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PDF ( Author`s version) - OATAO (Open Archive Toulouse Archive

1. Cette exp rience a t r alis e sur 3 chiens apparemment sains 1 tube h parin de 4 mL a t pr lev sur une chienne bouvier bernois lka de 52 kg en une ponction 12 tubes h parin s de 4 mL ont t pr lev s sur Faia chienne beauceron de 32 2kg en une ponction 11 tubes h parin s de 4 mL ont t pr lev s sur Gaia chienne dogue allemand de 58 3kg en 2 ponctions r alis es au m me moment 56 Les chantillons sanguins ont t centrifug s imm diatement et leur plasma s par de leur culot de globule rouge A la limite plasma culot il est difficile de bien s parer ces deux parties cette phase interm diaire a donc t jet e Tous les plasmas des diff rents pr levements ont t mis ensemble ainsi que tous les culots de globules rouges de mani re obtenir un pool de plasma de 40 mL et un pool de globules rouges de 38 mL Deux millilitres d eau pure a t ajout e au pool de globule rouge ce qui a cr un choc osmotique et donc une lyse totale des globules rouges Nous avons ensuite reconstitu des tubes avec une proportion plus ou moins importante de globules rouges en restant dans les normes physiologiques Tableau 7 Nous avons m lang avec pr caution les tubes obtenus puis nous les avons a nouveau centrifug s Figure 15 Les tubes ainsi cr s des photographies de l chelle de couleur obtenue ont t r alis es pour pouvoir par la suite l aide de la couleur
2. pid miologiques biais ventuelles p 73 B La concentration en cuivre p 73 1 Valeurs usuelles de la concentration en cuivre chez le chien apparemment sain 2 Effet des crit res pid miologiques sur la cupr mie CONCLUSION sn rennes erdisne EEEE tra rte rent etant eh ele net p 76 ANNEXES nes ence cv vee en s inn av Monte drame Leone Eu p 77 Annexe 1 Questionnaire ayant t rempli par tous les propri taires de chien p 78 Annexe 2 Mode d emploi du dosage en cuivre l ENVT p 80 BIBLIOGRAPHIE Sn nt den ane tue p 84 13 Abbreviations hCtr1 Human Copper Transporter COMMD1 Copper Metabolism gene MURR1 containing Domain 1 XIAP X linked Inhibitor of Apoptosis Protein MTF 1 Metal responsive element binding Transcription Factor 1 CCS the Copper Chaperone for SOD1 Atox 1 Antioxydant protein 1 SOD superoxyde dismutase DMT1 Divalent Metal Transporter 1 NRAMP Natural Resistance Associated Macrophage Protein DCT1 Divalent Cation Transporter 1 14 Tables des illustrations Table des Figures Figure 1 Illustration de l absorption du cuivre chez l homme Figure 2 Le cuivre dans les h patocytes Figure 3 M canisme d action de la c ruloplasmine Figure 4 Localisation de l ATP7A et l ATP7B dans les cellules en fonction de la concentration en cuivre Figure 5 M tabolisme du cuivre dans le placenta Figure 6 Variations de la concentration en cuivre en fonction de l ge Figure 7 Variatio
3. NATIONALE VETERINAIRE Minist re de l Agriculture de l Agroalimentaire et de la F ret ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE M A MILON PROFESSEURS CLASSE EXCEPTIONNELLE AUTEFAGE Andr Pathologie chirurgicale CORPET Denis Science de l Aliment et Technologies dans les Industries agro alimentaires DELVERDIER Maxence Anatomie Pathologique ENJALBERT Francis Alimentation EUZEBY Jean Pathologie g n rale Microbiologie Immunologie FRANC Michel Parasitologie et Maladies parasitaires MARTINEAU Guy Pathologie m dicale du B tail et des Animaux de Basse cour PETIT Claude Pharmacie et Toxicologie REGNIER Alain Physiopathologie oculaire SAUTET Jean Anatomie SCHELCHER Francois Pathologie m dicale du B tail et des Animaux de Basse cour PROFESSEURS 1 CLASSE M BERTHELOT Xavier Pathologie de la Reproduction M BOUSQUET MELOU Alain Physiologie et Th rapeutique Mme CLAUW Martine Pharmacie Toxicologie M CONCORDET Didier Math matiques Statistiques Mod lisation M FOUCRAS Gilles Pathologie des ruminants M LEFEBVRE Herv Physiologie et Th rapeutique PROFESSEURS 2 CLASSE Mme BENARD Genevi ve Hygi ne et Industrie des Denr es alimentaires d Origine animale M BERTAGNOLI St phane Pathologie infectieuse Mme CHASTANT MAILLARD Sylvie Pathologie de la Reproduction M DUCOS Alain Zootechnie M DUCOS DE LAHITTE Jacques Parasitologie et Maladies parasitaires Mme GAYRARD TROY V roniqu
4. WARET SZKUTA Agn s Production et pathologie porcine MAITRES DE CONFERENCES et AGENTS CONTRACTUELS M BOURRET Vincent Microbiologie et infectiologie Mme FERNANDEZ Laura Pathologie de la reproduction ASSISTANTS D ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHE Mile DEVIERS Alexandra Anatomie Imagerie M DOUET Jean Yves Ophtalmologie Mile LAVOUE Rachel M decine Interne Mile PASTOR M lanie M decine Interne M VERSET Micha l Chirurgie des animaux de compagnie REMERCIEMENTS A Monsieur le professeur MOULIS Professeur l Universit Paul Sabatier de Toulouse Qui nous a fais l honneur d accepter la pr sidence de notre jury de th se Avec toute ma gratitude hommages respectueux A Madame le Docteur Nathalie Priymenko Maitre de conf rences a l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse Alimentation Qui m a accompagn tout au long de la r alisation de cette th se Merci pour votre disponibilit votre patience votre gentillesse et votre perp tuelle bonne humeur Tr s sinc res remerciements A Madame le Docteur Lydie BRET BENNIS Maitre de conf rences a l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse Physique et Chimie biologiques et m dicales Qui nous a fait l honneur de prendre part notre jury Sinc re reconnaissance A Madame le Docteur Petra Rouch Buck Docteur en m decine v t rinaire IRPH Merci pour votre aide pr cieuse et votre implication dans ce travail Qu elle recoive ici ma profonde reconnaissance et
5. il n y a pas de diff rences significatives entre la cupr mie chez la chienne st rilis e et chez le m le ce qui nous laisse suppos que par un m canisme similaire celui rencontr chez l homme les hormones sexuelles f minines l oestradiol entrainent une augmentation de la quantit de cuivre dans le sang Ces r sultats sont cependant en contradiction avec ceux obtenus sur des beagles 106 Lors de cette tude 800 beagles avaient taient pr lev s La concentration en cuivre tait plus lev e chez les m les que chez les femelles De plus lors de cette tude une diff rence entre la concentration plasmatique en cuivre chez le m le entier et chez le m le castr avait t mise en vidence Nous ne retrouvons pas cela avec au contraire une tendance non significative l augmentation Nous n expliquons pas cette diff rence gt La race La race semble avoir un impact important sur la concentration en cuivre dans le sang chez le chien Cela avait d j t mis en vidence lors d une pr c dente tude 108 II est important de not que certaines races tels que les bouviers pr sentent des concentrations cuprique tr s basse l oppos des l vriers qui ont des concentrations tr s lev es Ces diff rences l ne s expliquent priori pas par la diff rence d activit ce param tre n ayant pas montr de variation significative de la concentration en cuivre dans notre tude 74 gt L h
6. molyse L h molyse n influence pas les r sultats du dosage de la concentration en cuivre par spectrom trie d absorption comme de pr c dentes tudes l avaient laiss suppos 106 107 Lors de cette exp rience les tubes n ont t que faiblement h molys s avec une note d h molyse de moins de 4 Or nous avons vu pr c demment que la majorit du cuivre se trouve dans le plasma et qu une tr s faible quantit li e la SOD se retrouve dans les globules rouges 5 32 33 Il est donc logique que la lyse d une partie des globules rouges ne lib re pas une quantit de cuivre suffisante pour modifier les r sultats des dosages 75 CONCLUSION Le cuivre est un m tal essentiel la vie un oligo l ment Il est apport l organisme par l alimentation et est limin par la bile Son m tabolisme est finement r gul ce qui entraine une concentration dans le sang en cuivre assez stable bien que variable d un individu l autre De nombreux facteurs de variations ont t identifi s bien que tous les m canismes d action n ont pas t d crypt s Nous avons ici montr que la m thode de conservation le temps de latence entre le pr l vement et la centrifugation l h molyse et la m thode de centrifugation n ont pas d influence sur le dosage du cuivre par spectrom trie d absorption Notre tude a permis de d finir des valeurs usuelles de la cupr mie chez le chien sain ainsi qu
7. molyse ne modifie pas de mani re significative la concentration en cuivre Figure 17 5 5 490 5 0 Bb 4 5 CU eet ee ote ie ETES Figure 17 Influence de l h molyse sur la concentration en cuivre Les num ros correspondent la gamme d h molyse r alis e pr c demment La concentration en cuivre est exprim e en umol L 3 Conclusion L h molyse ne semble pas avoir une influence sur la concentration en cuivre Cependant beaucoup de manipulation ont t r alis es et la composition initiale de chaque tube n est pas identique il est donc possible qu il y ait un biais dans cette exp rience La gamme d h molyse r alis e permettra d estimer le taux d h molyse de mani re objective B L influence de l h molyse 1 Mat riel et m thodes Cette exp rience a t r alis e sur onze chiens apparemment sains de plus de 20 kg Cinq tubes h parin s de 4 mL ont t pr lev s aux veines jugulaires en une ponction au m me moment chaque chien mise part un chien pour lequel seulement 4 tubes ont t pr lev s Les onze chiens ont t r partis en 2 groupes 59 Groupe 1 Trois chiens ont t inclus dans ce groupe Les 5 tubes n ont subit aucune transformation Groupe 2 Les 8 autres chiens ont t inclus dans ce groupe Les tubes ont t secou es de mani re nerg tique pendant un temps donn plus ou moins long afin d h molyser les pr levements voir tablea
8. rempli par tous les propri taires de chien Pr l vement Date Heure Race Age Robe Etiquette du chien Sexe St rilis e O F Gi LI M bn Depuis quand CLitraceptif Lesquels Code Postal Etat corporel BCS 9 Poids r el Poids id al estim Mode de vie L Appartement L Maison avec jardin L Maison avec jardin sorties ext rieures L Autre Vit avec d autres animaux si oui lesquels Activit L Calme LI Actif Ll Tr s actif sportif troupeau chasse r guli re Agility Remarques ventuelles Alimentation cocher plusieurs cases si vous m langez Moment du dernier repas LI Croquettes L Alimentation humide Nom pr cis Boite Barquette Quantit en grammes Sachets Nom pr cis Quantit L Ration m nag re pr paration la Eau maison ingr dients L Robinet C Puits Quantit Ll Bouteille pr cisez marque 78 Friandises lesquelles Autre remarque Nombre de repas Ll LJ LWolont Votre animal ronge t il l che t il ou joue t il avec des objets en m tal jouets gamelle Pr cisez Ant c dents m dicaux Date de la derni re vermifugation Produit utilis L animal pr sente t il ClDes modifications du LIDes anomalies de _ D autres signes pelage pigmentation de la peau dermatologiques oil te
9. 2001 57 5 p 521 31 101 Milne D B Assessment of copper nutritional status Clin Chem 1994 40 8 p 1479 84 102 GJ B Copper control as an antiangiogenic anticancer therapy lessons from treating Wilson s disease Experimental biology and medecine 2001 226 p 665 673 103 Walter R M Jr Uriu Hare J Y Lewis Olin K Oster M H Anawalt B D Critchfield J W Keen C L Copper zinc manganese and magnesium status and complications of diabetes mellitus Diabetes Care 1991 14 11 p 1050 6 104 Hamza l Faisst A Prohaska J Chen J Gruss P Gitlin J D The metallochaperone Atox1 plays a critical role in perinatal copper homeostasis Proc Natl Acad Sci U S A 2001 98 12 p 6848 52 105 Montaser A C Tetreault M Linder Comparison of copper binding components in dog serum with those in other species Proc Soc Exp Biol Med 1992 200 3 p 321 9 106 Fisher G L Effects of disease on serum copper and zinc values in the Beagle Am J Vet Res 1977 38 7 p 935 40 107 Keen C L B Lonnerdal G L Fisher Seasonal variations and the effects of age on serum copper and zinc values in the dog Am J Vet Res 1981 42 2 p 347 50 108 Mert H Mert N Dogan I Cellat M Yasar S Element status in different breeds of dogs Biol Trace Elem Res 2008 125 2 p 154 9 109 Shih J L Keating J H Freeman L M Webster C R L Chronic hepatitis in Labrador Retrievers clinical presentation and progn
10. 39 La maladie est principalement caract ris e par de la mortalit infantile bien que la clinique soit variable 20 La maladie de Wilson La maladie de Wilson se caract rise par une surcharge en cuivre dans le foie ainsi qu une lib ration de cuivre sous forme libre dans le sang Cette fraction libre potentiellement toxique serait responsable de signes cliniques tels que des troubles neurologiques 38 C est une maladie autosomale r cessive qui touche l ATP7B qui intervient dans le foie LATP7B n tant pas exprim e on a donc une perte de la capacit a excr ter le cuivre vers la bile et incorporer le cuivre la c ruloplasmine 5 20 39 Les signes sont principalement h patiques troubles de la coagulation mort fulgurante etc ou nerveux ataxie tremblements rigidit etc Cette maladie est trait e par des ch lateurs du cuivre Autres D autres maladies comme la cirrhose infantile indienne endemic tyrolean infantile cirrhosis ETIC ou la toxicit cuprique idiopathique maladie autosomiale r cessive ont t d crites chez l homme Ces pathologies apparaissent souvent t t dans l enfance et leur origine g n tique n a pas encore t identifi mais est fortement suspect 10 11 2 Acquise De d ficit gt M dicamenteux Un traitement par des sels de zinc perturbe l absorption du cuivre comme nous l avons vu pr c demment 39 Il existe des ch lateurs du cuivre tels q
11. 80 7 66 Comportement pendant la consultation Contract 22 14 7 Normal 90 60 Agit 38 25 3 Alimentation Croquettes 147 98 Croquettes type premium 106 12 2 Croquettes supermarche 41 27 9 Alimentation humide ou ration m nag re 3 2 Nombre de repas par jour 1 47 313 2 76 50 7 3 15 10 volont 12 8 Eau de boisson Eau du robinet 141 94 Flaque eau de pluie puit 7 4 7 Eau de bouteille 2 1 3 Etat corporel Poids r l lt 10kg 42 28 10 20kg 55 36 7 20 30kg 23 15 3 30 40kg 19 12 7 gt 40kg 10 6 7 BCS de 1 3 animal maigre 10 6 6 de 4 5 animal normal 110 73 3 de 6 8 animal en surpoids 30 20 Troubles dermatologiques Oui 84 56 Non 66 44 Hemolyse 1 122 81 3 2 22 14 7 3 4 2 7 4 2 1 3 Tableau 10 Caract ristiques pid miologiques de la population canine tudi es 67 B Analyse statistique des donn es La normalit de la distribution des valeurs de la cupr mie a t test e par le test Shapiro Wilk dans R version 3 0 1 Une ANOVA avec 13 facteurs a t r alis race intensit de la couleur statut sexuel BCS lieu de vie d lai entre le pr levement et le repas le fait de ronger du m tal le nombre de repas par jour l activit la pr sence d autres animaux l existence d une h molyse et le moment du pr l vement Il R sultats A Distribution des concentrations en cuivre dans la population canine La distribution de la concentration plasmatique
12. ATP7A and ATP7B cousins not twins J Bioenerg Biomembr 2007 39 5 6 p 403 7 20 S Lutsenko M J P Fonction and regulation of the mammalian copper transporting ATPases Insights from biochemical and cell biological approaches The journal of Membrane biology 2002 191 p 1 12 21 Hellman N E Kono S Mancini GM Hoogeboom AJ De Jong GJ Gitlin JD Mechanisms of copper incorporation into human ceruloplasmin J Biol Chem 2002 277 48 p 46632 8 22 Sato M J D Gitlin Mechanisms of copper incorporation during the biosynthesis of human ceruloplasmin J Biol Chem 1991 266 8 p 5128 34 23 Wirth P L M C Linder Distribution of copper among components of human serum J Natl Cancer Inst 1985 75 2 p 277 84 24 Babic Z Tariba B Kova i J Pizent A Varnai V M Macan J Relevance of serum copper elevation induced by oral contraceptives a meta analysis Contraception 2012 25 Camakaris J Voskoboinik J F Mercer Molecular mechanisms of copper homeostasis Biochem Biophys Res Commun 1999 261 2 p 225 32 26 Linder M C Wooten L Cerveza P Cotton S Shulze R Lomeli N Copper transport Am J Clin Nutr 1998 67 5 Suppl p 965S 971S 27 Meyer L A Durley A P Prohaska J R Harris Z L Copper transport and metabolism are normal in aceruloplasminemic mice J Biol Chem 2001 276 39 p 36857 61 28 Holtzman N A B M Gaumnitz Studies on the rate of release and turnover of cerulo
13. Diaz Iron copper and zinc levels in urine relationship to various individual factors J Trace Elem Med Biol 1995 9 4 p 200 9 86 F Kamp T R CM Donangelo Effect of oral contraceptive use and zinc supplementation on zinc iron and copper biochemical indices in young women The european e journal of clinical nutrition and metabolism 2011 6 p 253 258 87 Benes B Sp va kova V Smid J Batariova A Cejchanova M Z tkov L Effects of age BMI smoking and contraception on levels of Cu Se and Zn in the blood of the population in the Czech Republic Cent Eur J Public Health 2005 13 4 p 202 7 88 Diaz Romero C Hendquez Sanchez P Lopez Blanco F Rodriguez Rodriguez E Serra Majem L Serum copper and zinc concentrations in a representative sample of the Canarian population J Trace Elem Med Biol 2002 16 2 p 75 81 89 Johnson P E D B Milne G I Lykken Effects of age and sex on copper absorption biological half life and status in humans Am J Clin Nutr 1992 56 5 p 917 25 90 Margen S K J Effect of oral contraceptive agents on the metabolism of some trace minerals The american journal of clinical nutrition 1975 28 p 392 402 91 Abdulrazzaq Y M Osman N Nagelkerke N Kosanovic M Adem A Trace element composition of plasma and breast milk of well nourished women J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng 2008 43 3 p 329 34 92 Laura Perrone MD G G phD Renata Moro Zin
