m langer 5 Scellez la plaque d HYBRIDATION et centrifugez 1 000 x g 20 C pendant 1 minute 6 Placez la plaque d HYBRIDATION dans le bloc pr chauff 95 C et incubez pendant 1 minute 7 R duisez le bloc chauffant 40 C et continuez incuber jusqu ce que le bloc chauffant atteigne 40 C environ 80 minutes Le refroidissement progressif est tr s important pour une bonne hybridation par cons quent les thermocycleurs PCR avec refroidissement actif p ex Peltier avec refroidissement thermo lectrique ne sont pas recommand s pour ce processus POINT D ARR T DE S CURIT Apr s que le bloc chauffant ait atteint 40 C la plaque d HYBRIDATION est stable lorsqu elle est maintenue 40 C pendant 2 heures Retrait des oligonucl otides non li s Pr paration 1 Ramenez le m lange extension ligation le tampon de lavage rigoureux et le tampon de lavage universel temp rature ambiante puis m langez bri vement Assemblez l unit d assemblage de la plaque filtrante ci apr s d sign e comme FPU
17. utilis pour chaque lecture d index Facultatif Pour enregistrer des renseignements plus d taill s sur les chantillons saisissez un nom et une description Facultatif Pour identifier les t moins sur la plaque s lectionnez Negative N gatif ou Positive Positif dans le menu d roulant Control T moin Acc dez l onglet Plate Graphic Plaque graphique et utilisez les options Copy to Clipboard Copier vers le bloc notes ou Print Imprimer pour capturer une image de la plaque d chantillon S lectionnez Finish Terminer Hybridation des pools d oligonucl otides Pr paration 1 Remettez le pool d oligonucl otides a 139 variants de fibrose kystique le tampon d hybridation les chantillons d ADN g nomique et l chantillon de contr le positif temp rature ambiante 2 M langez vigoureusement le pool d oligonucl otides 139 variants de fibrose kystique et le tampon d hybridation pour vous assurer que tous les pr cipit s ont t compl tement dissous puis centrifugez bri vement les tubes pour recueillir le liquide 3 R glez un bloc chauffant de 96 puits 95 C 4 Pr chauffez un incubateur a 37 C 5 Cr ez la plaque d chantillon en fonction du graphique de la plaque imprim partir de IWM Proc dure 1 Pr voyez une nouvelle plaque PCR de 96 puits ci apr s d nomm e la plaque d HYBRIDATION 2 Ajoutez 5 ul d chantillon ou de contr le 50 ng ul 250 ng total dans les puits appropri
18. 0 A 621 1G gt T 711 1G gt T 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET dkak A HET o aeon O CIA Acne w e e mwm o 0 w ale ICA AAA m 00 41 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Nom bre Pan 4 G notype total el d echan d chantillon Variants d ap tillon pels par site A 31 1717 1G gt A HET 810 A 39 F508del 3849 10kbC gt T HET Appels concordants positifs variants Site Site Site 1 2 3 1 2 3 OIEA Amon ooo alsoo s o wji ACC OA a r en CCC ON A F508del 3659delC 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET Appels concordants n gatifs type sauvage Site Site Site Con Con Con N de a tai N cor cor cor a d aucun dance dance dance de EN HER appels positive n gative globale age re 2 m 00 m 00 42 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Nom bre dl ae on concordants wi ow Con Cort de A No gt i a positifs variants n gatifs type sauvage E N es An o an notype rat s d chan A typ Variants d ap d aucun dance dance dance el til d chantillon L de 1 iti P global illon els appels ositive n gative obale Site Site Site Site Site Site typage ER ES i g par 1 R 3 i 3 3 site COI CIA CI O CO mjw 49 F508del 1898 1G gt A 810 12 12 12 798 798 798 100 100
19. 10 12 10 12 798 665 798 0 1354 94 44 94 44 94 44 A 6 F508del 2183AA gt G 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 HET A 7 R75X HET 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 39 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Nom bre dl ae on concordants F Gin Con Coit de g Ne o a positifs variants n gatifs type sauvage N pes Re es an notype rat s d chan typ Variants d ap d aucun dance dance dance el til d chantillon L de 1 iti ati global illon els appels ositive n gative obale 3 Site Site Site Site Site Site typage PE E 7 g par P R 3 i 2 3 site A gu F508del W1282X 810 12 11 12 7988 797 798 DAR 97 22 99 96 99 92 HET A F508del 3849 10kbC gt T 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET voeon w eje em d o o o a m 00 m 00 A F508del 3659delC 810 12 12 12 798 798 798 100 100 HET 40 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Nom bre ds peep ne concordants F Co Con Coit de g Ne o Sra positifs variants n gatifs type sauvage N pes Re es an notype rat s d chan typ Variants d ap d aucun dance dance dance el til d chantillon L de 1 iti Saati global illon els appels ositive n gative obale E Site Site Site Site Site Site typage ER ES i g par 1 R 3 i 5 3 site m 0
20. 13 50 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC 10 Rohlfs EM Zhou Z Heim R Nagan N Rosenblum L et al 2011 Cystic Fibrosis Carrier Testing in an Ethnically Diverse US Population Clinical Chemistry 57 6 841 848 11 Clinical and Functional Translation of CFTR CFTR2 Disponible sur www cftr2 org En ligne Ao t 2013 12 The Clinical and Functional Translation of CFTR CFTR2 Project Disponible sur www nacfconference org art plenaryarchives 2011 Cutting pdf En ligne Pr sent par Garry Cutting au nom du projet CFTR2 lors de la 25e Conf rence Nord am ricaine sur la fibrose kystique NACFO parrain e par la Fondation de la fibrose kystique 4 novembre 2011 Anaheim CA 13 Sosnay PR Siklosi KR Van Goor F Kaniecki K Yu H et al 2013 Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene Nat Genet 25 ao t Epub avant impression 14 Grody WW Cutting GR Klinger KW Richards CS Watson MS Desnick RJ March April 2001 Laboratory standards and guidelines for population based cystic fibrosis carrier screening Genetics in Medicine 3 2 149 154 15 Castellani C Cuppens H Macek H Jr Cassiman JJ Kerem E et al 2008 Consensus on the use and interpretation of cystic fibrosis mutation analysis in clinical practice Cystic Fibrosis 7 179 196 16 Pratt VM Caggana M Bridges C Buller AM DiAntonio L et al M
21. 7delG 1506V G330X S549R c 1647T gt G G970R 1507V R334W S549N 3120G gt A F508C 1336K G551D 3120 1G gt A t Class dans la base de donn es du CFTR2 comme un variant provoquant la fibrose kystique tandis que l article Sosnay le classe parmi les variants ind termin s La classification de la base de donn es est plus actuelle et s appuie sur le test fonctionnel achev qui n tait pas disponible l poque de la publication de Sosnay Principes proc duraux Le Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina implique deux proc dures principales La premi re consiste pr parer manuellement les chantillons s quencer et s appelle pr paration de la librairie La pr paration de la librairie comporte quatre tapes cl s l hybridation 1 extension ligation l amplification de PCR et la normalisation de librairie La deuxi me proc dure consiste s quencer l chantillon pr par l aide de la chimie SPS s quen age par synth se sur le MiSeqDx Pr paration de la librairie Sonde R gion Sonde personnalis e 1 d int r t personnalis e 29 mt TT PP e ADN NN A NV AN NN NN D o on LEEDS nm y Mes Sonde Sonde personnalis e 1 8 personnalis e 2 D P7 Index 1 Index2 P5 A Hybridation la premiere tape hybridation hybride un groupe d oligonucl otides en amont et en aval sp cifiques au Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC en chantillon d ADN
22. A z Ne de N Variant Type de z Echan Echan n gatifs dance dance dance Nom d ADNc d appels Echan rat s de d aucun UN E nom courant variant 3 tillons de tillons type positive n gative globale par tillons A F typage appels UN lign e synth sauvage Co Ce variant cliniques A cellulaire tiques DIV est l acronyme pour variant de d l tion insertion Le rapport Sanger a indiqu le variant P2055 comme h t rozygote pour l chantillon clinique Une r vision des donn es de suivi de Sanger a cependant indiqu que le variant tait en r alit homozygote et rapport de mani re incorrecte Le syst me MiSeqDx a signal le variant comme tant homozygote Un chantillon d h t rozygote synth tique pour exon 8 a t rapport comme h t rozygote pour le variant CFTR dele22 23 Un examen approfondi a r v l que ce r sultat provient probablement d une faible contamination Il a t d termin que l chantillon h t rozygote synth tique d origine a t pr par de mani re incorrecte Lorsqu il a t test ult rieurement apr s avoir t pr par nouveau en utilisant le m me plasmide il a pu tre d tect Avec un r sultat R117H positif le variant Poly TG PolyT est galement rapport Dans le cas d un variant F508del homozygote trois bases de type sauvage suppl mentaires c d variants 1506V 1507V F508C qui n ont pas t identifi es dans l chantillon ont
23. DN Les limites de concentration pour chaque substance sont indiqu es dans le tableau ci dessous En outre pour valuer l interf rence r sultant de la collecte de sang petite prise l EDTA a t int gr aux chantillons de sang Pour valuer l interf rence r sultant de la pr paration d chantillon le tampon de lavage final d une m thode de filtration sur colonne de silice a t ajout de l ADN g nomique purifi Le test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx a atteint un taux d appel de 100 pour tous les chantillons test s et un taux de reproductibilit de 100 de g notypage entre les chantillons en pr sence et en l absence de substances interf rentes Pour valuer l incidence d une interf rence de primer d indexage de multiplexage une tude de contamination crois e utilisant deux chantillons chacun pr sentant des g notypes homozygotes uniques au niveau de quatre positions g nomiques diff rentes et deux primers d index respectifs a t effectu e Aucun changement Janvier 2014 N 15038347 R v A FRA 49 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC concernant l appel de variants n a t observ avec des niveaux de contamination lt 40 Le g notype de l chantillon est devenu h t rozygote avec des niveaux gt 40 Aucune interf rence n a t observ e au niveau de tous les l ments interf rents endog nes ou exog nes Concentration Concentrat
24. NV Intron 11 G542X SNV Exon 12 S549N SNV Exon 12 S549R c 1647T gt G SNV Exon 12 G551D SNV Exon 12 R553X SNV Exon 12 R560T SNV Exon 12 1812 1 G gt A SNV Intron 12 1898 1G gt A SNV Intron 13 W846X SNV Exon 15 2789 5G gt A SNV Intron 16 3120 1G gt A SNV Intron 18 3272 26A gt G SNV Intron 19 Y1092X C gt A SNV Exon 20 M1101K SNV Exon 20 R1158X SNV Exon 22 R1162X SNV Exon 22 3849 10kbC gt T SNV Intron 22 W1282X SNV Exon 23 N1303K SNV Exon 24 DIV est l acronyme pour Deletion Insertion Variant variant de d l tion insertion Extraction d ADN Trois m thodes d extraction disponibles dans le commerce et couramment utilis es correspondant l extraction base de billes magn tiques la pr cipitation dans l alcool et la filtration sur colonne de silice ont t valu es l aide du sang total anticoagul EDTA Au total 14 chantillons de sang uniques ont t utilis s dans l tude correspondant au g notype de type sauvage et aux trois g notypes mutants trois chantillons avec F508del un chantillon avec 1506V et un chantillon avec D110H Les trois m thodes d extraction d ADN ont t test es ind pendamment par deux op rateurs diff rents qui ont effectu trois analyses par m thode d extraction Chaque extraction a t effectu e 48 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC par chaque op rateur des dates diff rentes La conc
