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Calprotectin - Bühlmann Laboratories

1. SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE If the extraction devices are used less than 1 g of native stool sample is needed for the extraction procedure Collect stool samples into plain tubes The samples can be stored refrigerated at 2 80 for at least 6 days The extracts are stable for at least 7 days at 2 8 C and for at least 24 months at 20 C Important The sample must be collected without any chemical or biological additions in the collection device STANDARDIZATION The test BUHLMANN fCAL ELISA is calibrated against purified MRP8 14 from human granulocytes 2014 08 14 3 36 STOOL SAMPLE EXTRACTION Standard extraction procedure 1 Label and weigh tare the empty polypropylene tube together with the inoculation loop 2 Take out 50 to 100 mg of the stool sample by means of the inoculation loop and place it into the pre weighted tube 3 Calculate the net amount of sample break off the inoculation loop and leave the lower part of the loop in the tube 4 Add Extraction Buffer according to the formula x mg stool x 49 y ul extraction buffer e g 50 mg stool 2450 pl buffer to the tube and close the tube 5 Homogenize the sample on a multi tube vortexer by vigorous shaking at highest speed for 30 minutes 6 Transfer the homogenate into a 2 mL Eppendorf tube and centrifuge in a microcentrifuge for 5 minutes at 3 000 x g 7 Take the supernatant into a fresh labeled tube and continue with the ELISA pro
2. 4b Pipete 100 uL del Control s rico bajo y alto en los pocillos respectivos 4c Pipete 100 uL de cada muestra diluida en los pocillos subsiguientes 5 Selle la microplaca con una alfombrilla de sellado coloque la placa en un mezclador de placas ajustado a 450 rpm e incube durante 30 5 minutos a 18 28C vea las precauciones t cnicas 6 Retire y deseche la alfombrilla de sellado Vac e los pocillos y l velos tres veces utilizando como m nimo 300 uL de tamp n de lavado por pocilo vea las precauciones t cnicas procedimiento de ELISA p gina 24 25 Vac e los pocillos y sacuda la placa firmemente en papel secante 7 Pipete 100 uL de marcador enzim tico en todos los pocillos 8 Cubra la placa conuna alfombrilla de sellado coloque la placa en un mezclador de placas ajustado a 450 rpm e incube durante 30 5 minutos a 18 280 9 Retire y deseche la alfombrilla de sellado Vac e los pocillos y l velos cinco veces utilizando como m nimo 300 uL de tamp n de lavado por pocillo Vac e los pocillos y sacuda la placa firmemente en papel secante Importante Deje que la soluci n substrato de TMB alcance 18 28 10 Pipete 100 uL de soluci n substrato de TMB en todos los pocillos 11 Cubra la placa con la alfombrilla de sellado coloque la placa en un mezclador de placas ajustado a 450 rpm proteja la placa de la luz directa e incube durante 15 2 minutos a 18 28 12 Pipete 100 uL de soluc
3. Procedura del dosaggio ELISA e Pipette di precisione da 10 uL 100 uL e 1000 uL con puntali monouso e Provette monouso di polistirene o polipropilene per la preparazione delle diluizioni dei campioni e Cilindro da 1000 mL per la diluizione del Tampone di Lavaggio Concentrato e Lavatore per micropiastra o erogatore a spruzzo per il Tampone di Lavaggio vedi Avvertenze Procedurali e Rotatore per micropiastra vedi Avvertenze Procedurali e Carta da blotting e Lettore per micropiastra per la misurazione dell assorbanza a 450 nm Revision date 2014 08 14 17 36 PRECAUZIONI PRECAUZIONI DI SICUREZZA e Le strip i Calibratori e i Controlli di questo kit contengono componenti di origine umana Bench testati e risultati negativi all antigene di superficie HBV e agli anticorpi HCV e HIV1 2 i reagenti devono essere maneggiati come potenzialmente infettivi e secondo le buone pratiche di laboratorio GLP utilizzando le dovute precauzioni e Substrato e soluzione di stop Il substrato di TMB B TMB12 contiene tetrametilbenzidina e perossido di idrogeno H20 La soluzione di stop B STS12 contiene acido solforico 0 25 M Ciascuno di questi reagenti irritante per gli occhi la pelle e le mucose Evitare il contatto con occhi pelle e vestiario Se viene a contatto con gli occhi la pelle e gli indumenti lavarsi immediatamente con molta acqua Se viene a contatto con gli occhi la pelle e gli indumenti lavarsi immediata
4. Table 5 REAGENTIEN GELIEFERT AUF BESTELLUNG Extraktionsbesteck f r Stuhlproben Packungen zu 50 und 200 CALEX Cap R hrchen gef llt mit B CALEX C50 Device Extraktionspuffer B CALEX C200 5 mL gebrauchsfertig Smart Prep 50 R hrchen Spatel und B den B CAL RD 50 R hrchen bestehend aus ScheBo R hrchen Konus und Quick Prep Dosierspitze Beet 1 3 mL gebrauchsfertig Table 6 ERFORDERLICHE Hilfsmittel enthalten Nicht im Lieferumfang Extraktion e 10 uL Einweg Impfschlingen 15 mL Polypropylen Einwegr hrchen mit Schraubver schluss f r die Standardextraktion e Laminar Flow Arbeitsplatz e Multi Tube Vortex Mixer e Pr zisionswaage 10 150 mg e Mikrozentrifuge 23000 x g e Zentrifuge 2500 x g ELISA e Pr zisionspipetten mit Einwegspitzen f r 10 100 und 1000 uL e Polystyrol oder Polypropylen Einwegr hrchen zur Durchf hrung von Probenverd nnungen e 1000 mL Messkolben zur Verd nnung des Waschpuffer Konzentrats Mikrotiterplattenwaschautomat oder Spritzflasche f r Waschpuffer siehe technische Vorsichtsmassnahmen Seite 7 8 Revision date 2014 08 14 7 36 VORSICHTSMASSAHMEN SICHERHEITSMASSNAHMEN e Die Mikrotiterplatte Kalibratoren und Kontrollen enthalten Bestandteile humanen Ursprungs Obwohl sie negativ in Tests fur HBV Oberfl chenantigen HCV und HIV1 2 Antik rper waren sollten gem ss Good Laboratory Practice als potentiell in
5. de tampon de lavage 10x Tampone di lavaggio concentrato 10x Tamp n de lavado concentrado x10 Concentrado de tamp o de lavagem Order Code Incubation Buffer Bestellnummer Inkubations Puffer Code Tampon d incubation Codice BUF INC Tampone di incubazione C digo Tamp n de incubaci n C digo Tamp o de incubac o Batch code Calibrator A E Chargenbezeichnung Kalibrator A E Code du lot Calibrateur A E E Codice del lotto C digo de lote C digo lote Calibratore A E Calibrador A E Calibrador A E In Vitro Diagnostic Medical Device In Vitro Diagnostikum Control Low Kontrolle tief Dispositif m dical de diagnostic in vitro Contr le bas IVD Dispositivo medico diagnostico in vitro CONTROL Controllo basso Producto sanitario para diagn stico in vitro Control bajo Producto s nitario para diagn stico in vitro Controle baixo Contains sufficient for n tests Control High Ausreichend f r n Ans tze Kontrolle hoch Contenu suffisant pour n tests CONTROL Contr le lev Controllo alto Contenuto sufficiente per saggi Contenudo sufficiente para n ensayos Contenudo sufficiente para n tests Control alto Controle alto Consult Instructions for Use Gebrauchsanweisung beachten Consulter le mode d emploi Consultare le istruzioni per l uso Consulte las instrucciones de uso Leia cuidadosamente as instruc es a Enzyme Label Enzym Marker Margueur enz
6. massima per 30 min 6 Trasferire il composto omogeneizzato in una provetta eppendorf da 2 mL e centrifugare in una microcentrifuga per 5 min a 3 000 x g 7 Trasferire il surnatante in una nuova provetta con etichetta e proseguire la procedura ELISA Procedure di estrazione con utilizzo di sistemi di estrazione delle feci La procedura di estrazione descritta e illustrata nelle istruzioni per l uso fornite assieme ai rispettivi sistemi di estrazione 1 Dispositivo CALEX codice B CALEX C50 B CALEX C200 tubi di estrazione sono gi riempiti con tampone di estrazione Revision date 2014 08 14 18 36 PROCEDURA DEL TEST Importante Lasciare equilibrare i reagenti a 18 28C prima dell uso Diluire solamente gli estratti di feci Calibratori e controlli sono pronti all uso 1 DILUIZIONE DEL CAMPIONE DI FECI RANGE DI MISURAZIONE 10 600 ug g 1 1 Procedura con pesatura manuale con Smart Prep o ScheBo Quick Prep Diluire gli estratti 1 50 con il tampone di incubazione es 20 uL di estratto e 980 uL di tampone di incubazione e mescolare bene Lasciare equilibrare i campioni per almeno 5 min a 18 28 prima di procedere al punto 4c 1 2 Dispositivo CALEX Cap Diluire gli estratti 1 5 con il tampone di incubazione es 100 uL di estratto e 400 uL di tampone di incubazione e mescolare bene Lasciare equilibrare i campioni per almeno 5 min a 18 280 prima di procedere al punto 4c RANGE DI MISUR
7. 10 ug g Dieci diversi campioni di feci con valori tra 5 2 e 1254 ug g di Calprotectina sono stati misurati 20 volte in duplicato La 96 del CV ed i valori medi sono stati calcolati per ciascun campione Il LoQ stato osservato al 15 del CV Il profilo di precisione osservato Figure 2 permette dosaggi accurati entro la gamma standard da 10 a 600 ug g Linearit di Diluizione 103 96 Sette campioni di feci con valori elevati di Calprotectina sono stati prelevati secondo la procedura del saggio L estratto stato diluito con Tampone d Incubazione e successivamente dosato secondo il protocollo valori attesi sono stati calcolati dai valori osservati con la prima diluizione valori sono presentati in Table 22 Rilevazione da inoculo 100 Due campioni di estratti fecali sono inoculati con diverse quantit di siero umano contenente Calprotectina I campioni sono stati misurati prima e dopo l inoculo secondo la procedura I valori sono presentati in Table 23 B HLMANN fCAL ELISA Cross reattivita lt 0 1 Tamponi d Incubazione inoculati con diverse quantit di MRP8 e MRP14 ricombinante sono stati misurati secondo la procedura valori sono presentati in Table 28 RANGE DI MISURAZIONE 30 1800 ug g Precisione Intra Saggio 4 0 La precisione intra saggio media stata calcolata a partire dai risultati di 20 duplicati da 3 campioni di estratti fecali dosati in una singola seduta secondo la procedura del sagg
8. 14 36 CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE Les caract ristiques de performances de l essai ont t valid es sur des chantillons test s en double GAMME DE DOSAGE 10 600 ug g Pr cision intra essai 4 796 Elle est obtenue partir des r sultats de 20 duplicatas de valeurs de 3 extraits de selles au cours d un m me essai Les donn es sont r pertori es dans la Table 20 B HLMANN fCAL ELISA Inter essai lt 15 96 La pr cision moyenne entre dosages ELISA est calcul e sur 5 extraits de selles Les pr l vements sont test s selon la proc dure de dosage en 10 analyses distinctes par trois techniciens en utilisant deux lots de kit dans deux laboratoires diff rents Les valeurs sont r pertori es dans la Table 21 Limite de blanc LoB 10 ug g 20 duplicatas de tampon d incubation furent analys s au cours d un m me essai La valeur moyenne et la d viation standard furent calcul es pour chaque absorbance obtenue La plus petite concentration detectable de Calprotectine clairement inf rieure au Calibrateur A 10 ug g fut d finie en ajoutant 2 d viations standard l absorbance moyenne et en reportant la valeur obtenue sur la courbe d talonnage g n r e lors d un nouvel essai Limite de quantification LoQ 10 ug g 10 chantillons diff rents de selles pr sentant des concentrations de Calprotectine comprises entre 5 2 et 1254 ug g furent analys s 20 fois en double en intra essai Le 96 de CV e
9. Abdeckfolie entsorgen die Kavit ten entleeren und f nf mal mit jeweils mindestens 300 uL Waschpuffer waschen Platte durch Ausschlagen auf saugf higem Papier sorgf ltig trocknen Wichtig TMB Substratl sung vor dem Gebrauch auf 18 28 erw rmen 10 100 uL TMB Substrat zu jeder Kavit t zugeben 11 Mikrotiterplatte zudecken und 15 2 Min bei 18 28C auf einem Mikrotiterplattensch ttler bei 450 rpm inkubieren Platte vor direktem Licht sch tzen 12 100 uL Stopp L sung zu jeder Mikrok vette zugeben und vorhandene Luftbl schen mit Pipettenspitzen entfernen Innerhalb der n chsten 30 Min bei 450 nm messen 13 Optische Dichte in einem Photometer bei 450 nm messen Mikrotiter Platten 2014 08 14 9 36 BERECHNUNG DER ERGEBNISSE Messen Sie die Extinktion bei 450 nm in einem Mikrotiterplattenphotometer f r Kalibratoren Kontrollen und Proben unter Verwendung eines 4PL Auswertemodus und Blankabzug MESSBEREICH 10 600 ug g Wenn Sie die Lower Range ELISA Variante verwenden m ssen die folgenden Kalibratorkonzentrationen in das ELISA Protokoll eingegeben werden 10 30 100 300 und 600 ug Calprotectin Zus tzliche Verdunnungsfaktoren m ssen mit den Ergebnissen multipliziert werden um die Endergebnisse zu erhalten In Table 19 und Figure 1 sind Beispiele f r Ergebnisse und Standardkurve angegeben Diese Ergebnisse und die Standardkurve sind nur als Beispiel gedacht Sie m ssen f r jeden Ansatz e
10. Important Allow the reagents to equilibrate to 18 28 prior to use Only dilute stool extracts Standards and controls are ready to use 1 SAMPLE DILUTION OPTIONS WORKING RANGE 10 600 ug g 1 1 Manual weighing procedure Smart Prep or ScheBo Quick Prep Dilute the stool extracts 1 50 with Incubation Buffer e g 20 uL extract and 980 uL incubation buffer and mix well Let the samples equilibrate for at least 5 minutes at 18 28 prior to proceeding to step 4c 1 2 CALEX Cap Device Dilute the stool extracts 1 5 with Incubation Buffer e g 100 uL extract and 400 uL incubation buffer and mix well Let the samples equilibrate for at least 5 minutes at 18 280 prior to proceeding to step 4c WORKING RANGE 30 1800 pg g The working range can be extended by a factor of 3 if you dilute the samples 1 7500 instead of 1 2500 This procedure is recommended if high Calprotectin concentrations are to be expected Precision and linearity of the assay allow for this extension of the measuring range 1 Manual weighing procedure Smart Prep or ScheBo Quick Prep Dilute the stool extracts 1 150 with Incubation Buffer e g 20 uL extract and 2980 uL incubation buffer and mix well Let the samples equilibrate for at least 5 minutes at 18 28 C prior to proceeding to step 4c 1 2 CALEX Cap Device Dilute the stool extracts 1 15 with Incubation Buffer e g 50 uL extract and 700 uL incubation buffer and mi
11. 1 4800 111 116 96 Mean 92 6 1 100 758 100 1 120 702 632 111 1 150 552 505 109 S 2 1 200 406 379 107 1 400 210 190 111 1 800 108 95 114 Mean 111 S3 Mean 105 S4 Mean 101 S5 Mean 99 32 36 B HLMANN Calprotectin ELISA Table 28 Cross Reactivity MRP8 MRP14 Spiked with ng mL ng mL 100 ug mL 26 0 38 7 10 ug mL 8 0 3 4 1 ug mL lt 4 0 lt 4 0 100 ng mL lt 4 0 lt 4 0 10 ng mL lt 4 0 lt 4 0 Table 29 ref 12 Clinical Study Calprotectin EK CAL Lactoferrin n 401 391 cut off 50 ug g 3 ug mL Sensitivity 84 4 74 2 Specificity 94 5 91 0 PPV 87 8 79 3 NPV 92 8 88 4 LR 15 4 0 17 LR 8 25 0 28 Revision date 2014 08 14 33 36 Data have been established with the lower range ELISA procedure Table description cf Results Performance Characteristics and Interpretation of Results Tabellenbeschreibung siehe Resultate Leistungsmerkmale und Interpretation der Resultate Explications aux tableaux voir R sultats Caracteristiques de Performance et Interpr tation des R sultats Descrizione tavola cf Risultati Caratteristiche di Prestazione e interpretazione dei resultati Explicaciones a las Tablas ver Resultados Caracteristicas de Efficiencia y Interpetaciones de los resultados Explicac o a Tablas ver Resultados Caracter stica
12. 1800 ug g de calprotectina Fatores adicionais de diluic o devem ser multiplicados com os resultados para obter os resultados finais Consulte a Table 24 e a Figure 3 para obter dados t picos resultados e curva padr o Esses resultados e curva padr o s o dados apenas para fins de demonstrac o Uma curva padr o deve ser gerada para cada conjunto de amostras a serem testadas RESULTADOS amp CALCULOS FAIXA DE USO 10 600 ug g Leia a absorb ncia de 450nm no leitor da microplaca para cada calibrador e controle da amostra usando um 4 PL que Revision date 2014 08 14 28 36 CARACTER STICA DE DESEMPENHO FAIXA DE USO 10 600 ug g Caracter sticas de desempenho do estabelecidas em duplicatas teste foram Precis o intra teste 4 7 A precis o intra teste foi calculada a partir de 20 pares de valores de 3 amostras fecais extra das e testadas numa nica batelada de acordo com o procedimento de teste Os valores encontram se na Table 20 Precis o inter testes lt 15 A precis o inter testes do ELISA foi calculada a partir de 5 amostras fecais extra das As al quotas foram testadas de acordo com o procedimento de teste em 10 bateladas e por tr s t cnicos diferentes usando 2 lotes de kit e em dois laborat rios diferentes Os valores encontram se na Table 21 Limite de detec o LoB lt 10 ug g Vinte duplicatas do tamp o de incuba o foram testadas em uma nica batelada Os desvios m dio
13. 2 bottles 3 bottles with preservatives x125mL x 125 mL Ready touse Calibrators Ato E e T 5 vials 5 vials B CAL Calprotectin ina x i mi Tul CASET Ready to use buffer matrix with preservatives Control Low High 2 vials 2 vials B CAL human serum with x 1 mL x1mL CONSET Ready to use preservatives Enzyme Label Anti Calprotectin 1 vial 2 vials 7 Ab conjugated to x12mL x12mL PRA A touse HRP TMB Substrate MAT 1 vial 2 vials TMB in citrate x12 mL x12 mL B TMB12 Ready to use buffer Stop Solution 1 vial 2 vials Ready to use M sulfuric xi2mL xi2mL 931512 Corrosive agent Table 1 The actual Calprotectin concentration of the standards A to E are 4 12 40 120 and 240 ng mL respectively For extraction and subsequent sample dilution a dilution of 1 2500 was taken into account for the assignment of calibrator A to E The following concentrations have to be used for the lower range ELISA procedure 10 30 100 300 and 600 ug g Calprotectin f you choose the extended range ELISA procedure the following calibrator concentrations have to be used in the respective ELISA protocol 30 90 300 900 and 1800 ug g Calprotectin 9 The controls contain lot specific amounts of native human Calprotectin Refer to the additional QC data sheet for actual concentrations Revision date 2014 08 14 MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED Extraction Procedure e 10 uL disposabl
14. 600 ug g suivez la proc dure ELISA standard 10 600 ug g Si la concentration des chantillons tend d passer 600 ug g suivez la proc dure ELISA tendue 30 1800 ug g a STANDARDISATION La trousse BUHLMANN fCAL ELISA est calibr e avec la MRP8 14 purifi e de granulocytes humains EXTRACTION Proc dure d extraction standard 1 Marquer et peser les tubes en polypropyl ne avec l anse d inoculation jetable 2 Pr lever 50 100 mg d chantillon de selles d congel es au moyen de l anse d inoculation et transf rer l anse dans le tube pr pes 3 D terminer la quantit nette d chantillon casser l anse et laisser sa partie inf rieure dans le tube 4 Ajouter le tampon d extraction selon la formule x mg de selles x 49 z y ul de tampon d extraction par ex 50 mg de selles 2450 tamp n d extraction dans le tube et le fermer 5 Homog n iser l chantillon l aide d un agitateur multi tubes pendant 30 minutes vitesse maximale Si on utilise le tube d extraction de selles Roche l extraction peut tre r duite 1 minute l aide d un vortex Revision date 2014 08 14 13 36 PROC DURE ELISA Important Les r actifs doivent tre quilibr s temp rature ambiante 18 28 C avant utilisation S euls les chantillons de selles doivent tre dilu es Calibrateurs et contr les sont pr ts l emploi 1 METHODES DE DILUTION DE L ECHANTILLON DE SELLES GAMME DE DOSAGE