14. Groupe 2 Les tubes sont centrifug s froid l aide de la centrifugeuse Sigma 3K15 bioblock scientific Certains des tubes ont t h molys s Ces tubes l ont t tout de m me analys s apr s une valuation subjective du taux d h molyse class de O non h molys a 2 tr s h molys Nous avons alors pr lev 1mL de plasma de chaque tube et les plasmas ont t analys s d apr s la m thode d crite pr c demment Un tube du groupe 2 a t exclu de l tude car nous n avons pas put pr lever 1 mL de plasma 53 B R sultats La m thode de centrifugation a chaud ou a froid n a pas d influence sur la concentration en cuivre p 0 383 Figure 13 10 CUIVRE 6 l d Figure 13 Effet du mode de centrifugation sur la concentration en cuivre Groupe 1 les tubes ont t centrifug s chaud Groupe 2 les tubes ont t centrifug s froid La concentration en cuivre est exprim e en pmol L Les moyennes sont repr sent es sur ce graphique C Conclusion La m thode de centrifugation n a pas d influence sur le taux de cuivre dos Nous utiliserons donc la centrifugeuse chaud eppendorf centrifuge 5702 accessible en clinique IV Influence du temps d attente avant centrifugation Les pr l vements sanguins ont t effectu s au service de m decine pr ventive r frig r s et centrifug s par nos soins La dur e entre le pr l vement et la centrifu
15. P type ATPase efflux pump from the Golgi apparatus to the plasma membrane a novel mechanism of regulated trafficking EMBO J 1996 15 22 p 6084 95 47 Louro M O J A Cocho J C Tutor Assessment of copper status in pregnancy by means of determining the specific oxidase activity of ceruloplasmin Clin Chim Acta 2001 312 1 2 p 123 7 48 Platonova N Guolikhandanovac N Tsymbalenkoa N Zhigulevaa E Zhivulkoc T Vasinc A Evsukovad l Puchkovaa L Milk ceruloplasmin is a valuable source of nutrient copper ions for mammalian newborns J Trace Elem Med Biol 2007 21 3 p 184 93 49 L Wooten R A S R W Lancey M Lietzow M C Linder Ceruloplasmin is found in milk and amniotic fluid and may have a nutritional role Nutritional Biochemistry 1996 7 p 632 639 50 Lonnerdal B Bioavailability of copper Am J Clin Nutr 1996 63 5 p 821S 9S 51 R A Laven C T L An evaluation of the effect of clotting on the relationship between copper and ceruloplasmin in bovine blood The veterinary journal 2007 174 p 400 402 52 Hsiung C S Andrade JD Costa R Ash KO Minimizing interferences in the quantitative multielement analysis of trace elements in biological fluids by inductively coupled plasma mass spectrometry Clin Chem 1997 43 12 p 2303 11 53 Faa G Nurchi V Demelia L Ambu R Parodo G Congiu T Sciot R Eyken P V Silvagni R Crisponi G Uneven hepatic copper distribution in Wilson s
16. West highland white terrier le dalmatien le doberman et le labrador retriever Toutes ces maladies sont caract ris es par une accumulation en cuivre dans le foie entrainant une inflammation voir une cirrhose h patique Cependant il existe des diff rences quant a leur intensit leur pid miologie et leur gravit 10 tableau 5 44 Bedlington Labrador Dobermann WHW terrier Dalmatien G ne COMMD1 Aut ial Mode de transmission Rad Complexe Complexe r cessive Pr disposition sexuelle Non Femelles Femelles Non Non Adolescent age Adolescent age Adolescent age Age moyen vieux Adolescent age Age d apparition i moyen moyen moyen chien moyen Pathologie h patique Cirrhose Cirrhose Cirrhose Cirrhose Cirrhose Augmentation de cuivre par rapport aux valeurs usuelles dans 50 x 10x 10x 20 x 20x le foie lt 400ug g Taux de c ruloplasmine Normal augment dans le sang Influence de l alimentation Mineure Majeure Tableau 5 Les h patites cupriques chez les chiens d apr s 10 Avec WHW terrier le West Highland White terrier D un point de vue histologique ces maladies par surcharge sont peu diff rentes car accumulation de cuivre commence toujours dans la zone centrolobulaire h patique 10 Les signes cliniques sont ceux d une h patite avec une diminution de l app tit des vomissements un abattement une perte de poids dela diarrh e parfois une PuPd 109 Le traitement par
17. ann es une princesse A Aur line Pour ton rire de cl molette pour les futurs b b s d Ayan peut tre un jour et pour les petits repas top chef A Carole Pour les heures de correction de m decine pour ta force int rieure que j admire et pour tous les fous rires Malgr la distance tu garderas toujours une grande place dans mon coeur A Paul Pour ta gentillesse ton humour que j adore et ta bonne humeur perp tuelle Apr s a interdiction formelle de me soulever la jupe plus JAMAIS A Tiffany Pour toutes ces boums et pour avoir toujours le sourire A Amandine Pour toutes ces boumettes endiabl es et pour ta joie de vivre A Audrey Pour tes cr pes et autres petits plats a tomber A Anne lise Pour ta gentillesse et ta modestie A Francois Lenfant Pour ces boumettes pour ta bonne humeur toujours constante pour tre le DJ de nos soir es et surtout pour LA chanson A Marine et H l ne mes amies de toujours Pour avoir toujours garder une place pour moi dans vos vies malgr la distance A mes petits poulots Adeline Charlotte Lucas Maxime Alys e s parce que vous tes les meilleurs A tous les poulots des autres que j aime quand m me Patard Herm s nooonnn Corentin et julie Marie Bartoli Fanny Josselin Albertini A Fabien Pour avoir fais un bout de chemin avec moi J esp re sinc rement que tu sauras tre heureux A tous ceux que je n ai pas cit s mais auq
18. atomique Quelque soit le principe utilis le dosage par spectrom trie permet de doser plusieurs m taux en m me temps dans un chantillon C est une technique pr cise fiable et rapide qui n cessite en g n ral une pr paration pr alable des chantillons 52 63 Il existe de nombreuses m thodes de pr paration des chantillons qui ont toutes pour but d viter les interf rences voir ci dessous Par exemple on r alise souvent une dilution l acide nitrique pour liminer la mati re organique contenue dans le pr l vement et qui peut interf rer lors de l atomisation ou encore colmater les bruleurs 61 64 65 2 Les interf rences en spectrom trie En spectrom trie il existe des interf rences spectrales et non spectrales Les interf rences non spectrales sont d origine physique alors que les interf rences spectrales sont d origine chimique 31 Les interf rences non spectrales galement appel es effet matrice sont dues a la pr sence de composants matriciels dans l chantillon Cet effet matrice est facilement contrebalanc par un calibrage externe on donne la machine des produits de r f rence contenant l oligo l ment que l on dose en concentration connue un calibrage interne on talonne la machine l aide de solutions compos es de l chantillon auquel on ajoute une quantit connue de l l ment d int r t 52 61 Les interf rences spectrales sont dues des
19. basolat ral de la cellule et se recycle en permanence entre la membrane plasmatique et un pool de v sicules intracellulaires qui capture le cuivre L ATP7B se redirige vers le p le apical de la cellule o il s accumule la surface de v sicules rassembl es pr s de la membrane cellulaire Il existe galement un faible pool de v sicules qui se recyclent en permanence tout comme pour l ATP7A Lorsque la concentration en cuivre retrouve son niveau basal l ATP7A retourne au niveau du Trans Golgi TG par transcytose L ATP7B retourne galement au niveau du TG alors que les v sicules accumul es transitent vers la membrane des canicules biliaires pour tre excr t es Sur ce sch ma l ATP7A et l ATP7B sont repr sent s dans une m me cellule mais cela ne repr sente pas la situation r elle ces transporteurs sont en r alit exprim s dans des cellules diff rentes l exception du placenta et du tissu mammaire 1 G Le cuivre pendant la gestation et la lactation 1 Lagestation Le cuivre est transf r au foetus via le placenta et secondairement via l ingestion de liquide amniotique 5 Les formes libres ou li es des acides amin s sont probablement celles qui sont les mieux transmises 47 la c ruloplasmine n ayant pas un r le essentiel dans ce processus 29 L ATP7A et l ATP7B jouent un r le primordial dans le transport du cuivre dans le placenta Les deux transporteurs sont pr sents dans les syn
20. bile 5 11 20 35 37 39 41 42 46 Dans des cellules polaris es l ATP7B se dirige vers le p le apical La majorit de ATP7B se retrouve alors a la surface des v sicules 19 Figure 4 En cas de chute rapide de la concentration intracellulaire en cuivre le taux de phosphorylation de l ATP7B diminue ce qui entraine sont retour rapide au trans golgi 20 Cette migration de l ATP7B en fonction de la concentration en cuivre a uniquement t mise en vidence dans les h patocytes Il est possible que ce ph nom ne ne soit pas pr sent dans les autres cellules exprimant ce transporteur 1 19 Comme vu pr c demment COMMD1 intervient dans l excr tion des v sicules form es COMMD1 est inhib par la X linked inhibitor of Apoptosis Protein XIAP qui active sa d gradation Lorsque le cuivre est pr sent en forte quantit dans la cellule XIAP re oit du cuivre de la part de CCS ce qui aboutit un changement de conformation de cette prot ine qui est alors d grad e L inhibition exerc e sur COMMD1 est alors lev e et l excr tion biliaire favoris e 10 27 3 a E b 1e Y D Apical Basolateral 7 TE emf Haute Cu eu Warza aTa Q V sicule ATP7A KV sieute amp ATP7B m em Basse Cu Figure 4 Localisation de l ATP7A et de l ATP7B dans les cellules en fonction de la concentration en cuivre Lorsque la concentration en cuivre est lev e fl ches rouges l ATP7A se redirige vers le p le
21. chez les femmes elle a tendance augmenter d apr s 88 36 4 Variations journali res Il y a une variation nycth m rale de la concentration en cuivre ainsi qu une variation du taux de c ruloplasmine en parall le m me si cette derni re est moins marqu e avec une diminution au cours de la nuit 94 95 Ces variations sont cependant relativement faibles 71 96 Figure 7 4 4 10 10 4 5 de variations de varations par rapport la par rapport la moyenne moyenne 9 10 0 10h ih 18h Xh 2h 6h 10h 1h i h 2h Temps en heure Temps en heure Figure 7 Variations de la concentration en cuivre gauche et en c ruloplasmine droite sur 24h chez l homme Les donn es ont t r colt es sur une semaine La concentration moyenne par heure sur la semaine pour chaque patient a t calcul e ainsi que la concentration moyenne de tous les patients toutes heures confondues ligne en pointill Les fl ches correspondent aux repas d apr s 94 5 L ob sit Les concentrations en cuivre et en c ruloplasmine dans le sang sont plus lev es chez les personnes ob ses 85 92 97 98 La concentration en cuivre est proportionnelle PIMC Indice de Masse Corporelle chez les hommes et non chez les femmes 87 6 L exercice physique Lors d un effort intense ponctuel on note une augmentation d environ 25 de la concentration en cuivre dans le plasma 88 99 Au contraire ch
22. crite pr c demment Un tube du groupe 1 et deux tubes du groupe 2 ont t exclus de l tude car nous n avons pas put pr lever 1mL de plasma B R sultats Les trois groupes tudi s ne sont pas significativement diff rents Figure 12 Cuivre 18 16 14 li 12 T T T 1 2 3 Figure 12 Effet du mode de conservation entre le pr l vement et la centrifugation sur la concentration en cuivre Groupe 1 Les tubes sont laiss s 2h a temp rature ambiante groupe 2 les tubes sont laiss s 2h au r frig rateur groupe 3 les tubes sont laiss s 1h temp rature ambiante puis 1h au r frig rateur La concentration en cuivre est exprim e en mol L Les moyennes sont repr sent es sur ce graphique L h molyse ne modifie pas de mani re significative les r sultats C Conclusion La m thode de conservation des tubes n a pas d influence sur le taux de cuivre dans le tube Nous pouvons donc prendre tous les pr l vements sans se soucier de leur m thode de conservation Nous les conserverons cependant 4 C imm diatement apr s la ponction Ces r sultats ne sont valables que pour un temps de conservation de 2h Si ce temps est inf rieur on peut supposer que les r sultats ne seront pas modifi s On ne peut cependant pas extrapoler cela des dur es de conservation plus importante pour lesquelles le comportement est inconnu 52 Lors de cette exp rience et malgr toutes nos
23. des ch lateurs du cuivre p nicillamine ou 2 3 2 tetramine diminue la quantit de cuivre dans le foie chez les chiens atteints L efficacit de ce traitement d pend de la race touch e Chez certains chiens il est possible d atteindre des concentrations cupriques h patiques normales lt 400 ug g 10 Le cas du Bedlington terrier La maladie du Bedlington terrier est une maladie autosomale r cessive touchant le g ne exprimant COMMD1 ce qui r duit de mani re drastique l excr tion biliaire du cuivre 10 110 111 L exc s de cuivre est alors stock dans les lysosomes des h patocytes On a une concentration sanguine en c ruloplasmine normale contrairement ce que l on observe dans la maladie de Wilson chez l homme 35 Cette maladie reste cependant complexe car les chiens poss dant deux g nes normaux de COMMD1 peuvent tout de m me tre atteints Il y a donc probablement un autre g ne non identifi qui est impliqu 10 La maladie se d clare autour de 2 5 ans d age 11 45 Une h patite chronique s installe progressivement et on observe alors des concentrations cupriques tr s lev es dans les h patocytes jusqu 15 000 ug g de mati re brute soit 50 fois la quantit normale 10 A terme cela entraine une cirrhose h patique 35 L exclusion de la reproduction des Bedlington en fonction d un test g n tique disponible aux Etats Unis chez VetGen ou encore en Australie chez Gente
24. des tubes estimer le taux d h molyse de nos pr l vements Figure 16 Pour finir nous avons pr lev 1mL de plasma de chaque tube et les plasmas ont t analys s d apr s la m thode d crite pr c demment N de tube plasma mL Globule rouge mL tubes 1 2 0 2 2 1 9 0 1 2 3 1 8 0 2 3 4 1 7 0 3 3 5 1 6 0 4 3 6 1 4 0 6 3 7 12 0 8 3 8 1 1 3 9 0 8 1 2 3 Tableau 7 Reconstitution des tubes avec diff rentes proportions de plasma et de globules rouges Chaque tube final contient 2 mL 57 S total ang tota gN 2mL d eau pure gt Lyse totale CH Em _ e CT a lt Centrifugation Pool de Pool de plasma Globules rouges Plasma Culot de Globules rouge Plasma Culot de Globules rouges Yo M langer Pool de Pool de plasma Globules rouges Schema 1 Schema 2 Figure 15 R alisation d une gamme d h molyse Sch ma 1 Les tubes de sang sont centrifug s pour cr er un pool de plasma et de globules rouges Sch ma 2 Les globules rouges sont h molys s l aide de 2mL d eau pure puis des tubes de 2mL sont reconstitu s avec diff rentes quantit s de globules rouges et de plasma cr ant ainsi une gamme d h molyse 2 R sultats gt La gamme d h molyse Les tubes sont num rot s de 1 non h molys 9 tr s h molys 1 2 3 qd 5 6 7 8 9 Figure 16 Gamme d h molyse 58 gt Influence de l h molyse sur les dosages Une l g re h
25. l ments pr sents dans l chantillon doser et ayant des propri t s chimiques similaires celles de l l ment d int r t masse mol culaire rayon d absorption etc Elles sont plus difficiles contr ler 66 Ill Les facteurs de variations connus de la concentration en cuivre dans le sang chez l homme De nombreux facteurs peuvent faire varier la concentration en cuivre dans le sang Pour interpr ter les r sultats d un dosage en cuivre il est donc important de les connaitre A Variations pr analytiques 1 S rum et plasma Comme vu pr c demment le dosage du cuivre peut s effectuer sur du s rum ou sur du plasma La concentration en cuivre dans le plasma est toujours sup rieure celle du s rum 67 En effet il a t montr que lors de la coagulation du sang une partie du cuivre li la c ruloplasmine est s questr e dans le culot Le m canisme est cependant inconnu 51 68 De plus le taux de cuivre s questr est ind pendant de la concentration initiale pr sente dans le plasma Il est donc conseill de r aliser les dosages partir de plasma 2 Le stockage La concentration en cuivre d un pr l vement sur sang total varie en fonction du temps de stockage et de la temp rature et ce ind pendamment du contenant Des variations majeures sont observ es au bout d une semaine Pour limiter les variations il est conseill de centrifuger les chantillons imm diatement apr s pr l vem
26. lorsqu il est pr sent en trop forte quantit ses propri t s d oxydor duction peuvent g n rer des radicaux libres ayant des cons quences dramatiques pour la cellule 1 Ainsi l hom ostasie du cuivre est primordiale pour permettre le maintien de la cellule dans des conditions optimales Chez l homme les normes physiologiques leurs facteurs de variations ainsi que les li s ce min ral sont bien connues En revanche chez le chien il y a tr s peu d tudes sur ce sujet Pourtant des signes dermatologiques squames changement de couleur du poil peuvent tre rencontr s lorsque l hom ostasie cuprique est modifi e mais aucun moyen n est disponible l heure actuelle pour en conna tre l incidence et le diagnostiquer chez le chien et le chat Ce travail a eu pour but dans un premier temps de faire le point sur le m tabolisme cuprique et son hom ostasie ainsi que sur les facteurs de variations identifi s chez l homme Dans un deuxi me temps une tude exp rimentale a t men e chez le chien afin de d terminer la cupr mie chez le chien sain pr sent en consultation de m decine pr ventive l Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse Le deuxi me but de cette tude a t d tablir des liens possibles entre certains facteurs pid miologiques et les variations de concentration en cuivre dans le plasma afin de pouvoir ventuellement d finir des profils risque de perturbation cuprique Ains
