(µbio générale 16-10`.do%2509c)
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1. 8 MORPHOLOGIE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE L aspect de la croissance bact rienne est tr s diff rent en milieu liquide ou sur milieu solide Croissance en milieu liquide A la fin de la phase exponentielle le nombre de bact ries est lev de l ordre de 108 10 cellules par ml de milieu et parfois plus encore L accumulation des cellules peut troubler uniform ment le milieu former des agglom rats un s diment un voile superficiel ou pr senter l une ou l autre combinaison de ces aspects morphologiques incubation Croissance sur milieu solide A la surface des milieux de culture solides les descendants de chaque cellule restent group s et s accumulent en de petites 17 masses visibles l il nu appel es colonies bact riennes Celles ci sont tr s rapproch es au point de former un tapis ou plus ou moins s par es les unes des autres selon le nombre de germes d pos s sur le milieu On notera l aspect des colonies la taille la bordure la surface lisse rugueuse la coloration pigment jaune pour Staphylococcus aureus pigment violet pour Serratia marcescens la pr sence d une h molyse sur g lose sang Les alpha d h molyse Absence d h molyse beta H 18 Exemples d isolement Pr l vement de gorge nombreuses Expectoration nombreuses colonies alpha colonies fs h molytiques g lose au sang h molytiques et muqueuses voquant un frais pneumocoque peti2. TRAVAUX PRATIQUES DE MICROBIOLOGIE GENERALE M P HAYETTE P HUYNEN C MEEX SOMMAIRE PREMIERE S ANCE THEORIE Etude microbiologique d un pr l vement pathologique 1 O N OA O1 RA WQ N B Qu est ce qu une bact rie Les bact ries dans le monde vivant Examen macroscopique d un pr l vement biologique Morphologie des bact ries et levures examen microscopique Milieux de culture et isolement des bact ries et levures Conditions de culture Manipulations bact riologiques de base Morphologie de la croissance bact rienne Classification des bact ries d int r t m dical M thodes d identification C Agents anti bact riens e CMI M thodes par dilution Kirby bauer E test Vitek 2 e CMB D finition Exemple de m thode d identification Streptocoques PREMIERE SEANCE PARTIE PRATIQUE Culture sur diff rents milieux Coloration de Gram Activit s biochimiques Etude de la coagulase du staphylocoque R alisation de galeries d identification R alisation d un antibiogramme DEUXIEME S ANCE PARTIE PRATIQUE o Lecture des galeries d identification o Lecture des antibiogrammes o Lecture des antifongigrammes o Groupage s rologique rapide des Streptocoques DEUXIEME S ANCE PARTIE THEORIQUE S rologie TROISIEME SEANCE a BIOLOGIE MOLECULAIRE b Evaluation des connaissances PREMIERE SEANCE A ETUDE MICROBIOLOGIQUE D UN PRELEVEMENT PATHOLOGIQUE
3. 1 QU EST CE QU UNE BACTERIE Une bact rie est un organisme microscopique g n ralement form d une seule cellule Celle ci se distingue des cellules de la majorit des autres organismes tant unicellulaires que pluricellulaires par son organisation simplifi e les cellules bact riennes sont de type procaryote tandis que celles des autres organismes sont de type eucaryote 2 LES BACTERIES DANS LE MONDE VIVANT Les bact ries sont rencontr es dans le sol l eau chez les plantes les animaux et l homme du moins au niveau des r gions du corps en relation avec l ext rieur peau nez bouche pharynx tube digestif et muqueuses g nitales Les esp ces susceptibles d engendrer des l sions tissulaires et de provoquer des maladies infectieuses int ressent principalement la Microbiologie M dicale 3 EXAMEN MACROSCOPIQUE D UN PRELEVEMENT BIOLOGIQUE Toute infection bact rienne s accompagne outre la pr sence de bact ries de signes biologiques li s l inflammation avec l ventuelle pr sence de leucocytes notamment de polynucl aires Ces l ments peuvent entra ner au del d un seuil une modification visuelle clairement perceptible l oeil nu qui signe une anomalie patente Exemple liquides pathologiques e Trouble urine LCR liquide pleural ou articulaire e H maturique urine LCR liquide pleural ou articulaire Odeur on notera celle caract ristique Consistance Exemple d une s
4. Etest 2 La m thode par diffusion en g lose ou m thode de Kirby Bauer Fond e sur des gradients de concentration c est la m thode manuelle la plus couramment utilis e Elle est fond e sur le fait qu un disque impr gn d antibiotique et d pos sur une g lose nutritive pr alablement inocul e par la suspension bact rienne tester va diffuser suivant un gradient de concentration et que la bact rie ne se d veloppera pas en pr sence de concentrations gales ou sup rieures la concentration minimale inhibitrice Le proc d emploie des disques de 6 millim tres de diam tre dont le papier a t impr gn d un antibiotique concentration connue M thode A partir d une suspension de bact ries on inocule de mani re standardis e une g lose nutritive On d pose ensuite sur cette g lose des disques impr gn s d antibiotique qui va lib rer un gradient progressivement d croissant d antibiotique au fur et mesure de l loignement du disque diffusion centrifuge Apr s incubation et croissance on peut observer une zone circulaire d inhibition autour du disque dont le diam tre sera plus ou moins grand suivant la sensibilit de la souche l antibiotique 23 Une table de concordance entre les diam tres d inhibition et l interpr tation de la sensibilit sensible interm diaire r sistant est alors utilis e afin d interpr ter les r sultats TIC
5. Sur la fiche de r sultats les tests sont s par s par groupe de 3 et une valeur 1 2 ou 4 est indiqu e pour chacun En additionnant l int rieur de chaque groupe les valeurs correspondant des r actions positives on obtient un code num rique ex 7 chiffres pour les galeries API 20E Identification Elle est obtenue l aide du catalogue analytique correspondant la galerie en recherchant le profil num rique dans la liste des profils 2 Identification des levures Les levures sont identifi es sur diff rents crit res e Caract res culturaux d lai de croissance T C optimale aspect macroscopique de la colonie en fonction du milieu de culture e Morphologie cellulaire forme coloration de la paroi pr sence ou absence d une capsule e Structure antig nique d tection des antig nes de paroi par des anticorps monoclonaux exemple le BICHRO LATEX ALBICANS est un test au latex qui permet l identification directe de Candida albicans partir des colonies de levures e Activit s biochimiques production d enzymes 40 Milieux base de substrats chromog nes inclus dans la g lose Ce type de milieux permet a la fois l isolement et l identification exemple le milieu CHROMagar Candida Candida glabrata rose Candida kruzei rose pale Candida albicans vert Candida tropicalis bleu violet Galerie d identification Identification par un ensemble de r actions du m tabolisme