15. After contact with eyes or skin wash immediately with plenty of water e Unused solution should be disposed of according to local State and Federal regulations TECHNICAL PRECAUTIONS Kit components e Residues in the microtiter plate wells result from the production process They are removed in the washing step Assay procedure step 3 and do not affect the results e Read carefully the instructions prior to carrying out the test Test performance will be adversely affected if reagents are incorrectly diluted modified or stored under conditions other than those as detailed in this instruction for use e Components must not be used after the expiry date printed on the labels e Do not mix different lots of reagents e Every effort should be made to ensure that no cross contamination occurs between reagents samples or between wells e Let the reagents adjust to reach room temperature Mix well vortex the reagents before use e Microwells cannot be re used Extraction eTo receive quantitative results it is important to homogenize the stool sample completely with the extraction buffer Avoid contamination at the top of the tube insoluble undigested components can still be in the tube after extraction ELISA Procedure e In the ELISA procedure the washing step is essential to guarantee reproducible results A minimal incubation time of the Wash Buffer in the wells of at least 20 seconds must be ensured each time e
16. Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer 1 50 verd nnen z B 20 ul Extrakt 980 Inkubationspuffer Nach der Verd nnung gut mischen und vor Gebrauch in Schritt 4c die Proben f r mindestens 5 Minuten bei 18 280 stehen lassen 1 2 CALEX Cap Device Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer 1 5 verd nnen z B 100 uL Extrakt 400 uL Inkubationspuffer Nach der Verd nnung gut mischen und die Proben vor Gebrauch in Schritt 4c mindestens 5 Minuten bei 18 28 C stehen lassen MESSBEREICH 30 1800 ug g The working range can be extended by a factor of 3 if you dilute the samples 1 7500 instead of 1 2500 This procedure is recommended if high Calprotectin concentrations are to be expected Precision and linearity of the assay allow for this extension of the measuring range Kalibratoren und 1 1 Manuelle Einwaage Smart Prep oder ScheBo Quick Prep Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer 1 150 verd nnen z B 20 Extrakt 2980 uL Inkubations puffer Nach der Verd nnung gut mischen und die Proben vor Gebrauch in Schritt 4c f r mindestens 5 Minuten bei 18 280 stehen lassen 1 2 CALEX Cap Device Die Stuhlextrakte mit Inkubationspuffer 1 15 z B 50 uL Extrakt 700 uL Inkubationspuffer and mix well Nach der Verd nnung gut mischen und die Proben vor Gebrauch in Schritt 4c f r mindestens 5 Minuten bei 18 280 stehen lassen 2 Eine Mikrotiterplatte mit ausreichenden Streifen f r die Bestimmung von Kalibratoren K
17. EK CAL EK CAL2 C digo ne Gtde 5 z 3 tubos 6 tubos Pronto para Tamp o de extra o da 125 mL da 125 mL B CAL EX aen Microplaca Prerecoberta com anti ak a 8 B CAL MP SONS para Calprotectina mAb poc po Vedador de placa 3 pe as 6 pe as Concentrado de Diluir com tamp o de lavagem 1 tubo 2 tubos SARDI 900 mL de 10x com da 100 mL da 100 mL B CAL WB HO preservativos deionizada Tamp o de A 2 tubos 3 tubos eh Pronto para incuba o Panes 198 125 mL da 125 mL BCAMB uso Calibradores A E Calprotectina em uma 5frascos 5frascos B CAL Pronto para matriz de tamp o da 1 mL datmL CASET uso conservantes a i ee 2frascos 2frascos B CAL Pronto para conservantes da1mL daimL CONSET Marcador enzimatico f 1 frascos 2 frascos ON Pronto para een da 12mL dai2mL BCALEL uso Substrato TMB E 1 frascos 2 frascos T Pronto para au tamp ode ga 12mL dai2mL P 912 so Solug o stop 1frascos 2 frascos PI en dai2mL dai2mL B STS12 agente corrosivo Table16 D A concentra o real de calprotectina nos padr es A a E de 4 12 40 120 e 240 ng mL respectivamente Para e subsequente diluig o da amostra uma diluig o de 1 2500 foi realizada para adesignag o dos calibradores de A a E As concentrag es seguintes t m de ser utilizadas para o procedimento de baixa faixa de ELISA 10 30 100 300 e 600 ug g de Calprotectina Se voc escolher a faixa estendida do pro
18. Hotte flux laminaire Agitateur Multi tubes ou vortex Balance de pr cision 10 150 mg Micro centrifugeuse 23000 x g Centrifugeuse gt 500 x g Proc dure de I ELISA e Pipettes de pr cision r glables avec pointes jetables pour 10 100 et 1000 uL e Tubes jetables en polypropyl ne ou polystyr ne pour la pr paration des dilutions d chantillons e Eprouvette gradu e de 1000 mL pour la pr paration du tampon de lavage Laveur automatigue de microplagues ou une pissette pour le tampon de lavage voir PRECAUTIONS TECHNIQUES Revision date 2014 08 14 12 36 PRECAUTIONS PR CAUTIONS DE S CURIT Mat riel d origine humaine Les barrettes de la microplaque les calibrateurs et les contr les de cette trousse contiennent des composants d origine humaine Bien que les tests de d tection de l antig ne de surface du VHB et des anticorps des virus VHC et VIH1 2 se soient r v l s n gatifs il convient de consid rer les r actifs comme capables de transmettre des maladies infectieuses et de les manipuler conform ment aux bonnes pratiques de laboratoire GLP BPL en prenant les pr cautions appropri es e Substrat et Solution Stop Le Substrat B TMB12 contient du t tram thylbenzidine et du peroxyde d hydrog ne H203 La Solution stop B STS12 contient de l acide sulfurique Ces substances irritent les yeux la peau ainsi que les muqueuses Eviter par cons quent tout contact avec les yeux la peau
19. avant d tre dos s selon la proc dure de dosage Les valeurs attendues sont calcul es partir de la valeur observ e d termin e la premi re dilution Les r sultats sont r pertori s dans la Table 27 CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE Les caract ristiques de performances de l essai ont t valid es sur des chantillons test s en double GAMME DE DOSAGE 30 1800 ug g Pr cision intra essai 4 0 La pr cision intra dosage moyenne est calcul e partir des r sultats de 20 duplicatas de valeur provenant de trois extraits de selles dos s au cours d une analyse unique selon la proc dure de dosage Les valeurs sont r pertori es dans la Table 25 Pr cision inter essai 15 96 La pr cision moyenne entre dosages ELISA est calcul e sur 5 extraits de selles Les pr l vements sont test s selon la proc dure de dosage en 10 analyses distinctes par trois techniciens en utilisant deux lots de kit dans deux laboratoires diff rents Les valeurs sont r pertori es dans la Table 26 Limite de quantification LoQ lt 30 ug g 18 chantillons de selles de concentrations en Calprotectine comprises entre 10 8 et 2080 ug g sont analys s 20 fois en double au cours d un dosage unique Le CV en 96 et la moyenne sont calcul s pour chaque chantillon La LoQ est calcul e comme tant la concentration de Calprotectine un CV de 15 Le profil de pr cision obtenu d montre que les mesures sont pr cises dans tout
20. conservarla refrigerada a 2 8 hasta 6 d as Los extractos son estables a 2 8 por lo menos 7 dias ya lt 20 por lo menos 24 meses Importante La muestra debe tomarse sin aditivos a ESTANDARIZACIONE EI kit BUHLMANN fCAL ELISA se calibra con MRP8 14 purificada de granulocitos humanos MATERIALES NECESARIOS NO INCLUIDOS Procedimiento de extracci n e Asas de inoculaci n de 10 uL desechables e Tubos de polipropileno de 15 mL con tapones de rosca necesarios para el procedimiento de extracci n est ndar o los dispositivos de extracci n v ase anteriormente e Campana de flujo laminar Mezclador vortex multitubo Revision date 2014 08 14 22 36 PROCEDIMIENTO DE EXTRACCI N Procedimiento de extracci n est ndar 1 Etiquetar y pesar tarar el tubo de polipropileno vac o junto con el asa de inoculaci n 2 Extraer de 50 a 100 mg de la muestra de heces descongelada mediante el asa de inoculaci n y colocarlos en el tubo pesado previamente 3 Calcular la cantidad neta de muestra romper el asa de inoculaci n y dejar la parte inferior del asa en el tubo 4 Afiadir tamp n de extracci n seg n la f rmula x mg de heces x 49 y ul tampon de extracci n i e 50 mg de heces 2450 ul tampon de extracci n al tubo y cerrar el tubo 5 Homogenizar la muestra en un mezclador vortex multitubo agit ndolo vigorosamente velocidad m s alta durante 30 minutos 6 Transferir el homogenizado a un tubo Eppendorf
21. de extracci n B CALEX C200 Cantidad 5 mL listos para uso E 3botelas 6 botellas Listo para Smart Prep 50 tubos esp tulas y fondos B CAL RD Tamp n de extraccion de 125 mL de 125 mL B CAL EX sar Microplaca 12x8 2x12x8 B CAL Listo para vos 50 tubos de extracci n cono amp recubierta con AcMo ocillos ocillos MP is r ScheBo Quick punta B CAL S050 anti Calprotectina H H Prep 1 3 mL de tamp n de extracci n Sellador de placas 3 unidades 6 unidades listo para usar Tamp n de lavado Diluir con concentrado 10x 1 botella 2 botellas B CAL 900mLde Table 15 concentrado con 100 mL de100mL WB agua conserv desionizada PRECAUCIONES Tamp n de Es 2 botellas botellas 2 LR Listo para PRECAUCIONES DE SEGURIDAD incubaci n de 125 mL 125 B CAL B usar con conservantes 37 Calibradores A a ET e Las filas de microtitulaci n calibradores y controles de este Calprotectina en una 5 viales 5 viales B CAL Listo para kit contienen componentes de origen humano Aunque ha matriz tamp n con detmL detmL CASET usar dado negativo para el ant geno de superficie de HBV y Contro b alto anticuerpos HCV y VIH1 2 los reactivos deben manipularse ontrol bajo alio TO Matriz de suero 5 vidlos 2 viales B CAL Listo para como si fueran susceptibles de transmitir infecciones y deben humano con deimL deimL CONSET usar manejarse de acuerdo con las Buenas Pr cticas de conservantes Laboratorio toman
22. de tamp o de incubac o e misture bem Deixe as amostras estabilizarem durante pelo menos 5 minutos a 18 28 antes de se prosseguir para a etapa 4c Faixa de Trabalho 30 1800 ug g A faixa de trabalho pode ser estendida em 3 vezes se voc diluir as amostras de 1 7500 em vez de 1 2500 Recomenda se este procedimento se altas concentra es de calprotectina forem esperadas Precis o e linearidade do ensaio permitem esta extens o para mensurar a faixa 1 1 Procedura pesagem manual com Smart Prep ou ScheBo Quick Prep Diluir os sobrenadantes 1 150 com tamp o de incuba o por exemplo 20 uL do extrato e 2980 uL de tamp o de incuba o e misture bem Deixe as amostras estabilizarem durante pelo menos 5 minutos a 18 28 antes de se prosseguir para a etapa 4c 1 2 Dispositivo CALEX Cap Diluir os sobrenadantes 1 15 com tamp o de incuba o por exemplo 50 uL do extrato e 700 uL de tamp o de incuba o e B HLMANN fCAL ELISA misture bem Deixe as amostras estabilizarem durante pelo menos 5 minutos a 18 28 antes de se prosseguir para a etapa 4c 2 Prepare uma placa com numero suficiente de fileiras para testar o n mero necess rio de calibradores controles e amostras dilu das Remova o excesso de fileiras do suporte e sele as numa bolsa metalizada junto com pacotes desumidificadores sem demora Armazene no refrigerador 3 Lave duas vezes os po os recobertos usando pelo menos 300 de tamp
23. et jeter le film adh sif Vider puis laver chaque puits trois fois avec au moins 300 uL de tampon de lavage se r f rer aux PRECAUTIONS TECHNIQUES proc dure de l ELISA Vider les puits et les s cher en tapant nergiquement la microplaque sur du papier absorbant 7 Ajouter 100 uL de marqueur enzymatique dans tous les puits 8 Recouvrir la microplaque d un nouveau film adh sif et incuber 18 28 durant 30 5 min sur un agitateu r de microplaques r gl 450 rpm Revision date 2014 08 14 9 Retirer et jeter le film adh sif Vider puis laver les puits cing fois avec au moins 300 uL de tampon de lavage Vider les puits et les s cher en tapant nergiquement la microplaque sur du papier absorbant Important laisser le substrat TMB s quilibrer une temp rature de 18 28 C 10 Ajouter 100 uL de substrat TMB dans chaque puits 11 Recouvrir la microplaque d un nouveau film adh sif et incuber sur l agitateur 450 rpm pendant 15 2 min 18 28C Prot ger la microplaque de la lumi re directe 12 Ajouter 100 uL de solution stop acide dans chaque puits Eliminer les bulles d air l aide d une pointe de pipette puis passer l tape 13 au cours des 30 min suivantes 13 Lire l absorbance 450 nm l aide d un lecteur de microplaques CALCUL DES RESULTATS Lire l absorbance 450nm l aide d un lecteur de plaque pour chaque calibrateur contr le et chantillon Utiliser un mod le de r gres
24. et les v tements En cas de contact accidentel avec les yeux ou la peau rincer imp rativement grande eau e Pour en savoir plus sur les pr cautions pour la manipulation et l limination des d chets nous vous recommandons fortement de consulter l organisme r glementaire comp tent pour votre pays PR CAUTIONS TECHNIQUES R actifs Les puits de la microplaque peuvent tre recouverts de r sidus form s lors du processus de production Ils sont limin s par le lavage voir l tape 3 de la proc dure et n ont aucune influence sur les r sultats e Lire attentivement les instructions avant de r aliser le test Le test ne donnera pas les r sultats escompt s en cas de dilution incorrecte ou de modification des r actifs ou de stockage dans des conditions autres que celles d taill es dans le pr sent mode d emploi Les composants ne doivent pas tre utilis s au del de la date d expiration imprim e sur les tiquettes Ne pas m langer des r actifs de lots diff rents e Il convient de prendre toutes les pr cautions requises pour emp cher toute contamination crois e entre r actifs entre chantillons ou entre puits e Laisser les r actifs s quilibrer temp rature ambiante Reconstituer les r actifs lyophilis s comme indiqu Bien m langer au vortex les r actifs avant utilisation e Les puits de la microplaque sont usage unique Extraction e Dans le but d obtenir des r sultats quantitati
25. le r sultat final e L enzyme HRP utilis e comme marqueur est inactiv e par l oxyg ne et est hautement sensible l azoture de sodium au thim rosal l acide hypochloreux ainsi qu aux hydrocarbures chlor s couramment rencontr s dans l eau N utiliser par cons quent que de l eau d ionis e ou distill e de bonne qualit e Comme les conditions varient d essai essai une courbe d talonnage doit tre tablie pour chaque nouveau dosage L alignement vertical est recommand Si la concentration initiale d un chantillon pr sente un signal plus lev que celui du calibrateur le plus haut l chantillon doit tre dilu l aide du tampon d incubation et dos nouveau selon la proc dure standard Le facteur de dilution doit tre pris en compte pour le calcul de la concentration effective Les cycles de cong lation d cong lation r p t s des chantillons et des r actifs doivent tre vit s 6 Transf rer l extrait obtenu dans un tube Eppendorf de 2 mL puis centrifuger dans une micro centrifugeuse durant 5 minutes 3000 x g 7 R cup rer le surnageant dans un nouveau tube pr alablement identifi et poursuivre avec la proc dure ELISA Proc dure d extraction l aide des tubes d extraction de selles L extraction est d crite et illustr e dans le manuel d utilisation fourni avec les tubes d extraction respectifs 1 Tube d extraction CALEX Cap r f B CALEX C50 B CALEX C200 l
26. nella tecnica verificare quanto segue i dispensazione controllo della temperatura e timer ii settaggio del lettore ELISA iii date di scadenza dei reagenti iv condizioni di conservazione e di incubazione v Soluzione di Substrato TMB deve essere incolore vi purezza dell acqua 20 36 LIMITI e reagenti forniti con questo kit sono ottimizzati per dosare Calprotectina umana in campioni fecali estratti e risultati del test vanno interpretati insieme alle informazioni derivanti dagli studi epidemiologici dalla valutazione clinica del paziente e da altre procedure diagnostiche B HLMANN fCAL ELISA ESPANOL USO PREVISTO El kit BUHLMANN fCAL ELISA est pensado para la extracci n y la determinaci n cuantitativa de la Calprotectina humana MRP8 14 S100A8 S100A9 en muestras de deposiciones ref 1 3 PRINCIPIOS B SICOS DEL ENSAYO Despu s de un procedimiento corto de extracci n con un volumen de heces y 49 vol menes de tamp n de extracci n la prueba permite la medici n selectiva del ant geno Calprotectina mediante un ELISA intercalado Un anticuerpo de captura monoclonal AcMo altamente espec fico para los complejos heterodim ricos y polim ricos de Calprotectina ref 4 5 recubre la Microplaca Los Calibradores controles y los extractos de los pacientes se incuban a temperatura ambiente por 30 minutos Despu s de un paso de lavado un segundo anticuerpo Ac de detecci n conjugado con Perox
27. o Marcador enzim tico Substrato TMB Soluc o stop Table 18 MATERIAIS NECESSARIOS MAS NAO INCLU DOS Procedimento de extrac o e Alcas de inoculac o descart veis de 10 uL e Tubos de polipropileno com tampas rosgueaveis de 15 mL necess rios para o procedimento padr o de extrac o veja acima e Estac o de trabalho de fluxo laminar Misturador de v rtice multitubos e Balanca de precis o 10 150 mg Microcentr fuga 23000 g e Centrifuga 2500 g Procedimento ELISA e Pipetas de precis o de 10 100 e 1000 uL com pontas descart veis e Tubos descart veis de poliestireno ou polipropileno para preparac o de diluig o de amostras e Cilindro de 1000 mL para diluir tamp o de lavagem e Lavadora de placa e microtituladora veja precauc es t cnicas ou garrafa de apertar para tamp o de lavagem e Rotador de microplaca veja precauc es t cnicas e Papel mata borr o e Leitor de placa e microplaca para medic o de absorv ncia a 450 nm PRECAUC ES MEDIDAS DE SEGURANCA e A microplaca os calibradores e os controles deste teste cont m componentes de origem humana Apesar de testados e apresentarem resultado negativo para ant geno de superficie HBV e anticorpos HCV e HIV1 2 Revision date 2014 08 14 26 36 os reagentes devem ser manipulados como se fossem capazes de transmitir infec es e devem ser manipulados de acordo com as boas pr ticas do laborat rio
28. rpm lt 10Hz Uma frequ ncia de rotag o mais elevada pode causar uma linearidade de dilui o mais insatisfat ria nos valores entre 300 900 e 600 1800 ug g A rotac o orbital deve ser usada em vez da agitac o reciproca e Uma nova curva padr o deve ser gerada todas s vezes em que o teste for realizado O alinhamento vertical recomendado e Se a concentrac o inicial de uma amostra desconhecida apresentar um valor mais alto que o calibrador a amostra deve ser dilu da com o tamp o de incubac o e testada novamente de acordo com o procedimento de teste O fator de diluig o resultante deve ser levado em conta no c lculo dos resultados COLHEITA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS S o necess rios 50 a 100 mg de amostra nativa de fezes para o procedimento de extrac o Colete amostras fecais em tubos lisos Armazene as amostras refrigeradas a 2 8 C por at 6 dias Os extratos permanecem est veis por at 2 7 dias se refrigerados entre 2 80 e por at gt 24 meses se mantidos a 20 Importante A amostra deve ser coletada sem a adi o de qualquer produto qu mico ou biol gico no dispositivo de coleta Importante Depois da extra o centrifugue os tubos por 5 minutos a 500 x g e continue com o procedimento ELISA 2 Dispositivo de extra o fecal da Roche C digo 10745804 322 ou o BUHLMANN Smart Prep C digo B CAL RD 3 ScheBo Quick Prep C digo B CAL SO50 Os tubos de extrac o s o cheios previ
29. sua utiliza o e Micropo os n o podem ser utilizados novamente Extra o e Para receber resultados quantitativos importante homogeneizar toda a amostra de fezes pesada no tamp o de extra o Evitar a contamina o no topo do tubo componentes insol veis n o digeridos podem estar ainda no tubo depois da extra o e Uma etapa curta de 5 minutos de centrifuga o durante a extra o pode dar como resultado uma solu o turva A turva o pode ser evitada com uma centrifuga o mais demorada mas n o haver influ ncia na determina o quantitativa da t cnica de ELISA Procedimento ELISA e No procedimento ELISA a etapa de lavagem essencial para garantir a reprodu o dos resultados Um tempo m nimo de incuba o do tamp o de lavagem nos po os de pelo menos 20 segundos deve ser garantido a cada medi o O n mero de ciclos de lavagem obrigat rio para garantir resultados reprodut veis e Na utiliza o do lavador autom tico BUHLMANN recomenda enfaticamente que se use o Modo de placa isto que cada etapa do processo dispensa o aspira o seja realizada em todas as strips sequencialmente antes de passar para a pr xima etapa de processo Desta forma o tempo m nimo de incuba o estar garantido e O n mero indicado de ciclos de lavagens mandat rio para garantir resultados reprodut veis B HLMANN fCAL ELISA e O rotador agitador de placa deve operar a 450