27. plasma ou sur du s rum II est cependant conseill de le faire sur du plasma car il a t montr que l on a une perte de c ruloplasmine et donc de cuivre lors de la coagulation du sang Le cuivre manquant se retrouve dans le culot Le m canisme est cependant inconnu 51 2 Lestissus Les biopsies h patiques sont un pr l vement de choix pour le diagnostic d un trouble cuprique Cependant ce n est pas facile obtenir et bien plus invasif qu une prise de sang 52 De plus la teneur en cuivre est h t rog ne entre les lobes mais galement au niveau des acini Ainsi il est parfois difficile de conclure a partir d une seule biopsie 10 34 53 3 Les cheveux Le dosage de cuivre dans les cheveux est th oriquement id al car il refl te les variations chroniques du statut en cuivre de l organisme Le pr l vement est simple et rapide r aliser et la concentration est plus lev e que dans le sang ce qui rend les dosages plus faciles 54 Cependant le taux de cuivre dans les cheveux est tr s variable en fonction des contaminants ext rieurs tels que le s bum la transpiration ou les r sidus de cuivre pr sents dans l air et dans les cosm tiques 52 55 de facteurs individuels tels que la race la couleur des cheveux ou le sexe 56 del alimentation 54 des traitements m dicamenteux re us par le donneur 52 54 de facteurs pr analytiques tels que le temps entre le pr l vement et l analyse 5
28. pr cautions certains tubes ont t h molys s Cela ne semble pas avoir modifi nos r sultats lll Influence de la m thode de centrifugation Les pr l vements sanguins seront effectu s au service de m decine pr ventive r frig r s puis centrifug s Il existe deux types de centrifugeuse des centrifugeuses chaud plus commodes utiliser et disponible aux cliniques de l ENVT et des centrifugeuses froid disponible uniquement dans le laboratoire d alimentation Nous pouvons avoir acc s ces deux types de centrifugeuses il est donc important de savoir si les r sultats obtenus par centrifugation avec l une ou l autre de ces machines sont quivalents ou le cas ch ant quelle centrifugeuse il vaut mieux utiliser A Mat riel et m thodes Cette exp rience a t r alis e sur une chienne bouvier bernois apparemment saine de 51 kg 12 tubes h parin s de 4mL ont t pr lev s aux jugulaires en 3 ponctions diff rentes au m me moment Ces douze tubes ont t r partis en 2 groupes de 6 tubes de mani re al atoire afin d homog n iser les groupes de d part et d ainsi viter les variations dues aux pr l vements multiples Les tubes ont alors t identifi s r frig r s pendant une heure puis centrifug s avec l une des deux machines 4000 tours pendant 10 min Groupe 1 Les tubes sont centrifug s chaud l aide de la centrifugeuse eppendorf centrifuge 5702
29. pr s les conditions que nous rencontrerons dans la clinique de l ENVT C La quantit pr lev e En m decine humaine la limite maximale d un pr l vement sanguin unique est de 6 du volume total circulant soit 10 du poids vif Les hommes ne doivent pas redonner leur sang dans le mois qui suit Nous avons d cid d extrapoler cela au chien et donc de ne pas d passer un maximum de 6mL kg Tous nos chiens ne seront pas re pr lev s dans le mois qui suit D Analyse statistique L influence des param tres pr analytiques sur la concentration en cuivre a t r alis e l aide du logiciel R version 3 0 1 par des ANOVA un facteur Les diff rences obtenues ont t consid r es comme significative avec un risque d erreur inf rieur 5 ll Influence de la m thode de conservation Lors de notre tude les pr levements sanguins seront effectu s au service de m decine pr ventive de l ENVT puis centrifug s par nos soins Dans ces conditions l la centrifugation ne pourra pas tre imm diate Il nous faut donc savoir quelles sont les modalit s de conservation optimales entre le moment du pr levement et le moment de la centrifugation et si leurs non respect a un impact important sur nos r sultats 50 A Mat riel et m thodes Cette exp rience a t r alis e sur un chien labrador apparemment sain de 30 kg labrador 21 tubes h parin s de 4mL ont t pr lev s aux jugulaires en 5 ponctions
30. puis centrifug s Le dosage est effectu sur le surnageant Figure 10 4 Centrifugation Surnageant Dhs Mati re organique Sa rouges t Hint de plasma se Ajout de 0 5mL 10 min d acide nitrique Figure 10 Illustration des transformations r alis es pr alablement au dosage de cuivre par spectrom trie d absorption Les op rations r alis es permettent d liminer la mati re organique voir pr c demment B Limiter l h molyse Bien que chez le chien l h molyse ne semble pas interf rer avec le dosage du cuivre 106 107 nous voulons la limiter au maximum pour faire varier chaque param tre individuellement 49 Pour cela nous avons utilis des aiguilles de diam tre 22G tant le diam tre le plus important notre disposition 113 La taille du tube est galement importante en effet plus le tube est grand plus la quantit de vide qu il contient est grande et donc plus la vitesse du sang pr lev est lev e ce qui augmente le risque d h molyse 114 Nous avons donc privil gi les tubes de petits volumes cependant assez grand pour r cup rer facilement 1mL de plasma les tubes de 4mL nous ont offerts le meilleur compromis De la m me mani re nous avons voulu viter toutes manipulations inutiles prise de sang la seringue transf r e dans un tube ou encore fractionnement d un grand tube dans plusieurs tubes de plus petit volume Le but de ces exp riences t d approcher au plus
31. s rum 106 107 B Variations physiologiques 1 Le sexe Des dosages de la concentration en cuivre dans le s rum ont t r alis s sur 800 beagles Dans cette tude il apparait que la concentration en cuivre dans le sang est significativement plus lev e chez les m les 0 780 0 095 ug mL que chez les femelles 0 702 0 094 ug mL contrairement ce que l on retrouve chez l homme Cette tude n a cependant t r alis e que chez des beagles 106 42 2 Les races De faibles variations de concentration plasmatique en cuivre ont t mises en vidence entre diff rentes races de chiens Soixante douze chiens de laboratoire sains de sept races diff rentes ont t pr lev s La concentration en cuivre a t dos e Une diff rence significative a t mise en vidence entre le caniche 0 77 0 04 ug mL c est a dire la concentration la plus faible et le berger allemand 0 89 0 03 ug mL c est a dire la concentration la plus lev Entre les autres races les diff rences n ont pas t significatives 108 Chez le chien la concentration en cuivre augmente d environ 20 entre 2 5 et 5 ans puis diminue Figure 9 Cette tude a t r alis e sur 800 beagles 107 0 85 0 80 Moyenne Cu ug mL OS 15 25 35 45 55 65 75 85 95 Age ans Figure 9 Variations du cuivre en fonction de l ge chez le chien d apr s 107 4 Lacastration Chez les males la concentrati
32. thode d crite pr c demment B R sultats On observe une diminution de la concentration en cuivre entre 10 et 20 min de conservation Cette concentration reste par la suite stable pendant 40 minutes puis au bout de 1h elle chute nouveau Les diff rences observ es ne sont pas significatives Figure 14 55 1 2 3 4 Figure 14 Influence du d lai pr levement centrifugation sur la concentration en cuivre Groupe 1 d lais de 10 min groupe 2 d lais de 20 min groupe 3 d lais de 1h groupe 4 d lai de 2h La concentration en cuivre est exprim e en pmol L C Conclusion Le temps de latence entre le moment du pr levement et le moment de la centrifugation n a pas d influence significative sur la concentration en cuivre Le graphique nous montre cependant une tendance la diminution de la concentration en cuivre apr s 1h Nous centrifugerons nos chantillons dans un d lai de 20 60 min apr s le pr l vement V Influence de I h molyse Lors de nos pr l vements il est possible que certains tubes soient h molys s Il est donc important de pouvoir quantifier l h molyse de mani re objective et de savoir si elle a une influence sur les r sultats D apr s les articles mentionn s pr c demment cela ne semble pas tre le cas Les exp riences ayant t r alis es sur du s rum et non sur du plasma il nous faut cependant v rifier cela A Une gamme d h molyse 1 Mat riel et m thodes
33. voire ob ses 115 Pour chaque chien le poids id al a t valu par nos soins en le calculant partir du poids r el et du BCS Un BCS de 1 9 poids r el poids id al 20 poids id al Un BCS de 2 9 poids r el poids id al 15 poids id al Un BCS de 3 9 poids r el poids id al 10 poids id al Un BCS de 4 ou 5 9 poids r el poids id al UnBCS de 6 9 poids r el poids id al 10 poids id al Un BCS de 7 9 poids r el poids id al 20 poids id al Un BCS de 8 9 poids r el poids id al 30 poids id al Un BCS de 9 9 poids r el poids id al 40 poids id al 63 R partition du tissu adipeux Note BCS Palpation du squelette pa ii Observation de la silhouette 2 End C tes vert bres bassin et saillies osseuses visibles Pas de graisse discernable fonte p distance musculaire extr me C tes vert bres bassin bien visibles autres saillies Pas de graisse palpable perte minime 2 Tr s maigne 7 ii osseuses ventuellement visibles de muscle C tes facilement palpables voire visibles apophyses 3 Maigre pineuses des vert bres lombaires visibles os du bassin pro minents Pas de tissu adipeux sous cutan recouvrant les c tes C tes facilement palpables voire visibles apophyses 4 Fin pineuses des vertebres lombaires visibles os du bassin Graisse de couverture minimale pro minents z z Pas d exc s de graisse sous cutan e 5 Optimal C
34. 20 Distribution de la concentration en cuivre en fonction de l ge dans la population canine tudi e Groupe 1 chiens de moins un 1an groupe 2 chiens de 1 2 ans groupe 3 chiens de 2 4 ans groupe 4 chiens de 4 6 ans groupe 5 chiens de plus de 6 ans Le point rouge correspond a la moyenne et le trait en gras la m diane La concentration en cuivre est exprim e en mol L La concentration plasmatique en cuivre est significativement plus faible chez les chiens de moins de un an groupe 1 que chez les chiens des groupes 3 4 et 5 adultes de plus de 2 ans 69 2 L effet de la race La race apparait comme un facteur de variation significatif de la concentration en cuivre p lt 0 01 Figure 21 Les bouviers groupe 9 ont t exclus de l analyse statistique car leur concentration en cuivre tait anormalement basse De m me les l vriers groupe 3 tant en nombre trop faible et ayant des concentrations plasmatiques en cuivre tr s lev es ont t exclus 10 Cuivre 1 2 4 5 6 7 8 Figure 21 Distribution de la concentration en cuivre en fonction de la race dans la population canine tudi e Groupe 1 bergers groupe 2 terriers et chiens de moins de 10kg groupe 3 l vriers exclus groupe 4 molosso des groupe 5 beagles groupe 6 chiens de chasse groupe 7 chiens nordiques groupe 8 bouledogues boxers dogues groupe 9 bouviers exclus Le point rouge correspond l
35. 4 De plus le m canisme d incorporation des oligo l ments dans les cheveux n est pas connu et aucun lien n a t mis en vidence entre la concentration de cuivre dans le sang et dans les cheveux 54 56 Ce pr l vement ne doit donc pas tre utilis 30 4 l urine L excr tion urinaire du cuivre varie dans la journ e Il est donc n cessaire de r colter les urines sur 24 h pour pouvoir interpr ter les r sultats 58 De plus comme vu pr c demment ce n est pas la voie principale d limination du cuivre On a donc des concentrations beaucoup plus faibles que dans le sang ce qui rend les dosages moins fiables 59 Pour finir le cuivre plasmatique est intimement li la c ruloplasmine qui n est pas limin e dans les urines En dosant le cuivre dans les urines on a donc uniquement acc s la fraction libre seule partie du cuivre excr t dans les urines Or c est la fraction li e la c ruloplasmine qui varie principalement On peut donc difficilement interpr ter les r sultats 12 60 B Le dosage 1 M thode de dosage Il existe de nombreuses techniques de dosage des oligo l ments telles que la voltim trie et la chromatographie d ions mais la spectrom trie est la m thode la plus sensible et la plus rapide 61 62 Il existe 3 principes de dosages de spectrom trie la spectrom trie de masse la spectrom trie d mission atomique la spectrom trie d absorption
36. 5 A Mat riel et m thodes p 55 B R sultats p 54 C Conclusion p 54 12 V Influence de HeMOlYSe scsscecsscsscessssssscsscesscssceseecsscssacsseesessssasssesseesessssessesecsesceees p 56 A Une gamme d h molyse p 56 1 Mat riel et m thode p 2 R sultats 3 Conclusion B Influence de l h molyse p 59 1 Mat riel et m thode p 2 R sultats 3 Conclusion PARTIE UM Siscecc chen ssctaceeha Saag cabanas an ne Minnie vavartenaiesden p 62 ETUDE EXPERIMENTALE DU TAUX DE CUIVRE DANS LE SANG CHEZ LE CHIEN APPARAMENT SAIN ET DE SES FACTEURS DE VARIATION l Mat riel et m thodes p 63 A Population des chiens tudi s et pr levements sanguins p 63 1 Crit res utilis s 2 Caract ristiques pid miologiques de la population tudi e B Analyse statistique p 68 HE R sultats er ne et na nas une p 68 A Distribution des concentrations en cuivre dans la population canine p 68 1 R partition des valeurs 2 Corr lations tablies entre les diff rentes variables quantitatives B Effet des facteurs pid miologiques sur la distribution de la concentration en cuivre de la population tudi e de chien sains p 69 1 L effet de la race 2 Lesexe et la st rilisation 3 Autres facteurs C Effet des facteurs pr analytiques sur la distribution de la concentration en cuivre de la population tudi e de chiens sains p 71 INN Disc SsION nt ennemie nine ren tee M tanins p 72 A Caract res
37. AAR AA Series version 9 12 coupl au passeur CETAC ASX 510 Les absorbances des chantillons sont report es sur la courbe talon r alis e par l appareil aux gammes talons Les valeurs sont corrig es par le facteur de dilution ici 4 5 Les valeurs habituelles du cuivre et du zinc plasmatiques pour les bovins sont comprises entre 12 60 et 18 90 umoles I soit 80 120 ug 100 La limite de carence est fix e 11 umoles l soit 70 ug 100 Valeurs indiqu es par Lamand INRA Theix 1975 Conditions de mesures voir aussi rapports Solaar Param tres et Etalonnage R glages Zn Cu Flamme Air ac tyl ne Pauvre oxydante exc s de comburant O2 de l air Brdleur 100 mm D bit ac tyl ne 0 9 1 2 I min 0 8 1 1 l min Longueur d onde 213 9 nm 324 8 nm Courant de lampe 75 Bande passante 0 5 nm Correction de fond D2 quadline x Lamand M 1972 Diagnostic en oligo l ments chez l animal Ann Nutr alim 26 2 B379 B410 82 NB Dans la m thode officielle du dosage du cuivre dans le s rum AOAC 983 24 les chantillons sont dilu s au avec de l eau et les solutions de travail d talonnage sont pr par es avec du glyc rol 10 Pour le zinc AOAC 991 11 les chantillons sont dilu s au 1 57 et la matrice commune chantillons gamme contient 0 03 de Brij 35 83 BIBLIOGRAPHIE 1 La Fontaine S J F Mercer Trafficking
38. OATAO Open Archive Toulouse Archive Ouverte Open Archive TOULOUSE Archive Ouverte OATAO OATAO is an open access repository that collects the work of Toulouse researchers and makes it freely available over the web where possible This is an author deposited version published in http oatao univ toulouse fr Eprints ID 10843 To cite this version Van on Sol ne Le statut en oligo l ment chez le chien sain le cuivre Th se d exercice M decine v t rinaire Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse ENVT 2013 90 p Any correspondance concerning this service should be sent to the repository administrator staff oatao inp toulouse fr EE os ECOLE NATIONALE VETERINAIRE Universite io T ae IouIouse ANNEE 2013 THESE 2013 TOU 3 4075 LE STATUT EN OLIGO L MENT CHEZ LE CHIEN SAIN LE CUIVRE THESE pour obtenir le grade de DOCTEUR VETERINAIRE DIPLOME D ETAT pr sent e et soutenue publiquement devant l Universit Paul Sabatier de Toulouse par VAN ON Sol ne N e le 4 Avril 1988 MONT DE MARSAN 40 Directeur de th se Mme Nathalie PRIYMENKO JURY PRESIDENT M Claude MOULIS Professeur l Universit Paul Sabatier de TOULOUSE ASSESSEURS Mme Nathalie PRIYMENKO Ma tre de Conf rences l Ecole Nationale V t rinaire de TOULOUSE Mme Lydie BRET BENNIS Ma tre de Conf rences l Ecole Nationale V t rinaire de TOULOUSE D er ECOLE a a
39. Pases permettant le passage d ions au travers d une membrane contre leur gradient de concentration qui assure le passage du cuivre dans l appareil de Golgi en utilisant l nergie d hydrolyse de l ATP 1 8 L ATP7A est pr sente dans le trans Golgi de tous les tissus a l exception du foie 9 Le cuivre est ensuite excr t dans la veine porte o il se lie de petites mol cules comme l albumine la transcupr ine et l histidine qui l am nent jusqu au foie 1 4 9 12 Autres cellules Cu histidine Cu albumin Ceruloplasmin Estomac Duod num hCTR1 V sicule biliaire Pancr as Cu histidine r Rein Cu albumin Figure 1 Illustration de l absorption du cuivre chez l homme Le cuivre est ing r puis est capt par la a A ar ex A PR 1 P muqueuse intestinale o il p n tre sous la forme Cu gr ce au transporteur hCtr1 Arriv dans l ent rocyte il est pris en charge par Hah1 une mol cule chaperonne qui le conduit jusqu l ATP7A du trans golgi Il est alors excr t dans la veine porte o il se lie l histidine albumine et la transcupr ine Le cuivre est achemin jusqu au foie dans lequel il rentre gr ce hCtr1 Au niveau du foie il est soit excr t dans la bile soit incorpor la c ruloplasmine et lib r dans le sang o il est alors apport d autres cellules 4 20 B Le cuivre dans le foie Le transporteur hCtr1 pr sent dans la membrane
40. a moyenne et le trait en gras la m diane La concentration en cuivre est exprim e en umol L La concentration plasmatique en cuivre est significativement plus faible chez les molosso des que chez les terriers et chiens de moins de 10 kg p lt 0 01 De plus elle a tendance tre plus lev chez les terriers et chiens de moins de 10kg que chez les chiens nordiques p lt 0 05 Le groupe des molosso des comprend les labradors golden retrievers les rottweilers les American Staffordshire les Sharpei les St Bernard et les Rhodesian ridgeback 3 Le sexe et la st rilisation La cupr mie d pend du statut sexuel sexe et existence ou non d une st rilisation p lt 0 01 Elle est significativement plus lev e chez les femelles que chez les m les entiers p lt 0 05 Figure 22 70 Sexe st rilis 2 I 1 1 i i 1 I I aa 1 i 1 i I i 1 i 1 1 ov 1 a 3 O T I I I I I I i i i o i i i 1 1 1 1 i 1 1 i I I i 1 1 I ll p 1 1 1 T T T T 0 1 2 3 Modalit Figure 22 Distribution de la concentration en cuivre en fonction de l tat sexuel dans la population canine tudi e Groupe 0 m le entier groupe 1 m le castr groupe 2 femelle non st rilis e groupe 3 femelle st rilis e Le point rouge correspond la moyenne et le trait en gras la m diane La concentration en cuivre est exprim e en umol L 4 Autres facteu
