Mode d`emploi ChromoQuant® QF-PCR kit Mises
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1. 220 311 Q07 123 FR05 3 4 ChromoQuant 311 002 1 48u Solution 1 tube PCR amber Marquer Localisation Chromosome STR Taille bp Couleur Dye label Xp22 31 X Y AMEL x 103 108 Vert Xp22 1 y 109 114 Yp11 2 D188391 18p11 31 18 Tetra 135 185 Vert HEX D18S976 18p11 31 18 Tetra 171 201 Bleu_ _ 6 FAM___ XHPRT_ _ Xq26 1 X Tetra 260 304 Bleu 6 FAM___ D138634 13q21 33 13 Tetra 380 445 Bleu 6 FAM D13S628 13q31 1 13 Tetra 420 475 Jaune NED D18S535 18q12 3 18 Tetra _ 450 505 Bleu 6 FAM Solution 2 tube PCR bleu label DXS6854 Xg26 1 X Tetra 93 119 Bleu 6 FAM D2151409 21q21 2 21 Tetra 193 219 Jaune NED SRY Yp11 31 Y SRY f 202 207 Bleu 6 FAM D2151444 21q22 13 21 Tetra 304 345 Bleu 6 FAM CyberGene AB Box 30057 104 25 Stockholm Su de 901 220 311 Q07 123 FR05 4 42. 50 ng M langer en pompant 5 fois avec une pipette Volume final 25UL 6 Taper d licatement contre la paillasse les tubes plac s sur la bande ou les passer dans une micro centrifugeuse pour s assurer que tous les r actifs retombent au fond du tube PCR 7 Proc der imm diatement l amplification PCR 901 220 311 Q07 123 FR05 2 4 Protocole PCR Les tapes 2 4 sont r p t es sur 26 cycles Choisir l tape 1 de la PCR en fonction de la Taq polymerase utilis e 94 C 3 min pour la Taq Promega ou 95 C 15 min pour la Taq Qiagen 1 HotStar Taq Qiagen 15 min 1 GoTaq Promega 3 min a Eaa e 2 min 5 min 3 sooo nu y Joc fin ES 4 C Electrophor se sur gel des fragments d ADN amplifi s 1 Dessaler individuellement chaque chantillon de PCR avant injection lectrocin tique dans les capillaires 2 Proc der l lectrophor se sur gel selon le manuel d utilisation de l instrument ou la meilleure routine du laboratoire pour obtenir la meilleure r solution de fragments entre 93 et 500 nucl otides Limites de la m thode et caract ristiques de performances L information concernant les marqueurs de chaque chromosome est 4 6 fois redondante Chr 13 18 et 21 Un r sultat analytique dans lequel deux des marqueurs d un chromosome sp cifique sont r v lateurs doit tre consid r comme r ussi et peut tre utilis comme une indication de diagnostic Ce kit n a pas t con u pour valu
3. Mode d emploi ChromoQuant QF PCR kit ChromoQuanf Diagnostic QF PCR in vitro ChromoQuant kit d analyse d anomalies chromosomiques courantes des chromosomes 13 18 21 et X Y 311 002 1 48u z Voir conditionnement Voir conditionnement 18 C TA f S7 a ne CE Mises en garde S utilise avec des s quenceurs fluorescents acceptant l ensemble de filtre D pour les biosyst mes appliqu s ABI PrisM 3100 310 3130 les analyseurs g n tiques et l ensemble de filtre 2 pour Amersham Biosciences MegaBACET 500 1000 Veillez ce que votre s quenceur accepte les marqueurs fluorescents 6 FAM HEX et NED Il est recommand d utiliser avec ce kit de l ADN purifi provenant du liquide amniotique de pr l vements buccaux de salive ou de sang Le fonctionnement du kit ne peut tre garanti que s il est utilis avec la Taq Polym rase recommand e La Taq polym rase n est PAS inclue dans ce kit Pour obtenir des r sultats de qualit utilisez gt 15 ng lt 150 ng d ADN par chantillon PCR InstaGene Matrix Pour des r sultats PCR optimum suivez les instructions communiqu es pour l instrument PCR disponible Les bouchons de PCR cass s doivent tre remplac s avant de passer l amplification PCR Les chantillons de patients contamin s de sang ne doivent pas tre analys s avec ce kit par exemple lorsque l ADN utilis provient du liquide amniotique Pour viter tout risque de contamination crois e pendant la pr paration d
4. dNTPSs B mercaptoethanol s rumalbumine bovine QO QO O OOUOOO0O0O0O OOU000000O OOUOO0O000O OOUO0OO000O OOUOOO0OO0O0O OOUO0000O OOUOO0O0O0O0O OOUOO000O0O OQO 00 OQO OQO 00 00 OOO 60e 1o acor Solution 1 13 18 Solution 2 21 901 220 311 Q07 123 FR05 1 4 Instructions de stockage et dur e de conservation apr s ouverture e Conserver le tampon QF PCR et les tubes PCR de primer mix non utilis s dans le noir une temp rature inf rieure 18 C Le tampon de dilution d enzyme peut tre conserv entre 20 et 8 C e Utiliser du papier d aluminium chaque fois que n cessaire pour prot ger les tubes d une exposition inutile la lumi re par exemple lorsque vous travaillez avec le kit sur la paillasse du laboratoire avant la PCR Il est recommand de toujours conserver le mat riel non utilis dans son sachet d aluminium refermable d origine e Dur e de conservation Voir date limite d utilisation R actifs sp cifiques suppl mentaires devant tre fournis par l utilisateur e Taq polymerase HotStar Taq Qiagen Ref 203203 250U 5U uL ou ventuellement Taq polymerase GoTaq Promega Inc Ref M8301 M3171 5U uL e Fluorescent pour lectrophor se sur gel taille standard par ex ABI GeneScan 500 ROX J Ref 401734 ou Amersham Biosciences ET ROX Ref 25 6550 01 Celui ci sera ajout l chantillon d ADN apr s la PCR mais avant l lectrophor se sur gel e Col
