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PelvoCheck® CT/NG Mode d`emploi - Greiner Bio-One

1. PelvoCheck CT NG respecte les exigences de la directive relative au diagnostic in vitro 98 79 CE et dispose d s lors du marquage de conformit CE Tout r sultat diagnostique obtenu l aide de PelvoCheck CT NG doit tre interpr t conjointement avec d autres r sultats cliniques ou de laboratoire 6 3 Principe du test Le kit PelvoCheck CT NG est un kit de test micro puce destin la d tection de l ADN de Chlamydia trachomatis CT et de Neisseria gonorrhoeae NG La proc dure du test d crite dans la Figure 1 est fond e sur la d tection d un fragment du g ne 16S de ARNr sp cifique de ces agents pathog nes Avant l analyse avec le kit PelvoCheck CT NG l ADN doit tre extrait d un chantillon d une ou d un couvillon g nital Le pr l vement d chantillon et l extraction d ADN ne font pas partie du kit de test PelvoCheck CT NG Des produits d di s au pr l vement d chantillon kit pr analytique PelvoCheck et l extraction d ADN kit d extraction d ADN oCheck sont aussi disponibles aupr s de Greiner Bio One et doivent tre achet s s par ment voir les informations utiles pour la commande au chapitre 2 Apr s extraction de l ADN g nomique bact rien et humain d un chantillon d urine ou d un frottis g nital un fragment de 200 300 bp du g ne 16S est amplifi par r action en cha ne par polym rase PCR en pr sence d un ensemble d amorces sp cifiques CT et NG Dans le c
2. EE EE ae EA ORTOR DO Puce ADN de CT NG PelvoCheck CT NG Mode d emploi Kit pr analytique pour la d tection de Chlamydia trachomatis et de Neisseria gonorrhoeae dans des chantillons d une humaine ou des frottis Vaginaux ou cervicaux R F 504 002 Pour un usage en diagnostic in vitro R vision BQ 029 03 par le personnel de laboratoire qualifi exclusivement D cembre 2014 Greiner Bio One GmbH Maybachstr 2 e 72636 Frickenhausen Allemagne T l phone 49 0 7022 948 0 T l copie 49 0 7022 948 514 info de gbo com www gbo com diagnostics o re in er D o one EXPLICATION DES SYMBOLES en de fr es pt ni da SV pl no tr Batch code Chargen bezeich nung Num ro de lot C digo de lote Codice del lotto C digo do lote Lot nummer Lotnum mer Lot nummer Kod partii batch nr KW IK TTAPTIOAG Parti kodu Use by Mindestens haltbar bis Date limite de conservation A utilizar pre feriblemente antes de Da utilizzare entro e non oltre A utilizar pre ferivelmente antes de Tenminste houdbaar tot Anvendes senest Sista f r brukningsdag Termin zydatno ci holdbar til TO AIV TEPO OIQTNPE TAI Son kullanma tarihi Consult Instruc tions for Use Vor Gebrauch Anwei sung lesen Lire le mode d emploi Antes de usar lea las instruccio nes Leggere le istruzi oni
3. La deuxi me tude clinique a valu des frottis cervicaux et vaginaux recueillis avec le syst me de pr l vement recommand chez 434 femmes g es de plus de 18 ans se pr sentant dans un h pital de jour sp cialis dans les maladies sexuellement transmissibles Deux ensembles de frottis cervicaux et vaginaux ont t pr lev s le premier ensemble tait recueilli avec les kits de pr l vement correspondants pour les frottis cervicaux et vaginaux recommand s pour l analyse avec le syst me de r f rence Hologic Gen Probe APTIMA Combo 2 kit de pr l vement d chantillons cervicaux APTIMA et kit de pr l vement de frottis vaginaux APTIMA Le deuxi me ensemble de frottis cervicaux et vaginaux a t obtenu avec le kit d couvillonnage PelvoCheck et analys avec PelvoCheck CT NG et Abbott RealTime CT NG PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Pour des motifs de diagnostic tous les frottis cervicaux et vaginaux recueillis avec les kits de pr l vement Hologic Gen Probe recommand s ont t test avec Hologic Gen Probe APTIMA Combo 2 associ une machine Hologic Gen Probe Panther Ensuite tous les frottis cervicaux et vaginaux ayant fait l objet d un pr d pistage et positifs vis a vis de CT et ou NG et un sous ensemble des frottis cervicaux et vaginaux ayant fait l objet d un pr d pistage et n gatifs vis vis de CT and NG ont t analys s avec PelvoCheck CT NG e
4. TTDOOMIO In vitro diagnostik tibbi tan r n Tempe rature limitation Tempera turbegren zung Limite de temp ra ture Limitaci n de tempera tura Limitazio ne tempe ratura Limita o de tempera tura Tempera tuurbeper king Tempera turbegra ens r Tempe ratur be gr nsning Ograni czenie tempera tury tempe raturbe grensning TEDODOUOG BEpHOKkpao DC Sicaklik s n rlamas Contents sufficient for lt n gt tests Inhalt ausrei chend f r lt n gt Tests Contenu suffisant pour lt n gt tests Contenido suficiente para lt n gt ensayos Contenuto sufficiente per test lt n gt Conte do suficiente para lt n gt ensaios Voldoen de inhoud voor lt n gt tests Indehol der nok til lt n gt test Inneh llet racker till lt n gt tester Zawarto wystarcza na lt n gt test w Innhold tilstrekke lig for lt n gt tester lepiex evo ODOKEIO yiq lt n gt TEOT eri i lt n gt test i in yeter lidir Danger Gefahr Danger Peligro Pericolo Perigo Gevaar Fare Fara NIEBEZPIECZ ENSTWO Fare KINAYNOZ Tehlikeli Store in the dark Im Dunkeln lagern stocker l abri de la lumi re Conser var en un lugar oscuro Conserva re al buio Conservar num local escuro Donker bewaren Opbeva res m rkt F rvaras m rkt Przechow ywa W c
5. valu e en pr sence de nombres croissants de l analyte oppos Tous les tests ont t r alis s trois fois en utilisant trois s ries de dilution ind pendantes PelvoCheck CT NG a la capacit de diff rencier CT de NG et la sp cificit est de 100 PelvoCheck CT NG permet de d tecter CT en pr sence d une exc s de 10 000 fois les copies du g nome de NG par r action et de d tecter copies NG en pr sence d un exc s de 10 000 100 000 fois les copies du g nome de CT par r action 11 1 3 Sp cificit analytique d accompagnement de la flore urog nitale La sp cificit analytique du test PelvoCheck CT NG a t test e en pr sence de bact ries champignons virus et cellules humaines susceptibles de se trouver dans les voies urog nitales humaines ou den tre isol s Chaque isolat a t analys avec le test PelvoCheck CT NG en utilisant au moins 1 ng d ADN g nomique par test Chaque analyse a t r alis e deux fois Dans le cas de Treponema pallidum la sp cificit a t d termin e deux fois une premi re fois avec un s rum d une personne test e positive vis vis de Treponema pallidum et une deuxi me fois avec 10 copies d un plasmide contenant une copie du fragment du g ne16 de ARNr de Treponema pallidum Les organismes non CT et non NG suivants ont t test s au moyen de PelvoCheck CT NG Aucun signal positif n a t d tect Ainsi la sp cificit analytique du test PelvoCheck CT
6. PelvoCheck CT NG Abbott RealTime CT NG 98 70 98 01 99 35 99 34 99 35 98 68 we 100 00 100 00 99 35 100 00 99 35 100 00 En g n ral la concordance totale des r sultats obtenu avec les trois m thodes tait lev e quels que soient l agent pathog ne et le type de frottis La concordance totale de PelvoCheck CT NG avec les r sultats obtenus avec les deux m thodes de r f rence pour CT dans des frottis cervicaux tait de 98 70 99 35 et de 98 01 99 34 dans les frottis vaginaux Dans le cas de NG la concordance totale de PelvoCheck CT NG avec les r sultats obtenus avec les deux m thodes de r f rence dans des frottis cervicaux tait de 99 35 100 00 et dans les frottis Vaginaux de 100 La concordance positive sensibilit de PelvoCheck CT NG avec les r sultats obtenus avec les deux m thodes de r f rence pour CT dans des frottis cervicaux tait de 96 15 98 04 et de 94 44 98 08 dans les frottis vaginaux Dans le cas de NG la concordance totale de PelvoCheck CT NG avec les r sultats obtenus avec les deux m thodes de r f rence dans des frottis cervicaux tait de 98 04 100 00 et de 100 00 dans les frottis vaginaux Un r sultat inconsistant entre le test Hologic Gen Probe APTIMA Combo 2 et le test PelvoCheck CT NG ou Abbott RealTime CT NG peut tre le r sultat de l utilisation de deux ensembles diff rents de frottis celui d APTIMA tant toujours pr lev en prem
7. pistage de 111 chantillons cliniques de Bacteroides ureolyticus Moraxella osloensis Neisseria meningitides Oigella urethralis et Treponema pallidum aucun effet critique susceptible d avoir influenc le r sultat qualitatif de l analyse PelvoCheck CT NG n a t observ De plus l ventualit d un transfert a t tudi e en hybridant des chantillons fortement positifs 10 copies de CT ou NG par chantillon et des contr les n gatifs en alternance selon une disposition en chiquier des puces PelvoCheck CT NG Aucun effet de transfert n a t observ PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 42 11 5 Performance clinique de PelvoCheck CT NG Les caract ristiques de la performance clinique du test PelvoCheck CT NG en termes de concordance positive et n gative avec d autres tests de type NAAT technique d amplification des acides nucl iques ont t d termin es dans deux tudes cliniques La premi re tude clinique a valu des chantillons d urine recueillis avec le syst me de pr l vement recommand kit de pr l vement PelvoCheck SAFE kit de pr l vement d chantillons Abbott multi Collect ou urine native de 1 649 jeunes femmes g es de 18 25 ans en consultation ou en h pital gyn cologique de jour pour un contr le de routine repr sentant une population typique de d pistage de CT En outre 115 chantillons positifs ou n gatifs vis vis de
8. Le CheckScanner est un scanner laser deux couleurs longueurs d onde d excitation de 532 nm et 635 nm qui permet de d tecter le signal fluorescent g n r par la pr sence de produits d amplification sp cifiques et des contr les voir le chapitre 6 4 2 Le logiciel CheckReport permet la visualisation l analyse et l valuation des r sultats et affiche automatiquement les valeurs correspondantes des agents pathog nes d tect s et des contr les dans un rapport d taill et un rapport succinct Le rapport indique clairement la pr sence ou l absence de CT et ou de NG et les contr les sur puce complets permettent d obtenir une analyse extr mement fiable 16 Le processus de PCR est couvert par les brevets am ricains d tenus par Hoffmann La Roche Inc L utilisation du processus de PCR n cessite une licence Aucun l ment de la pr sente publication ne doit tre interpr t comme constituant une autorisation ou une licence implicite pour l utilisation du processus de PCR couvert par les brevets d tenus par Hoffmann La Roche Inc 12 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 1 R action de PCR HD LLLLLLULL ES 2 Hybridation 3 Lavage et s chage 4 Lecture et analyse Figure 1 Proc dure du test PelvoCheck CT NG 1 R action de PCR Apr s l extraction d ADN un fragment du g ne 16S d ARNr d environ 200 300 nucl otides et d
9. Les chantillons ont t trait s dans un laboratoire en utilisant toujours le m me quipement Tableau 5 PelvoCheck CT NG R p tabilit Nombre d analyses positives Nombres total Nombre d analyses See Cible Matrice Concen Type d analyses n gatives Nombre R p tabilit tration d chantillon total d analyses Ka positives positives h gatives pour CT NG pour CT pour NG urine humaine CT L regroupement 100 100 100 100 8 8 quiva CTetNG lents de individuel 100 100 99 100 99 100 frottis Pour tous les chantillons d urine et chaque analyse r p t e les agents pathog nes ont t d tect s et les analyses des chantillons n gatifs ont produit des r sultats n gatifs Ainsi la r p tabilit de PelvoCheck CT NG pour les chantillons d urine est de 100 avec des chantillons dont la PD95 est multipli e par trois et les contr les n gatifs pour donner une probabilit d erreur de 0 Dans le cas des quivalents de frottis pour tous les chantillons et chaque analyse r p t e CT a t d tect e et les analyses des chantillons n gatifs ont produit des r sultats n gatifs pour CT et NG En ce qui concerne NG lun des 100 chantillons positifs vis vis de CT et de NG tait n gatif vis vis de NG et les analyses des chantillons n gatifs taient n gatifs pour les deux agents pathog nes Ainsi la r p tabilit de PelvoCheck CT NG pour les quivalents de frottis est