41. aires 40 7 poss de un appartement peu de chiens de chasse ou de chiens de travail sont repr sent s ici l cole v t rinaire de Toulouse drainant une client le essentiellement urbaine B La concentration en cuivre 1 Valeurs usuelles de la concentration en cuivre chez le chien apparemment sain La concentration plasmatique en cuivre a t d termin e au laboratoire d alimentation de l cole v t rinaire de Toulouse par spectrom trie de flamme Elle a vari de 4 44 10 18 umol L d o des valeurs usuelles comprises entre 4 9 et 9 9 umol L Ces valeurs diff rent de celles trouv es dans la litt rature Dans les tudes 106 107 r alis es sur 800 beagles la cupr mie est de 10 13 3 umol L Ces valeurs sont bien plus lev es que celle trouv es chez les beagles de notre tude allant de 5 95 9 63 mol L avec 7 68 umol L de moyenne Ces valeurs ayant taient obtenue en dosant le cuivre dans le s rum on s attendrait au contraire obtenir des valeurs plus lev es dans le plasma que dans le s rum cause de la s gr gation de cuivre dans le caillot sanguin 51 68 La m thode de dosage utilis es dans ces tudes et la notre est identique Nous n avons pas d explication cette diff rence Les chiens tudi s pr c demment taient r alis es sur des beagles vivants en chenil dans des conditions identiques Il est possible que le lieu de vie ou les modes d alimentation aient influenc les con
42. analytiques p 32 1 S rumet plasma 2 Le stockage B Variations physiologiques p 33 1 L alimentation 2 Les hormones 3 Lage 4 Variations journali res 11 C 5 l ob sit 6 L exercice physique Variations pathologiques p 38 1 G n tique 2 Acquise 3 Signes cliniques associ s une carence ou un exc s en cuivre IV Les donn es actuelles sur le m tabolisme du cuivre et ses facteurs de variations chez l cheni isa tasses ee rt cant ce cat is p 41 A Variations pr analytiques p 42 1 Les composants sanguins 2 L h molyse 3 Lalip mie B Variations physiologiques p 42 1 Lesexe 2 les races 3 Lage 4 La castration 5 Lestress C Variations pathologiques p 44 1 Pathologies non sp cifiques 2 H patite de surcharge en cuivre PARTIE RES ee aaah Smear RS Me en nent tac p 48 ETUDE EXPERIMENTALE DES FACTEURS DE VARIATION PRE ANALYTIQUE DU DOSAGE DU CUIVRE DANS LE SANG l Principes g n raux des exp riences r alis es see p 49 A Le dosage p 49 B Limiter l h molyse p 49 C La quantit pr lev e p 50 D Analyse statistique p 50 Il Influence de la m thode de conservation ses p 50 A Mat riel et m thodes p 51 B R sultats p 52 C Conclusion p 52 Ill Influence de la m thode de centrifugation ss p 53 A Mat riel et m thodes p 53 B R sultats p 54 C Conclusion p 54 IV Influence du temps d attente avant centrifugation ss ess p 5
43. c copper and iron in obese children and asolescents Nutrition research 1998 18 p 183 189 93 Lockitch G Halstead A C Wadsworth L Quigiey G Reston L Jacobson B Age and sex specific pediatric reference intervals and correlations for zinc copper selenium iron vitamins A and E and related proteins Clin Chem 1988 34 8 p 1625 8 88 94 Lifschitz M D R I Henkin Circadian variation in copper and zinc in man J Appl Physiol 1971 31 1 p 88 92 95 Yokoyama K Araki S Sato H Aono H Circadian rhythms of seven heavy metals in plasma erythrocytes and urine in men observation in metal workers Ind Health 2000 38 2 p 205 12 96 lyengar V Presampling factors in the elemental composition of biological systems Analytical chemistry 1982 54 97 Atkinson R L Dahms W T Bray G A Jacob R Standtead H H Plasma zinc and copper in obesity and after intestinal bypass Ann Intern Med 1978 89 4 p 491 3 98 Kim OY S M Moon J Chung JH Plasma ceruloplasmin as a biomarker for obesity a proteomic approach Clinical biochemistry 2011 44 p 351 356 99 Rodriguez Tuya P G E Maynar Mari o M Garcia Monc Carra RM Sanchez Misiego A Evaluation of the influence of physical activity on the plasma concentrations of several trace metals European journal of applied physiology and occupational physiology 1996 73 p 299 303 100 Campbell J D Lifestyle minerals and health Med Hypotheses
44. centrations usuelles en cuivre Dans l tude 105 r alis e sur des chiens non sains mais sans probl me s rieux la concentration usuelle en cuivre tait comprise entre 2 87 7 23 umol L Ces r sultats sont inverse plus faibles que ceux observ s dans notre tude mais ces dosages avaient t r alis s sur du s rum ou il est logique d avoir des concentrations plus faibles 51 68 73 2 Effet des crit res pid miologiques sur la cupr mie 1A gt L ge Il apparait dans notre tude que la concentration plasmatique en cuivre est plus faible chez les chiots de moins de 1 an que chez les adultes Ces r sultats concordent avec ceux vu pr c demment chez le beagle dans lesquels ont observe une augmentation de 20 de la concentration en cuivre dans le sang chez le chien entre 2 5 et 5 ans 107 Les besoins en cuivre augmentent durant la croissance il est possible qu il soit ainsi consomm en plus grande quantit lors de cette p riode Durant les premiers mois de vie le chiot consomme ses r serves cupriques et met plusieurs mois par la suite pour reconstituer ses r serves 77 Il est donc imp ratif de consid rer l ge du chien lors de l interpr tation d une concentration en cuivre gt Le sexe La concentration en cuivre chez le chien est plus lev e chez les femelles que chez les males Ce fait a largement tait d montr et tudi chez l homme 63 84 85 72 On remarque galement qu
45. cretion and retention by young men consuming low dietary copper determined by using the stable isotope 65Cu Am J Clin Nutr 1998 67 6 p 1219 25 77 Beshgetoor D M Hambidge Clinical conditions altering copper metabolism in humans Am J Clin Nutr 1998 67 5 Suppl p 1017S 1021S 78 Abdel Mageed AB O F The effect of various dietary zinc concentrations on the biological interactions of zinc copper and iron in rats Biological trace elements research 1991 29 p 239 256 79 Fischer P W A Giroux M R L Abbe The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption Am J Clin Nutr 1981 34 9 p 1670 5 80 Speich M A Pineau F Ballereau Minerals trace elements and related biological variables in athletes and during physical activity Clin Chim Acta 2001 312 1 2 p 1 11 81 Storey M L J L Greger Iron zinc and copper interactions chronic versus acute responses of rats J Nutr 1987 117 8 p 1434 42 82 R A Wapnir G D C Vaquero solans Inhibition of intestinal copper absorption by divalent cations and low molecular weight ligands in the rat Biological Trace Element Research 1993 36 p 291 305 83 Van Campen D E Gross Influence of ascorbic acid on the absorption of copper by rats J Nutr 1968 95 4 p 617 22 84 Milne D B P E Johnson Assessment of copper status effect of age and gender on reference ranges in healthy adults Clin Chem 1993 39 5 p 883 7 85 Rodriguez E C
46. ctionnel on a donc une accumulation de cuivre dans le sang et dans les tissus 19 77 103 40 gt Obstruction biliaire On peut rencontrer des augmentations de la concentration en cuivre dans le sang lors d obstruction du flux biliaire qui est la voie principale d excr tion du cuivre 77 3 Signes cliniques associ s a une carence ou un exc s en cuivre Lors de d ficit ou d exc s en cuivre les signes cliniques sont en g n ral peu sp cifiques ce qui rend le diagnostic difficile Signes cliniques d un d ficit en cuivre Un d ficit en cuivre se manifeste essentiellement par des troubles de la d marche un retard de croissance des poils et cheveux secs et cassants une d coloration de la peau et des cheveux 39 77 101 104 On a galement des signes biologiques tels que une an mie car le cuivre via l h phaestine associ un transporteur intervient dans l absorption du fer une leucop nie neutrop nie une thrombop nie 39 97 Signes cliniques d une surcharge en cuivre Lors de surcharge en cuivre on a principalement des troubles digestifs h patiques et neurologiques Les principaux signes cliniques sont une irritation de la paroi des intestins voire une rosion une an mie une hypotension unict re un coma un choc et la mort Lors d une intoxication aig e une d tresse h patique et ou r nale peut se d velopper en quelques jours 12 24 62 IV Le
47. cytiotrophoblastes du placenta et ont des r les diff rents lATP7A tant localis au p le basolat ral de la cellule intervient dans le passage du cuivre dans la circulation sanguine foetale LATP7B tant localis au p le apical de la cellule intervient dans l exportation du cuivre du placenta vers la m re pour prot ger le foetus d une ventuelle surcharge cuprique 1 28 Arriv dans le foetus le cuivre se lie aux m tallothion ines et est stock dans le foie Cela permet au foetus d accumuler des r serves pour ses premiers mois de vie 5 Le cuivre est majoritairement d livr au foetus pendant le dernier tiers de gestation 5 On a a ce moment la une diminution de la concentration en ATP7B ainsi qu une relocalisation de ce transporteur vers l appareil de Golgi ce qui permet un apport bien plus important de cuivre vers la circulation sanguine foetale Figure 5 Circulation maternelle Circulation matemelle Apical p fa amp p P P n R n i Insuline Oestrogenes 3 me trimestre bh Ermeytiotrophobaste amp Y amp VT Vpn Va D 0 alar FE Basolater al wee Circulation foetale Circulation foetale Gu ATPTA ATPTE Q v sicute amp ATP7A QO V sicule ATP7B Figure 5 M tabolisme du cuivre dans le placenta Au d but de la gestation l ATP7A est situ au p le basolat ral des syncytiotrophoblastes du placenta assurant le passage du cuivre de
48. de cuivre sans transformation math matique pr alable a t consid r e comme normale Shapiro Wilk p 0 47 Figure 19 L intervalle de valeurs usuelles correspondant calcul avec un risque de 5 a t de 4 9 9 9 umol L tous chiens confondus Lorsque l on exclut les chiens ayant des concentrations particuli rement basses chiens nordiques et bouviers et particuli rement hautes type l vrier cet intervalle de r f rence est de 4 95 9 95 umol L Cuivre 10 Fr quence H 5 6 7 8 9 10 Figure 19 R partition de la concentration en cuivre dans le plasma dans la population canine tudi e 68 B Effet des facteurs pid miologiques sur la distribution de la concentration en cuivre de la population tudi e de chiens sains Les effets de diff rents facteurs biologiques exog nes ou endog nes ge sexe robe race activit lieu de vie type alimentaire et BCS ont t tudi s sur la r partition des concentrations en cuivre dans le sang Les r sultats montrent qu il n existe aucune interaction entre les diff rents facteurs dans ce mod le 1 L effet de l ge La concentration en cuivre d pend de l ge des chiens p lt 0 001 Figure 20 Age o 4 I I i a on od i i 1 1 I i i H 1 1 l 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 7 i O EE 1 i 1 l 1 1 o 4 1 1 l 7 i 1 I e4 l l 1 2 3 4 5 Modalit Figure
49. de pr lev plusieurs tubes lors d une seule et m me ponction pr l vements multiples ne modifie pas de mani re significative les r sultats On peut donc supposer que lorsque nous pr levons plusieurs tubes en une ponction la composition initiale en cuivre est la m me pour chaque tube L h molyse n a pas d influence sur la quantit de cuivre dos Lors de ce test h molyse est bien le seul facteur de variation ces r sultats sont plus fiables Nous consid rerons donc par la suite que l h molyse n interf re pas avec le dosage du cuivre et les tubes l g rement h molys s ne seront pas exclus de cette tude Ce facteur sera cependant quantifi gr ce la gamme d h molyse r alis e pr c demment 61 PARTIE 3 ETUDE EXPERIMENTALE DU TAUX DE CUIVRE DANS LE SANG CHEZ LE CHIEN APPARAMENT SAIN ET DE SES FACTEURS DE VARIATION 62 I Mat riel et m thodes A Population des chiens tudi s et pr levements sanguins 1 Crit res utilis s Cette tude inclut 150 chiens et a t r alis e Ecole Nationale V t rinaire de Toulouse Parmi ces chiens 133 ont t pr sent s en m decine pr ventive pour leur vaccination annuelle ou en reproduction en vue d une st rilisation les 17 restants provenant du chenil de physiologie Tous les chiens inclus dans cette tude sont consid r s comme apparemment sains apres un examen clinique conduit syst matiquement avant chaque prise de sang Ils n ont
50. des h patocytes capte le cuivre et le fait rentrer dans la cellule 13 Une fois l int rieur le cuivre se fixe Figure 2 des mol cules chaperonnes Hah1 la Copper Chaperone for SOD1 CCS et Cox 17 charg es de son transport cytosolique pour le redistribuer ensuite vers les cuproprot ines effectrices 5 8 Il n a cependant pas t d montr qu il existait une interaction directe entre hCtr1 et les mol cules chaperonnes il est donc possible qu il existe un interm diaire 14 des m tallothion ines c est dire des mol cules de faible poids mol culaire charg es du stockage de cuivre 5 10 et ayant des propri t s anti oxydantes 12 au glutathion intervenant dans la d toxification du cuivre 10 Lorsque le cuivre sous forme Cu entre dans la cellule le glutathion s y fixe imm diatement pour viter une surcharge cuprique puis le redistribue aux m tallothion ines 15 16 A 7 F 2 Les ions de cuivre libres Cu ou Cu sont toxiques pour la cellule ils sont donc enti rement li s en conditions normales 5 16 17 1 Synth se de la c ruloplasmine Le cuivre li la mol cule chaperonne Hah1 est achemin vers l appareil de Golgi o il est pris en charge par l ATP7B 8 18 L ATP7B est une ATPase de type P similaire l ATP7A bien que cette derni re ait des capacit s de transport plus importantes 9 19 Elle est pr sente sur l appareil trans golgien des c
51. die soit une maladie auto immune 10 La maladie du Dalmatien La maladie du Dalmatien est une maladie h r ditaire avec un stockage du cuivre dans les h patocytes Il ne semble pas avoir de pr disposition sexuelle Cette maladie est pr sente en Europe mais la pr valence n est pas connue 10 46 Dans cette premi re partie nous avons donc tudi les bases du m tabolisme du cuivre pour mieux comprendre ses variations Il apparait que la concentration en cuivre dans l organisme est finement r gul e et les variations observ es sont plut t d ordre inter individuelle que intra individuelle 47 PARTIE II ETUDE EXPERIMENTALE DES FACTEURS DE VARIATION PRE ANALYTIQUE DU DOSAGE DU CUIVRE DANS LE SANG 48 Comme vu pr c demment les facteurs pr analytiques peuvent tre des sources de variations Tres peu d articles sont disponibles sur le sujet notamment chez le chien Nous avons donc essay d identifier plus pr cis ment quels taient leur influence sur nos mesures l Principes g n raux des exp riences r alis es A Le dosage Pour toutes ces exp riences les dosages ont t effectu s sur du plasma par spectrophotom trie d absorption l aide de la machine SOLAAR AA Series version 9 12 coupl e au passeur CETAC ASX 510 Avant dosage 0 5 mL d acide nitrique est ajout au millilitre de plasma de l chantillon Apr s 10 min les chantillons sont dilu s au ia par l ajout de 3mL d eau distill e
52. diff rentes au m me moment Ces vingt et un tubes ont t r partis en 3 groupes de 7 tubes de mani re al atoire afin d homog n iser les groupes de d part et d ainsi viter les variations dues aux pr l vements multiples Les tubes sont alors identifi s et conserv s de trois diff rentes mani res Figure 11 Groupe 1 Les tubes sont laiss s temp rature ambiante pendant 2 heures apr s le pr l vement Groupe 2 Les tubes sont mis au r frig rateur 4 C imm diatement apr s le pr l vement et y restent pendant 2 heures Groupe 3 Les tubes sont laiss s temp rature ambiante pendant une heure apr s le pr l vement puis mis au r frig rateur 4 C pendant une heure Pr l vement T0 C entrigugation T 2h 4 Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3 M Temp rature ambiante M 4 C Figure 11 Influence de la m thode de conservation des pr l vements avant centrifugation sur le dosage du cuivre illustration des trois groupes constitu s Les pr l vements ont ensuite t centrifug s chaud machine eppendorf centrifuge 5702 4000 tours pendant 10 min Certains des tubes ont t malgr tout h molys s Ces tubes l ont t tout de m me analys s apr s une valuation subjective du taux d h molyse class de 0 non h molys 2 tr s h molys 51 Nous avons alors pr lev 1mL de plasma de chaque tube et les plasmas ont t analys s par la m thode d
53. disease J Hepatol 1995 22 3 p 303 8 54 K Sreenivasa Rao T B T Prasada Rao Y Babu G R K Naidu Determination of iron cobalt nickel manganese zinc copper cadmium and lead in human hair by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry Spectrochimica acta Part B 2002 57 p 1333 1338 55 Rodrigues JL B B Nunes JA Passos CJ Barbosa F Jr Evaluation of the use of human hair for biomonitoring the deficiency of essential and exposure to toxic elements Science of the total environment 2008 405 p 370 376 56 W Wasiak W C A Ciszewski Hair analysis Part1 Differentiel pulse anodic stripping voltammetric determination of lead cadmium zinc and copper in human hair samples of 86 persons in permanent contact with a polluted workplace environment Analytica chimica acta 1996 335 p 201 207 57 Vir S C A H Love W Thompson Serum and hair concentrations of copper during pregnancy Am J Clin Nutr 1981 34 11 p 2382 8 58 Brewer G J Wilson disease and canine copper toxicosis Am J Clin Nutr 1998 67 5 Suppl p 1087S 1090S 59 Turnlund J R Keyes W R Anderson H L Acord L L Copper absorption and retention in young men at three levels of dietary copper by use of the stable isotope 65Cu Am J Clin Nutr 1989 49 5 p 870 8 60 Carruthers M E C B Hobbs R L Warren Raised serum copper and caeruloplasmin levels in subjects taking oral contraceptives J Clin Pathol 1966 19 5
