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Mercodia Insulin ELISA

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1. Calibrators 1 2 3 4 5 5 vials 1000 ul Ready for use Concentration indicated on vial label recombinant human insulin Color coded yellow Calibrator 0 1 via 5 ml Ready for use Color coded yellow Enzyme Conjugate 11X 1 via 12 ml Preparation Peroxidase conjugated mouse see below monoclonal anti insulin Enzyme Conjugate Buffer 1 bottle 120 ml Ready for use Color coded blue Wash Buffer 21X 2 bottle 200 ml Preparation see below Substrate TMB 1 bottle 220 ml Ready for use Colorless solutionNotel Light sensitive Stop Solution 1 bottle 70 ml Ready for use 0 5 M H5S0 Preparation of enzyme conjugate solution Prepare the needed volume of enzyme conjugate solution by dilution of Enzyme Conjugate 11X 14 10 in Enzyme Conjugate Buffer according to the table below Mix gently Use within one day Number of Enzyme Enzyme Conjugate plates Conjugate 11X Buffer 10 plates 1 vial 1 bottle 5 plates 5 0 ml 50 ml 3 plates 3 0 ml 30 ml 2 plates 2 0 ml 20 ml 1 plate 1 0 ml 10 ml Preparation of wash solution Prepare the needed volume of wash solution by diluion of Wash Buffer 21X in redistilled water 12 20 according to the table below Mix properly Number of Wash Buffer 21X Redistilled plates water 10 plates 2 bottles 8000 ml 5 plates 180 ml 3600 ml 3 plates 110 ml 2200 ml 2 plates 70 ml 1400 ml 1 plate 35 ml 700 ml Storage after dilution 2 8 C for 4 weeks SPECIMEN
2. REFERENZEN Gaines Das R E and Bristow A F 1988 WHO International reference reagents for human proinsu lin and human C peptide Biol Stand 16 179 186 Lindstrom T Hedman CA Arnqvist HJ 2002 Use of a novel double antibody technique to describe he pharmacokinetics of rapid acting insulin analogs Diabetes Care 25 1049 1054 Riserus U Vessby B Arner P Zethelius B 2004 Supplementation with trans10cis12 conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men close association with impaired insulin sensitivity Diabetologia 47 1016 1019 Rudovich NN Rochlitz HJ Pfeiffer AF 2004 Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal weight and normal glucose tolerant first degree relatives of type 2 diabetic patients Diabetes 53 2359 2365 Sjostrand M Gudbjornsdottir S Holmang A Lonn L Strindberg L Lonnroth P 2002 Delayed ranscapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects Diabetes 51 2742 2748 20 UTILISATION PREVUE Le test Mercodia Insulin ELISA fournit une m thode de d termination des quantit s d insuline humaine dans le s rum ou le plasma R SUM ET EXPLICATION DU TEST L insuline est la principale hormone impliqu e dans le contr le du m tabolisme du glucose Son pr curseur la proinsuline est s cr t par les cellules B des lots de Langerhans puis transform pour don ner
3. d ut med 1000 ml destillerat vatten f r att g ra tv ttl sning F rvaring efter utsp dning 2 8 C i 4 veckor Substrate TMB aska 22 ml F rdig att anv ndas F rgl s v tska Obs Ljusk nslig Stop Solution aska 7 ml F rdig att anv ndas 0 5 M H550 54 Beredning av enzymkonjugatl sning Bered nskad m ngd enzymkonjugatl sning genom att sp da Enzyme Conjugate 11X 1 10 i Enzyme Conjugate Buffer enligt tabellen nedan Vid beredning av enzymkonjugatl sning till hela plattan halls hela inneh llet av Enzyme Conjugate Buffer i flaskan med Enzyme Conjugate 11X Blanda varsamt Anv nd inom en dag Antal strips Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 12 strips 1 flaska 1 flaska 8 strips 700 ul 7 0 ml 6 strips 500 pl 5 0 ml 4 strips 350 ul 3 5ml REAGENSER 10 X 96 Varje Mercodia Insulin ELISA kit 10 1113 10 inneh ller reagenser f r 10 x 96 brunnar tillr ck ligt manga f r 42 prov och en kalibratorkurva i duplikat p varje platta F r st rre analysseri er anv nd sammanslagna reagenser fr n f rpackningar med identiska lotnummer Utg ngs datumet f r hela kitet st r p ytterettiketten Rekommenderad f rvaringstemperatur r 2 8 C Coated Plate 10 plattor 96 brunnar F rdig att anv ndas monoklonalt mus anti insulin Strips med 8 brunnar F r oanv nda mikrotiterplattbrunnar terslut p sen med tejp och anv nd inom tv m nader
4. parer la solution de lavage Stockage apr s dilution temp rature comprise entre 2 et 8 C pendant 4 semaines Substrate TMB iole 22 ml Pr t l emploi Solution incolore Remarque Cette solution est sensible la lumi re Stop Solution iole 7 ml Pr te l emploi H 50 0 5 M 22 Pr paration du conjugu enzymatique Pr parez le volume du conjugu enzymatique n cessaire en diluant 11X l Enzyme Conjugate 1 10 dans l Enzym Conjugate Buffer en suivant les indications du tableau ci dessous Lors de la pr para tion du conjugu enzymatique pour une plaque enti re transf rer tout le tampon du Enzyme Conjugate Buffer dans le flacon du Enzyme Conjugate 11X M langez sans agiter A uitliser dans la journ e suivant la pr paration Nombre de bandes Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 12 bandes 1 fiole 1 fiole 8 bandes 700 ul 7 0 ml 6 bandes 500 yl 5 0 ml 4 bandes 350 ul 3 5 ml R ACTIFS 10 X 96 Chaque kit Mercodia Insulin ELISA 10 1113 10 contient suffisamment de r actifs pour 10 x 96 puits soit une quantit permettant de traiter 42 chantillons et une courbe d talonnage en double sur chaque plaque Pour des s ries de dosages plus importantes m langez les r actifs de kits portant des num ros de lot identiques La date de p remption du kit figure sur l tiquette appos e l ext rieur La temp rature de stockage recommand e est 2 8 C Coated Plate 10 plaque 96
5. via 12 ml Ready for use Wash Buffer 21X bottle Dilute with 1000 ml redistilled water to make wash solution Storage after dilution 2 8 C for 4 weeks 50 ml Substrate TMB Colorless solution Note Light sensitive via 22 ml Ready for use Stop Solution 0 5MH 50 via 7 ml Ready for use Preparation of enzyme conjugate solution Prepare the needed volume of enzyme conjugate solution by dilution of Enzyme Conjugate 11X 1410 in Enzyme Conjugate Buffer according to the table below When preparing enzyme conjugate solution for the whole plate pour all of the Enzyme Conjugate Buffer into the Enzyme Conjugate 11X vial Mix gently Use within one day Number of strips Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 12 strips 1 vial 1 vial 8 strips 700 ul 7 0 ml 6 strips 500 ul 5 0 ml 4 strips 350 ul 3 5 ml REAGENTS 10 X 96 Each Mercodia Insulin ELISA kit 10 1113 10 contains reagents for 10 x 96 wells sufficient for 42 samples and one calibrator curve in duplicate on each plate For larger series of assays use pooled reagents from packages bearing identical lot numbers The expiry date for the complete kit is stated on the outer label The recommended storage temperature is 2 8 C Coated Plate 10 plates 96 wells Ready for use mouse monoclonal anti insulin 8 well strips For unused microplate wells completely reseal the bag using adhesive tape and use within two months
6. 1st International Reference Preparation 66 304 GARANTIE Les donn es de performances pr sent es dans ce document ont t obtenues lors de tests respectant la proc dure indiqu e Tout changement ou modification dans la proc dure non recommand par Mercodia AB est susceptible d affecter les r sultats Si la proc dure n est pas respect e Mercodia AB d cline toute responsabilit concernant les garanties exprim es l gales ou implicites y compris la garantie implicite relative la qualit marchande et la conformit d usage de ce kit Mercodia AB et ses distributeurs agr s ne sauront tre tenus pour passibles de dommages indirects ou immat riels si la proc dure d crite n est pas respect e R F RENCES Gaines Das R E and Bristow A F 1988 WHO International reference reagents for human proinsulin and human C peptide Biol Stand 16 179 186 Lindstrom T Hedman CA Arnqvist HJ 2002 Use of a novel double antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid acting insulin analogs Diabetes Care 25 1049 1054 Riserus U Vessby B Arner P Zethelius B 2004 Supplementation with trans10cis12 conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men close association with impaired insulin sensitivity Diabetologia 47 1016 1019 Rudovich NN Rochlitz HJ Pfeiffer AF 2004 Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal w
7. 50 100 200 und 1000 yl vorzugsweise Mehrfachpipetten f r die Zugabe der Enzym konjugatl sung des TMB Substrates und der Stop Solution Becherglas und Messzylinder f r die Aufbereitung der Reagenzien Doppelt destilliertes Wasser Mikroplattenleser 450 nm Filter Plattensch ttler Die empfohlene Geschwindigkeit liegt bei 700 900 Umdrehungen pro Minute Orbitalbewegung REAGENZIEN 1 X 96 edes Mercodia Insulin ELISA 10 1113 01 Kit enth lt Reagenzien f r 96 Brunnen Dies reicht aus f r 42 Proben und eine Kalibratorkurve im Duplikat F r gr ere Assay Serien ist es empfehlenswert Reagenzien die miteinander vermischt werden sollen aus Packungen mit der selben Lot Nummer anzuwenden Das Haltbarkeitsdatum f r das komplette Kit ist auf dem Etikett der Packung vermerkt Die empfohlene Lagerungstemperatur ist 2 8 C Coated Plate 1 Platte 96 Brunnen gebrauchsfertig Maus Anti Insulin monoklonal 8 Brunnen Strips Die unbenutzten Mikrotitierstreifen k nnen in der mit Klebstreifen wiederverschlossenen Originalverpackung zwei Monate lang aufbewahrt werden Calibrators 1 2 3 4 5 5 Fl schchen 1000 ul gebrauchsfertig Konzentrationen ist auf dem Fl schchen angegeben rekombinantes Humaninsulin Gelbf rbung Calibrator 0 Fl schchen 5 ml gebrauchsfertig Gelbf rbung Enzyme Conjugate 11X Fl schchen 1 2 ml Zubereitung s unten Peroxidasekonjugiertes monoklonales Anti Insulin der Maus Enzyme C
8. COLLECTION AND HANDLING Serum Collect blood by venipuncture allow to clot and separate the serum by centrifugation Samples can be stored at 2 8 C up to 24 hours For longer periods store samples at 20 C Avoid repeated freezing and thawing Plasma Collect blood by venipuncture into tubes containing heparin or EDTA as anticoagulant and separate the plasma fraction Samples can be stored at 2 8 C up to 24 hours For longer periods store samples at 20 C Avoid repeated freezing and thawing Preparation of samples No dilution is normally required however samples containing gt 200 mU I should be diluted 1 9 viv with Calibrator 0 TEST PROCEDURE All reagents and samples must be brought to room temperature before use Prepare a calibrator curve for each assay run Prepare enzyme conjugate solution and wash solution Prepare sufficient microplate wells to accomodate Calibrators and samples in duplicate Pipette 25 ul each of Calibrators and samples into appropriate wells Add 100 yl of enzyme conjugate solution to each well Incubate on a plate shaker 700 900 rpm for 1 hour at room temperature 18 25 C Wash 6 times with 700 pl per well using an automatic plate washer with overflow wash function Do not include soak step in washing procedure Or manually Discard the reaction volume by inverting the microplate over a sink Add 350 pl wash solution to each well Discard the wash solution tap firmly several ti
9. Eller manuelt Bortkast vaesken i pladen ved at vende den p hovedet over en vask Tilsaet 350 pl vaske oplosning til hver brand Bortkast vaske oplasningen bank pladen flere gange mod absorberende papir for at fjerne overskydende v ske Gentag 5 gange Undg at forl nge perioden hvor br ndene st r med v ske i l bet af vaskeperioden 7 Tils t 200 pl Substrate TMB nkuber i 15 minutter ved stuetemperatur 18 25 C 9 Tilsaet 50 ul Stop Solution hver brand Placer pladen p et rystebord i cirka 5 sekunder for at sikre blandingen 10 Aflaes optisk densitet ved 450 nm og beregn resultaterne Aflaes inden for 30 minutter co Obs For att forhindre kontermination mellem konjugatet og substratet anbefales det at anvende s rskilte pipetter o INTERN KVALITETSKONTROL Kommercielle Kontroller som f eks Mercodia Diabetes antigen control Kodenr 10 1164 01 og eller interne serumpuljer med lave mellem og h je insulin koncentrationer skal regelm ssigt analyseres som ukendte og resultaterne afbildes fra dag til dag Det er god laboratoriepraksis at registrere folgende data for hver analyse s ttets partinummer rekonstitueringsdatoer for s t tets komponenter OD veerdier for blindprover Calibrators og kontrolprover 49 BEREGNING AF RESULTATER Computerberegning Computersturet datareduktion af absorbansen for Calibrators bortset fra Calibrator 0 i forhold til koncentration ved hjaelp af cubic spline regress
10. Plate 10 Platte 96 Brunnen gebrauchsfertig Maus Anti Insulin monoklonal 8 Brunnen Strips Die unbenutzten Mikrotitierstreifen k nnen mit Klebstreifen in der wiederverschlossenen Originalverpackung zwei Monate lang aufbewahrt werden Calibrators 1 2 3 4 5 5 Fl schchen 1000 ul gebrauchsfertig Konzentrationen s Etiketten rekombinantes Human Insulin Gelbf rbung Calibrator 0 1 Fl schchen 5 ml gebrauchsfertig Gelbf rbung Enzyme Conjugate 11X 1 Fl schchen 12 ml Zubereitung s unten Peroxidasekonjugiertes monoklonalesAnti Insulin der Maus Enzyme Conjugate Buffer 1 Flasche 120 ml gebrauchsfertig Blauf rbung Wash Buffer 21X 2 Flaschen 200 ml Zubereitung s unten Substrate TMB 1 Flasche 220 ml gebrauchsfertig Farblose L sung Achtung lichtempfindlich Stop Solution 1 Flasche 70 ml gebrauchsfertig 0 5 MH SO yos naq Vorbereitung der Enzymkonjugatl sung Vorbereiten der ben tigten Enzymkonjugatl sung durch mischen von Enzym Conjugate 11X 12 10 mit Enzym Conjugate Buffer entsprechend der folgende Tabelle Vorsichtig mischen Innerhalb eines Tages aufgebrauchen Anzahl Platten Enzyme Enzyme Conjugate conjugate 11X buffer 10 Platten 1 Fl schen 1 Fl schen 5 Platten 5 0 ml 50 ml 3 Platten 3 0 ml 30 ml 2 Platten 2 0 ml 20 ml 1 Platten 1 0 ml 10 ml Vorbereitung den Waschl sung Vorbereiten des ben tigten Waschl sung Volumens durch mischen des Wash Buffer 21X mit doppelt destilliert