6. celui du bouillon nutritif ordinaire dont la formule est la suivante extrait de viande de b uf 3 g peptone 5 g chlorure sodique 8 g et eau distill e ad 1 000 ml Ce milieu qui couvre les besoins nutritifs d un grand nombre de bact ries d int r t m dical peut tre utilis directement ou servir la pr paration de milieux sp ciaux gt Milieux enrichis Ils sont utilis s pour la culture des esp ces exigeantes sur le plan nutritionnel Ils sont enrichis par l adjonction d extraits d organes c ur ou cervelle de sang cheval ou mouton etc Exemple s lose enrichie au sang de mouton 5 qui permet la croissance de la plupart des bact ries Gram et Gram y compris les plus exigeantes au point de vue nutritionnel g lose au sang 12 gt Milieux s lectifs L incorporation dans un milieu d un produit d termin permet quelquefois la croissance d une ou plusieurs esp ces mais emp che le d veloppement des autres il s agit alors d un milieu s lectif Exemples 1 l association acide nalidixique colimycine CNA inhibe la flore bact rienne Gram n gatif mais est sans effet sur les Gram positif Staphylococcus aureus sur g lose CNA 2 Le milieu de MacConkey renferme des sels biliaires et du crystal violet qui inhibent le d veloppement des bact ries Gram positif mais non celui de nombreux Gram n gatifs dont les ent robact ries et les Pseudomonas Klebsiella p
7. e extraction enzymatique des antig nes une suspension de colonies dans la solution d extraction pronase a t incub e 1 heure 37 C e bien homog n iser les suspensions de latex sensibilis es par des immunoglobulines de lapin sp cifiques de groupes A B C et D e d poser une goutte de latex dans chacun des cercles de la carte de r action e d poser une goutte de solution contenant les antig ne du Streptocoque extraits c t de chaque suspension de latex e m langer soigneusement le contenu de chaque cercle au moyen d un b tonnet ATTENTION changer d embout chaque cercle 44 e donner la carte un l ger mouvement de rotation pendant 2 minutes au maximum e une agr gation visible des particules de latex indique une r action positive Quel est le s rogroupe du Streptocoque que l on vous a distribu Si le s rogroupe obtenu ne vous permet pas d identifier l esp ce en fonction du type d h molyse vous est il possible de pr ciser avec plus d exactitude de quelle esp ce il s agit Si non de quel s test s compl mentaire s auriez vous besoin pour identifier pr cis ment l esp ce du Streptocoque 45 DEUXIEME PARTIE RECHERCHE IMMUNOLOGIQUE D ANTIGENES ET D ANTICORPS Objectifs Conna tre les diff rentes m thodes de diagnostic d une infection La pr sence d une infection virale bact rienne ou parasitaire repose sur la mise en vid
8. et le milieu ambiant O SE Les couvillons qui sont constitu s par une petite boule d ouate ou de dacron fix l extr mit d une tige de bois de m tal ou de plastic sont g n ralement envelopp s dans du papier avant st rilisation Ils servent principalement r aliser le pr l vement des chantillons et l inoculation riche des milieux g los s Inoculation d un milieu g lifi Pour inoculer un milieu solide on recourt des proc d s qui diff rent selon le but poursuivi La m thode des stries permet d obtenir des colonies distinctes partir d un inoculum liquide ou solide Une boucle de fil portant l inoculum est d plac e selon un mouvement de va et vient la surface du milieu Cinq s ries de stries sont habituellement effectu es successivement en prenant soin apr s chaque trac de flamber l oese puis de la laisser refroidir et de faire d buter chaque nouvelle s rie de stries dans le trac de la pr c dente Le w A i 2 T EE mn TAN ee h nf 16 La bo te de P tri est alors mise incuber couvercle dirig vers le bas afin d viter que des gouttes de condensation ne tombent sur la g lose Ce mode op ratoire dilue progressivement l inoculum par appauvrissement m canique de sorte que les colonies pourront tre tr s nombreuses et confluentes au niveau des premi res stries puis de moins en moins serr es et finalement parfaitement isol es
9. interm diaire ou utilisation de l assimilation des sucres auxanogrammes sous forme de galeries type API exemple galerie Api candida ID 32 C Api Candida Api32C 41 e G notypage int r t uniquement en pid miologie e Biologie mol culaire la PCR et le s quen age peuvent tre un recours dans les cas o l identification est r ellement difficile ma s ils ne constituent en aucun cas une technique de routine La combinaison de tous les param tres n est pas toujours n cessaire et l utilisation de telle ou telle m thode varie en fonction des laboratoires 3 Lecture et interpr tation des tests de sensibilit 3 1 Bact ries M thode de Kirby Bauer En pratique il faut mesurer le diam tre de la zone d inhibition pour chaque antibiotique en mm et le comparer aux valeurs de r f rence fixant la sensibilit de l esp ce bact rienne au type d antibiotique examin e Sensible S la souche peut tre atteinte par un traitement dose habituelle par voie g n rale e R sistante R la souche ne pourra probablement pas tre atteinte quel que soit le type de traitement e Interm diaire I la souche peut tre atteinte par un traitement local par une augmentation des doses par voie g n rale ou par une concentration physiologique particuli re urine bile Syst me Etest 42 Apr s la p riode d incubation lire directement la valeur de la CMI corresponda
10. la solution lactescente en agr gats visibles l il nu Ces techniques sont en g n ral moins sp cifiques et moins sensibles que les dosages ELISA 52 Exemples de r action d agglutination en tubes avec des dilutions du s rum ou de LCR Agslutination en tube sur lame s rodiagnostic de Wright pour la brucellose test pour la Syphilis VDRL RPR N patif Autre application identification des esp ces de Streptocoques voir exercice pratique 53 TROISIEME PARTIE BIOLOGIE MOLECULAIRE Objectifs Introduction l application de l amplification g nique la Microbiologie Le principe consiste amplifier un g ne entier ou non avec des amorces sp cifiques PCR qui peut tre ult rieurement r v l par lectrophor se sur gel ou par hybridation hybridation ou encore s quenc et compar avec ceux d pos s dans des banques s quen age nucl otidique Les applications quantitatives deviennent courantes G n ralit s La biologie mol culaire regroupe un ensemble de techniques bas es sur l tude la d tection et la modification des acides nucl iques Le r le du laboratoire de microbiologie m dicale repose sur l isolement et l identification de l agent pathog ne ainsi que l tude de la r sistance aux agents anti bact riens Les m thodes dites traditionnelles comprennent l examen direct la mise en culture et l identification Selon le germe en cause le d lai de r ponse