54. e Physiologie de la Reproduction Endocrinologie M GUERRE Philippe Pharmacie et Toxicologie Mme HAGEN PICARD Nicole Pathologie de la Reproduction JACQUIET Philippe Parasitologie et Maladies Parasitaires LIGNEREUX Yves Anatomie MEYER Gilles Pathologie des ruminants PICAVET Dominique Pathologie infectieuse SANS Pierre Productions animales 22222222222 22222 MINISTERE DE L AGRICULTURE DE L AGROALIMENTAIRE ET DE LA FOR T Mme TRUMEL Catherine Pathologie m dicale des Equid s et Carnivores PROFESSEURS CERTIFIES DE L ENSEIGNEMENT AGRICOLE Mme M MICHAUD Fran oise Professeur d Anglais SEVERAC Benoit Professeur d Anglais MAITRES DE CONFERENCES HORS CLASSE M M Mile Mme M Mile M Mme M M Mme BAILLY Jean Denis Hygi ne et Industrie des Denr es alimentaires d Origine animale BERGONIER Dominique Pathologie de la Reproduction BOULLIER S verine mmunologie g n rale et m dicale BOURGES ABELLA Nathalie Histologie Anatomie pathologique BRUGERE Hubert Hygi ne et Industrie des Denr es alimentaires d Origine animale DIQUELOU Armelle Pathologie m dicale des Equid s et des Carnivores JOUGLAR Jean Yves Pathologie m dicale du B tail et des Animaux de Basse cour LETRON RAYMOND Isabelle Anatomie pathologique LYAZRHI Faouzi Statistiques biologiques et Math matiques MATHON Didier Pathologie chirurgicale PRIYMENKO Nathalie Alimentation MAITRES DE CONFERENCES class
55. e normale M Mme Mile Mme Mile Mile Mile Mme M Mme M M Mme ASIMUS Erik Pathologie chirurgicale BENNIS BRET Lydie Physique et Chimie biologiques et m dicales BIBBAL Delphine Hygi ne et Industrie des Denr es alimentaires d Origine animale BOUCLAINVILLE CAMUS Christelle Biologie cellulaire et mol culaire CADIERGUES Marie Christine Dermatologie CONCHOU Fabrice Imagerie m dicale CORBIERE Fabien Pathologie des ruminants CUEVAS RAMOS Gabriel Chirurgie Equine DANIELS H l ne Microbiologie Pathologie infectieuse DOSSIN Olivier Pathologie m dicale des Equid s et des Carnivores FERRAN Aude Physiologie GUERIN Jean Luc Elevage et Sant avicoles et cunicoles JAEG Jean Philippe Pharmacie et Toxicologie LACROUX Caroline Anatomie Pathologique des animaux de rente LIENARD Emmanuel Parasitologie et maladies parasitaires MAILLARD Renaud Pathologie des Ruminants MEYNAUD COLLARD Patricia Pathologie Chirurgicale MOGICATO Giovanni Anatomie Imagerie m dicale NOUVEL Laurent Pathologie de la reproduction PALIERNE Sophie Chirurgie des animaux de compagnie PAUL Mathilde Epid miologie gestion de la sant des levages avicoles et porcins PRADIER Sophie M decine interne des quid s RABOISSON Didier Productions animales ruminants TROEGELER MEYNADIER Annabelle Alimentation VOLMER Romain Microbiologie et Infectiologie disponibilit a cpt du 01 09 10 VERWAERDE Patrick Anesth sie R animation
56. e de mettre en relief certains facteurs de variations d ja identifi s dans diff rentes tudes Cependant les r sultats sont variables d une tude l autre sans que nous ayons pu trouver d explication a cela La concentration en cuivre est plus faible chez les chiots de moins de un an que chez les adultes vraisemblablement a cause des besoins augment s lors de la croissance De plus comme chez l Homme il semblerait que les hormones sexuelles f minines jouent un r le dans le m tabolisme du cuivre entrainant des concentrations en cuivre plus lev es chez les femelles que chez les m les Enfin la concentration en cuivre est variable d une race l autre Les autres facteurs pid miologiques tels que l activit physique la couleur de la robe le BCS le lieu de vie le moment du dernier repas ou encore le contact avec des objets m talliques n ont pas d influence sur la concentration en cuivre Nous avons aussi mis en vidence des points de variations qu il sera int ressant d explorer comme les concentrations plus faibles en cuivre chez le jeune ou dans certaines races comme les chiens nordiques et les bouviers bernois D autres tudes devront venir compl ter notre travail exp rimental en vue de confirmer ou non les diff rences de cupr mie tr s diff rentes dans ces races car l effectif de chiens de notre population tait insuffisant pour conclure 76 ANNEXES 77 Annexe 1 Questionnaire ayant t
57. e inter membranaire de la mitochondrie 60 de la quantit totale de Cox17 pr sente dans la cellule se trouve dans le cytosol 4 o elle d livre le cuivre au cytochrome C oxydase Elle est pr sente dans toutes les cellules de l organisme dont les h patocytes Le cytochrome C oxydase est la derni re enzyme de la chaine respiratoire mitochondriale pr sente sur la membrane interne de la mitochondrie qui poss de deux sites de liaison pour le cuivre Elle r duit la mol cule d oxyg ne en eau gr ce au potentiel oxydo r ducteur du cuivre tout en pompant des protons de l int rieur vers l espace inter membranaire de la mitochondrie 5 Ce processus permet par le retour des protons au travers d une ATP synthase de cr er de l nergie cellulaire Mitochondrie Le syst me porte Les canaux biliaires La veine cave Figure 2 Le cuivre dans les h patocytes Le cuivre rentre dans les h patocytes gr ce au transporteur hCTR1 Arriv dans le secteur intracellulaire il est pris en charge par les mol cules chaperonnes COX17 d livre le cuivre au cytochrome C oxydase de la mitochondrie CCS la Cu Zn SOD dont la maturation et l activation sont catalys es par COMMD1 ATOX1 l ATP7B de l appareil de Golgi pour son incorporation dans la c ruloplasmine Lorsque la teneur en cuivre intracellulaire est lev e l ATP7B est transloqu e dans des v sicules vers la membrane des canaux biliaire pour excr ter le cuivre dan
58. ellules du foie et des reins et en tr s faibles quantit s dans le placenta le cerveau le c ur et les poumons 1 20 Elle assure le passage du cuivre dans l appareil de Golgi pour permettre son incorporation la c ruloplasmine ainsi qu d autres cuproprot ines 5 20 La c ruloplasmine est une ferroxydase qui comporte 6 atomes de cuivre et est synth tis e dans le foie Ces atomes de cuivre sont rapidement incorpor s lors de la synth se de cette prot ine par un processus de tout ou rien 21 22 Le complexe ainsi form est nomm l holoc ruloplasmine Soixante dix pourcent du cuivre circulant dans le plasma est pr sent sous cette forme ci 12 23 24 2 Distribution la superoxyde dismutase Le cuivre li la mol cule chaperonne hCCS est transf r la superoxyde dismutase SOD 8 La superoxyde dismutase est une enzyme pr sente dans le cytosol et dans l espace inter membranaire des mitochondries de toutes les cellules dont le foie Elle utilise le potentiel r ducteur du cuivre pour catalyser la r action de transformation du superoxyde 21 0 gt en peroxyde hydrog ne H202 et oxyg ne O2 et ainsi prot ger les cellules contre les radicaux libres qui sont toxiques 5 8 20 3 Distribution la mitochondrie La mol cule chaperonne Cox17 lie trois Cu 8 et transite entre le cytosol 40 de la quantit totale de Cox17 pr sente dans la cellule se trouve dans le cytosol et l espac
59. enome 2011 23 1 2 p 62 75 11 Vonk W I C Wijmenga B van de Sluis Relevance of animal models for understanding mammalian copper homeostasis Am J Clin Nutr 2008 88 3 p 840S 5S 12 Linder M C M Hazegh Azam Copper biochemistry and molecular biology Am J Clin Nutr 1996 63 5 p 797S 811S 13 Askwith C J Kaplan ron and copper transport in yeast and its relevance to human disease Trends Biochem Sci 1998 23 4 p 135 8 14 Portnoy ME S P Rogers RS Culotta VC Metal transporters that contribute copper to metallochaperones in Saccharomyces Mol Genet Genomics 2001 265 p 873 882 15 Freedman J H M R Ciriolo J Peisach The role of glutathione in copper metabolism and toxicity J Biol Chem 1989 264 10 p 5598 605 16 Bertinato J MR L Abbe Maintaining copper homeostasis regulation of copper trafficking proteins in response to copper deficiency or overload J Nutr Biochem 2004 15 6 p 316 22 17 Rae T D Schmidt P J Pufahl R A Culotta V C O Halloran T V Undetectable intracellular free copper the requirement of a copper chaperone for superoxide dismutase Science 1999 284 5415 p 805 8 18 Klomp L W Lin S J Yuan D S Klausner R D Cizewski Culotta V Gitlin J D Identification and functional expression of HAH1 a novel human gene involved in copper homeostasis J Biol Chem 1997 272 14 p 9221 6 84 19 Linz R S Lutsenko Copper transporting ATPases
60. ent et de ne conserver que le plasma De plus pour un stockage de plusieurs semaines les chantillons peuvent tre congel s 20 C 66 32 B Variations physiologiques 1 Alimentation L alimentation est un facteur principal de variation du cuivre Ce facteur reste cependant difficile a interpr ter bien qu il soit tr s tudi 62 Le moment du repas Apr s un repas il y a deux pics de concentration en cuivre Le premier a lieu 1 2h apres l ingestion et correspond au cuivre r cemment absorb li l albumine Ce pic retombe rapidement et est suivi par un deuxi me au bout de 2 4h qui correspond du cuivre incorpor la c ruloplasmine dans le foie et qui se retrouve nouveau dans le sang Il s en suit un plateau qui dure 36 48h 66 69 Ces variations sont cependant faibles moins de 8 et peuvent tre n glig es 70 71 La composition du repas gt Energie La concentration en cuivre dans le sang augmente lorsque pour une m me quantit de cuivre le nombre de calories ing r augmente 72 gt Prot ines Les prot ines facilitent l absorption du cuivre 2 73 et cet effet est d autant plus marqu que les prot ines sont d origine animale Le besoin de cuivre diminue en fonction de la quantit de prot ines ing r es 50 gt Glucides Le fructose diminue l absorption du cuivre L amidon n a aucun effet 2 74 gt Mati res grasses La concentration plasmatiq
61. enterology 2006 130 2 p 493 506 38 KO L The nature of the copper complexes in bile and their relationship to the absorption and excretion of copper in normal subjects and in Wilson s disease Gut 1973 14 p 221 232 85 39 Trocello Anomalies du m tabolisme du cuivre chez l adulte La revue de m decine interne 2010 40 Petris M J Smith K Lee J Thiele D J Copper stimulated endocytosis and degradation of the human copper transporter hCtr1 J Biol Chem 2003 278 11 p 9639 46 41 Labbe S D J Thiele Pipes and wiring the regulation of copper uptake and distribution in yeast Trends Microbiol 1999 7 12 p 500 5 42 Balamurugan K W Schaffner Copper homeostasis in eukaryotes teetering on a tightrope Biochim Biophys Acta 2006 1763 7 p 737 46 43 Coyle P Philcoxa J C Careya L C Rofea B A M Metallothionein the multipurpose protein Cell Mol Life Sci 2002 59 4 p 627 47 44 Durnam D M R D Palmiter Transcriptional regulation of the mouse metallothionein I gene by heavy metals J Biol Chem 1981 256 11 p 5712 6 45 Vanderwerf S M Cooper M J Stetsenko I V Lutsenko S Copper specifically regulates intracellular phosphorylation of the Wilson s disease protein a human copper transporting ATPase J Biol Chem 2001 276 39 p 36289 94 46 Petris M J Mercer J F B Culvenor J G Lockhart P Gleeson P A Camakaris J Ligand regulated transport of the Menkes copper
62. ervalle de r f rence de la cupr mie chez le chien sain et l influence de facteurs pid miologiques sur ce dernier La population tudi e comprend 150 chiens et est repr sentative de la population canine fran aise Chez ces individus un dosage ponctuel de la concentration plasmatique en cuivre sur tube h parin a t r alis Dans ce travail il apparait que la concentration en cuivre est plus faible chez le chiot que chez l adulte varie entre les races et est plus lev chez la chienne non st rilis e que chez le m le Mots clefs Cuivre chien spectrom trie d absorption plasma facteurs pid miologiques ge sexe race English title The trace elements status of healthy dogs the copper Abstract This work is an experimental study with aims to establish the reference interval of the concentration of copper of the healthy dog and the effects of some epidemiological factors on this concentration The population studied here is constituted by 150 healthy dog and is representative of french canine population In this population single measures of plasma copper concentration were performed The concentration of copper in blood of puppies seems to be lower than adults and can change according to the breed and seems to be higher on females than males Keywords Copper dog Absorption Spectrometry plasma epidemiological factors age sex breed 91
63. es g nes est stimul e en cas de forte concentration cytoplasmique cuprique par l interm diaire de MTF 1 44 La Metal responsive element binding transcription factor 1 MTF 1 est une prot ine pr sente en temps normal dans le cytoplasme et qui s accumule dans le noyau de la cellule lorsque la concentration en cuivre augmente pour activer la transcription des m tallothion ines 35 42 Il semblerait qu il existe galement un autre moyen de stockage du cuivre dans les cellules un stockage intra vacuolaire hCtr2p est un transporteur de faible affinit pour le cuivre similaire hCtr1 41 et pr sent la surface de ces vacuoles pour mobiliser cette r serve en cas de d ficit en cuivre 11 14 3 L excr tion biliaire L excr tion biliaire est le m canisme principal de l hom ostasie du cuivre 5 Lorsque la concentration en cuivre augmente dans le cytoplasme des h patocytes l ATP7B lie le cuivre ce qui entraine une modification de la conformation du transporteur L ATP7B laisse alors apparaitre un site de phosphorylation sp cifique d une cas ine kinase II Ainsi lors de concentration cuprique en augmentation le taux de phosphorylation de l ATP7B augmente galement 1 Ce processus est rapide sp cifique et r versible 45 Lorsque les deux sites de phosphorylation sont occup s l ATP7B est transf r e de l appareil de Golgi des v sicules p ri caniculaires en vue d tre excr t dans la
64. es et ne rejoint pas le sang Il est par la suite limin par desquamation des cellules de la muqueuse digestive 73 77 79 e Fer Un antagonisme entre le fer et le cuivre a galement t mis en vidence lors de absorption intestinale de ces deux l ments 77 80 On suppose que cela est le reflet d une comp tition pour DMT1 6 Cet effet est cependant moins marqu que celui observ avec le zinc 81 e Etain Une augmentation de la proportion d tain dans la ration cinq fois la quantit de cuivre diminue l absorption du cuivre Cet effet ne s observe qu apr s 4 semaines de consommation 82 e Cobalt Le cobalt peut se retrouver en grandes quantit s dans l alimentation lors d une contamination accidentelle Libre il n a pas d effet sur l absorption du cuivre Cependant lorsqu il est en pr sence d histidine l absorption du cuivre est diminu e d un tiers 82 e Cadmium Le cadmium peut galement diminuer l absorption du cuivre par un m canisme similaire a celui du zinc il induit la synth se de m tallothion ines dans la muqueuse intestinale 73 gt Les vitamines e L acide ascorbique vitamine C La vitamine C diminue l absorption du cuivre lorsqu elle est prise par voie orale Par exemple chez l homme une prise de 2 5 mg d acide ascorbique diminue l absorption du cuivre d environ 15 2 50 83 34 e Autres D autres acides organiques tels que l acide citrique l acide lact
65. ez les personnes pratiquant une activit physique r guli re le cuivre est redistribu du sang vers les tissus et on observe une diminution de la concentration plasmatique en cuivre Cette diminution pourrait galement tre due une plus grande perte de cuivre lors des efforts r p t s notamment au niveau de la transpiration 85 88 37 2h 6h 5 p pi oa bi FE y 4 Concentration Cu ms L 5 D ba Non Modera Rezulier Sportifs Exercice physique i Hoan M Femme Figure 8 Concentration en cuivre plasmatique en fonction de l activit physique r guli re pratiqu e On observe une diminution de la concentration cuprique avec l activit physique chronique chez l homme comme chez la femme bien que cette diff rence soit plus marqu e chez la femme d apr s 88 C Variations pathologiques Chez l homme lorsqu il y a des maladies intercurrentes le taux de cuivre est alors modifi Pour interpr ter un dosage en cuivre d un patient malade il est donc important de conna tre ses variations 1 G n tique La maladie de Mank s La maladie de Mank s se caract rise par un d ficit en cuivre et est fatale car il n existe pas de traitement efficace Elle est due une mutation r cessive du g ne codant pour l ATP7A port e par le chromosome X entrainant une perte de ce transporteur On a alors une s questration du cuivre dans les ent rocytes et un d ficit de cuivre dans le sang
66. gation peut tre variable d un chantillon l autre il est donc important de s assurer que cela n a pas trop d impact sur les r sultats obtenus ou le cas ch ant dans quelle mesure En effet nous avons vu pr c demment que lorsque le d lai d attente tait d une semaine nous observions des variations majeures dans la concentration en cuivre 66 II nous faut donc savoir si cela est galement valable sur des dur es beaucoup plus courtes que nous observerons en clinique 54 A Mat riel et m thodes Cette exp rience a t r alis e sur un chien apparemment sain de 52 kg Huit tubes h parin de 4 mL ont t pr lev s au niveau de la veine jugulaire en une ponction au m me moment Ces huit tubes ont t r partis en 4 groupes de 2 tubes de mani re al atoire afin d homog n iser les groupes de d part et d ainsi viter les variations dues aux pr levements multiples Les tubes ont alors t identifi s r frig r s puis centrifug s a diff rents moments Tableau 6 N de tube Temps pr l vement centrifugation 1 10 min 2 20 min 3 1h 4 2h Tableau 6 Influence du temps entre le pr l vement et la centrifugation sur le dosage du cuivre L exp rience a t r alis e deux fois pour la reproductibilit des r sultats Les tubes pr lev s n ont pas t h molys s Nous avons alors pr lev 1mL de plasma de chaque tube et les plasmas ont t analys s d apr s la m