10. NG obtenus lors de d pistages effectu s aupr s de femmes g es de 18 25 ans fournis par un laboratoire clinique ont t test s Les 1 649 chantillons d urine incluaient 50 chantillons ensemenc s avec CT en diff rentes concentrations pour reproduire la distribution de femmes naturellement infect es du fait d une carence d chantillons positifs vis vis de CT La pr paration des chantillons a t r alis e pour PelvoCheck CT NG aveclekit d extraction d ADN oCheck pour Roche avecle syst me MagNAPure et pourAbbott RealTime CT NG avec la machine RealTime m2000 conform ment aux instructions du fabricant Les analyses de PelvoCheck CT NG ont t compar es aux tests NAAT disponibles dans le commerce test Roche Cobas TaqgMan CT et un PCR hautement sensible pour NG maison por pseudo g ne du partenaire clinique voir les tableaux 7 8 Au total 133 chantillons ont t analys s selon une deuxi me m thode de r f rence Abbott RealTime CT NG voir les tableaux 7 8 Tableau 7 Degr de la performance de diagnostic de PelvoCheck CT NG compar aux m thodes de r f rence pour CT Concordance Concordance en nombre d chantillons Concordance positive urine individuel 80 81 Roche Cobas TaqMan CT Concordance n gative urine individuel ma 1566 1568 Type M thode de r f rence Crit re de qualit can illon PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 T
11. Neisseria meningitidis Neisseria flavescence Neisseria sicca Neisseria subflava Oigella urethralis Peptoniphilus asaccharolyticus Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus micros Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Prevotella nigrescens Proteus hauseri Proteus mirabilis Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Serratia marcescens Staphylococcus aureus ssp aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus saprophyticus Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus agalactiae Streptococcus constellatus Streptococcus criceti Streptococcus cristatus Streptococcus gordonii Streptococcus intermedius Streptococcus mitis Streptococcus mutans Streptococcus oralis Streptococcus parasanguinis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius Streptococcus sanguinis Streptococcus sobrinus Treponema denticola Treponema pallidum Ureaplasma uralyticum Veillonella parvula HPV 16 11 2 R p tabilit Pour valuer la r p tabilit des tests de PelvoCheck CT NG un technicien a analys des chantillons d urine humaine ins min s avec CT et NG PD95 multipli e par trois et des chantillons d urine n gatifs ainsi que des quivalents de frottis ins min s avec CT et NG PD95 multipli e par trois et des quivalents de frottis n gatifs conform ment au protocole standard du test oCheck CT NG voir Tableau 5
12. One r f 453 100 ou 453 101 ou e du kit pr analytique PelvoCheck SWAB Greiner Bio One r f 453 103 respectivement peuvent tre trait s directement 250 uL de solution d chantillon doivent tre utilis s pour extraire l ADN l aide du kit d extraction d ADN oCheck Les chantillons d urine ne peuvent pas tre concentr s par centrifugation car le milieu de conservation du kit pr analytique PelvoCheck r f 453 100 ou 453 101 provoque la lyse des cellules 8 1 3 Contr le externe de la qualit pour la surveillance de la performance CT NG L chantillonnage l extraction d ADN et l amplification sont surveill s par les contr les internes le contr le d chantillon et le contr le de PCR du PelvoCheck CT NG voir le chapitre 6 4 2 Contr les sur puce Pour le contr le de la performance sp cifique aux agents pathog nes il est n cessaire d ajouter des contr les externes de qualit Le contr le AcroMetrix CT NG Life technologies r f 967 146 est recommand en tant que contr le qualit sp cifique pour les agents pathog nes Le contr le AcroMetrix CT NG contient des cellules bact riennes inactiv es de Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrheae dans une matrice propri taire Les contr les qualit imitent les pathog nes pr sents dans la nature et m me s ils sont inactiv s ils contiennent des cellules bact riennes intactes qui permettent de v rifier l extraction la purification
13. cautions sp ciales doivent tre observ es pour viter toute contamination de la r action voir le chapitre 7 Les enzymes HotStarTaq polym rase et uracil N glycosylase sont n cessaires mais elles ne sont pas fournies dans le kit de test PelvoCheck CT NG et doivent tre achet es s par ment voir le chapitre 2 Le kit de test PelvoCheck CT NG a t valid avec la HotStarTaqd polym rase de Qiagen et avec l uracil N glycosylase de Fermentas voir les informations utiles pour la commande au chapitre 2 Il est imp ratif d utiliser ces enzymes pour atteindre les performances tablies 8 2 1 Configuration du thermocycleur Le kit de test PelvoCheck CT NG a t valid avec les thermocycleurs suivants e __GeneAmp PCR system 9700 Applied Biosystems e Thermocycleur 96 puits Veriti M Applied Biosystems Il est absolument n cessaire d utiliser l un des thermocycleurs cit s ci dessus pour atteindre les performances tablies Le programme du thermocycleur de PCR PelvoCheck CT NG est r sum dans le tableau 1 Tableau 1 NE du gt de PelvoCheck CT NG PCR Dur e Temp C Nombre de cycles Ce pp 30 secondes 60 secondes 30 secondes Co ET A ES En outre les param tres d ex cution suivants doivent tre d finis pour chaque thermocycleur D finir le volume de r action sur 26 uL la vitesse de rampe sur 9600 ou Max et la temp rature du couvercle sur 103 C Une
14. dans deux chambres de lavage oCheck Pr chauffer la solution de lavage Il au bain marie 50 C Pr parer la chambre d hybridation Pr incuber la quantit de puces PelvoCheck CT NG analyser dans la chambre d hybridation pr par e temp rature ambiante 18 25 C M langer les produits de PCR et les d gyrer un court instant M langer le tampon d hybridation et le d gyrer un court instant M langer 30 uL du tampon d hybridation PelvoCheck CT NG dans un microtube pour PCR de 0 2 mL avec 10 uL du produit de PCR Bien m langer et d gyrer un court instant Transf rer 30 uL du m lange d hybridation dans chaque puits de la puce PelvoCheck CT NG en utilisant une pipette multicanaux viter la formation de bulles d air Incuber la puce PelvoCheck CT NG pendant exactement 30 minutes temp rature ambiante 18 25 C Retirer le porte lame magn tique de la chambre d hybridation Poser le porte lame dans la chambre de lavage oCheck contenant la solution de lavage Fixer la poign e oCheck Laver la ou les puces PelvoCheck CT NG dans la solution de lavage temp rature ambiante 18 25 C pendant 20 secondes Laver la ou les puces PelvoCheck CT NG dans la solution de lavage Il pr chauff e au bain marie 50 C pendant 30 secondes Retirer tout liquide de la surface de la puce PelvoCheck CT NG par centrifuga
15. de 99 100 avec des chantillons dont la PD95 est multipli e par trois et les contr les n gatifs pour donner une probabilit d erreur de 0 1 40 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 11 3 Reproductibilit La reproductibilit pour le PelvoCheck CT NG test kit a t d termin e en utilisant 128 chantillons cliniques contenant des chantillons d urine et des frottis cervicaux et vaginaux positifs vis vis de CT positifs vis vis de NG et n gatifs vis vis de CT et NG Dans le cas des chantillons d urine des chantillons individuels ont t ensemenc s avec des mat riels de r f rence pour la g n ration d chantillons doublement positifs La d termination a t effectu e selon la m me m thode et avec les m mes composants de kit avec un mat riel d chantillon identique mais par un personnel diff rent dans des laboratoires distincts et l aide d une instrumentation diff rente Les r sultats ont t consid r s comme tant concordants pour les chantillons positifs si des agents pathog nes identiques taient d tect s et dans le cas des chantillons n gatifs si les analyses taient valides mais n gatives propos des agents pathog nes Pour tous les chantillons cliniques concordants les r sultats ont d montr un accord de 100 pour les cas positifs et les cas n gatifs 11 4 Robustesse Les variations des param tres suivants ont t pr
16. du HPV veuillez rep rer les diff rences entre les protocoles m Avant d utiliser passer au vortex ou agiter et ensuite centrifuger tous les composants liquides du kit de test PelvoCheck CT NG pour s assurer de l homog n it des concentrations 8 1 Pr l vement d chantillons et extraction d ADN 8 1 1 Pr l vement d chantillon Le pr l vement d chantillon ne fait pas partie du kit de test PelvoCheck CT NG Deux kits de pr l vement d di s pour les chantillons d urine kit pr analytique PelvoCheck SAFE ou STRAW et un kit pr analytique pour les frottis vaginaux et cervicaux kit pr analytique PelvoCheck SWAB sont aussi disponibles chez de Greiner Bio One voir les informations utiles pour la commande au chapitre 2 PelvoCheck CT NG a t valid en utilisant de l ADN pr par avec le kit d extraction d ADN oCheck partir des chantillons d urine humains pr lev s au moyen du kit pr analytique PelvoCheck SAFE Greiner Bio One Frickenhausen Allemagne et partir des frottis vaginaux et cervicaux pr lev s au moyen du kit pr analytique PelvoCheck Greiner Bio One Frickenhausen Allemagne Suivre attentivement les instructions d taill es du mode d emploi du kit pr analytique PelvoCheck SAFE ou STRAW et du kit pr analytique PelvoCheck SWAB En ce qui concerne l analyse PelvoCheck CT NG partir d chantillons d urine il faut recueillir le premier jet correspondant aux 20 3
17. e l utilisation de PelvoCheck CT NG Pour tout probl me rencontr lors des autres tapes du test par exemple l extraction d ADN se reporter au mode d emploi correspondant PROBL ME et cause Commentaires et suggestions MESSAGE D ERREUR COULD NOT READ BARCODE IMPOSSIBLE DE LIRE LE CODE BARRES Code barres endommag Rechercher tout dommage sur le code barres Saisir le code barres la main lorsque la fen tre correspondante s ouvre La puce a t mal charg e Contr ler l orientation de la puce et la balayer dans le bon sens MESSAGE D ERREUR MISSING SPOTS PRINTING CONTROL FAILED OR ORIENTATION CONTROL FAILED spots manquants chec du contr le d impression ou d orientation Recommencer l hybridation du ou des produits de PCR sur une autre puce Formation de bulles d air Recommencer l hybridation du ou des produits de PCR sur une autre puce pendant le transfert de liquide Pipeter soigneusement pour viter la formation de bulles d air sur la puce HYBRIDISATION CONTROL FAILED chec du contr le d hybridation Temp rature d hybridation La bonne temp rature d hybridation est 20 25 C Veiller respecter les inad quate conditions d hybridation de PelvoCheck CT NG Au besoin contr ler la temp rature de la salle au moyen d un thermom tre Dur e d hybridation erron e La dur e d hybridation est de 30 minutes Elle diff re de celle du test PapilloCheck Veiller respec
18. importance de l identification pr coce pour pr venir les effets long terme et la poursuite de la propagation de l agent pathog ne Dans ce contexte la notification au partenaire et le traitement sont des mesures importantes pour viter toute r infection et la propagation de la MST Au cours des derni res ann es plusieurs autorit s sanitaires nationales ont d marr des programmes de d pistage de la chlamydiose pour tendre les tests aux adolescents qui pr sentent le risque le plus lev d infection et de d veloppement de MIDI Il est pr conis que toutes les jeunes femmes et les jeunes hommes sexuellement actifs en Allemagne pas les hommes se soumettent un d pistage de la chlamydiose au moins une fois par an 8 Simms l Stephenson J M 2000 Pelvic inflammatory disease epidemiology what do we know and what do we need to know Sexually Transmitted Infections 76 80 87 Centre pour le contr le et la pr vention des maladies http www cdc gov std PID STDFact PID htm derni re consultation de la page 25 mars 2011 derni re mise jour de la page 28 septembre 2011 10 Schachter J 1985 Chlamydiae Psittacosis Lymphogranulom a Venereum Trachoma group p 856 862 In E H Lennette et al d Manual of Clinical Microbiology 4 d American Society for Microbiology Washington D C Yuan Y Y X Zhang N G Watkins and H D Caldwell 1989 Nucleotide and deduced amino acid sequences for the four variab