30. 0 ug g Calprotectin Werte zwischen 50 und 200 ug g k nnen durch eine milde Form der organischen Erkrankung wie z B eine durch NSAIDs verursachte Entz ndung eine milde Form der Divertikulitis und durch IBD in einer Remissionsphase verursacht werden Da eine geringe Entz ndungsaktivit t vorhanden ist empfehlen sich eine Wiederholungsmessung und weitere Untersuchungen Erh hte Werte oberhalb von 200 ug g Calprotectin Werte gt 200 ug g deuten auf eine aktive Form einer organischen Erkrankung des gastrointestinalen Traktes hin Geeignete weitere Untersuchungen durch Gastroenterologen und therapeutische Massnahmen werden empfohlen Der f r Erwachsene empfohlene Cut off Wert von 50 ug g kann auch f r Kinder zwischen 4 und 17 Jahren verwendet werden unabh ngig von deren Geschlecht Ref 9 10 36 QUALIT TSKONTROLLE Ein vollst ndiges Verst ndnis dieser Arbeitsanleitung ist f r den erfolgreichen Einsatz des Produktes notwendig Zuverl ssige Resultate werden nur durch die Anwendung von GLP aktuelle GLP Richtlinien und die Einhaltung der Arbeitsanleitung erreicht B HLMANN fCAL ELISA Da es keine kommerziell erh ltlichen Kontrollen fur Calprotectin gibt wird empfohlen einen Pool von positiven Stuhlextrakten als interne Qualit tskontrolle mitzuf hren Alle Kontrollen m ssen im angegebenen Vertrauensbereich liegen Die Vertrauensbereiche der Kontrollen sind Lot spezifisch und sind auf dem Kit beiliegenden QC D
31. 10 600 ug g 1 1 Proc dure de pes e manuelle Smart Prep ou ScheBo Quick Prep diluer les surnageants au 1 50 me avec du tampon d incubation par exemple 20 uL d extrait et 980 uL de tampon d incubation et bien homog n iser Laisser les chantillons s dimenter pendant au moins 5 min temp rature ambiante 18 28 C avant de r aliser l tape 4c 1 2 Dispositif CALEX Cap diluer les surnageants au 1 5 me avec du tampon d incubation par exemple 100 pL d extrait et 400 uL de tampon d incubation et bien homog n iser Laisser les chantillons s dimenter pendant au moins 5 minutes temp rature ambiante 18 28 C avant de r aliser l tape 4c B HLMANN fCAL ELISA GAMME DE DOSAGE 30 1800 ug g La gamme de dosage peut tre tendue d un facteur 3 si les chantillons sont dilu s au 1 7500 me au lieu de 1 2500 me Cette proc dure est recommand e lorsque des valeurs lev es de calprotectine f cale sont attendues La pr cision et la lin arit du test permettent l extension de la gamme de dosage 1 1 Proc dure de pes e manuelle Smart Prep ou ScheBo Quick Prep diluer les surnageants au 1 150 me avec du tampon d incubation par exemple 20 uL d extrait et 2980 uL de tampon d incubation et bien homog n iser Laisser les chantillons s dimenter pendant au moins 5 min temp rature ambiante 18 28 C avant de r aliser l tape 4c 1 2 Dispositif CALEX Cap diluer les surnagean
32. AZIONE 30 1800 ug g Il range di misurazione pu essere esteso di un fattore 3 se si diluiscono i campioni 1 7500 invece di 1 2500 Questa procedura raccomandata qualora 5 prevedano valori elevati di calprotectina La precisione e la linearit del saggio consentono questa estensione del range di misurazione 1 1 Procedura con pesatura manuale con Smart Prep o ScheBo Quick Prep Diluire gli estratti 1 150 con il tampone di incubazione es 20 uL di estratto e 2980 uL di tampone di incubazione e mescolare bene Lasciare equilibrare i campioni per almeno 5 minuti a 18 28 C prima di procedere al punto 4c 1 2 Dispositivo CALEX Cap Diluire gli estratti 1 15 con il tampone di incubazione es 50 uL di estratto e il 700 uL di tampone di incubazione e mescolare bene Lasciare equilibrare i campioni per almeno 5 minuti a 18 28 prima di procedere al punto 4c B HLMANN fCAL ELISA 2 Preparare una piastra con le strip sufficienti per il numero richiesto di calibratori controlli e campioni diluiti Rimuovere le strip in eccesso dal contenitore e risigillarle immediatamente nella busta di alluminio con I essiccante Conservarle refrigerate 3 Lavare i pozzetti coattati due volte usando almeno 300 uL di Tampone di Lavaggio per pozzetto Svuotare i pozzetti scuotendo la piastra energicamente su carta per blotting Importante per i tre passaggi di lavaggio con il tampone di lavaggio deve essere assicurato un tempo di incub
33. B CAL E an eines Se 1 mt 1 Ar CASET Pronto all uso tampone con conservanti Controllo Basso Alto ht 2 provette da 2 provette da B CAL Matrice di siero 1 N 1 a CONSET Pronto all uso umano con conservanti Marcatore Enzimatico Anti 1 provetta 2 provette Calprotectina Ab da 12 mL da 12 mL B CAL EL Pronto all uso coniugato con HRP Subst rato 1 provetta 2 provette TMB in un da 12 mL da 12 mL B TMB12 Pronto all uso tampone citrato Soluzione di Pronto all uso Stop 1 provetta 2 provette B STS12 A gente Acido Solforico 12 mL da 12 mL corrosive 0 25 M Table 10 La concentrazione effettiva degli standards da A ad E rispettivamente di 4 12 40 120 e 240 ng ml di Calprotectina Per l estrazione e la successiva diluizione del campione stata presa in considerazione una diluizione di 1 2500 per l assegnazione dei calibratori da A ad E Le seguenti concentrazioni di Calprotectina devono essere utilizzate per la procedura ELISA a basso range 10 30 100 300 e 600 ug g di Calprotectina B HLMANN fCAL ELISA 2 Se invece si utilizza la procedura ELISA a range esteso si dovranno utilizzare le seguenti concentrazioni 30 90 300 900 e 1800 ug g di Calprotectina 2 controlli contengono quantit lotto specifiche di Calprotectina umana Per le concentrazioni effettive far riferimento al foglio aggiuntivo QC CONSERVAZIONE E DURATA Reagenti sigillati Conservare a 2 8 No
34. CalB 90 0 138 CalB 90 0 140 Cal B Avg 90 0 139 1 0 Cal C 300 0 464 Cal C 300 0 452 Cal C Avg 300 0 458 1 9 Cal D 900 1 207 Cal D 900 1 192 Cal D Avg 900 1 200 0 8 Cal E 1800 1 627 Cal E 1800 1 630 Cal E Avg 1800 1 629 0 1 Ctrl Low 0 147 105 Ctrl Low 0 162 115 Ctrl Low Avg 0 155 110 6 2 Ctrl High 0 618 396 Ctrl High 0 618 396 Ctrl High Avg 0 618 396 0 6 Table 25 Intra Assay Precision Mean SD CV Sampl a ug g ug g 96 Sample 1 37 7 2 5 6 7 Sample 2 713 20 1 2 8 Sample 3 1246 32 4 2 6 Mean 4 0 Table 26 Inter Assay Precision Mean SD CV S ur kg a ug g 96 Sample 1 75 5 9 7 12 8 Sample 2 225 20 8 8 Sample 3 788 62 7 8 Sample 4 1000 111 11 1 Sample 5 1764 221 12 6 Mean 10 6 Revision date 2014 06 30 APPENDIX III TABLES TABELLEN TABLES TABELLE TABLAS EXTENDED RANGE PROCEDURE 30 1800 ug g Figure 3 Example of a Standard Curve Standard Curve OD 450 nm 1 0 54 4 PFi y A D 14 x C B 4D B STD CAL STD CAL Concentration vs Values Curve Fit Option Fixed Weight Value Figure 4 ug g 0 0371 10000 Precision Profile 20 Intra Assay CV n 100 0 Calprotectin pg g 1000 0 10000 0 Table 27 Dilution Linearity Parallelism X Observed Expected O E Sample Dilution ug g ug g ES 1 225 2466 100 1 350 1296 1585 82 S 1 1 1200 420 462 91 1 2400 237 233 102
35. In a clinical study 401 symptomatic patients scheduled for colonoscopy were investigated Endoscopy examination showed 273 patients with functional diseases whereas 128 patients had various organic diseases colitis Crohn s ulcers diverticulitis polyps adenomas cancer or infectious diseases ref 12 ROC curve analysis AUC 0 935 resulted in an optimal clinical cut off at 50 ug g Applying this cut off a clinical sensitivity and specificity of 84 496 and 94 596 respectively can be reached in the differentiation between organic and functional diseases see Table 29 Faecal Calprotectin levels from adults and children are comparable whereas levels of newborns can be significantly increased ref 8 These data support the following recommendation for interpretation of results Normal values below 50 ug g Calprotectin values lt 50 ug g are not indicative of inflammation in the gastrointestinal tract Patients with low Calprotectin levels are likely not to be in need of invasive procedures to determine the inflammation cause ref 12 Elevated values between 50 and 200 ug g Calprotectin values between 50 and 200 ug g can represent mild organic disease such as inflammation caused by NSAIDs mild diverticulitis and IBD in remission phase The low inflammatory response shown within this range may suggest repeating the measurement and performing further investigations Elevated values above 200 ug g Calprotectin values gt 200
36. MEDICI N 30 1800 ug g Precisi n intraensayo 4 0 La precisi n media intraensayo se calcul a partir de los resultados de 20 pares de valores de 3 muestras de extractos de heces procesados en un solo an lisis de acuerdo con el procedimiento del ensayo Los valores se presentan en la Table 25 Precisi n interensayo 15 96 La precisi n media interensayo del ELISA se calcul a partir de 5 muestras de extractos Las al cuotas se analizaron de acuerdo con el procedimiento del ensayo en 10 repeticiones diferentes por parte de tres t cnicos de laboratorio usando 2 lotes de kits en dos laboratorios distintos Los valores se presentan en la Table 26 L mite de cuantificaci n LoQ 30 ug g 18 muestras de heces con valores de Calprotectina entre 10 8 y 2080 ug g se midieron 20 veces por duplicado en un ensayo Se calcularon el coeficiente de variabilidad CV y los valores medios para cada muestra El LoQ fue calculado en base a la concentraci n de Calprotectina a 15 del CV El perfil de la precisi n resultante permite una medici n precisa en todo el rango est ndar o sea de 30 hasta 1800 ug g Los resultados se presentan en la Figure 4 Linealidad de la diluci n 102 96 Cinco muestras de heces con concentraciones elevadas de Calprotectina fueron extra das de acuerdo con el procedimiento del ensayo Los extractos se diluyeron con buffer de incubaci n y despu s se analizaron conforme al procedimiento Los valores esp
37. OCKAGE ET PEREMPTION DES REACTIFS R actifs non ouverts non entam s Stables 2 80 Ne pas utiliser au del de la date de p remption figurant sur les tiquettes R actifs ouverts reconstitu s Tampon d extraction Stables 2 80 jusqu la date de p remption Replacer imm diatement les barrettes non utilis es dans la pochette contenant le dessiccateur puis la refermer soigneusement Stable 2 8 jusqu la date de p remption Microplaque Tampon de lavage Stable 2 8 pendant 6 mois apr s dilution Tampon d incubation Calibrateurs Contr les Marqueur Stables 2 8 jusqu la date de p remption enzymatique Substrat TMB Solution stop Table 8 REACTIFS FOURNIS SELON LA DEMANDE Tubes d extraction de selles Unit s 50 ou 200 dispositifs r B CALEX C50 CALEX Ca i p remplis avec 5 mL de tampon B CALEX C200 d extraction pr ts l emploi 50 tubes spatules et fonds de B CAL RD Smart Prep tube 50 tubes comprenant chacun Schebo Quick c ne amp embout du doseur Prep pr remplis avec 1 3 mL de B CAL SO50 rep tampon d extraction pr ts l emploi Table 9 MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI Proc dure d extraction e Anses d inoculation jetables de 10 ul e Tubes de 15 mL en polypropyl ne avec bouchons visser pour la proc dure d extraction standard ou tubes d extraction voir ci dessus
38. RD 3 ScheBo Quick Prep Code B CAL SO50 Die Extraktionsr hrchen sind vorgef llt mit Extraktionspuffer Wichtig Nach der Extraktion mit Smart Prep oder ScheBo Quick Prep werden die R hrchen 5 Minuten bei 3000 x g zentrifugiert Alternativ wird das Homogenat in ein 2 mL Eppendorfgef ss berf hrt und 5 Minuten bei 3000 x g in einer Mikrofuge zentrifugiert Den Uberstand in ein frisches beschriftetes R hrchen berf hren und mit der Assaydurchf hrung fortfahren UNTERSUCHUNGSMATERIAL UND LAGERUNG F r die Extraktion werden weniger als 1g native Stuhlprobe ben tigt Die Stuhlprobe muss in einem leeren Entnahmer hrchen gesammelt werden und kann mindestens 6 Tage bei 2 8 gelagert werden Die Extrakte sind f r mindestens 7 Tage bei 2 8 C und mindestens 24 Monate bei 20 stabil Wichtig Die Stuhlproben d rfen nicht mit chemischen oder biologischen Zus tzen versetzt werden STANDARDISIERUNG Der Test BUHLMANN fCAL ELISA ist gegen gereinigtes MRP8 14 aus humanen Granulocyten kalibriert STUHLPROBENEXTRAKTION Standardextraktionsanleitung 1 Die leeren Polypropylenr hrchen beschriften und zusam men mit der Einweg Impfschlinge austarieren 2 Mit Hilfe der Impfschlinge 50 100 mg Stuhlprobe entnehmen und in das vorgewogene R hrchen geben 3 Das Nettogewicht der entnommenen Probe bestimmen die Impfschlinge abbrechen und den unteren Teil davon im R hrchen belassen 4 Extraktionspuffer entsp
39. REAGENZIEN UND VORBEREITUNG Reagenz EK CAL EK CAL2 Art Nr Rekonstitu tion Menge Extraktions 3 Flaschen 6 Flaschen Gebrauchs Puffer zui25mL zut25mL PCALEX eme Mikrotiter Platte 4 18 12 2 8 12 Gebrauchs Beschichtet mil Kavit ten Kavit ten SE fertig anti Calprotectin mAk Abdeckfolien 3 St ck 6 St ck Waschpuffer a Konzentrat 10x 1 Flasche 2 Flaschen B CAL WB deionisier Konservierungs zu 100 mL zu 100 mL stoffe tem verd nnen Inkubations puffer 2 Flaschen Flaschen B CAL IB Gebrauchs Konservierungs zu 125 mL zu 125 mL fertig stoffe Kalibratoren A E Calprotectin in 5 R hrchen 5 R hrchen B CAL Gebrauchs proteinhaltigem zu 1 mL 201 fertig Puffer Konser vierungsstoffe Kontrolle tief hoch Humanserum 2 R hrchen 2 R hrchen B CAL Gebrauchs mit zu1mL zu1mL CONSET fertig Konservierungs stoffen Enzym Marker anti Calprotectin 1 Flasche 2 Flaschen B CAL EL Gebrauchs Ak konjugiert mit zu 12 mL zu 12 mL fertig HRP TMB Substrat L sung 1 Flasche 2Flaschen 5 pio Gebrauchs Citrat gepufferte zu 12 mL zu 12 mL fertig TMB L sung Stopp L sung 1 Flasche 2Flaschen ee 0 25 M H2SO zu 12mL zu 12 mL karrosiv Table 4 B HLMANN fCAL ELISA Die tats chliche Konzentrationen der Kalibratoren A E betragen 4 12 40 120 und 240 ng mL Calprotectin F r die Extraktion und die Probenve
40. When using automated washer BUHLMANN strongly recommends using plate mode i e each process step dispense aspiration is performed on all of the strips sequentially before processing to the next process step Thus the minimal incubation time is guaranteed e The indicated no of washing cycles is mandatory to ensure reproducible results e Set the Plate rotator shaker at 450 rpm 10 Hz Higher rotation frequency may cause poor dilution linearity at values between 300 900 and 600 1800 ug g Orbital rotation instead of reciprocal shaking should be used eTo ensure a complete antigen antibody interaction the incubation time in step 5 must be at least 30 minutes Moderately longer incubation time up to 5 minutes has no influence to the final outcome e The Enzyme Label is inactivated by oxygen and is highly sensitive to sodium azide thimerosal hypochlorous acid and aromatic chlorohydrocarbons often found in laboratory water supplies Therefore use only deionized high quality water A new standard curve must be generated each time the assay is performed Vertical alignment is recommended e f the initial concentration of an unknown sample reads above the concentration of the highest Calibrator Revision date Calibrator E the sample must be further diluted with Incubation Buffer and assayed again according to the assay procedure The resulting total dilution factor must be taken into account for the calculation of results
41. a es fecais positivas para controle de qualidade interno A reprodutibilidade dos par metros de curva padr o e valores de controle devem estar dentro dos limites estabelecidos de aceitabilidade do laborat rio Os limites de confian a para os controles s o espec ficos de um lote e impressos numa folha de dados QC adicional Se a precis o do teste n o satisfaz os limites estabelecidos e a repeti o excluir erros na t cnica verifique os seguintes pontos i uso da pipeta controle de temperatura e dispositivos de temporiza o ii ajustes do leitor ELISA iii datas de expira o de reagentes iv condi es de armazenamento e incuba o v Solu o de substrato TMB deve ser incolor vi pureza da gua 29 36 LIMITA ES DE DESEMPENHO e Reagentes fornecidos com este kit est o sendo otimizados para determina o de calprotectina em amostras de fezes humanas e Resultados de teste devem ser interpretados em conjunto com as informa es dispon veis da avalia o cl nica do paciente e outros procedimentos de diagn stico B HLMANN fCAL ELISA Revision date APPENDIX I REFERENCES LITERATURREFERENZEN REFERENCES RIFERIMENTI REFERENCIAS Striz I and Trebichavsky I Calprotectin a pleiotropic molecule in acute and chronic inflammation Physiol Res 53 245 253 2004 Tibble JA et al Use of surrogate markers of inflammation and Rome criteria to distinguish organic from nonorganic intestinal
42. a solug o de substrato em todos os pocos 11 Cubra a placa com um selador de placas proteja a placa da luz direta e deixe incubar por 15 2 minutos em um rotador de placas a 450 rpm a 18 286 12 Pipete 100 uL de soluc o stop em todos os pocos Remova as bolhas de ar com uma ponta de pipeta Prossiga com a etapa 13 dentro de 30 minutos 13 Leia a absorv ncia a 450nm em um leitor de micro titulador de placa se encaixa no substrato branco para obter a amostra de calprotectina calculada Se voc preferir o faixa inferior do procedimento ELISA as seguintes concentrac es de calibrador devem ser usadas no respectivo protocolo ELISA 10 30 100 300 e 600 ug g de calprotectina Fatores adicionais de diluic o devem ser multiplicados com os resultados para obter os resultados finais Consulte a Table 19 e a Figure 1 para obter dados t picos resultados e curva padr o Esses resultados e curva padr o s o dados apenas para fins de demonstrac o Uma curva padr o deve ser gerada para cada conjunto de amostras a serem testadas FAIXA DE USO 30 1800 ug g Leia a absorb ncia de 450nm no leitor da microplaca para cada calibrador e controle da amostra usando um 4 PL que se encaixa no substrato branco para obter a amostra de calprotectina calculadas Se voc preferir o procedimento ELISA de faixa inferior as seguintes concentra es de calibrador devem ser usadas no respectivo protocolo ELISA 30 90 300 900 and
43. aggio ELISA Un anticorpo monoclonale a cattura mAb altamente specifico rispettivamente per i complessi eterodimerici e dimerici di Calprotectina ref 4 5 coattato alla micropiastra Calibratori controlli ed estratti del paziente sono incubati per 30 min a temperatura ambiente Dopo una fase di lavaggio un secondo anticorpo Ab coniugato con perossidasici di rafano HRP rileva le molecole di Calprotectina legate all anticorpo monoclonale coattato alla piastra Dopo incubazione ed ulteriore lavaggio viene aggiunto il substrato tetrametilbenzidina TMB con formazione di colore blu seguito dall aggiunta di soluzione di stop virata del colore al giallo L assorbanza viene misurata a 450 nm 16 36 REAGENTI FORNITI E LORO PREPARAZIONE Reagenti EK CAL EK CAL2 Codice Ricostituzione Quantit Tampone per 3 flaconi 6 flaconi estrazione dai2smL Letz BOALEX Pronto all uso Micropiastra Precoattata con Pozzetti da Pozzetti da anti calprotecina 12 8 2x12x8 CAL MP Pronto all uso mAb Foglio Sigillante per la 3 fogli 6 fogli piastra Tampone di Diluire Lavaggio Concentrato i puc m B CAL WB 900 ml di 10x acqua Con conservanti deionizzata Tampone di Incubazione 2 flaconi 3 flaconi da 125 mL da 125 mL B CAL IB Pronto all uso conservanti Calibratori dalla A E Calprotecina in 5 provette 5 provetteda
