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1. Non sensible t Sensible T GGCGGGCACT GGCGGCCACT Produit PCR 221bp Produit PCR 221bp Digestion avec l enzyme de restriction Haelll l GGCGGGCACT GGCGG CCACT Fragment 221 bp Fragment 44 bp Fragment 177 bp 4 Pr paration du gel d agarose Le gel d agarose est une matrice pour s parer les mol cules d ADN selon leur taille dans un champ lectrique Les petits fragments migrent plus vite que les grands la concentration d agarose est choisie en fonction de la taille des fragments s parer Ici nous allons utiliser un gel 2 d agarose Peser 1 4 g d agarose et mettez le dans un Erlenmeyer de 250ml Ajouter 70 mi de tampon d lectrophor se TBE 1x Faire bouillir four micro ondes plaque chauffante ou bec bunsen Veillez ce que l agarose ne d borde pas en bouillant L agarose fondu est compl tement transparent Si certains r sidus sont toujours visibles remettre la solution chauffer Laisser refroidir le liquide environ 60 C Ajouter 7 ul de SYBR safe intercalant qui permettra de visualiser l ADN et m langer en agitant l Erlenmeyer Verser l agarose dans la cuve pr par e avec un peigne pour former les puits attention si l agarose est trop chaud la cuve d lectrophor se se d forme Apr s solidification du gel d couper une petite lamelle d agarose en haut et en bas du gel pour lib rer les lectrodes Lorsque le gel est refroidi et solidifi ajouter du tampo2. de d naturation de l ADN 2 me tape l hybridation 40 65 C En descendant la temp rature les amorces s apparient s hybrident par compl mentarit leurs s quences cibles sur l ADN 1 cycle de PCR 3 me tape l longation 72 C A cette temp rature la Taq synth tise les brins d ADN compl mentaires en ajoutant des desoxynucl otides triphosphates la suite des amorces Le temps d longation d pend de la taille du fragment amplifier et de la vitesse de polym risation de l enzyme la Taq ajoute environ 1000 nucl otides par minute Ces trois tapes correspondent 1 cycle de PCR la suite duquel on a doubl le nombre de fragment d ADN cible initial Environ une trentaine de cycle sont en principe effectu s dans une exp rience de PCR classique Ainsi apr s 30 cycles on aura amplifi 2 fois notre ADN cible 1 cycle 2 me cycle D naturation Hybridation Elongation D naturation Y ri g4 v 2 etc jusqu n cycles a 4065 v temps L BiOutils Sch ma de l amplification par PCR A I V4 ADN initial 1 cycle 27 cycle SIDE lt A S TDA 4 s pur per ym Es TW O Hybridation Elongation Protocole PCR sensibilit au PTC L homme est capable de distinguer 5 saveurs fondamentales le sucr le sal l acide lamer et umami glutamate gr ce des r cepteurs situ s au niveau de bourgeons gustatifs Dans les ann
3. CAT ataqace agatctctecegg Locus TAS2R38 sur le chromosome 7 tCOctacgaag tgaccaartrg agcaacagtg CEQYCECCTO agctaccaag OC LOCCLCA EgCttogcCaa C CELQCaEctr acadactgtge ChACCELACE J LLCLECCg accagaaact LOCELCELECE aTCCCOTOgE tctgggcatg aLLCLOCLCOL acacrgrLgcL 5 AGG TTG GCT TGG TTT GCA ATC ATC 3 Caggagrac H ELeatLEt attgigtgert gtgctatoca ccatcatcat CICCEACE ECA J LO gg ECTCE DCACEgECCC tatccatgaa COCECCECOET ggacgercgagc CLOJEQACEC AC LCLCLQEC gcgacaaaat cagcchtcct gggorcagag ga 5 CCT TCG TTT TCT TGG TGA ATT TTT GGG ATG TAG TGA AGA GGC GG 3 221 pb AELCECLOCLE cttcootgaat gErCgCg cte gotctacccac gctatggarcg CLACLECAaad Caggaagatc CEQCOETEgO taacaditaca Croctatcetg CICCLOCCLCO cagcctggag gatatccatoc aggggtgatg gatcoccaggo cagcctga aag A site de restriction Haelll Primer 1 lt I OE 44pb 177 pb Primer 2 BiOutils ANA V BiOutils L EXPERIENCE 7 YAA 1 Extraction d ADN partir de cellules pith liales de la bouche Mettre 500 ul d H2O dans un tube Eppendorf Frotter abondamment l int rieur des joues avec un couvillon coton tige st rile afin d obtenir un maximum de cellules pith liales Tremper l couvillon dans le tube contenant les 500 ul d H 0 Tourner l couvillon et le frotter contre les parois du tube Bien essorer l couvillon en le sortant du tube Centrifuger le tube 2 minutes la vitesse ma