11. Standardabweichnungen ber dem betr gt 94 113 Mittelwert 104 on bis zu 307000 mU I wurde kein Hook Effekt festgestellt Jede Probe wurde unter 6 verschiedenen Bedingungen 6 mal gemessen Probe Mittelwert Variationskoeffizienz mU I intra Assay inter Assay total Assay Yo 1 11 34 3 6 5 0 2 36 4 0 2 6 4 7 3 80 2 8 2 8 4 0 4 154 3 2 2 9 44 yos naq Spezifit t Die folgenden Kreuzreaktionen konnten festgestellt werden C peptide 0 0196 Proinsulin 0 0196 Proinsulin des 31 32 0 5 Proinsulin split 32 33 0 5 Proinsulin des 64 65 9896 Proinsulin split 65 66 5696 nsulin lispro Humalog Eli Lily 0 00000396 nsulin aspart lt 3 2 GF I 0 0296 GF II 0 0296 Ratteninsulin 0 796 Mausinsulin 0 396 Schweineinsulin 374 Schafinsulin 48 Rinderinsulin 31 KALIBRIERUNG Mercodia Insulin ELISA Kit wurde gem ss der 1st International Reference Preparation f r menschliches Insulin 66 304 kalibriert HAFTUNG Die hier aufgef hrten Durchf hrungsdaten wurden mit dem indizierten Verfahren gewonnen Jede von Mercodia AB nicht empfohlene Anderung oder Modifikation des Verfahrens kann die Resultate beeintr chtigen In diesem Fall lehnt Mercodia AB jede explizierte implizierte oder gesetzliche Garantie ab die implizierte Marktf higkeit und Anwendbarkeit inbegriffen Mercodia AB und deren Vertreter k nnen dann weder f r direkte Sch den noch f r Folgesch den haftbar gemacht werden
12. e Pipetter f r 25 50 100 200 och 1000 ul repeterbara pipetter r att f redra f r tillsats av enzymkonjugatl sning Substrate TMB och Stop Solution e Bagare och m tglas f r iordningst llande av reagens e Dubbeldestillerat vatten e Mikrotiterplattl sare 450 nm filter Plattskak rekommenderad hastighet r 700 900 varv per minut orbital r relse e Tv ttutrustning f r mikrotiterplattor REAGENSER 1X96 Varje Mercodia Insulin ELISA kit 10 1113 01 inneh ller reagenser till 96 brunnar tillr ckligt m nga f r 42 prov och en kalibratorkurva i duplikat F r st rre analysserier anv nd samman slagna reagenser fr n f rpackningar med identiska lotnummer Utg ngsdatumet f r hela kitet st r p ytterettiketten Rekommenderad f rvaringstemperatur r 2 8 C e Coated Plate platta 96 brunnar F rdig att anv ndas monoklonalt mus anti insulin Strips med 8 brunnar F r oanv nda mikrotiterplattbrunnar terf rslut p sen med tejp och anv nd inom tv m nader Calibrators 1 2 3 4 5 5 flaskor 1000pl F rdig att anv ndas Koncentration angiven p flaskans etikett rekombinant humant insulin Gul f rgm rkning Calibrator 0 aska 5 ml F rdig att anv ndas Gul f rgm rkning Enzyme Conjugate 11X aska 1 2 ml Spad enligt peroxidaskonjugerat nedan monoklonalt mus anti insulin Enzyme Conjugate Buffer aska 12 ml F rdig att anv ndas Bl fargmarkning Wash Buffer 21X aska 50 ml Sp
13. i princip insulin Insulinniv n i serum r mycket l g och kar inte vid stimulering med glukos Vid hypopituitarism r insulinniv erna likaledes mycket l ga D remot finner man vid typ II diabetes ldersdiabetes NIDDM ofta normala eller t o m kade insulinniv er F rh jda insulinniv er f religger ofta vid fetma insulin om och vissa endokrina dysfunktioner s som Cushings syndrom och akromegali TESTPRINCIP Mercodia Insulin ELISA r en fast fas enzym immunoassay som baserar sig p sandwich teknik med tv monoklonala antikroppar som r riktade mot separata antigena determinanter p in sulinmolekylen Under inkubation reagerar insulinet i provet med peroxidaskonjugerade anti insulinantikroppar och anti insulinantikroppar bundna till en mikrotiterbrunn En enkel tv tt av l gsnar obunden enzyminm rkt antikropp Det bundna konjugatet detekteras genom reaktion med 3 3 5 5 tetrametylbensidin TMB Enzymreaktionen avl ses spektrofotometriskt efter att ha stoppats genom tillsats av syra VARNINGAR OCH S KERHETS TG RDER e F r in vitro diagnostiskt bruk e Inneh llet i detta kit eller rester av det far inte komma i kontakt med idisslande djur eller svin Stop Solution i detta kit inneh ller 0 5 M H SO F lj standards kerhets tg rder f r hante ring av farliga kemikalier Alla patientprover skall hanteras som om de vore smittb rande 53 2 BUET MATERIAL SOM KR VS MEN EJ TILLHANDAH LLS
14. miske ikteriske eller h molyserede pr ver forstyrrer ikke analysen FORVENTEDE V RDIER God praksis foreskriver at hvert laboratorium fastl gger sine egne intervaller for forventede v rdier F lgende resultater kan fungere som en vejledning indtil laboratoriet selv har indsam let tilstr kkelige data Fasteniveauer for 137 testede tilsyneladende sunde individer gav et gennemsnit p 9 2 mU I en medianveerdi p 6 9 mU I og et interval der svarer til de midterste 95 af observationerne p 2 25 mull YDEEVNE Registreringsgraense Registreringsgraensen er 1 mU I beregnet som to standardafvigelser over Calibrator 0 Genfinding Genfinding efter tils tning er 94 113 gennemsnit 104 Hook effekt Prover med en koncentration p op til 30 000 mU I kan m les uden at f falsk lave resultater Nojagtighed Hver prove analyseres 6 gange ved 6 forskellige lejligheder Prove Gennemsnit Variationskoefficient mU I inden for mellem samlet analyse analyse analyse 1 11 3 4 3 6 5 0 2 36 4 0 2 6 4 7 3 80 2 8 2 8 4 0 4 154 32 2 9 4 4 51 Specificitet Der blev fundet falgende krydsreaktioner C peptid 0 0196 Proinsulin 0 0196 Proinsulin des 31 32 0 596 Proinsulin split 32 33 0 596 Proinsulin des 64 65 98 Proinsulin split 65 66 56 nsulin lispro Humalog Eli Lily lt 0 000003 nsulin aspart lt 3 2 GF I lt 0 02 GF II 0 0296 Rotteinsulin 0 796 Musinsulin 0 396 Svininsulin 37496 F ri
15. peptide C e l insulina Entrambi sono secreti in una somma equimolare nel portale della circolazione La molecola matura dell insulina comprende due catene di polipeptide la catena A e la catena B rispettivamente 21 e 30 Le due catene sono legate insieme da due ponti concatenati disulfidici C anche un ponte disulfidico intercatenato nella catena A La secrezione dell insulina principalmente controllata dalla concentrazione di glucosio nel plasma e l ormone ha un significante numero di azioni metaboliche La sua funzione principale di controllare il condotto e l utilizzazione del glucosio nei tessuti periferici tramite il vettore di glucosio Questa e le altre attivit ipoglicemiche per esempio l inibizione di glicogenesi e glico genolisi sono mitigate dagli ormoni iperglicemici inclusi il glucagone l epinefrina adrenalina la crescita degli ormoni e cortisolo Le concentrazioni di insulina sono ridotte drasticamente nei pazienti di diabete melito insulina dipendenti IDDM e in altre condizioni come l ipopituitarismo I livelli di insulina sono aumentati nei pazienti di diabete melito non insulina dipendenti NIDDM di obesit insulinoma e alcune disfunzioni endocrine come la sindrome di Cushing e l acromegalia PRINCIPIO DI PROCEDURA Mercodia Insulin ELISA una fase concreta dell immunoanalisi enzima due sito E basata sulla tecnica diretta sandwich nella quale due anticorpi monoclonali sono diretti contro determinanti ant
16. per 96 prove sufficienti per 42 campioni e una calibratura curva in duplicato Per diverse serie di analisi usare reagenti pro venienti da scatole portanti identici numeri di lotto La data di scadenza del kit completo stabilita sull etichetta all esterno Si raccomanda di conservare ad una temperatura di 2 8 C Coated plate 1 piastra 96 pozzetti Pronti per l uso Topo monoclonale anti insulina 8 strips per pozzetti pozzetti delle micro piastre inutilizzati devono essere risigillati e adoperati entro due mesi Calibrators 1 2 3 4 5 5 fiale 1000 ul Pronto all uso Concentrazione indicata sull etichetta della fiala recombinant human insulin Giallo colore codificato Calibrator 0 1 fiala 5 ml Pronto all uso Giallo colore codificato Enzyme Conjugate 11X 1 fiala 1 2 ml Per la preparazione vedi sotto Peroxidase Conjugate topo monoclonale Anti insulina Enzyme Conjugate Buffer 1 fiala 12 ml Pronto all uso Blu colore codificato Wash Buffer 21 X 1 bottiglia 50 ml Diluire con 1000 ml d acqua ridistillata per fare di soluzione di lavaggio Conservare dopo la diluizione 2 8 C per 4 settimane Substrate TMB 1 fiala 22 ml Pronto all uso Soluzione incolore Nota Sensibile alla luce Stop Solution 1 fiala 7 ml Pronto all uso 0 5 M H550 38 Preparazione della soluzione enzima coniugato Preparare la quantit necessaria della soluzione enzima coniugato con la diluizione dell Enzyme C
17. separate Pipetten zu verwenden INTERNE QUALIT TSKONTROLLE Um die t gliche G ltigkeit der Resultate zu sichern ist die Verwendung von Kontrollen als Unbekannte ratsam Daf r wird Mercodia Diabetes antigen control Code No 10 1164 01 empfohlen oder pathologische Proben mit tiefen mittleren und hohen Insulinkonzentratio nen Des weiteren sollten folgende Daten f r jeden Kit protokolliert werden Lot Nummer de Kits Rekonstruktion der Daten der Kitkomponenten OD Werte der Blanke Calibrators und Kontrollen 17 yos naq BERECHNUNG DER RESULTATE Computergest tzte Berechnung Es kann eine computergest tzte Berechnung der Absorbanzwerte der Calibrators ausser Calibrator 0 und deren Konzentration mit Hilfe einer cubic spline regression erfolgen Manuelle Berechnung 1 Einzeichnen der f r die Calibrators ausser Calibrator 0 erhaltenen Absorbanzwerte im Verh ltnis zur Insulinkonzentration auf einem log log Papier und erstellen Kalibratorkurve 2 Die Konzentration der unbekannten Proben aus der Kalibratorkurve ablesen Beispiel von Resultaten Brunnen Identifikation A450 Mittelwert mU I 1 A B Calibrator 0 0 070 0 071 1 C D Calibrator 1 0 105 0 106 1E F Calibrator 2 0 202 0 204 1 G H Calibrator 3 0 434 0 470 2 A B Calibrator 4 1 348 1 351 2 C D Calibrator 5 2 451 2 476 2 E F Unbekannte 1 0 222 0 214 11 1 2G F Unbekannte 2 0 546 0 538 35 6 3A B Unbekannte 3 1 941 1 978 153 Konzentrationen i
18. verificar resultados de un ensayo 1 00 0 0 450 nm 0 10 Am ee 1 10 100 1000 Insulin mU I 34 FACTOR DE CONVERSI N 1 g l 29 mU I 1 mU I 6 0 pmol l L MITES DEL PROCEDIMIENTO gual que todas las pruebas diagn sticas un diagn stico clinico definitivo no debe estar basado nicamente en los resultados de una sola prueba sino que el m dico debe hacerlo s lo despu s de haber evaluado todos los datos cl nicos Es complicado realizar esta prueba en individuos que est n sometidos a insulinoterapia por a formaci n de anticuerpos anti insulina que pueden interferir en el ensayo Las muestras lip micas ict ricas o hemolizadas no interfieren en el ensayo VALORES ESPERADOS Una buena pr ctica de laboratorio dicta que cada laboratorio establezca su propio rango de valores Los siguientes resultados pueden servir de gu a hasta que el laboratorio haya reunido suficientes datos por su cuenta Los niveles en ayunas de 137 individuos estudiados aparentemente sanos dieron una media de 9 2 mU l una mediana de 6 9 mU I y un rango correspondiente al 95 central de las observaciones de 2 25 mU l CARACTER STICAS DEL RENDIMIENTO L mite de detecci n El limite de detecci n es 1 mU I calculado como dos desviaciones est ndar por encima del Calibrator 0 Recuperaci n La recuperaci n a la adici n es del 94 113 media 104 Efecto gancho Las muestras con una concentraci n superior
19. 0 5 Proinsulina split 32 33 0 596 Proinsulina des 64 65 9896 Proinsulina split 65 66 5696 nsulina lispro Humalog Eli Lily lt 0 000003 nsulina aspart lt 3 2 GF I lt 0 02 GF II lt 0 02 nsulina di ratta 0 7 nsulina di topo 0 396 nsulina porcino 374 nsulina di pecora 48 nsulina bovino 31 CALIBRATURA kit specifico Mercodia Insulin ELISA calibrato contro i Riferimenti 1st International Reference Preparation 66 304 GARANZIA dati dei rendimenti presentati qui sono stati ottenuti usando le procedure indicate Qualsiasi cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da Mercodia AB possono avere effetti su i risultati nel caso in cui Mercodia rinuncia al diritto tutte le garanzie espresse implicite o fissate inclusa la garanzia implicita per l uso commerciale e appropriato Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati in tal caso non sar soggetto a danni indiretti o consequenziali RIFERIMENTI Gaines Das R E and Bristow A F 1988 WHO International reference reagents for human proin sulin and human C peptide Biol Stand 16 179 186 Lindstrom T Hedman CA Arnqvist HJ 2002 Use of a novel double antibody technique to describe he pharmacokinetics of rapid acting insulin analogs Diabetes Care 25 1049 1054 Riserus U Vessby B Arner P Zethelius B 2004 Supplementation with trans10cis12 conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men close association with i