44. alprotectina La precisi n y la linealidad del ensayo hacen posible esta extensi n del intervalo de medici n del kit de an lisis INTERVALO DE 1 1 Procedimientomanual de pesado Smart Prep o ScheBo Quick Prep Diluir los sobrenadantes 1 150 con tampon de incubaci n e g 20 uL extracto y 2980 uL tampon de incubaci n y mezclar bien Dejar reposar las muestras diluidas al menos 5 minutos a 18 28 antes del pipeteado del paso 4c Revision date 2014 08 14 23 36 1 2 Dispositivo CALEX Cap Diluir los sobrenadantes 1 15 con tampon de incubaci n e g 50 uL extracto y 700 uL tampon de incubaci n y mezclar bien Dejar reposar las muestras diluidas al menos 5 minutos a 18 28 antes del pipeteado del paso 4c 2 Prepare una placa con filas suficientes para probar el n mero requerido de calibradores controles y muestras diluidas Retire las filas sobrantes del soporte y vuelva a guardarlas en la bolsa de aluminiojunto con los sacos desecantes sin demora Almac nelo a 2 8 3 Lave dos veces los pocillos recubiertos utilizando como m nimo 300 uL de tamp n de lavado por pocillo Vac e los pocilos y sacuda la placa firmemente en papel secante Importante Aseg rese de incubar el tamp n de lavado en los pozos un tiempo m nimo de 20 segundos para cada de los tres pasos de lavado 4a Pipete 100 uL de tamp n de incubaci n en el pocillo respectivo Pipete 100 de calibrador A E en los pocillos respectivos
45. amente com tamp o de extra o Importante Depois da extrac o com Smart Prep o ScheBo Quick Prep centrifugue os tubos por 5 minutos a 3 000 x g Ou ent o transfira o homogeneizado para um tubo Eppendorf de 2 mL e centrifugue o por 5 minutos a 3 000 x g Decante o sobrenadante em um tubo novo e etiquetado e continue com o procedimento ELISA FAIXA DE TRABALHO ELISA O teste pode ser realizado de acordo com os seguintes procedimentos faixa inferior ou estendida do procedimento ELISA Qual procedimento a ser escolhido depende da concentra o esperada de calprotectina das amostras Para amostras at 600 ug g escolha o faixa inferior do procedimento faixa de uso 10 600 ug g Se as amostras tendem a exceder 600 ug g escolha o faixa estendida do procedimento faixa de uso 30 1800 ug g PADRONIZACAO O teste BUHLMANN fCAL ELISA calibrado contra MRP8 14 de granul citos humanos PROCEDIMENTO DE TESTE Extrac o Procedimento padr o de extrac o 1 Marque com uma etiqueta e pese o tubo vazio de polipropileno tara junto com a alca de inoculag o 2 Retire 50 a 100 mg da amostra das fezes com a alca de inoculac o e insira a no tubo previamente tarado 3 Estime o valor liquido da amostra quebre a alga de inoculac o e deixe a parte inferior da alga no tubo 4 Adicione o tamp o de extrag o segundo a f rmula x mg de fezes x 49 y ul tamp o de extrac o p e 50 mg da fezes 2450 ul ta
46. atenblatt angegeben Falls die Ergebnisse des Testes nicht innerhalb der erwarteten Bereiche liegen und wiederholte Messungen einen Durchf hrungsfehler ausschliessen sind folgende Punkte zu berpr fen i Pipetten Thermometer und Uhren Laborwecker ii Photometer Eichung iii Verfallsdaten der Reagenzien iv Lagerung und Inkubations Bedingungen v die Substratl sung sollte farblos sein vi Wasserreinheit LEISTUNGSEINSCHRANKUNGEN e Die Reagenzien die mit diesem Kit geliefert werden sind fur die Messung von humanem Calprotectin extrahierten Stuhlproben optimiert e Die Ergebnisse sollten in Verbindung mit der Anamnese des Patienten und weiteren diagnostischen Tests verwendet werden Revision date 2014 08 14 FRANCAIS E DOMAINE D UTILISATION La trousse BUHLMANN fCAL ELISA d a t con ue pour l extraction et la d termination quantitative de calprotectine MRP8 14 S100A8 S100A9 humaine dans les chantillons de selles r f 1 3 PRINCIPE DU DOSAGE Apr s une extraction rapide avec un volume de selles et 49 volumes de tampon d extraction ce dosage permet la mesure s lective de l antig ne calprotectine au moyen d un ELISA de type sandwich Les puits de la microplaque sont recouverts d un anticorps monoclonal de capture Acm anticorps hautement sp cifique aux complexes h t rodim riques et polym riques de calprotectine r f 4 5 Les calibrateurs les contr les et les extraits de se
47. azione minimo di 20 secondi vedi Precauzioni Tecniche Procedura del dosaggio ELISA 4a Dispensare 100 uL di Tampone d Incubazione nel pozzetto rispettivo Bianco Dispensare 100 uL del Calibratore A E nei rispettivi pozzetti 4b Dispensare 100 uL di Controllo Basso e Alto nei rispettivi pozzetti 4c Dispensare 100 di successivi pozzetti ogni campione diluito nei 5 Coprire la piastra con un foglio sigillante e incubarla per 30 5 minuti massimo su un mixer impostato a 450 rpm a 18 28 vedi Precauzioni Tecniche Procedura del dosaggio ELISA 6 Rimuovere ed eliminare il foglio sigillante Svuotare i pozzetti e lavare 3 volte usando almeno 300 uL di Tampone di Lavaggio per pozzetto vedi Precauzioni Tecniche Procedura del dosaggio ELISA Svuotare i pozzetti scuotendo la piastra energicamente su carta per blotting 7 Dispensare 100 uL di Marcatore enzimatico in ogni pozzetto 8 Coprire la piastra con un foglio sigillante e incubarla per 30 5 minuti massimo su un mixer impostato a 450 rpm 18 28 9 Rimuovere ed eliminare il foglio sigillante Svuotare i pozzetti e lavare cinque volte usando almeno 300 pL di Tampone di Lavaggio per pozzetto Svuotare i pozzetti scuotendo la piastra energicamente su carta per blotting Importante lasciare che la soluzione di substrato TMB raggiunga 18 28 10 Dispensare 100 uL di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti 11 Coprire la piastra con un f
48. b BUHLMANN BUHLMANN fCAL ELISA Calprotectin EK CAL 96 tests EK CAL2 192 tests Revision date 2014 08 14 B HLMANN LABORATORIES AG Baselstrasse 55 CH 4124 Sch nenbuch Switzerland Tel 441 61 487 1212 Fax 41 61 487 1234 info buhImannlabs ch English page Deutsch Seite Frangais page Italiano pagina Espa ol p gina Portugu s p gina 11 16 21 25 ENGLISH INTENDED USE The BUHLMANN fCAL ELISA kit is designed for the extraction and quantitative determination of human Calprotectin MRP8 14 S100A8 S100A9 in stool samples ref 1 3 PRINCIPLE OF THE ASSAY The test allows for the selective measurement of Calprotectin antigen by sandwich ELISA A monoclonal capture antibody mAb highly specific to the Calprotectin heterodimeric and polymeric complexes ref 4 5 respectively is coated onto the microtiter plate Calibrators controls and patients extracts are incubated at room temperature for 30 minutes After a washing step a detection antibody Ab conjugated to horseradish peroxidase HRP detects the calprotectin molecules bound to the monoclonal antibody coated onto the plate After incubation and a further washing step tetramethylbenzidine will be added blue color formation followed by a stopping reaction change to yellow color The absorption is measured at 450 nm REAGENTS SUPPLIED AND PREPARATION STORAGE AND SHELF LIFE OF REAGENTS Unopened Reagents Stor
49. bate for 30 t5 min on a plate rotator set at 450 rpm at 18 28 C 9 Remove and discard the Plate Sealer Empty the wells and wash five times using at least 300 of Wash Buffer per well Empty the wells and tap the plate firmly onto blotting paper Important Allow the TMB Substrate Solution to equilibrate to 18 28 C 10 Pipet 100 uL of the TMB Substrate Solution to all wells 11 Cover the plate with a plate sealer protect the plate from direct light and incubate for 15 2 min on a plate rotator set at 450 rpm at 18 286 12 Pipet 100 pL of Stop Solution to all wells Remove air bubbles with a pipette tip Proceed to step 13 within 30 min 13 Read the absorbance at 450 nm in a microtiter plate reader 2014 08 14 4 36 RESULTS amp CALCULATION Read the absorbance at 450 nm in a microplate reader for each calibrator control and sample using a 4 PL fit with blank subtraction and have the concentration of the samples calculated WORKING RANGE 10 600 ug g If you choose the lower range ELISA procedure the following calibrator concentrations have to be used in the respective ELISA protocol 10 30 100 300 and 600 ug g Calprotectin Additional dilution factors have to be multiplied with the results to obtain the final results Refer to Table 19 and Figure 1 for typical data results and standard curve These results and standard curve are provided for demonstration purposes only A standard curve must be generat
50. ble 28 Reatividade cruzada lt 0 1 Um tamp o de incuba o acrescido de diferentes volumes de recombinante MRP8 e MRP14 foi medido de acordo com o procedimento de teste Os valores est o apresentados na Table 28 FAIXA DE USO 30 1800 ug g Precis o intra teste 4 0 A precis o m dia intra teste foi calculada a partir dos resultados de 20 duplicatas de 3 amostras de fezes extra das e testadas num nico lote de acordo com o procedimento de teste Os valores s o apresentados na Table 25 Precis o Inter testes lt 15 A precis o inter testes do ELISA foi calculado a partir de 5 amostras extra das de fezes As fra es foram testadas de acordo com os procedimentos de teste por 3 t cnicos diferentes em 10 lotes diferentes usando 2 lotes de kit em 2 laborat rios diferentes Os valores s o apresentados na Table 26 Limite de detec o LoQ lt 30 ug g 18 amostras fecais com valores entre 10 8 e 2080 ug g de calprotectina foram medidos 20 vezes em um teste O CV porcentual e os valores m dios foram calculados para cada amostra O LoQ foi observado a 15 do CV O perfil de precis o resultante permite que a medi o precisa dentro da faixa padr o de 30 a 1800 ug g Os resultados foram apresentados na Figure 4 Linearidade da dilui o 102 Cinco amostras de fezes com concentra es elevadas de calprotectina foram extra das de acordo com o procedimento de teste Os extratos foram dilu dos com tamp o de inc
51. cedimento ELISA as seguintes concentrag es devem ser usadas no respectivo protocolo ELISA 30 90 300 900 e 1800 ug g de calprotectina Os controles cont m quantidades espec ficas de calprotectina humana no lote Veja a folha de dados adicional QC para as concentrac es reais 2 B HLMANN fCAL ELISA REAGENTES FORNECIDOS MEDIANTE PEDIDO Dispositivos de extracao fecal CALEX Cap Embalagem com 50 o 200 tubos B CALEX C50 com 5mL de tamp o de extrac o E Device pronto para uso B CALEX C200 Smart Prep 50 tubos esp tulas e tampas B CAL RD 50 tubos consistindo de tubo Schebo Quick suporte do doseador amp doseador B CAL SO50 Prep 1 3 mL de tamp o de extrac o pronto para uso Table 17 ARMAZENAMENTO PRAZO DE VALIDADE DOS REAGENTES Reagentes n o abertos Armazenar a 2 8 use depois da data de expira cao do kit impresso nas etiquetas Reagentes abertos reconstitu dos Tamp o de extra o Armazene a 2 8 C at a data de expira o Devolver imediatamente as fileiras n o utilizadas para a bolsa metalizada contendo os sacos de dissecadores e selar novamente a beirada inteira do selo zip Armazenar a 2 89C at a data de expirac o Microplaca Tamp o de lavagem dilu do Armazenar a 2 8 C por um periodo m ximo de 6 meses Tamp o de incubac o Calibradores Controles yna Armazenar a 2 89C at a data de expirac
52. cedimiento depende de la concentraci n de Calprotectina esperada en las muestras Para muestras de hasta 600 ug g se elegir el procedimiento rango bajo intervalo de medicion 10 600 Lg g Si las muestras sobrepasan el nivel de 600 ug g se debe elegir el procedimiento de rango extendido intervalo de medicion 30 1800 ug g PROCEDIMIENTO Importante Dejar que los reactivos alcancen los 18 28 antes de su uso Diluir s lamente los extractos de heces Calibradores y controles est n listos para usar 1 DILUCI N DE LAS MUESTRAS DE HECES PROCEDIMIENTO ELISA DE BAJO INTERVALO DE MEDICI N 10 600 ug g 1 1 Procedimiento manual de pesado Smart Prep o ScheBo Quick Prep Diluir los sobrenadantes 1 50 con tampon de incubaci n e g 20 uL extracto y 980 uL tampon de incubaci n y mezclar bien Dejar reposar las muestras diluidas al menos 5 minutos a 18 28 antes del pipeteado del paso 4c del PROCEDIMIENTO 1 2 Dispositivo CALEX Cap Diluir los sobrenadantes 1 5 con tampon de incubaci n e g 100 uL extracto y 400 uL tampon de incubaci n y mezclar bien Dejar reposar las muestras diluidas al menos 5 minutos a 18 28C antes del pipeteado del paso 4c del PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENTO ELISA DE BAJO MEDICION 30 1800 ug g El intervalo de medici n se puede extender en un factor de 3 si se diluyen las muestras a 1 7500 en lugar de 1 2500 Este procedimiento es el recomendado si se esperan concentraciones altas de C
53. cedure Extraction procedures using fecal extraction devices The extraction procedure is described and illustrated in the instruction for use delivered with the respective extraction device 1 CALEX Cap Device Code B CALEX C50 B CALEX C200 The extraction tubes are prefilled with extraction buffer Important After extraction centrifuge the CALEX Cap Device for 5 minutes at 500 x g and continue with the ASSAY PROCEDURE 2 Fecal Extraction Device Roche Code 10745804322 or BUHLMANN Smart Prep Code B CAL RD 3 ScheBo Quick Prep Code B CAL SO50 The extraction tubes are prefilled with extraction buffer Important After extraction with BUHLMANN Smart Prep and ScheBo Quick Prep centrifuge the tubes for 5 minutes at 3 000 x g Alternatively transfer the homogenate into a 2 mL Eppendorf tube and centrifuge it in a microcentrifuge for 5 minutes at 3 000 x g Decant the supernatant into a fresh labeled tube and continue with the ASSAY PROCEDURE BUHLMANN fCAL ELISA WORKING RANGE The assay can be performed according to the following procedures lower or extended range ELISA procedure Which procedure is to be chosen depends on the expected Calprotectin concentration of the samples For samples up to 600 ug g choose the lower range procedure working range 10 600 ug g If the samples tend to exceed 600 ug g choose the extended range procedure working range 30 1800 ug g ASSAY PROCEDURE
54. controles contienen cantidades espec ficas de lote de Calprotectina humana nativa Ver la hoja de datos de QC adicional para las concentraciones reales Revision date 2014 08 14 21 36 e En cuanto a las precauciones adecuadas que debe tomar para la correcta eliminaci n de los reactivos del kit recomendamos encarecidamente consultar con anterioridad la normativa local espec fica de su pa s PRECAUCIONES T CNICAS e Residuos pueden formarse en los pocillos durante el processo de la producci n Ellos estan eliminado completamente durante lavar los pocillos y no tienen ninguna influencia en los resultados v ase a punto 3 de la instrucci n de uso elea atentamente las instrucciones antes de realizar el ensayo El rendimiento del ensayo se ver gravemente B HLMANN fCAL ELISA afectado si los reactivos son incorrectamente diluidos modificados o almacenados en condiciones distintas a las que se detallan en estas instrucciones de uso e Los componentes no deben utilizarse despu s de la fecha de caducidad impresa en las etiquetas e No mezcle diferentes lotes de reactivos e Debe hacerse todo lo posible para garantizar que no se produzca contaminaci n cruzada entre reactivos muestras o entre pocillos e Deje que los reactivos alcancen la temperatura ambiente 18 28 y m zclelos bien con agitador de v rtice antes de ser utilizados e Los micropocillos no deben ser reutilizados Extracci n ePara obtener res
55. de 1 2 flacons de B CAL EY S rum humain ML 4 mL CONSET Pr ts l emploi avec conservateurs Margueur enzymatigue Ac anti 1 flacon de 2 flacons de xin Calprotectine 12mL 12mL B CAL EL Pr t l emploi conjugu la HRP Substrat TMB Solution de 1 flacon de 2 flacons de zi dans un tampon 12 mL 12mL SE proa EHS citrate Solution stop 1 flacon de 2 flacons de B STS12 Pr te l emploi 0 25 M H2SO 12mL 12mL corrosif Table 7 B HLMANN fCAL ELISA Les concentrations actuelles de calprotectine des calibrateurs A E sont respectivement 4 12 40 120 et 240 ng mL Apr s extraction et dilution de l chantillon une dilution 1 2500 est prise en compte pour la d termination des calibrateurs A E Les concentrations suivantes doivent tre utilis es pour la gamme basse de dosage ELISA 10 30 100 300 and 600 ug g de calprotectine f cale 2 Pour la proc dure ELISA tendue utilisez les concentrations de calibrateurs A E suivantes dans le mode op ratoire du lecteur de microplaques correspondant 30 90 300 900 et 1800 ug g de Calprotectine 9 Les concentrations en Calprotectine humaine native des contr les varient en fonction des lots Veuillez vous r f rer la fiche de contr le qualit pour les concentrations effectives e Papier absorbant e Agitateur de microplaques voir PRECAUTIONS TECHNIQUES e Lecteur de microplaques pour la mesure de l absorbance 450 nm ST
56. de 2 mL y centrifugar en microcentr fuga durante 5 minutos a 3 000 x g 7 Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo etiquetado y continuar con el procedimiento ELISA Procedimientos de extracci n utilizando dispositivos de extracci n de heces El procedimiento de extracci n se describe y se ilustra en las instrucciones de uso entregadas con los respectivos dispositivos de extracci n 1 Dispositivo CALEX Cap c digo B CALEX C50 B CALEX C200 Los tubos contienen 5 0 mL de tamp n de extracci n B HLMANN fCAL ELISA Importante Tras la extracci n centrifugue los extractos durante 5 minutos a 500 x g y prosiga con el Procedimiento 2 Dispositivo de extracci n de heces Roche c digo 10745804322 o BUHLMANN Smart Prep c digo B CAL RD El tiempo de extracci n v rtex puede reducirse a 1 minuto 3 ScheBo Quick Prep c digo B CAL SO50 Los tubos de extracci n contienen tamp n de extracci n Importante Tras la extracci n con Smart Prep o ScheBo Quick Prep centrifugue los extractos durante 5 minutos a 3000 x g Alternativamente transfiera el homogeneizado a un tubo Eppendorf de 2 mL y centrifuguelo en una microcentr fuga durante 5 minutos a 3000g Decante el sobrenadante a un nuevo tubo etiquetado y prosiga con el Procedimiento PROCEDIMIENTO DEL ELISA El ensayo se puede realizar de acuerdo con los siguientes procedimientos ELISA de rango bajo o de rango extendido La elecci n del pro
57. dencia del sexo ref 9 PORTUGU S UTILIZAC O PREVISTA O kit B HLMANN fCAL ELISA foi desenvolvido para a extrac o e determinac o quantitativa da calprotectina humana MRP8 14 S100A8 S100A9 em amostras fecais ref 1 3 PRINC PIO DO TESTE Ap s um curto procedimento de extrag o usando um volume de fezes e 49 volume de tamp o de extrac o o teste leva em considerac o a medida seletiva do ant geno calprotectina pela t cnica sandu che ELISA Uma captura monoclonal de anticorpo mAb altamente espec fica dos complexos heterodim rico e polim rico da Calprotectina ref 4 5 respectivamente recoberta numa microplaca de microtitula o Calibradores controles e extratos da amostra do pacientes s o incubados temperatura ambiente por 30 minutos Depois de uma etapa de lavagem um anticorpo de detec o Ab conjugado com peroxidase de raiz forte HRP detecta mol culas de calprotectina ligadas ao anticorpo monoclonal recoberta na placa Depois da incuba o e de uma etapa adicional de lavagem tetrametilbenzidina TMB ser acrescentado formando a cor azul seguido por uma rea o de interrup o trocando para a cor amarela A absor o medida em 450 nm CONTROL DE CALIDAD Es necesario comprender totalmente estas instrucciones de uso para obtener unos resultados satisfactorios S lo se obtendr n resultados fiables utilizando t cnicas de laboratorio precisas gu as de Buenas Pr cticas de Lab