25. R Scellez la SGP avec un timbre adh sif pour plaque et r servez REMARQUE Apr s utilisation conservez la plaque SGP scell e une temp rature de 15 C 25 C La plaque SGP scell e est stable pendant un maximum de trois jours Combinez et transf rez les contenus de la barrette de huit tubes PCR dans le tube PAL M langez le tube PAL compl tement Mettez en route un tube Eppendorf frais ci apr s d sign comme le tube DAL Ajoutez 585 ul de tampon de dilution de librairie au tube DAL Ajoutez 6 ul de Contr le interne PhiX de 20 pM au tube DAL Pipettez de haut en bas 3 a 5 fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total Transf rez 9 ul du PAL dans le tube DAL contenant le tampon de dilution de librairie Pipettez de haut en bas 3 5 fois pour rincer la pointe et assurer un transfert total M langez le tube DAL sous agitateur vortex une vitesse maximale Centrifugez le tube DAL a 1 000 x g a 20 C pendant une minute Incubez le tube DAL sur un bloc chauffant 96 C pendant 2 minutes Apr s l incubation inversez le tube DAL 1 2 fois pour m langer puis placez imm diatement dans un bain d eau glac e Gardez le tube DAL dans un bain d eau glac e pendant 5 minutes Charger les librairies d chantillons sur la cartouche 1 3 Utilisez une pointe de pipette s par e propre et vide de 1 ml pour percer l opercule scellant le r servoir sur la cartouche de r actifs tiquet e Load
26. a fibrose kystique MiSeqDx MC R sum des variants r pertori s dans l ordre de coordonn es g nomiques Gras ACMG 23 Italigue Rapport sous certaines conditions M1V T3381 Q552X 3121 1G gt A CFTR dele2 3 1154insTC R553X 3272 26A gt G Q39X S341P A559T L1065P E60X R347H R560T R1066C P67L R347P R560K R1066H R75X R352Q 1811 1 6 kb A gt G L1077P G85E 1213delT 1812 1 G gt A W1089X 394delTT 1248 1G gt A E585X Y1092X C gt A 405 1 G gt A 1259insA 1898 1G gt A Y1092X C gt G 406 1G gt A W401X c 1202G gt A 1898 3A gt G M1101K E92X W401X c 1203G gt A 2143delT E1104X E92K 1341 1G gt A R709X R1158X Q98X PolyTG PolyT K710X R1162X 457TAT gt G 1461ins4 2183delAA gt G 3659delC D110H A455E 2184insA S1196X R117C 1525 1G gt A 2184delA W1204X c 3611G gt A R117H S466X C gt A 2307insA W1204X c 3612G gt A Y122X S466X C gt G L732X 3791delC 574delA L467P 2347delG 3849 10kbC gt T 621 1G gt T 1548delG R764X G1244E 663delT S489X 2585delT 3876delA G178R S492F E822X S1251N 711 1G gt T Q493X 2622 1G gt A 3905insT 711 3A gt G 1507del E831X W1282X 71145 G gt A F508del W846X 4005 1G gt A 712 1 G gt T 1677delTA R851X N1303K H199Y V520F 2711delT 4016insT P2055 Q525X 2789 5G gt A Q1313X L206W 1717 8G gt A Q890X 4209TGTT gt AA Q220X 1717 1G gt A L927P CFTRdele22 23 Janvier 2014 N 15038347 R v FRA 3 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC 852del22 G542X S945L 4382delA 1078delT S549R c 1645A gt C 300
27. ai 2009 Development of Genomic Reference Materials for Cystic Fibrosis Genetic Testing Journal of Molecular Diagnostics 11 3 186 193 17 Amos J Feldman GL Grody WW Monaghan K Palomaki GE et al dition 2008 r vis e en mars 2011 American College of Medical Genetics Standards and Guidelines for Clinical Genetic Laboratories 18 Rehm HL Bale SJ Bayrak Toydemir P Berg JS Brown KK Deignan JL et al 2013 ACMG clinical laboratory standards for next generation sequencing Genetics in Medicine Genetics in Medicine 15 9 733 747 Brevets et marques commerciales Ce document et son contenu sont exclusifs Illumina Inc et ses soci t s affili es Illumina et sont exclusivement destin s a l usage contractuel de son client dans le cadre de l utilisation du ou des produits d crits dans les pr sentes et aucune autre fin Ce document et son contenu ne seront utilis s ou distribu s aucune autre fin et ou communiqu s divulgu s ou reproduits d aucune fa on sans le consentement crit pr alable d Illumina Illumina ne c de aucune licence en vertu de son brevet de sa marque de commerce de son copyright ou de ses droits traditionnels ni des droits similaires d un tiers quelconque par ce document Les instructions contenues dans ce document doivent tre suivies strictement et explicitement par un personnel qualifi et ad quatement form de fa on assurer l utilisation correcte et s re du ou des produits
28. calcul e pour chaque g notype de variant en divisant le nombre d chantillons ayant des appels de variant concordants par le nombre total d chantillons ayant ce variant tel qu indiqu par les m thodes de r f rence Une concordance n gative a t calcul e travers toutes les positions de type sauvage TS en divisant le nombre de positions de TS concordantes par le nombre total de positions TS tel qu indiqu par les m thodes de r f rence La concordance globale CG a t calcul e travers toutes les positions signal es en divisant le nombre de TS concordants et des positions de variantes par le nombre total de positions signal es tel que d termin par les m thodes de r f rence Le test 139 variants de fibrose kystique MiSeqDx Illumina pr sentait une CP au niveau du g notype de 100 La CN pour toutes les positions TS tait gt 99 99 et la CG pour toutes les positions rapport es tait gt 99 99 Tous les r sultats des tests sont bas s sur des tests initiaux Janvier 2014 N 15038347 R v FRA 25 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Pr cision globale du test a 139 variants de fibrose kystique MiSeqDx Illumina Appels positifs variants Nomb pal 4 Appels N de No Concor Concor Concor Variant Type de A chan chan n gatifs A dance dance dance A Nom d ADNc d appels Echan A rat s de d aucun se ee nom courant variant llons tillons de tillons type ag appel
29. cessaire Le bloc chauffant doit tre conforme aux sp cifications de performance suivantes Vous pouvez utiliser des blocs chauffants avec couvercles chauff s Plage de temp ratures ambiante 5 C 99 C R gulation de temp rature 0 1 C 37 C 0 4 C 60 C 2 Incubateur d chantillons un incubateur four hybridation est n cessaire L incubateur doit tre conforme aux sp cifications de performance suivantes Plage de temp ratures 10 C 100 C R gulation de temp rature 0 2 C 3 Centrifugeuse de table une centrifugeuse de table pouvant maintenir une temp rature de 20 C est n cessaire une centrifugeuse s par e est n cessaire dans la zone de post amplification Vous pouvez utiliser n importe quelle centrifugeuse pour plaques atteignant les vitesses indiqu es par le protocole 280 2 400 x g 4 Pipettes de pr cision un ensemble de pipettes de pr cision est n cessaire un ensemble s par est n cessaire dans la zone de post amplification L utilisation de pipettes de pr cision est n cessaire pour s assurer une distribution pr cise des r actifs et des chantillons Les pipettes mono canal ou multi canal peuvent tre utilis es si elles sont talonn es r guli rement et sont pr cises moins de 5 du volume indiqu 5 Consommables les consommables suivants sont n cessaires Plaques PCR jupe 96 puits 0 2 ml en polypropyl ne ou quivalent REMARQUE Assurez vo
30. ci apr s d nomm e la plaque SGP Ajoutez 30 ul de tampon de stockage de librairie chaque puits utiliser dans la plaque SGP Apr s l lution de 5 minutes assurez vous que tous les chantillons dans la plaque LNP sont compl tement remis en suspension Si les chantillons ne sont pas compl tement remis en suspension pipettez doucement ces chantillons de haut en bas ou tapotez doucement la plaque sur le banc pour remettre en suspension les billes puis secouez pendant encore 5 minutes Placez la plaque LNP sur le support magn tique pendant au moins 2 minutes Transf rez le surnageant de la plaque LNP la plaque SGP Pipettez de haut en bas 5 fois pour m langer Scellez la plaque SGP et centrifugez 1 000 x g 20 C pendant 1 minute POINT D ARR T DE S CURIT Si vous ne proc dez pas imm diatement au groupement des librairies et au s quencage ult rieur sur le l MiSeqDx stockez la plaque SGP une temp rature comprise entre 15 et 25 C pendant 3 jours au maximum Groupement des librairies Pr parer le groupage de librairies 1 2 3 R glez un bloc chauffant convenable aux tubes centrifuger de 1 5 ml sur 96 C Dans un seau glace pr parez un bain d eau glac e Faites refroidir le tampon de dilution de librairie dans le bain d eau glac e Commencez par d congeler la cartouche de r actifs de MiSeqDx Pr parer une nouvelle dilution de NaOH x ATTENTION L utilisation de NaOH nouvelle
31. d crits dans les pr sentes Le contenu int gral de ce document doit tre lu et compris avant d utiliser ces produits LE MANQUEMENT LIRE COMPL TEMENT ET SUIVRE EXPLICITEMENT TOUTES LES INSTRUCTIONS CONTENUES DANS LES PR SENTES POURRA CAUSER DES DOMMAGES AUX PRODUITS DES BLESSURES AUX PERSONNES UTILISATEURS O AUTRES ET DES DOMMAGES AUX AUTRES BIENS ILLUMINA REJETTE TOUTE RESPONSABILIT R SULTANT DE L USAGE ABUSIF DU OU DES PRODUITS D CRITS DANS LES PR SENTES Y COMPRIS LES PIECES DE RECHANGE DE CES PRODUITS OU LE LOGICIEL OU DE TOUTE UTILISATION DE CE S PRODUITS S QUI SORT DU CADRE DES LICENCES OU DES PERMISSIONS CRITES EXPRESSES ACCORD ES PAR ILLUMINA EN RAPPORT L ACQUISITION DE CES PRODUITS PAR LE CLIENT DESTIN AU DIAGNOSTIC IN VITRO UNIQUEMENT 2012 2014 Illumina Inc Tous droits r serv s Ilumina et MiSeq Dx sont des marques de commerce ou des marques d pos es de Illumina Inc Les autres marques et noms contenus dans les pr sentes sont la propri t de leurs d tenteurs respectifs AMPure Beckman et Beckman Coulter sont des marques d pos es ou des marques de commerce de Beckman Coulter Inc Janvier 2014 N 15038347 R v FRA 51 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Coordonn es Ilumina Emergo Europe San Diego Californie 92122 tats Unis Molenstraat 15 1 800 809 ILMN 4566 2513 BH La Haye 1 858 202 4566 en dehors de l Am rique du Nord Pays Bas techsup