11. lame en verre Ensuite on ajoute des anticorps coupl s un compos fluorescent dirig s contre l antig ne recherch On proc de ensuite la lecture de la lame au microscope fluorescence Entre autres elle fournit un diagnostic rapide et sensible des infections respiratoires ex RSV Parainfluenza e virus de la grippe et de la rougeole Ces virus infectent les cellules de tout l arbre respiratoire Ainsi des cellules desquam es obtenues par aspirations nasopharyng e sont elles fix es sur des lames de microscope et color es 50 avec des antis rums marqu s la fluoresc ine sp cifiques de chaque virus raison d un anti s rum par lame Immunofluorescence sp cifique du HSV virus Herpes sur un frottis vaginal les cellules infect es pr sentent une fluorescence jaune verte Antig n mie du CMV positive les leucocytes marqu s par l anticorps fluorescence jaune verte contiennent une phosphoprot ine du CMV Le patient greff r nal va b n ficier d un traitement contre le CMV m me s il ne pr sente pas encore de signes cliniques Indications de la recherche d antig nes par immunofluorescence Permettre une prise en charge sp cifique et rapide du patient dans certaines circonstances pr partum Herpes infections respiratoires Grippe Virus Respiratoire Syncytial virus Parainfluenza Ad novirus diarrh es du nourrisson Rotavirus Ad novirus recher
12. optochine L optochine est un compos antiseptique action s lective sur Streptococcus pneumoniae La sensibilit cet antibiotique est un test d orientation permettant de diff rencier les pneumocoques S pneumoniae qui sont sensibles des autres streptocoques 26 Streptococcus pneumoniae 4 Sensibilit la bacitracine Les streptocoques du groupe A S pyogenes se distinguent parmi les streptocoques P h molytiques par leur sensibilit un antibiotique la bacitracine En effet 95 des souches de Streptocoques A sont sensibles la bacitracine alors que seulement 4 des Streptocoques des autres groupes le sont La recherche de la sensibilit la bacitracine en pr sence d un Streptocoque B h molytique constitue ainsi un test d orientation vers S pyogenes 27 Tests permettant de diff rencier les principaux streptocoques d int r t Esp ce H molyse S pyogenes B S agalactiae B S bovis et Variable Ent rocoques Strepto viridans a diverses esp ces S pneumoniae m dical Groupe Optochine s rologique A R sistant B R sistant D R sistant Non groupable R sistant Non groupable Sensible 28 Bacitracine Sensible R sistant R sistant R sistant R sistant L EXERCICE PRATIQUE Identification des bact ries et des champignons pr sents dans un chantillon clinique Bien que la th orie expos e dans ce syllabus ne porte que sur les bact
13. peut prendre plusieurs jours ce qui n est pas le cas avec les techniques de biologie mol culaire comme la polymerase chain reaction PCR qui permettent une r ponse beaucoup plus rapide A R action de polym risation en cha ne PCR La technique de r actions de polym risation en cha ne permet d amplifier sp cifiquement une s quence d finie d ADN en plusieurs millions d exemplaires gr ce des amorces et l action d une ADN polym rase Principe partir d un pr l vement l ADN ou l ARN est extrait La m thode d amplification d ADN consiste tout d abord en la s paration par la chaleur des deux brins d ADN contenant la r gion amplifier L chantillon est 54 alors m lang avec des amorces compl mentaires des s quences nucl otidiques encadrant la r gion amplifier Lorsque l ADN se refroidit les amorces en exc s se fixent leur s quence compl mentaire sur ADN cible puis des nucl otides sont incorpor s s quentiellement par une ADN polym rase thermostable la Taq polym rase deux copies de ADN cible sont alors produites Les brins n o synth tis s servent ensuite eux m mes de matrice pour initier l tape de polym risation du cycle suivant La r p tition des trois tapes d naturation hybridation polym risation aboutit une amplification exponentielle de la s quence cible consid r e titre indicatif une amplification th orique est de 106 fois pour 20 cycl
14. puits Quand chaque groupe a r alis son d p t un l ve moniteur va Compl ter les puits vides avec 10 ul d eau st rile k Brancher le g n rateur et laisser migrer le gel durant 30 minutes Visualisation des r sultats n Retirer le gel d agarose du g n rateur E Placer le gel sur la plaque du trans illuminateur n Recouvrir du verre protecteur Brancher les UV Observer les bandes r sultant de la migration du marqueur de poids mol culaire Le t moin n gatif n engendre aucune bande 61 2 Interpr tation des r sultats d une PCR classique Observation des photos de gel qui vous sont propos es Interpr tation des r sultats pour la PCR Aspergillus et la PCR Plasmodium sp 3 Interpr tation des r sultats d une PCR temps r el Observation des donn es brutes d une PCR temps r el Interpr tation des r sultats pour la PCR cytom galovirus 62
15. sence de l anticorps pr sent dans le s rum On dose ensuite le marqueur une enzyme coupl e au complexe Antig ne Anticorps C est une r action d immuno enzymologie Dans chaque cas se produit une r action color e dont l intensit est proportionnelle la quantit d anticorps pr sent Ce type de dosage existe pour de nombreux virus CMV EBV Influenza pour des parasites Toxoplasma gondii ainsi que pour des bact ries intracellulaires Chlamydia Mycoplasma ou non Borrelia e Formation d un complexe antig ne anticorps anticorps Ac pr sents dans le s rum antig ne Ag adsorb sur un support plastique e D tection du complexe antig ne anticorps par fixation d un anticorps anti immunoglobuline humaine marqu par une enzyme Anticorp e Ajout d un substrat chromog ne qui r agit avec l enzyme et production d une r action color e si l Ac est pr sent dans le s rum ee J 47 tribution de s rums et de gestion des m thodes ELISA pe Exemple d appareils de dis Aspect d une plaque de r action ELISA en fin de manipulation les puits fortement color s correspondent des s rums positifs pour la r action ELISA contenant donc les anticorps recherch s La lecture automatis e des densit s optiques est r alis e sur un spectrophotom tre e Indication o Mise en vidence d anticorps apparaissant au cours d une infectio
16. Ticarcilline PIP Pip racilline FEP C f pime AMC Amoxycilline Ac clavulanique CAZ Ceftazidime PTZ Pip racilline Tazobactam 3 Le syst me Etest Celui ci comprend une bandelette mince et inerte avec un gradient exponentiel d antibiotique sur une face le code de l antibiotique et une chelle de lecture sur l autre face Les bandelettes sont appliqu es sur la surface d une g lose inocul e Apr s la p riode d incubation requise pour que la croissance de la bact rie devienne visible 18 h on peut lire une ellipse d inhibition Au point d intersection de l ellipse et de la bandelette la concentration de l antibiotique test interrompt la croissance de la bact rie et cette valeur correspond la CMI 4 Automate Vitek 2 Antibiogramme automatis A l aide de cartes antibiogramme adapt es chaque type de bact ries VITEK 2 mesure la croissance bact rienne dans un puits de 24 contr le et dans les puits contenant des antibiotiques diff rentes concentrations D termination de la CMI e D finition La plus faible concentration d antibiotique capable d entra ner la mort d au moins 99 99 des bact ries d un inoculum lt 0 01 de survivants e Valeur indicatrice du pouvoir bact ricide d un antibiotique e Sa d termination consiste mesurer les survivants dans les tubes sans croissance visible aux concentrations respectives de 2 4 et 8 mg l dans l