67. giter au vortex vitesse maximum de 5 10 secondes pour disperser le coagulat au maximum Laisser pr cipiter 10 minutes Compl ter 4 5 ml en rajoutant 3 ml d eau distill e boucher agiter fortement la main pour disperser le plus possible les ventuels grumeaux Centrifuger 15 minutes 4000 tours min temp rature ambiante Le dosage se fera sur le surnageant en vitant d aspirer le culot Remarque Si le dosage doit tre diff r laisser les chantillons pr par s temp rature ambiante 2 Gamme talon commune Solution fille commune A partir des solutions m res 1 g l pr parer la solution fille commune Zn Cu 10 mg l en introduisant 1 ml de chaque solution m re dans une fiole jaug e de 100 ml et en compl tant avec de l eau distill e Cette solution fille est stable pendant au moins un mois temp rature ambiante 81 Points de gamme Pipeter successivement 1 2 5 5 7 5 ml de solution fille commune dans 4 fioles jaug es de 100 ml Rajouter 10 ml d HCI 3 N et ajuster a l eau distill e R aliser une fiole pour le blanc avec seulement 10 ml HCI 3 N et de l eau distill e On a donc les points de gamme correspondants Pour le Zn 1 53 3 82 7 65 11 47 umoles Soit 0 1 0 25 0 50 0 75 mg l de zinc et de cuivre Pour le Cu 1 57 3 93 7 87 11 77 umoles Mesures L appareil actuellement en service est le spectrophotom tre d absorption atomique SOL
68. hCtr1 est endocyt ce qui diminue le nombre de r cepteurs pr sents sur la membrane plasmique des ent rocytes et donc l absorption du cuivre Si cette concentration augmente encore hCtr1 est rapidement d grad dans le but de pr venir son retour a la surface de la cellule 25 35 40 41 ATP7A Lorsque la concentration intracellulaire en cuivre augmente l ATP7A est transloqu e vers la membrane plasmique pour liminer le surplus de cuivre 41 42 Un m canisme similaire celui de l ATP7B contr le cette relocalisation voir ci dessous 1 34 Dans les cellules polaris es l ATP7A se dirige vers le p le basolat ral et s y accumule sous forme de v sicules lib r es par exocytose 19 Il existe un turn over permanent de l ATP7A entre la membrane plasmique et les v sicules 1 19 figure 4 Quand la concentration intracellulaire en cuivre est redevenue normale l ATP7A retourne dans l appareil de Golgi 4 figure 4 2 Le stockage Lors d un exc s de cuivre dans le cytoplasme des cellules celui ci se lie directement au glutathion sous forme de Cu 43 Le cuivre tant toxique l tat libre ce ph nom ne permet de prot ger la cellule Il est par la suite transf r aux m tallothion ines qui assurent son stockage 5 9 15 26 Les m tallothion ines sont cod es par au moins 10 g nes et les quatre principales prot ines qui en d coulent sont nomm es de MT 1 a MT 4 42 43 L expression de c
69. i dans ce travail ont t tudi s des facteurs biologiques comme l ge le sexe la st rilisation la race et la couleur du poil mais aussi des facteurs environnementaux tels que le style de vie l alimentation et l activit physique 17 PARTIE LE CUIVRE CHEZ LE CHIEN ET CHEZ L HOMME SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE l Le m tabolisme du cuivre La connaissance pr cise du m tabolisme du cuivre permet une meilleure compr hension des m canismes d action intervenant lors de variations de la concentration cuprique Nous allons d tailler les tapes clefs du m tabolisme cuprique telles que l absorption du cuivre son utilisation ou encore son limination Nous verrons galement par quels m canismes la concentration en cuivre est finement r gul e et enfin nous nous int resserons au m tabolisme du cuivre lors de la gestation et de la lactation A De l alimentation au foie 1 L absorption Le cuivre est apport par l alimentation Un homme ing re en moyenne 2 5 mg de cuivre par jour dont 30 70 est absorb Les recommandations d apport journalier varient mais il existe un consensus autour de l apport n cessaire de 0 9 2 2mg in toto chez l adulte 2 10 Le cuivre est ing r sous forme de sels sulfate de cuivre oxyde de cuivre etc et est eje 2 r 2 en partie solubilis dans l estomac Il se retrouve alors libre sous forme Cu et arrive dans le 2 NS 2 1 2 duod num o il es
70. ique mais li e une prot ine qui est n cessaire l activit biologique de celle ci hormis celles cit es pr c demment Tableau 2 comme par exemple La lysyl oxydase joue un r le crucial dans la formation la maturation et la stabilisation des connections inter tissulaire dont la liaison collag ne lastine 9 20 Elle fait partie de la matrice extracellulaire et cette enzyme est inactive en absence de cuivre Le cuivre ne catalyse pas la r action mais intervient dans la structure de l enzyme et l a rend ainsi active 5 La tyrosinase est impliqu e dans la synth se de m lanine Elle est inactive en absence de cuivre aussi la carence en cuivre se traduit par une hypopigmentation de la peau des cheveux et des poils 9 La peptidyl glycine monooxyg nase est importante pour la synth se d hormones neuroendocrines 9 L h phaestine est un homologue de la c ruloplasmine et a aussi une activit ferroxydase C est une prot ine transmembranaire qui est impliqu e dans l absorption intestinale du fer 5 24 Cuproenzyme C ruloplasmine Cu Zn SOD Cytochrome c oxydase M tallothion ines Lysyl oxydase Tyrosinase Dopamine B hydroxylase Peptidylglycine a amidating mono oxygenase H phaestine CMGP Prot ine des prions PrPC S Adenosylhomocysteine Prot ine pr curseur du B amylo de Angiog nine Facteur de coagulation V et VIII Fonction Ferroxydase Transport du fer Transport du cuivre D
71. ique ou encore l acide ac tique augmentent la biodisponibilit du cuivre C est pour cela qu en g n ral les fruits augmentent la concentration en cuivre 2 L eau L eau est une source de cuivre qui ne doit pas tre n glig e La concentration en cuivre de l eau varie en fonction de la zone g ographique 50 72 tat et la composition des tuyaux En effet les tuyaux en cuivre sont communs dans de nombreuses zones Lorsqu ils sont abim s ils peuvent tre une source majeure de cuivre La concentration en cuivre dans l eau peut par exemple tre sup rieure 5 mg L 35 50 2 Les hormones Le sexe La concentration en cuivre dans le plasma est beaucoup plus lev e chez les femmes 10 7 26 6 mol L que chez les hommes 8 8 17 5 umol L 63 84 85 72 Cette diff rence est li e l stradiol qui stimule la production de c ruloplasmine et g n re une plus grande concentration en cuivre dans le plasma 24 86 Chez les enfants non pub res il n y a donc pas de diff rence entre les filles et les gar ons 87 88 De m me chez les personnes de plus de 60 ans les femmes sont m nopaus es il n y a pas de diff rence du taux de cuivre dans le plasma entre les sexes 32 89 Il semblerait galement qu il y ait chez les femmes des variations cycliques du taux de cuivre de plus ou moins 15 60 en relation avec le cycle hormonal En effet la concentration de cuivre est plus lev e durant le
72. ir toujours accompagn et pouss a r aliser mes r ves c est grace a vous si j en suis la aujourd hui Pour votre amour et votre patience car je sais que je ne suis pas facile tous les jours surtout avec toi papa et pour avoir fait de moi la personne que je suis aujourd hui merci A mes fr res Merci de m accompagner et de mettre autant de sourire dans ma vie Pour toutes vos citations de film pour les soir es jeux endiabl es et parce que vous tes et serez toujours l pour moi et m avais toujours soutenu quoi qu il arrive m me quand c tait difficile m me si les brebis se sont parfois gar e elles sont toujours revenues au troupeau merci A mes grands parents Que j esp re pouvoir remercier encore longtemps A tous mes amis Merci de faire partie de ma vie et de la rendre plus belle chaque jour A Katy Pour ton amiti a toute preuve pour notre voyage au Cambodge et pour les prochains a venir Parce que les plus belles amiti s sont celles qui perdurent malgr la distance et que le temps n effacera jamais A Franck Pour toutes nos soir es tous ces rocks et pour tous ces sourires Pour tous ces souvenirs que l on s est cr et tous les prochains venir A Am lie Pour la danse et pour tous ces moments partag s et puis pour les feux de l amour aussi A Isabelle Pour les soir es cin club pour les karaok s et pour tre rester fid le ce que tu es tous au long de ces
73. la m re au f tus L ATP7B est situ au p le apical renvoyant le cuivre vers la circulation sanguine de la m re ce qui prot ge le f tus d une surcharge cuprique Dans le troisi me tiers de gestation le taux d insuline et d strog ne augmente ce qui induit la redirection de l ATP7B vers le trans Golgi TG alors que l ATP7A s accumule en plus grand nombre au p le basolat ral de la cellule Ainsi le transport du cuivre de la m re au f tus est beaucoup plus important d apr s 1 2 Lalactation Apr s la naissance le cuivre est d livr au nouveau n via le lait 5 Dans les premiers jours de vie il est principalement li la c ruloplasmine 70 dans les 5 premiers jours La c ruloplasmine une fois absorb e se retrouve intacte dans la circulation sanguine du nouveau n 48 Elle est synth tis e par le tissu mammaire pendant la lactation par un processus semblable celui du foie 48 Par la suite le cuivre est principalement li l albumine dans le lait seul 20 25 reste li la c ruloplasmine au bout d un mois de lactation chez l homme 1 49 50 29 ll Le dosage du cuivre A Le pr l vement 1 Le sang De nombreuses enzymes ont t test es comme marqueur indirect du statut en cuivre de l organisme En r alit la concentration en cuivre dans le sang est un marqueur pr coce d un d ficit en cuivre chez l homme 11 Le dosage du cuivre peut se faire sur du
74. les dont 19 taient castr s 12 7 et 87 taient des femelles dont 35 taient st rilis es 23 3 La majorit des chiens 42 taient de jeunes adultes entre 1 et 3 ans 29 3 44 chiens avaient moins de 1 an 26 39 chiens avaient entre 3 et 8 ans et 2 7 4 chiens taient plus vieux environ 8 ans et plus L ge moyen des chiens est de 2 7 ans Une forte proportion 67 3 de chiens de race a t observ e 45 races diff rentes taient repr sent es r parties de fa on pr pond rante sur quatre groupes raciaux le groupe cynophile 6 des chiens courants avec 21 8 soit 22 chiens le groupe 1 chiens de berger avec 18 8 soit 19 chiens et les groupes 2 Pinscher schnauzer et molosso des et 9 chiens d agr ment et de compagnie avec tous deux 12 9 soit 13 chiens Les groupes 3 chiens de terrier 7 chiens d arr t et 8 Spaniels retrievers et chiens d eau taient repr sent s un peu mois souvent respectivement 10 8 et 9 chiens soit 9 9 7 9 et 8 9 et 12 et les groupes cynophiles 5 chiens scandinaves et 10 L vrier taient rarement repr sent s dans notre population respectivement 3 9 et 3 N anmoins 4 races sont apparues pr dominantes les Beagles 20 chiens les labradors 6 chiens les bergers allemands 5 chiens et les bergers australiens 5 chiens De plus seulement 16 6 des chiens tudi s ont t qualifi s par leur propri taire de tr s sportifs alors que 34 chiens 22 7 e
75. lise 48 91 Les contraceptifs La concentration en cuivre dans le s rum et la concentration en c ruloplasmine dans le plasma augmentent lors de prise de contraceptifs oraux chez la femme concentration en cuivre de 10 7 26 6 mol L chez la femme sans contraceptif est de 15 7 31 5 umol L chez la femme prenant des contraceptifs 60 84 Cependant les pilules actuelles tant de moins en moins dos es riches en hormones la diff rence s att nue au cours du temps Ce sont les strog nes contenus dans ces pilules qui sont responsables de cette augmentation 24 86 En effet les progestatifs n ont aucun effet sur la concentration en cuivre dans le sang 90 3 L ge Chez les enfants la concentration en cuivre dans le s rum diminue avec l ge 92 93 Chez l homme adulte la concentration en cuivre augmente significativement avec l ge alors qu elle a tendance diminuer chez la femme 87 Figure 6 Chez l homme cette augmentation a t attribu e la diminution de l excr tion biliaire plut t qu une augmentation des capacit s d absorption intestinale 2 84 Chez la femme cette diminution est probablement due la diminution du taux et de l activit des strog nes avec l ge 24 32 87 Concentration en cuivre mg L M Homme O Femme Figure 6 Variations de la concentration en cuivre en fonction de l ge Chez les hommes elle diminue significativement alors que
76. m tallothion ines et donc diminue la concentration en cuivre dans le sang 12 77 84 100 101 gt Intoxication Une intoxication aig e peut survenir lors d un empoisonnement accidentel La dose toxique rapport e chez l homme est de 15 mg de cuivre par kilogramme en une fois soit environ dix fois l apport journalier recommand chez un adulte 39 La faible incidence des toxicoses chroniques est probablement le reflet de l efficacit des syst mes d hom ostasie du cuivre 39 gt Inflammation infection La concentration en c ruloplasmine et en cuivre dans le plasma augmente lors d inflammation ou d infection contrairement aux autres ions En effet la synth se et l excr tion de la c ruloplasmine dans les h patocytes sont stimul es par l interleukine 1 et 6 5 12 80 gt N oplasie Le cuivre pourrait tre n cessaire l angiog n se C est pour cela que beaucoup de tumeurs le s questrent Lors de processus n oplasique on a une concentration en cuivre augment e dans le sang 5 12 23 77 102 gt Diab te Le taux de cuivre dans le plasma est plus lev chez les personnes atteintes de diab te de type 1 ou 2 L insuline entraine la relocalisation de l ATP7A vers la membrane basolat rale des ent rocytes et joue ainsi un r le dans l export du cuivre surnum raire pr sent en intracellulaire acteur principal de l hom ostasie du cuivre En cas de diab te ce m canisme n est plus fon
77. membrane plasmique Cette deuxi me voie rentre en jeux principalement lorsque le cuivre est en grande quantit dans la cellule 5 Le cuivre relargu retourne au foie pour tre limin 36 Le m canisme pr cis d exportation du cuivre dans la bile n est pas enti rement r solu mais on suppose que l ATP7B et le Copper Metabolism gene MURRI1 containing Domain 1 COMMD1 coordonnent la fusion des v sicules contenant le cuivre avec la membrane des canalicules biliaires 1 5 10 11 35 37 Figure 2 25 Le cuivre se retrouve alors dans la bile o il est li a l acide tauroch nod oxycholatel cithine Cette liaison emp che la r absorption du cuivre qui vient d tre excr t Le complexe se dissocie par la suite dans le gros intestin o seul l acide biliaire peut tre r absorb et le cuivre est limin dans les f ces 38 Cependant le cuivre excr t dans la salive les s cr tions pancr atiques et le suc gastrique est libre et donc r absorb 12 F L hom ostasie La concentration en cuivre est finement r gul e Les tapes clefs de la r gulation sont L absorption intestinale Le stockage L excr tion biliaire 2 1 L absorption intestinale Lorsque la concentration en cuivre dans les h patocytes augmente l absorption intestinale diminue Cela est principalement du au transporteur hCtr1 5 hCtr1 Lorsque la concentration extracellulaire en cuivre augmente l g rement
78. mes sinc res remerciements A Monsieur le Docteur Vincent Blanchart Merci pour votre aide votre gentillesse et vos topos perp tuels Qu il re oive ici ma profonde reconnaissance et mes sinc res remerciements A Am lie et framboise ASV de l cole v t rinaire de Toulouse Pour votre p dagogie votre implication et votre bonne humeur Merci de m avoir accompagn durant toute cette ann e A Madame Marie Luce Chemit Pour son travail de qualit Sinc res remerciements Et surtout un grand GRAND merci tous les chiens et leurs propri taires qui ont particip s cette tude A la clinique v t rinaire des ar nes A Madame le Docteur Sabine Arbouille Pour m avoir encourag et guid tous au long de ces ann es pour m avoir toujours consid r comme ton gal et pour ton amiti qui m est ch re Sinceres remerciements A Monsieur le Docteur Nicolas Vicart Pour m avoir accueillie la clinique d s mon plus jeune ge et encore aujourd hui Sinc res remerciements A Monsieur le Docteur Pierre Marot Pour ta gentillesse et ta bonne humeur Sinc res remerciements A Joelle Vanessa et Karene car travailler avec vous est un plaisir A toutes les autres cliniques qui m ont accueillies au fil de ces ann es et tout particuli rement Monsieur le Docteur Marambat et sa femme Madame le Docteur Besombes et au Docteur Anselme pour votre gentillesse sinc res remerciements A mes parents Merci de m avo
79. ns de la concentration en cuivre et en c ruloplasmine sur 24h chez l homme Figure 8 Concentration en cuivre plasmatique en fonction de l activit physique r guli re pratiqu e Figure 9 Variations du cuivre en fonction de l ge chez le chien Figure 10 Illustration des transformations r alis es pr alablement au dosage de cuivre par spectrom trie d absorption Figure 11 Influence de la m thode de conservation des pr l vements avant centrifugation sur le dosage du cuivre illustration des trois groupes constitu s Figure 12 Effet du mode de conservation entre le pr l vement et la centrifugation sur la concentration en cuivre Figure 13 Effet du mode de centrifugation sur la concentration en cuivre Figure 14 Influence du d lai pr l vement centrifugation sur la concentration en cuivre Figure 15 R alisation d une gamme d h molyse Figure 16 Gamme d h molyse Figure 17 Influence de l h molyse sur la concentration en cuivre Figure 18 Effet du taux d h molyse sur la concentration en cuivre Figure 19 R partition normale de la concentration en cuivre dans le plasma dans la population canine tudi e Figure 20 Distribution de la concentration en cuivre en fonction de l ge dans la population canine tudi e Figure 21 Distribution de la concentration en cuivre en fonction de la race dans la population canine tudi e Figure 22 Distribution de la concentration en cuivre en fonction du