32. e Guide de l utilisateur de MiSeg Reporter n 15038356 _ FRA Proc dures de contr le qualit Les bonnes pratiques de laboratoire exigent que le mat riel de contr le soit valu pour d tecter d ventuelles diff rences dans le traitement du sang et les proc dures techniques dans le laboratoire de l utilisateur qui pourraient entra ner une variabilit significative dans les r sultats 1 Contr les positifs un chantillon de contr le positif d ADN est requis pour chaque analyse L chantillon de contr le positif d ADN doit tre un chantillon correctement caract ris par au moins un variant CFTR connu Illumina recommande d alterner les contr les positifs conformes aux normes techniques et directives 2008 de l ACMG American College of Medical Genetics pour les tests de mutation de la FKY et aux normes de laboratoire clinique 2013 de ll ACMG pour le s quen age de nouvelle g n ration L chantillon de contr le positif doit g n rer le g notype attendu Si le contr le positif g n re un g notype diff rent de celui attendu alors il y a peut tre eu une erreur dans le suivi de l chantillon ou un enregistrement incorrect des primers d indexage Le test entier doit tre refait commen ant par la pr paration de librairie Contr le n gatif sans mod le ni ADN l utilisation d un contr le n gatif sans mod le ni ADN est requise pour chaque analyse de fa on d tecter les cas possibles de contam
33. e g notypage pour les 137 petits sites InDel SNV comprenant la r gion PolyTG PolyT ont t compar s une analyse de s quence bidirectionnelle Sanger Deux tests valid s bas s sur la PCR ont t utilis s comme m thode de r f rence pour les deux grandes d l tions du panel Chaque test duplex PCR a utilis deux ensembles de primer pour faire la distinction entre les g notypes de type sauvage h t rozygote et homozygote L un des ensembles de primer a t con u pour border les points de rupture de d l tion tandis que l autre a amplifi une r gion interne de la d l tion Les deux produits ont t d tect s par une s paration de taille sur un gel d agarose Les tests PCR ont t valid s en utilisant un panel de 28 chantillons au total 22 chantillons pour chaque d l tion compos d chantillons d ADN g nomique d riv s de sang et de lign e cellulaire et de plasmides synth tiques qui englobait les g notypes TS HET et HOM pour chaque grande d l tion Les tests PCR ont t confirm s avec une sp cificit et une reproductibilit a 100 pour tous les chantillons test s par le biais d une valuation de produits PCR sur un gel d agarose La pr cision des tests PCR a t confirm e au moyen d un s quencage Sanger et avec une valeur de 100 pour tous les chantillons La pr cision a t d termin e pour chaque g notype l aide de trois mesures statistiques Une concordance positive a t
34. e vigoureusement et assurez vous que tous les pr cipit s ont compl tement dissous 4 M langez les billes de librairie vigoureusement pendant une minute avec inversion intermittente jusqu ce que les billes soient remises en suspension et qu aucun culot ne se trouve au fond du tube lorsque celui ci est inverse Proc dure 1 M langez le diluant de normalisation de librairie et les billes de librairie dans un tube conique de 15 ml tout juste rempli comme suit k REMARQUE En cas de traitement lt 24 chantillons utilisez un tube de 1 5 ml tout juste rempli a Pour 96 chantillons ajoutez 4 4 ml de diluant de normalisation de librairie b Pipettez les billes de librairie de haut en bas 10 fois et remettez en suspension REMARQUE Il est extr mement important de remettre en suspension compl tement le culot de billes de la librairie Janvier 2014 N 15038347 R v A FRA 19 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC 10 11 12 13 14 15 16 au fond du tube L utilisation d un P1000 permet de s assurer que les billes sont remises en suspension de mani re homog ne et qu il n y a aucune masse de billes au fond du tube C est essentiel pour atteindre la densit r guli re des amplifiats sur le Flow Cell c Pour 96 chantillons pipettez 800 ul de billes de librairie dans le tube contenant le diluant de normalisation de librairie d M langez en retournant le tube 15 20 fois Ajoutez 45 ul de la
35. ement de haut en bas 5 6 fois pour combiner soigneusement l ADN la solution de travail PCR d Transf rez les autres colonnes de la plaque filtrante la plaque AMP en proc dant de la m me mani re Les extr mit s doivent tre chang es apr s chaque colonne pour viter la contamination crois e de l index et de l chantillon 7 Scellez la plaque AMP et s curisez avec un rouleau en caoutchouc 8 Centrifugez 1 000 x g 20 C pendant 1 minute 9 Transf rez la plaque AMP vers la zone de post amplification 10 R alisez la PCR en utilisant le programme suivant sur un thermocycleur 95 C pendant 3 minutes 25 cycles de 95 C pendant 30 secondes 62 C pendant 30 secondes 72 C pendant 60 secondes 72 C pendant 5 minutes Maintenez 10 C POINT D ARR T DE S CURIT Si vous ne proc dez pas imm diatement au nettoyage PCR la plaque AMP peut rester sur le thermocycleur durant la nuit ou peut tre stock e entre 2 et 8 C jusqu 48 heures Nettoyage PCR Pr paration 1 Ramenez les billes de nettoyage PCR a la temp rature ambiante 2 Pr parez une nouvelle solution d thanol 80 partir de l thanol absolu Proc dure 1 Centrifugez la plaque AMP a 1 000 x g 20 C pendant 1 minute 2 Mettez en route une nouvelle plaque MIDI ci apr s d sign comme la plaque CLP 3 Renversez les billes de nettoyage PCR 10 fois M langez vigoureusement l aide d un agitateur vortex pu
36. enseignement relatif aux variants ne sera affich Cet chantillon doit tre r p t 5 Il est recommand de soumettre les variants valid s l aide d chantillons synth tiques voir le tableau de pr cision a une v rification par l utilisateur au moyen d une m thode de r f rence avant de rapporter les premiers r sultats de patient avec ces variants 6 Si deux variants ou plus sont identifi s pour un chantillon il est recommand que l utilisateur v rifie le r sultat en r p tant l chantillon l aide du test a 139 variants de fibrose kystique MiSeqDx Illumina avec un nouvel extrait d ADNg pour carter une contamination crois e de l chantillon REMARQUE Une mise en phase de l haplotype doit tre envisag e lorsque deux variants ou plus sont d tect s 7 Toutes les interpr tations des variants doivent tre effectu es par un g n ticien mol culaire clinique dipl m ou quivalent conform ment aux directives et proc dures locales15 Les r f rences d interpr tation possibles Janvier 2014 N 15038347 R v FRA 23 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC incluent mais sans s y limiter la base de donn es CFTR211 l article de Sosnay les directives de ACMG en 2004 et l avis du comit ACOG en 20112 Pour plus de renseignements sur la m thode de calcul et de pr sentation des r sultats ou pour obtenir une description du contenu du rapport de fichier texte consultez l
37. ent Scellez la plaque CLP et secouez la dans un agitateur pour microplaques 1 800 tr min pendant 2 minutes Apr s l avoir secou e v rifiez si des chantillons ont t resuspendus Si non r p tez cette tape Incubez temp rature ambiante pendant 2 minutes Placez la plaque CLP sur un support magn tique pendant au moins 2 minutes ou jusqu ce que le surnageant soit vacu Mettez en route une nouvelle plaque MIDI ci apr s d sign comme la plaque LNP Transf rez 20 ul de surnageant de la plaque CLP la plaque LNP En option Transf rez le 10 ul restant du surnageant de la plaque CLP la nouvelle plaque et tiquetez la plaque avec un nom d analyse et une date d analyse Conservez cette plaque entre 15 C et 25 C jusqu la fin de l analyse de s quencage et de l analyse de donn es Les produits PCR nettoy s peuvent tre utilis s pour des efforts de d pannage en cas de pannes d chantillon POINT D ARR T DE S CURIT Si vous arr tez ce point scellez la plaque LNP et centrifugez 1 000 x g 20 C pendant 1 minute 1 ta plaque est stable pendant une dur e maximale de 3 heures entre 2 C et 8 C Normalisation de la librairie Pr paration 1 Pr parez une nouvelle solution 0 1N NaOH 2 Ramenez le diluant de normalisation de librairie les billes de librairie et le lavage de normalisation de librairie la temp rature ambiante 3 M langez le diluant de normalisation de librairi
38. entration d ADN et le taux A260 A280 des chantillons d ADNg extraits ont t d termin s l aide de la spectrophotom trie La taille totale des chantillons pour chaque m thode d extraction dans cette tude tait de 168 14 chantillons x 2 op rateurs m thode d extraction x 3 analyses op rateur x 2 r plicats chantillon d ADN g nomique extrait D bit au Nomore remier M thode d extraction d chantillons D bit d appel Pr cision ra de testes V chantillon Pr cipitation dans l alcool 168 100 100 100 Filtration sur colonne de silice 168 100 100 100 Extraction base de billes magn tiques 168 100 100 100 Pourcentage d chantillons pr sentant un taux d appel gt 99 dans la premiere analyse Entr e d ADN La plage d entr es d ADN du test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina a t valu e en effectuant une tude de dilution en s rie au moyen de 14 chantillons d ADN repr sentatifs contenant 16 variants de fibrose kystique uniques Chaque chantillon a t test en double sur 9 niveaux d entr e d ADN variant de 1 250 ng 1 ng 1 250 ng 500 ng 250 ng 100 ng 50 ng 25 ng 10 ng 5 ng et 1 ng Pour la d termination de la pr cision des g notypes d chantillon ont t compar s aux donn es de s quencage bidirectionnel Sanger et les d l tions ont t compar es un test PCR Les limites sup rieure et inf rieure identifi es pour une entr e d ADN sont res
39. et le tampon d hybridation lors du stockage Combin le pool d oligonucl otides 139 variants de fibrose kystique devient instable m me lorsqu il est conserv congel L utilisation de thermocycleurs refroidissement actif p ex Peltier avec refroidissement thermo lectrique n est pas recommand e pour l tape d hybridation L tape de refroidissement passif est essentielle pour une hybridation ad quate Ajoutez toujours le polym rase PCR au m lange ma tre PCR juste avant l utilisation Ne jamais conserver la solution de travail combin e Durant l tape de normalisation de la librairie il est extr mement important de resuspendre compl tement le culot des billes de la librairie C est essentiel pour parvenir une densit consistante d amplifiats sur la Flow Cell du MiSeqDx Respectez les temps d incubation indiqu s dans l tape de normalisation de librairie Une incubation inappropri e peut affecter la repr sentation de la librairie et la densit des amplifiats tant donn le nombre de transferts de plaque et le risque subs quent de contamination il faut tre tr s vigilant et s assurer que le contenu du puits reste enti rement dans le puits Ne pas clabousser les contenus La recommandation de 250 ng en mati re d entr e d ADN permet de varier la quantit d ADN les performances des tests d pendent de ce niveau d entr e Les variants d chantillon portant la d signation No Call Aucun appel sur