17. a r alisation d un frottis bact rien et fongique partir des diff rentes colonies obtenues sur les diff rents milieux utilis s et leur observation au microscope optique apr s avoir r alis une coloration de Gram confirmeront le type de bact ries ou de champignons contenus dans l chantillon 2 1 Pr paration du frottis D poser 1 goutte d eau st rile sur une lame en verre l aide d une pipette st rile Pr lever une colonie bact rienne ou fongique l aide d une oese st rile et la m langer la goutte d eau Laisser s cher l air ambiant 2 2 R aliser une coloration de Gram Le frottis fix est color pendant 1 minute avec une solution de violet de crystal Il est ensuite rinc sous un filet d eau claire On ajoute une solution iodo iodur e de Lugol agissant comme mordant et le frottis est maintenu dans ce milieu pendant 1 minute Apr s lavage l eau claire on verse goutte goutte sur la lame inclin e un m lange alcool ac tone pendant 20 secondes D s que le solvant s coule clair il faut sans tarder arr ter son action par un grand lavage l eau et bien goutter Le frottis est alors soumis une coloration de contraste en le traitant avec une solution de safranine pendant 30 secondes rinc soigneusement l eau claire et s ch l air libre ou d licatement entre deux feuilles de papier buvard 30 2 3 Observer le
18. bation 35 37 C r v ler les tests n cessitant l addition de r actifs o TDA Tryptophane D Aminase ajouter une goutte de r actif TDA une couleur marron rouge tre indique une r action positive o IND INDole production ajouter une goutte de r actifs Kovacs Une couleur rose diffusant dans toute la cupule indique une r action positive o VP Voges Proskauer production d Ac to ne ajouter une goutte des r actifs VPT et VP2 Attendre au minimum 10 minutes Une couleur rose ou rouge indique une r action positive o noter toutes les r actions spontan es ou induites par l addition de r actifs en se r f rant aux instructions du tableau b Galerie non Ent robact ries API 20NE Apr s incubation 30 C r v ler les tests n cessitant l addition de r actifs o NO r duction des Nitrates ajouter une goutte de r actif NIT 1 et NIT 2 dans la cupule NO e apr s 5 minutes une couleur rouge indique une r action positive 38 e une r action n gative peut tre due la production d azote ajouter 2 3 mg de r actif Zn dans la cupule NO3 une cupule rest e INCOLORE apr s 5 minutes indique une r action POSITIVE o TRP TRYptophane ajouter une goutte de r actifs Kovacs Une couleur rose diffusant dans toute la cupule indique une r action positive o Tests d assimilation observer la croissance bact rienne une cupule trouble indique une r action positive o noter toutes les r ac
19. che d une infection CMV infra clinique chez un patient immunod prim antig n mie pp65 Avantage rapidit d obtention du r sultat 20 minutes 4 heures Limites Manque de sensibilit Un r sultat n gatif n exclut pas le diagnostic Immunofluorescence lecture au microscope fonction de l exp rience de l observateur 51 3 2 D tection d anticorps L antig ne correspondant l anticorps recherch est fix sur une lame en verre On y ajoute le s rum du patient et ensuite un anticorps marqu dirig contre D l anticorps rechercher Si l anticorps recherch est pr sent dans le s rum on observera une fluorescence sp cifique lors de l observation au microscope Legionella pneumophilia les anticorps anti Legionella pr sents dans le s rum se fixent sur des bact ries Legionella coat s sur une lame Apr s ajout d un anticorps marqu la fluoresc ine qui va se fixer sur les anticorps du s rum qui se sont fix s sur les bact ries les bact ries de la lame apparaissent fluorescentes 5 Agglutination de particules de latex Ces techniques sont utilis es pour la recherche d anticorps et d antig nes On utilise de petites particules de latex recouvertes d un antis rum sp cifique d un virus ou d une bact rie Si l antig ne ou l anticorps est pr sent dans l chantillon il se fixe aux particules recouvertes d anticorps dissociant
20. elle lors d infections germes ana robies diarrh ique dans un liquide pleural 4 MORPHOLOGIE DES BACTERIES ET LEVURES EXAMEN MICROSCOPIQUE Les bact ries ont des tailles allant des cellules naines de 0 2 microns ou m me moins des cellules g antes longues de 500 microns mais la plupart ont une dimension comprise entre 1 et 10 microns Elles peuvent le plus souvent tre observ es au microscope ordinaire grossissement de 1000 fois environ sans avoir subi de pr paration particuli re examen l tat frais entre lame et lamelle de bact ries mises en suspension dans un liquide ou apr s coloration Les levures sont des champignons unicellulaires dont la taille varie de 2 20 pm La taille des champignons est donc sup rieure celle des bact ries ce qui permet facilement de les distinguer Les levures peuvent se pr senter sous plusieurs formes Forme ronde ou ovalaire levures et spores Forme pseudofilamenteuse cha nes de levures formant des filaments diff rentes esp ces de Candida Forme filamenteuse formation de vrai mycelium C albicans 4 1 Microscope optique Souvent on ne notera aucune anomalie macroscopique d o la n cessit de rechercher des microorganismes bact ries parasites levures et des l ments cellulaires leucocytes au microscope optique Cet examen est galement utile pour pr ciser la nature des anomalies macroscopiques observ es L e
21. ence de l agent infectieux d antig nes du g nome ou encore sur la mise en vidence d une r ponse s rologique Le diagnostic s rologique se base sur la mise en vidence d une production d anticorps la suite d une infection La r ponse immunitaire se d veloppe apr s un d lai minimum de 8 10 jours Par ailleurs certains tests g n rent des r actions crois es et sont donc moins sp cifiques ex recherche d TgM dans le diagnostic d une Toxoplasmose La sensibilit varie selon le type de technique utilis e Pour le diagnostic d une infection en cours il est important d analyser deux pr l vements cons cutifs 10 15 jours d intervalle pour observer une modification significative du taux d anticorps En phase aigu les IgM apparaissent apr s 7 jours environ et disparaissent rapidement quelques mois les IgG sont d apparition plus tardive apr s quelques semaines et peuvent persister tr s longtemps durant des ann es R ponse s rologique apparition des anticorps Sympt mes p JG temps 46 Pr l vements S rum principalement pr l vements divers respiratoires urines LC Resi Techniques 1 Principe de la r action ELISA enzyme linked immunosorbent assay gt Permet de d tecter des antig nes ou des anticorps et de les quantifier 1 1 D tection des anticorps L antig ne coupl avec un marqueur permettant de l identifier est mis en 2 J 2 2 pr