19. informations utiles pour la commande au chapitre 2 m Diluer l uracil N glycosylase 1 50 dans de l eau de qualit PCR la concentration finale est de 0 02 U L Utiliser une nouvelle dilution d UNG pour chaque pr paration de r action PCR PelvoCheck CT NG voir le chapitre 8 2 3 Ne pas r utiliser l UNG dilu m M langer soigneusement la dilution d UNG en la passant au vortex pendant 2 secondes puis en la centrifugeant ou en la pipetant plusieurs fois Le kit de test PelvoCheck CT NG a t valid avec l uracil N glycosylase de Fermentas voir le chapitre 2 Il est imp ratif d utiliser cette enzyme pour atteindre les performances tablies ug Ajouter 1 uL de cette dilution chaque r action PCR PelvoCheck CT NG voir le chapitre 8 2 3 Tableau 2 Cette quantit est suffisante pour liminer la contamination par recirculation de la PCR Veiller ne pas utiliser une solution d UNG plus concentr e car cela pourrait nuire aux performances de la PCR avec pour r sultat une baisse de la sensibilit de PelvoCheck CT NG En g n ral pour le traitement de TUNG le m lange r actionnel de PCR est incub pendant 20 minutes 37 C CUNG est par la suite inactiv par une tape d incubation suppl mentaire de 15 minutes 95 C Ces deux tapes sont d j int gr es dans le PCR PelvoCheck CT NG PCR et correspondants aux deux premi res tapes du programme du thermocycleur voir le Tableau 1 en pag
20. le niveau de remplissage du bain marie est gal celui de la solution de lavage II PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Ne jamais r utiliser les solutions de lavage car cela pourrait entra ner une accumulation de produit de PCR rinc pouvant potentiellement interf rer avec les r sultats du PelvoCheck CT NG Utiliser de nouvelles solutions de lavage pour chaque analyse Le m lange de solution de lavage pr par au pr alable peut tre conserv au maximum pendant une semaine temp rature ambiante 18 25 C V rifier s il se forme un pr cipit de SDS Le cas ch ant r chauffer le m lange de solution de lavage jusqu dissolution du pr cipit et r quilibrer temp rature ambiante 18 25 C Ensuite pr parer l exp rience d hybridation suivante Tableau 3 Pr paration du m lange de solution de lavage Les volumes r sum s dans ce tableau sont suffisants pour les deux tapes de lavage solutions de lavage I et Il et pour le nombre indiqu de puces PelvoCheck CT NG Nombre de puces PelvoCheck CT NG Composants Tampon B PelvoCheck CT NG 1 25 mL 3 75 mL ET Volume total 111 25 mL 222 5 mL 333 75 mL 445 mL PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 29 8 3 2 Hybridation L hybridation doit tre effectu e temp rature ambiante 18 25 C Les principales tapes de travail pour l hybridation des produits de PCR p
21. place L hybridation doit tre effectu e temp rature ambiante 18 25 C Commencer les pr parations n cessaires pour les tapes d hybridation et de lavage au moins 30 minutes avant de d buter la proc dure d hybridation mg Pour dissoudre les ventuels pr cipit s qui se sont form s dans les tampons d hybridation et de lavage exposer ceux ci la temp rature ambiante 18 25 C pendant 30 minutes et bien m langer avant utilisation Le stockage du kit de test PelvoCheck CT NG entre 4 et 8 C peut entra ner la pr cipitation de sels dans le tampon d hybridation et le tampon B Laisser les solutions s quilibrer temp rature ambiante 18 25 C puis passer le tube au vortex ou agiter le flacon jusqu dissolution du pr cipit m Pr parer la chambre d hybridation oCheck Placer une serviette en papier neuve et humide dans la chambre d hybridation et fermer le couvercle pour cr er une atmosph re satur e en humidit Pour viter l vaporation du faible volume de m lange d hybridation qui se trouve sur la puce il est n cessaire de r aliser l hybridation dans une atmosph re satur e en humidit Une chambre d hybridation d di e l analyse PelvoCheck CT NG est disponible aupr s de Greiner Bio One voir le chapitre 2 ug Incuber la quantit requise de puces PelvoCheck CT NG dans la chambre d hybridation pr par e temp rature ambiante 18 25 C pendant au moins 10 minutes Le porte lame m
22. surface des puces PelvoCheck CT NG par centrifugation 3 minutes 1 minute 500 g vitesse maximale Figure 6 tapes de travail de la proc dure de lavage Effectuer les tapes de lavage et de s chage avant la lecture de la puce PelvoCheck CT NG l aide du scanner CheckScanner et du logiciel CheckReport 33 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 8 4 Lecture et valuation de la puce PelvoCheck CT NG Placer la ou les puces PelvoCheck CT NG dans le scanner CheckScanner et proc der la lecture de la mani re indiqu e en d tail dans le Guide de l utilisateur du logiciel CheckReport Pour de plus amples informations sur l installation du scanner CheckScanner et du logiciel CheckReport ainsi que sur le syst me informatique requis consulter le mode d emploi du scanner CheckScanner et du logiciel CheckReport La derni re version du logiciel peut tre t l charg e sur le site Web de Greiner Bio One https www gbo com en_INT know how services download center html 34 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 9 R SOLUTION DES PROBL MES Si l un des messages d erreur suivants appara t pendant la lecture de la puce ou si l analyse PelvoCheck CT NG choue en raison de contr les sur puce sp cifiques proc der comme suit Ne pas h siter contacter le distributeur Greiner Bio One local pour toute question ou difficult li
23. ug Pr parer le m lange r actionnel compos de PelvoCheck CT NG PCR MasterMix HotStarTaq polym rase et uracil N glycosylase pour la quantit requise de PCR comme indiqu dans le Tableau 2 voir en page 27 Pour analyser plusieurs chantillons le m lange r actionnel doit tre pr par en lot dans la quantit requise pour toutes les analyses Pour s adapter aux variations de volume qui surviennent au cours du pipetage il est recommand d augmenter le nombre de r actions n de 1 pour chaque puce n 1 Par exemple pr parer un volume de m lange r actionnel pour 13 amplifications si 12 chantillons doivent tre test s voir le Tableau 2 page 27 Il est recommand d inclure un contr le n gatif pour chaque lot de PelvoCheck CT NG PCR MasterMix pr par Le tampon d lution d ADN provenant du kit d extraction d ADN appropri ou de l eau de qualit PCR peut servir de contr le n gatif Toujours utiliser un flacon de PelvoCheck CT NG PCR MasterMix pour les r actions d une puce mg M langer soigneusement le m lange r actionnel en le passant au vortex pendant 2 secondes puis en le centrifugeant ou en le pipetant plusieurs fois m Aliquoter le m lange r actionnel en pipetant 21 uL pour chaque PCR dans un microtube pour PCR de 0 2 mL paroi fine Ajouter de l ADN dans un espace de travail s par de celui de la pr paration du m lange r actionnel voir le chapitre 7 2 m Ajouter 5 pi d
24. 0 premiers mL du jet d urine pour une d tection sensible des agents pathog nes Ceci est particuli rement important pour la d tection de CT qui est un organisme intracellulaire strict alors que NG est surtout associ aux cellules En g n ral le premier jet d urine contient une quantit abondante de cellules et seul l chantillonnage de cette fraction permet une analyse PelvoCheck CT NG sensible conform ment aux caract ristiques de performance indiqu s PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Chapitre 8 1 2 Extraction d ADN check Kit g extracti Chapitre 8 2 PCR Chapitre 8 3 2 Hybridation Chapitre 8 3 3 Lavage et s chage Chapitre 8 4 Lecture et valuation Figure 4 Vue d ensemble des diff rentes tapes de travail du PelvoCheck CT NG PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 21 8 1 2 Extraction d ADN L extraction d ADN ne fait pas partie du kit de test PelvoCheck CT NG Cette proc dure doit tre effectu e avant l analyse PelvoCheck CT NG l aide du kit d extraction d ADN oCheck galement fourni par Greiner Bio One voir les informations utiles pour la commande au chapitre 2 Suivre rigoureusement le mode d emploi du kit d extraction d ADN oCheck Les chantillons d urine humaine ou les frottis g nitaux pr lev s e au moyen du kit pr analytique PelvoCheck Greiner Bio
25. 7 que celle du porA PCR maison 55 57 98 2 contre 96 5 probablement en raison d une sensibilit analytique plus lev e et peut tre des variations des s quences porA r cemment d crites pour une souche de gonocoques isol e en Australie Whiley et al 2011 Eurosurveillance La sp cificit du test PelvoCheck CT NG 57 58 pour l ADN de NG DNA semble tre inf rieure celle du porA PCR maison 58 58 98 3 contre 100 Cette plus faible sp cificit repose toutefois seulement sur un r sultat positif dans un chantillon ayant obtenu un r sultat n gatif aussi bien pour le porA PCR maison que pour le test Abbott RealTime CT NG L chantillon peut contenir de l ADN de NG qui ne peut tre d tect que par le test PelvoCheck CT NG s il s agit de celui des tests utilis s dont la sensibilit est la plus lev e Dans ce contexte une d claration r cente pr tend que la confirmation de tests NAAT positifs peut tre difficile si la sensibilit du test de confirmation est inf rieure celle du test initialement utilis Ceci est vident lorsque l chantillon est la limite du positif et contient uniquement un nombre r duit de copies des s quences cibles Schachter ef al 2006 J Clin Microbiol C est la raison pour laquelle les r sultats NAAT positifs non confirm s par un autre NAAT ne sont pas n cessairement des faux positifs mais peuvent repr senter aussi des r sultats faux n gatifs du test de confirmation
26. ES DE S CURIT Le kit de test PelvoCheck CT NG est r serv un usage en laboratoire et pas pour la m dication un usage domestique ou d autres fins Toujours porter une blouse adapt e des gants usage unique et des lunettes de protection et respecter les consignes de s curit donn es dans ce chapitre Toujours porter une blouse adapt e des gants usage unique et des lunettes de protection et respecter les consignes de s curit donn es dans ce chapitre et dans le chapitre 7 3 Informations r glementaires Les composants suivants du kit de test PelvoCheck CT NG contiennent des substances nocives ou dangereuses Composant Classification Pictogramme Mentions de danger et conseils de prudence du kit conform ment SGH et mention Quantit au r glement d avertissement Substances 03 dangereuses n 1272 2008 Tampon toxicit aigu H302 Nocif en cas d ingestion d hybridation voie orale H332 Nocif par inhalation PelvoCheck cat gorie 4 H314 Provoque des br lures de la peau et des CT NG toxicit aigu l sions oculaires graves solution de inhalation H412 Nocif pour les organismes aquatiques thyocianate de cat gorie 4 entra ne des effets n fastes long terme guanidine toxicit aquatique ED 25 50 chronique P273 P273 viter le rejet dans l environnement N CAS cat gorie 3 BEER P280 P280 Porter des gants de protection des 593 84 0 corrosion cutan e v tements
27. Il est absolument n cessaire de s parer les zones d extraction d amplification et d hybridation de l ADN Un produit d amplification ne doit jamais tre introduit dans la zone d sign e pour l extraction et le mat riel de pr l vement ne doit jamais tre introduit dans la zone pr vue pour la pr paration du mastermix d amplification La figure 3 illustre la fa on dont un laboratoire peut tre s par en trois sections distinctes L une des salles est exclusivement utilis e pour l extraction d ADN la deuxi me pour la mise en place et la r alisation des r actions de PCR et la troisi me pour l hybridation et l analyse Afin d viter la contamination des chantillons chaque salle doit tre exclusivement r serv e l application ou la technique indiqu e L utilisation de couleurs peut tre avantageuse pour viter un change accidentel d quipements ou de consommables entre les zones Salle 2 Q Figure 3 S paration des salles Salle 1 L ensemble de la proc dure d extraction d ADN doit tre effectu e dans cette salle Salle 2 Dans cette salle le m lange r actionnel destin la PCR est pr par et aliquot id alement sous une hotte PCR L ajout des chantillons d ADN extraits dans la salle 1 doit tre effectu dans un espace part de la salle 2 Salle 3 Les tapes de r action d hybridation de lavage et de s chage de la puce ont lieu dans la troisi me salle du laboratoire De plus le sca