58. determination of Calprotectin from human stool samples e Test results should be interpreted in conjunction with information available from clinical assessment of the patient and other diagnostic procedures Revision date DEUTSCH ANWENDUNGSZWECK Der B HLMANN fCAL ELISA Kit wird eingesetzt f r die quantitative Bestimmung von humanem Calprotectin MRP8 14 S100A8 S100A9 aus extrahierten Stuhlproben Ref 1 3 PRINZIP DER METHODE Calprotectin wird selektiv mittels Sandwich ELISA bestimmt Die Kavit ten der Mikrotiterplatte sind mit einem monoklonalen Fangantik rper mAk beschichtet welcher gegen ber heterodimerem und polymerem Calprotectin hoch spezifisch ist Ref 4 5 Das Calprotectin in den Kalibratoren Kontrollen und Patientenproben bindet w hrend der Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur an den Fangantik rper Nach einem Waschschritt wird das am mAk gebundene Calprotectin durch einen mit Meerrettich Peroxidase HRP konjugierten Nachweisantik rper Ak detektiert Nach der Inkubation und einem weiteren Waschschritt wird Tetramethylbenzidin TMB zugegeben Die Enzym Substratreaktion f hrt zu einem blaugef rbten Produkt sie wird durch Zugabe der Stopp L sung gestoppt Dabei findet gleichzeitig ein Farbumschlag nach Gelb statt Die bei einer Wellenl nge von 450 nm gemessene optische Dichte der L sung ist direkt proportional zur Calprotectinkonzentration der Probe 2014 08 14 6 36 GELIEFERTE
59. disease Gastroenterol 123 450 460 2002 Fagerhol MK Calprotectin a faecal marker of organic gastrointestinal abnormality Lancet 356 1783 4 2000 Hessian PA and Fisher L The heterodimeric complex of MRP 8 S100A8 and MRP 14 S100A9 Antibody recognition epitope definition and the implications for structure Eur J Biochem 268 353 63 2001 Goebeler M et al Expression and complex formation of S100 like proteins MRP8 and MRP14 by macrophages during renal allograft rejection Transplantation 58 355 61 1994 Tibble JA et al A simple method for assessing intestinal inflammation in Crohn s disease Gut 47 506 513 2000 Wassell J et al Faecal Calprotectin a new marker for Crohn s disease Ann Clin Biochem 41 230 232 2004 2014 08 14 30 36 10 11 12 13 Konikoff MR and Denson LA Role of fecal calprotec tin as a biomarker of intestinal inflammation in inflam matory bowel disease Inflamm Bowel Dis 12 6 524 34 2006 Fagerberg UL et al Colorectal inflammation is well predicted by fecal calprotectin in children with gastrointestinal symptoms J Pediatr Gastroenterol Nutr 40 450 5 2005 Johnson MW et al Faecal calprotectin a noninvasivee diagnostic tool and marker of severity in pouchitis Eur J Gastroenterol Hepatol 20 174 179 2008 Sipponen T et al Faecal Calprotectin Lactoferrin and Endoscopic Disease Activity in Monitoring Anti TNF alpha Therapy for Crohn s Disease Aliment P
60. do las precauciones adecuadas Marcador enzim tico i i e Soluci n substrato y soluci n de interrupci n La Ac anti Calprotectina T Mal 2 viales B CAL Listo para m y conjugado con HRP 12mL de12mL usar soluci n substrato B TMB12 contiene Substrato de TMB 1 vial 2 viales 8 TMB12 Listo para tetrametilbenzidina y per xido de hidr geno La TMB en tamp n Citrato 12 mL de12mL usar soluci n de interrupci n B STS12 contiene cido Soluci n de Listo sulf rico Los dos reactivos pueden irritar los ojos la piel interrupci n FYD este y las membranas mucosas Evite el contacto con los ojos si 12mL de 12 mL Agente cido Sulf rico 0 25 M corrosivo la piel y la ropa Table 13 Las concentraciones efectivas de los est ndares A a E son 4 12 40 120 240 ng mL de Calprotectina respectivamente Durante la extracci n y diluci n adicional de los extractos para la medici n en el ELISA se produce una diluci n total de 1 2500 Para tener en cuenta esos pasos de diluci n para los c lculos finales las concentraciones de los calibradores A al E para el procedimiento ELISA de bajo intervalo de medici n son 10 30 100 300 y 600 ug g de Calprotectina 2 Para el procedimiento ELISA de intervalo de medici n extendido se requiere utilizar las siguientes concentraciones de calibradores en el protocolo ELISA respectivo 30 90 300 900 y 1800 ug g de Calprotectina Los
61. dose of Calprotectin was calculated to be clearly below Calibrator A 10 ug g by adding two standard deviations to the mean absorbance and intersecting this value with the standard curve obtained in a new run Detection limit LoQ 10 ug g Ten stool samples with values between 5 2 and 1254 ug g Calprotectin were assayed 20 times in duplicates in one assay The CV and the mean values were calculated for each sample The functional sensitivity was observed at 15 CV The resulting precision profile Figure 2 allows the precise measurement within the whole standard range from 10 to 600 ug g Dilution Linearity 103 96 Seven stool samples with elevated Calprotectin values were extracted according to the assay procedure The extracts were diluted with Incubation Buffer and subsequently assayed according to the assay procedure The expected values were calculated from the observed value found with the first dilution The results are presented in Table 22 Spiking Recovery 100 96 Two extracted stool samples were spiked with different amounts of diluted Calprotectin containing human serum The samples were measured before and after spiking according the assay procedure The results are presented in Table 23 Crossreactivity 0 1 96 Incubation Buffer spiked with different amounts of recombinant MRP8 and MRP14 were measured according to the assay procedure The values are presented in Table 28 WORKING RANGE 30 1800 ug g Intra Assa
62. e at 2 8 C Do not use past kit expiration date printed on the labels Opened Reconstituted Reagents Extraction Buffer Store at 2 8 until expiration d ate Return unused strips immediately to the foil pouch containing the desiccant packs and reseal along the entire edge of zip seal Store until expiration date at 2 80 Microtiter Plate Diluted Wash Buffer Store for up to 6 months at 2 80 Incubation Buffer Calibrators Controls Store at 2 8 until expiration date Enzyme Label TMB Substrate Stop Solution Table 2 REAGENTS SUPPLIED SUPPLEMENTARY Fecal Extraction Devices Package with 50 or 200 CALEX Cap tubes respectively each B CALEX C50 Device filled with extraction buffer B CALEX C200 5 ml ready to use Smart Prep 50 tubes spatulas and base B CAL RD caps 9 Quick 50 tubes consisting of tube ne Gulck cone amp dosing tip B CAL SO50 1 3 mL ready to use Table 3 Reagents EK CAL EK CAL2 Code Reconstitution Quantity 3 bottles 6 bottles Extraction Buffer 125 mL x125 mL B CAL EX Ready to use Microtiter Plate precoated with 12x8 2x12x8 n on anti Calprotectin wells wells B CAL MP Ready to use mAb Plate Sealer 3 pieces 6 pieces Wash Buffer Concentrate 1 bottle 2 bottles B CAL WB sini Hel wi 10x with x100mL x100mL P 20 3 deionized H2O preservatives Incubation Buffer
63. e inoculation loops e 15 mL polypropylene tubes with screw caps required for standard extraction procedure extraction devices see above e Laminar flow work station e Multi tube vortex mixer e Precision balance 10 150 mg Micro centrifuge 23000 g e Centrifuge 2500 g ELISA Procedure e 10 100 and 1000 uL precision pipettes with disposable tips e Disposable polystyrene or polypropylene tubes for the preparation of sample dilutions e 1000 mL cylinder to dilute the Wash Buffer Microtiter plate washer see Technical Precautions or squeeze bottle for Wash Buffer e Microtiter plate rotator see Technical Precautions Blotting paper Microtiter plate reader for measurement of absorbance at 450 nm 2 36 PRECAUTIONS SAFETY PRECAUTIONS e The microtiter plate calibrators and controls of this test contain components of human origin Although tested and found negative for HBV surface antigen HCV and HIV1 2 antibodies the reagents should be handled as if capable of transmitting infections and should be handled in accordance with Good Laboratory Practices GLP using appropriate precautions B HLMANN fCAL ELISA e Substrate and Stop Solution The Substrate TMB B TMB12 contains Tetramethylbenzidine and hydrogen peroxide The Stop Solution B STS12 contains sulfuric acid 0 25 M Each of those reagents is irritant to eyes skin and mucous membranes Avoid contact with Eyes skin and cloths
64. e la plage d talonnage entre 30 et 1800 ug g Les r sultats sont repr sent s sur la Figure 4 Revision date 2014 08 14 INTERPRETATION DES RESULTATS La m thode d estimation de Calprotectine dans les selles est fiable et facile utiliser pour diff rencier les maladies gastro intestinales organiques des maladies gastro intestinales fonctionnelles Dans une tude clinique 401 patients symptomatiques programm s pour une coloscopie ont t examin s L examen endoscopique a montr que 273 patients pr sentent des maladies fonctionnelles alors que 128 patients pr sentent des maladies organiques diverses colites maladie de Crohn ulc res diverticules polypes ad nomes cancer ou maladies infectieuses r f 12 L analyse de la courbe ROC AUC 0 935 montre une valeur seuil clinique optimale 50 ug g En appliquant cette valeur seuil une sensibilit clinique et une sp cificit respectivement de 84 496 et 94 595 ont t atteintes dans la diff renciation des maladies organiques et fonctionnelles voir Table 29 La concentration de Calprotectine dans les selles est comparable chez les adultes et les enfants tandis qu elle peut augmenter de facon significative chez les nouveau n s r f 8 Ces donn es confortent les recommandations suivantes pour l interpr tation des r sultats Valeurs normales inf rieures 50 ug g Des valeurs de Calprotectine 50 ug g excluent une inflammation au niveau du t
65. e sind in Table 27 dargestellt INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Die Bestimmung von Calprotectin aus Stuhlproben ist eine verl liche und einfache Art organische von funktionellen gastrointestinalen Erkrankungen zu unterscheiden In einer klinischen Studie wurde von 401 Patienten bei denen zuvor eine endoskopische Untersuchung durchgef hrt wurde Calprotectin im Stuhl untersucht Die endoskopische Untersuchung zeigte bei 273 Patienten eine funktionelle Erkrankung w hrend bei 128 Patienten unterschiedliche organische Erkrankungen festgestellt wurden Kolitis Crohn s Ulzera Divertikulitis Polypen Adenome Karzinome oder Infektionserkrankungen Ref 12 Die ROC Analyse AUC 0 935 ergab einen optimalen klinischen Cut off von 50 ug g Calprotectin Bei Anwendung dieses Grenzwertes kann eine klinische Spezifit t von 84 4 und eine Sensitivit t von 94 5 erreicht werden siehe Table 29 Calprotectin Werte von Erwachsenen und Kindern zwischen 4 und 17 Jahren sind vergleichbar w hrend die Werte von Neugeborenen signifikant h her sind Ref 8 Diese Daten st tzen die folgenden Empfehlungen zur Beurteilung der Ergebnisse Normalwerte unter 50 ug g Calprotectin Werte lt 50 ug g schliessen eine Entz ndung des gastrointestinalen Traktes weitgehend aus Bei niedrigen Calprotectinwerten bedarf es in der Regel keiner invasiven Untersuchungen um die Ursache der Erkrankung zu bestimmen Ref 12 Erh hte Werte zwischen 50 und 20
66. ed for each set of samples to be assayed WORKING RANGE 30 1800 ug g If you choose the extended range ELISA procedure the following calibrator concentrations have to be used in the respective ELISA protocol 30 90 300 900 and 1800 ug g Calprotectin Additional dilution factors have to be multiplied with the results to obtain the final results Refer to Table 24 and Figure 3 for typical data results and standard curve These results and standard curve are provided for demonstration purposes only A standard curve must be generated for each set of samples to be assayed B HLMANN fCAL ELISA PERFORMANCE CHARACTERISTICS WORKING RANGE 10 600 ug g Assay performance characteristics have been established in duplicates Intra Assay Precision 4 7 The intra assay precision was calculated from 20 pairs of values from 3 extracted stool samples assayed in a single run according to the assay procedure The values are presented in Table 20 Inter Assay Precision lt 15 The inter assay precision of the ELISA was calculated from 5 extracted stool samples The aliquots were tested according to the assay procedure in 10 different runs by three technicians using 2 kit lots in two different labs The values are presented in Table 21 Detection limit LOB 10 pg g Twenty duplicates of Incubation Buffer were assayed in a single run Mean and standard deviation were calculated for the absorbance values The minimal detectable
67. elevati sopra i 200 ug g I valori di Calprotectina gt 200 ug g sono indicativi di una malattia attiva organica con infiammazione nel tratto gastrointestinale Sono suggerite appropriate ulteriori procedure investigative e curative eseguite da specialisti Il cut off suggerito per gli adulti 50 ug g pu essere anche usato per i bambini con et compresa tra i 4 e i 17 anni senza differenziazione di sesso ref 9 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI La valutazione della Calprotectina nelle feci un metodo facile e attendibile per distinguere tra malattie gastrointestinali funzionali e organiche In uno studio clinico condotto su 401 pazienti sintomatici la Calprotectina stata determinata prima di eseguire una colonscopia L esame endoscopico ha mostrato 273 pazienti con malattie gastrointestinali funzionali mentre 128 pazienti con varie malattie organiche colite Crohn s ulcera diverticolite polipi adenomi cancro o malattie infettive r f 12 Analisi di curve ROC AUC 0 935 mostrano un cut off clinico ottimale ad un valore di 50 ug g Applicando questo valore cut off viene raggiunta una sensibilit di 84 4 e specificit clinica di 94 5 Ci rende possibile la differenziazione tra malattie gastrointestinali funzionali e organiche vedi Table 29 La concentrazione di Calprotectina nelle feci comparabile in adulti e bambini mentre nei neonati pu essere significativamente pi elevata ref 8 Questi dati su
68. er Reaktion vollst ndig ablaufen kann muss die Inkubationszeit in Schritt 5 mindestens 30 Minuten betragen Leicht l ngere Inkubationszeiten bis zu 5 Minuten zeigen dagegen keinen Einfluss auf das Endresultat e Die als Enzymmarker verwendete Peroxidase HRP wird durch Sauerstoff inaktiviert und ist sehr empfindlich gegen Natriumazid Thimerosal Hypochlors ure und aromatische chlorierte Kohlenwasserstoffe die im Wasser vorkommen k nnen Daher sollte nur deionisiertes oder destilliertes Wasser von hoher Qualit t verwendet werden e Die Standardkurve muss bei jedem Testansatz bestimmt werden Vertikale Anordnung wird empfohlen e Falls die Konzentration einer Probe gr sser als diejenige des h chsten Kalibrators E ist muss diese Probe mit Inkubationspuffer verd nnt und erneut getestet werden Der zus tzliche Verd nnungsfaktor muss bei der Konzentrationsberechnung dieser Probe ber cksichtigt werden Extraktion unter Verwendung von Stuhlextraktions bestecken Die Extraktion ist beschrieben und illustriert in den Anleitungen die den Extraktionsbestecken beiliegen i CALEX Cap Device Code B CALEX C50 B CALEX C200 Die Extraktionsr hrchen sind mit 5 ml Extraktionspuffer gef llt Wichtig Nach der Extraktion werden die Extraktionsr hrchen 5 Minuten bei 500 x g zentrifugiert Danach mit der Assaydurchf hrung fortfahren 2 F kales Extraktionsbesteck Code 10745804322 oder BUHLMANN Smart Prep Code B CAL
69. erados se calcularon a partir del valor encontrado en la primera diluci n Los resultados se presentan en la Table 27 24 36 INTERPRETACI N DE RESULTADOS La evaluaci n de Calprotectina en heces es un m todo fiable que posibilita la distinci n entre enfermedades org nicas y enfermedades gastrointestinales funcionales En un estudio con 401 pacientesque estaban en lista para realizar una colonoscopia Los niveles de Calprotectina fecal fueron determinados antes de someterlos a unaendoscopia La endoscopia confirm que 273 pacientes sufrian de enfermedades funcionales mientras que 128 pacientes ten an varias enfermedades org nicas Colitis Morbus Crohn lceras diverticulitis p lipos adenomas c ncer o enfermedades infecciosas ref 12 Una an lisis de la curva ROC AUC 0 935 resulta en un valor limite ptimo de 50 ug g Aplicando este valor l mite la sensibilidad y la especifidad clinica del metodo alcanz 84 496 y 94 596 respectivamente v anse Table 29 Esto demuestra que la Calprotectina fecal es una excellente biomarcador para discriminar entre enfermedades org nicas y funcionales Por lo tanto las muestras que B HLMANN fCAL ELISA exceden el valor limite de 50 ug g se pueden considerar como positivas y los pacientes no deben someterse a investigaciones invasivas como la colonoscopia y otras m todos para confirmar una inflamaci n organica La concentraci n de Calprotectina en heces es comparable e
70. es tubes d extraction sont pr remplis avec le tampon d extraction Important Apr s extraction centrifuger les tubes CALEX Cap 5 minutes 500 x g et poursuivre avec la proc dure ELISA 2 Tubes d extraction de selles B HLMANN Smart Prep r f B CAL RD 3 ScheBo Quick Prep r f B CAL SO50 les tubes d extraction sont pr remplis avec le tampon d extraction Important Apr s extraction avec Smart Prep ou ScheBo Quick Prep centrifuger les tubes 5 minutes 3000 x g L extrait peut aussi tre transf r dans un tube Eppendorf de 2 mL et centrifug l aide d une micro centrifugeuse pendant 5 minutes 3000 x g R cup rer le surnageant dans un nouveau tube pr alablement identifi et poursuivre avec la proc dure ELISA PRELEVEMENT ET CONSERVATION DES ECHANTILLONS La mise en uvre de la proc dure n cessite 50 100 mg d chantillon natif de selles pour chaque extraction Le pr l vement de selles se fait dans des tubes ordinaires Elles se conservent au r frig rateur 2 80 au moi ns 6 jours Les extraits sont stables pendant au moins 7 jours 2 8 et au moins 24 mois 20 C Important Les chantilons doivent tre pr lev s sans additifs GAMME DE DOSAGE ELISA Le dosage peut tre mis en ceuvre selon la proc dure ELISA standard ou tendue Le choix d pend de la concentration en Calprotectine des chantillons Pour les chantillons dont la concentration ne d passe pas
71. est ndar de la absorbancia media y cruzando este valor con la curva est ndar obtenida en un nuevo ciclo L mite de cuantificaci n LoQ 10 ug g 10 muestras de heces distintas con valores de entre 5 2 y 1254 ug gde Calprotectina fueron ensayadas 20 veces en duplicados como un intraensayo Se calcularon para cada muestra el CV y los valores medios Se observ el LoQ a 15 CV El perfil de precision Figure 2 que resulta permite la medida exacta dentro de la gama est ndard a partir de 10 a 600 ug g Revision date 2014 08 14 Linealidad de la Diluci n 103 96 Se procedi a la extracci n de siete muestras de heces con elevados valores de Calprotectina seg n el procedimiento del ensayo Los extractos fueron diluidos con tamp n de incubaci n y posteriormente incubados de acuerdo con el protocolo Los valores esperados calculados a partir del valor observado obtenido con la primera diluci n se presentan en la Table 22 Recuperaci n de Spiking 100 96 Dos muestras de heces extra das fueron sometidas a spiking con distintas cantidades de suero humano diluido que conten a Calprotectina Las muestras fueron medidas antes y despu s del spiking seg n el procedimiento de ensayo Los valores se presentan en la Table 23 Reactividad cruzada 0 1 Tamp n de incubaci n con distintas cantidades de MRP8 y MRP14 recombinantes fu medido seg n el procedimiento de ensayo Los valores se presentan en Table 28 INTERVALO DE
72. fekti s behandelt werden und die entsprechenden Sicherheits vorkehrungen getroffen werden e Substrat und Stopp L sung Das Substrat B TMB12 enth lt Tetramethylbenzidin und Wasserstoff peroxid H203 Die Stopp L sung B STS12 enth lt 0 25 M Schwefels ure H gt SO Jeder dieser Reagenzien reizt die Augen die Haut und die Schleimhautmembranen Ber hrung mit den Augen der Haut und die Bekleidung vermeiden Nach Ber hrung sofort mit viel Wasser sp len e Ungebrauchte L sungen sollten gem ss der gesetzlichen Bestimmungen entsorgt werden TECHNISCHE VORSICHTSMASSNAHMEN Kit Komponenten e Auf Grund des Produktionsprozesses kann es R ckst nde in den Wells der Mikrotiterplatten haben Sie werden mit dem 1 Waschen Assaydurchf hrung Schritt 3 entfernt und haben keinen Einflu auf die Ergebnisse elesen Sie die Arbeitsanleitung sorgf ltig vor der Testdurchf hrung Die Testqualitat kann negativ beeinflusst werden wenn die Reagenzien nicht korrekt verd nnt oder ver ndert werden sowie nicht entsprechend der in dieser Anleitung angegebenen Lagerungsbedingungen gelagert werden e Die Reagenzien d rfen nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwendet werden e Mischen Sie nicht Reagenzien verschiedener Kitlots e Vermeiden Sie unter allen Umst nden dass es zu einer Kontamination zwischen verschiedenen Reagenzien Proben und zwischen den Wells kommt e Die Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur quilibrieren