5. e la PCR veillez ce qu une nouvelle extr mit soit utilis e pour la pipette pour chaque puits remplir d ADN Le sel interf re avec la s paration des fragments pendant l lectrophor se du gel Il est conseill de proc der un dessalage apr s la PCR La qualit de la formamide ou de l eau ajout e l chantillon d ADN avant le chargement ou l injection lectrocin tique affectera la sensibilit Veillez utiliser la meilleure qualit Les r actifs pour la purification de l ADN g nomique ne sont pas inclus dans le kit La technique PCR est prot g e par les brevets d pos s aux Etats Unis sous les num ros 4 683 195 et 4 683 202 et leurs homologues trangers d tenus par Hoffman La Roche AB L utilisateur doit d tenir une licence aupr s de Hoffman La Roche pour utiliser la technologie PCR Composition du kit e Douze 12 bandes de 8 tubes e Chaque tube de PCR contient une solution primer mix pr te l emploi Primer mix Solution 1 Chromosome 13 18 X Y Primer mix Solution 2 Chromosome 21 X Y Une bande de 8 tubes ambr s suffit donc pour d terminer le chromosome 13 18 sur huit 8 patients et une bande de 8 tubes bleus suffit pour d terminer le chromosome 21 sur huit 8 patients e Bouchons de bandes PCR e 1 Tampon de dilution d enzyme 300uL dans un tube bouchon viss blanc Tampon Tris EDTA e 1 Tampon QF PCR 1 5 mL dans un tube bouchon viss jaune MgCb NH4 2SO4
6. er ou d terminer si une translocation a t effectu e impliquant les chromosomes 13 18 21 X ou Y Cependant il peut toujours tre possible de d tecter un tat trisomique au niveau chromosomique Ce kit ne doit pas tre utilis pour d tecter des aberrations g n tiques en mosa ques par ex lyonisation En ce qui concerne le syndrome Turner X0 ChromoQuant ne peut donner qu une indication D autres m thodes sont recommand es pour diagnostiquer le syndrome Tuner X0 Normal 1 1 Homozygote Trisomie 1 1 1 Dans le cadre d une STR le ratio de pic est de 0 8 1 4 Le ratio de pic de la trisomie est lt 0 65 et gt 1 8 Zone ou hauteur de l all le le plus court divis e par la zone ou hauteur de l all le le plus long Les ratios d all les se situant entre les marges de variations normale et anormale sont consid r s comme non concluants et doivent faire l objet d une nouvelle analyse Si pour un m me chromosome on obtient des sch mas d all le normaux et anormaux il est impossible d interpr ter le r sultat final comme tant normal ou anormal Des tudes plus approfondies doivent tre effectu es Heterozygote Non r velateur Le Pour une information d taill e sur l interpr tation des r sultats se reporter au Guide de l Utilisateur de ChromoQuant Le Guide de l Utilisateur peut tre t l charg sur le site web de ChromoQuant ou command directement aupr s de CyberGene AB Ref 901 115 00 901
7. onnes pour le dessalage du produit de PCR avant l lectrophor se sur gel capillaire e Autres r actifs pour la purification de l ADN g nomique Comment utiliser ce kit Purification et pr paration de l ADN Les r actifs n cessaires pour purifier l ADN provenant de tissus humains NE sont PAS inclus dans le kit Il est recommand d utiliser des technologies de pr paration d ADN commerciales fournissant un ADN g nomique pur Quelle que soit la m thode de pr paration diluer l ADN pour obtenir une concentration finale de 1 5 15ng uL en utilisant de l eau st rilis e Amplification PCR Multiplex d ADN g nomique 1 D congeler le tampon de QF PCR et le tampon de dilution d enzyme temp rature ambiante et les placer sur de la glace 2 D terminer le nombre total de tubes PCR c est dire de solution 1 2 N 3 M langer dans un microtube de polypropyl ne s par par ex tube Eppendorf 1 5 ml e 1 6 Tampon de dilution d enzyme 0 4 uL de Taq Polym rase et tampon QF PCR de 13 uL multipli s par N Pr parer toujours quelques l ments suppl mentaires Les tubes PCR fournis avec le kit sont rang s par bandes de 8 Une bande de chaque couleur permettra d analyser respectivement 8 chantillons de patients Pour obtenir de meilleurs r sultats il est recommand de travailler rapidement sur de la glace 4 Ajouter 15 uL du m lange principal de l tape 3 dans chaque tube de PCR 5 Ajouter 10 uL d chantillon d ADN 15 1
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