28. KEN RREEEN RRE EEE RENE E EEN R KEEN EEERE KENNEN 24 6 2 I e eieiei e leie du tHermecycleUrs a ane e 24 8 2 2 Traitement par uracil N Glycosylase NGC E 25 E Reparan orac ER E 26 8 3 AyDridation et lavage moe a 28 EE EE 28 9 3 2 ee ee D S E E 30 57 LV AT e echange a e a a de 20 32 8 4 Lecture et valuation de la puce PelvoCheck CT NG nn nnnnesrnennnneremenmneeennnnnne 34 D PANNAGE EE E 35 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 10 ASSISTANCE TECHNIQUE gebeten geed anne 38 11 CARACT RISTIQUES DE PERFORMANCE DE PELVOCHECK CT NG aasan 39 11 1 Performance analytique de PelvoCheck CT NG nn nnnrrrnrrrrnnrrrrrrnennnnnsrrnnennnnnnnns 39 ln Ve ME ite EEN de EE 39 11 1 2 Sp cificit analytique pour CT et NG iii 39 11 1 3 Sp cificit analytique d accompagnement de la flore urog nitale 39 OR a a E E 40 To Reproduce do E Ai N E EE se ct a ee ee tn ae ae Gates 41 11 5 Performance clinique de PelvoCheck CT NG nr rnnnnrnnnnesnenneeeenmnenennmeeennnnnes 43 12 PROCOTOLE COURT PELVOCHECK CITING 2 cn 47 12 1 Salle 2 PCR Pr paration du m lange r actionnel sis 47 12 2 Salle 2 PCR Ajout de la matrice d ADN PCR nn nnrrnnnrrnnrrnenenennnes 48 12 3 Salle 3 Hybridation Pr paration r action d hybridation 49 12 4 Salle 3 Lavage et
29. NG est de 100 pour les organismes courants dans les voies urog nitales humaines PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Acinetobacter baumannii Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter lwoffi Actinobacillus actinomycetemcomitans Actinomyces odontolyticus Actinomyces israelis Bacillus subtilis Bacteroides ureolyticus Bacteroides uniformis Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium breve Campylobacter concisus Campylobacter gracilis Campylobacter rectus Candida albicans Candida glabrata Capnocytophaga gingivalis Capnocytophaga ochracea Capnocytophaga sputigena Citrobacter amalonaticus Citrobacter freundii Citrobacter koseri Citrobacter koseri Chlamydophila psittaci Chlamydophila pneumoniae Clostridium difficile Clostridium perfringens Eikenella corrodens Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter sakazakii Enterococcus durans Enterococcus faecali Enterococcus faecium Escherichia coli Eubacterium nodatum Fusobacterium nucleatum Gardnerella vaginalis Hafnia alvei Kingella denitrificans Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Lactobacillus casei Lactobacillus crispatus Lactobacillus gasseri Lactobacillus iners Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus vaginalis Mobiluncus muleris Mogibacterium timidum Morganella morganii Mycoplama hominis Moraxella osloensis Mycoplasma hominis Mycoplasma genitalium Mycoplasma orale Mycoplosma pneumoniae Neisseria elongata
30. Se laver soigneusement les mains apr s avoir manipul les chantillons et les r actifs PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 8 PROC DURE D UTILISATION DU PELVOCHECK CT NG Le chapitre suivant d crit en d tail les diff rentes tapes de travail menant in fine l laboration d un rapport d taill indiquant clairement la pr sence ou l absence de Chlamydia trachomatis et ou de Neisseria gonorrhoeae dans chaque chantillon analys La Figure A voir page 21 pr sente une vue d ensemble des diff rentes tapes de travail r aliser Elle illustre galement le sous chapitre correspondant qui d crit l tape du test en particulier Les tapes de travail doivent tre men es dans l ordre indiqu dans ce chapitre Chaque tape pratique est indiqu e par une fl che bleue um Le pr l vement des chantillons l extraction d ADN et l analyse avec le logiciel CheckReport ne font pas partie du kit de test PelvoCheck CT NG La description de ces tapes de travail est donc abr g e dans ce chapitre Pour de plus amples informations consulter les manuels d utilisation correspondants par exemple au kit pr analytique PelvoCheck sur chantillon d urine au kit pr analytique PelvoCheck par couvillon au kit d extraction d ADN oCheck et au logiciel CheckReport Veuillez lire attentivement le mode d emploi Si vous utilisez d j le kit de test PapilloCheck pour le d pistage
31. ableau 8 Degr de la performance de diagnostic de PelvoCheck CT NG compar aux m thodes de r f rence pour NG Concordance en Concordance nombre d chantillons Concordance positive urine individuel 54 55 e es Concordance n gative urine individuel 57 60 g ne porA Type M thode de r f rence Crit re de qualit Sr d chantillon La comparaison des r sultats de PelvoCheck CT NG et de Roche COBAS TaqMan CT ainsi que de PelvoCheck CT NG et Abbott RealTime CT NG d montre une grande concordance des r sultats dans 1646 1649 chantillons 99 8 et 132 133 chantillons 99 2 respectivement En ce qui concerne le test Abbott RealTime CT NG en tant que test de r f rence sup rieur aucun r sultat faux positif vis vis de CT n a t obtenu avec le test PelvoCheck CT NG ni avec le test Roche COBAS TaqMan CT sp cificit de 100 pour chaque test La sensibilit du test PelvoCheck CT NG en termes d ADN de CT semble tre l g rement sup rieure compar celle de Roche COBAS TaqgqMan CT 82 83 98 8 par rapport 81 83 97 6 En g n ral Taccord total des r sultats obtenus avec le PelvoCheck CT NG et le porA PCR maison 111 115 96 5 ainsi que celui des r sultats d riv s des analyses avec PelvoCheck CT NG et Abbott RealTime CT NG 113 115 98 2 taient lev s La sensibilit du test PelvoCheck CT NG pour l ADN de NG tait l g rement plus lev e 56 5
32. adre de la m me r action un fragment du g ne humain non r p titif ADAT1 ad nosine d aminase1 sp cifique l ARNt humain est amplifi pour surveiller la pr sence de mat riel d chantillon humain dans l chantillon d urine ou le frottis g nital contr le d chantillon et un mod le de contr le interne pr sent dans le PelvoCheck CT NG PCR MasterMix est amplifi pour surveiller la performance de la PCR contr le de PCR Au cours de la PCR l ADN amplifi est marque par fluorescence Le PelvoCheck CT NG PCR MasterMix contient en outre du dUTP Toute contamination par recirculation potentielle issue des r actions PCR pr c dentes peut donc tre exclue en utilisant un traitement base d uracil n glycosylase UNG voir le chapitre 8 2 2 Les produits de PCR sont ensuite hybrid s avec des sondes d ADN sp cifiques aux pathog nes et avec des contr les fix s la surface de la puce PelvoCheck CT NG Chaque puce contient 12 micro puces ADN ce qui permet d analyser simultan ment 12 chantillons chantillons d urine ou frottis et des chantillons de contr le n gatifs L ADN non li est limin aux tapes de lavage suivantes L efficacit de l hybridation est surveill e contr le d hybridation Enfin la puce PelvoCheck CT NG est lue analys e et valu e automatiquement respectivement gr ce au scanner CheckScanner et au logiciel CheckReport Voir les informations utiles pour la commande au chapitre 2
33. agn tique de la chambre d hybridation est quip d un aimant l une de ses deux extr mit s seulement Si moins de quatre puces PelvoCheck CT NG doivent tre hybrid es simultan ment veiller remplir le porte lame avec les puces PelvoCheck CT NG du c t oppos l aimant Sinon les puces PelvoCheck CT NG ne seront pas recouvertes de liquide au cours de la proc dure de lavage Conserver les puces PelvoCheck CT NG non utilis es dans la bo te lames du PelvoCheck CT NG ou sera conserv e dans la pochette en plastique ferm e avec le sachet de dessicatif et mise l abri de la lumi re m Pr parer les solutions de lavage I et Il conform ment aux instructions suivantes Pr paration des solutions de lavage I et Il ug Pr parer le m lange des solutions de lavage l et Il en fonction du nombre de puces PelvoCheck CT NG analys es comme indiqu dans le Tableau 3 voir page 29 mg Aliquoter deux volumes gaux du m lange de solution de lavage dans deux chambres de lavage oCheck distinctes et les tiqueter en tant que solutions de lavage et II Chaque chambre de lavage oCheck contient une chelle grav e qui indique la quantit de solution de lavage n cessaire pour 4 puces au maximum Utiliser cette chelle pour contr ler la quantit de tampon m Pr chauffer la solution de lavage Il 50 C dans un bain marie temp rature contr l e pendant au moins 20 minutes avant l utilisation S assurer que
34. ase 5 U uL imp rativement Qiagen 203203 203205 203207 203209 e Uracil N glycosylase Uracil ADN glycosylase 1 U uL Fermentas r f EN0361 r f EN0362 e Prot inase K 30 mg et 1 8 mL de tampon de prot inase K uniquement pour le regroupement imp rativement Greiner Bio One 515 041 Consommables suppl mentaires requis e Eau de qualit PCR e Eau purifi e e Gants usage unique e Contr le AcroMetrix CT NG Life technologies r f rence 967146 quipement suppl mentaire requis e Micro centrifugeuse pour microtubes de 1 5 et 2 mL e Centrifugeuse pour tubes en polypropyl ne de 50 mL ou centrifugeuse pour lames par ex mini centrifugeuse pour lames de paillasse e Micro centrifugeuse pour microtubes simples de 0 2 mL ou barrettes pour PCR de 8 tubes e Thermocycleur pour PCR imp rativement m GeneAmp PCR system 9700 Applied Biosystems m Thermocycleur 96 puits Veriti M Applied Biosystems e Bain marie 50 C e Micropipettes diff rents volumes entre 1 et 1 000 uL e Multi pipette 8 canaux volume 5 50 uL e Pipeteur pour pipettes en verre et en plastique e Vortex e Racks pour diff rents microtubes e Minuteur e Container DASRI Autre mat riel requis e Ordinateur concernant le syst me requis voir les modes d emploi du scanner CheckSanner et du logiciel CheckReport 7 Pour la proc dure de lavage de PelvoCheck CT NG deux chambres de lavage oChe
35. ck sont n cessaires PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 3 EXP DITION ET STOCKAGE L exp dition du kit de test PelvoCheck CT NG se fait temp rature ambiante Le kit doit toutefois tre stock entre 4 et 8 C imm diatement apr s la r ception et prot g de la lumi re Toujours conserver la bo te lames contenant les puces PelvoCheck CT NG dans une poche zipp e ferm e contenant un dessicatif Tous les composants doivent tre stock s dans le conditionnement d origine du kit afin d viter tout m lange de lots avec des dates de p remption diff rentes Lorsqu ils sont conserv s correctement le kit de test PelvoCheck CT NG et ses composants peuvent tre utilis s jusqu la date de p remption indiqu e Dans ces conditions la dur e de conservation correspond la date de p remption apr s la premi re ouverture du kit et de ses composants Le stockage du kit de test PelvoCheck CT NG entre 4 et 8 C peut entra ner la pr cipitation de sels dans le tampon d hybridation et le tampon B Cela ne compromet pas la qualit du produit Les pr cipit s doivent tre dissous avant l utilisation en ramenant le produit temp rature ambiante 18 25 C et en passant le tube le flacon au vortex ou en l agitant Produit Stockage PelvoCheck CT NG 4 8 C abri de la lumi re PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 4 CONSIGN
36. contr le d hybridation ainsi que l homog n it et la qualit de l impression contr le d orientation et contr le d impression Outre la pr sence ou l absence de CT et ou de NG le logiciel CheckReport affiche automatiquement dans un rapport d taill les valeurs correspondantes des contr les et les agents pathog nes d tect s Les deux longueurs d onde d excitation du scanner CheckScanner sont utilis es pour afficher les diff rents contr les Le canal rouge longueur d onde d excitation de 635 nm sert au contr le de l efficacit de l chantillonnage et de l extraction d ADN ainsi qu la performance du test contr le d chantillon et de PCR alors que la qualit de l hybridation et de la puce contr le d hybridation d orientation et d impression est valu e dans le canal vert longueur d onde d excitation de 532 nm Canal rouge longueur d onde d excitation de 635 nm Contr le d chantillon PelvoCheck CT NG contr le la qualit de l chantillon de son chantillonnage et ou de l extraction d ADN en amplifiant un fragment du g ne humain non r p titif ADAT1 ad nosine d aminase1 sp cifique l ARNt humain Si de l ADN humain est pr sent en quantit suffisante dans l ADN extrait de l chantillon un signal fluorescent est g n r sur les spots de contr le de l chantillon Si l amplification de l ADAT1 est nulle ou insuffisante le logiciel CheckReport indique que le contr le d chantil