73. fs il est important d homog n iser l int gralit des selles pes es dans le tampon d extraction Il convient galement d viter de contaminer le bouchon du tube Les substances non dissoutes non dig r es peuvent persister dans les tubes apr s l extraction Procedure de I ELISA e Le lavage est un point important de l ELISA Pour garantir la reproductibilit des r sultats il est n cessaire que le tampon de lavage incube chaque fois au minimum 20 secondes dans les puits de la plaque e Les laboratoires BUHLMANN recommandent lors de l utilisation d un laveur de plaque automatique le choix du mode Plaque avec lequel chaque tape B HLMANN fCAL ELISA remplissage aspiration est effectu e sur toute la plaque avant de passer l tape suivante De cette facon le temps d incubation minimum est garanti e Il est obligatoire de respecter le nombre de cycles de lavage pour l obtention de r sultats fiables L agitateur de plaque doit tre r gl 450 rpm 10 Hz Une fr quence de rotation sup rieure peut avoir pour cons quence une faible lin arit de dilution pour les valeurs comprises entre 300 900 et 600 1800 ug g Le mode orbital est pr f rable au mode r ciproque e Le temps d incubation de l tape 5 ne doit pas tre inf rieur 30 minutes pour assurer l interaction compl te entre l antig ne et l anticorps Des temps d incubation un peu plus longs jusqu 5 minutes n ont pas d influence sur
74. g g s o indicativos de doen a org nica ativa com inflama o no trato gastrointestinal Sugere se procedimentos investigativos e curativos apropriados por especialistas O n vel de corte sugerido para adultos 50 ug g podem tamb m ser usados por crian as de 4 a 17 anos independente de sexo ref 9 INTERPRETA O DOS RESULTADOS A avalia o da calprotectina fecal uma forma confi vel e f cil de distinguir doen a org nico das gastrointestinais funcionais Num estudo cl nico 401 pacientes sintom ticos previstos para colonoscopia foram investigados Exames endosc picos mostraram que dos 273 pacientes com doen as funcionais 128 pacientes tinham diversas doen as org nicas colite doen a de Crohn lceras diverticulite p lipos adenomas c ncer ou doen as infecciosas ref 12 A an lise da curva AUC 0 935 caracter stica de opera o do receptor COR resultou em um corte cl nico timo em 50 ug g Aplicando se este corte uma Revision date 2014 08 14 CONTROLE DE QUALIDADE Compreens o exaustiva desta instru o torna se necess ria para a utiliza o bem sucedida do produto Resultados confi veis ser o obtidos somente com as t cnicas precisas de laborat rio e a correta utiliza o de um Guia de Boas Praticas seguindo com exatid o esta instru o de uso Como n o existe controle da extra o de calprotectina dispon vel comercialmente recomenda se o uso de uma amostra de extr
75. harmacol Ther 28 1221 1229 2008 Manz M et al Value of fecal calprotectin in the evaluation of patients with abdominal discomfort an observational study BMC Gastroenterology 12 5 2012 Jahnsen J Reseth AG Aadland E Measurement of calprotectin in faeces Tidsskr Nor Legeforen 128 743 5 2008 B HLMANN fCAL ELISA APPENDIX Il TABLES TABELLEN TABLES TABELLE TABLAS LOWER RANGE PROCEDURE 10 600 ug g Table 19 Example of Results Figure 1 Example of a Standard Curve Conc Absorb Calc Conc CV Conc ug g OD ug g Blank Avg 0 096 Cal A 10 0 073 2 EN Cal A 10 0 066 Cal A Avg 10 0 069 7 2 Cal B 30 0 143 re cau ue Gell Cal B 30 0 153 Cal B Avg 30 0 148 4 8 E Cal C 100 0 465 A TTT TTT A ae ae a Cal C 100 0 456 5 Cal C Avg 100 0 460 1 4 V Mew A LE Cal D 300 1 121 Cal D 300 1 135 Cal D Avg 300 1 128 0 9 ot Cal E 600 1 658 100 Cal E 600 1 671 eh Cal E Avg 600 1 664 0 6 9 STD CAL t ys OD M 0 Rm Er P ie ES Ctrl Low 0 201 41 Curve Fit Option Fixed Weight Value Ctrl Low 0 189 39 Ctrl Low Avg 0 195 40 4 4 Ctrl High 0 598 134 Ctrl High 0 583 130 Ctrl High Avg 0 590 132 1 8 Table 20 Intra Assay Prec
76. i n de interrupci n en todos los pocillos Elimine las burbujas de aire con la punta de una pipeta Contin e con el paso 13 al cabo de 30 minutos como m ximo 13 Lea la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de microtitulaci n B HLMANN fCAL ELISA RESULTADOS Y CALCULOS Lea la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de microtitulaci n para cada pocillo del calibrador y del blanco para cada una de las muestras y de los controles reste el pocillo del blanco y registre la absorbancia corregida Lea la concentraci n de Calprotectina utilizando un algoritmo de cuatro par metros INTERVALO DE MEDICION BAJO 10 600 ug g Las concentraciones de los calibradores A al E para el procedimiento ELISA de rango bajo son 10 30 100 300 y 600 ug g de Calprotectina Los factores de diluci n addicionales deben ser multiplicados por los resultados para obtener las concentraciones finales V anse Table 19 y Figure 1 de datos caracteristicos resultados curva de calibraci n Atenci n Estos resultados y la curva de calibraci n se prove n solamente paraprop sitos de demostraci n La curva de calibraci n debe ser confeccionada cada vez que se analizan nuevas muestras INTERVALO DE MEDICI N 30 1800 ug g Las concentraciones de los calibradores A al E para el procedimiento ELISA de rango extendido son 30 90 300 900 y 1800 ug g de Calprotectina Los factores de diluci n addicionales deben ser multiplicad
77. idasa de R bano HRP detecta las mol culas de Calprotectina unidas al anticuerpo monoclonal que recubre la placa Tras la incubaci n y un nuevo paso de lavado se afiade tetrametilbenzidina TMB formaci n de color azul seguido de una soluci n de interrupci n cambia a color amarillo La absorci n se mide a 450 nm REACTIVOS INCLUIDOS Y PREPARACI N ALMACENAMIENTO Y DURACI N DE LOS REACTIVOS Reactivos antes de abrir Almacenar a 2 8 No utilizar el kit despu s de la fecha de caducidad impresa en las etiquetas Reactivos abiertos reconstituidos Almac nese a 2 8 hasta la fecha de caducidad Guarde inmediatamente las filas que no ha utilizado en la bolsa de aluminio que contiene los sacos desecantes y vuelva a cerrarla completamente por toda la cremallera Almac nese a 2 80 hasta la fecha de caducidad Almac nese hasta 6 meses a 2 80 Tamp n de extracc on Microplaca Tamp n de lavado Tamp n de incubaci n Calibradores Controles Almac nese a 2 8 hasta la fecha de Marcador enzim tico caducidad Substrato de TMB Soluci n de interrupci n Table 14 REACTIVOS SUMINISTRADOS PREVIO PEDIDO Tubos deextracci n de heces Embalajes con 50 o 200 A Reconstituci Dispositivos dispositivos cada uno rellenado B CALEX C50 Reactivos EK CAL EK CAL2 C digo CALEX Cap con tamp n
78. ine Standardkurve ansetzen MESSBEREICH 30 1800 ug g Wenn Sie die Extended Range ELISA Variante benutzen m ssen Sie die folgenden Kalibratorkonzentrationen in das ELISA Protokoll eingeben 30 90 300 900 und 1800 ug g Calprotectin Zus tzliche Verd nnungsfaktoren m ssen mit den Ergebnissen multipliziert werden um die Endergebnisse zu erhalten In Table 24 und Figure 3 sind Beispiele f r Ergebnisse und Standardkurve angegeben Diese Ergebnisse und die Standardkurve sind nur als Beispiel gedacht Sie m ssen f r jeden Ansatz eine Standardkurve ansetzen B HLMANN fCAL ELISA LEISTUNGSMERKMALE Die Leistungsmerkmale wurden in Doppelbestimmung evaluiert MESSBEREICH 10 600 ug g Intra Assay Precision 4 7 Die Intra Assay Pr zision wurde bestimmt durch die 20 fache Doppelmessung von je drei extrahierten Stuhlproben im gleichen Ansatz der entsprechend der Arbeitsanleitung durchgef hrt wurde Die Ergebnisse sind in Table 20 dargestellt Inter Assay Precision 15 Die Inter Assay Pr zision wurde bestimmt durch die Messung von 5 extrahierten Stuhlproben Die Aliquots wurden getestet entsprechend der Testanleitung in 10 verschiedenen L ufen durchgef hrt von drei Laboranten unter Verwendung von 2 Kit Lots in zwei Labors Die Ergebnisse sind in Table 21 dargestellt Nachweisgrenze LoB 10 ug g Zwanzig Doppelmes sungen mit Inkubations Puffer wurden in einem Testansatz getestet Mittelwert und Standardab
79. io valori sono presentati in Table 25 Precisione Inter Saggio lt 15 La precisione inter saggio media della procedura ELISA stata calcolata da 5 campioni di estratti fecali Le aliquote sono state dosate con la procedura prevista per il dosaggio in 10 diverse sedute da tre tecnici utilizzando 2 lotti del kit in due diversi laboratori valori sono presentati in Table 26 Limite di Guantificatione LoQ 30 ug g 18 campioni di feci con valori di Calprotectina compresi tra 10 8 e 2080 ug g sono stati analizzati 20 volte in duplicato in un unica seduta Per ciascun campione sono stati calcolati il CV in e i valori medi Il LoQ stato calcolato al 15 di CV Il profilo di precisione osservato consente determinazioni precise entro l intero range standard da 30 a 1800 ug g risultati sono riportati in Figure 4 Linearit di diluizione 102 Cinque campioni di feci con concentrazioni elevate di Calprotectina sono stati estratti con la procedura prevista per il saggio Gli estratti sono stati diluiti con tampone di incubazione e successivamente dosati con la procedura prevista per il saggio I valori attesi sono stati calcolati a partire dal valore osservato rilevato con la prima diluizione valori sono presentati in Table 27 diverticolite e una IBD in fase di remissione La bassa risposta infiammatoria mostrata in questo range pu suggerire di ripetere la misurazione e di effettuare ulteriori investigazioni Valori
80. ision Table 22 Dilution Linearity Parallelism Mean D V PRES Observed Expected O E Sample ed iod d Sample Dilution ug al ug g Le 1 200 405 low 52 5 1 4 2 7 1 400 182 202 90 medium 173 8 5 6 3 2 1 800 95 101 94 high 408 5 33 0 8 1 81 1 1600 49 51 98 1 3200 25 25 99 nd 1 6400 15 6 12 7 123 1 12800 6 6 6 3 104 Table 21 Inter Assay Precision Mean 101 Mean SD CV 1 50 232 E Sample ug g ug g 1 100 124 116 107 1 200 61 58 106 3 74 3 7 9 10 7 Mean 98 Sample 4 227 15 0 6 6 1 400 290 Sample 5 520 57 8 11 1 1 800 145 145 100 11 3 sh 1 1600 73 72 100 1 3200 39 36 106 Figure 2 Precision Profile 1 6400 19 18 103 Mean 103 S4 Mean 100 55 124 o S6 Mean 88 N S7 Mean 106 5 15 CV gt Table 23 Spiking Recovery a spiked with Observed Expected O E E Sample 099 Leg ug ug E E 10 13 6 15 3 88 9 30 33 6 35 3 95 2 100 101 105 96 1 100 S1 SS 150 147 155 94 5 Calprotectin ug g 300 287 305 94 1 400 468 405 115 4 Mean 97 4 10 32 9 34 6 95 1 30 49 2 54 6 90 1 24 6 100 139 125 111 5 S2 i 150 176 175 100 5 300 358 325 110 3 400 467 425 109 9 Mean 103 Revision date 2014 08 14 31 36 BUHLMANN fCAL ELISA Table 24 Example of Results Conc Absorb Calc Conc CV Conc ug g OD ug g Blank Avg 0 057 Cal A 30 0 047 Cal A 30 0 046 Cal A Avg 30 0 047 0 9
81. lassen und mischen vortexen e Mikrotiterstreifen d rfen nicht wiederverwendet werden Extraktion e Um die Extraktion quantitativ durchzuf hren ist es wichtig dass die eingewogene Stuhlprobe vollst ndig homogenisiert wird Kontaminationen am oberen Rand des Extraktionsr hrchens sollten vermieden werden unl sliche unverdaute Bestandteile k nnen auch nach der Extraktion vorhanden sein ELISA e Die korrekte Durchf hrung der in der Arbeitsvorschrift beschriebenen Waschschritte ist essentiell um reproduzierbare Resultate zu garantieren Eine minimale Inkubationszeit des Waschpuffers in der Kavit t von mindestens 20 Sekunden muss bei jedem Waschschritt eingehalten werden e Wird ein Waschautomat eingesetzt muss der Platten Modus gew hlt werden Das heisst dass jeder Schritt Einf llen erst ber die gesamte Platte ausgef hrt wird bevor der n chste Schritt Absaugen gestartet wird Somit kann die minimale Inkubationszeit gew hrleistet werden B HLMANN fCAL ELISA e Die angegebene Anzahl von Waschschritten muss eingehalten werden um reproduzierbare Resultate zu gew hrleisten Der Mikrotiterplattensch ttler muss auf ca 450 rpm 10 Hz eingestellt sein Eine h here Rotationsgeschwindigkeit kann zu einer schlechteren Verdunnungslinearit t bei Werten zwischen 300 900 und 600 1800 ug g f hren Eine Rotationsbewegung sollte einer Horizontalbewegung vorgezogen werden e Damit die Antigen Antik rp
82. lles sont incub s pendant 30 minutes temp rature ambiante Apr s une tape de lavage le second anticorps Ac conjugu la p roxydase de raifort HRP se fixe la mol cule de calprotectine li e l Acm Apr s une incubation et un lavage le substrat TMB t tram thylbenzidine est ajout aux puits La r action enzymatique permet d obtenir une coloration bleue Elle est stopp e par l ajout d une solution acide H2SO La couleur bleue vire au jaune La mesure de l absorbance 450 nm est directement proportionnelle la concentration de calprotectine REACTIFS FOURNIS ET PREPARATION 11 36 R actifs EK CAL EK CAL2 Code Reconstitution Quantit Tampon 3 flacons 6 flacons POM d extraction de125mL _ 125 P CAL EX Pr t l emploi Microplaque Coat e avec un 2x8x12 B CAL BET Acm anti 8 x 12 puits puits MP Pr te l emploi Calprotectine Films adh sifs 3 pi ces 6 pi ces de A reconstituer concentr 10x 1 flacon 2 flacons B CAL avec 900 mL Avec de 100 mL de 100mL WB d eau d ionis e conservateurs d incubation 2 flacons de 3 flacons de EST Avec 125 mL 125 mL B CAL IB Pr t I emploi conservateurs Calibrateurs A EI Calprotectine 5 flacons de 1 5 flacons de B CAL EER dans un tampon mL 1mL CASET Pr ts l emploi prot ique avec conservateurs Contr les bas et lev 2 flacons
83. meno 24 mesi Attenzione ll campione deve esser raccolto senza alcun additivo chimico o biologico presente nel dispositivo RANGE DI MISURAZIONE ELISA Il dosaggio pu essere effettuato con le seguenti procedure procedura ELISA a basso range o a range esteso La scelta dell una o dell altra procedura dipende dalla concentrazione di Calprotectina attesa dei campioni Per campioni fino a 600 ug g scegliere la procedura a basso range range di misurazione 10 600 ug g Se le concentrazioni dei campioni tendono a superare i 600 ug g scegliere la procedura a range esteso range di misurazione 30 1800 ug g _ STANDARDIZZAZIONE Il kit BUHLMANN fCAL ELISA calibrato con la MRP8 14 purificata da granulociti umani PROCEDURA DI ESTRAZIONE DI CAMPIONI DI FECI Procedura d estrazione standard 1 Etichettare e pesare tarare la provetta di polipropilene vuota insieme all ansa per inoculazione 2 Prelevare da 50 a 100 mg del campione di feci mediante l ansa per inoculazione e metterlo nella provetta prepesata 3 Calcolare il peso netto del campione spezzare l ansa per inoculazione e lasciare la parte finale dell ansa nella provetta 4 Aggiungere il Tampone d estrazione corrispondente alla formula x mg di feci x 49 y ul tampone d estrazione per es 50 mg di feces 2450 ul tampone d estrazione alla provetta e chiuderla 5 Omogenizzare il campione in un vortex per provette scuotendo vigorosamente velocit
84. mente con molta acqua PRECAUZIONI TECNICHE Reagenti del kit e Residui rimasti nei pozzetti causati dal processo di produzione vengono completamente eliminati dai lavaggi durante la procedura descritta e non compromettono in alcun modo i risultati fare riferimento al punto 3 della Procedura del Dosaggio Test e Leggere attentamente le istruzioni prima di eseguire il test Le prestazioni del test subiranno un effetto negativo se si utilizzano reagenti diluiti in modo errato modificati conservati diversamente da come specificato nelle presenti istruzioni per l uso componenti non devono essere utilizzati dopo la data di scadenza riportata sulle etichette e Non miscelare reagenti appartenenti a lotti diversi e Assicurarsi che non si verifichino cross contaminazioni tra reagenti campioni o tra pozzetti e Lasciare che i reagenti raggiungano la temperatura ambiente Miscelare bene agitare con il vortex i reagenti prima dell uso e Le strip non possono essere riutilizzate Estrazione e Per ottenere risultati quantitativi importante omogeneizzare l intero campione di feci nel tampone di estrazione Evitare la contaminazione nella parte alta del dispositivo componenti non solubili non digerite possono ancora trovarsi nel dispositivo dopo l estrazione Procedura del dosaggio ELISA e Nella procedura del dosaggio ELISA i passaggi del lavaggio sono essenziali per garantire la riproducibilit dei risultati Un te
85. mp o de extrag o no tubo e feche o 5 Homogene ze a amostra num vortex multitubos com uma agitac o vigorosa na maior velocidade durante 30 minutos 6 Transfira o homogeneizado para um tubo Eppendorf de 2 mL e centrifugue numa minicentrifuga durante 5 minutos a 3 000 x g 7 Leve o sobrenadante para um tubo fresco etiquetado e continue com o procedimento ELISA Procedimentos de extrac o usando dispositivos de extrac o fecal O procedimento de extra o est descrito e ilustrado nas instruc es de uso fornecidas com o respectivo dispositivo de extrac o 1 Dispositivo CALEX Cap C digo B CALEX C50 B CALEX C200 Os tubos de extrac o s o previamente preenchido com 5 mL tamp o de extrac o Revision date 2014 08 14 27 36 PROCEDIMENTO ELISA Importante Permitir que os reagentes estejam entre 18 28 C antes de usar Diluir apenas o extrato de fezes Calibradores e controles est o prontos para o uso 1 DILUIC O DA AMOSTRA DE FEZES Faixa de trabalho de 10 600 ug g 1 1 Procedura pesagem manual Smart Prep ou ScheBo Quick Prep Diluir os sobrenadantes 1 50 com tamp o de incubac o por exemplo 20 uL do extrato e 980 uL de tamp o de incuba o e misture bem Deixe as amostras estabilizarem durante pelo menos 5 minutos a 18 28 C antes de se prosseguir para a etapa 4c 1 2 Dispositivo CALEX Cap Diluir os sobrenadantes 1 5 com tamp o de incubac o por exemplo 100 mL do extrato e 400 mL
86. mpo minimo di incubazione di almeno 20 secondi del tampone di lavaggio nei pozzetti deve essere eseguito in ogni passaggio e Usando un lavatore automatico Buhlmann suggerisce vivamente di usare il PLATE MODE ossia erogazione aspirazione sequenziale su tutte le strip cos che il tempo minimo di incubazione sia garantito e E importante che il numero di lavaggi consigliato sia rispettato per assicurare la riproducibilit dei risultati e L agitatore per le micropiastre deve essere impostato ad una velocit di 450 rpm lt 10 Hz Una frequenza di rotazione superiore potrebbe causare una scarsa linearit nelle diluizioni per valori tra 300 900 e 600 1800 ug g Il movimento circolare dell agitatore preferibile a quello latero laterale B HLMANN fCAL ELISA e Per assicurare la reazione completa antigene anticorpo il periodo d incubazione al punto 5 della procedura deve essere di almeno 30 min Un incubazione moderatamente pi lunga fino a 5 minuti non influenza la procedura e marcatore enzimatico inattivato con ossigeno ed altamente sensibile alla sodio azide al thimerosal all acido ipocloroso ed ai cloroidrocarboni aromatici che spesso si trovano nei rifornimenti d acqua di laboratorio Di conseguenza usare solo acqua deionizzata di elevata qualit e Dal momento che le condizioni variano da saggio a saggio si deve creare una nuova curva standard ogni volta che viene eseguito una nuova analisi Si co