20. 8 C i upp till 4 veckor PROVTAGNING OCH HANTERING Serum Ta blod genom venpunktion l t det koagulera och separera serumet genom centrifugering Pro ver kan f rvaras vid 2 8 C i upp till 24 timmar F r l ngre tidsperioder f rvara proverna vid 20 C Undvik upprepad frysning och upptining Plasma Ta blod genom venpunktion och s tt till r r inneh llande heparin eller EDTA som motverkar koagulation och separera plasmadelen Prover kan f rvaras vid 2 8 C i upp till 24 timmar F r l ngre tidsperioder f rvara proverna vid 20 C Undvik upprepad frysning och upptining 56 Provbehandling Normalt sett beh vs det ingen sp dning men prover som inneh ller gt 200 mU I b r sp das 1 9 v v med Calibrator 0 TESTETS UTFORANDE Alla reagenser och prover m ste rumstempereras f re anvandning En kalibratorkurva ska ing i varje analys 1 Bered enzymkonjugatl sning och tvattl sning G r i ordning tillr ckligt manga mikrotiterplattbrunnar f r att rymma duplikat av Calibrators och prover Pipettera 25 pl vardera av Calibrators och prover i l mpliga brunnar Tills tt 100 ul enzymkonjugatl sning till varje brunn Inkubera p en plattskak 700 900 rpm i 1 timme vid rumstemperatur 18 25 C Tv tta 6 g nger med 700 ul per brunn anv nd en automatisk microtiterplatt tv tt med overflow funktion Anv nd inte soak funktion vid tv ttproceduren er manuellt Avl gsna reaktionsl sningen genom att v nda
21. Calibrators 1 2 3 4 5 5 flaskor 1000 pl F rdig att anv ndas Koncentration angiven p flaskans etikett rekombinant humant insulin Gul f rgm rkning Calibrator 0 1 flaska 5 ml F rdig att anv ndas Gul f rgm rkning Enzyme Conjugate 11X 1 flaska 12 ml Sp d enligt Peroxidas konjugerat nedan monoklonalt mus anti insulin Enzyme Conjugate Buffer 1 flaska 120 ml F rdig att anv ndas Bl f rgm rkning Wash Buffer 21X 2 flaskor 200 ml Framst lls enligt nedan Substrate TMB 1 flaska 220 ml F rdig att anv ndas F rgl s v tska Obs Ljusk nslig Stop Solution 1 flaska 70 ml F rdig att anv ndas 0 5 MH SO 55 gt ELEZIS Beredning av enzymkonjugatl sning Bered nskad volym enzymkonjugatl sning genom att sp da Enzym Conjugate 11X 14 10 i Enzym Conjugate Buffer enligt tabellen nedan Blanda varsamt Anv nd inom en dag Antal plattor Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 10 plattor 1 flaska 1 flaska 5 plattor 5 0 ml 50 ml 3 plattor 3 0 ml 30 ml 2 plattor 2 0 ml 20 ml 1 platta 1 0 ml 10 ml Beredning av tv ttl sning Bered nskad m ngd tv ttl sning genom utsp dning av Wash Buffer 21X i destillerat vatten 1 20 enligt tabellen nedan Blanda noggrannt Antal plattor Wash Destillerat Buffer 21X vatten 10 plattor 2 flaskor 8000 ml 5 plattor 180 ml 3600 ml 3 plattor 110 ml 2200 ml 2 plattor 70 ml 1400 ml 1 platta 35 ml 700 ml F rvaring efter utsp dning 2
22. Mercodia Insulin ELISA Directions for Use Gebrauchsinformation Mode d emploi Instrucciones para el uso Instruzioni per l uso Brugsanvisning Bruksanvisning 10 1113 01 Reagents for 96 determinations 10 1113 10 Reagents for 10 x 96 determinations Manufactured by Hersteller Fabriqu par Fabricado por Prodotto da Fremstillet af Tillverkad av Mercodia AB Sylveniusgatan 8A SE 754 50 Uppsala Sweden Schweden Su de Suecia Svezia Sverige Mercodia A EXPLANATION OF SYMBOLS USED ON LABELS ERKL RUNG DER SYMBOLE AUF DEN ETIKETTEN EXPLICATION DES SYMBOLES UTILISES SUR LES ETIQUETTES EXPLICACI N DE LOS S MBOLOS UTILIZADOS EN LAS ETIQUETAS SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI USATI SULLE ETICHETTE FORKLARING AF SYMBOLER ANVENDT P ETIKETTER F RKLARING AV SYMBOL ERNA SOM ANV NDS P ETIKETTERNA X296 Reagents for 96 determinations Reagenzien f r 96 Bestimmungen R actifs pour 96 mesures Reactivos para 96 determinaciones Reagenti per 96 rilevazioni Reagens til 96 bestemmelser Reagenser f r 96 best mningar Expiry date Verfallsdatum A utiliser avant Fecha de caducidad Data di scadenza Udlebsdato Utg ngsdatum Store between 2 8 C Lagerungstemperatur 2 8 C A conserver entre 2 et 8 C Conservar a entre 2 8 C Conservare tra i 2 8 C Opbevar ved 2 8 C F rvara vid 2 8 C LOT Lot No Lot Nr N de lot N lote Lotto n Partinr Lotnr IVD For in vitro diagnos
23. a 30 000 mU l pueden medirse sin obtener resul ados falsamente bajos Precisi n Cada muestra se analiz en 6 replicados en seis ocasiones diferentes Muestra Valor medio Coeficiente de variaci n mU I intra inter total ensayo 96 ensayo ensayo 1 11 3 4 3 6 5 0 2 36 4 0 2 6 4 7 3 80 2 8 2 8 4 0 4 154 3 2 2 9 4 4 35 Especificidad Se han hallado las siguientes reacciones cruzadas P ptido C 0 0196 Proinsulina 0 01 Proinsulina des 31 32 0 5 Proinsulina split 32 33 0 5 Proinsulina des 64 65 9896 Proinsulina split 65 66 5696 nsulina lispro Humalog Eli Lily 0 00000396 nsulina aspart 3 296 GF I lt 0 02 GF II lt 0 02 nsulina de rata 0 7 nsulina de rat n 0 396 nsulina porcino 374 nsulina de oveja 48 nsulina bovino 31 CALIBRACI N El Mercodia Insulin ELISA se calibra contra el reactivo de 1st International Reference Preparation 66 304 GARANT A Los datos de rendimiento presentados aqu se obtuvieron usando el procedimiento indicado Cualquier cambio o modificaci n en el procedimiento no recomendado por Mercodia AB puede afectar los resultados en cuyo caso Mercodia AB declina cualquier responsabilidad y garant a acordada implicita o expl cita incluso la garant a implicita sobre la comerciabilidad e idoneidad para su uso Mercodia AB y sus distribuidores autorizados en tal caso no asumir n responsabilidades por dafios y perjuicios indire
24. ar Codificado en amarillo Enzyme Conjugate 11X 1 via 1 2 ml Preparaci n Monoclonal de rat n Enzyme Conjugate v ase a continuaci n con peroxidasa anti insulina Enzyme Conjugate Buffer 1 via 12 ml Listo para usar Codificado en azul Wash Buffer 21X 1 botella 50 ml Diluir con 1000 ml de agua bidestilada para hacer de soluci n de lavado Conservaci n despu s de la diluci n 2 8 C durante 4 semanas Substrate TMB 1 via 22 ml Listo para usar Soluci n incolora Atenci n Es sensible a la luz Stop Solution 1 via 7 ml Listo para usar 0 5 M H550 30 Preparaci n de la disoluti n conjugado enzim tico Preparar el volumen necessario disoluci n de conjugado enzim tico por diluci n del Enzyme Conjugate 11X 12 10 en Enzyme Conjugate Buffer seg n la siguiente tabla Si se usa toda la placa verter completamente el tamp n Emzyme Conjugate Buffer al vial Enzyme Conjugate 11X Mezclar suavemente Utilizar en un dia N mero de tiras Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 12 tiras 1 vial 1 vial 8 tiras 700 pl 7 0 ml 6 tiras 500 ul 5 0 ml 4 tiras 350 ul 3 5 ml REACTIVOS 10 X 96 Cada kit de Mercodia Insulin ELISA 10 1113 10 contiene reactivos para 10x96 pocillos sufi cientes para 42 muestra y una curva de calibraci n por duplicado Para series de ensayos m s amplias mezclar reactivos de paquetes de n mero de lote id ntico La fecha de caducidad del kit completo est en el exteri
25. cauciones rutinarias para el manejo de productos qu micos peligrosos Las muestras de los pacientes deben manipularse como si fueran capaces de transmitir infecciones 29 MATERIAL REQUERIDO PERO NO SUMINISTRADO e Pipetas de 25 50 100 200 y 1000 pl para la adici n de la disoluci n conjugado enzim tico Substrate TMB y Stop Solution se prefieren las pipetas de repetici n e Cubetas y probetas para preparar los reactivos Agua bidestilada e Lector de microplacas filtro de 450 nm e Agitador de placas La velocidad recommendable es de 700 900 vueltas por minuto movimiento orbital REACTIVOS 1 X 96 Cada kit de Mercodia Insulin ELISA 10 1113 01 contiene reactivos para 96 pocillos suficien tes para 42 muestra y una curva de calibraci n por duplicado Para series de ensayos m s amplias mezclar reactivos de paquetes de n mero de lote id ntico La fecha de caducidad del kit completo est en el exterior identificada en una etiqueta La temperatura de conservaci n recomendada es 2 8 C Coated plate 1 placa 96 pocillos Listo para usar anticuerpo monoclonal 8 tiras de pocillos de rat n anti insulina Para los pocillos de microplacas no utilizados volver a sellar la bolsa y utilizarlos en los dos meses siguientes Calibrators 1 2 3 4 5 5 viales 1000 ul Listo para usar Concentraci n indicada en la etiqueta del vial recombinant human insulin Codificado en amarillo Calibrator 0 1 via 5 ml Listo para us
26. ctos o consiguientes REFERENCIAS Gaines Das R E and Bristow A F 1988 WHO International reference reagents for human proinsulin and human C peptide Biol Stand 16 179 186 Lindstrom T Hedman CA Arnqvist HJ 2002 Use of a novel double antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid acting insulin analogs Diabetes Care 25 1049 1054 Riserus U Vessby B Arner P Zethelius B 2004 Supplementation with trans10cis12 conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men close association with impaired insulin sensitivity Diabetologia 47 1016 1019 Rudovich NN Rochlitz HJ Pfeiffer AF 2004 Reduced hepatic insulin extraction in response to gast ric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal weight and normal glucose tolerant first degree relatives of type 2 diabetic patients Diabetes 53 2359 2365 Sjostrand M Gudbjornsdottir S Holmang A Lonn L Strindberg L Lonnroth P 2002 Delayed trans capillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects Diabetes 51 2742 2748 36 USO PROPOSTO Mercodia Insulin ELISA fornisce un metodo per la determinazione quantitativa dell insulina umana nel siero o nel plasma RELAZIONE E SPIEGAZIONE DEL TEST L insulina il principale ormone responsabile del controllo di glucosio nel metabolismo E sintetizzata nelle cellule delle isolette di Langerhans come il precursore proinsulina che ela borato per formare la
27. de Stop Solution e B chers et prouvettes cylindriques pour la pr paration des r actifs e Eau redistill e Lecteur de microplaques filtre de 450 nm e Agitateur secoueur de plaques Le r gime recommand est de 700 900 tours par minute mouvement orbital R ACTIFS 1 X 96 Chaque kit Mercodia Insulin ELISA 10 1113 01 contient suffisamment de r actifs pour 96 puits soit une quantit permettant de traiter 42 chantillons et une courbe d talonnage en double Pour des s ries de dosages plus importantes m langez les r actifs de kits portant des num ros de lot identiques La date de p remption du kit figure sur l tiquette appos e l ext rieur La temp rature de stockage recommand e est 2 8 C Coated Plate 1 plaque 96 puits Pr te l emploi Anticorps monoclonal murin Bandes de 8 puits anti insuline S il reste des puits inutilis s replacez les dans leur emballage herm tiquement ferm Utilisez ces puits sous deux mois Calibrators 1 2 3 4 5 5 fioles 1000 ul Pr te l emploi Conc indiqu e sur l etiquette recombinant human insulin Code couleur jaune Calibrator 0 fiole 5 ml Pr te l emploi Code couleur jaune Enzyme Conjugate 11X A pr parer peroxidase conjugu monoclona voir ci dessous murin anti insulin iole 1 2 ml Enzyme Conjugate Buffer iole 12 ml Pr t l emploi Code couleur bleu Wash Buffer 21X lacon 50 ml Diluez avec 1000 ml d eau distill e pour pr
28. des peptides C et de l insuline s cr t s en quantit s quimolaires dans la circulation portale La mol cule d insuline elle m me comprend deux chaines de polypeptides la cha ne A et la cha ne B compos es respectivement de 21 et de 30 acides amin s Ces deux chaines sont rattach es par deux ponts disulfure interchaines La chaine A comporte galement un pont disulfure intracha ne L insuline dont la s cr tion est principalement contr l e par la concentration de glucose plas matique produit plusieurs effets m taboliques importants Sa principale fonction consiste contr ler l absorption et l utilisation du glucose dans les tissus p riph riques via le transporteur du glucose Cette activ hypoglyc miante ainsi que d autres inhibition de la glucon ogen se et de la glycog nolyse h patiques est contrebalanc e par les hormones hyperglyc miantes notamment le glucagon l adr naline l hormone de croissance et le cortisol Les concentrations en insuline sont fortement r duites dans le diab te insulinod pendant insulin dependent diabetes mellitus IDDM et dans d autres affections telles que l insuffisance hypophysaire Elles sont accrues dans le diab te non insulinod pendant non insulin dependent diabetes mellitus NIDDM l ob sit l insulinome et quelques autres dysfonctionnements endo criniens tels que le syndrome de Cushing et l acrom galie PRINCIPE DE LA PROC DURE Une caract ristique du te
29. dus apparemment sains donne une moyenne de 9 2 mU I une valeur m diane de 6 9 mU l et une tendue de 2 mU I 25 mU I 95 des observations valeurs extr mes exclues CARACT RISTIQUES DE PERFORMANCES Limites de d tection la limite de la d tection est inf rieure 1 mU I deux carts type au dessus du Calibrator 0 R cup ration Le dosage en retour donne une valeur comprise entre 94 et 113 moyenne 104 Effet crochet Le kit permet d effectuer des mesures sur des chantillons d une concentration maximale de 30 000 mU I sans donner de faux r sultats bas Pr cision Chaque chantillon a t analys en 6 exemplaires six occasions diff rentes Echantillon Valeur moyenne Coefficient de variation mU I pendant entre total du dosage le dosage les dosages 1 11 34 3 6 5 0 2 36 4 0 2 6 4 7 3 80 2 8 2 8 4 0 4 154 3 2 2 9 4 4 21 sie5ueJ4 Sp cificit Les r actions crois es ci dessous ont t identifi es Peptide C 0 0196 Proinsuline 0 0196 Des 31 32 proinsulin 0 5 Split 32 33 proinsulin 0 5 Des 64 65 proinsulin 9896 Split 65 66 proinsulin split 65 66 5696 nsulin lispro Humalog Eli Lily 0 00000396 nsulin aspart lt 3 2 GF 0 0296 GF II 0 0296 nsuline du rat 0 796 nsuline du souris 0 396 nsuline du porcine 374 nsulin du mouton 48 nsulin du boeuf 31 ETALONNAGE Le kit sp cial Mercodia Insulin ELISA est talonn l aide du r actif de