40. g e pour viter la contamination crois e de l index d Mettez au rebut les bouchons orange d origine et utilisez des bouchons orange neufs Pr parez la solution de travail PCR m lange ma tre PCR polym rase PCR comme suit a Pour 96 chantillons ajoutez 56 ul de Polym rase PCR 2 8 ml de m lange ma tre PCR b Retournez la solution de travail PCR pr par e 20 fois pour la m langer La solution de travail PCR est stable temp rature ambiante pendant 10 minutes Janvier 2014 N 15038347 R v FRA 17 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Proc dure 1 Retirez le FPU de l incubateur puis enlevez l opercule en aluminium 2 Couvrez la plaque filtrante avec un couvercle et centrifugez 2 400 x g a 20 C pendant 2 minutes 3 Ajoutez 25 ul de 0 05 N NaOH chaque puits d chantillon sur la plaque filtrante Pipettez la solution NaOH de haut en bas 5 6 fois 4 Recouvrez et incubez la plaque filtrante la temp rature ambiante pendant 5 minutes 5 Pendant que la plaque filtrante est en incubation transf rez 22 ul de la solution de travail PCR chaque puits de la plaque AMP contenant des primers d indexage 6 Transf rez les chantillons lu s du filtre la plaque AMP comme suit a Pipettez les chantillons de la premi re colonne de la plaque filtrante de haut en bas 5 6 fois b Transf rez 20 ul de la plaque filtrante la colonne correspondante de la plaque AMP c Pipettez douc
41. g nomique la fin du processus une proc dure de lavage en trois tapes avec un filtre capable de s lectionner la taille retire les oligonucl otides non li s de l ADN g nomique B Extension ligation la deuxi me tape l extension ligation connecte les oligonucl otides en amont et en aval hybrid s Une ADN polym rase s tend de l oligonucl otide en amont jusqu la r gion cibl e suivie d une ligation l extr mit 5 de l oligonucl otide en aval en utilisant une ADN ligase Le r sultat est la formation de produits contenant des oligonucl otides sp cifiques la FK bord s de s quences n cessaires pour l amplification C Amplification de PCR la troisi me tape l amplification de PCR amplifie les produits d extension ligation l aide de primers qui ajoutent les s quences d indexage pour le multiplexage des chantillons tout comme les 4 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC adaptateurs courants n cessaires la g n ration d amplifiats sur le MiSeqDx la fin de ce processus une proc dure de nettoyage de PCR purifie les produits PCR d sign s comme une librairie D Normalisation de librairie la derni re tape la normalisation de librairie normalise la quantit de chaque librairie pour assurer une repr sentation plus gale dans la derni re librairie regroup e la fin de ce processus la librairie regroup e est charg e
42. g ont t fournis pour permettre l incorporation des tapes d extraction utilis es dans la pr paration d ADN g qui sert d entr e primaire pour le flux de travail du test Le d bit de passage des chantillons d fini comme le nombre d chantillons passant les m triques QC lors de la premi re tentative tait de 99 9 La concordance positive au niveau du g notype pour tous les variants tait de 99 77 La concordance n gative pour toutes les positions TS tait de 99 88 et la concordance globale pour toutes les positions rapport es tait de 99 88 Tous les r sultats des tests sont bas s sur des tests initiaux Aucun test de r p tition n a t effectu pour l tude de reproductibilit Tableau 18 Reproductibilit du test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx Pb Appels concordants Appels concordants bre NN a E E Con Con Con No total positifs variants n gatifs type sauvage N de No dore do es Pan G notype E rat s d chan j k Variants d ap p d aucun dance dance dance el ill ii 1 de appels ositive n gative lobale ji a Site Site Site Site Site Site typage PE cdi BTE LS par 1 2 3 1 2 3 vol o de site A 1 S549N HET 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 2 1812 1 G gt A HET 810 6 6 6 804 804 804 0 0 100 100 100 A 3 Q493X F508del HET 810 12 12 12 798 798 798 0 0 100 100 100 A 4 F508del 2184delA 810 12 12 12 797 798 798 0 I 100 100 100 HET A 5 Y122X R1158X HET 8
43. hoisis car ils repr sentent l ensemble complet de variants valid s sur le plan clinique qui sont class s comme provoquant la fibrose kystique dans la base de donn es CFTR2 l universit Johns Hopkins un produit de l initiative CFTR2 Clinical and Functional Translation of CFTR Le test est pr vu pour 134 variants provoquant la fibrose kystique un variant de panel recommand par 1 ACMG R117H class comme une mutation aux cons quences cliniques variables ou MVCC selon CFTR2 un variant de modification rapport sous certaines conditions PolyTG PolyT et trois variants b nins rapport s sous certaines condi tions I506V 1507V F508C 4 pour un total de 139 variants rapport s Les 134 variants provoquant la fibrose kystique correspondent aux 129 variants provoquant la fibrose kystique dans la base de donn es CFTR2 La base de donn es CFTR2 comprend cinq variants provoquant la fibrose kystique pour les quels la m me modification de niveau de prot ine peut provenir de deux modifications de nucl otide distinctes p ex S466X C gt A et S466X C gt G Ces cinq variants sont r pertori s en fonction du codon d acide amin dans la base de donn es CFTR2 p ex S466X tandis que le test rapporte chaque variant individuel p ex S466X C gt A et S466X C gt G La liste des 139 variants rapport s par Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC est fournie dans le Tableau 2 Tableau 2 Test 139 variants de l
44. iSeqDx MC Appels positifs variants Nombre ou Appels N de No Concor Concor Concor Variant Type de 5 Echan Echan n gatifs dance dance dance Nom d ADNc d appels Echan rat s de d aucun 4 AE nom courant variant p t tillons tillons de tillons type typage appels positive n gative globale li th 0 O 0 HE diniqu s gn e synth sauvage Co Co cellulaire tiques 2184insA DIV c 2052_2 500 3 1 496 100 100 053insA m 00 2307insA DIV c2175 21 500 3 2 495 100 100 76insA j 00 29 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Appels positifs variants Nombre ou Appels N de No Concor Concor Concor Variant Type de 5 Echan Echan n gatifs dance dance dance Nom d ADNc d appels Echan rat s de d aucun 4 AE nom courant variant p t tillons tillons de tillons type typage appels positive n gative globale li th 0 O 0 variant cliniques nes es sauvage Ce cellulaire tiques 191C gt T 00 30 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Appels positifs variants Nombre ou Appels N de No Concor Concor Concor Variant Type de 5 Echan Echan n gatifs 3 dance dance dance Nom d ADNc d appels Echan rat s de d aucun EN MANE nom courant variant Se tillons tillons de tillons type typage anels positive n gative globale P lig
45. ibrose kystique MiSeqDx MC Bo te 2 Tableau 5 Bo te 2 de r actifs de post amplification Quantit DX 102 1003 DX 102 1004 20 cartouches 2 cartouches Composant Test 139 variants de la cartouche de r actifs et fibrose kystique MiSeqDx Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Volume de remplissage 4 6 ml 45ml 10 ul Contenu Cartouche a usage unique contenant une g n ration d amplifiats et des r actifs de s quencage pour une utilisation avec le MiSeqDx comprenant du formamide du 2 mercapto thanol et lt 2 de DMSO Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Bo te 3 Tableau 6 Bo te 3A de r actifs de pr amplification c Quantit AR DX 102 1003 DX 102 1004 Tampon de lavage 10 flacons 1 flacon rigoureux Tampon de lavage 10 tubes 1 tube universel Tableau 7 Bo te 3B de r actifs de post amplification c i Quantit TRE DX 102 1003 DX 102 1004 Billes de nettoyage PCR 10 tubes 1 tube Lavage de 20 tubes 2 tubes normalisation de librairie Billes de librairie 10 tubes 1 tube Test 139 variants de la 20 conteneurs 2 conteneurs Flow Cell et fibrose kystique MiSeqDx Janvier 2014 Volume de remplissage 24 ml 4 8 ml Volume de remplissage 5ml 4 8 ml 1 2 ml 1 Flow Cell Ingr dients actifs Stockage Solution aqueuse tamponn e 15 C 25 C contenant des sels du 2 mercapto thanol et du formamide Solution aqueuse tampo
46. illumina Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC DESTIN AU DIAGNOSTIC IN VITRO UNIQUEMENT Catalogue n DX 102 1004 2 analyses jusqu 96 chantillons par trousse Catalogue n DX 102 1003 20 analyses jusqu 960 chantillons par trousse Utilisation pr vue Le test 139 variants de la fibrose kystique Illumina MiSeqDx est un syst me de diagnostic in vitro qualitatif permettant de d tecter simultan ment 139 des mutations pathog nes causant la fibrose kystique et les variants du g ne r gulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique CFTR cliniquement pertinents dans l ADN g nomique isol partir d chantillons de sang total p riph rique humain Les variants comprennent les variants recommand s en 2004 par 1 American College of Medical Genetics ACMG Coll ge am ricain de g n tique m dicale et en 2011 par 1 American College of Obstetricians and Gynecologists ACOG Coll ge am ricain des obst triciens et gyn cologues Ce test est destin au d pistage des porteurs chez des adultes en ge de procr er des tests de confirmation de diagnostic chez des nouveau n s et des enfants et en tant que test initial pour faciliter le diagnostic d individus soup onn s d avoir la fibrose kystique Les r sultats de ce test doivent tre interpr t s par un g n ticien mol culaire clinicien dipl m ou quivalent et doivent tre utilis s avec les autres renseignements
47. ination Le d bit d appel pour le contr le n gatif doit tre inf rieur 10 Si un contr le n gatif g n re un d bit d appel gt 10 cela signifie qu une contamination a peut tre eu lieu durant le traitement du test Le test est consid r un chec et le test entier doit tre refait commen ant par la pr paration de librairie Contr le de type sauvage l chantillon de contr le d ADN de type sauvage est recommand chaque analyse L chantillon de contr le de type sauvage doit tre un chantillon correctement caract ris ne contenant pas de variants CFTR L chantillon de contr le de type sauvage doit g n rer le g notype attendu Si le contr le de type sauvage g n re un g notype diff rent de celui attendu alors il y a peut tre eu une erreur dans le suivi de l chantillon ou un enregistrement incorrect des primers d indexage Le test entier doit tre refait en commen ant par la pr paration de la librairie Avant la premi re utilisation de ce produit dans le laboratoire de l utilisateur les performances du test doivent tre v rifi es en testant un nombre d chantillons positifs et n gatifs ayant des caract ristiques de performance connues Toutes les exigences de contr le de la qualit doivent tre effectu es conform ment aux r glementations locales r gionales et ou f d rales ou aux exigences d accr ditation 24 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de