22. environnement jouent un r le important pour la croissance La concentration en l ments nutritifs du milieu de culture ne peut pas tre trop lev e car beaucoup de bact ries sont inhib es dans un milieu hypertonique La plupart des bact ries d int r t m dical croissent un pH compris entre 6 5 et 7 5 et une temp rature voisine de 35 C Enfin les besoins gazeux sont importants satisfaire Selon les cas la culture devra ou pourra tre r alis e l air libre dans une atmosph re enrichie en gaz carbonique ou dans une enceinte appauvrie en oxyg ne En effet certains germes sont a robies stricts ou ana robies stricts tandis que d autres sont micro a rophiles a robies ana robies facultatifs ana robies a rotol rants ou encore capnophiles Jarre CO 7 MANIPULATIONS BACTERIOLOGIQUES DE BASE Les outils du bact riologiste Le fil droit et la boucle de fil encore appel e anse ou oese sont form s d un fil en nickel chrome d une longueur de 5 8 cm fix un manche m tallique Ces instruments permettent de transf rer des bact ries partir d une colonie ou d un milieu liquide vers une g lose ou un bouillon Ils sont st rilis s par la chaleur 15 imm diatement avant leur utilisation et refroidis en vitant tout contact avec des objets non st riles D s la fin de la manipulation ils doivent nouveau tre st rilis s afin de ne pas contaminer la table de travail
23. es Pour amplifier l ARN une tape pr liminaire de transcription inverse en ADN est indispensable avant la PCR elle est r alis e in vitro gr ce l action d une transcriptase inverse d origine aviaire ou murine ARN transcription inverse ATi ADH d naturation de l AC hybridation des amorces EN sens et anti sens m LL UE 35 45 cycles production exponentielle du fragment encadr parles amorces 55 B PCR classiques Apr s l amplification g nique il est n cessaire de d tecter les acides nucl iques amplifi s Plusieurs techniques sont disponibles fournissant un r sultat qualitatif 1 D tection sur gel d agarose marqueurs de taille Extraction PCR 0 60 cycles LS Electrophor se LE me k CE To 1 E EEN TE a L pr lag polym rase Un appareil de PCR thermocycleur et la r v lation UV d un produit amplifi apr s lectrophor se sur gel Gel d agarose apr s PCR et electrophor se Le gel est photographi sous lumi re UV Les signaux positifs apparaissent sous l aspect de bandes claires nettes fl che Le r sultat n est interpr table que s il existe des t moins positifs la r action a fonctionn et un t moin n gatif il n existe pas de contamination 56 2 D tection par hybridation mol culaire Une fois amplifi l ADN marqu va s hybrider sp cifiquement avec des sondes oligonucl otidiques immobilis es en
24. exemple et comparer semi quantitativement la gamme t moin obtenue au temps 0 par dilution de base 10 100 10 1 01 DD 0 01 0 1 1 100 Num ration de l moculum Num ration apr s dilutions des survivants e Notion importante notamment dans les infections s v res Lorsque la CMI est proche de la CMB un antibiotique peut tre consid r comme bact ricide 25 EXEMPLE DE METHODE D IDENTIFICATION STREPTOCOQUES 1 Les antig nes bact riens de surface La mise en vidence d antig nes bact riens de surface peut contribuer l identification de certaines esp ces bact riennes et peut pr senter un int r t notamment pid miologique Groupes s rologiques La classification de Lancefield permet de subdiviser les streptocoques en 20 groupes par la caract risation immunologique d antig nes de surface habituellement des polysaccharides polyoside C Les s rogroupes A B et D sont les plus importants en m decine Certaines esp ces ne sont pas typables 2 H molyse Sur g lose au sang les colonies peuvent tre entour es d une zone circulaire d h molyse Celle ci est de type P lorsque l h molyse des globules rouges est compl te ce qui entra ne l apparition d une zone incolore et transparente Lorsque l h molyse des globules rouges est partielle on parle d h molyse de type a la zone pr sente alors une coloration verd tre beta alpha 3 Sensibilit l
25. frottis color au microscope 40x puis 100x Les bact ries non d color es par l alcool sont dites Gram positif elles apparaissent en violet tandis que les bact ries Gram n gatif d color es par l alcool et recolor es par le colorant de contraste apparaissent en rose Les levures et filaments myc liens apparaissent Gram positif 3 Activit s biochimiques Recherche d activit enzymatique permettant d orienter le diagnostic R aliser le test ad quat catalase ou cytochome oxydase en fonction du type de bact rie que vous avez en culture coque gram positif ou bacille gram n gatif 3 1 Production de catalase Principe mise en vidence par une production d oxyg ne test positif lorsque la bact rie est mise en contact avec du peroxyde d hydrog ne Utilit du test diff renciation des bact ries de type coque Gram Mode op ratoire le test consiste transf rer au moyen d une oese un fragment de colonie dans une goutte d eau oxyg n e plac e sur une lame de verre la pr sence de catalase donne lieu l apparition de bulles d oxyg ne Interpr tation par exemple les staphylocoques pr sentent une r action positives et sont dits catalase positifs tandis que les streptocoques sont catalase n gatifs CATALASE TEST 3 2 Production de cytochrome oxydase Principe ce test tablit si une bact rie contient un certain type de cytochrome dans sa cha ne re
26. ille ou de levures ainsi que la pr sence ou non de globules rouges et de globules blancs ex s diment urinaire 4 1 2Examen apr s coloration Observer d abord au faible grossissement ensuite passer au 1000x a Pr paration d un frottis Le liquide examiner est pr lev au moyen d une oese ou d un autre instrument et d pos sur une lame de verre propre La suspension est tendue avec la boucle sur une surface d un deux centim tres carr s de fa on obtenir un mince film de cellules suspension faiblement laiteuse et ensuite s ch e Le frottis est alors fix en le passant dans une flamme puis est refroidi b Coloration Coloration simple Le frottis fin est trait par un seul colorant basique bleu de m thyl ne Cette technique est simple et rapide ex diplocoques en grain de caf intracellulaires Coloration de Gram Les bact ries non d color es par l alcool sont dites Gram positif elles apparaissent en violet tandis que les bact ries Gram n gatif d color es par l alcool et recolor es par le colorant de contraste apparaissent en rose Ces deux comportements r sultent d une diff rence fondamentale de composition et de structure de la paroi Contrairement la paroi des bact ries Gram n gatif celle des bact ries Gram positif interpose une barri re emp chant la d coloration par l alcool du cytoplasme qui est le si ge de la r act
27. ince en appuyant l g rement pour faciliter l adh rence les disques peuvent tre diff renci s gr ce l impression sur chacun d eux d un sigle et de la charge incuber la bo te renvers e dans un d lai raisonnable en g n ral pendant 24 48 heures Ensuite lecture et interpr tation des diam tres d inhibition de la croissance bact rienne R sistant Interm diaire Sensible lors de la prochaine s ance de TP B Syst me E test Il faut e pr parer chacune des suspensions bact riennes densit gale au point 0 5 sur l chelle de McFarland dans une solution st rile de NaCl 0 9 36 e ensemencer les milieux Mueller Hinton ordinaire ou enrichi de sang par couvillonnage selon la technique pr conis e dans la m thode de Kirby Bauer e prendre chaque bandelette avec une pince ne toucher que la partie haute indiqu e par le code de l antibiotique appliquer l aide d une pince et incuber Ensuite lecture et interpr tation lors de la prochaine s ance de TP 8 Etude de la sensibilit aux antifongiques Visualisation de fungitest et sensititre au TP2 37 L EXERCICE PRATIQUE SUITE 1 Identification de la bact rie R v lation des caract res d identification Les r actions produites pendant la p riode d incubation se traduisent par des virages color s spontan s ou r v l s par l addition de r actifs a Galerie Ent robact ries API 20E Apr s incu