30. eight and normal glucose tolerant first degree relatives of type 2 diabetic patients Diabetes 53 2359 2365 Sjostrand M Gudbjornsdottir S Holmang A Lonn L Strindberg L Lonnroth P 2002 Delayed trans capillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects Diabetes 51 2742 2748 28 UTILIZACI N PREVISTA Mercodia Insulin ELISA es un m todo para la determinaci n cuantitativa de insulina humana en suero o plasma RESUMEN Y EXPLICACI N DE LA PRUEBA La insulina es la principal hormona encargada del control del metabolismo de la glucosa Es sintetizada por las c lulas B de los islotes de Langerhans como el precursor proinsulina que se procesa para formar p ptido C e insulina Ambos se secretan en cantidades equimolares a la circulaci n portal La mol cula de insulina madura consta de dos cadenas polipept dicas la cadena A y la cadena B 21 y 30 amino cidos respectivamente Las dos cadenas est n unidas por dos puentes disulfuro intercatenarios En la cadena A tambi n hay un puente disulfuro intracatenario La secreci n de insulina se controla principalmente mediante la concentraci n plasm tica de glucosa y la hormona tiene diversas e importantes acciones metab licas Su funci n principal es controlar la captaci n y utilizaci n de glucosa en los tejidos perif ricos por medio de la glucosa Esta y otras acciones hipogluc micas como la inhibici n de la neoglucogenesis y la glucogeno lisis hep tica e
31. em Wasser 14 20 entsprechend der folgenden Tabelle Gr ndliches mischen erforderlich Anzahl Platten Wash doppelt dest Buffer 21X Wasser 10 Platten 2 Flaschen 8000 ml 5 Platten 180 ml 3600 ml 3 Platten 110 ml 2200 ml 2 Platten 70 ml 1400 ml 1 Platten 35 ml 700 ml Lagerung nach Vermischung 4 Wochen bei einer Temperatur von 2 8 C PR PARATGEWINNUNG UND HANDHABUNG Serum Gewinnen von Blut durch Venenpunktion gerinnen lassen und das Serums durch Zentrifugieren abtrennen Die Proben k nnen bis zu 24 Stunden bei 2 8 C aufbewahrt werden L ngere Lagerzeiten erfordern eine Temperatur von 20 C Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden Plasma Gewinnen von Blut durch Venenpunktion Verhinderung einer Koagulation des Venenblutes durch die Zugabe von Heparin oder EDTA AnschlieBend Trennung der Plasmafraktion Die Proben k nnen bis zu 24 Stunden bei 2 8 C aufbewahrt werden L ngere Lagerzeiten erfordern eine Temperatur von 20 C Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden 16 Vorbereitung der Proben Normalerweise ist eine Verd nnung der Proben nicht notwendig Liegt jedoch die Konzentration ber 200 mU I wird eine Verd nnung von 1 10 v v mit Calibrator 0 empfohlen TESTDURCHF HRUNG Alle Reagenzien m ssen vor Beginn auf Raumtemperatur gebracht werden Ebenso sollte f r jeden Test eine Kalibratorkurve gemacht werden Vorbereiten der Enzymkonjugatl sung und der Waschl s
32. enne og andre hypoglyk miske aktiviteter som f eks haemningen af hepatisk glukoneogenese og glycogenolyse modvirkes af de hyper glyk miske hormoner herunder glukagon epinephrin adrenalin v ksthormon og cortisol Insulintoncentrationer er kraftigt reduceret ved insulinafh ngig diabetes mellitus IDDM og visse andre tilstande som f eks hypopituitarisme Insulinkoncentrationen er forh jet ved insulin uafh ngig diabetes mellitus NIDDM fedme insulinoma og visse endokrine dysfunktioner som f eks Cushings syndrom og akromegali PRINCIP FOR PROCEDUREN Mercodia Insulin ELISA er en tosidet solid phase enzymimmunanalyse Den er baseret p den direkte sandwich teknik hvor to monoklonale antistoffer rettes mod separate antigene deter minanter p insulin molekylet Under inkubation reagerer insulin i proven med peroxydase konjugeret anti insulin antistoffer og anti insulin antistoffer bundet til mikrotitreringsbrenden En enkel skylning fjerner ubundet enzym maerket antistof Det bundne konjugat registreres ved reaktion med 3 3 5 5 tetramethylbenzidin TMB Reaktionen stoppes ved at tils tte syre for at give et kolorimetrisk endepunkt der afl ses spektrofotometrisk ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Til in vitro diagnosticering Indholdet af dette s t samt rester deraf m ikke komme i kontakt med dravtyggende dyr eller svin e Stop Solution i dette s t indeholder 0 5 M H S0 Overhold almindelige forholdsregler for h ndteri
33. ensates for reduced insulin secretion in normal weight and normal glucose tolerant first degree relatives of type 2 diabetic patients Diabetes 53 2359 2365 Sjostrand M Gudbjornsdottir S Holmang A Lonn L Strindberg L Lonnroth P 2002 Delayed ranscapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects Diabetes 61 62 63 SUMMARY PROTOCOL SHEET ZUSAMMENFASSUNG DES PROTOKOLLBLATTES FEUILLE DE PROTOCOLE RESUMEE HOJA DE RESUMEN DEL PROTOCOLO PRO TOCOLLO DI SINTESI OVERSIGTSPROTOKOLARK SAMMANFATTNINGSPROTOKOLL Mercodia Insulin ELISA Add Calibrators and samples 25 ul Incubate 15 minutes 18 25 C Calibrators und Proben beigeben Inkubieren 15 Minuten 18 25 C Ajout de Calibrators et d chantillons Incubation 15 minutes 18 25 C A adir Calibrators y muestras Incubar 15 min 18 25 C Aggiungere Calibrators e campioni Incubazione 15 minuti 18 25 C ils t Calibrators og pr ver Inkuber 15 min 18 25 C ills tt Calibrators och prover Inkubera 15 minuter 18 25 C Add enzyme conjugate solution 100 pl Add Stop Solution 50 yl Shake for 5 sec Aj AI A i i Enzymkonjugatl sung beif gen jout du conjugu enzymatique adir la disoluci n de conjugado enzym tico ggiungere la soluzione enzima coniugato s t enzymekonjugatoplasning Is tt enzymekonjugatl sning Stop Solution beif gen Ajout de Stop Solution A adir Stop Solution Aggiungere Stop Solution Tils t Sto
34. erum oder Plasma ZUSAMMENFASSUNG UND ERKL RUNG DES TESTES nsulinmolek l be Aminos uren Di bunden In der A Die Sekretion kontrolliert Dabe C peptide werden in gleichmolaren haupts chliche Funktion ist die Absorption steht aus zwei Polypeptidke des Insulins wird haupts d i hat das Hormon eine Anz nsulin ist das bedeutendste Hormon das f r die Kontrolle des Glukosestoffwechsels verant wortlich ist Es wird in den f Zellen der la Vorstufe Proinsulin welche in C Peptide und Insulin umgeformt wird Sowohl Insulin als auch Mengen in das Verdauungssystem sekretiert Das ausgereifte ngerhans schen Inselzellen gebildet Ebenso die ten der A Kette und der B Kette 21 respektive 30 e zwei Ketten sind durch zwei Interketten Disulphidbr cken miteinander ver Kette befindet sich ebenfalls eine Intraketten Disulphidbr cke hlich durch die Glukosekonzentration im Plasma ahl wichtiger Funktionen im Metabolismus Seine und die Verwertung der Glukose im peripheren Gewebe via Glukosetransport Hyperglyk mische Hormone wie das Glukagon Epinephrin Adrenalin Wachstumshormone und Kortiso wie der Inhibition der Glukoneogenese und d wirken hypoglyk mischen Aktivit ten entgegen er Glykogenolyse Die Insulinkonzentration im Blut ist in der insulinabh ngigen Diabetes Mellitus IDDM und unter einigen anderen Bedingungen wie der Hypopituitarism betr chtlich reduziert Insulin ist erh ht bei nich
35. essaire la solusion de lavage en diluant 21X Wash Buffer dans l eau distill e 14 20 en suivant les indications du tableau ci dessous M langez correctement Nombre de plaques Wash Eau Buffer 21X redistill e 10 plaques 2 flacones 8000 ml 5 plaques 180 ml 3600 ml 3 plaques 110 ml 2200 ml 2 plaques 70 ml 1400 ml 1 plaque 35 ml 700 ml Stockage apr s dilution temperature comprise entre 2 8 C pendant 4 semaines COLLECTE ET MANIPULATION DES SP CIMENS S rum Collectez le sang par ponction veineuse attendez la coagulation puis isolez le s rum par centrifugation Les chantillons peuvent tre stock s jusqu 24 heures une temp rature comprise entre 2 et 8 C Pour les conserver plus longtemps stockez les 20 C Evitez de les congeler et de les d congeler plusieurs fois Plasma Collectez le sang par ponction veineuse dans des tubes contenant de l h parine ou de l EDTA comme anticoagulant et isolez le plasma Les chantillons peuvent tre stock s jusqu 24 heures une temp rature comprise entre 2 et 8 C Pour les conserver plus longtemps stockez les 20 C Evitez de les congeler et de les d congeler plusieurs fois 24 Pr paration des chantillons En g n ral les chantillons n ont pas besoin d tre dilu s toutfois ceux dont la concentration est sup rieure 200 mU I doivent dilu s 1 9 v v avec le Calibrator 0 PROC DURE DE TEST Tous les r actifs et chantillons doivent
36. h event Mercodia AB disclaims all warranties expressed implied or statutory including the implied warranty of merchantability and fitness for use Mercodia AB and its authorised distributors in such event shall not be liable for damages indirect or consequential REFERENCES Gaines Das R E and Bristow A F 1988 WHO sulin and human C peptide Bio Stand 16 179 Lindstrom T Hedman CA Arnqvist HJ 2002 Use of a novel double antibody technique to describe he pharmacokinetics of rapid acting insulin ana sensitivity Diabetologia 47 1016 1019 Rudovich NN Rochlitz HJ Pfeiffer AF 2004 Red nternational reference reagents for human proin 186 logs Diabetes Care 25 1049 105454 Riserus U Vessby B Arner P Zethelius B 2004 Supplementation with trans10cis12 conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men close association with impaired insulin uced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal weight and normal glucose tolerant first degree relatives of 51 2742 2748 12 ype 2 diabetic patients Diabetes 53 2359 2365 Sjostrand M Gudbjornsdottir S Holmang A Lonn L Strindberg L Lonnroth P 2002 Delayed ranscapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects Diabetes ZIELSETZUNG Mercodia Insulin ELISA bietet eine Methode zur quantitativen Bestimmung von Insulin in huma nem S
37. ico y de soluci n de lavado Preparar suficientes pocillos de microplaca para los Calibrators y muestras por duplicado Pipetear 25 pl de cada Calibrator y muestra en los pocillos correspondientes A adir 100 ul disoluci n de conjugado enzim tico a cada pocillo Incubar en un agitador de placas 700 900 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente 18 25 C 6 Lavar 6 veces con 700 ul pocillo mediante Lavador de placas automatico con funci n de sobre flujo de lavado No usar el paso de remojo durante el proceso O manualmente Verter el liquido invirtiendo la microplaca en una pila Afiadir 350 pl de soluci n de lavado golpeando firmemente la placa contra papel absorbente para eliminar todo el l quido en exceso Repetir 5 veces Evitar remojo prolongado durante el proceso 7 A adir 200 pl de Substrate TMB Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente 18 25 C 9 Afiadir 50 ul de Stop Solution a cada pocillo Colocar la placa en un agitador durante aproximadamente 5 segundos para aseguar el mezclado 10 Leer la densidad ptica a 450 nm y calcular los resultados Leer en 30 minutos um E amp FA oo Aviso Usar pipetas distintas para prevenir contaminaci n entre conjugado y substrato CONTROL DE CALIDAD INTERNA Los controles comerciales como Mercodia Diabetes antigen control N de c digo 10 1164 01 ylo mezclas de sueros internas con concentraciones de insulina bajas medias y altas se ana
38. igenici separati sulla molecola insulina Durante l incubazione la insulina presente nel campione reagisce con gli anticorpi anti insulina coniugati a perossidasi e gli anticorpi anti insulina legati al pozetto per microtitolazione Un leggero lavaggio rimuovi indirettamente l anticorpo Enzyme marcato Il Conjugate diretto scoperto dalla reazione con 3 3 5 5 tetrametibenzidine TMB La reazione fermata aggiungendo acido per dare una posizione estrema colorimetrica che letta spettrometricamente PREACAUZIONI E AVVISI e Per l uso diagnostico in vitro e contenuti di questo kit e i suoi residui non devono essere ammessi al contatto con animali ruminanti o suini e La Stop Solution in questo kit contiene 0 5 M H S0 Seguire le precauzioni quotidiane di rou tine per maneggiare sostanze chimiche pericolose Tutti i pazienti presi come campione potrebbero essere trattati come capaci di trasmettere infezioni 37 MATERIALI RICHIESTI MA NON INCLUSI Pipette for 25 50 100 200 e 1000 pil riutilizza le pipette in dotazione per l aggiunta della soluzione enzima coniugato Substrate TMB e Stop Solution Beakers e cilindri per la preparazione di reagenti Acqua ridistillata Lettore micro piastra 450nm filtro Piastra dello shaker La velocit raccomandata di 700 900 giri minuto movimento orbitale Micro piastra piano di lavaggio REAGENTI 1 X 96 Ogni kit Mercodia Insulin ELISA 10 1113 01 contiene reagenti