48. ion Substance de test o de a i analyses oa le D bit d appel Limite sup rieure Limite inf rieure Bilirubine 16 684 umol l 137 umol l 100 Cholest rol 16 13 mmol l 2 6 mmol l 100 H moglobine 16 2 g l 0 4 g l 100 Triglyc ride 16 37 mmol l 7 4 mmol l 100 EDTA 16 7 mg ml 2 8 mg ml 100 Indexage de l chantillon Des primers d indexage de l chantillon ont t utilis es pour attribuer un code barres unique chaque chantillon d ADN permettant la capacit de grouper plusieurs chantillons en une seule analyse de s quencage Au total 96 index d chantillons ont t analys s l aide de huit chantillons d ADN unique pour v rifier la capacit du test faire syst matiquement un g notypage pour un chantillon donn travers des combinaisons diff rentes de primers d indexage Chaque chantillon a t analys avec 12 combinaisons diff rentes de primers d indexage Les r sultats des chantillons ont t compar s aux donn es de s quen age bidirectionnel Sanger pour l ensemble des positions variants except les deux grandes d l tions qui ont t confirm es l aide du test duplex PCR La reproductibilit et la pr cision ont t 100 pour toutes les combinaisons de primers d chantillon index R f rences 1 Watson MS Cutting GR Desnick RJ Driscoll DA Klinger K et al 2004 Cystic fibrosis population carrier screening 2004 revision of American College of Medical Genetics mutati
49. ique toute la nuit ou elle peut tre conserv e entre 2 C et 8 C pendant un maximum de deux jours Avant le stockage de la plaque entre 2 C et 8 C scellez bien la plaque 9 Ne pas congeler les billes de librairie ou m langez au r actif diluant de normalisation de librairie si elles ne sont pas utilis es imm diatement Janvier 2014 N 15038347 R v A FRA 9 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC 10 La plaque de normalisation de librairie termin e peut tre conserv e entre 15 C et 25 C pendant un maximum de trois jours 11 La librairie d ensembles d amplicons peut tre conserv e entre 15 C et 25 C pendant un maximum de trois jours 12 Chargez imm diatement le groupe d amplicons fra chement dilu s dans la cartouche de r actifs Le stockage du groupe d amplicons dilu s peut entra ner une r duction consid rable de la densit d amplifiats Mat riels et quipement quipement et mat riel fournis vendus s par ment 1 MiSeqDx Instrument catalogue n DX 410 1001 2 Trousse de montage de plaque d index TruSeq n de r f rence FC 130 1005 3 Trousse de montage de plaque d index et de collier TruSeq n de r f rence FC 130 1007 4 Bouchons de remplacement d adaptateur d index n de r f rence DX 502 1003 quipement et mat riel n cessaires non fournis Mat riels et quipement de pr amplification 1 Bloc chauffant un bloc chauffant pour une plaque 96 puits est n
50. is renversez 10 fois de plus Inspectez visuellement la solution pour vous assurer que les billes sont resuspendues 4 Ajoutez 45 ul de des billes de nettoyage PCR dans chaque puits de la plaque CLP 5 Transf rez la totalit du produit PCR de la plaque AMP la plaque CLP 6 Scellez la plaque CLP et secouez la dans un agitateur pour microplaques 1 800 tr min pendant 2 minutes 7 Incubez temp rature ambiante sans secouer pendant 10 minutes 18 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Placez la plaque sur un support magn tique pendant au moins 2 minutes ou jusqu ce que le surnageant soit vacu Avec la plaque CLP sur le support magn tique retirez soigneusement et jetez le surnageant Avec la plaque CLP sur le support magn tique lavez les billes comme suit a Ajoutez 200 ul d thanol a 80 fra chement pr par dans chaque puits d chantillon b Placez la plaque sur le support magn tique pendant 30 secondes ou jusqu ce que le surnageant soit limin c Retirez le surnageant et mettez le au rebut R p tez le lavage comme d crit l tape pr c dente Utilisez une pipette multi canal P20 r gl e sur 20 ul pour retirer l exc s d thanol Retirez la plaque CLP du support magn tique et s chez l air libre pendant 10 minutes Ajoutez 30 ul de tampon d lution chaque chantillon puis m langez bri vem
51. itez la contamination crois e Utilisez de nouvelles pointes de pipette entre les chantillons et entre chaque distribution des r actifs M langez les chantillons l aide d une pipette et centrifugez la plaque lorsque c est indiqu N agitez pas les plaques L utilisation de pointes r sistantes l a rosol r duit le risque de r tention d amplicons et de contamination crois e d un chantillon l autre Un pair index chantillon doit correspondre exactement la feuille de l chantillon Les inad quations entre la feuille de l chantillon et le sch ma de la plaque entra neront une perte de l identification positive des chantillons et un rapport de r sultats incorrect Toujours pr parer de l thanol 80 frais pour les tapes de lavage L thanol peut absorber l eau pr sente dans l air ce qui affecte les r sultats Assurez vous que tout l thanol est retir du fond des puits pendant les tapes de lavage Des r sidus d thanol pourraient affecter les r sultats 12 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Notes 1 e9 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Respectez le temps de s chage indiqu apr s l tape du support magn tique pour assurer une vaporation totale L thanol r siduel peut modifier les performances des r actions ult rieures Ne pas m langer le pool d oligonucl otides 139 variants de fibrose kystique
52. itif Certains composants de ce test contiennent du formamide un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive pour plus de renseignements consultez la section R actifs la page 6 Des risques de l sions corporelles peuvent survenir par inhalation ingestion contact avec la peau et contact avec les yeux Mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilis conform ment aux normes de s curit gouvernementales locales applicables Pour plus de renseignements communiquez avec l assistance technique d Illumina Certains composants de ce test contiennent du 2 mercapto thanol un agent r ducteur pour plus de renseignements consultez la section R actifs a la page 6 Des risques de l sions corporelles peuvent survenir par inhalation ingestion contact avec la peau et contact avec les yeux Utilisez dans une zone bien a r e et mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilis conform ment aux normes de s curit gouvernementales locales applicables Pour plus de renseignements communiquez avec l assistance technique d Illumina Manipulez tous les sp cimens comme s ils taient des agents potentiellement infectieux Le non respect des proc dures comme d crites peut entra ner des r sultats erron s ou une baisse consid rable de la qualit des chantillons Utilisez les pr cautions de routine en laboratoire Ne pas pipetter avec la bouche Ne pas manger boire ou fumer dans les zones de travai
53. l indiqu es Portez des gants jetables et des blouses de laboratoire lors de la manipulation des sp cimens et des r actifs du test Lavez vous les mains soigneusement apr s avoir manipul les sp cimens et les r actifs du test Ne pas utiliser un composant du test au del de la date d expiration indiqu e sur l tiquette du carton de la trousse Ne pas interchanger les composants du test venant de lots de test diff rents Notez que les lots de test sont indiqu s sur l tiquette du carton du test Conservez les composants du test la temp rature sp cifi e dans les zones de pr amplification et de post amplification indiqu es Des cycles de cong lation d cong lation r p t s jusqu 6 des composants de la Bo te 1 ne compromettront pas l int grit du test Pour emp cher la d gradation des chantillons ou des r actifs veillez ce que toutes les vapeurs d hypochlorite de sodium se dissipent avant de commencer le protocole Des pratiques de laboratoire appropri es et une bonne hygi ne de laboratoire sont n cessaires pour emp cher les produits PCR de contaminer les r actifs les instruments et les chantillons d ADN g nomique La contamination des PCR peut causer des r sultats incorrects et non fiables Pour viter la contamination veillez ce que les zones de pr amplification et de post amplification aient des quipements d di s p ex pipettes pointes de pipette agitateur vortex et centrifugeuse v
54. la fibrose kystique MiSeqDx Illumina le d bit d chantillons par analyse MiSeqDx peut tre de 8 48 chantillons Les primers d indexage utilis s pendant l amplification par PCR doivent tre bas s sur le d bit d chantillons final souhait pour assurer la diversit dans la s quence d indexage d y REMARQUE Pour une efficacit maximale du d bit proc dez la pr paration de la librairie pour 96 chantillons au plus puis r partissez les chantillons en deux analyses de s quen age avec un maximum de 48 chantillons par analyse MiSeqDx utilise un voyant DEL vert pour s quencer des bases G T et un voyant DEL rouge pour s quencer des bases A C chaque cycle au moins un des deux nucl otides de chaque canal de couleur doit tre lu pour assurer Janvier 2014 N 15038347 R v FRA 13 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC l enregistrement appropri Il est important de maintenir l quilibrage des couleurs pour chaque base de l index lu en cours de s quencage sinon l chec de l enregistrement pourrait se produire lors du s quen age de la lecture d index Reportez vous au Tableau 11 pour choisir des combinaisons de primers d indexage pour des analyses de 48 ou 96 chantillons Tableau 11 M langes de primers d indexage pour des analyses de s quencage avec 48 chantillons ou 96 chantillons Rang es A H Primer d indexage A A501 Primer d indexage B A502 Primer d i
55. la fibrose kystique MiSeqDx MC Caract ristiques de performance Pr cision La pr cision du test a 139 variants de fibrose kystique MiSeqDx Illumina a t valu e en valuant 500 chantillons repr sentant un large ventail de variants CFTR provenant de quatre sources distinctes La source principale de donn es de pr cision tait une tude de pr cision clinique men e en utilisant un panel de 366 chantillons La majorit n 355 des chantillons comprenaient des sp cimens d ADN cliniques archiv s et anonymis s isol s partir de sang humain les 11 chantillons restants ont t obtenus partir de specimens de lign e cellulaire disponible sur le march Les donn es provenant de cette tude ont t compl t es par les donn es de pr cision de 68 chantillons de lign e cellulaire dans l tude de reproductibilit 14 chantillons cliniques de l tude analytique d valuation de la m thode d extraction et 52 chantillons de plasmide synth tique Les plasmides synth tiques ont t con us pour inclure le contexte g nomique des variants rares et contenaient partout entre un neuf variants dans la m me structure Ils ont t lin aris s dilu s en des nombres de copies quivalents d ADN g nomique puis m lang s avec des chantillons d ADN g nomique humain pr sentant un g notype de type sauvage avec des nombres de copies quivalents pour imiter un chantillon h t rozygote Les r sultats d