28. ion Remarque les levures apparaissent galement en violet apr s une coloration de gram Colorations acido alcoolo r sistantes Les colorations acido alcoolo r sistantes utilisent les propri t s particuli res de la paroi des bact ries Ziehl Les bacilles acido alcoolo r sistants BAAR compte tenu de la composition de leur paroi sont d tect s sp cifiquement Il s agit du groupe des mycobact ries dont le bacille tuberculeux Bacille de KOCH BK M thode coloration la fuschine ph niqu e d coloration acido alcoolique contre coloration au bleu Interpr tation les BAAR apparaissent color s en rouge sur un fond bleu 4 2 Microscope fluorescence Il existe deux types de coloration en fluorescence Fluorescence directe le micro organisme est color directement avec un fluorochrome Exemple coloration l auramine l utilisation d un colorant fluorescent l auramine permet de colorer sp cifiquement les mycobact ries qui apparaissent alors fluorescentes Immunofluorescence le micro organisme est color indirectement par l interm diaire d un anticorps coupl un fluorochrome voir plus loin Le fluorochrome absorbe la lumi re ultraviolette et la r met une longueur d onde sup rieure dans la partie visible du spectre La couleur de la lumi re r mise varie selon la nature du fluorochrome utilis Par exemple la fluoresc ine absorbe
29. la lumi re UV la longueur d onde de 495 nm et la r met sous forme d une lumi re visible jaune vert d une longueur d onde de 525 nm 10 4 3 Microscopie fond noir condenseur sp cial Il s agit de rechercher des bact ries trop fines pour tre visibles au microscope optique Cette recherche n est pas d usage courant Exemple diagnostic microscopique de la syphilis recherche de la pr sence de Treponema pallidum sur un pr l vement de s rosit de chancre A La classification la plus simple des bact ries qui repose sur leur morphologie peut se doubler d un crit re de diff renciation fond sur leur comportement apr s coloration par les m thodes de Gram ou de Ziehl Neelsen Cependant pour bien les identifier et les d finir il est indispensable de les cultiver afin de rechercher d autres caract res 5 LES MILIEUX DE CULTURE ET L ISOLEMENT DES BACTERIES ET LEVURES D finition milieux nutritifs pour les bact ries et levures permettant leur croissance Il existe deux formes de milieux liquides et solides A Les milieux synth tiques Ce sont des milieux dont la composition qualitative et quantitative est connue exactement Ils permettent l tude pr cise des besoins nutritifs des bact ries 11 B Les milieux empiriques Ces milieux sont pr par s partir de produits naturels dont on ne conna t pas la composition avec pr cision L exemple le plus simple est
30. lignes parall les sur une bandelette Apr s incubation et r v lation avec un substrat chromog ne les r sultats peuvent tre visuellement interpr t s Tahap 1 C PCR en temps r el Les m thodes de PCR en temps r el mesurent la quantit de mol cules d ADN fabriqu es pendant le d but de la phase exponentielle de la r action de PCR Sch matiquement l ADN fabriqu pendant la PCR est quantifi par incorporation d une mol cule fluorescente ou hybridation de deux sondes sp cifiques mettant une fluorescence Ces thermocycleurs particuliers sont quip s pour la lecture continue en temps r el de la fluorescence mise Fluorescence croissante chantillon positif contenant de FADN de virus m m e T moin n gatif sans ADN de virus 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 Nombre de cycles Seuil de positivit sH D S quen age Apr s PCR il est possible de s quencer le produit amplifi afin d obtenir la s quence nucl otidique de celui ci et d terminer la pr sence ventuelle de mutations HCTX_ FIND 1 850 HCTX_REV 100 951 umplkme tan 460 D n Aan AN AVAN VVA han M MAN A AGC G A A G G AC GAAT t G A E G A A AAGC C A A G G AC GAT TC A E G G G e Indications des m thodes de diagnostic mol culaire Techniques qualitatives montrer la pr sence d un virus ou d une bact rie en particulier lorsque ce
31. n plus ou moins r cente par un virus une bact rie ou un parasite o D termination de l immunit vis vis d un pathog ne o Etudes pid miologiques e Limites Sensibilit moindre chez certains patients nourrissons personnes immunod prim es femmes enceintes Interpr tation parfois d licate 1 2 D tection des antig nes La d tection des antig nes se fait selon une m thode semblable celle reprise ci dessus Mais dans le cas pr sent c est un anticorps et non plus un antig ne 48 coupl avec un marqueur permettant de l identifier qui est utilis pour d tecter l antig ne pr sent dans le s rum 2 Les m thodes de diagnostic rapide des antig nes Exemple Recherche d antig ne soluble de Legionella pneumophila dans les urines Ce test apporte un diagnostic tiologique en cas de pr somption d infection Legionella en parall le avec la culture de pr l vements respiratoires Les avantages de ce test sont pr cocit d s le d but des signes simplicit sur urines rapidit en 15 minutes Principe du test immunochromatographie Un anticorps dirig contre l antig ne recherch dans le liquide biologique est fix sur une bandelette Lors de la migration du liquide le long de la bandelette les antig nes pr sents dans le liquide vont se fixer sur les anticorps de la bandelette donnant lieu une r action color e Ex Recherche d a
32. neumoniae sur g lose Mac Conkey 3 Le milieu Sabouraud antibiotiques Les champignons peuvent pousser sur la plupart des milieux utilis s en bact riologie Mais il existe des milieux dont la composition est sp cifiquement adapt e leurs besoins nutritifs Milieux sp cifiques s lectifs 13 o Sabouraud antibiotiques permet d inhiber la croissance des bact ries o Sabouraud antibiotiques anti moisissures inhibe en plus le d veloppement de certaines moisissures Utilis pour la recherche de dermatophytes gt Milieux d identification Ce sont des milieux qui sont employ s pour la mise en vidence d une activit enzymatique Exemple Le milieu de MacConkey contient du lactose et du rouge neutre qui permet de distinguer les bact ries qui utilisent le lactose car l assimilation du sucre entra ne une acidification colonies roses Remarque le milieu de MacConkey est la fois un milieu s lectif et d identification Exemples de milieux solides coul s en bo te de P tri selon le produit pathologique et la demande e Pus liquides de ponction milieux enrichis au sang frais cuit chocolat et milieux s lectifs e __ Expectoration milieux enrichis au sang frais cuit et milieux s lectifs e Urines milieu polyvalent pour identifier les bact ries gram positif et Gram n gatif CLED Ent robact ries sur g lose CLED 14 6 CONDITIONS DE CULTURE Certaines conditions d