39. ion kan udfares for at opn koncentrationen af insulin Manuel beregning 1 Plot de absorbansveerdier der er opn et for Calibrators bortset fra Calibrator 0 mod insulin koncentrationen p dobbeltlogaritmisk papir og tegn en kalibratorkurve 2 Aflaes koncentrationen for de ukendte prover fra kalibratorkurven Eksempel p resultater Brande Identitet Auen Gennemsnit konc mU I 1 A B Calibrator 0 0 070 0 071 1C D Calibrator 1 0 105 0 106 1E F Calibrator 2 0 202 0 204 1 G H Calibrator 3 0 434 0 470 2 A B Calibrator 4 1 348 1 351 2 C D Calibrator 5 2 451 2 476 2 E F Ukendt 1 0 222 0 214 11 1 2 G H Ukendt 2 0 546 0 538 35 6 3 A B Ukendt 3 1 941 1 978 153 Koncentration angivet p h tteglassets etiket Exempel p kalibratorkurve Der vises en typisk kalibratorkurve Brug ikke denne kurve til at bestemme faktiske analyse resultater 1 00 0 D 450 nm 0 10 1 10 100 1000 Insulin mU l 50 KONVERTERINGSFAKTOR 1 g l 29 mU I 1 mU I 6 0 pmol l PROCEDURENS BEGR NSNINGER Som ved alle diagnosticeringsanalyser m en definitiv klinisk diagnose ikke baseres p resulta tet af en enkelt analyse men skal foretages af laegen efter at alle kliniske resultater er blevet be d mt Anvendelsen af denne test p individer der allerede er i insulinbehandling kompliceres af dannelse af anti insulin antistoffer der kan forstyrre analysen St rkt lip
40. lizar n de forma rutinaria como muestras desconocidas y los resultados se representar n d a a d a Es una buena pr ctica de laboratorio registrar los siguientes datos en cada ensayo n mero de lote del kit fechas de reconstituci n de los componentes del kit valores de DO de blanco Calibrators y controles 33 C LCULO DE RESULTADOS C lculo computarizado Para obtener la concentraci n de insulina puede realizarse la reducci n de datos computarizados de la absorbancia para los Calibrators sin Calibrator 0 frente a la concentraci n utilizando una regresi n spline c bica C lculo manual 1 Representar gr ficamente los valores de absorbancia obtenidos para los Calibrators sin Calibrator 0 frente a la concentraci n de insulina en papel log log y construir una curva de calibraci n 2 Leer la concentraci n de las muestras desconocidas a partir de la curva de calibraci n Ejemplo de resultados Pocillos Identidad Auen Conc media mU I 1A B Calibrator 0 0 070 0 071 1C D Calibrator 1 1 105 0 106 1E F Calibrator 2 0 202 0 204 1 G H Calibrator 3 0 434 0 470 2A B Calibrator 4 1 348 1 351 2C D Calibrator 5 2 451 2 476 2 E F Desconocida 1 0 222 0 214 314 2 G H Desconocida 2 0 546 0 538 35 6 3A B Desconocida 3 1 941 1 978 153 Concentraci n indicada en la etiqueta del vial Ejemplo de curva de calibraci n Aqui se presenta una curva de calibraci n tipica Esta curva no debe utilizarse para
41. mes against absorbent paper to remove excess liquid Repeat 5 times Avoid prolonged soaking during washing Add 200 ul Substrate TMB into each wel Incubate for 15 minutes at room temperature 18 25 C Add 50 ul Stop Solution to each well Place plate on a shaker for approximately 5 seconds to ensure mixing 10 Read optical density at 450 nm and calculate results Read within 30 minutes O Un Ps D EES Note To prevent contamination between the conjugate and substrate separate pipettes are recommended INTERNAL QUALITY CONTROL Commersial controls such as Mercodia Diabetes antigen control Code No 10 1134 01 10 1164 01 and or internal serum pools with low intermediate and high insulin concentration should routinely be assayed as unknowns and results charted from day to day It is good laboratory practice to record the following data for each assay kit lot number reconstitution date of components OD values for the blank Calibrators and controls CALCULATION OF RESULTS Computerized calculation The concentration of insulin is obtained by computerized data reduction of the absorbance for the Calibrators except for Calibrator 0 versus the concentration using cubic spline regression Manual calculation 1 Plotthe absorbance values obtained for the Calibrators except for Calibrator 0 against the insulin concentration on a log log paper and construct a calibrator curve 2 Read the concentration of the unk
42. microtiterplattan upp och ner ver en slask Tills tt 350 pl tv ttl sning till varje brunn Avl gsna tv ttl sningen knacka plattan best mt flera g nger p absorberande papper f r att ta bort verf dig v tska Upprepa 5 g nger Undvik l ngvarig soak under tv ttproceduren 7 Tills tt 200 ul Substrate TMB till varje brunn nkubera i 15 minuter vid rumstemperatur 18 25 C Ils tt 50 pl Stop solution till varje brunn Placera plattan p en plattskak i ca 5 sekunder f r att se till att l sningen blandas 10 Avl s optisk densitet vid 450 nm och ber kna resultaten Avl s inom 30 minuter N anu kw m vo sia Obs F r att undvika kontamination rekommenderas att separata pipetter anv nds f r konjugat och substrat INTERN KVALITETSKONTROLL Kommersiella kontroller s som Mercodia Diabetes antigen control Kod nr 10 1164 01 och eller interna kontrollprover med l ga mellan och h ga insulinkoncentrationer b r regelm ssigt analyseras som ok nda och resultaten b r kartl ggas dag f r dag Det tillh r goda laboratorie rutiner att anteckna f ljande uppgifter f r varje test kitets lotnummer kitkomponenternas rekonstitutionsdatum OD v rden f r blankv rde Calibrators och kontroller 57 CD ACT BER KNING AV RESULTATEN Datorber kning Kalibratorkurva kan konstrueras genom att anv nda cubic spline regression med absorbansvardena f r Calibrators f rutom Calibrato
43. ml Preparation de soluci n de lavado Preparar el volumen necessario solusi n de lavado diluyendo el Wash Buffer 21X en agua bidestilada 1 20 seg n la siguiente tabla Mezclar adecuadamente Nombre de placas Wash Agua Buffer 21X bidestilada 10 placas 2 botellas 8000 ml 5 placas 180 ml 3600 ml 3 placas 110 ml 2200 ml 2 placas 70 ml 1400 ml 1 placa 35 ml 700 ml Conservaci n despu s de la diluci n 2 8 C durante 4 semanas OBTENCI N Y MANIPULACI N DE MUESTRAS Suero Recoger la sangre por venipunci n dejar coagular y separar el suero por centrifugaci n Las muestras pueden conservarse a 2 8 C hasta 24 horas Para periodos m s largos conservar las muestras a 20 C Evitar la congelaci n y descongelaci n de forma repetida Plasma Recoger la sangre por venipunci n en tubos que contienen heparina o EDTA como anti coagulante y separar la fracci n de plasma Las muestras pueden conservarse a 2 8 C hasta 24 horas Para periodos m s largos conservar las muestras a 20 C Evitar la congelaci n y descongelaci n de forma repetida 32 Preparaci n de las muestras Normalmente no es necesario diluirlas sin embargo las muestras que contienen gt 200 mU I deben diluirse 1 9 v v Calibrator 0 PROCEDIMIENTO DE EVALUACI N odos los reactivos y muestras deben estar a temperatura ambiente antes de su uso Preparar una curva de calibraci n para cada ensayo Preparar disoluci n de conjugado enzim t
44. mpaired insulin sensitivity Diabetologia 47 1016 1019 Rudovich NN Rochlitz HJ Pfeiffer AF 2004 Reduced hepatic insulin extraction in response to gast ric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal weight and normal glucose tolerant first degree relatives of type 2 diabetic patients Diabetes 53 2359 2365 Sjostrand M Gudbjornsdottir S Holmang A Lonn L Strindberg L Lonnroth P 2002 Delayed ranscapillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects Diabetes 51 2742 2748 44 TILSIGTET ANVENDELSE Mercodia Insulin ELISA er en metode til kvantitativ bestemmelse af humant insulin i serum eller plasma OVERSIGT OG FORKLARING AF ANALYSEN Insulin er det vigtigste hormon i forbindelse med styring af glukosemetabolismen Det synteti seres i B cellerne i de langerhanske ger ligesom forl beren proinsulin der behandles for at danne C peptid og insulin De udskilles begge i aekvimolaere maengder i portal cirkulation Det modne insulinmolekyle best r af to polypeptid kaeder A kaeden og B kaeden med henholdsvis 21 og 30 aminosyrer De to k der k des sammen af to disulfid broer mellem k derne Der er ogs en kaedeintern disulfid bro i A kaeden Insulinudskillelsen styres prim rt af glukosekoncentrationen i plasma og hormonet har en raekke vigtige stofskiftefunktioner Den primaere funktion er at styre optagelsen og udnyttelsen af glukose i perifert v v via glukosetransporteren D
45. nd 10 plader 2 flasker 8000 ml 5 plader 180 ml 3600 ml 3 plader 110 ml 2200 ml 2 plader 70 ml 1400 ml 1 plade 35 ml 700 ml Opbevaring efter fortynding 2 8 C i 4 uger UDTAGNING OG H NDTERING AF PROVER Serum Tag blod ved venepunktur lad det koagulere og adskil serummet ved centrifugering Prover kan opbevares ved 2 8 C i op til 24 timer L ngere opbevaring skal ske ved 20 C Undg at ned fryse og opto af flere omgange Plasma Tag blod ved venepunktur i rar med heparin eller EDTA som antikoagulant og adskil plasma fraktionen Prover kan opbevares ved 2 8 C i op til 24 timer L ngere opbevaring skal ske ved 20 C Undg at nedfryse og opta af flere omgange 48 Forberedelse af prover Fortynding er normalt ikke noedvendigt men proever der indeholder gt 200 mU l skal fortyndes 14 9 v v med Calibrator 0 TESTPROCEDURE Alle reagenser og prover skal bringes til stuetemperatur for brug Lav en kalibratorkurve for hver analysekorsel 1 Klarger enzymkonjugatoplesning og vaske opl sning 2 Klarger tilstraekkeligt med mikropladebrende til Calibrators og prover i dublet 3 Pipetter 25 yl af bade Calibrators og pr ver i de relevante br nde 4 Tils t 100 ul enzymkonjugatoplasning i hver brand 5 Inkuber p et rystebord 700 900 rpm i 1 time ved stuetemperatur 18 25 C 6 Vask 6 gange med 700 pl per brand anvend en automatisk pladevasker med overflow unktion Benyt ikke soak funktion i vaske proceduren
46. ng af farlige kemikalier Alle patientprover skal h ndteres som potentielt smittefarlige 45 NODVENDIGE MEN IKKE MEDFOLGENDE MATERIALER Pipetter til 25 50 100 200 og 1000 pl repetitionspipetter foretraekkes til tilsaetning af enzymkonjugatoplosning Substrate TMB og Stop Solution e Bagerglas og m lebeegre til klarg ring af reagenser e Redestilleret vand e Mikropladeaflaeser 450 nm filter e Rystebord Anbefalet hastighed er 700 900 omdrejninger per minut orbital bev gelse Skylleanordning til mikroplader REAGENSER 1X96 Hvert Mercodia Insulin ELISA 10 1113 01 seet indeholder reagenser til 96 brande nok til 42 prover og en kalibratorkurve i dublet Til sterre analyseserier skal der bruges puljereagenser fra pakker med samme partinummer Udlabsdatoen for hele s ttet er angivet p den yderste etiket Den anbefalede opbevaringstemperatur er 2 8 C Coated plate 1 plade 96 brande Klar til brug Monoklonalt anti insulin fra mus Strimler med 8 brende Ved ubrugte mikropladebrande skal posen genforsegles og brandene bruges inden for 2 m neder Calibrators 1 2 3 4 5 5 h tteglas 1000 pl Klar til brug Koncentration angivet p h tteglassets etikett rekombineret humant insulin Farvekodet gul Calibrator 0 haetteglas 5 ml Klar til brug Farvekodet gul Enzyme Conjugate 11X haetteglas 1 2 ml Klarg ring Peroxidase konjugeret fra mus se nedenfor monoklonalt Anti insulin Enzyme Conjuga
47. nown samples from the calibrator curve Example of results Wells Identity Auen Mean conc mU I 1A B Calibrator 0 0 070 0 071 1C D Calibrator 1 0 105 0 106 1E F Calibrator 2 0 202 0 204 1 G H Calibrator 3 0 434 0 470 2 A B Calibrator 4 1 348 1 351 2C D Calibrator 5 2 451 2 476 2 E F Unknown 1 0 222 0 214 11 1 2 G H Unknown 2 0 546 0 538 35 6 3A B Unknown 3 1 941 1 978 153 Concentration indicated on vial label Example of calibrator curve A typical calibrator curve is shown here Do not use this curve to determine actual assay results 1 00 0 D 450 nm 0 10 j 001 pn 1 10 100 1000 Insulin mU I Conversion factor 1 ugi 29 mU I 1 mU I 6 0 pmol l LIMITATIONS OF THE PROCEDURE As with all diagnostic tests a definitive clinical diagnosis should not be based on the results of a single test but should be made by the physician after all clinical findings have been evaluated Application of this test to individuals already undergoing insulin therapy is complicated by formation of anti insulin antibodies that are capable of interfering in the assay Grossly lipemic icteric or hemolysed samples do not interfere in the assay EXPECTED VALUES Good practice dictates that each laboratory establishes its own expected range of values The following results may serve as a guide until the laboratory has gathered sufficient data of its own Fasting levels for 137 tested apparently health