37. dans l chantillon L hybridation a t effectu e sans ajout de produit de PCR M lange insuffisant du m lange d hybridation Probl mes li s au thermocycleur SAMPLE CONTROL FAILED chec du contr le d chantillon chec du pr l vement d chantillon Mat riel d chantillon insuffisant Stockage incorrect de l chantillon chec de la pr paration de l ADN Pas d ajout d ADN d chantillon l amplification PCR PCR AND OR SAMPLE CONTROLS HAVE NOT FAILED BUT DISPLAY A SNR 635 VALUE OF 0 les contr les de PCR et ou d chantillon n ont pas chou mais affichent une valeur signal sur bruit 635 nulle CONTAMINATION STATUS OF NEGATIVE CONTROL IS CONTAMINATED l tat de contamination du contr le n gatif est contamin a Le contr le n gatif du lot d extraction d ADN et le contr le n gatif du lot de PCR sont contamin s Les r actifs de PCR ont t contamin s PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Commentaires et suggestions Recommencer l analyse PelvoCheck CT NG en commen ant par la pr paration de la PCR Veiller utiliser de l uracil N glycosylase la bonne dilution attention dans le cas de PelvoCheck CT NG la dilution est de 1 50 Elle diff re de celle du test PapilloCheck Recommencer l analyse PelvoCheck CT NG en commen ant par la pr para tion de la PCR Veiller bien m
38. de protection un quipement de cat gorie 1c protection des yeux du visage P305 P351 P338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX rincer avec pr caution l eau pendant plusieurs minutes Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent tre facilement enlev es Continuer rincer Appeler un CENTRE ANTIPOISON ou un m decin Informations suppl mentaires concernant le danger UE EUHO32 Au contact d un acide d gage un gaz tr s toxique Tampon B irritation cutan e H315 Provoque une irritation cutan e PelvoCheck cat gorie 2 H318 Provoque des l sions oculaires graves CT NG l sions oculaires solution de graves P280 Porter des gants de protection des v tements dod cylsulfate cat gorie 1 D de protection un quipement de protection de sodium des yeux du visage 10 20 di P305 P351 P338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX N CAS 151 21 3 rincer avec pr caution l eau pendant plusieurs minutes Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent tre facilement enlev es Continuer rincer La version actuelle de la Fiche de donn es de s curit de ce produit peut tre t l charg e sur le site Web de Greiner Bio One www gbo com en INT know how services download center html PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 5 LIMINATION DES D CHETS Apr s avoir lav et s ch la puce PelvoCheck CT NG il es
39. e 24 L inactivation de l uracil N glycosylase et l activation de la HotStarTaq polym rase se produisent au cours de la seconde tape 15 minutes 95 C 18 L achat du PelvoCheck CT NG s accompagne d une licence limit e en vertu des brevets am ricains n 5 035 996 5 683 896 5 945 313 6 287 823 et 6 518 026 ainsi que des brevets trangers correspondants 19 Longo M C et al 1990 Use of uracil DNA glycosylase to control carry over contamination in polymerase chain reactions Gene 93 125 128 25 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 8 2 3 Pr paration de la PCR l exception de la HotStarTaq polym rase et de l uracil N glycosylase le PelvoCheck CT NG PCR MasterMix contient d j tous les composants n cessaires la PCR tampon de PCR Mol dNTP amorces et mod le de contr le de PCR La HotStarTaq polym rase ne fait pas partie du kit PelvoCheck CT NG et doit tre achet e s par ment aupr s de Qiagen voir les informations utiles pour la commande au chapitre 2 Le kit de test PelvoCheck CT NG a t valid avec la HotStarTaq polym rase de Qiagen voir le chapitre 2 Il est imp ratif d utiliser cette polym rase pour atteindre les performances tablies De mani re optimale la pr paration du m lange r actionnel est r alis dans un environnement prot g par exemple sous une hotte PCR pour viter toute contamination de la r action
40. es fragments de deux cibles de contr le sont amplifi s par PCR en pr sence d amorces sp cifiques La sonde fluorescente est introduite pendant la PCR 2 Hybridation Les produits d amplification sont ensuite hybrid s avec des sondes d ADN compl mentaires pr sentes dans cinq exemplaires de chaque puce 3 Lavage et s chage Les produits d amplification non li s sont limin s lors des tapes de lavage suivantes 4 Lecture et analyse La puce PelvoCheck CT NG est lue analys e et valu e l aide du scanner CheckScanner et du logiciel CheckReport Un rapport est cr indiquant clairement la pr sence ou l absence de Chlamydia trachomatis et ou de Neisseria gonorrhoeae 13 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 6 4 Conception de la puce PelvoCheck CT NG 6 4 1 Configuration de la puce PelvoCheck CT NG Chaque puce PelvoCheck CT NG contient 12 micro puces nomm es de A1 B6 Chaque micro puce PelvoCheck CT NG comporte 8 sondes diff rentes et pr sente un bord sur lev Chaque sonde est d pos e en cinq exemplaires Trois sondes sp cifiques aux types permettent la d tection de CT et de NG NG 1 et NG 2 au moyen du canal rouge longueur d onde d excitation de 635 nm Quatre contr les du processus et le contr le d impression de tous les spots permettent de surveiller la proc dure du test dans le canal vert et le canal rouge longueurs d onde d excitation de 532 et 635 n
41. et la d tection d acide nucl ique bact rien l aide de PelvoCheck CT NG Les analyses peuvent donc tre effectu es en suivant les m mes instructions que celles pour les chantillons des patients Pour en savoir plus sur le contr le AcroMetrix CT NG Life technologies r f 967146 consulter les informations du produit Pour les informations utiles pour la commande consulter le chapitre 2 AcroMetrix CT NG contient un mat riel de contr le de 20 mL Pour une utilisation en tant que contr le qualit de PelvoCheck CT NG il est recommand de pr parer 25 uL d aliquots pr ts l emploi et de les stocker 20 C ou moins Ne pas recongeler les aliquots et liminer toute partie non utilis e Ne pas utiliser AcroMetrix CT NG au del de la date de p remption indiqu e Pr parer 230 uL du milieu de conservation d chantillons donn de l eau de qualit PCR et ajouter 20 uL de contr le AcroMetrix CT NG pour atteindre un volume final de 250 ul Continuer conform ment au mode d emploi du kit d extraction d ADN pr paration avec une colonne unitaire oCheck et ensuite au mode d emploi du PelvoCheck CT NG chapitre 8 7 Documentation du contr le AcroMetric CT NG num ro MAN0007487 Date d entr e en vigueur 31 d c 13 R v A 00 22 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Si la pr paration l extraction l amplification l hybridation et la lecture de l chantillon
42. extrait d ADN pour chaque PCR et m langer en passant au vortex pendant 2 secondes puis en centrifugeant ou en pipetant plusieurs fois Le volume total d une PCR est de 26 uL m Placer les microtubes dans un thermocycleur et lancer la PCR l aide du programme du thermocycleur indiqu dans le chapitre 8 2 1 voir le tableau 1 page 24 Une fois la PCR termin e les produits d amplification doivent tre utilis s imm diatement des fins d hybridation ou conserv s l abri de la lumi re lt 20 C pendant trois mois maximum vu que l activit de l uracil N glycosylase peut tre en partie r tablie des temp ratures inf rieures 55 C PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Tableau 2 Pr paration de la r action de PCR pour le PelvoCheck CT NG 1 r action 13 r actions 26 r actions 39 r actions 52 r actions 1 puce 2 puces ERL 4 puces PelvoCheck CT NG PCR MasterMix SR 258 7 uL 517 4 uL 776 1 uL 1 034 8 uL HotStarTaq polym rase 5 U uL 0 1 uL 1 3 uL 2 6 uL 3 9 uL 5 2 uL Uracil N glycosylase Dilution au 1 50 39 uL 52 uL 0 02 U pL Volume total avant l ajout de l ADN dans 819 uL 1 092 uL l chantillon ADN extrait de l chantillon d urine ou du frottis matrice d ADN Volume total par r action 27 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 8 3 Hybridation et lavage 8 3 1 Pr paration et mise en
43. hantillons Ge EL d ADN Pr paration en colonne unitaire 515 040 50 pr parations Pointes filtre pour micropipettes st riles sans ADNase Herl 96 960 137 261 96 960 750 265 96 768 Pointes filtre 10 uL de faible r tention Pointes filtre 100 uL de faible r tention Pointes filtre 1 250 uL de faible r tention Microtubes exempts d ADNase Microtubes 1 5 mL 616 201 500 4000 Microtube 0 2 mL 683 201 500 1000 8 barrettes pour PCR de 0 2 mL 673 210 125 1250 Barrettes de bouchons pour 8 barrettes pour PCR 373 270 125 1250 de 0 2 mL Tube en polypropyl ne de 50 ml 210 261 25 450 Pipettes en plastique pour pipeteur Pipette de 10 mL 607 180 ou 607 160 Pipette de 25 mL 760 180 ou 760 160 Pipette de 50 mL 768 180 ou 768 160 4 Certaines tailles de pointe cit es sont en option en fonction des micropipettes disponibles En principe il est recommand d utiliser des barrettes de 8 tubes pour PCR Les microtubes simples 0 2 mL sont en option si les barrettes ne sont pas disponibles Uniquement n cessaire en cas d absence de centrifugeuse pour lames PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 quipement R f Greiner Bio One N Quantit CheckScanner 862 070 Version de base du logiciel CheckReport 862 080 Module d extension du logiciel CheckReport de es PelvoCheck CT NG RE EE RE Enzymes requises e Taq Polym rase HotStarTaq ADN polym r
44. ication PCR Ce r sultat est jug valide si le logiciel CheckReport d tecte au moins un agent pathog ne dans l chantillon et que le signal est sup rieur un seuil d fini Le contr le d chantillon et ou de PCR peut ensuite pr senter des si gnaux de fluorescence faibles voire nuls en raison de la comp tition qui s est exerc e au cours de la PCR Recommencer l analyse PelvoCheck CT NG en commen ant par amplification d ADN 36 PROBL ME et cause Commentaires et suggestions b Seul le contr le n gatif du Recommencer l analyse PelvoCheck CT NG en commen ant par l extrac lot d extraction d ADN est tion d ADN Si les contr les n gatifs continuent tre contamin s utiliser un contamin nouveau kit d extraction d ADN Les chantillons ont t contamin s pendant l extraction d ADN c Seul le contr le n gatif du lot Recommencer l analyse PelvoCheck CT NG en commen ant par de PCR est contamin lhybridation d ADN Le contr le n gatif de l amplification PCR a t contamin par un d versement d chantillons positifs 37 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 10 ASSISTANCE TECHNIQUE Pour toute question ou difficult li e aux produits oCheck ne pas h siter contacter un distributeur Greiner Bio One local ou directement le service d assistance technique l adresse support dx gbo com Le personnel du service d assistance techni