80. of the copper ATPases ATP7A and ATP7B role in copper homeostasis Arch Biochem Biophys 2007 463 2 p 149 67 2 Wapnir R A Copper absorption and bioavailability Am J Clin Nutr 1998 67 5 Suppl p 1054S 1060S 3 Moller L B Carsten Petersen B Connie Lund A Nina Horn Characterization of the hCTR1 gene genomic organization functional expression and identification of a highly homologous processed gene Gene 2000 257 1 p 13 22 4 Pena M M J Lee D J Thiele A delicate balance homeostatic control of copper uptake and distribution J Nutr 1999 129 7 p 1251 60 5 Tapiero H D M Townsend and K D Tew Trace elements in human physiology and pathology Copper Biomed Pharmacother 2003 57 9 p 386 98 6 Arredondo M Munoz P Mura C V Nunez M T DMT1 a physiologically relevant apical Cu1 transporter of intestinal cells Am J Physiol Cell Physiol 2003 284 6 p C1525 30 7 Bertini A R Menkes disease Cellular and molecular Life Sciences 2008 65 p 89 91 8 Puig S D J Thiele Molecular mechanisms of copper uptake and distribution Curr Opin Chem Biol 2002 6 2 p 171 80 9 Garcia Hejl C Vrignaud C Garcia C Ceppa F From gene to disease copper transporting P ATPases alteration Pathol Biol Paris 2009 57 3 p 272 9 10 Fieten H Leegwater P A J Watson A L Rothuizen J Canine models of copper toxicosis for understanding mammalian copper metabolism Mamm G
81. on s rique de cuivre est significativement plus basse chez les m les castr s avec une concentration moyenne en cuivre de 0 78 0 06 ug mL que chez le chien entier et de 0 718 0 095 ug mL chez le chien castr respectivement On a alors une concentration moyenne proche de celle des femelles 0 702 0 094 ug mL Cette tude a t r alis e sur 800 beagles 106 5 Le stress Lors de stress le taux de cuivre dans le sang semble diminuer l g rement de 4 Dans cette tude sur 800 beagles la moiti des chiens taient pr lev s ponctuellement 43 alors que l autre moiti a t pr lev e tous les mois On suppose donc que les chiens pr lev s tous les mois pendant un an se sont habitu s et donc sont moins stress s 106 C Variations pathologiques 1 Pathologies non sp cifiques Exc s de cuivre La concentration en cuivre chez le chien augmente lors de processus tumoral d infections chroniques et d pilepsie de respectivement 1 7 et 4 106 Cependant lors de dermatite chronique et de troubles h patiques il n y a pas de variations 106 D ficit en cuivre Lors de malabsorption ou d ent ropathie avec perte de prot ines la concentration plasmatique en cuivre diminue 106 2 H patite par surcharge en cuivre De nombreux d sordres du stockage en cuivre ont t identifi s chez le chien On les retrouve principalement dans certaines races telles que le Bedlington terrier le
82. opulation canine en g n ral Notre unique crit re d inclusion pour les chiens de cette tude ayant t un tat clinique apparemment sain suite un examen clinique rigoureux de nombreuses races et de nombreux ges sont alors repr sent s les chiens ne re oivent pas tous la m me alimentation et ils vivent dans des conditions non similaires contrairement aux tudes r alis es pr c demment Cependant certains biais inh rents l chantillonnage des animaux dans cette tude peuvent tre pr sents 72 A Caract res pid miologiques biais ventuels Dans notre population 40 des femelles et 30 des m les taient st rilis es contre 40 des femelles et 19 des m les dans les r f rences nationales fran aises d apr s l enqu te Facco Sofres de 2008 Cette proportion relativement lev e de sujets st rilis s chez les males proviens probablement du fait que une grande partie des chiens pr lev s appartenaient a des tudiants v t rinaires plus sensibilis s au risque d affection prostatique et que leurs chiens vivant en collectivit sont plus confront s des probl mes comportementaux inh rents aux hormones sexuelles masculines De la m me mani re La majorit des chiens 72 1 recevaient une alimentation de type v t rinaire Ce r sultat semble biais par le fait que les tudiants v t rinaires ont des prix pr f rentiels sur ces diff rentes marques Une grande proportion de propri t
83. ostic factors J Vet Intern Med 2007 21 1 p 33 9 110 Van De Sluis B Rhotuizen J Pearson P L Van oost B A Wijmenga C Identification of a new copper metabolism gene by positional cloning in a purebred dog population Hum Mol Genet 2002 11 2 p 165 73 111 Klomp AE v d S B Klomp LW Wijmenga C The ubiquitously expressed MURR1 protein is absent in canine copper toxicosis Journal of Hepatology 2003 39 p 703 709 112 Fieten H Hooijer Nouwens BD Biourge VC Leegwater PA Watson AL van den Ingh TS Rothuizen J Association of dietary copper and zinc levels with hepatic copper and zinc concentration in labrador retrievers J Vet Intern Med 2012 26 6 p 1274 80 89 113 Kennedy C Angermuller S King R Noviello S Walker J Warden J Vang S A comparison of hemolysis rates using intravenous catheters versus venipuncture tubes for obtaining blood samples J Emerg Nurs 1996 22 6 p 566 9 114 Cox S R Dages JH Jarjoura D Hazelett S Blood samples drawn from IV catheters have less hemolysis when 5 mL vs 10 mL collection tubes are used J Emerg Nurs 2004 30 6 p 529 33 115 D P L Development and validation of a body condition score system for dogs Canine Practice 1997 22 p 10 15 90 Toulouse 2013 Nom Van on Pr nom Sol ne Titre Le statut en oligo l ment chez le chien sain le cuivre R sum Ce travail est une tude exp rimentale ayant pour but de d terminer l int
84. p 498 500 61 Aceto M Abollinoz O Concetta Bruzzoniti M Ment Mentastiz E Sarzaniniz C Malandrinoz M Determination of metals in wine with atomic spectroscopy flame AAS GF AAS and ICP AES a review Food Addit Contam 2002 19 2 p 126 33 62 J M Jurado LJ M F Pablos A Moreda pineiro P Bermejo barrera Direct determination of copper lead and cadmium in aniseed spirits by electrothermal atomic absorption spectrometry Food chemistry 2007 101 p 1296 1304 63 Forrer R K Gautschi H Lutz Simultaneous measurement of the trace elements Al As B Be Cd Co Cu Fe Li Mn Mo Ni Rb Se Sr and Zn in human serum and their reference ranges by ICP MS Biol Trace Elem Res 2001 80 1 p 77 93 64 Parker M M F L Humoller DJ Mahler Determination of copper and zinc in biological material Clin Chem 1967 13 1 p 40 8 65 Meret S R I Henkin Simultaneous direct estimation by atomic absorption spectrophotometry of copper and zinc in serum urine and cerebrospinal fluid Clin Chem 1971 17 5 p 369 73 66 Schmitt Y Influence of preanalytical factors on the atomic absorption spectrometry determination of trace elements in biological samples J Trace Elem Electrolytes Health Dis 1987 1 2 p 107 14 67 Spolders M Ohlschl ger S Rehage J Flachowsky G Inter and intra individual differences in serum copper and zinc concentrations after feeding different amounts of copper and zinc over t
85. pas re us de traitement dans le mois pr c dent Pour chaque chien le propri taire a d remplir un questionnaire indiquant l ge la race la robe le sexe et une ventuelle st rilisation ainsi que la date o celle ci a eu lieu Il est galement demand si le chien a pris des contraceptifs au cours de sa vie en pr cisant la mol cule utilis e De plus il indique l activit de son chien son mode de vie la pr sence d un jardin ou non la pr sence d autres animaux s il joue ou est en contact avec un quelconque m tal ses habitudes alimentaires type et marque de nourriture nombre de repas par jour quantit de nourriture par repas moment du dernier repas et la provenance de l eau de boisson et la date et le produit de la derni re vermifugation Le Body Condition Scoring BCS a t valu par nos soins sur tous les chiens Les principaux crit res d valuation sont la pr sence de d p ts graisseux sur les vues lat rales et dorsales des c tes des vert bres lombaires et des autres saillies osseuses la pr sence d une taille marqu e d un abdomen gonfl ou distendu la quantit de graisse sous cutan e les autres d p ts graisseux et les ventuelles pertes de masses musculaires Un BCS de 4 9 ou 5 9 correspond une morphologie id ale Les animaux poss dant un BCS de 1 3 sur 9 sont consid r s comme maigres alors que les animaux poss dant un BCS allant de 6 9 9 sont en surpoids
86. plasmin and apoceruloplasmin in rat plasma J Biol Chem 1970 245 9 p 2354 8 29 Harris Z L LW Klomp J D Gitlin Aceruloplasminemia an inherited neurodegenerative disease with impairment of iron homeostasis Am J Clin Nutr 1998 67 5 Suppl p 972S 977S 30 Harris Z L J D Gitlin Genetic and molecular basis for copper toxicity Am J Clin Nutr 1996 63 5 p 836S 41S 31 Kunihito terada Y k copper incorporation into ceruloplasmin in rat liver Biochimica et Biophysica acta 1995 1270 p 58 62 32 Bureau l Anderson R A Arnaud J Raysiguier Y Favier A E Rousse A M Trace mineral status in post menopausal women impact of hormonal replacement therapy J Trace Elem Med Biol 2002 16 1 p 9 13 33 lyengar V J Woittiez Trace elements in human clinical specimens evaluation of literature data to identify reference values Clin Chem 1988 34 3 p 474 81 34 McMillin G A J J Travis J W Hunt Direct measurement of free copper in serum or plasma ultrafiltrate Am J Clin Pathol 2009 131 2 p 160 5 35 Wijmenga C L W Klomp Molecular regulation of copper excretion in the liver Proc Nutr Soc 2004 63 1 p 31 9 36 Tavassoli M T Kishimoto M Kataoka Liver endothelium mediates the hepatocyte s uptake of ceruloplasmin J Cell Biol 1986 102 4 p 1298 303 37 Cater M A La Fontaine J F B ATP7B mediates vesicular sequestration of copper insight into biliary copper excretion Gastro
87. rne D faut de pigmentation OSquames Poil noir devenu roux CD coloration de la truffe Oplaques ryth mateuses OPoil laineux CHyperpigmentation OEpaississement de la peau OAutre pr cisez Outre pr cisez Oautre pr cisez Pr cisez la date d apparition Pr l vement sur tube h parin plein de 4 mL A ne pas remplir par le propri taire Etat d agitation de l animal C Animal craintif fig contract LWnimal normal Lhnimal agit excit hyper mobile Date et Heure de centrifugation Temps entre le pr l vement et la centrifugation H molyse C Non ClOui n Autre remarque 79 Annexe 2 Mode d emploi du dosage en cuivre a l ENVT Dosage du cuivre et du zinc dans le plasma m thode Lamand modifi e Principe Le dosage des oligo l ments se fait sur le plasma le cas ch ant sur le s rum Apr s pr cipitation des prot ines par l acide chlorhydrique on dose le cuivre et le zinc par spectrophotom trie d absorption atomique sur le plasma dilu au 1 4 5 me dans de l eau distill e Pr paration des chantillons 1 Pr levement Le sang est pr lev l aiguille inox par coulement sur tube plastique chimiquement propre et sec avec 2 gouttes d h parine liquide 5000 UI ml ou cristallis e Le tube est retourn 1 2 fois pour bien m langer l h parine au sang puis centrifug sur place dans le meilleur des cas ou le plus rapidement pos
88. rs Les autres facteurs tudi s n ont aucun effet significatif sur la concentration en cuivre dans le plasma chez le chien C Effet des facteurs pr analytiques sur la distribution de la concentration en cuivre de la population tudi e de chiens sains Le moment du dernier repas et l heure du pr l vement n ont eu aucun effet sur la concentration en cuivre dans le sang L h molyse n a pas d influence significative sur la cupr mie Figure 22 71 H molyse Cuivre T T T 1 2 3 Modalit Figure 23 Distribution de la concentration en cuivre en fonction du taux d h molyse des tubes dans la population canine tudi e Groupe 1 taux d h molyse 1 groupe 2 taux d h molyse 2 groupe 3 taux d h molyse 3 et 4 Le point rouge correspond a la moyenne et le trait en gras a la m diane La concentration en cuivre est exprim e en mol L Il Discussion De rares tudes se sont int ress es la concentration en cuivre et ses variations dans des populations canines pr sentant un caract re pid miologique commun la race 106 107 le mode de vie 106 107 108 Cependant ces tudes ont t r alis es sur des populations de chiens d di es l exp rimentation ou sur des populations de chiens appartenant une seule race Notre tude a la particularit d tre r alis e sur une population de chiens sains pid miologiquement h t rog ne mais repr sentative de la p
89. s mangeait deux repas par jour Seuls 12 chiens ont re u une alimentation volont Enfin la majorit des chiens 73 3 soit 110 chiens pr sentent un BCS dit normal entre 4 et 5 9 mais 30 chiens poss dent un BCS sup rieur 6 9 soit un poids r el sup rieur d environ 15 au poids id al Seul dix chiens tait trop maigres pr sentant un BCS inf rieur 3 9 soit un poids r el inf rieur au poids id al d environ 20 65 Sexe Males Males non castr s Males castr s Femelles Femelles non st rilis es Femelles st rilis es Age Chiots lt 1an Jeunes adultes 1 3ans Adultes 3 8 ans Mature gt 8ans Races Crois s Pure race Groupe 1 chiens de bergers Groupe 2 Pinscher schnauzer et molosso des Groupe 3 chiens de terrier Groupe 4 Teckels Groupe 5 chiens scandinaves Groupe 6 chiens courants Groupe 7 chiens d arr t Groupe 8 Spaniels retrievers et chiens d eau Groupe 9 chiens d agr ment et de compagnie Groupe 10 L vriers Activit Activit limit e Activit mod r e Tr s sportif Lieu de vie Maison avec jardin Appartement Chenil Contact avec des objets en m tal Pas de contact avec du m tal Effectif 63 19 87 52 35 63 39 101 13 34 91 25 72 61 17 29 121 Pourcentage 42 70 30 58 60 40 29 3 42 26 2 7 32 7 67 3 18 8 12 9 9 9 3 9 21 8 7 9 8 9 12 9 22 1 60 7 16 6 40 7 11 3 19 3
90. s donn es actuelles sur le m tabolisme du cuivre et ses facteurs de variations chez le chien Chez le chien tr s peu d tudes ont t r alis es nous avons donc tr s peu de donn es De plus les tudes disponibles ont t r alis es quasiment exclusivement sur des beagles servant l exp rimentation 41 A Variations pr analytiques 1 Les composants sanguins Chez le chien la concentration en cuivre dans le s rum est deux fois plus faible que chez l homme 322 139 ng mL chez le chien Le cuivre est li aux m mes prot ines mais dans des proportions diff rentes il est majoritairement li la transcupr ine 105 Tableau 4 Composant Proportion de cuivre ug l C ruloplasmine 135 180 37 49 Albumine 29 8g Transcupr ine macroglobuline 150 200 41 54 Prot ines de faible poids mol culaire 6 2 Tableau 4 Prot ines de transport plasmatique du cuivre chez le chien d apr s 105 2 L h molyse Des dosages de la concentration en cuivre dans le s rum ont t r alis s sur 800 beagles L h molyse ne semble pas influencer la concentration en cuivre dans le s rum 106 107 3 Lalip mie Des dosages de la concentration en cuivre dans le s rum ont t r alis s sur 800 beagles Certains pr l vements pr sentaient visuellement une lip mie importante Le dosage a cependant t effectu et la lip mie ne semble pas avoir d influence sur la concentration en cuivre dans le
91. s la bile Le cuivre se lie galement au glutathion puis est transf r aux m tallothioneines Il existerait galement un autre moyen de stockage du cuivre des v sicules portant leur surface le transporteur hCTR2 un transporteur similaire hCTR1 qui permettrait la lib ration de ce cuivre en cas de n cessit d apr s 4 10 11 35 39 22 C Transport sanguin L holoc ruloplasmine form e dans le foie est excr t e dans la circulation sanguine et est distribu e aux autres cellules qui poss dent des r cepteurs sp cifiques 25 L holoc ruloplasmine se lie aux r cepteurs ce qui induit un changement de sa conformation et permet la lib ration de 4 des 6 atomes de cuivre 26 Sans cette liaison le cuivre reste emprisonn dans la c ruloplasmine sans change possible 12 22 27 28 Malgr cela la c ruloplasmine n est pas essentielle dans le m tabolisme du cuivre car son absence n entraine pas de d ficit en cuivre En effet d autres prot ines telles que l albumine ou la transcupr ine peuvent remplir la fonction de transporteur en cas de d ficit en c ruloplasmine 29 30 Il existe une autre forme appel e apoc ruloplasmine contenant un unique atome de cuivre que l on retrouve en faible quantit dans le sang Cette forme la n est pas fonctionnelle car ne poss de pas la m me conformation que l holoc ruloplasmine 31 et poss de une demi vie plus courte 28 Le cuivre a donc un r le essen
92. s menstruations et plus faible pendant l ovulation Le m canisme n est pas bien connu et pas expliqu 24 71 86 La gestation et la lactation Lors de la grossesse la concentration en cuivre dans le sang de la m re augmente particuli rement durant le deuxi me et le troisi me trimestre Elle atteint son maximum autour de la 22 et 25 semaine puis diminue progressivement jusqu l accouchement 90 Cette augmentation est d autant plus marqu e que la femme est primipare et peut aller jusqu doubler 57 On ne sait rien sur ce domaine chez les chiens La concentration en c ruloplasmine augmente en parall le Comme vu pr c demment les strog nes stimulent la synth se de c ruloplasmine On suppose donc que l augmentation de c ruloplasmine pendant la grossesse est due au taux d hormones lev Cela n a cependant pas t prouv 47 84 Cette augmentation pourrait galement tre due a une mobilisation du cuivre par le tissu mammaire avant la lactation ou encore 35 un m canisme de d fense de l organisme maternel envers les produits issus du m tabolisme du foetus En effet la c ruloplasmine a des propri t s anti oxydantes 57 Lors de la lactation la concentration en cuivre dans le plasma reste constante et la concentration dans le lait diminue au fur et mesure du temps en parall le de celle de la c ruloplasmine elle est divis e par trois au bout de 5 jours de lactation puis se stabi