48. nsulin 48 Bovine insulin 31 KALIBRERING Mercodia Insulin ELISA saettet er kalibreret mod den 1st International Reference Preparation 66 304 GARANTI De angivne ydeevnedata blev opn et ved af den angivne fremgangsm de Alle aendringer af fremgangsmaden der ikke anbefales af Mercodia AB kan pavirke resultaterne og i dette tilfaelde oph ver Mercodia AB alle garantier det v re sig udtrykkelige stiltiende eller lovbefalede her under den stiltiende garanti for salgbarhed og egnethed til et bestemt formal I et s dant tilfaelde kan Mercodia AB og dennes autoriserede distributarer ikke drages til ansvar for indirekte skader eller f lgeskader REFERENCER Gaines Das R E and Bristow A F 1988 WHO International reference reagents for human pro insulin and human C peptide Biol Stand 16 179 186 Lindstrom T Hedman CA Arnqvist HJ 2002 Use of a novel double antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid acting insulin analogs Diabetes Care 25 1049 1054 Riserus U Vessby B Arner P Zethelius B 2004 Supplementation with trans10cis12 conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men close association with impaired insulin sensitivity Diabetologia 47 1016 1019 Rudovich NN Rochlitz HJ Pfeiffer AF 2004 Reduced hepatic insulin extraction in response to gas tric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal weight and normal glucose tolerant first degree relative
49. nto all uso Blu colore codificato Wash Buffer 21 X 2 bottiglia 200 ml Per la preparazione vedi sotto Substrate TMB 1 fiala 220 ml Pronto all uso Soluzione incolore Nota Sensibile alla luce Stop Solution 1 fiala 70 ml Pronto all uso 0 5 M H 50 39 Preparazione della soluzione enzima coniugato Preparare la quantit necessaria della soluzione enzima coniugato con la diluizione dell Enzyme Conjugate 11X 1 10 nel Enzyme Conugate Buffer in base alla tabella sottostante Mescolare lievemente Usare entro un giorno Numero di piastra Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 10 piastra 1 fiala 1 bottiglia 5 piastra 5 0 ml 50 ml 3 piastra 3 0 ml 30 ml 2 piastra 2 0 ml 20 ml 1 piastra 1 0 ml 10 ml Preparazione di soluzione di lavaggio Preparare la quantit necessaria il tampone di lavaggio con la diluizione del Wash Buffer 21X in acqua ridistillata 1 20 in base alla tabella sottostante Mescolare icompletamente Numero di piastra Wash Buffer 21X Acqua ridistillata 10 piastra 2 bottiglia 8000 ml 5 piastra 180 ml 3600 ml 3 piastra 110 ml 2200 ml 2 piastra 70 ml 1400 ml 1 piastra 35 ml 700 ml Dopo la diluizione conservare a 2 8 C per 4 settimane LA RACCOLTA E IL TRATTAMENTO DEL MODELLO Il siero Il prelievo in vena di sangue permette di coagulare e separare il siero con la centrifugazione campioni possono essere conservati a 2 8 C fino a 24 ore Per periodo pi lunghi conse
50. onjugate 11X 1 10 nel Enzyme Conjugate Buffer in base alla tabella sottostante Quando si prepara la soluzione enzima coniugato per tutta la piastra versare tutto il tampone Enzyme Conjugate Buffer nella fiala dell Enzyme Conjugate 11X Mescolare lievemente Usare entro un giorno Numero di strisce Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 12 strisce 1 fiala 1 fiala 8 strisce 700 pl 7 0 ml 6 strisce 500 pl 5 0 ml 4 strisce 350 ul 3 5 ml REAGENTI 10 X 96 Ogni kit Mercodia Insulin ELISA 10 1 113 10 contiene reagenti per 10 x 96 prove sufficienti per 42 campioni e una calibratura curva in duplicato Per diverse serie di analisi usare reagenti provenienti da scatole portanti identici numeri di lotto La data di scadenza del kit completo stabilita sull etichetta all esterno Si raccomanda di conservare ad una temperatura di 2 8 C Coated plate 10 piastra 96 pozzetti Pronti per l uso Topo monoclonale anti insulina 8 strips per pozzetti pozzetti delle micro piastre inutilizzati devono essere risigillati e adoperati entro due mesi Calibrators 1 2 3 4 5 5 fiale 100041 Pronto all uso Conc indicata sull etichetta della fiala recombinant human insulin Giallo colore codificato Calibrator 0 1 fiala 5 ml Pronto all uso Giallo colore codificato 2 E 5 Enzyme Conjugate 11X 1 fiala 12ml Peroxidase Conjugate topo monoclinale Anti insulina Enzyme Conjugate Buffer 1 fiala 120 ml Pro
51. onjugate Buffer Fl schchen 12 ml gebrauchsfertig Blauf rbung Wash Buffer 21X Flasche 50 ml Waschl sung Verd nnen mit 1000 ml dest Wasser Lagerung nach der Verd nnung 4 Wochen bei einer Temperatur von 2 8 C TMB Substrate Fl schchen 22 ml gebrauchsfertig Farblose L sung Achtung lichtempfindlich Stop Solution Fl schchen 7 ml gebrauchsfertig 0 5 MH SO Vorbereitung der Enzymkonjugatl sung Vorbereiten der ben tigten Konjugatl sung durch mischen von Enzym Conjugate 11X 14 10 mit Enzym Conjugate Buffer entsprechend der folgenden Tabelle W hrend Sie die Konju gatl sung f r die ganze platte vorbereiten sch tten Sie den Enzyme Conjugate Buffer komplett in das Fl schchen Enzym Conjugate 11X Vorsichtig mischen Innerhalb eines Tages aufbrauchen Anzahl Streifen Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 12 Streifen 1 Fl schen 1 Fl schen 8 Streifen 700 ul 7 0 ml 6 Streifen 500 pl 5 0 ml 4 Streifen 350 ul 3 5 ml REAGENZIEN 10 X 96 Jeder Mercodia Insulin ELISA Kit 10 1113 10 enth lt Reagenzien f r 10 x 96 Brunnen Dies reicht aus f r 42 Proben und eine Kalibratorkurve im Duplikat pro Platte F r gr ssere Test Serien ist es empfehlenswert Reagenzien die miteinander vermischt werden sollen aus Packungen mit der selben Lot Nummer anzuwenden Das Haltbarkeitsdatum f r das komplette Kit ist auf dem Etikett der Packung vermerkt Die empfohlene Lagerungstemperatur ist 2 8 C Coated
52. oposti a terapie di insulina ostacolato dalla formazione di anticorpi anti insulina in grado di interferire nell analisi Grossolanamente campioni lipemic itterico o hemolysed non interferiscono nell analisi VALORI PREVISTI E buona norma e pratica di ogni laboratorio stabilire una serie del tutto sua di presunti valori seguenti risultati potrebbero servire come guida fino a che il laboratorio abbia raccolto dati sufficienti del tutto suoi I livelli di digiuno per 137 esaminati individui apparentemente sani hanno reso un media di 9 2 mU I una mediana di 6 9 mU I e una serie corrispondente al centrale 95 delle osservazioni dei 2 25 mU l CARATTERISTICHE E ESECUZIONE Il limite della scoperta Il limite della scoperta 1mU I calcolato come due deviazioni standard sopra della Calibrator 0 Riacquisto Il riacquisto sull aggiunta 94 113 significa 104 Hook effect I campioni con una concentrazione sopra i 30000 mU I pu essere analizzata senza dare falsa mente bassi risultati E gt 5 Precisione Ogni campione stato analizzato su 6 riprodotti in 6 diversi momenti Campioni Valore principale Coefficiente di variazione MU Nell analisi Fra analisi Totale analisi 96 1 11 34 3 6 5 0 2 36 4 0 2 6 4 7 3 80 2 8 2 8 4 0 4 154 3 2 2 9 4 4 43 Specificit Sono state trovate le seguenti reazioni trasversali C peptide 0 0196 Proinsulina 0 0196 Proinsulina des 31 32
53. or identificada en una etiqueta La temperatura de conservaci n recomendada es 2 8 C Coated plate 10 placa 96 pocillos Listo para usar anticuerpo monoclonal de rat n anti insulina 8 tiras de pocillos Para los pocillos de microplacas no utilizados volver a sellar la bolsa y utilizarlos en los dos meses Siguientes Calibrators 1 2 3 4 5 5 viales 1000 ul Listo para usar Conc indicada en la etiqueta del vial recombinant human insulin Codificado en amarillo Calibrator 0 1 vial 5 ml Listo para usar Codificado en amarillo Enzyme Conjugate 11X 1 vial 12 ml Preparaci n Monoclonal de rat n Enzyme Conjugate v ase a continuaci n con peroxidasa anti insulina Enzyme Conjugate Buffer 1 botella 120 ml Listo para usar Codificado en azul Wash Buffer 21X 2 botella 200 ml Preparaci n v ase a continuaci n Substrate TMB 1 vial 220 ml Listo para usar Soluci n incolora Atenci n Es sensible a la luz Stop Solution 1 vial 70 ml Listo para usar 0 5 MH SO 31 Preparaci n de la disoluci n conjugado enzim tico Preparar el volumen necessario disoluci n conjugado enzim tico por diluci n del Enzyme Conjugate 11X 1 10 en Enzyme Conjugate Buffer seg n la siguiente tabla Mezclar suave mente Utilizar en un dia N mero de placas Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 10 placas 1 vial 1 botella 5 placas 5 0 ml 50 ml 3 placas 3 0 ml 30 ml 2 placas 2 0 ml 20 ml 1 placa 1 0 ml 10
54. ous 30 minutes sie5ueJ4 oo Note Pour viter les contaminations du conjugue avec le substrat il est recommand d utiliser es pipettes diff rentes a CONTR LE QUALIT INTERNE Les contr les disponibles dans le commerce tels que le Mercodia Diabetes antigen control r f rence 10 1134 01 10 1164 01 ou les m langes de s rums internes dont la concentration en insuline est faible moyenne ou lev e doivent syst matiquement amp tre soumis un dosage comme des m langes de concentration inconnue et les r sultats doivent amp tre report s sur un graphique journalier C est une bonne pratique pour un laboratoire d enregistrer les donn es sui vantes pour chaque dosage num ro de lot du kit dates de reconstitution des composants valeurs OD du blanc des calibrators et des contr les 25 CALCUL DES R SULTATS Calcul par ordinateur Pour calculer la concentration en insuline r duisez les donn es d absorbance des Calibrators l exception du Calibrator 0 compar es la concentration en appliquant une quation de r gression de la spline cubique Calcul manuel 1 Placez les points correspondant aux valeurs d absorbance obtenues pour les Calibrators l exception du Calibrator 0 en fonction de la concentration d insulin sur du papier pour graphiques logarithmiques et tracez la courbe d talonnage 2 Lisez la concentration des nouveaux chantillons partir de cette courbe Exemple de
55. p Solution Tills tt Stop Solution to ensure mixing 50 ul Sicherstellen von Durchmischung 5 Sek sch tteln 50 pl Secouer pendant 5 secondes pour bien m langer 50 pl Agitar durante 5 segundos para ase gurar el mezclado 50 pl Scuotere per 5 secondi per assi curarsi che sia tutto mescolato 50 pl Rysti 5 sekunder for sikre blanding 50 pl Skaka i 5 sekunder f r att se till att l sningen blandas Measure Aso Messung Aaen Mesure de A459 Medir Auen Misura A 4so Allez Ayso Mat vid An ncubate 1 hour at 18 25 C on a shaker nkubieren 1 Stunde auf einem Sch ttler bei 18 25 C ncubation 1 heure 18 25 C sur un agita teur secoueur de plaques ncubar 1 hora a 18 25 C en un agitador de placas incubazione 1 ora a 18 25 C in una piastra shaker nkuber 1 time ved 18 25 C p et ryste bord nkubera 1 timme vid 18 25 C p en plattskak Wash 6 times Waschen 6 mal incage 6 rincages avar 6 veces avare 6 volte Skyl 6 gange v tta 6 g nger Add Substrate TMB 200 pl Substrate TMB beigeben Ajout de Substrate TMB A adir Substrate TMB Aggiungere Substrate TMB Tilsaet Substrate TMB Tills tt Substrate TMB 31 3107 Revised 2009 05 05 X O Graf Tryckeri AB
56. patient speciments should be handled as of capable of transmitting infections MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED Pipettes for 25 50 100 200 and 1000 ul repeat pipettes preferred for addition of enzyme e Beakers and cylinders for reagent preparation e Redistilled water Microplate reader 450 nm filter conjugate solution Substrate TMB and Stop Solution e Plate shaker The recommended velocity is 700 900 cycles per minute orbital movement Microplate washing device REAGENTS 1 X 96 Each Mercodia Insulin ELISA kit 10 1113 01 contains reagents for 96 wells sufficient for 42 samples and one calibrator curve in duplicate For larger series of assays use pooled reagents from packages bearing identical lot numbers The expiry date for the complete kit is stated on the outer label The recommended storage temperature is 2 8 C Coated Plate mouse monoclonal anti insulin 1 plate 8 well strips 96 wells Ready for use For unused microplate wells completely reseal the bag using adhesive tape and use within two months Calibrators 1 2 3 4 5 Concentration indicated on vial label recombinant human insulin Color coded yellow 5 vials 1000 ul Ready for use Calibrator 0 Color coded yellow via 5 ml Ready for use Enzyme Conjugate 11X peroxidase conjugated mouse monoclonal anti insulin via 1 2 ml Preparation see below Enzyme Conjugate Buffer Color coded blue
57. puits Pr te l emploi Anticorps monoclonal murin anti insuline Bandes de 8 puits S il reste des puits inutilis s replacez les dans leur emballage herm tiquement ferm Utilisez ces puits sous deux mois Calibrators 1 2 3 4 5 5 fioles 1000 ul Pr te l emploi Conc indiqu e sur l tiquette recombinant human insulin Code couleur jaune Calibrator 0 1 fiole 5 ml Pr te l emploi Code couleur jaune Enzyme Conjugate 11X 1 fiole 12 ml A pr parer peroxidase conjugu monoclonal murin anti insulin voir ci dessous Enzyme Conjugate Buffer 1 fiole 120 ml Pr t l emploi Code couleur bleu Wash Buffer 21X 2 flacon 200 ml A pr parer Voir ci dessous Substrate TMB 1 flacon 220 ml Pr t l emploi Solution incolore Remarque Cette solution est sensible la lumi re Stop Solution lacon 70 ml Pr te l emploi H 50 0 5 M 23 sie5ueJJ Pr paration du conjugu enzymatique Pr parez le volume du conjugu enzymatique n cessaire en diluant 11X l Enzyme Conjugate 14 10 dans l Enzym Conjugate Buffer en suivant les indications du tableau ci dessous M langez sans agiter A uitliser dans la journ e suivant la pr paration Nombres de plaques Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 10 plaques 1 fiole 1 flacon 5 plaques 5 0 ml 50 ml 3 plaques 3 0 ml 30 ml 2 plaques 2 0 ml 20 ml 1 plaque 1 0 ml 10 ml Pr paration la solution de lavage Pr parez le volume n c