45. iemno ci Oppbeva res m rkt ATTOONKEUETOI OTA OKOTEIV Karanl k yerde saklay n z Important Note Wichtiger Hinweis Re marque impor tante Nota im portante Nota im portante Aviso im portante Belangri jke op merking Vigtig henvis ning Viktigt medde lande Wa ne Viktig merknad 2 NHAVTIK UT EIEN nemli Not TABLE DES MATI RES ON DU AT EE 5 2 CONSOMMABLES QUIPEMENT ET MAT RIEL REQUIS es 6 3 EXP DITION ET STOCKAGE NENNEN 8 4 CONSIGNES DE S CURIT ENEE 9 5 LIMINATION DES D CHETS EEN 10 GREIN 11 OT COM EEN 11 6 27 USAH pr vue se ce en en ne RS a a 12 0 31 PnIMCIDE du LOS EE 12 6 4 Conception de la puce PelvoCheck CT NG nn nrrrrnnrrrnnnerrnnnnsrnnnnernennsnenns 14 6 4 1 Configuration de la puce PelvoCheck CT NG ES 2 14 El EE 15 7 CONDITIONS G N RALES DE TRAVAIL AVEC PELVOCHECK CT NG 17 T i instructions DEE 17 E Ka Klee EE 17 1 3 AVertissements et pr cautions sin nn nee E en ee 18 13 APIevVentIOMO Renn e E re DEE 18 7 3 2 Instructions pour la manipulation EE 18 Lo o Precautions generales tora terana a a a Li 18 e SC Travailler en Be Ee EE 19 8 PROC DURE D UTILISATION DU PELVOCHECK CTING EE 20 8 1 Pr l vement d chantillons et extraction d ADN nirrnrrnnrnnnnnnns 20 Ski Prelevement d chantillons am aaa a a 20 12 te e ie ADN EE ER o Ve EE ee enn E ER 8 2 R action en cha ne par polym rase PCR
46. ier De plus la plupart des r sultats inconsistants ont montr une alternance de r sultats positifs et n gatifs caract ristiques des chantillons positifs limites En revanche tous les frottis cervicaux et vaginaux ensemenc s avec CT ou NG frottis vrai positifs v rifiable et identiques pour les 3 m thodes ont obtenu des r sultats positifs et aucun r sultat inconsistant par rapport aux deux m thodes de r f rence n a t d tect Aucune analyse n a r v l des r sultats CT ou NG faux n gatifs avec PelvoCheck CT NG de ce fait la concordance n gative sp cificit de PelvoCheck CT NG tait de 100 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 2 Salle 2 Pr parer de pr f rence une dilution d uracil N ADN glycosylase et de PelvoCheck CT NG PCR MasterMix sur une paillasse propre Diluer l uracil N glycosylase dans de l eau de qualit PCR 1 50 M langer soigneusement la dilution UNG Pr parer le m lange r actionnel pour la quantit requise de PCR PelvoCheck CT NG PCR MasterMix HotStar Taq Polym rase 5 U uL Uracil N Glycosylase Dilution 1 50 0 02 U L Volume total avant l ajout de l ADN dans l chantillon 19 9 uL 0 1 uL 1 uL 21 uL 258 7 uL 517 4uL 776 1 uL 1 034 8 uL 1 3 uL 2 6 uL 3 9 uL 5 2 uL 13 ul 26 uL 39 uL 52 uL 273 uL 546 uL 819uL 1092 yL M langer soigneusement le m lange r act
47. ionnel Aliquoter le m lange r actionnel ajouter 21 uL du m lange r actionnel pour chaque PCR dans un microtube pour PCR de 0 2 mL d une barrette pour PCR 12 2 Salle 2 PCR Ajout de la matrice d ADN R action de PCR Salle 2 m Ajouter 5 pL de matrice d ADN pour chaque PCR m Bien m langer m D buter la PCR avec le programme pr par du thermocycleur Dur e Temp C Nombre de cycles 30 secondes 60 secondes 45 30 secondes D ee S mr e fe fe fen e fk fy wee a PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Commencer les pr parations au moins 30 minutes avant lhybridation Stabilisation des tampons d hybridation et de lavage Pr paration de la chambre d hybridation Pr incubation des puces Pr chauffage du bain marie 50 C Pr paration des solutions de lavage Dissoudre les ventuels pr cipit s qui se sont form s dans les tampons d hybridation et de lavage en les exposant la temp rature ambiante 18 25 C et bien m langer Pr parer le m lange de solution de lavage pour la quantit de puces PelvoCheck CT NG analyser Eau purifi e 100 mL 200 mL 300 mL 400 mL Tampon A PelvoCheck CTING 10 mL 20 mL 30 mL 40 mL Tampon B PelvoCheck CT NG 1 25 mL 2 5 mL 3 75 mL D mL Volume total 111 25 mL 222 50 mL 333 75 mL 445 mL Aliquoter le m lange de solution de lavage
48. ire de r guli rement talonner entretenir les micropipettes le bain marie et le bloc chauffant Le pipetage de petites quantit s de l ordre du microlitre est une op ration d licate Il faut d s lors veiller pipeter avec la plus grande pr cision possible Pour viter toute contamination microbienne des r actifs retirer les aliquots des tubes de r actif avec prudence Toutes les tapes de centrifugation doivent tre r alis es temp rature ambiante 18 25 C PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 7 3 4 Travailler en toute s curit e Faire preuve de prudence lors de la manipulation d chantillons biologiques contenant du liquide biologique humain potentiellement infectieux Afin de r duire le risque d infection li du mat riel potentiellement infectieux il est recommand de travailler sous flux laminaire jusqu ce que la lyse des chantillons soit termin e Manipuler et liminer tous les chantillons biologiques comme s ils taient susceptibles de transmettre des agents pathog nes e Ne jamais pipeter les solutions la bouche e Ne pas manger boire fumer ni appliquer de produits cosm tiques dans les zones de travail e viter tout contact direct avec les chantillons biologiques ainsi que toute projection des chantillons e Toujours porter une blouse des gants et des lunettes de protection dans le cadre d un travail avec des chantillons humains e
49. ises en compte afin d valuer la robustesse du syst me de test PelvoCheck e Quantit de polym rase e Mode d acc l ration du cycleur de PCR e Variation du type de dispositif e Quantit de produit de PCR dans l hybridation e Volume de tampon d hybridation e Temp rature d hybridation e Dur e d hybridation e Temp rature de lavage e Dur e du lavage Tous les tests ont t effectu s trois fois avec trois concentrations du mod le 10 100 et 10 copies de plasmides de CT ou NG par chantillon et avec une r p tition du test Les plages v rifi es de valeurs de param tres auxquelles une d tection robuste de CT et NG est possible avec PelvoCheck CT NG sont r sum es dans le tableau 6 Tableau 6 Robustesse de PelvoCheck CT NG Param tre N I Quantit de polym rase 0 5 2 unit s rxn Mode d acc l ration 9 600 et Max ABI GenAmp GenAmp Type de dispositif ABI Verity Verity ABI GenAmp ABl Verity Dur e d hybridation Temp rature de lavage de l tape de lavage 50 C 50 C 5 C 1 tape de lavage f 20 secondes 10 secondes Dur e du lavage 2 tape de lavage 30 secondes 10 secondes PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 41 En cas d amplification de la robustesse la pr sence de certaines bact ries courantes en exc s dans les voies urog nitales peut entra ner une comp tition de lamplification Lors de l analyse pour d
50. iter que la surface de la puce ne se dess che pendant la proc dure de lavage ug liminer imm diatement tout liquide de la surface de la puce par centrifugation Si une micro centrifugation sp ciale des micro puces est utilis e centrifuger pendant 1 minute Si une centrifugation pour tubes de 50 mL est utilis e placer chaque puce PelvoCheck CT NG lav e dans un tube s par de 50 mL et centrifuger temp rature ambiante 18 25 C pendant 3 minutes 500 g La puce PelvoCheck CT NG est maintenant pr te tre lue imm diatement Pour le nettoyage des chambres de lavage oCheck rincer plusieurs fois l eau apr s chaque proc dure de lavage et de s chage PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Premi re tape de lavage m Retirer soigneusement le porte lame magn tique de la chambre d hybridation m D poser rapidement le porte lame dans la chambre de lavage oCheck contenant la solution de lavage l m Fixer la poign e oCheck m Laver la ou les puces PelvoCheck CT NG dans la solution de lavage temp rature ambiante 18 25 C pendant 20 secondes en d pla ant le porte lame de haut en bas Deuxi me tape de lavage m Laver la ou les puces PelvoCheck CT NG dans la solution de lavage Il dans un bain chaud 50 C pendant 30 secondes en d pla ant le porte lame de haut en bas S chage m Retirer imm diatement tout liquide de la
51. langer le m lange r actionnel Recommencer l extraction d ADN et l analyse PelvoCheck CT NG Recommencer l hybridation Recommencer l hybridation Contr ler les performances du thermocycleur et sa programmation tapes de la PCR rampe de chaleur et volume Attention utiliser uniquement les termocycleurs valid s GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems Mode 9600 ou thermocycleur 96 puits Veriti Applied Biosystems Mode 9600 avec PelvoCheck CT NG Peu de cellules ont t pr lev es voire aucune pour des raisons potentielle ment diff rentes urine pas de premier jet recueilli volume d urine recueilli trop important effet de dilution ou l chantillon n a pas t bien m lang avant sa mise en contact avec le milieu de collecte frottis couvillonnage insuffisant ou dur e du contact trop courte entre le dispositif de pr l vement d chantillon et le milieu de collecte avant l extraction d ADN lib ration mer ficace de cellules partir du dispositif de collecte Recommencer le pr l ve ment d chantillon L ADN de l chantillon a t d grad en raison d un stockage incorrect temp rature de transport et de stockage dur e de stockage maximale Recommen cer le pr l vement d chantillon Recommencer l extraction d ADN Veiller bien m langer l chantillon avec de proc der l extraction d ADN Recommencer l analyse PelvoCheck CT NG en commen ant par amplif
52. le domains of the major outer membrane proteins of the 15 Chlamydia 12 Adams E J et al 2004 Chlamydia trachomatis in the United Kingdom a systematic review and analysis of prevalence studies Sexually Transmitted Infections 80 354 362 13 Van Bergen J et al 2005 Prevalence of urogenital Chlamydia trachomatis increases significantly with level of urbanisation and suggests targeted screening approaches results from the first national population based study in the Netherlands Sexually Transmitted Infections 81 17 23 14 Centre europ en de pr vention et de contr le des maladies ECDC Surveillance Report Annual epidemiological report 2011 Stockholm ISBN 978 92 9193 321 1 15 Centre europ en de pr vention et de contr le des maladies ECDC Chlamydia control in Europe June 2009 Stockholm ISBN 978 92 9193 165 1 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 6 2 Utilisation pr vue Le kit PelvoCheck CT NG est un kit de diagnostic kit qui est pr vu pour la d tection qualitative et la diff rentiation de Chlamydia trachomatis CT et Neisseria gonorrhoeae NG dans des chantillons d urine humaine ou des couvillons vaginaux ou cervicaux Il doit tre utilis en association avec les quipements indiqu s et exclusivement par du personnel qualifi Le kit de test n est pas pr vu pour l analyse d autres mat riels d chantillons ou pour l analyse quantitative d une charge de CT et de NG
53. lon a chou Les cons quences sont doubles en fonction du signal des spots sp cifiques aux agents pathog nes Si l chantillon est positif pour CT et ou NG l analyse reste valide Dans ce cas le contr le d chantillon ayant chou est un r sultat direct de la comp tition entre l ADN humain et un exc s d ADN bact rien pendant la PCR Si en revanche l chantillon est n gatif pour CT et NG le logiciel CheckReport indiquera que l analyse a chou en raison d un mauvais pr l vement de l chantillon quantit insuffisante de cellules dans l chantillon et ou d une extraction inefficace de l ADN Dans ce cas il est recommand de recommencer l analyse en commen ant par l extraction d ADN ou au besoin de pr lever un nouvel chantillon voir R solution des probl mes dans le chapitre 9 Contr le de PCR PelvoCheck CT NG surveille aussi la performance de la PCR L amplification d un ADN de contr le interne pr sent dans le PelvoCheck CT NG PCR MasterMix g n re un signal sur les spots de contr le de PCR de la puce PelvoCheck CT NG La qualit de la r action d amplification est galement valu e automatiquement par le logiciel CheckReport Si la performance de la PCR est inf rieure un seuil pr d fini le logiciel CheckReport indique que le contr le PCR a chou failed et l analyse doit tre recommenc e voir R solution des probl mes dans le chapitre 9 Si la quantit d ADN bact rien co