56. langes de primers d indexage pour des analyses de s quencage avec 8 chantillons Primer d indexage 1 Primer d indexage 2 Primer d indexage 10 A710 A701 A702 Primer d indexage C Echantillon 1 Echantillon 2 Echantillon 3 A503 Primer d indexage D chantillon 4 chantillon 5 chantillon 6 A504 Primer d indexage E chantillon 7 chantillon 8 A505 S quences de primers d indexage Tableau 13 S quences de primers d indexage A A501 H A508 Primer d indexage S quence Primer d indexage A A501 TGAACCTT Primer d indexage B A502 TGCTAAGT Primer d indexage C A503 TGTTCTCT Primer d indexage D A504 TAAGACAC Primer d indexage E A505 CTAATCGA 14 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Primer d indexage S quence Primer d indexage F A506 CTAGAACA Primer d indexage G A507 TAAGTTCC Primer d indexage H A508 TAGACCTA Tableau 14 S quences de primers d indexage 1 A701 12 A712 Primer d indexage Sequence S quence Primer d indexage 1 A701 ATCACGAC Primer d indexage 2 A702 ACAGTGGT Primer d indexage 3 A703 CAGATCCA Primer d indexage 4 A704 ACAAACGG Primer d indexage 5 A705 ACCCAGCA Primer d indexage 6 A706 AACCCCTC Primer d indexage 7 A707 CCCAACCT Primer d indexage 8 A708 CACCACAC Primer d indexage 9 A709 GAAACCCA Primer d indexage 10 A710 TGTGACCA Primer d indexage 11 A711 AGGGTCAA Primer d indexage 12
57. lez le test 139 variants de la cartouche de r actifs et fibrose kystique MiSeqDx dans un bain d eau contenant assez d eau d ionis e temp rature ambiante pour submerger la base de la cartouche de r actifs jusqu la ligne de d limitation de l eau imprim e sur la cartouche de r actifs Ne pas permettre l eau de d passer la ligne de d limitation de l eau maximale 2 Laissez la cartouche de r actifs d congeler dans le bain d eau temp rature ambiante pendant environ une heure ou jusqu d cong lation compl te 3 Retirez la cartouche du bain d eau et tapotez la doucement contre la paillasse pour retirer l eau de la base de la cartouche S chez la base de la cartouche Assurez vous que l eau n a pas clabouss la partie sup rieure de la cartouche de r actifs Inspection de la cartouche de r actifs 1 Retournez la cartouche de r actifs 10 fois pour m langer les r actifs d congel s puis v rifiez visuellement que toutes les positions sont d congel es REMARQUE Il est essentiel que les r actifs dans la cartouche soient compl tement d congel s et m lang s pour assurer un s quen age correct 2 Inspectez visuellement le r actif de l emplacement 1 pour v rifier qu il est compl tement m lang et qu il ne contient pas de pr cipit s 3 Tapotez doucement la cartouche sur la paillasse pour r duire les bulles d air dans les r actifs 4 REMARQUE Les tubes des dispositifs d aspiration MiSe
58. lus de 39 000 patients atteints de la fibrose kystique avec pres de 1 900 variants de la fibrose kystique qui ont t enregistr s au fil des ann es dans la base de don n es CFTR1 de l H pital pour enfants malades de Toronto 1113 Des caract ristiques cliniques comme la concentration de chlorure dans la sueur les fonctions pulmonaires FEV 1 pr vu et l tat du pancr as ont t analys es avec les renseignements sur le g notype CFTR L approche syst matique consistant analyser simultan ment ces variants des points de vue clinique fonctionnel et g n tique a permis de g n rer 134 variants uniques provoquant la fibrose kys tique au niveau de 129 positions g nomiques uniques tant donn que pour cinq positions deux modifications de nucl otide apparaissent la m me position actuellement contenus dans la base de donn es CFTR2 depuis ao t 2013 L utilisation d un panel comprenant tous ces variants devrait repr senter 95 4 des all les provoquant la fibrose kys tique et faire augmenter de 72 environ 91 le taux d identification des couples pr sentant un risque par le biais d une d tection des deux all les et en utilisant le panel de 23 variants recommand par l ACMG 2 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Variants CFTR dans un panel Les variants rapport s par le Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC ont t sp cifiquement c
59. ment dilu est essentielle pour d naturer compl tement les chantillons pour la g n ration d amplifiats sur le MiSeqDx 20 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC 1 Combinez les volumes suivants dans un tube de microcentrifugeuse Eau de laboratoire 900 ul Stock de 1 0 N NaOH 100 ul 2 Retournez le tube plusieurs fois pour m langer D naturer et diluer Contr le interne PhiX 1 Combinez les volumes suivants pour diluer la librairie de contr le interne PhiX de 2 nM Librairie de contr le interne PhiX de 10 nM 2 ul tampon 1X TE 8 ul 2 Combinez les volumes suivants pour obtenir une librairie de contr le interne PhiX de 1 nM Librairie de contr le interne PhiX de 2 nM 10 ul 0 1 N NaOH 10 ul 3 Agitez bri vement la solution de la librairie de contr le interne PhiX de 1 nM 4 Centrifugez la solution du mod le a 280 x g a 20 C pendant 1 minute 5 Incubez temp rature ambiante durant 4 5 minutes pour d naturer la librairie de contr le interne PhiX en brins uniques 6 Ajoutez le volume suivant de tampon de dilution de librairie r frig r au pr alable au tube contenant la librairie contr le interne PhiX d natur pour obtenir une librairie de contr le interne PhiX de 20 pM Librairie de contr le interne PhiX d natur e 20 ul Tampon de dilution de librairie pr alablement r frig r 980 ul Pr paration de la cartouche de r actifs 1 D conge
60. n e synth sauvage il ds variant cliniques cellulaire tiques W1282X CFTR DEL 500 1 1 498 1s 100 99 80 dele22 23 457TAT gt G DIV c 325 327 500 1 499 100 100 100 delTATinsG c 3964 78_ 4242 577del 31 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Appels positifs variants Nombre ou Appels N de No Concor Concor Concor Variant Type de 5 Echan Echan n gatifs 3 dance dance dance Nom d ADNc d appels Echan y rat s de d aucun EN ala E nom courant variant En tillons tillons de tillons type typage anels positive n gative globale P lign e synth sauvage il a variant cliniques cellulaire tiques 1259insA DIV c 1127 1 500 2 498 100 100 100 128insA W401X SNV c 1203G gt A 500 1 499 100 100 100 c 1203G gt A 32 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Appels positifs variants Nomb a Appels Ned No Concor Concor Concor A o A F o de o Variant Type de 5 Echan Echan n gatifs dance dance dance 3 Nom d ADNc d appels chan rat s de d aucun 4 AE nom courant variant p t tillons tillons de tillons type typage appels positive n gative globale li th 0 O O variant cliniques nee SYES sauvage Ce cellulaire tiques 1461ins4 DIV c 1329_ 500 0 0 1 499 100 100 100 1330ins AGAT S549R SNV c
61. n variant PolyTG PolyT qui peut affecter le ph notype clinique p ex 12 13 TG ou 5T pr sente une orientation cis trans sur le variant R117H J REMARQUE Le g notype PolyTG PolyT est d termin par le test 139 variants de fibrose kystique MiSeqDx Illumina en se basant sur le nombre de lectures des g notypes les plus courants En raison de la nature num rique du s quen age de derni re g n ration le test permet d atteindre un niveau lev de pr cision partir de plusieurs observations par rapport d autres technologies bas es sur le s quen age qui utilisent seulement quelques observations Lorsqu un chantillon pr sente un g notype F508del ou 1507del homozygote si un ou plusieurs des trois polymorphismes b nins I506V I507V et F508C sont d tect s cela est rapport pour l chantillon Si les trois polymorphismes b nins sont tous de type sauvage le rapport indique que les variants I506V 1507V et F508C ne sont pas pr sents pour l chantillon REMARQUE Etant donn qu il s agit d un test bas sur le s quencage il n existe aucune interf rence avec la signalisation de la mutation F508del ou 1507del en raison des trois polymorphismes b nins Par cons quent aucune correction n est apport e au r sultat d tect Le r sultat du g notype est rapport comme HET lorsqu un chantillon est identifi comme h t rozygote et les all les de type sauvage et mutant sont d tect s pour l chantillon
62. ndexage C A503 Primer d indexage D A504 Primer d indexage E A505 Primer d indexage F A506 Colonnes 1 6 Primer d indexage 1 A701 Primer d indexage 2 A702 Primer d indexage 3 A703 Primer d indexage 4 A704 Primer d indexage 5 A705 Primer d indexage 10 A710 Colonnes 7 12 Primer d indexage 6 A706 Primer d indexage 7 A707 Primer d indexage 8 A708 Primer d indexage 9 A709 Primer d indexage 11 A711 Primer d indexage 12 A712 Primer d indexage G A507 Primer d indexage H A508 Si le s quen age est inf rieur 48 chantillons dans une analyse de s quen age s lectionnez les index appropri s sur la base de leurs s quences pour maintenir l quilibrage des couleurs dans les canaux verts et rouges Consultez le Tableau 13 et le Tableau 14 Au minimum les analyses avec 8 48 chantillons doivent comprendre des combinaisons de primers d indexage identifi es dans Tableau 12 Pour effectuer avec pr cision des analyses plus petites au moins huit chantillons doivent tre pr sents Si six chantillons uniques l exclusion des contr les positifs et n gatifs ne sont pas disponibles il convient d effectuer l analyse avec les r pliques d chantillon ou n importe quel chantillon d ADN g nomique humain Reportez vous au Tableau 12 pour conna tre le jeu d index d quilibrage des couleurs minimal utiliser pour les analyses de s quen age 8 chantillons Tableau 12 M
63. nn e 15 C 25 C Solution aqueuse tamponn e 15 C 25 C contenant l ADN g nomique PhiX Stockage 15 C 25 C Ingr dients actifs Stockage Solution aqueuse tamponn e 2 C 8 C contenant des sels du 2 mercapto thanol et du formamide Solution aqueuse tamponn e 2 C 8 C contenant des sels Ingr dients actifs Stockage Solution aqueuse tamponn e 2 C 8 C contenant des billes paramagn tiques en phase solide et du poly thyl ne glycol Solution aqueuse tamponn e 2 C 8 C contenant des sels du 2 mercapto thanol et du formamide Solution aqueuse tamponn e 2 C 8 C contenant des billes paramagn tiques en phase solide Substrat en verre avec des 2 C 8 C oligonucl otides li s par covalence N 15038347 R v FRA 7 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Bo te 4 Tableau 8 Bo te 4 de r actifs de post amplification Composant A A erre Ingr dients actifs P DX 102 1003 DX 102 1004 remplissage 9 Test 139 variants de 20 flacons 2 flacons 353 1ml Solution aqueuse tamponn e la solution SBS PR2 et fibrose kystique MiSeqDx Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Bo te 5 Tableau 9 Bo te 5 de r actifs de pr amplification Composant a te Ingr dients actifs P DX 102 1003 DX 102 1004 remplissage 8 Plaque filtrante 20 plaques 2