58. r sultats Puits Conc Identit Auen moy mU L 1A B Calibrator 0 0 070 0 071 1C D Calibrator 1 0 105 0 106 1E F Calibrator 2 0 202 0 204 1 G H Calibrator 3 0 434 0 470 2A B Calibrator 4 1 348 1 351 2C D Calibrator 5 2 451 2 476 2E F Nouveau 1 0 222 0 214 11 1 2 G H Nouveau 2 0 546 0 538 35 6 3A B Nouveau 3 1 941 1 978 153 Conc indiqu e sur l tiquette Exemple de courbe d talonnage La courbe pr sent e est une courbe d talonnage type Ne l utilisez pas pour d termine les r sultats de dosages r els 0 0 450 nm 1 10 100 1000 Insulin mu 26 FACTEUR DE CONVERSION 1 ugi 29 mU I 1 mU I 6 0 pmol l LIMITES DE LA PROC DURE Comme pour tous les tests de diagnostic le diagnostic clinique d finitif ne doit pas reposer sur les conclusions d un seul test il doit tre effectu par le m decin apr s valuation de tous les r sultats cliniques L application de ce test des patients recevant d j une insulinoth rapie se complique par la formation d anticorps anti insuline susceptibles d interf rer avec le dosage L h molyse l ict re ou la lip mie n affectent pas le dosage VALEURS MOYENNES La d ontologie incite chaque laboratoire tablir sa propre gamme de valeurs Les r sultats suivants peuvent servir de guide jusqu ce que le laboratoire ait rassembl suffisamment de donn es provenant de ses propres sources Un test de glyc mie jeun sur 137 indivi
59. r 0 mot insulin koncentrationen Manuell ber kning 1 M rk ut absorbansv rdena som erh lls f r Calibrators f rutom Calibrator 0 mot insulin koncentrationen p ett logpapper och konstruera en kalibratorkurva 2 Avl s de ok nda provernas koncentration fr n kalibratorkurvan Exempel p resultat Medelkoncentration Brunnar Identitet Auen mU I 1A B Calibrator 0 0 070 0 071 1C D Calibrator 1 0 105 0 106 1E F Calibrator 2 0 202 0 204 1 G H Calibrator 3 0 434 0 470 2A B Calibrator 4 1 348 1 351 2C D Calibrator 5 2 451 2 476 2E F Ok nd 1 0 222 0 214 11 1 2 G H Ok nd 2 0 546 0 538 35 6 3A B Ok nd 3 1 941 1 978 153 gt Koncentrationen anges p flaskans etikett Exempel p kalibratorkurva En typisk kalibratorkurva visas h r Anv nd inte den h r kurvan f r att fastst lla verkliga testresultat 1 00 0D 450 nm 0 10 0 01 qu mmemnn 1 10 100 1000 Insulin mU 58 OMR KNINGSFAKTOR 1 g l 29 mU I 1 mU I 6 0 pmol l METODENS BEGR NSNINGAR Liksom f r alla andra diagnostiska tester b r man inte basera en definitiv klinisk diagnos p re sultaten fr n ett enstaka test Diagnosen b r st llas av en l kare efter att alla kliniska fynd har utv rderats Det r sv rare att till mpa testet p individer som redan genomg r insulinbehandling p grund av bildning av anti insulinantikroppar som kan p verka provresultatet Starkt lipemiska ikteriska eller hemolyse
60. rade prover p verkar inte testresultatet F RV NTADE V RDEN Det tillh r goda rutiner good practice att varje laboratorium skall etablera sin egen skala med f rv ntade v rden F ljande resultat kan tj na som v gledning till dess att laboratoriet har sam lat tillr ckligt med egna uppgifter Niv er f r 137 fastande till synes friska testindivider gav ett medelv rde p 9 2 mU l ett me dianv rde p 6 9 mU l och en sp nnvidd som motsvarar de mittersta 95 av observationerna p 2 25 mull ANALYTISKA PRESTANDA EGENSKAPER Gr ns f r p visbarhet Detektionsgr nsen r 1 mU l ber knad som tv standardavvikelser ovanf r Calibrator 0 Recovery Recovery vid tillsats r 94 113 medel 104 Hook effekt Prover med en koncentration p upp till 30 000 mU kan m tas upp utan att visa felaktiga l ga resultat Precision Varje prov analyserades sexfaldigt vid sex olika tillf llen Prov Medelvarde Variationskoefficient mU I inom mellan totalt testet 96 testet 96 testet 96 1 11 34 3 6 5 0 2 36 4 0 2 6 4 7 3 80 2 8 2 8 4 0 4 154 32 2 9 44 Pa TES 59 Specificitet C peptid Proinsulin Proinsulin des 31 32 Proinsulin split 32 33 Proinsulin des 64 65 Proinsulin split 65 66 nsulin lispro Humalog Eli Lily nsulin aspart GF I GEI Rattinsulin Musinsulin Grisinsulin Farinsulin Bovint insulin KALIBRERING F ljande korsreaktioner har hittats lt 0 01 l
61. rator 0 verso la concentrazione usando un regressione cubica flessibile potrebbe essere errettuata per ottenere la concentrazione di insulina Calcolo manuale 1 Tracciare i valori di assorbenza ottenuti per le Calibrators eccetto il Calibrator 0 contro la concentrazione di insulina in un registro e formula una calibratura curva 2 Leggere la concentrazione dei campioni sconosciuti dalla calibratura curva Risultati ottenuti pozzetti Identit A450 Conc princ mU l 1 A B Calibrator 0 0 070 0 071 1 C D Calibrator 1 0 105 0 106 1E F Calibrator 2 0 202 0 204 1 G H Calibrator 3 0 434 0 470 2 A B Calibrator 4 1 348 1 351 2C D Calibrator 5 2 451 2 476 2E F Incognita 1 0 222 0 214 11 1 2 G H Incognita 2 0 546 0 538 35 6 3A B Incognita 3 0 546 0 538 153 Concentrazione indicata sull etichetta della fiala Esempio di una calibratura curva Una calibratura rappresentativa mostrata qui Non usare questa curva per determinare i risultati attuali delle analisi 1 00 op 450 nm 0 10 a A A ETICI Sf el 1 10 100 1000 Insulin mU I 42 IL FATTORE DI CONVERSIONE 1 ugi 29 mU I 1 mU I 6 0 pmol l LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA Come tutti i test diagnostici una diagnosi clinica definitiva non dovrebbe essere basata sui risultati di un singolo test ma dovrebbe essere fatto medico dopo averne valutate le conclusioni cliniche L applicazione di questo test su individui gi sott
62. re 350 yl di soluzione di lavaggio ad ogni pozzetto Eliminare la soluzione di lavaggio sbattere con forza diverse volte contro carta assorbente per rimuovere il liquido in eccesso Ripetere 5 volte Evitare prolungate pause di immersione durante la procedura di lavaggio 7 Aggiungere 200 pl Substrate TMB Mettere in incubatrice per 15 minuti a temperatura ambiente 18 25 C 9 Aggiungere 50 ul Stop Solution ad ogni pozzetto Mettere la piastra in uno shaker per approssimativamente per 5 secondi per garantire la miscelazione 10 Leggere l assorbivit a 450 nm e calcolare i risultati Leggere entro 30 minuti oo Ei 3 Nota Per evitare qualsiasi contaminazione tra coniugato e substrato devono essere usate pipette distinte CONTROLLO DI QUALITA INTERNO I controlli commerciali tale come il Mercodia Diabetes antigen control codifica No 10 1164 01 e o il siero interno proveniente da diversi donatori con basse intermedie e alte concentrazioni di insulina dovrebbero essere analizzate periodicamente come se fossero esterne e i risultati tracciati di giorno in giorno E buona norma di un laboratorio registrare i seguenti dati per ciascuna analisi un certo numero di kit una ricostituzione dei dati e dei componenti del kit i valori di OD per il modulo Calibrators e controlli 41 IL CALCOLO DEI RISULTATI Calcolo computerizzato La riduzione dei dati computerizzati dell assorbenza per le Calibrators eccetto il Calib
63. rimler med 8 brande 96 br nde Klar til brug or 2 m neder Calibrators 1 2 3 4 5 Konc angivet p h tteglassets etikett rekombineret humant insulin Farvekodet gul 5 haetteglas 1000 pi Klar til brug Calibrator 0 1 heetteglas 5 ml Klar til brug Farvekodet gul Enzyme Conjugate 11X 1 heetteglas 12 ml Klarg ring Peroxidase konjugeret fra mus se nedenfor monoklonalt Anti insulin Enzyme Conjugate Buffer 1 flaske 120 ml Klar til brug Farvekodet bl Wash Buffer 21X 2 flaske 200 ml Klarg ring se nedenfor Opbevaring efter fortynding 2 8 C i 4 uger Substrate TMB 1 flaske 220 ml Klar til brug Farvel s opl sning Bem rk Lysf lsom Stop Solution 1 flaske 70 ml Klar til brug 0 5 MH SO 47 Forberedelse af enzymkonjugatoplesning Forbered den p kr vede m ngde enzymkonjugatoplesning ved at fortynde Enzyme Conjugate 11X 14 10 i Enzym Conjugate Buffer i henhold til tabellen nedenfor Bland forsigtigt Bruges inden 24 timer Antal plader Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 10 plader 1haetteglas 1 flaske 5 plader 5 0 ml 50 ml 3 plader 3 0 ml 30 ml 2 plader 2 0 ml 20 ml 1 plade 1 0 ml 10 ml Forberedelse af vaske oplosning Forbered den p kr vede m ngde vaske opl sning ved fortynding af Wash Buffer 21X i redestil leret vand 12 20 i henhod til tabellen nedenfor Bland grundigt Antal plader Wash Buffer 21X Redestilleret va
64. rvare i campioni a 20 C Evitare di ripetere il congelamento e lo scongelamento Plasma Prelevare il sangue direttamente in vena in provette contenenti eparina o EDTA come anti coagulante e separare la frazione del plasma campioni possono essere conservati a 2 8 C fino a 24 ore Per periodi pi lunghi conservare i campioni a 20 C Evitare di ripetere il con gelamento e lo scongelamento 40 Preparazione dei campioni La diluizione non normalmente richiesta comunque i campioni contenenti 5200 mU I dovrebbero essere diluiti 1 9 v v con Calibratore 0 PROCEDURA DEL TEST Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima dell uso Preparare una calibratura curva per ciascuna serie di analisi 1 Preparare la soluzione enzima coniugato e di soluzione de lavaggio 2 Preparare sufficiente pozzetti nelle micropiastre a comporre Calibrators e campione in duplice copia 3 Pipette 25 pl per ogni Calibrators e campioni in appropriati pozzetti 4 Aggiungere 100 yl della soluzione enzima coniugato per ogni pozzetto 5 Mettere in incubatrice in una piastra shaker 700 900 rpm per 1 ora a temperatura ambiente 18 25 C 6 Lavare 6 volte con 700 pl per pozzetto usando un lavatore automatico per piastre con la funzione traboccare lavare Nella procedura di lavaggio non utilizzare la funzione immersione O manualmente Eliminare il volume di reazione capovolgendo la micropiastra su un lavabo Aggiunge
65. s of type 2 diabetic patients Diabetes 53 2359 2365 Sjostrand M Gudbjornsdottir S Holmang A Lonn L Strindberg L Lonnroth P 2002 Delayed trans capillary transport of insulin to muscle interstitial fluid in obese subjects Diabetes 51 2742 2748 52 ANV NDNING Mercodia Insulin ELISA r ett in vitro test f r kvantitativ best mning av humant insulin i serum och plasma SAMMANFATTNING Insulin r det hormon som reglerar glukosmetabolismen i kroppen Det syntetiseras av beta cellerna i bukspottk rteln via ett f rstadium proinsulin som omvandlas till insulin genom av spj lkning av C peptiden Bada uts ndras i ekvimol ra m ngder i portablodet Den mogna in sulinmolekylen innefattar tv polypeptidkedjor A kedjan och B kedjan 21 respektive 30 amino syror De tv kedjorna r sammankopplade genom tv disulfidbryggor inom kedjorna Det finns ven en disulfidbrygga inom A kedjan Uts ndring av insulin kontrolleras huvudsakligen av koncentrationen av plasmaglukos och hormonet har ett antal viktiga metaboliska aktiviteter Den viktigaste r att kontrollera upptag ningen och anv ndningen av glukos i perifera v vnader via glukostransport ren Denna och andra hypoglykemiska aktiviteter s som inhibering av hepatisk glukoneogenes och glykogenolys motverkas av de hyperglykemiska hormonerna som innefattar glukagon epinefrin adrenalin tillv xthormon och cortisol Vid typ I diabetes insulinberoende diabetes IDDM saknas
66. s the inhibition of hepatic gluconeogenesis and glycogenolysis are coun teracted by the hyperglycaemic hormones including glucagon epinephrine adrenaline growth hormone and cortisol Insulin concentrations are severely reduced in insulin dependent diabetes mellitus IDDM and some other conditions such as hypopituitarism Insulin levels are raised in non insulin dependent diabetes mellitus NIDDM obesity insulinoma and some endocrine dysfunctions such as Cushing s syndrome and acromegaly PRINCIPLE OF THE PROCEDURE Mercodia Insulin ELISA is a solid phase two site enzyme immunoassay It is based on the direct sandwich technique in which two monoclonal antibodies are directed against separate antigenic determinants on the insulin molecule During incubation insulin in the sample reacts with per oxidase conjugated anti insulin antibodies and anti insulin antibodies bound to microtitration well A simple washing step removes unbound enzyme labelled antibody The bound conjugate is detected by reaction with 3 3 5 5 tetramethylbenzidine TMB The reaction is stopped by adding acid to give a colorimetric endpoint that is read spectrophotometrically WARNINGS AND PRECAUTIONS For in vitro diagnostic use The contents of this kit and their residues must not be allowed to come into contact with ruminating animals or swine The Stop solution in this kit contains 0 5 M H S0 Follow routine precautions for handling hazardous chemicals All
67. st n contrarrestadas por las hormonas hipergluc micas como glucagon adrena lina hormona del crecimiento y cortisol Las concentraciones de insulina est n reducidas de forma importante en la diabetes mellitus insulinodependiente DMID y en otras patolog as como el hipopituitarismo Los niveles de insu lina est n aumentados en la diabetes mellitus no insulinodependiente DMNID obesidad insu linoma y algunas disfunciones endocrinas como el s ndrome de Cushing y la acromegalia PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO Mercodia Insulin ELISA es un inmunoensayo de fase s lida de dos puntos Se basa en la t cnica de sandwich directo seg n la que dos anticuerpos monoclonales se dirigen contra determinan tes antig nicos separados de la mol cula de insulina Durante la incubaci n la insulina de la muestra reacciona con los anticuerpos anti insulina conjugados en peroxidasa y anticuerpos anti insulina ligados con pocillo de microtitraci n El anticuerpo marcado con enzima no unido se elimina con un simple lavado El Enzyme Conjugate unido se detecta por reacci n con 3 3 5 5 tetrametilbencidina TMB La reacci n se para a adiendo cido para dar un punto final colorim trico que se lee por espectrofotometria ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Para uso diagn stico in vitro El contenido de este kit y sus residuos no deben dejarse entrar en contacto con animales rumiantes o cerdos Stop Solution de este kit contiene H SO 0 5 M Seguir las pre