4. a c 2 10c La PCR sensibilit au PTC oF La PCR La technique de polym risation en cha ne en anglais polymerase chain reaction ou PCR permet d amplifier des millions de fois un unique fragment d ADN Cette m thode est devenue un outil pr cieux non seulement pour la recherche en biologie mol culaire mais galement pour le diagnostic m dical la d termination de microorganismes ou encore la criminologie L invention de la PCR revient Kary Mullis dans les ann es 80 Il obtint pour cette d couverte le Prix Nobel de Chimie en 1993 La d couverte d ADN polym rases thermor sistantes la Taq polym rase par exemple isol es de bact ries Thermus aquaticus vivant dans des sources d eau chaude a facilit l utilisation de la PCR et a permis son automatisation Th mes la PCR la structure du g nome humain le g notypage la criminologie l ADN l lectrophor se Une r action de PCR n cessite de l ADN amplifier d nomm template des amorces galement appel s primers des desoxynucl otides triphosphates dATP dCTP dGTP dTTP une ADN polym rase thermor sistante la Taq par exemple du magn sium Mg indispensable au fonctionnement de l ADN polym rase Aa a A Ces 5 ingr dients sont m lang s dans un tube essai et soumis diff rents cycles de temp ratures 1 re tape la d naturation 94 C L ADN template est chauff 94 C Les deux brins de l ADN se s parent On parle
5. agments de 221 177 et 44 bp individu 5 et contr le positif Analyse du g notype e Observez votre g notype et ceux des autres personnes e Calculez la fr quence des g notypes de la classe e Calculez la fr quence des all les de la classe e Calculez la valeur de Hardy Weinberg pour la classe Analyse du ph notype La sensibilit au PTC est un trait g n tique dominant Ainsi les personnes homozygote et h t rozygote devraient d tecter l amertume du produit Pour le v rifier vous allez recevoir deux papiers l un impr gn de PTC et l autre pas Commencez par d poser sur votre langue le papier contr le non impr gn et testez ensuite le papier impr gn de PTC Que constatez vous V rifiez s il y a concordance entre le g notype et le ph notype WY BiOutils Mat riel j e P20 Y 4 e P200 e P1000 e Pointes jaunes st riles e Pointes bleues st riles e Ecouvillons st riles e Solutions NaOH HCI et Tris HCI e Tubes eppendorf 1 5 ml e Machine PCR tubes PCR e Cuves lectrophor se transformateur e Bloc chauffant e Centrifugeuse e Agarose e T BE1x e SYBR Safe e Bouteilles d eau st rile e RedTaq Ready mix e PTC primers mix e DMSO e ADN contr le e Tampon de digestion e Enzyme Haelll e Marqueur d ADN
6. es 30 un chimiste du nom d Arthur Fox est le premier mettre en vidence la diff rence de sensibilit au PTC ph nylthiocarbamide un compos organique amer produit par diverses plantes comme le brocoli Alors qu il venait de synth tiser ce compos l un de ses coll gues s est plaint de l amertume du produit alors que lui ne sentait rien Quelques ann es plus tard une tude men e par Albert Blakeslee a montr que l incapacit sentir le PTC est un trait g n tique r cessif qui varie au sein de la population Les individus sensible peuvent d tecter le PTC all le T et les individus non sensibles ne peuvent pas le d tecter all le t Il existe une trentaine de r cepteurs sensibles aux diff rentes substances am res Identifi en 2003 le g ne TAS2R38 localis sur le chromosome 7 code pour le r cepteur au PTC Le s quen age de ce g ne a permis de mettre en vidence la pr sence d une variation g nique entre les individus sensibles et non sensibles Cette variation se caract rise par une diff rence de 3 nucl otides ou SNPs dans le g ne TAS2R38 en rouge sur la s quence du g ne ci dessous SNP Un SNP Single Nucleotide Polymorphism est une variation dans une s quence d ADN qui arrive lorsqu un seul nucl otide diff re entre les membres d une m me esp ce Ces variations sont tr s fr quentes dans le g nome humain environ 1 1000 Elles repr sentent d ailleurs 90 de l ensemble des variations g n ti
7. istribuer ensuite les 20 ul du m lange dans les petits tubes de PCR pr alablement marqu sur le c t par les initiales des personnes tester Dans votre petit tube ajouter 5 ul de votre solution d ADN Fermer le tube Dans le petit tube PCR destin au cont le n gatif ajouter 5 ul d H 0 la place de l ADN Fermer le tube Dans le petit tube PCR destin au cont le positif ajouter 5 ul d ADN B2B Fermer le tube En suivant les instructions du mode d emploi de la machine PCR mettre les tubes dans la machine et lancer le programme PTC Le programme dure environ 1h30 Il comporte les cycles suivants 94 C 5 minutes 94 C 30 secondes 64 C 45 secondes 30 cycles 72 C 45 secondes 72 C 5 minutes A la fin de la r action de PCR les tubes peuvent tre gard s au cong lateur 20 Arr ter la machine PCR en suivant les indications du mode d emploi ke e 2 3 Digestion du produit PCR e Transf rer 13 ul du produit PCR dans un tube eppendorf Garder le reste du produit PCR au cong lateur il pourra tre utilis comme contr le si n cessaire Ajouter 2 ul du mix de digestion 1x 22 X Tampon digestion 10x 1 5 ul 33 ul Enzyme Haelll 0 5 ul 11 ul Fermer le tube le centrifuger quelques secondes afin de tout faire tomber au fond du tube Placer votre tube eppendorf 37 et laisser dig rer 20 30minutes Ala fin de la digestion les tubes peuvent tre gard s au cong lateur pour la le on suivante