93. sexe et de la st rilisation dans la population canine tudi e Figure 23 Distribution de la concentration en cuivre en fonction du taux d h molyse des tubes dans la population canine tudi e Table des tableaux Tableau 1 Composants liant le cuivre dans le plasma chez l homme et leur proportion Tableau 2 Enzymes utilisant le cuivre comme cofacteur et leur fonction Tableau 3 Les voies d excr tion du cuivre chez l homme 15 Tableau 4 Prot ines de transport plasmatique du cuivre chez le chien Tableau 5 Les h patites cupriques chez le chien Tableau 6 Influence du temps entre le pr levement et la centrifugation sur le dosage du cuivre Tableau 7 Reconstitution des tubes avec diff rentes proportions de plasma et de globules rouges Tableau 8 Temps de m lange des tubes du groupe 2 Tableau 9 Principaux crit res de d termination du BCS Body Score Condition par inspection visuelle chez le chien Tableau 10 Caract ristiques pid miologiques de la population canine tudi e 16 INTRODUCTION Le cuivre est un m tal essentiel a la vie c est un oligo l ment De multiples enzymes impliqu es dans la synth se de neurotransmetteurs dans la formation du tissu conjonctif ou bien encore dans la chaine respiratoire l utilisent comme cofacteur De ce fait tout d ficit entrainant un mauvais fonctionnement voire une inactivation de ces enzymes est d l t re Le cuivre peut cependant s av rer toxique
94. sible apr s conservation du tube sur bain de glace 1 heure maximum 2 Centrifugation et r cup ration 15 minutes a 1500 g 12 minutes a 2500 g 08 minutes 3000 g Apres centrifugation pipeter le plasma sans reprendre d h maties et conserver au r frig rateur Remarques 10 ml de sang total correspondent 3 5 ml de plasma apr s centrifugation Les h maties contenant 5 fois plus de zinc que le plasma toute h molyse compromet l interpr tation du zinc plasmatique Attention au laminage lors du pr l vement ou la pr sence d eau La conservation du plasma se fait au r frig rateur et non au cong lateur R actifs HCI 3N diluer 250 ml HCI concentr d 1 18 37 qsp 1 H20 distill e Eau distill e Solutions m res de cuivre et de zinc a 1 g L solutions standard CertiPUR Merck 80 Cuivre solution talon Cu NO3 dans HNO 0 5 mol l 500 ml ref 1 19786 0500 Zinc solution talon Zn NO3 dans HNO 0 5 mol 500 ml ref 1 19806 0500 Mat riel Tubes polypropyl ne 5 ml et bouchons Vortex Centrifugeuse Micropipettes et pipette multidistribution Embouts jetables Mode op ratoire 1 Pr paration des chantillons Homog n iser les chantillons bruts par retournement doux si des h maties sont pr sentes en culot laisser re s dimenter quelques minutes Pr lever 1 ml d chantillon la pipette dans un tube sec de 5 ml et rajouter 0 5 ml d HCI 3N A
95. st a permis de diminuer la pr valence de la maladie dans cette race 10 L h patite du labrador retriever L h patite du labrador retriever est une maladie complexe et h r ditaire 85 d h ritabilit Le cuivre s accumule progressivement dans le foie au cours des ann es d abord de mani re asymptomatique puis l animal d compense brusquement 10 Elle se d clare chez les adultes et plut t chez les vieux chiens et est g n ralement fatale en quelques mois Les femelles sont pr dispos es 109 Il a t montr qu une alimentation riche en cuivre et pauvre en zinc augmente de mani re significative le risque de d velopper une h patite chez le labrador 112 Le risque de d clarer la maladie augmente durant la p riode post partum Les hormones ou le stress pourraient acc l rer la vitesse de d gradation de la fonction h patique lors de la gestation et de la lactation Cela n a cependant pas t d montr 10 La maladie du West Highland White terrier La maladie du West Highland White terrier a clairement une distribution familiale et n a pas de pr disposition sexuelle On ne connait rien de plus 10 La maladie du Doberman Les dobermans pr sentent parfois une forme s v re d h patite et de cirrhose avec surcharge cuprique Elle se retrouve de fa on quasi exclusive chez les femelles et l issue est souvent fatale en quelques semaines ou quelques mois 10 Il est possible que cette mala
96. t r duit sous forme Cu et absorb 2 Figure 1 Il rentre dans les ent rocytes par deux m canismes gr ce un transporteur saturable et ayant une haute affinit pour le cuivre le human copper transporter 1 hCtr1 3 Ce transporteur permet l absorption de Cu lorsque la concentration en cuivre dans les ent rocytes est faible 4 12 14 Il est pr sent dans toutes les cellules de l organisme 5 via une diffusion passive a travers la bordure en brosse qui est pr dominante lorsque la concentration en cuivre dans les ent rocytes est forte 5 Un autre transporteur de m taux le Divalent Metal transporter 1 DMT1 aussi connu sous le nom de Natural Resistance Associated Macrophage Protein 2 Nramp2 et de Divalent Cation Transporter 1 DCT1 pourrait galement jouer un r le dans absorption du cuivre de mani re non sp cifique Il a t d montr que DMT1 assure le passage du fer dans les ent rocytes par un processus couplant le transport de protons Son r le pour le cuivre reste incertain 6 2 Dansles ent rocytes Arriv dans le secteur intracellulaire le cuivre se fixe des mol cules chaperonnes Hah1 galement appel e Antioxydant protein 1 Atox1 Chaque Hah1 lie une mol cule 19 unique de cuivre 7 Ces mol cules chaperonnes acheminent le cuivre jusqu l ATP7A une ATPase de type P Il existe diff rents types d ATPases le type P correspondant aux AT
97. tes palpables Al recouvrant les c tes L ger exc s de graisse recouvrant les 6 Surcharge C tes palpables Fa 8 Graisse d pos e sur les c tes les 7 Gros C tes difficiles palper si lombes et la base de la queue s g Fort d p t de graisse sur les c tes les 8 Ob se C tes palpables en excer ant une forte pression lombes et la base de la queue D p t majeur de graisse sur le thorax 9 Tr s ob se C tes non palpables rachis base de la queus encoulure membres et face Tableau 9 Principaux crit res de d termination du BCS Body Score Condition par inspection visuelle chez le chien 115 La pr sence de troubles dermatologiques et leur identification pr cise est galement r alis e par nos soins Les pr l vements de sang ont t r alis s par ponction la veine jugulaire sur tube h parin de 4 mL Ils ont ensuite t plac s 4 C et centrifug s 20 60 min apr s pendant 10 minutes 4000 tours min et temp rature ambiante Un millilitre de plasma a t pr lev et le taux d h molyse a t valu gr ce la gamme d h molyse r alis e pr c demment Les plasmas ainsi obtenus ont ensuite t conserv s 4 C jusqu au moment des analyses r alis es une fois par semaine Les plasmas ont subit le m me traitement que pr c demment 64 2 Caract ristiques pid miologiques de la population tudi e Au sein de la population tudi e 63 chiens taient des m
98. tiel dans la fonction et la stabilit de la c ruloplasmine 1203 Hs O Cp Cu Cp Cu Fe Fe Figure 3 M canisme d action de la c ruloplasmine En plus de son r le de transporteur la c ruloplasmine est une ferroxydase elle utilise le potentiel oxydo r ducteur du cuivre pour oxyder le fer L holoc ruloplasmine retourne a son tat d origine en r duisant l oxyg ne Le m tabolisme cuprique est donc troitement li au m tabolisme du fer 29 Outre la liaison la c ruloplasmine voire l albumine et la transcupr ine le cuivre peut aussi se lier d autres prot ines 34 Tableau 1 23 Proportion de cuivre ANSE ug l uM C ruloplasmine 650 700 10 11 65 70 Albumine 120 180 2 3 12 18 Transcupr ine macroglobuline 90 14 9 Ferroxydase II 10 0 16 1 Superoxyde dismutase extracellulaire et histidine lt 10 lt 0 16 lt l Facteurs de coagulation V et VIII lt 5 lt 0 08 lt 0 5 Metallothion ines exracellulaire lt 1 lt 0 02 lt 0 1 Compos s de 15 60kDa 40 0 63 4 Petits peptides et acides amin s 35 0 55 4 Cuivre libre 0 0001 0 0000002 0 Tableau 1 Composants liant le cuivre dans le plasma chez l homme et leur proportion 5 Enfin on retrouve du cuivre dans les globules rouges o il est le cofacteur de la SOD 32 33 D L utilisation du cuivre Il existe de multiples enzymes qui utilisent le cuivre comme cofacteurs un cofacteur est une substance chimique non prot
99. toxification des radicaux libres Production d nergie cellulaire par transport d lectron dans le mitochondrie Stockage du cuivre en surplus et d autres ions divalent m tallique Liaison collag ne lastine Formation de la m lanine Formation de cat cholamine Bioactivation de neuropeptides et d hormone peptidiques Ferroxydase Aide l absorption du fer homologue de la c ruloplasmine Ferroxydase Homologie de la c ruloplasmine Lie le cuivre Propri t inconnue M tabolisme d hydrolyse des acides amin s sulfuris s Fonction inconnue Angiogen se Coagulation Tableau 2 Enzymes utilisant le cuivre comme cofacteur et leur fonction d apr s 4 5 11 E L limination du cuivre Le cuivre est principalement excr t dans la bile 98 35 Une faible quantit est excr t e dans la salive l urine ou encore via la desquamation des cellules pith liales gastriques et intestinales 5 Tableau 3 Fluides Concentration en cuivre Excretion journali re ug g pe Salive 0 22 330 450 Suc gastrique 0 39 1000 Bile 4 0 2500 S cr tion pancr atique 0 3 0 9 400 1300 Urine 0 02 0 05 30 75 Tableau 3 Les voies d excr tion du cuivre chez l homme On a donc une excr tion moyenne d environ 5325ug de cuivre par jour d apr s 12 26 La majorit des cellules ne peuvent pas liminer le cuivre Elles le relarguent alors dans le sang par deux voies l exocytose et par diffusion au travers de la
100. u 8 N de tube Temps de m lange 1 0 2 10s 3 30s 4 1 min 5 min Tableau 8 Temps de m lange des tubes du groupe 2 Les tubes sont alors r frig r s puis centrifug s Le taux d h molyse est quantifi l aide de la gamme d h molyse pr c demment r alis e Aucun tube du groupe 1 n est h molys Nous avons alors pr lev 1 mL de plasma de chaque tube et les plasmas ont t analys s d apr s la m thode d crite pr c demment 2 R sultats Les tubes ont t s par s en 4 groupes pour lesquels une note d agitation a t attribu e Une note d agitation de 1 correspond tube d h molyse 1 c est dire n ayant pas t h molys et une note d agitation de 4 correspond un taux d h molyse de 4 ou plus Il n y a pas de diff rence significative dans le groupe 1 Il n y a pas de diff rence significative en fonction du taux d h molyse Figure 18 60 1 2 3 4 Figure 18 Effet du taux d h molyse sur la concentration en cuivre Groupe 1 Les tubes n ont pas t agit s groupe 2 La note d agitation est de 2 groupe 3 La note d agitation est de 3 Groupe 4 la note d agitation est de 4 ou plus La concentration en cuivre est exprim e en mol L Les moyennes sont repr sent es sur ce graphique 3 Conclusion La concentration en cuivre des tubes du groupe 1 n est pas significativement diff rente de celle des autres groupes Le fait
101. ue en cuivre augmente avec la consommation d acide gras 72 Cette augmentation est plus importante avec les acides gras satur s 74 gt Fibres Une alimentation riche en fibres augmente l limination f cale en cuivre et donc diminue son absorption Cependant cela ne semble pas avoir d effet sur la concentration dans le sang du moins relativement court terme moins de trois semaines 50 73 75 gt Oligo l ments e Cuivre Le taux de cuivre dans la ration influence son absorption par les ent rocytes 33 Lorsqu il est faible l absorption du cuivre augmente S il est trop faible l organisme n arrive plus a compenser et on a alors une diminution de la concentration en cuivre dans le sang 76 Par exemple lorsque l ingestion de cuivre est de 1 mg kg en accord avec les recommandations d apport journalier de l homme plus de 50 est absorb 16 L absorption diminue avec l apport alimentaire en cuivre 76 Par exemple lorsque l ingestion de cuivre est de 5 mg kg moins de 20 est absorb 16 e Zinc Un apport excessif en zinc peut tre a l origine d un d ficit en cuivre Le zinc induit la synth se de m tallothion ines dans la muqueuse intestinale Ces deux m taux sont alors en comp tition pour ces prot ines nouvellement synth tis es mais le cuivre poss de une affinit plus importante et s y lie plus avidement Ce cuivre est alors s questr dans les cellules intestinal
102. ue la p nicillamine ou le t trathiomolybdate prescrit lors de rhumatisme inflammatoire chronique qui limitent la biodisponibilit du cuivre et peuvent terme entrainer un d ficit 5 Un traitement base d anti acides pendant une p riode prolong e diminue la concentration plasmatique en cuivre Il semblerait que les anti acides contiennent des oxydes qui pr cipitent les sels de cuivre a un pH alcalin et donc diminue l absorption du cuivre 77 gt Malassimilation Lors de malassimilation l absorption du cuivre est diminu e On a alors un d ficit en cuivre lorsque les r serves sont puis es Une malassimilation peut tre secondaire une intervention chirurgicale ou une maladie digestive chronique 39 69 gt Pr matur Lors de la gestation l accumulation du cuivre chez le foetus se fait majoritairement durant le dernier tiers la r serve en cuivre pr sente dans le foie est donc plus faible chez les pr matur s Comme les besoins en cuivre augmentent lors de la croissance plus longue chez ses enfants l on a fr quemment des d ficits 77 39 gt Pertes excessives Les personnes atteintes d un syndrome n phrotique sont pr dispos es un d ficit en cuivre secondaire une augmentation des pertes urinaires 77 Lors de br lure on peut galement avoir une perte importante de cuivre 77 De surcharge gt M dicamenteux Un traitement base de glucocortico des stimule la synth se de
103. uel je pense soyez remerci ici A tous ceux auquel je ne pense pas forcement mais qui ont fait partie de ma vie et on contribu s faire de moi la personne que je suis soyez remerci s galement 10 TABLE DES MATIERES ABBREVIATIONS cirina i cectdanaedadacbdtende ces A A IA RA Aa airia tobe cba p 14 TABLE DES ILLUSTRATIONS inini hin aea naaa aaea Taan REAS ATASATE EAEE p 15 INTRODUCTION iaiia aa ae S EAA EE AE E tS p 17 PARTIE LR a Eaa a ai Aa A A AA Aa a Aaaa p 18 LE CUIVRE CHEZ LE CHIEN ET CHEZ L HOMME SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE I Le m tabolisme du cuivre p 19 A De l alimentation au foie p 19 1 L absorption 2 Dans les ent rocytes B Le cuivre dans le foie p 21 1 Synth se de la c ruloplasmine 2 Distribution la superoxyde dismutase 3 Distribution la mitochondrie C Le transport sanguin p 23 D L utilisation du cuivre p 24 E L limination du cuivre p 25 F L hom ostasie p 26 1 L absorption intestinale 2 Le stockage 3 L excr tion biliaire G Le cuivre pendant la gestation et la lactation p 28 1 Lagestation 2 Lalactation Il Le dosage du cuiVre i n ses nes en wae be Nad sods intro tie reste de d s p 30 A Le pr levement p 30 1 Lesang 2 Les tissus 3 Les cheveux 4 Uurine B Le dosage p 31 1 M thode de dosage 2 Les interf rences en spectrom trie Ill Les facteurs de variations connus de la concentration en cuivre dans le sang chez A Variations pr
104. wo lactations J Anim Physiol Anim Nutr Berl 2008 94 2 p 162 73 68 Laven R A C T Livesey An evaluation of the effect of clotting and processing of blood samples on the recovery of copper from bovine blood Vet J 2006 171 2 p 295 300 69 Sternlieb H D Janowitz Absorption of Copper in Malabsorption Syndromes J Clin Invest 1964 43 p 1049 55 70 O lux D n The assessment of biological variation components of copper zinc and selenium Journal of Nutritional biochemistry 1995 6 p 43 47 71 Lahey M E C J Gubler G E Cartwright M M Wintrobe Studies on copper metabolism VI Blood copper in normal human subjects J Clin Invest 1953 32 4 p 322 8 72 Sanchez C L pez Jurado M Aranda P Llopis J Plasma levels of copper manganese and selenium in an adult population in southern Spain influence of age obesity and lifestyle factors Sci Total Environ 2010 408 5 p 1014 20 73 Sandstead H H Copper bioavailability and requirements Am J Clin Nutr 1982 35 4 p 809 14 74 M Fields M D L C G Lewis Effect of satured versus unsaturated fat on the pathogenesis of copper deficiency in rats Nutritional Biochemistry 1996 7 p 246 251 87 75 Drews L M C Kies H M Fox Effect of dietary fiber on copper zinc and magnesium utilization by adolescent boys Am J Clin Nutr 1979 32 9 p 1893 7 76 Turnlund J R Keyes W R Peiffer G L Karen C Scott K C Copper absorption ex
105. xercaient une activit limit e Il appara t donc que a grande majorit des chiens 91 chiens soit 60 7 a eu une activit mod r e En parall le 48 des chiens tudi s vivaient dans une maison avec acc s un jardin et 40 7 vivaient en appartement De plus seulement 19 3 de la population tudi e soit 29 chiens a eu acces a des objets en m tal principalement une gamelle en inox Concernant le comportement des chiens tudi s pendant la consultation 22 d entre eux 14 7 taient contract 38 25 3 taient agit s et la majorit 60 soit 90 chiens avaient un comportement normal Concernant l alimentation 98 des chiens mangeaient des croquettes Parmi ces chiens mangeant principalement des croquettes 29 9 avaient des c t s et restes de table Les trois chiens restant 2 mangeaient uniquement une alimentation humide ou une ration m nag re Quant la qualit des aliments distribu s aux chiens tudi s 72 1 d entre eux recevaient une alimentation de type v t rinaire stricte dite premium Hill s Royal canin Proplan Eukanuba Virbac Specific le reste recevant une alimentation de grande surface Carrefour Brekkies Friskies Canigou Frolic Parmi les chiens recevant une alimentation de type v t rinaire de haute qualit 30 2 ont re u des c t s des restes de table et des os ronger La majorit des chiens tudi s 50 7 soit 76 chien

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