87. n nifios y adultos Por lo tanto sepuede utilizar el valor de corte 50 ug g recomendado para adultos tambien para ni os de 4 a 17 a os de edad ref 8 Las concentraci nes de Calprotectina en reci n nacidos son considerablemente elevadas ref 9 Estos datos respaldan la siguiente interpretaci n de los resultados Valores normales por debajo de 50 ug g Estos valores de calprotectina 50 ug g no son indicativos de inflamaci n del tracto gastrointestinal No es probable que pacientes con niveles bajos de Calprotectina fecal precisen de procedimientos invasivos adicionales para determinar la causa de la inflamaci n ref 12 Valores elevados entre 50 y 200 ug g Los valores de calprotectina entre 50 y 200 ug g pueden ser representativos de un trastorno org nico leve tal como inflamaci n originada por AINE diverticulitis leve o en fase de remisi n La baja respuesta inflamatoria mostrada dentro de ese intervalo puede sugerir la repetici n de la medida y la realizaci n de investigaciones adicionales Valores elevados por encima de 200 ug g Los valores de calprotectina gt 200 ug g son indicativos de un trastorno org nico activo con inflamaci n del tracto gastrointestinal Sugieren llevar a cabo investigaciones adicionales apropiadas y procedimientos curativos por parte de especialistas El nivel de corte sugerido para adultos 50 ug g se puede utilizar tambi n para nifios de entre 4 y 17 afios de edad con indepen
88. n utilizzare oltre la data di scadenza stampata sulle etichette Reagenti aperti ricostituiti Tampone per estrazione Conservare a 2 8 fino alla data di scadenza Riporre immediatamente le strip non utilizzate nella busta di alluminio che contiene l essiccante e risigillarle Conservarle fino a 2 mesi a 2 8 Micropiastra Tampone di Lavaggio Diluito Conservare fino a 6 mesi a 2 80 Tampone di Incubazione Calibratori Controlli Conservare a 2 8 fino alla data di scadenza Marcatore Enzimatico Substrato TMB Soluzione di Stop Table 11 REAGENTI FORNITI SU RICHIESTA Dispositivi di estrazione delle feci Dispositivi Unit da 50 o am E a B CALEX C50 ciascuno riempito con tampone di Cap estrazione 5 mL pronto all uso B CALEX C200 Smart Prep 50 dispositivi spatole e camere di B CAL RD raccolta feci ScheBo 50 dispositivi costituiti da provetta x cono amp tappo dosatore B CAL SOFI Quick Prep 1 3 mL Pronto all uso Table 12 MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI Procedura di estrazione e Anse per inoculazione da 10 uL e Provette di polipropilene con tappi a vite da 15 mL necessarie per procedura di estrazione standard dispositivi di estrazione vedi sopra e Cappa a flusso laminare e Vortex per provette e Bilancia di Precisione 10 150 mg e Microcentrifuga gt 3000 x e Centrifuga 500 x g
89. nm in un lettore per micropiastre per ognuno dei calibratori controlli e campioni e con un modello di regressione logistica 4 parametri calcolare la concentrazione di Calprotectina dei campioni Revision date 2014 08 14 19 36 CARATTERISTICHE DEL TEST RANGE DI MISURAZIONE 10 600 ug g Le caratteristiche di prestazione del dosaggio sono state convalidate in duplicato Precisione Intra Saggio 4 7 La precisione intra saggio stata calcolata sui risultati di 20 duplicati di valori da 3 campioni di estratto fecale dosati in un unica seduta secondo la procedura del saggio valori sono presentati in Table 20 Precisione Inter Saggio lt 15 La precisione inter saggio media della procedura ELISA stata calcolata su 5 campioni di estratti fecali Le aliquote sono state dosate con la procedura prevista per il dosaggio in 10 diverse sedute da tre tecnici utilizzando 2 lotti del kit in due diversi laboratori valori sono presentati in Table 21 Limite del Bianco 10 ug g Venti duplicati di Tampone d Incubazione sono stati dosati in un unica seduta La media e la deviazione standard sono state calcolate per i valori di assorbanza La dose minima rilevabile di Calprotectina stata calcolata nettamente al di sotto del Calibratore A 10 ug g aggiungendo due deviazioni standard al assorbanza media e intersecando questo valore con la curva standard ottenuta in una nuova seduta Limite di Quantificatione LoQ
90. nsiglia un allineamento verticale e Se la concentrazione iniziale di un campione non noto maggiore del Calibratore E il campione deve essere ulteriormente diluito con il Tampone d Incubazione e dosato ancora secondo procedura Il fattore di diluizione applicato dovr essere preso in considerazione per i calcoli finali Importante Dopo l estrazione centrifugare il dispositivo CALEX Cap per 5 min a 500 x ge proseguire con la procedura del test 2 Sistema di estrazione delle feci Roche Codice 10745804322 o BUHLMANN Smart Prep Codice B CAL RD E possibile ridurre il tempo di estrazione con vortex a 1 min 3 ScheBo Quick Prep Codice B CAL SOFI Le provette di estrazione sono gi riempite con tampone di estrazione Importante Dopo l estrazione con Smart Prep e ScheBo Quick Prep centrifugare le provette per 5 minuti a 3000 g Alternativamente trasferire l omogenato in una provetta di Eppendorf da 2 mL e centrifugare in microcentrifuga per 5 minuti a 3000 x g Decantare il surnatante in una nuova provetta con etichetta e proseguire con la procedura del test RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Se si utilizzano i dispositivi di estrazione necessario meno di 1g di feci originali per la procedura di estrazione Raccogliere il campione di feci in provette o contenitori e conservarlo refrigerato a 2 8 per almeno 6 giorni Gli estratti sono stabili a 2 8 per almeno 7 giorni e a lt 20 per al
91. o de lavagem por po o Esvazie os po os e bata a placa firmemente contra o papel absorvente Importante Para cada uma das tr s etapas de lavagem deve ser garantido um tempo m nimo de incuba o de pelo menos 20s para o tamp o de lavagem nos po os Ver Cuidados T cnicos Procedimento ELISA 4a Pipete 100 uL de tamp o de incuba o bruto Pipete 100 uL de calibrador A E nos respectivos po os 4b Pipete 100 uL de controles baixo e alto nos respectivos po os 4c Pipete 100 pL de cada amostra dilu da nos po os subsequentes 5 Cubra a placa com um selador de placas e deixe incubar durante 30 5 minutos em um rotador de placas a 450 rpm a 18 28 C veja Cuidados T cnicos Procedimento ELISA 6 Remova e descarte o selador de placa Esvazie os po os e lave tr s vezes usando pelo menos 300 uL de tamp o de lavagem por po o veja Cuidados T cnicos Procedimento ELISA Esvazie os po os e bata a placa firmemente no papel absorvente 7 Pipete100 uL de Enzima em cada po o 8 Cubra a placa com um selador de placas e deixe incubar por 30 5 minutos em um rotador de placa a 450 rpm a 18 28 C 9 Remova e descarte o selador de placas Esvazie os po os e lave cinco vezes usando pelo menos 300 uL de tamp o de lavagem por poco Esvazie os pocos e bata a placa firmemente contra o papel absorvente Importante D tempo para que a solug o de substrato TMB se equilibre a 18 28 C 10 Pipete 100 uL d
92. oglio sigillante proteggere la piastra dalla luce diretta ed incubarla per 15 2 minuti su un mixer impostato a 450 rpm a 18 28 12 Dispensare 100 uL di Soluzione di Stop in tutti i pozzetti Eliminare le bolle d aria con un puntale Procedere al punto 13 entro 30 minuti 13 Leggere lassorbanza a 450 nm in un lettore per micropiastre RANGE DI MISURAZIONE 10 600 ug g Se si sceglie la procedura ELISA a basso range si dovr far riferimento alle seguenti concentrazioni di calibratori 10 30 100 300 e 600 ug g di Calprotectina Ulteriori fattori di diluizione devono essere moltiplicati con i risultati per ottenere i risultati finali Per dati di riferimento vedere Table 19 e Figure 1 risultati e curva standard Questi risultati e la curva standard sono forniti a solo scopo dimostrativo Una curva standard deve essere generata per ogni set di campioni RANGE DI MISURAZIONE 30 1800 ug g Se si sceglie la procedura ELISA a range esteso si dovr far riferimento alle seguenti concentrazioni di calibratori 30 90 300 900 e 1800 ug g di Calprotectina Ulteriori fattori di diluizione devono essere moltiplicati con i risultati per ottenere i risultati finali Per dati di riferimento vedere risultati e curva standard Questi risultati e la curva standard sono forniti a solo scopo dimostrativo Una curva standard deve essere generata per ogni set di campioni RISULTATI E CALCOLO Leggere l assorbanza a 450
93. ontrollen und verd nnten Proben best cken Ungebrauchte Streifen vom Halter entfernen und unverz glich mit Trockenmittel einpacken und gek hlt lagern 3 Kavit ten zweimal mit jeweils 2300 uL Waschpuffer waschen Waschpuffer aussch tten und Platte durch Ausschlagen auf saugf higem Papier sorgf ltig trocknen Wichtig Eine minimale Inkubationszeit des Waschpuffers in der Kavit t von 20 Sekunden muss bei allen drei Waschschritten eingehalten werden siehe technische Vorsichtsmassnahmen ELISA 4a 100 uL Inkubationspuffer pipettieren Blank in die entsprechende Kavit t pipettieren Je 100 uL Kalibrator A E in die entsprechenden Kavit ten pipettieren 4b Je 100 Kontrolle Tief und Hoch in die entsprechenden Kavit ten pipettieren 4c Je 100 uL der verd nnten Proben in die n chsten Kavit ten pipettieren 5 Mikrotiterplatte mit einer Folie abdecken und auf einem Mikrotiterplattensch ttler bei 450 rpm 30 5 Revision date Minuten bei 18 28 inkubieren siehe technische Vorsichtsmassnahmen ELISA 6 Abdeckfolie entfernen die Kavit ten entleeren und 3x mit jeweils 2300 uL Waschpuffer waschen siehe technische Vorsichtsmassnahmen ELISA Platte durch Ausschlagen auf saugf higem Papier sorgf ltig trocknen 7 _ 100 uL Enzym Marker zu allen Kavit ten zugeben 8 Mikrotiterplatte mit einer Folie abdecken und auf einem Mikrotiterplattensch ttler bei 450 rpm 30 5 Min bei 18 28 inkubieren 9
94. oratorio actuales y siguiendo cuidadosamente estas instrucciones de uso Dado que no hay un control de extracci n para Calprotectina disponible comercialmente recomendamos el uso de un pool de extractos fecales que den positivo para Calprotectina para el control de calidad interno La reproducibilidad de los par metros de la curva est ndar y de los valores de control debe encontrarse dentro de los l mites establecidos de aceptabilidad del laboratorio Los l mites de confianza para los controles son espec ficos del lote y est n impresos en la hoja de datos de control de calidad adicional Si la precisi n del ensayo no se correlaciona con los limites establecidos y la repetici n excluye errores de la t cnica compruebe los siguientes aspectos i instrumentos de pipeteado control de temperatura y tiempo ii ajustes del lector de ELISA iii fechas de caducidad de los reactivos iv condiciones de almacenamiento e incubaci n v la soluci n substrato con TMB debe ser incolora vi pureza del agua LIMITACIONES e Los reactivos suministrados con este kit est n optimizados para medir Calprotectina en heces elos resultados del ensayo deben interpretarse considerando la informaci n disponible de estudios epidemiol gicos la evaluaci n cl nica del paciente y otros procedimientos de diagn stico Revision date 2014 08 14 25 36 REAGENTES FORNECIDOS E PREPARAC O Reagentes
95. os por los resultados para obtener las concentraci nes finales V anse Table 24 y Figure 3 de datos caracter sticos resultados y curva de calibraci n Atenci n Estos resultados y la curva de calibraci n se prove n solamente paraprop sitos de demostraci n La curva de calibraci n debe ser confeccionada cada vez que se analizan nuevas muestras CARACTER STICAS DE EFICIENCIA Las caracter sticas de rendimiento del an lisis han sido validadas por duplicado INTERVALO DE M DICION BAJO 10 600 ug g Precisi n Intraensayo 4 7 La precisi n intraensayo se calcul a partir de los resultados de 20 pares de valores de 3 muestras deheces extra das ensayadas en un solo ciclo seg n el procedimiento del ensayo Los valores se presentan en la Table 20 Precision interensayo 15 La precisi n media interensayo del ELISA se calcul para cinco muestras de extractos de heces Las al cuotas se analizaron de acuerdo con el procedimiento del ensayo con 10 repeticiones diferentes por tres t cnicos de laboratoriousando 2 lotes de kits en dos laboratorios distintos Los valores se presentan en la Table 21 L mite para el blanco LoB 10 ug g Se ensayaron veinte duplicados de tamp n de incubaci n en un Unico ciclo Se calcul la desviaci n de est ndar y media para los valores de absorbancia Se calcul que la dosis m nima detectable de Calprotectina estaba por debajo del Calibrador A 10 ug g m s dos desviaciones
96. pportano le seguenti raccomandazioni per l interpretazioni dei risultati Valori normali sotto i 50 ug g valori di Calprotectina 50 ug g non sono indicativi di una infiammazione del tratto gastrointestinale Per pazienti con bassi livelli di Calprotectina probabilmente non sono necessarie ulteriori procedure invasive per determinare le cause dell infiammazione ref 12 Valori elevati compresi tra i 50 e i 200 ug g valori di Calprotectina compresi tra i 50 e i 200 ug g possono rappresentare una debole malattia organica come una infiammazione causata da NSAID una debole Revision date 2014 08 14 CONTROLLO DI QUALITA Per un uso efficace del prodotto necessaria un approfondita comprensione di queste istruzioni Si otterranno risultati attendibili soltanto attraverso l utilizzo di precise tecniche di laboratorio attuali linee guida e seguendo accuratamente queste istruzioni per l uso Dal momento che non esiste in commercio un controllo di qualit esterno per Calprotectina si consiglia l uso di un pool di estratti positivi per il controllo di qualit interno La riproducibilit dei parametri della curva standard e dei valori di controllo deve rientrare entro determinati limiti di accettabilit del laboratorio limiti di confidenza per i Controlli sono lotto specifici e riportati sul Foglio Dati di QC aggiunto al kit Se la precisione del dosaggio non correla con i limiti stabiliti e la ripetizione esclude errori
97. ractus gastro intestinal Les patients ayant une faible concentration de Calprotectine f cale ne n cessitent donc pas d intervention invasive pour d terminer la cause de l inflammation r f 12 Valeurs lev es entre 50 et 200 ug g Des valeurs de Calprotectine entre 50 et 200 ug g peuvent avoir pour origine une maladie organique telle qu une inflammation caus e par les AINS une diverticulite non s v re ou un syndr me de l intestin irritable en phase de r mission En pr sence d une inflammation de faible intensit il est recommand de r p ter la mesure et de r aliser des tests compl mentaires Valeurs lev es sup rieures 200 ug g Des valeurs de Calprotectine 2200 ug g indiquent une maladie de type organique active avec inflammation du tractus gastro intestinal ll est sugg r de r aliser des examens compl mentaires et de mettre en place un traitement curatif sous le suivi de m decins sp cialistes La valeur seuil propos e pour les adultes 50 ug g peut galement tre utilis e comme r f rence chez les enfants g s de 4 17 ans quel que soit le sexe r f 9 15 36 CONTROLE QUALITE Une lecture exhaustive de ce manuel est recommand e pour l utilisation correcte du produit Des r sultats fiables ne seront obtenus que par un travail en laboratoire pr cis bonnes pratiques de laboratoire usuelles et en suivant fid lement les recommandations de cette brochure Comme il n existe pas de con
98. rd nnung wurde eine Gesamtverd nnung von 1 2500 bei den Konzentrationen der Kalibratoren A E bereits ber cksichtigt Sie werden f r die Lower Range ELISA Variante folgendermassen angegeben 10 30 100 300 und 600 ug g Calprotectin Wenn Sie die Extended Range ELISA Variante verwenden geben Sie die folgenden Kalibratorkonzentrationen in das entsprechende ELISA Auswerteprotokoll ein 30 90 300 900 und 1800 ug g Calprotectin 39 Die Kontrollen enthalten Lot abh ngige Konzentrationen von nativem humanem Calprotectin Die genauen Konzentrationen werden auf dem QC Datenblatt angegeben e Mikrotiterplattensch ttler siehe technische Vorsichts massnahmen e Saugf higes Papier e Mikrotiterplatten Photometer mit optischem Filter 450 nm LAGERUNG UND HALTBARKEIT DER REAGENZIEN Unge ffnete Reagenzien Bei 2 8 lagern Zu verwenden bis zum Verfallsdatu m angegeben auf der Packungsetikette Ge ffnete rekonstituierte Reagenzien Extraktions Puffer Bis zum Verfallsdatum bei 2 8C lagern Ungebrauchte Streifen sofort in die mit Trockenmittel Mikrotiterplatte versetzte Packung zur ckbringen Packung gut ver schliessen Bei 2 8 bis zum Verfallsdatum haltbar Waschpuffer Bei 2 8 bis 6 Monate nach der Verd nn ung lagern Inkubations Puffer Kalibratoren Kontrollen Bis zum Verfallsdatum bei 2 8 lagern Enzym Marker TMB Substrat Stopp L sung
99. rechend der Formel x mg Stuhl x 49 y ul Extraktionspuffer z B 50 mg Stuhl 2450 ul Extraktionspuffer ins R hrchen geben und verschliessen 5 Die Probe in einem Multi Tube Vortex Mixer durch starkes Sch tteln h chste Geschwindigkeit 30 Minuten extrahieren 6 Das Homogenat in ein 2 mL Eppendorf R hrchen berf hren und f r 5 Min bei 3000 x g in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren 7 Den berstand in ein frisches angeschriebenes R hrchen geben und den ELISA durchf hren Revision date 2014 08 14 8 36 MESSBEREICHE Der Test kann entweder nach der Anleitung f r den unteren Konzentrationsbereich Lower Range ELISA Variante oder der Anleitung f r den erweiterten Messbereich Extended Range ELISA Variante durchgef hrt werden Welche Version Sie w hlen sollten h ngt von der erwarteten Calprotectin Konzentration der Proben ab F r Proben bis zu 600 ug g sollte die Anleitung Messbereichsverfahren 10 600 ug g verwendet werden Wenn die Konzentration der Proben jedoch h ufig oberhalb von 600 ug g liegt raten wir zu dem erweiterten Messbereichsverfahren 30 1800 ug g B HLMANN fCAL ELISA ASSAYDURCHFUHRUNG Wichtig Vor der Verwendung der Reagenzien m ssen diese eine Temperatur von 18 28 aufweisen Nur die Stuhlextrakte verd nnen Kontrollen sind gebrauchsfertig 1 PROBENVERDUNNUNGSOPTIONEN MESSBEREICH 10 600 ug g 1 1 Manuelle Einwaage Smart Prep oder ScheBo Quick Prep
100. rhaltenen Werte sind in Table 28 dargestellt MESSBEREICH 30 1800 pg g Intra Assay Pr zision 4 0 96 Die Intra Assay Pr zision wurde entsprechend der Arbeitsanleitung bestimmt als Mittelwert von 20 Wertepaaren von 3 extrahierten Stuhlproben in einem Lauf Die Ergebnisse sind in Table 25 dargestellt Inter Assay Pr zision 15 96 Die Inter Assay Pr zision wurde bestimmt durch die Messung von 5 extrahierten Stuhlproben Die Aliquots wurden getestet entsprechend der Testanleitung in 10 verschiedenen L ufen durchgef hrt von drei Laboranten unter Verwendung von 2 Kit Lots in zwei Labors Die Ergebnisse sind in Table 26 dargestellt Nachweisgrenze LoQ 30 ug g Achtzehn Stuhlproben mit Werten zwischen 10 8 and 2080 ug g Calprotectin wurden 20mal in einem Assay bestimmt Der CV und der Mittelwert wurde f r jede Probe bestimmt Als funktionelle Sensitivit t Revision date 2014 08 14 die Calprotectinkonzentration bei 1596 CV definiert Das Pr zisionsprofil erlaubt pr zise Messungen ber den gesamten Standardbereich von 30 bis 1800 ug g ie Ergebisse sind in Figure 4 dargestellt Verdiinnunglinearit t 102 F nf Stuhlproben mit erh hten Calprotectin Konzentrationen wurden gem ss der Arbeitsanleitung extrahiert Die Extrakte wurden mit Inkubationspuffer verd nnt und gem ss der Arbeitsan leitung getestet The erwarteten Werte wurden gem ss der beobachteten Werte der 1 Verd nnung berechnet Die erhaltenen Wert