8. n d lectrophor se TBE 1x et enlever le peigne 5 Analyse des g notypes sur gel R cup rer vos tubes Ils contiennent d j le tampon de charge rouge et sont donc pr ts tre mis sur gel Charger le gel 1er puits 5 ul de marqueur 2 me puits et suivants 10 ul de vos chantillons dig r s Avant dernier puits le contr le n gatif Dernier puits le contr le positif W BiOutils Allumer le transformateur et faire migrer 100V amp rage maximum I If Quand le colorant rouge de migration arrive en bas du gel arr ter le transformateur su Laisser refroidir le gel quelques instants Eventuellement en le mettant au frigo L intensit du signal sera ainsi plus forte Prendre le gel et visualiser les bandes sous la lampe bleue Prendre une photo 6 R sultats et discussions Voici un exemple de r sultat Taille enpb M 1 2 3 4 5 6 7 C 500 400 300 200 4 Fragment de 221 pb Fragment de 177 pb 100 s 7 M marqueur de taille Colonnes 1 7 g notypes de 7 individus Les individus 1 3 6 7 sont sensibles au PTC les individus 2 et 4 sont non sensibles au PTC l individu 5 et le contr le positif sont sensibles Homozygote non sensible au PTC 1 fragment de 221 bp individus 2 et 4 Homozygote sensible au PTC 2 fragments de 177 et 44 bp individus 1 3 6 7 Remarque la bande 44 bp n est pas visible H t rozygote sensible au PTC 3 fr
9. ques humaines G ne TAS2R38 individu non sensible au PTC i 61 tal Loi 241 301 361 427 481 541 601 061 124 1041 841 901 961 Primer forward Primer reverse ALOELOACLC AECLOAagEce CLCCogdarg agcatcagce ttecagaagt ALLO aer C ECAL COEL E COCag acc COCCECCCCCA aggortCcaact QOECEQUeC ggaaggqcaca DCCCACALE tatdltocct gtctgtgttg datgecaagt gtraagagccg L gende caacrtegcar cggagtCcCtge tagtgaagag OG CCLECCGE tgagtgaacc aagecaaoor tetetceacac C CLOggEaC gcagacctca ggcagaataa CEGOLECC L cgaggacaar aagcoctcaa CaLECOLOc ggataatggc tgaggagagc accacaagge Les 3 SNPs sont indiqu s en rouge 1 SNP position 145 individu sensible C acide amin pro individu non sensible G acide amin ala geme SNP position 785 individu sensible C acide amin ala individu non sensible T acide amin val 3 SNP position 886 individu sensible G acide amin val individu non sensible A acide amin ile Remarque Le primer forward a t con u de fa on obtenir son extr mit le site de restriction de enzyme Haelll cad 5 GGGC 3 dans le cas d un individu non sensible au PTC et 5 GGCC 3 dans le cas d un individu sensible Chromosome maternel Chromosome paternel CCOCAaCLOorg agtggggttt Jc dldactg gcacggactg actgaaccac CEOQOCETOEL GLECCLOALC CacCtCOLCCCOG GLECACAdgEc aga atctceaat ACCOCECOCO gaaggtctat DECTOLEUCC J CC LACCg AJCLLOLCCE
10. ximum afin de faire tomber les cellules pith liales A l aide de la P1000 enlever le surnageant en prenant soin de laisser le culot de cellules au fond du tube Attention ne pas aspirer le culot de cellules Ajouter 0 1 mI de solution de NaOH 200 mM sur le culot et le resuspendre en vortexant ou en pipetant l aide de la P1000 Fermer le tube et incuber 95 C pendant 10 minutes dans le bloc chauffant Vortexer bri vement Ajouter 0 1 ml de HCI 200 mM dans votre tube Ajouter 0 1 mI Tris HCI pH 8 5 200 mM dans votre tube Votre pr paration d ADN est pr te et peut tre stock e au cong lateur ou utilis e directement pour la suite de l exp rience 2 Amplification par PCR Pr parer le m lange de r actif pour la PCR juste avant l emploi Ce m lange contient le 2 x Taq mix taq polym rases dNTPs tampon de polym risation et tampon de charge rouge les primers et de l H 0 Pour une classe de 16 l ves par exemple on compte 16 r actions plus un contr le n gatif ainsi qu un contr le positif soit un total de 18 r actions Afin de faciliter le pipetage et pour avoir assez de mat riel en cas d erreurs nous pr voyons un m lange pour 22 r actions 1 r action 22 r actions 2 x Taq mix rouge 12 50 ul 275 ul Primers mix 5 00 ul 110 ul DMSO 1 25 ul 27 5 ul H2O 1 25 ul 27 5 ul Ce m lange est pr par dans un tube Eppendorf 1 5 ml juste avant l emploi M langer en pipetant en haut et en bas d licatement D
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