33. nt l intersection des deux ellipses d inhibition V rifier que la sensibilit obtenue l aide des deux m thodes correspondent pour un m me antibiotique 3 2 Levures Lecture d un antifongigramme en milieu liquide Ce sont des tests en microdilution r alis s dans des cupules ou plaques de microtitration Ces tests sont pour certains des r pliques du test de r f rence Exemple Fungitest test deux concentrations utilis pour les levures Il permet de d terminer des zones de sensibilit cf photo 4 ns lt 4 O 99 i Ka Sensititre test 12 concentrations de 7 antifongiques utilis pour les levures Il permet de d terminer des CMI concentration minimale inhibitrice cf photo 43 Sensititre r alis sur une culture de Candida vis vis de 6 antifongiques D monstration de la lecture d un antifongigramme tests commercialis applicable aux levures par technique de microdilution Fungitest et Sensititre Quelle information suppl mentaire vous apporte le Sensititre par rapport au Fungitest 4 Groupage s rologique rapide des streptocoques au moyen de r actifs commercialis s Slidex Strepto kit de bioM rieux Ce groupage est tabli l aide d une r action d agglutination Il va vous permettra d orienter le diagnostic d esp ce du Streptocoque que vous avez en culture La technique comporte les tapes suivantes
34. ntig ne de Legionella dans les urines Autres tests fond s sur le m me principe recherche d antig ne de Plasmodium dans le sang 49 3 Immunofluorescence L immunofluorescence est appliqu e gt la d tection d antig nes pr sent dans les cellules par ex virus Influenza dans les cellules respiratoires virus Herpes dans les cellules cutan es gt la d tection d anticorps Chlamydia Legionella p e circulant dans le s rum 3 1 D tection d antig nes Elle permet de visualiser directement la pr sence d antig nes dans les cellules infect es l aide d un anticorps sp cifique du micro organisme recherch Ces m thodes permettent d obtenir un r sultat en quelques heures La qualit du pr l vement conditionne le r sultat Des antis rums mono ou polyclonaux peuvent tre utilis s pour mettre en vidence les antig nes viraux dans les liquides biologiques partir de cellules desquam es ou encore dans les leucocytes circulants De telles m thodes sont souvent tr s sensibles car elles d tectent les antig nes des fractions virales qui ne sont plus cultivables Elles ont cependant l inconv nient d tre sp cifiques d un seul agent pathog ne c est dire qu il faut un examen s par pour chaque pathog ne test Les tests immunologiques utilis s varient selon la m thode de d tection du complexe antig ne anticorps utilis e Le pr l vement est d abord fix sur une
35. ois minutes Agglutination C albicans Absence d agglutination C non albicans autre esp ce Dans ce cas l tude est compl t e par la r alisation d une galerie de type API 32C qui permet d identifier toutes les esp ces de levures Les galeries 32c et d autres techniques d identification des levures seront d taill es au TP2 35 7 Etude de la sensibilit aux agents antibact riens A M thode de Kirby Bauer La r alisation d un antibiogramme exige des conditions exp rimentales rigoureusement d finies Il faut utiliser un milieu de culture conforme standardis tel le milieu de Mueller Hinton agar ordinaire pour les gram n gatifs ou enrichi de sang pour les gram positifs qui doit tre r parti raison de 25 ml pour la bo te ronde de 90 mm et s ch avant emploi addition ventuelle de 5 de sang de cheval ou de mouton pour assurer la croissance des bact ries exigeantes pr parer une suspension bact rienne dans l eau distill e st rile partir de quelques colonies isol es sur milieu g los de mani re obtenir un trouble peine visible de densit gale au point 0 5 sur l chelle de McFarland tremper un couvillon st rile dans la suspension bact rienne l essorer par rotation contre la paroi du tube et le frotter doucement sur toute la surface du milieu en tournant la bo te trois fois de 60 afin d assurer une bonne distribution de l inoculum R partir le disque la p
36. oplasma gondii Champignons Aspergillus fumigatus D tection quantitative Virus Cytom galovirus Epstein barr virus Les techniques de biologie mol culaire permettent galement de mettre en vidence des g nes de r sistance pr sents chez les micro organismes Exemples D tection de la pr sence de beta lactamases spectre largi chez les ent robact ries par PCR classique suivie d un s quen age du g ne CONCLUSIONS Un aspect encourageant des progr s accomplis est sans conteste l approche mol culaire avec l amplification g nique PCR et le s quen age de certains g nes D autres progr s essentiels sont attendre dans ce domaine en particulier pour les diagnostics directement sur produits pathologiques 60 BIOLOGIE MOLECULAIRE Partie pratique 1 D p ts sur gel d agarose Mat riel n cessaire gt Gel d agarose 2 pr coul gt G n rateur gt Marqueur de poids mol culaire gt T moin n gatif Mode op ratoire Cette manipulation sera r alis e par un l ve moniteur Brancher le g n rateur m Fixer le gel sur le g n rateur m Faire un pr run du gel m Retirer le peigne prot geant les puits z D poser 10 ul d eau st rile dans tous les puits La suite des manipulations sera r alis e par un repr sentant de chaque groupe s D poser 10 ul de marqueur de poids mol culaire dans un premier puits et 10 ul de t moin n gatif dans un second
37. res pures Les pr l vements pathologiques peuvent contenir diff rents micro organismes qu il faudra isoler avant d en effectuer l identification La m thode des stries permettant d obtenir des colonies distinctes partir d un inoculum liquide ou solide il sera d s lors tr s facile de pr lever une seule colonie de chaque type pour proc der l identification L identification de la majorit des bact ries habituellement rencontr es est alors pr cis e dans un d lai de 24 48 h e A l aide de tests d orientation rapide oxydase catalase voir exercice pratique 20 e Par ensemencement d une galerie biochimique adapt e Identification par un ensemble de r actions du m tabolisme interm diaire l aide de galeries de caract res e Recherches compl mentaires il peut tre n cessaire de d terminer les propri t s antig niques par des r actions d agglutination sur lame l aide d immun s rums streptocoques e Jl existe des automates qui r alisent des identifications o Vitek 2 Identification partir d une culture pure en 5 15h Identification automatis e par tests colorim triques bas s sur les caract res biochimiques du micro organisme 21 o MALDI TOF Identification partir d une culture pure en 10 minutes Identification par spectrom trie de masse onisation du micro organisme par un laser s paration des ions obtenus en fonction de leur masse e