54. m La configuration de la micro puce PelvoCheck CT NG est illustr e dans la Figure 2 et les contr les sur puce sont expliqu s plus en d tail au chapitre 6 4 2 b TESTEN EES 635 nm GI 1 111 Ad A AAA AAA Contr le de PCR Contr le d chantillon canal rouge c 414144141111 4244441111 532 nm 414111111411 1111111111 canal vert Tous les spots dans le canal vert contr le de l impression et de lhomog n it Figure 2 conception de la puce PelvoCheck CT NG a Sch ma de la puce PelvoCheck CT NG avec 12 compartiments ind pendants chacun contenant une micro puce b et c Images des micro puces affich es par le logiciel CheckReport pour deux longueurs d onde d excitation diff rentes utilis es pour la lecture du b canal rouge 635 nm c le canal vert 532 nm et sch mas de la configuration de la puce PelvoCheck CT NG Les sondes sp cifiques aux agents pathog nes et les contr les sur puce sont pr sent s PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 6 4 2 Contr les sur puce La configuration de la puce ADN PelvoCheck CT NG int gre des contr les sur puce complets Plusieurs syst mes de contr le surveillent les tapes cl s du processus et du traitement de la puce y compris la qualit de l chantillon et l efficacit de l extraction d ADN contr le d chantillon la performance de la PCR contr le de PCR l efficacit de l hybridation
55. nner CheckScanner est utilis conjointement avec le logiciel CheckReport pour l analyse finale du test PelvoCheck CT NG Ni l quipement ni les consommables ne doivent tre interchang s entre les diff rentes salles et les diff rents espaces du laboratoire Ainsi une duplication de l quipement et des consommables est n cessaire et doit tre prise en compte lors de l quipement du laboratoire PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 7 3 Avertissements et pr cautions 7 3 1 Pr vention de la contamination Tout au long de la proc dure une blouse doit tre port e et chaque salle du laboratoire doit disposer de ce type de mat riel de protection Il faut porter des gants chaque tape de l analyse et il faut en changer r guli rement notamment pendant l extraction d ADN L espace de travail doit tre d contamin l aide d une solution de nettoyage appropri e Ne jamais toucher l int rieur du bouchon d un microtube Pour viter une contamination crois e n ouvrir qu un seul tube la fois Utiliser des pointes filtre pour micropipettes appropri es quip es d une barri re a rosole sans DNase sans RNase et sans ADN humain Toujours changer les pointes des pipettes entre les transferts de liquides 7 3 2 Instructions pour la manipulation des puces ADN Les puces ADN doivent tre utilis es dans un environnement sans poussi re Le d p t de poussi res et a
56. ntenue dans l chantillon est tr s lev e le signal fluorescent des spots de contr le de PCR peut tre faible voire nul en raison de la comp tition qui s est exerc e pendant la PCR Dans ce cas le signal fluorescent d au moins une sonde sp cifique aux agents pathog nes doit d passer un seuil pr d fini pour que le test soit consid r comme valide Canal vert signaux la longueur d onde de 532 nm Contr le d hybridation PelvoCheck CT NG contr le l efficacit de l hybridation en utilisant une sonde marqu e de fluorescence contenue dans le tampon d hybridation PelvoCheck CT NG qui s hybride en s quences d ADN sp cifiques sur la puce PelvoCheck CT NG Une hybridation suffisante g n re des signaux de fluorescence sur chaque spot de la puce Les r sultats de cinq spots de contr le d hybridation sur la puce PelvoCheck CT NG sont valu s par le logiciel CheckReport pour estimer la performance de la r action d hybridation PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Contr le d impression La qualit du processus d mpression sur la puce PelvoCheck CT NG est surveill e par la pr sence d un signal de fluorescence au niveau de chaque spot de la puce pour garantir la pr sence et lhomog n it de tous les spots Contr le d orientation Les spots de contr le d orientation de la puce PelvoCheck CT NG g n rent des signaux de fluorescence quelle que soit l efficacit du
57. ont r ussi le logiciel CheckReport valuera l analyse du contr le externe de la qualit comme tant valide et positive pour Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrheae Si les contr les qualit sont n cessaires en cours de l analyse des frottis il est recommande d utiliser le milieu de conservation d chantillons d un nouveau kit d couvillonnage PelvoCheck CT NG r f 453 103 Dans le cas de traitement d chantillons d urine il est recommand d utiliser le milieu de conservation d chantillons d un nouveau kit pr analytique PelvoCheck SAFE ou STRAW r f 453 100 et 453 101 dilu 1 3 5 avec de l eau de qualit PCR par ex 80 uL de milieu de conservation d chantillons 200 uL d eau de qualit PCR pour effectuer des contr les positifs avec le contr le AcroMetrix CT NG S il n est pas possible d utiliser le milieu de conservation de l chantillon comme indiqu ci dessus il est possible d utiliser la place de l eau de qualit PCR pour effectuer les contr les de performance sp cifiques L application du contr le AcroMetrix CT NG en tant que syst me de contr le qualit externe est uniquement valid pour le traitement d chantillons individuels PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 8 2 R action en cha ne par polym rase PCR La PCR est une m thode tr s sensible qui permet de d tecter des quantit s d ADN extr mement faibles Des pr
58. our r aliser la r action de PCR du PelvoCheck CT NG sur la puce PelvoCheck CT NG sont illustr es sur la figure 5 voir page 31 m M langer les produits de PCR avant utilisation D gyrer un court instant Si les produits de PCR ont t conserv s 20 C jusqu l hybridation commencer par les d congeler avant de m langer puis proc der comme indiqu ug Passer le tampon d hybridation au vortex avant utilisation D gyrer un court instant ug M langer 30 uL du tampon d hybridation PelvoCheck CT NG dans un microtube propre d une 8 barrettes pour PCR avec 10 uL du produit de PCR soit en passant au vortex soit en pipetant plusieurs fois mg D gyrer un court instant mg Transf rer 30 uL du m lange d hybridation dans chaque puits de la puce en utilisant six canaux d une pipette multicanaux viter la formation de bulles d air Il est recommand de traiter six chantillons en parall le l aide d une multi pipette 8 canaux et de 8 barrettes pour PCR voir la figure 5 page 31 Cela am liore l efficacit et la rapidit de la manipulation ce qui r duit le risque d vaporation Si plusieurs lames doivent tre trait es en m me temps l utilisation d une multi pipette est requise pour atteindre le temps d hybridation qui convient Si possible hybrider les 12 puits d une puce En cas de traitement de moins de 12 chantillons laisser les puits inutilis s vides Ces derniers ne pourront toutefois pas tre utili
59. prima del uso Antes de usar leia as inst ru es Gebruik saanwij zing lezen L s brugsan visningen L s bruk sanvisnin gen f re anv nd ning Przed u yciem przeczyta instrukcj Les bruksan visning f r bruk TTOIV TNV xp on dIQB OTE TIG ON YIEG Kullanma dan nce talimat okuyun PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Catalog Number Katalog nummer Num ro de r f rence N mero de cat lo go Numero catalogo N mero de cat lo go Catalo gusnum mer Katalog nummer Katalog nummer Numer katalo gowy katalog nummer ApIO G Kata you Katalog numaras Manufac turer Hersteller Fabricant Fabri cante Produt tore Fabri cante Fabrikant Producent Tillverkare Producent produsent Fapaywy retici firma In Vitro Diag nostic Me dical Device In Vitro Diagnos tika Medi zinprodukt Dispositif m dical de diag nostic in vitro Producto medicinal de diagn sti ca in vitro Dispositivo medico diagnosti co in vitro Producto medicinal de diagn sti ca in vitro In vitro diag nostisch medisch product In vitro meskdicin doag nose apparat In vitro medicinsk doag nostisk apparatur Diag nostyka in vitro Produkt yw in vitro di agnostisk medisinsk utstyr In vitro layvwoTIK IOTpIK
60. processus d hybridation Le logiciel CheckReport utilise ces spots comme des l ments d orientation pour pouvoir trouver les spots de fa on satisfaisante il s agit l d une condition pr alable l analyse correcte des signaux PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 7 CONDITIONS G N RALES DE TRAVAIL AVEC PELVOCHECK CT NG 7 1 Instructions g n rales Lors de la mise en uvre d une m thode de pointe actuellement utilis e en biologie mol culaire dans un laboratoire les instructions suivantes doivent tre prises en compte afin de garantir une s curit maximale pour les laborantins ainsi que la qualit des r sultats Les techniques de biologie mol culaire notamment l extraction d ADN l amplification et la d tection des produits d amplification doivent tre mises en uvre par un personnel correctement form En outre des conditions de travail nettes et bien structur es sont indispensables pour viter des r sultats erron s tels que ceux dus une d gradation ou une contamination de l ADN par les produits d amplification cette fin il est n cessaire de s parer les zones d extraction d amplification et de d tection comme indiqu au chapitre 7 2 Chaque zone doit tre munie d un quipement de consommables de blouses et de gants s par s Ne jamais transf rer les blouses les gants ou les quipements d une zone distincte l autre 7 2 S paration des salles
61. que de Greiner Bio One comprend des scientifiques exp riment s disposant d un savoir faire pratique et th orique appropri dans le domaine de la biologie mol culaire et des produits oCheck 38 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 11 CARACT RISTIQUES DE PERFORMANCE DE PELVOCHECK CT NG 11 1 Performance analytique de PelvoCheck CT NG 11 1 1 Limite de d tection La probabilit de d tection 95 PD95 du test PelvoCheck CT NG a t d termin e avec des stocks quantifi s d un fournisseur certifi DSMZ Elle a t calcul e partir d chantillons individuels quivalents d urine humaine stabilis e et de frottis Table 4 PelvoCheck CT NG Limite de d tection R capitulatif de la limite de d tection de PelvoCheck CT NG Echantillon d urine individuel chantillon de frottis individuel UFI mL unit formant infection par mL et UFC mL unit formant colonie par mL RE S e et eher GE d 7 S Get A e Ee concerne l chantillon positif vis vis de CT regroup s avec quatre chantillons d une n gatifs vis vis de CT 11 1 2 Sp cificit analytique pour CT et NG La d tection qualitative de nombres d croissants de copies du g nome ADN de CT ou de NG a t effectu e en pr sence de 10 copies r action de l analyte oppos Dans une deuxi me exp rience la d tection qualitative de 10 copies du g nome ADT de CT ou de NG par r action a t
62. rdance positive et n gative ainsi que la concordance totale ont t calcul es voir les tableaux 9 11 Tableau 9 Degr de la performance de diagnostic de PelvoCheck CT NG compar aux m thodes de r f rence pour CT Concordance Concordance en nombre d chantillons Concordance positive Type M thode de r f rence Crit re de qualit Colon Hologic Gen Probe APTIMA Combo 2 1 ensemble de frottis SE 100 00 102 102 Concordance n gative Concordance positive Abbott RealTime CT NG 98 08 51 52 2 ensemble de frottis 100 00 103 103 Concordance n gative PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 Tableau 10 Degr de la performance de diagnostic de PelvoCheck CT NG compar aux m thodes de r f rence pour NG Concordance en Concordance nombre d chantillons Hologic Gen Probe APTIMA SES positive 100 00 49 49 Combo 2 Type M thode de r f rence Crit re de qualit canule 100 00 104 104 Concordance n gative 100 00 102 102 Concordance positive Abbott RealTime CTING 100 00 49149 2 ensemble de frottis 100 00 103 103 Concordance n gative 100 00 102 102 Tableau 11 Concordance totale des r sultats obtenus avec PelvoCheck CT NG et les m thodes de r f rence pour tous les chantillons er ensemble de frottis Hologic Gen Probe Abbott RealTime CT NG x Hologic Gen Probe APTIMA Combo 2 x PelvoCheck CT NG APTIMA Combo 2 x