68. st Mercodia Insulin ELISA est le dosage immunologique enzymatique double site en phase solide Il repose sur une technique de type sandwich direct dans laquelle deux anticorps monoclonaux sont dirig s contre deux d terminants antig niques distincts de l insuline En phase d incubation les mol cules d insuline de l chantillon r agissent avec les anticorps anti insuline correspondants dans le peroxidase conjugu et les anticorps anti insuli ne correspondants fix s aux puits de microtitration Un rincage simple limine les anticorps marqu s non li s Le conjugu est d tect par r ac tion avec la 3 3 5 5 t tram thylbenzidine TMB Pour arr ter la r action on ajoute de l acide Cette solution fournit un point d valuation colorim trique qui sera lu par spectrophotom trie AVERTISSEMENTS ET PR CAUTIONS e Ce kit est r serv l utilisation diagnostique in vitro Vous devez viter tout contact entre le contenu ou les r sidus de ce kit et les ruminants ou les suid s e La Stop Solution fournie contient 0 5 M d acide sulfurique H S0 Respectez les pr cautions habituelles relatives l utilisation de produits chimiques dangereux Tous les sp cimens patient doivent tre trait s comme des chantillons contagieux 21 sie5ueJJ MAT RIEL N CESSAIRE NON FOURNI Pipettes de 25 50 100 200 et 1000 ul pipettes r p tition recommand es pour l ajout du conjugu enzymatique de Substrate TMB et
69. st auf dem Fl schechn angegeben Beispiel einer Kalibratorkurve Hier wird eine typische Kalibratorkurve gezeigt Diese soll nicht zur Berechnubg aktueller Testergebnisse benutz werden 1 00 op 450 nm 0 10 Qe u Insulin mUN UMRECHNUNGSFAKTOR 1 ugi 29 mU I 1 mU I 6 0 pmol l GRENZEN DES VERFAHRENS Wie bei allen diagnostischen Tests sollte auch hier eine endg ltige klinische Beurteilung nicht auf den Resultaten eines Einzeltests beruhen sondern erst nach Erhalt der Ergebnisse aller kli nischen und der Laborbefunde abgegeben werden Proben von Individuen die ein ren da in diesen Anti Insulin An er Insulinbehandlung unterzogen wurden k nnen den Test st ik rper vorhanden sind Lipemic Icteric oder h molysierte Proben beeintr chtigen den Versuch nicht ERWARTETE WERTE Es wird empfohlen dass jedes Labor eigene Referenzwerte etabliert Die folgenden Resultate k nnen als Richtlinie gelten bis das Labor gen gend eigene Daten gesammelt hat Die Werte von 137 augenscheinlich gesunden und fastenden Personen erreichten einen Mittelwert von 9 2 mU I und einen Medianwert von 6 9 mU I Die Spannweite betrug 2 25 mU I bezogen auf die zentralen 95 der beobachteten Werte TESTCHARAKTERISIERU Nachweisgrenze Die Nachweisgrenze liegt bei 1 Calibrator 0 Wiederfindung Die Wiederfindung nach Zugabe Hookeffekt Bei Proben mit einer Konzentrati Pr zision NG mU I definiert durch zwei
70. t 0 01 lt 0 5 lt 0 5 98 56 0 000003 3 296 lt 0 02 lt 0 02 0 7 0 396 374 48 31 Mercodia Insulin ELISA kit kalibreras mot 1st International Reference Preparation 66 304 GARANTI De presenterade uppgifterna fr n utf randet erh lls med anv ndning av p visat f rfarande F r ndringar eller modifieringar av f rfarandet som inte rekommenderas av Mercodia AB kan p verka resultaten I dessa fall fr ns ger sig Mercodia AB allt ansvar underf rst tt s v l som lagstadgat inklusive underf rst dd s ljbarhets och anv ndbarhetsgaranti Mercodia AB och deras auktoriserade distribut rer skall i dessa fall inte h llas ansvariga f r skador som orsakats indirekt eller som en konsekvens REFERENSER Gaines Das R E and Bristow A F 1988 WHO International reference reagents for human pro insulin and human C peptide Biol Stand 16 179 186 51 2742 2748 60 Lindstrom T Hedman CA Arnqvist HJ 2002 Use of a novel double antibody technique to describe the pharmacokinetics of rapid acting insulin analogs Diabetes Care 25 1049 1054 Riserus U Vessby B Arner P Zethelius B 2004 Supplementation with trans10 cis12 conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men close association with impaired insulin sensitivity Diabetologia 47 1016 1019 Rudovich NN Rochlitz HJ Pfeiffer AF 2004 Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide comp
71. t insulinabh ngiger Diabetes Mellitus NIDDM Obesit t Insulinoma und einigen endokrinen Disfunktionen wie das Cushing s Syndrom und Acromegaly DAS TESTPRI NZIP Mercodia Insulin ELISA ist ein enzymatischer zweiseitiger Immunoassay mit einer Festphase Der Test basiert auf der direkten Sandwich technik in welcher zwei monoklonale Antik rper gegen ein bestimmtes Antigen im Insulinmolek l gerichtet sind W hrend der Inkubation reagiert das Insulin in der Probe mit den Insulin Antik rpern im Peroxidase Konjugat und den Insulin Antik rpern welche auf der Mikrotitierplatte gebunden sind Eine einfache Waschung entfernt die ungebunde nen enzymatisch gekennzeichneten Antik rper Das gebundene Konjugat wird durch 3 3 5 5 Tetramethylbenzidine TMB sichtbar gemacht Durch Zugabe von S ure wird die Reaktion ge stoppt Der dadurch erhaltene colometrische Endpunkt wird nun spektrophotometrisch abgelesen WARNUNG U e Zum Gebrauc ND VORSICHTSMASSNAHMEN h in der in vitro Diagnostik Nicht f r innere oder uBere Anwendung bei Mensch und Tie e Der Inhalt dieses Kits darf nicht in Kontakt mit Wiederk uern oder Schweinen kommen Die Stop Solut liche Chemika ien beachten ion in diesem Kit enth lt 0 5 M H SO Bitte Routinevorkehrungen f r gefahr F r samtliche Patientenproben sollten die VorsichtsmaBnahmen f r den Umgang mit Blutderivaten beachtet werden 13 yos naq ZUS TZLICH BEN TIGTES MATERIAL 25
72. te Buffer h tteglas 12 ml Klar til brug Farvekodet bl Wash Buffer 21X flaske 50 ml Fortynd med 1000 ml redestilleret vand for at lave vaske opl sning Opbevaring efter fortynding 2 8 C i 4 uger Substrate TMB h tteglas 22 ml Klar til brug Farvel s opl sning Bem rk Lysf lsom Stop Solution h tteglas 7 ml Klar til brug 0 5 M H550 46 Forberedelse af enzymkonjugatoplosning Forbered den p kraevede maengde enzymkonjugatoplesning ved at fortynde Enzyme Conjugate 11X 1 10 i Enzym Conjugate Buffer i henhold til tabellen nedenfor Hvis der forberedes enzymkonjugatoplasning til en hel plade h ld hele indeholdet af Enzyme Conjugate Buffer over i Enzyme Conjugate 11X r ret Bland forsigtigt Bruges inden 24 timer Antal strimler Enzyme Enzyme Conjugate Conjugate 11X Buffer 12 strimler 1 heetteglas 1 heetteglas 8 strimler 700 ul 7 0 ml 6 strimler 500 pl 5 0 ml 4 strimler 350 ul 3 5 ml REAGENSER 10 X 96 Hvert Mercodia Insulin ELISA 10 1113 10 saet indeholder reagenser til 10 x 96 br nde nok til 42 pr ver og en kalibreringskurve i dublet Til st rre analyseserier skal der bruges puljereagen ser fra pakker med samme partinummer Udlabsdatoen for hele s ttet er angivet p den yderste etiket Den anbefalede opbevaringstemperatur er 2 8 C Coated plate Monoklonalt anti insulin fra mus Ved ubrugte mikropladebrande skal posen genforsegles og brandene bruges inden 10 plade St
73. tic use Zum Gebrauch in der in vitro Diagnose Ce kit est r serv l utilisation diagnostique in vitro Para uso diagn stico in vitro Per l uso diagnostico in vitro Til in vitro diagnosticering F r in vitro diagnostiskt bruk Directions for Use Gebrauchsinformation Mode d emploi Instrucciones para el uso Instruzioni per l uso Brugsanvisning Bruksanvisning Mercodia 2008 2009 13 21 29 37 45 53 INTENDED USE Mercodia Insulin ELISA provides a method for the quantitative determination of human insulin in serum or plasma SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST Insulin is the principal hormone responsible for the control of glucose metabolism It is synthe Sized in the B cells of the islets of Langerhans as the precursor proinsulin which is processed to form C peptide and insulin Both are secreted in equimolar amounts into the portal circulation The mature insulin molecule comprises two polypeptide chains the A chain and B chain 21 and 30 amino acids respectively The two chains are linked together by two inter chain disulphide bridges There is also an intra chain disulphide bridge in the A chain Secretion of insulin is mainly controlled by plasma glucose concentration and the hormone has a number of important metabolic actions Its principal function is to control the uptake and utilization of glucose in peripheral tissues via the glucose transporter This and other hypogly caemic activities such a
74. tre mis temp rature ambiante avant utilisation Pr parez une courbe de Calibrator pour chaque dosage 1 Preparez la solution de l enzyme conjugu e et la solution de lavage 2 Preparez un nombre suffisant de puits de microplaques pour y loger les calibrators et les chantillons en double 3 Pipetez 25 yl de Calibrator et d chantillons dans les puits appropri s 4 Ajoutez 100 yl la solution de l enzyme conjugu e dans chaque puits 5 Laissez incuber sur un agitateur secoueur de plaques 700 900 rpm pendant une heure temp rature ambiante entre 18 et 25 C 6 Lavez 6 fois avec 700 pl par puit avec un laveur de plaques automatique en utilisant la fonction aspiration verticale Evitez l tape de trempage dans la proc dure de lavage Ou lavez manuellement Jetez le volume r actionnel en retournant la plaque au dessus d un vier Ajoutez 350 pl de solution de lavage dans chaque puit Jetez la solution de lavage tapez fermement plusieurs fois sur un papier absorbant pour ter l exc s de liquide R p tez 5 fois Evitez les trempages prolong s pendant l tape de lavage 7 Ajoutez 200 pl de Substrate TMB Laissez incuber pendant 15 minutes temp rature ambiante 18 et 25 C 9 Ajoutez 50 yl de Stop Solution dans chaque puits Placez la plaque sur un agitateur secoueur pendant environ 5 secondes afin que le m lange s effectue bien 0 Lisez la densit optique 450 nm et calculez les r sultats La lecture doit tre r alis e s
75. ung 2 Vorbereiten gen gender Mikrotiterplatten f r die Calibrators und die Proben im Dublikat 3 Pipettieren von 25 pl von jedem Calibrator und der Proben in die daf r vorgesehenen Brunnen 4 Zugabe von 100 yl Enzymkonjugatl sung in die Brunnen 5 Inkubation auf einem Sch ttler 700 900 rpm f r eine Stunde bei Raumtemperatur 18 25 C 6 6 mal waschen mit 700 pl pro Vertiefung unter Verwendung eines Platten Waschautomaten mit berlauf Waschfunktion Die Waschprozedur sollte keine Einwirkzeit beinhalten Wird manuell gewaschen bitte folgendermaBen vorgehen Reaktionsvolumen verwerfen durch Umdrehen der Mikrotiterplatte ber einem Ausgussbecken 350 ul Waschl sung in jede Vertiefung geben Waschl sung verwerfen und mehrmals kr ftig gegen saugf higes Papier schlagen um bersch ssige Fl ssigkeit zu entfernen 5 mal wiederholen L ngere Einwirkzeiten w hrend dieser Waschprozedur vermeiden 7 Zugabe von 200 ul TMB Substrate in die Brunnen 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur 18 25 C 9 Zugabe von 50 pl Stop Solution in jeden Brunnen Um eine gute Mischung von Substrate und Stop Solution zu gew hrleisten wird empfohlen die Platte f r 5 Sekunden auf den Sch ttler zu stellen 10 Messen der Absorbance bei 450 nm und auswerten Das Resultat sollte innerhalb von 30 Minuten abgelesen werden oo Beachten Sie Um Kontaminationen zwischen dem Konjugat und dem Substrat zu vermeiden emphehlen wir Ihnen
76. y individuals yielded a mean of 9 2 mU l a median of 6 9 mU l and a range corresponding to the central 95 of the observations of 2 25 mU I PERFORMANCE CHARACTERISTICS Detection limit The detection limit is 1 mU I calculated as two standard deviations above the Calibrator 0 Recovery Recovery upon addition is 94 113 mean 104 Hook effect Samples with a concentration of up to 30 000 mU I can be measured without giving falsely low results Precision Each sample was analyzed in 6 replicates on six different occasions Sample Mean value Coefficient of variation mU I within between total assay assay assay 96 1 11 3 4 3 6 5 0 2 36 4 0 2 6 4 7 3 80 2 8 2 8 4 0 4 154 3 2 2 9 4 4 Specificity he following crossreactions have been found C peptide 0 0196 Proinsulin 0 0196 Proinsulin des 31 32 0 596 Proinsulin split 32 33 0 596 Proinsulin des 64 65 98 Proinsulin split 65 66 56 nsulin lispro Humalog Eli Lily lt 0 000003 nsulin aspart lt 3 2 GF I 0 0296 GF II 0 0296 Rat insulin 0 796 Mouse insulin 0 396 Porcine insulin 37496 Sheep insulin 4896 Bovine insulin 3196 CALIBRATION Mercodia Insulin ELISA kit is calibrated against 1st International Reference Preparation 66 304 WARRANTY The performance data presented here was obtained using the procedure indicated Any change or modification in the procedure not recommended by Mercodia AB may affect the results in whic

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