64. ns indels et autres variants structurels dans un fichier de test standardis appel MiSeqDxCF139VariantAssay txt Pour plus de renseignements consultez la section Fichier de rapport d analyse dans le Guide de l utilisateur de MiSeq Reporter n 15038356_FRA Limites de la proc dure 1 Destin au diagnostic in vitro Les r sultats obtenus l aide du Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina doivent tre utilis s et interpr t s dans le contexte d une valuation clinique complete 2 Letest est con u pour identifier un sous ensemble sp cifique de variants connus dans le g ne CFTR mais n inclut pas tous les variants identifi s dans le gene CFTR Par cons quent si un variant n est pas identifi cela ne garantit pas que d autres variants CFTR ne sont pas pr sents dans les chantillons analys s 3 Les variants identifi s par le biais de ce test varient en fr quence parmi les diff rentes populations Janvier 2014 N 15038347 R v FRA 5 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC 4 Comme avec n importe quel test bas sur l hybridation les polymorphismes ou variants sous jacents dans les r gions de liaison d un oligonucl otide peuvent affecter les alleles sond s et par cons quent les appels faits 5 Le test ne permet pas de d terminer si l orientation du variant PolyTG PolyT est en cis trans sur le variant R117H Pour les patients pr sentant un variant R117H des tests
65. obale est de 38 3 ans aux tats Unis Variants CFTR et incidence Le g ne r gulateur de la perm abilit transmembranaire de la fibrose kystique CFTR identifi en 1989 est situ sur le bras long du chromosome 7 et contient 27 exons codants r partis sur 230 kb4 Un ARNm 6 5 kb produit par un all le normal code le CFTR une prot ine intrins que de l amino acide 1 490 qui fonctionne comme un canal chlorure r gul dans les cellules pith liales de nombreux organes Plus de 1 900 variants du CFTR sont actuellement d crits la majorit tant des mutations ponctuelles Le variant CFTR le plus courant est l all le F508del qui repr sente presque Janvier 2014 N 15038347 R v FRA 1 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC 70 de tous les variants CFTR3 D autres variants CFTR courants se traduisent souvent par un ph notype de fibrose kystique ou des troubles li s au CFTRS Les estimations de l incidence et de la pr valence de la fibrose kystique sont respectivement d une naissance sur 2 000 4 000 et d environ 30 000 individus aux tats Unist Toutes les ethnies sont touch es des fr quences variables 1 sur 3 000 Caucasiens 1 sur 9 200 Hispano am ricains 1 sur 10 900 Am rindiens 1 sur 15 000 Afro Am ricains et 1 sur 31 000 Asio Am ricains f Les estimations actuelles de la fr quence d un porteur de mutation du g ne CFTR par groupe ethnique aux tats Unis bas es sur une c
66. ohorte de 364 890 individus faisant l objet d un test de d pistage et sans ant c dents familiaux de fibrose kystique sont fournies dans le Tableau 1 Tableau 1 Fr quence g n rale des porteurs de mutation du g ne de la fibrose kystique selon les groupes ethniques aux Etats Unis Groupe ethnique Fr quence des porteurs observ e Afro Am ricains 1 sur 84 Juifs Ashk nazes 1 sur 29 Asiatiques 1 sur 242 Caucasiens 1 sur 28 Hispaniques 1 sur 59 Juifs 1 sur 32 Moyen Orientaux 1 sur 91 Am rindiens 1 sur 70 Sud asiatiques 1 sur 118 Autre groupe ethnique 1 sur 111 Groupe ethnique gt 1 1 sur 34 En partie afro am ricains 1 sur 56 En partie caucasiens 1 sur 32 En partie hispaniques 1 sur 51 Non indiqu 1 sur 37 Tous les individus 1 sur 38 Pr sentation du projet CFTR2 Le projet CFTR2 est une initiative internationale men e par une quipe de chercheurs et de cliniciens qui est soutenue par une subvention de la National Institute of Health et de la U S Cystic Fibrosis Foundation 1112 Le projet CFTR2 vise fournir des renseignements cliniques et fonctionnels la fois complets et r vis s par des experts sur les variants CFTR Dans le but de valider cliniquement tous les variants de la fibrose kystique avec des fr quences d allele de 0 01 et plus 25 registres et cliniques traitant la fibrose kystique dans le monde 3ont rassembl des ressources afin de faire le rapprochement entre des renseignements cliniques provenant de p
67. on panel Genetics in Medicine 6 5 387 391 2 Comit sur la g n tique April 2011 The American College of Obstetricians and Gynecologists Committee Opinion Update on Carrier Screening for Cystic Fibrosis 486 1 4 3 Bobadilla JL Macek Jr M Fine JP Farrell PM 2002 Cystic Fibrosis A Worldwide Analysis of CFTR Mutations Correlation With Incidence Data and Application to Screening Human Mutation 19 575 606 4 Moskowitz SM Chmiel JF Sternan DL Cheng E Gibson RL et al 2008 Clinical practice and genetic counseling for cystic fibrosis and CFTR related disorders Genetics in Medicine 10 12 851 868 5 Moskowitz SM Chmiel JF Sternen DL Cheng E Cutting GR CFTR related disorders Pagon RA Bird TC Dolan CR Stephens K diteurs GeneReviews Seattle WA Universit de Washington 2008 Disponible sur www ncbi nlm nih gov books NBK1250 En ligne Mise jour le 19 f vrier 2008 6 Katkin JP 2012 Cystic fibrosis Clinical manifestations and diagnosis Disponible sur www uptodate com En ligne 7 d cembre 2012 7 Farrell PM Rosenstein BJ White TB Accurso FJ Castellani C et al 2008 Guidelines for diagnosis of cystic fibrosis in newborns through older adults Cystic Fibrosis Foundation consensus report J Pediatr 153 2 S4 S14 8 Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2010 9 Cystic Fibrosis Mutation Database CFTR1 Disponible sur www genet sickkids on ca app En ligne Ao t 20
68. pectivement de 1 250 ng et 25 ng car ils pr sentaient un d bit au premier passage gt 95 sans aucun appel incorrect pr cision et taux d appel de 100 Les entr es d ADN de 1 250 ng 250 ng et 100 ng ont t galement test es avec 4 chantillons d ADN repr sentatifs et au moins 20 r plicats par niveau d entr e d ADN pour chaque chantillon n 4 x 20 80 chantillons tandis que la limite inf rieure de 25 ng a t test e avec 14 chantillons 20 r plicats pour chaque chantillon n 14 x 20 280 chantillons Le d bit au premier passage de la pr cision et de l chantillon tait de 100 tous les niveaux d entr e d ADN Les r sultats indiquent que le test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx Illumina peut tre utilis dans la plage d entr es d ADN variant de 1 250 ng 25 ng pour produire des r sultats pr cis Substances interf rentes Pour valuer l incidence de substances interf rentes sur le syst me pour fibrose kystique Illumina MiSeqDx les performances du test ont t valu es en pr sence et en l absence d ventuels l ments interf rents Huit sp cimens de sang total ont t test s dans l tude notamment trois chantillons positifs la fibrose kystique avec des g notypes uniques Quatre substances interf rentes endog nes bilirubine cholest rol hemoglobine et triglyc ride ont t test es en les int grant des sp cimens de sang avant l extraction d A
69. plaques S O Plaque de microtitration en polypropyl ne avec une membrane en poly thersulfone modifi e Tableau 10 Bo te 5 de r actifs de post amplification Composant E ne volame ee Ingr dients actifs DX 102 1003 DX 102 1004 remplissage Tampon d lution 10 tubes 1 tube 4 8 ml Solution aqueuse tamponn e Tampon de stockage de 10 tubes 1 tube 35ml Solution aqueuse tamponn e librairie R actifs n cessaires non fournis R actif de pr amplification e 10 N NaOH pr parez partir de comprim s ou utilisez une solution standard e Tampon TE e Fau exempte d ADNase et d ARNase R actifs de post amplification e 10 N NaOH pr parez partir de comprim s ou utilisez une solution standard e thanol 200 pour la biologie mol culaire e Tampon TE e Fau exempte d ADNase et d ARNase Stockage et manipulation 1 La temp rature ambiante correspond une temp rature de 15 C 30 C Stockage 2 C 8 C Stockage 15 C 30 C Stockage 15 C 30 C 15 C 30 C 2 Les r actifs suivants sont exp di s congel s et sont stables lorsque stock s entre 15 C et 25 C jusqu la date d expiration indiqu e Pool d oligonucl otides 139 variants de la fibrose kystique Tampon d hybridation M lange extension ligation Primers d indexage A A501 H A508 Primers d indexage 1 A701 12 A712 Polym rase PCR 8 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 varian
70. port illumina com www illumina com tiquette du produit Reportez vous la l gende des symboles livr e avec chaque trousse pour une r f rence compl te aux symboles qui peuvent appara tre sur l emballage et l tiquetage du produit 52 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014
71. qDx descendant au fond de chaque r servoir pour aspirer les r actifs il est important qu aucune bulle d air ne reste dans les r servoirs 4 Placez la cartouche de r actifs sur la glace ou r servez la une temp rature comprise entre 2 C et 8 C jusqu 6 heures jusqu ce que vous soyez pr t configurer l analyse Pour obtenir de meilleurs r sultats chargez directement l chantillon et configurez l analyse Janvier 2014 N 15038347 R v A FRA 21 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Pr parer les chantillons pour le s quencage 1 O1 amp N 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Ramenez le tampon de dilution de librairie temp rature ambiante M langez le tampon de dilution de librairie et assurez vous que tous les pr cipit s sont compl tement dissous Si la plaque SGP a t conserv e congel e d congelez la plaque SGP temp rature ambiante Centrifugez la plaque SGP 1 000 x g 20 C pendant une minute Mettez en route un tube Eppendorf frais ci apr s d sign comme le tube PAL D terminez les chantillons regrouper pour le s quen age Un maximum de 48 chantillons peut tre regroup pour le s quen age Si la plaque SGP a t conserv e congel e m langez chaque librairie s quencer en pipettant de haut en bas 3 5 fois Transf rez 5 ul de chaque librairie s quencer de la plaque SGP colonne par colonne une barrette de tubes PC
72. rme aux sp cifications de performance suivantes Plage de temp ratures ambiante 5 C 99 C R gulation de temp rature 0 1 C 37 C 0 4 C 60 C Support magn tique un support magn tique pour une plaque 96 puits est n cessaire Les meilleures performances sont atteintes lorsque les aimants sont du c t du support et non au fond Pipettes de pr cision un ensemble de pipettes de pr cision est n cessaire un ensemble s par est n cessaire dans la zone de pr amplification L utilisation de pipettes de pr cision est n cessaire pour s assurer une distribution pr cise des r actifs et des chantillons Les pipettes mono canal ou multi canal peuvent tre utilis es si elles sont talonn es r gulierement et sont pr cises a moins de 5 du volume indiqu Consommables les consommables suivants sont n cessaires Plaques PCR a jupe a 96 puits 0 2 ml en polypropylene ou quivalent REMARQUE Assurez vous que la plaque 96 puits s adapte parfaitement au support magn tique Plaques de stockage 96 puits 0 8 ml plaques MIDI Tubes coniques 15 ml Tubes de microcentrifugeuse Eppendorf bouchon viss recommand Barrettes de huit tubes PCR Bassin de solution sans PVC ni DNase RNase cuve Opercule adh sif en aluminium Timbre adh sif pour plaques Pointes de pipette r sistantes l a rosol Collecte transport et stockage des sp cimens REMARQUE Manipulez tous les sp cimen