63. s chage lecture et valuation sis 50 PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 1 COMPOSITION DU KIT Kit de test PelvoCheck CT NG Contenu Quantit 5 PelvoCheck CT NG PCR MasterMix PCR MasterMix 5 x 300 uL S 1 bo te de lames PelvoCheck CT NG Bo te de lames 5 x 12 puces avec 5 puces PelvoCheck CT NG 9 x 12 puces BE 2 PelvoCheck CT NG Tampon d hybridation Tampon d hybridation 2 x 1200 uL Tampon concentr 1 tampon PelvoCheck CT NG 1 x 55 mL concentr Tampon B concentr 1 tampon B PelvoCheck CT NG Sn concentr 1 Un kit de test PelvoCheck CT NG suffit analyser 60 chantillons 2 Contient tous les composants n cessaires pour la PCR sauf la Taq ADN polym rase et l uracil N glycosylase 3 Une puce PelvoCheck CT NG contient 12 micro puces PelvoCheck CT NG PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 2 CONSOMMABLES QUIPEMENT ET MAT RIEL REQUIS Il est recommand d utiliser PelvoCheck CT NG conjointement aux consommables quipements et mat riels r pertori s et de n autoriser qu un personnel qualifi les utiliser Consommables R f Greiner Bio One N Quantit PelvoCheck CT NG 504 002 AGE ee per 60 r actions Kit de pr analytique PelvoCheck SAFE 453 100 50 chantillons Kit de pr analytique PelvoCheck STRAW 453 101 70 chantillons Kit pr analytique PelvoCheck Swab 453 103 60 c
64. s s ult rieurement Manipuler la puce avec soin pour viter de d verser le m lange d hybridation Le d versement peut entra ner une contamination crois e des chantillons et g n rer des faux positifs ug ncuber la puce pendant exactement 30 minutes temp rature ambiante 18 25 C dans la chambre d hybridation pr par e dans une atmosph re sombre et satur e en humidit Veiller ne pas d placer la chambre d hybridation pendant l hybridation Ne jamais modifier le temps d incubation ni la temp rature de la r action d hybridation car cela peut provoquer une perte d intensit du signal de fluorescence ou une hausse de la fluorescence non sp cifique Ne pas exposer les puces hybrid es la lumi re directe du soleil PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 m Pr parer une atmosph re satur e en humidit dans la chambre d hybridation m Incuber la quantit requise de puces PelvoCheck CT NG dans la chambre d hybridation temp rature ambiante 18 25 C voir le chapitre 8 3 1 m M langer 30 uL du tampon d hybridation PelvoCheck CT NG dans un microtube de 0 2 mL d une barrette pour PCR avec 10 uL du produit de PCR Bien m langer Transf rer 30 uL du m lange d hybridation dans chaque puits de la puce PelvoCheck CT NG en utilisant une pipette multicanaux viter la formation de bulles d air Fermer la chambre d hybridation et inc
65. smission sexuelle des agents pathog nes Chlamydia trachomatis CT et Neisseria gonorrhoeae NG Ces organismes sont des bact ries Gram n gatif non motiles Les esp ces de CT sont intracellulaires strictes et incluent quinze s rotypes A B Ba C D E F G H I J K L1 L2 and L3 susceptibles de provoquer des maladies chez l tre humain Les s rotypes D K sont les principaux responsables des infections g nitales Chlamydia chez les hommes et les femmes La d tection PelvoCheck CT NG est fond e sur l amplification d une r gion fortement conserv e du g ne 16S d ARNr Le test peut donc d tecter tous les s rotypes de CT et la variante su doise contenant une d l tion dans le plasmide cryptique de CT Les CT NG remontent du vagin ou du col ut rin jusqu aux organes reproducteurs de la femme Chez les femmes enceintes les infections Chlamydia non trait es peuvent aussi mettre en danger la vie du nouveau n en provoquant une conjonctivite une pneumonie atypique et la c cit du nourrisson La chlamydiose est la MST la plus souvent signal e en Europe Des tudes fond es sur des populations ont trouv une pr valence d infections Chlamydia trachomatis de 1 4 8 en fonction de la tranche d ge Les trois quarts de l ensemble des cas de chlamydiose sont signal s chez les jeunes g s de 15 24 ans M me si les MST et la MIP peuvent tre gu ries leurs effets peuvent tre permanents Ceci montre l
66. t Abbott RealTime CT NG en utilisant le deuxi me ensemble de frottis pr lev s avec le kit d couvillonnage PelvoCheck La pr paration des chantillons a t r alis e pour PelvoCheck CT NG avec le kit d extraction d ADN oCheck et pour Abbott RealTime CT NG avec la machine RealTime m2000 conform ment aux instructions du fabricant L application du kit d couvillonnage PelvoCheck pour l analyse des frottis associ e avec le Abbott RealTime CT NG a t test e pour l tude d valuation de la performance clinique Tous les chantillons test s ont montr la m me performance quel que soit le kit de pr l vement utilis kit d couvillonnage PelvoCheck ou kit de pr l vement d chantillons Abbott multi Collect En raison d une faible pr valence de CT et de NG et d une faible participation de femmes satisfaisant les crit res d finis les frottis cervicaux et vaginaux individuels ayant obtenu un r sultat n gatif vis vis de CT ou de NG avec Hologic Gen Probe APTIMA Combo 2 ont t enrichis avec du mat riel de r f rence CT et NG reproduisant la distribution naturelle dans les frottis cervicaux et vaginaux Pour CT 25 frottis cervicaux et 25 frottis vaginaux et pour NG 46 frottis cervicaux et 44 frottis vaginaux ont t pr par s et analys s avec les trois m thodes Les r sultats obtenus avec PelvoCheck CT NG ont t compar s ceux de Hologic Gen Probe APTIMA Combo 2 et de Abbott RealTime CT NG La conco
67. t possible d liminer les solutions de lavage let II sans pr caution particuli re liminer la puce PelvoCheck CT NG usag e les composants du kit inutilis s et le m lange d hybridation inutilis avec les d chets chimiques du laboratoire Respecter toutes les r glementations nationales et locales relatives l limination PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 6 INTRODUCTION 6 1 Contexte La maladie inflammatoire pelvienne MIP est la complication la plus courante et la plus grave de certaines maladies sexuellement transmissibles MTS Elle consiste en une inflammation de l ut rus des trompes de Fallope et ou des ovaires qui peut voluer pour former des cicatrices avec des adh rences avec les tissus avoisinants Cette maladie peut provoquer des l sions tissulaires aux cons quences graves comme des douleurs pelviennes chroniques la formation d abc s des grossesses extra ut rines et l infertilit Il est difficile d valuer l incidence et la pr valence r elles de la MIP car les cas subcliniques sont facilement ignor s et cette maladie n est pas d claration obligatoire Les donn es provenant de la pratique g n rale en Angleterre et au pays de Galles permettent d valuer une pr valence de la MIP de 1 7 et le CDC a estim que chaque ann e plus de 750 000 femmes aux tats Unis souffrent d un pisode de MIP aigu La plupart des cas de MIP sont provoqu s par une tran
68. ter les conditions d hybridation de PelvoCheck CT NG Temp rature incorrecte des Les tapes de lavages doivent se d rouler la bonne temp rature tape de solutions de lavage lavage 20 25 C et tape de lavage II 50 C V rifier la temp rature des deux solutions de lavage et respecter le bon ordre de la proc dure Temp rature incorrecte du La deuxi me tape de lavage doit tre effectu e 50 C V rifier la temp rature bain marie du bain marie S assurer que la temp rature de l eau est r gl e sur 50 C Au besoin confirmer la temp rature l aide d une thermom tre Mauvaise pr paration du Recommencer la pr paration du m lange d hybridation avec les volumes m lange d hybridation corrects puis hybrider les produits de PCR sur une autre puce PCR CONTROL FAILED chec du contr le de PCR Pas d ajout de HotStarTaq ADN Recommencer l analyse PelvoCheck CT NG en commen ant par la polym rase au MasterMix pr paration de la PCR Ajout de HotStarTaq ADN Recommencer l analyse PelvoCheck CT NG en commen ant par la polym rase ne fonctionnant pr paration de la PCR et en utilisant un nouveau lot d ADN polym rase pas correctement au MasterMix PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 PROBL ME et cause Ajout d uracil N glycosylase non dilu e au MasterMix M lange insuffisant du m lange r actionnel Pr sence d inhibiteurs de PCR
69. tion Lire la ou les puces PelvoCheck CT NG l aide du scanner CheckScanner Effectuer une lecture et une analyse de la mani re indiqu e dans le mode d emploi du logiciel CheckReport Cr er des rapports 3 minutes 500 g 1 minute vitesse maximale WT
70. uber la puce PelvoCheck CT NG pendant exactement 30 minutes temp rature ambiante 18 25 C Figure 5 tapes de travail de la proc dure d hybridation PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 8 3 3 Lavage et s chage L quipement sp cial fourni par Greiner Bio One permet le lavage simultan de quatre puces PelvoCheck CT NGu maximum voir le chapitre 2 L quipement suppl mentaire requis pour traiter les puces PelvoCheck CT NG se compose de deux chambres de lavage oCheck et d une poign e pour le porte lame magn tique de la chambre d hybridation Les diff rentes tapes de travail sont illustr es sur la figure 6 voir page 33 mg Retirer soigneusement le porte lame magn tique contenant les lames hybrid es de la chambre d hybridation ug D poser le porte lame contenant les lames directement dans la chambre de lavage oCheck qui contient la solution de lavage V rifier que le c t magn tique est orient vers le haut ug Fixer la poign e oCheck sur le porte lame et commencer la premi re des trois tapes de lavage m Laver la puce temp rature ambiante 18 25 C dans la solution de lavage I en la d pla ant rapidement de haut en bas pendant 20 secondes Les puces doivent toujours rester recouvertes de solution de lavage m Laver la puce pendant 30 secondes dans la solution de lavage Il 50 C en d pla ant vigoureusement le porte lame de haut en bas v
71. utres particules sur la surface de la puce doit tre vit Ne pas toucher la zone d hybridation situ e la surface de la puce Seul le c t tiquet de la puce est destin l hybridation Ne pas utiliser de marqueurs pour identifier les puces ADN car ils g n rent une fluorescence non sp cifique sur la puce Les puces ADN sont exclusivement usage unique Les puces hybrid es ne peuvent pas tre r utilis es Conserver les puces inutilis es dans leur bo te d origine l int rieur de la poche zipp e fournie qui contient un dessicatif 7 3 3 Pr cautions g n rales Le pr sent kit est exclusivement destin tre utilis des fins de diagnostic in vitro et ne doit tre utilis que par le personnel form aux pratiques de laboratoire de diagnostic in vitro r ception v rifier que les composants du kit ne sont pas endommag s Si l un des composants par exemple les flacons de tampon est endommag contacter le distributeur Greiner Bio One local Ne pas utiliser des composants de kit endommag s faute de quoi les performances du kit pourraient tre r duites Ne pas utiliser le kit de test PelvoCheck CT NG apr s la date de p remption Ne pas utiliser de r actifs p rim s par ex polym rase Uracil N glycosylase Ne pas m langer les r actifs de diff rents lots Utiliser exclusivement les r actifs l quipement fournis avec le kit et ceux recommand s par le fabricant Il est n cessa
72. vitesse de rampe sup rieure peut entra ner une performance insuffisante de la r action de PCR Pour savoir comment les configurer consulter le mode d emploi du thermocycleur correspondant PelvoCheck CT NG Mode d emploi R vision BQ 029 03 D cembre 2014 8 2 2 Traitement par uracil N Glycosylase UNG Le PelvoCheck CT NG PCR MasterMix contient du dUTP qui est int gr dans les produits d amplification pendant la PCR PelvoCheck CT NG les produits de PCR risquent donc d tre d grad s par l UNG L UNG coupe le produit de PCR au niveau des sites o un r sidu de d oxyuridylate a t incorpor Les produits de PCR coup s ne seront pas amplifi s dans la r action suivante Un traitement UNG peut donc aussi tre utilis pour liminer une contamination par recirculation li e aux r actions PCR pr c dentes Le syst me UNG int gr dans la PCR PelvoCheck CT NG n limine que la contamination crois e avec les produits de PCR des PCR pr c dentes Il est impossible d liminer les autres contaminations survenant par exemple pendant la pr paration de l chantillon l extraction d ADN ou l ajout de mod le la r action PCR Il est donc toujours n cessaire de suivre les instructions et les pr cautions particuli res pour viter la contamination d crite au chapitre 7 L uracil N glycosylase ne fait pas partie du kit PelvoCheck CT NG et doit tre achet e s par ment aupr s de Fermentas voir les

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