101. rom ticos que se encuentran con frecuencia en los suministros de agua de laboratorio Por tanto utilice unicamente agua desionizada de alta calidad Puesto que las condiciones var an de ensayo a ensayo debe generarse una nueva curva est ndar cada vez que se realice un nuevo ensayo Se recomienda la alineaci n vertical Si la concentraci n inicial de una muestra desconocida es mayor que el calibrador m s alto calibrador E la muestra debe diluirse con tamp n de incubaci n e incubarse de nuevo seg n el procedimiento del ensayo El factor de diluci n resultante debe tenerse en cuenta para los c lculos finales son Balanza de precisi n 10 150 mg e Microcentrifuga 23000 x g e Centrifuga 2500 x g Procedimiento de ELISA e Pipetas de precisi n con puntas desechables de 10 pL 100 uL y 1000 uL e Tubos desechables de poliestireno o polipropileno para la preparaci n de las diluciones de muestra e Cilindro graduado de 1000 mL para la diluci n del tamp n de lavado concentrado e L avador de placas de microtitulaci n o botella flexible para el tamp n de lavado e Agitador de placas de microtitulaci n e Papel secante e Lector de placas de microtitulaci n para la medici n de la absorbancia a 450 nm OBTENCI N Y CONSERVACI N DE MUESTRAS EI procedimiento requiere de 50 a 100 mg de muestra de hecespara cada extracci n Recoger la muestra de heces en tubos desechables de poliestireno o polipropileno y
102. s de desempenho y Interpretac o do resultados B HLMANN fCAL ELISA APPENDIX IV SHORT PROTOCOL CALPROTECTIN EXTRACTION Standard Extraction Procedure Pre weigh empty tube Weigh 50 to100 mg Add 49 volumes Close tube and Inoculation loop faeces of 1x B CAL EX vortex vigorously for 30 min QA vi i Transfer 1 0 ml Centrifuge 5 min Transfer supernatant into a fresh into a fresh tube at 3000 x g tube and continue with the lower or extended range ELISA procedure 1 50 or 1 150 CALPROTECTIN ELISA Precoated Microtiter Plate wash 2 x 100 HL Calibrators Controls or diluted Samples incubate 30 5 minutes at 18 28C on a plate rotator C wash 3 x add 100 uL Enzyme Label incubate 30 5 minutes at 18 28C on a plate rotator wash 5 x add 100 pL Substrate incubate 15 2 minutes at 18 28 on a plate rotator add 100 pL Stop Solution Read absorbance at 450 nm within 30 minutes TIME TO RESULT 75 MINUTES Revision date 2014 08 14 34 36 B HLMANN fCAL ELISA NOTES Revision date 2014 08 14 35 36 B HLMANN fCAL ELISA APPENDIX V SYMBOLS SYMBOLE SYMBOLES SIMBOLI SIMBOLOS Symbol Explanation Symbol Explanation z Use By Verwendbar bis Utiliser jusqu au Utilizzare entro Fecha de caducidad Data de expira o BUF WASH 10X Wash Buffer Concentrate 10x Wasch Puffer Konzentrat 10x Concentr
103. s e padr o foram calculados para os valores de absorv ncia A dose m nima detect vel de calprotectina foi calculada de forma a estar claramente abaixo do calibrador A 10 ug g adicionando dois desvios padr es da absorv ncia m dia e fazendo a intersec o deste valor com a curva padr o obtida numa nova batelada Limite de detec o LoQ 10 0g g Dez amostras fecais com valores entre 5 2 e 1254 ug g de calprotectina foram testadas 20 vezes em duplicatas em um teste O CV e os valores m dios foram calculados para cada amostra A sensibilidade funcional foi observada em 15 CV O perfil de precis o resultante Figure 2 permite a medi o precisa dentro de toda a faixa padr o de 10 a 600 ug g B HLMANN fCAL ELISA Linearidade de diluic o 103 Sete amostras fecais com valores elevados de calprotectina foram extra das de acordo com o procedimento de teste Os extratos foram dilu dos com o tamp o de incubac o e subseq entemente testados de acordo com o procedimento do teste Os valores esperados foram calculados a partir do valor observado encontrado com a primeira dilui o Os resultados est o apresentados na Table 22 Recupera o de picos 100 Duas amostras fecais extra das foram acrescidas de diferentes quantidades de calprotectina dilu da contendo soro humano As amostras foram medidas antes e depois do acr scimo de acordo com o procedimento de teste Os resultados est o apresentados na Ta
104. sion logistique 4 param tres en soustrayant le blanc et calculer les concentrations en calprotectine f cale des chantillons GAMME DE DOSAGE 10 600 ug g Si vous optez pour la proc dure domaine de valeurs basses utilisez les concentrations de calibrateurs suivantes dans le mode du lecteur de microplaques correspondant 10 30 100 300 600 ug g Les r sultats doivent tre multipli s par le ou les ventuels facteurs de dilution suppl mentaires pour obtenir les r sultats finaux Des exemples caract ristiques de donn es sont report s dans la Table 19 r sultats et la Figure 1 courbe d talonnage Ces r sultats et cette courbe d talonnage ne sont fournis qu titre d exemple Tracez une courbe d talonnage pour chaque nouveau set d chantillons doser GAMME DE DOSAGE 30 1800 ug g Si vous optez pour la proc dure plage de mesure tendue utilisez les concentrations de calibrateurs suivantes dans le mode du lecteur de microplaques correspondant 30 90 300 900 et 1800 ug g Les r sultats doivent tre multipli s par le ou les ventuels facteurs de dilution suppl mentaires pour obtenir les r sultats finaux Des exemples caract ristiques de donn es sont report s dans la Table 24 r sultats et la Figure 3 courbe d talonnage Ces r sultats et cette courbe d talonnage ne sont fournis qu titre d exemple Tracez une courbe d talonnage pour chaque nouveau set d chantillons doser
105. t les valeurs moyennes furent calcul es pour chaque chantillon La LoQ observ e est de l ordre de 15 96 de CV Le profil de pr cision r sultant Figure 1 permet une mesure pr cise dans la gamme standard enti re de 10 600 ug g Lin arit de la dilution 103 96 7 chantillons de selles pr sentant des valeurs de Calprotectine lev s furent extraits selon la proc dure usuelle Les extraits furent dilu s avec du tampon d incubation puis analys s selon le protocole standard Les valeurs attendues furent calcul es partir des r sultats obtenus lors de la premi re dilution Elles sont pr sent es dans la Table 22 Test de r cup ration 100 96 2 extraits de selles furent additionn s de diff rentes concentrations de Calprotectine native dilu e contenant du s rum humain Les chantillons furent analys s selon la proc dure standard avant puis apr s l addition de Calprotectine Les donn es obtenues sont pr sent es dans la Table 23 R actions crois es 0 1 Le tampon d incubation fut additionn respectivement de diff rentes concentrations des 2 monom res recombinant MRP8 et MRP14 puis analys selon la proc dure standard Les donn es obtenues sont pr sent es dans la Table 28 Lin arit de la dilution 102 Cinq chantillons de selles de concentration en Calprotectine sup rieure la normale sont pr lev s selon la proc dure de dosage Les extraits sont dilu s dans le tampon d incubation
106. tr le pour la calprotectine commercialement disponible nous recommandons B HLMANN fCAL ELISA l utilisation d un pool d extraits positifs et n gatifs comme r f rence interne et contr le qualit La reproductibilt des param tres de la courbe d talonnage et des valeurs des contr les devrait tre comprise dans le domaine des valeurs attendues tablies par chaque laboratoire Si la pr cision des mesures ne correspond pas aux limites tablies et que les r p titions excluent toute erreur technique il est recommand de contr ler les param tres suivants i pipetage appareils de mesure de temp rature et de temps ii calibration des instruments iii date de p remption des r actifs iv conditions de stockage et d incubation v le substrat TMB devrait tre incolore vi puret de l eau ITALIANO USO Il Kit B HLMANN fCAL ELISA inteso per l estrazione e la determinazione quantitativa della Calprotectina umana MRP8 14 S100A8 S100A9 nei campioni di feci ref 1 3 LIMITES e Les r actifs fournis dans ce coffret sont optimis s pour le dosage de Calprotectine dans les chantillons de selles e Les r sultats du test doivent tre interpr t s en tenant compte des informations r sultant de l examen clinique du patient et d autres proc dures diagnostiques Revision date 2014 08 14 PRINCIPIO DEL DOSAGGIO ll test consente la misurazione selettiva dell antigene Calprotectina attraverso un s
107. ts au 1 15 me avec du tampon d incubation par exemple 50 uL d extrait et 700 uL de tampon d incubation et bien homog n iser Laisser les chantillons s dimenter pendant au moins 5 min temp rature ambiante 18 280 avant de r aliser avant de r ali ser l tape 4c 2 Pr parer une microplaque avec suffisamment de puits pour recevoir tous les calibrateurs contr les et chantillons dilu s Retirer les barrettes en surplus du support et les placer imm diatement au froid dans la pochette pr vue cet effet et contenant le dessiccateur 3 Laver deux fois chaque puits avec au moins 300 uL de tampon de lavage Vider les puits et taper nergiquement la microplaque sur du papier absorbant Important le tampon de lavage doit incuber un minimum de 20 secondes dans les puits et ceci pour chacune des trois tapes de lavage se r f rer aux PRECAUTIONS TECHNIQUES proc dure de l ELISA 4a Distribuer 100 uL de tampon d incubation blanc dans le puits respectif Distribuer 100 uL de calibrateur A E dans les puits respectifs 4b Distribuer 100 uL de contr les bas et lev dans les puits respectifs 4c Distribuer 100 uL de chaque chantillon dilu dans les puits suivants 5 Couvrir la microplague l aide d un des films adh sifs fournis et incuber 18 280 pendant 30 5 min sur un agitateur de microplaque r gl 450 rpm se r f rer aux PRECAUTIONS TECHNIQUES proc dure de l ELISA 6 Retirer
108. uba o e subsequentemente testados de acordo com o procedimento de teste Os valores esperados foram calculados a partir do valor observado encontrado na primeira dilui o Os resultados foram apresentados na Table 27 sensibilidade cl nica e especificidade de 84 4 e 94 5 respectivamente podem ser obtidas na diferencia o entre doen as org nicas e funcionais veja Table 29 N veis de calprotectina fecal de adultos e crian as s o compar veis ao passo que n veis de rec m nascidos podem ser significativamente maiores ref 8 Esses dados apoiam a seguinte recomenda o para interpreta o de resultados Valores normais abaixo de 50 ug g Valores de calprotectina lt 50 ug g n o s o indicativos de inflama o no trato gastrointestinal Pacientes com baixos n veis de calprotectina provavelmente n o ter o necessidade de procedimentos invasivos para determinar a causa da inflama o ref 12 Valores elevados entre 50 e 200 ug g Valores de calprotectina entre 50 e 200 ug g podem indicar doen as org nicas leves tais como inflama es causadas por NSAIDs drogas anti inflamat rias n o esteroidais diverticulite suave e IBD doen a inflamat ria do intestino em fase de remiss o A baixa resposta inflamat ria mostrada dentro desta faixa pode sugerir que se repitam as medi es em um curto prazo e seja realizado mais investiga es Valores elevados acima de 200 ug g Valores de calprotectina gt 200 u
109. ug g are indicative of active organic disease with inflammation in the gastrointestinal tract Appropriate further investigative and curative procedures by specialists are suggested The cut off level suggested for adults 50 ug g can also be used for children aged from 4 to 17 years regardless of sex ref 9 2014 08 14 5 36 QUALITY CONTROL Thorough understanding of this instruction is necessary for the successful use of the product Reliable results will be obtained only by precise laboratory techniques current GLP guidelines and accurately following this instruction for use Since there is no control for Calprotectin commercially available we recommend using a pool of positive stool extractions for internal quality control The reproducibility of standard curve parameters and control values should be within established limits of laboratory acceptability The confidence limits for the Controls are lot specific and printed on the additional QC data sheet If the precision of the assay does not meet the established limits and repetition has excluded errors in technique check the following issues i pipetting temperature controlling and timing devices ii ELISA reader settings iii expiration dates of reagents iv storage and incubation conditions v TMB Substrate Solution should be colorless vi purity of water B HLMANN fCAL ELISA PERFORMANCE LIMITATIONS e Reagents delivered with this kit are being optimized for the
110. ultados cuantitativos es importante homogenizar toda la muestra de feces pesada en el tamp n de extracci n Evitar la contaminaci n en la parte superior del tubo tras la extracci n puede haber todav a en el tubo componentes insolubles no solubilizados Procedimiento del ELISA e En el procedimiento de ELISA los pasos de lavado son esenciales para garantizar de resultados reproducibles Aseg rese de incubar el tamp n de lavado en los pozos un tiempo m nimo de 20 segundos Usando una arandela automatizada B hlmann recomienda realizar el proceso de dispensado y aspiraci n secuencialmente antes de proceder al pasosiguiente As el tiempo m nimo de la incubaci n est garantizado El Agitador de placas de microtitulaci n debe ser ajustado a 450 rpm 10 Hz Una frecuencia de rotaci n m s alta puede causar resultados pobres de diluci n entre valores de 300 900 y 600 1800 ug g La rotaci n es preferible a la sacudida horizontal Las repeticiones indicadas del lavado obligatorias para asegurar resultados reproducibles Para asegurar una interacci n completa de antigeno anticuerpo el tiempo de la incubaci n en el paso 5 no debe ser menor de 30 minutos Un tiempo moderado m s largo de incubaci n hasta 5 minutos no tiene ninguna influencia en el resultado final La enzima utilizada como marcador se inactiva por ox geno y es altamente sensible a Azida S dica Timerosal Acido Hipocloroso y Clorohidrocarburos a
111. usando as precau es apropriadas e Substrato e solu o stop O substrato TMB B TMB12 contem tetrametilbenzidina per xido de hidrog nio H202 A solu o stop B STS12 contem cido sulf rico 0 25 M Cada um desses reagentes irritante para os olhos pele e membranas mucosas Evite contato com os olhos pele e roupas Vista vestimentas de prote o adequadas luvas e prote o dos olhos Ap s um contato com os olhos ou com a pele lave imediatamente com gua em abund ncia e Solu o n o utilizada deve ser descartada de acordo com os regulamentos locais estaduais e federais PRECAU ES T CNICAS Componentes do kit e Res duos nos po os da microplaca v m do processo de produ o Eles s o removidos na etapa de lavagem etapa 3 do procedimento de teste e n o afetam os resultados e Leia cuidadosamente as instru es antes de realizar o teste A efici ncia do teste pode ser afetada se os reagentes estiverem incorretamente dilu dos modificados ou armazenados em condi es que n o as detalhadas nestas instru es de uso e Componentes n o podem ser usados depois da data de expira o impressa nas etiquetas e Nunca misture lotes diferentes de reagentes e Todas as a es devem ser feitas de modo a garantir que nenhuma contamina o cruzada ocorra entre reagentes amostras ou entre po os e Deixe que os reagentes se ajustem em cada temperatura ambiente Misture bem vortex os reagentes antes de
112. weichung wurden f r die Absorptionswerte ermittelt Die kleinste Nachweisbare Menge wurde berechnet durch Interpolation vom Mittelwert plus zwei Standardabweichungen auf der erhaltenen Eichkurve und liegt klar unter dem Kalibrator A 10 ug g Nachweisgrenze LoQ 10 ug g Zehn verschiedene Stuhlproben mit Werten zwischen 5 2 und 1254 ug g Calprotectin wurden gleich wie in der Intra Assay Pr zision in Doppelans tzen 20 fach gemessen Die Mittelwerte und die Variationskoeffizienten wurden f r jede Probe berechnet Das daraus entstandene Pr zisionsprofil in Figure 2 zeigt dass innerhalb des gesamten Standardbereichs 10 600 ug g ausreichend pr zise gemessen werden kann Verdiinnungslinearit t 103 Sieben Stuhlproben mit erh hten Calprotectin Konzentrationen wurde gem ss der Arbeitsanleitung extrahiert Die Extrakte wurden mit Inkubationspuffer verd nnt und gem ss der Arbeitsan leitung getestet Die erhaltenen Werte sind in Table 22 dargestellt Wiederfindung 100 Zwei extrahierte Stuhlproben wurden mit verd nntem Humanserum mit unterschied lichen Konzentrationen an nativem Calprotectin versetzt Die Proben wurden vor und nach Zugabe des verd nnten Serums entsprechend der Arbeitsanleitung gemessen Die Resultate sind in Table 23 angegeben Kreuzreaktivit t lt 0 1 Inkubationspuffer wurde mit verschiedenen Konzentrationen von rekombinantem MRP8 oder MRP14 versetzt und entsprechend der Arbeitsanleitung gemessen Die e
113. x well Let the samples equilibrate for at least 5 minutes at 18 286 prior to proceeding to step 4c 2 Prepare a plate with sufficient strips to test the required number of calibrators controls and diluted samples Remove excess strips from the holder and re seal them in the foil pouch together with the desiccant packs without delay Store refrigerated 3 Wash the coated wells twice using at least 300 uL of Wash Buffer per well Empty the wells and tap the plate firmly onto blotting paper Important For every of the three wash steps a minimal incubation time of at least 20 seconds of the Wash Buffer in the wells must be ensured see Technical Precautions ELISA Procedure 4a Pipet 100 uL of Incubation Buffer Blank and Pipet 100 uL of Calibrator A E into the respective wells Revision date 4b Pipet 100 uL of the Low and High Controls into the respective wells 4c Pipet 100 uL of each diluted sample into the subsequent wells 5 Cover the plate with a plate sealer and incubate for 30 max 5 min on a plate rotator set at 450 rpm at 18 28 see Technical Precautions ELISA Procedure 6 Remove and discard the plate sealer Empty the wells and wash three times using at least 300 uL of Wash Buffer per well see Technical Precautions ELISA Procedure Empty the wells and tap the plate firmly onto blotting paper 7 Pipet 100 uL of Enzyme Label to each well 8 Cover the plate with a plate sealer and incu
114. y Precision 4 0 The intra assay precision mean was calculated from the results of 20 duplicates from 3 extracted stool samples assayed in a single run according to the assay procedure The values are presented in Table 25 Inter Assay Precision 15 96 The inter assay precision of the ELISA was calculated from 5 extracted stool samples The aliquots were tested according to the assay procedure in 10 different runs by three technicians using 2 kit lots in two different labs The values are presented in Table 26 Detection limit 30 ug g 18 stool samples with values between 10 8 and 2080 ug g Calprotectin were measured 20 times in one assay The 96 CV and the mean values were calculated for each sample The LoQ was observed at 15 CV The resulting precision profile allows the precise measurement within the whole standard range from 30 to 1800 ug g The results are presented in Figure 4 Dilution Linearity 102 Five stool samples with elevated Calprotectin concentrations were extracted according to the assay procedure The extracts were diluted with Incubation Buffer and subsequently assayed according to the assay procedure The expected values were calculated from the Revision date observed value found with the first dilution The results are presented in Table 27 INTERPRETATION OF RESULTS Estimation of faecal Calprotectin is a reliable and easy way to distinguish organic from functional gastrointestinal diseases
115. ymatigue Marcato enzimatico Marcador enzim tico Marcador enzim tico lt Temperature limitation Zul ssiger Temperaturbereich TMB Substrate TMB Substrat Substrat TMB Limites de temp rature Limiti di temperatura SUBSITMB Substrato di TMB Limite de temperatura Substrato de TMB Limite de temperatura Substrato TMB Extraction Buffer Stop Solution Extraktions Puffer Stopp L sung Tampon d extraction SOLNISTOP Solution stop Tampone per estrazione Tamp n de extracci n Tamp o extrac o Soluzione stoppante Soluci n de parada Soluc o stop Microtiter plate Mikrotiterplatte Microplague Micropiastra Microplaca Microplaca CALEX is a registered trademark of BUHLMANN in many countries of the world Revision date 2014 08 14 36 36 VD Printing Date 2014 08 15 B HLMANN fCAL ELISA

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