73. s comme s ils taient des agents potentiellement infectieux Les sp cimens de sang total recueillis dans les tubes K EDTA peuvent tre utilis s Les sp cimens de sang total peuvent tre stock s pendant un maximum de sept jours temp rature ambiante jusqu 30 jours entre 2 C et 8 C ou jusqu 30 jours entre 15 C et 25 C Transportez le sang total pendant un maximum de sept jours temp rature ambiante 30 jours entre 2 C et 8 C ou 30 jours si congel entre 15 C et 25 C Le transport de sang total doit se conformer aux r glements nationaux f d raux r gionaux et locaux sur le transport d agents tiologiques Aucun effet n gatif sur les performances du test n a t observ lorsque ADN g nomique a t soumis six cycles de cong lation d cong lation Aucun effet n gatif sur les performances du test n a t observ sur les sp cimens de sang total contenant un taux lev de bilirubine de cholest rol de triglyc rides d ETDA ou d h moglobine Janvier 2014 N 15038347 R v FRA 11 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Avertissements et pr cautions 10 11 12 13 14 15 4 ATTENTION Les lois f d rales restreignent la vente de ce dispositif qui doit tre vendu par un m decin ou sur ordonnance de ce dernier ou tout autre praticien autoris par la loi de l Etat o il exerce utiliser ou ordonner l utilisation du dispos
74. s positive n gative globale par 0 A typ li th o o o variant cliniques gnee symne sauvage 9 cellulaire tiques CFTR DEL C 54 5940_ 500 4 1 0 495 100 100 100 273 10250 del21kb 26 N 15038347 R v AFRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Appels positifs variants Nombre ou Appels N de No Concor Concor Concor Variant Type de 5 Echan Echan n gatifs 3 dance dance dance Nom d ADNc d appels Echan rat s de d aucun EN MINE nom courant variant p t tillons tillons de tillons type typage appels positive n gative globale li th 0 O O variant cliniques nes es sauvage Ce cellulaire tiques 1154insTC DIV c 1022_1023 500 1 499 100 100 insTC 27 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Appels positifs variants Nombre ou Appels N de No Concor Concor Concor Variant Type de 5 Echan Echan n gatifs dance dance dance Nom d ADNc d appels Echan rat s de d aucun 4 ME nom courant variant p t tillons tillons de tillons type typage appels positive n gative globale li th 0 O O ne dinidues gn e synth sauvage cellulaire tiques 1507del DIV c 1519_1521 500 4 2 494 100 100 100 delATC 1677delT A DIV c 1545_1546 500 1 499 100 100 delTA m 00 28 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique M
75. se kystique Tampon d hybridation M lange extension ligation Primers d indexage A A501 H A508 Primers d indexage 1 A701 12 A712 Polym rase PCR M lange ma tre PCR 6 N 15038347 R v A FRA Quantit DX 102 1003 DX 102 1004 10 tubes 1 tube 10 tubes 1 tube 10 tubes 1 tube 10 tubes par 1 tube par primer primer 10 tubes par 1 tube par primer primer 10 tubes 1 tube 10 tubes 1 tube Volume de remplissage 600 ul 4 32 ml 4 8 ml 192 ul 128 ul 56 ul 2 8 ml Ingr dients actifs Solution aqueuse tamponn e contenant des oligonucl otides ciblant le g ne CFTR Solution aqueuse tamponn e contenant des sels et du formamide Solution aqueuse tamponn e contenant un m lange exclusif d ADN polym rases de ligase ADN et des ANTP Primer PCR avec des s quences d indexage et des adaptateurs de s quen age Primers PCR avec s quences d indexage et adaptateurs de s quen age ADN polym rase exclusif Solution aqueuse tamponn e contenant des sels et des ANTP Stockage 15 C 25 C 15 C 25 C 15 C 25 C 15 C 25 C 15 C 25 C 15 C 25 C Janvier 2014 Tableau 4 Bo te 1B de r actifs de post amplification Quantit Composant DX 102 1003 DX 102 1004 Diluant de 10 tubes 1 tube normalisation de librairie Tampon de dilution de 10 tubes 1 tube librairie Contr le interne PhiX 1 tube 1 tube Test 139 variants de la f
76. solution de travail diluant de normalisation de librairie billes de librairie combin e chaque puits de la plaque LNP contenant des librairies Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques 1 800 tr min pendant 30 minutes Placez la plaque sur un support magn tique pendant au moins 2 minutes ou jusqu ce que le surnageant soit vacu La plaque LNP sur un support magn tique retirez avec pr caution le surnageant et mettez le au rebut D posez la plaque LNP du support magn tique et lavez les billes avec le lavage de normalisation de librairie comme suit a Ajoutez 45 ul de lavage de normalisation de librairie chaque puits d chantillon b Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques a 1 800 tr min pendant 5 minutes c Placez la plaque sur un support magn tique pendant au moins 2 minutes ou jusqu ce que le surnageant soit vacu d Retirez le surnageant et mettez le au rebut R p tez la proc dure de lavage de normalisation de librairie comme d crit l tape pr c dente Utilisez une pipette multicanaux P20 r gl e 20 ul pour retirer tout exc s de lavage de normalisation de librairie D poser la plaque LNP du support magn tique et ajoutez 30 ul de la solution 0 1 N NaOH chaque puits Scellez la plaque LNP et secouez sur un agitateur pour microplaques 1 800 tr min pendant 5 minutes Pendant l lution de 5 minutes pr voyez une nouvelle plaque PCR 96 puits
77. suppl mentaires doivent tre effectu s pour d terminer si un variant PolyTG PolyT qui peut affecter le ph notype clinique p ex 12 13 TG ou 5T pr sente une orientation cis trans sur le variant R117H 6 PolyTG PolyT sont des r gions homopolym riques connues pour tre difficiles interpr ter avec des tests bas s sur le s quen age en raison du glissement de polym rase Un taux de 0 9 4 448 de rat s de typage a t observ pour des r sultats PolyTG PolyT d montrant un cart de 1 TG par rapport au s quen age bidirectionnel Sanger Tableau 17 Composants du produit La plateforme Illumina MiSeqDx comprend les composants suivants e Testa 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC N de r f rence DX 102 1004 ou DX 102 1003 e MiSeqDx Instrument N de r f rence DX 410 1001 R actifs R actifs fournis Les r actifs pour le test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Illumina sont fournis par Illumina Le catalogue n DX 102 1003 a t configur pour 20 analyses avec un maximum de 48 chantillons par analyse jusqu a 960 chantillons au total Le catalogue n DX 102 1004 a t configur pour 2 analyses avec un maximum de 48 chantillons par analyse jusqu 96 chantillons au total Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MO Bo te 1 Tableau 3 Bo te 1A de r actifs de pr amplification Composant Pool d oligonucl otides a 139 variants de la fibro
78. tion de la librairie car les volumes d chantillon restants dans les tubes ne correspondaient a aucun volume ayant t supprim Des preuves indiquent que les chantillons 9 et 10 ont t vraisemblablement chang s par l op rateur avant la pr paration de la librairie L emplacement de type sauvage correspondant au variant M1V pour un r plicat de chacun des deux chantillons a abouti un aucun appel en raison d une couverture insuffisante 46 N 15038347 R v A FRA 100 100 S O 100 100 100 100 99 77 99 96 100 100 100 100 100 100 99 88 99 96 100 100 100 100 100 100 99 88 Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Tableau 19 Renseignements suppl mentaires sur les variants de l tude de reproductibilit mn R gion Variation nom aand Type de variant de g ne CFTR PolyTG PolyT Compos DIV Intron 9 CFTR dele2 3 DEL Intron1 Intron3 1507del DIV Exon 11 2143delT DIV Exon 14 3876delA DIV Exon 23 1078delT DIV dans la r gion homopolym rique Exon 8 3905insT DIV dans la r gion homopolym rique Exon 23 R75X SNV Exon 3 E92X SN Y122X SNV G178R SNV L206W SNV R334W SNV Exon 8 R347P SNV Exon 8 Janvier 2014 N 15038347 R v A FRA 47 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Mod dd Type de variant 7 e CFTR R347H SNV Exon 8 A455E SNV Exon 10 Q493X SNV Exon 11 1717 1G gt A S
79. ts de la fibrose kystique MiSeqDx MC M lange ma tre PCR Diluant de normalisation de librairie Tampon de dilution de librairie Contr le interne PhiX Test a 139 variants de la cartouche de r actifs et fibrose kystique MiSeqDx Except pour la cartouche de r actifs les r actifs sont stables pendant un maximum de 6 cycles de cong lation d cong lation qui peuvent se produire avant la date d expiration indiqu e Ne pas recongeler la cartouche de r actifs apres qu elle a t d congel e Elle peut tre conserv e pendant un maximum de 6 heures entre 2 C et 8 C 3 Les r actifs suivants sont exp di s r frig r s et sont stables lorsque stock s entre 2 C et 8 C jusqu la date d expiration indiqu e Tampon de lavage rigoureux Tampon de lavage universel Billes de nettoyage PCR Billes de librairie Lavage de normalisation de librairie Test 139 variants de la solution SBS PR2 et fibrose kystique MiSeqDx Test 139 variants de la Flow Cell et fibrose kystique MiSeqDx 4 Les r actifs suivants sont exp di s ambiantes et sont stables lorsque stock s temp rature ambiante jusqu la date d expiration indiqu e Tampon d lution Plaque filtrante Tampon de stockage de librairie 5 Les changements dans l apparence physique des r actifs fournis peuvent indiquer la d t rioration des mati res Si des changements dans l apparence physique se produisent par ex des changements apparents de la couleur
80. us que la plaque 96 puits s adapte parfaitement au support magn tique Plaques de stockage 96 puits 0 8 ml plaques MIDI Bassin de solution sans PVC ni DNase RNase cuve Opercule adh sif en aluminium Joint appropri pour plaques PCR Pointes de pipette r sistantes l a rosol Mat riels et quipement de post amplification 1 Thermocycleur un thermocycleur est n cessaire Le thermocycleur doit avoir un couvercle chauff et respecter les sp cifications de performance suivantes Plage de contr le de la temp rature 4 C 99 C Pr cision du contr le 0 25 C de 35 C 99 C 10 N 15038347 R v A FRA Janvier 2014 Test 139 variants de la fibrose kystique MiSeqDx MC Agitateur pour microplaques un agitateur pour microplaques est n cessaire dans la zone du laboratoire de post amplification L agitateur pour microplaques doit tre conforme aux sp cifications de performance suivantes Vitesse de m lange max 3 000 tr mn Plage de vitesses de m lange 200 a 3 000 tr mn Centrifugeuse de table une centrifugeuse de table pouvant maintenir une temp rature de 20 C est n cessaire une centrifugeuse s par e est n cessaire dans la zone de pr amplification Vous pouvez utiliser n importe quelle centrifugeuse pour plaques atteignant les vitesses indiqu es par le protocole 280 2 400 x g Bloc chauffant un bloc chauffant pour les tubes est n cessaire Le bloc chauffant doit tre confo

Notice d`accompagnement du test de la fibrose - Support

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