38. ries vous observerez galement sur les bo tes de P tri qui vous seront distribu es des colonies de levures et de champignons filamenteux dont la th orie vous aura t pr sent e en cours car cela correspond davantage la r alit des chantillons cliniques 1 Culture sur diff rents milieux G lose au sang Avantage de ce milieu permet la croissance de la plupart des bact ries Gram et m me des plus exigeantes au point de vue nutritionnel Inconv nient de ce milieu si plusieurs types de bact ries sont pr sents dans l chantillon il sera impossible d obtenir une culture pure pour poursuivre l identification G lose MacConkey Permet d obtenir la croissance des Gram uniquement inhibition des Gram Permet de distinguer les colonies utilisant le lactose roses de celles qui ne l utilisent pas transparentes G lose acide nalidixique colimycine Permet d obtenir la croissance des Gram uniquement inhibition des Gram G lose sabouraud chloramph nicol gentamicine Permet la croissance s lective des levures et des champignons filamenteux Les bact ries sont inhib es 1 1 Observer l aspect des colonies forme taille couleur 29 1 2 L utilisation de ces 4 milieux permet de pr ciser si l chantillon contient uniquement des bact ries Gram ou Gram ou un m lange des deux ou si l chantillon contient des levures 2 Examen direct des colonies apr s coloration de Gram L
39. spiratoire L oxydation de substrat chromog ne comme la 31 t tram thyl p ph nyl nediamine entra ne l apparition d une couleur violette intense Utilit du test identification ph notypique selon la production d enzyme diff renciation des bacilles Gram Mode op ratoire on utilise une bandelette de papier impr gn e du r actif le N dim thyl paraph nyl ne diamine sur laquelle un fragment de colonie est tal au moyen d une oese Les esp ces contenant l oxydase donnent en 30 secondes au maximum une r action positive de coloration violette Interpr tation certaines bact ries non fermentantes comme le Pseudomonas aeruginosa ou bacille pyocyanique sont cytochrome oxydase positive tandis que les Ent robact ries ne r agissent pas cytochrome oxydase n gative Des tapes r alis es pr c demment observation des milieux de culture lecture du frottis bact rien apr s coloration r alisation des tests oxydase O cytochrome oxydase vous connaissez le type de bact rie en pr sence soit Staphylocoque Soit Streptocoque Soit ent robact rie Soit bacille gram n gatif non fermentant Soit levure se Culture Examen direct coloration de Gram Staph Dor Dor Autre Autre Staph Galeries Non r alis e 33 4 Identification des Staphylocoques coagulase Ce test mettant en vidence l aptitude des bact ries coaguler le plasma e
40. st le principal test caract risant S aureus Il permet donc de diff rencier le Staphylocoque dor des Staphylocoques coagulase n gative Le test de d tection consiste incuber pendant 4 heures 37 C un m lange de plasma de lapin et de la souche tester L apparition d un caillot est observ e en inclinant le tube 90 C En pratique la d tection de la coagulase est obtenue par un test d agglutination Plusieurs tests d agglutination d tectant un ou plusieurs antig nes ou r cepteurs de surface r cepteur pour le fibrinog ne prot ineA antig nes capsulaires sont commercialis s Le test de la coagulase permet l identification de 99 des souches de S aureus mais certaines souches ne produisent pas de coagulase L identification de l esp ce est dans ce cas r alis e par d autres tests r aliser un test de coagulase sur les deux souches de Staphylocoques 5 Identification des bact ries au moyen de galerie de caract res Il est possible d identifier les bact ries selon des caract res biochimiques li s la production d enzymes sp cifiques de l esp ce Le syst me APT consiste en une galerie d identification comportant un certain nombre de tests biochimiques standardis s et miniaturis s Il existe diff rents types de galeries miniaturis es adapt s chacun un groupe de bact ries pr alablement d fini par exemple les 34 ent robact ries streptocoques les staphylocoq
41. t charge Obtention d un spectre de masse dont les pics correspondent des prot ines sp cifiques de chaque micro organisme Comparaison du spectre obtenu avec les spectres pr sents dans la librairie de spectres et identification du micro organisme 600 700 800 900 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3900 4200 4500 4800 Mass m z C LES AGENTS ANTIBACTERIENS Les agents antibact riens peuvent tre bact ricides ou bact riostatiques Chaque agent peut tre caract ris par un spectre d activit plus ou moins large selon le nombre d esp ces bact riennes Certaines bact ries sont naturellement sensibles ou r sistantes aux antibiotiques Il existe deux types de r sistance les r sistances naturelles les r sistances acquises par mutation ou par acquisition d un g ne de r sistance C est pourquoi il s av re utile d valuer in vitro la sensibilit d une bact rie isol e dans un pr l vement pathologique certains antibiotiques Il existe plusieurs m thodes D termination de la concentration minimale inhibitrice CMI 22 1 La m thode par dilution Elle permet de d terminer la plus petite concentration exprim e en microgrammes ml capable d inhiber la croissance de la bact rie consid r e concentration minimale inhibitrice ou CMI Cette m thode de r f rence est une technique lourde qui tend tre supplant e par le syst me
42. tes et brillantes voquant une souche de Haemophilus influenzae g lose au sang cuit ou g lose chocolat Urine nombreuses colonies de deux Urine colonies de plusieurs types diff rents types d ent robact ries colonies muqueuses et colonies irr guli res 19 B CLASSIFICATION DES BACTERIES D INTERET MEDICAL Les principaux groupes de bact ries d int r t m dical peuvent d j tre d finis sur base de quelques caract res seulement morphologie affinit s tinctoriales pr sence de spores mobilit croissance en a robiose et ou en ana robiose production de catalase test de la cytochrome oxydase utilisation du glucose par oxydation et ou par fermentation La recherche d autres propri t s bact riennes principalement la capacit de produire des enzymes et de m taboliser des substrats divers permet de poursuivre l identification de pr ciser le nom d esp ce et m me parfois de distinguer certaines particularit s au sein de l esp ce A cette fin on peut avoir recours des m thodes conventionnelles exemple mise en vidence de l utilisation d un sucre par incorporation de ce sucre et d un indicateur de pH dans un milieu de culture On peut aussi utiliser des syst mes commercialis s pr ts l emploi Par exemple bioM rieux s a Marcy l Etoile France proposent diff rents types de galeries miniaturis es adapt s chacun un groupe de bact ries pr alablement d fini Les cultu
43. tions spontan es ou induites par l addition de r actifs en se r f rant aux instructions du tableau c Galerie Streptocoques APT 20 STREP Apr s incubation 35 37 C r v ler les tests n cessitant l addition de r actifs o VP Voges Proskauer production d Ac to ne ajouter une goutte de r actif VP 1 et VP 2 o HIP Acide HIPpurique ajouter 2 gouttes de NIN o De PYRA PYRolidonyl Arylamidase LAP Leucine Amino Peptidase ajouter une goutte de ZYM A et ZYM B Attendre 10 minutes puis lire toutes les r actions en se r f rant au tableau de lecture d Galerie Staphylocoques ID 32 STAPH Apr s incubation 35 37 C r v ler les tests n cessitant l addition de r actifs o NIT ajouter une goutte de r actif NIT 1 et NIT 2 o VP ajouter une goutte de r actif VP 1 et VP 2 o De BGAL PyrA ajouter une goutte de FB Attendre de 5 10 minutes puis lire toutes les r actions en se r f rant au tableau de lecture La lecture de ces r actions se fait l aide du tableau de lecture 39 Exemple fermentation des sucres la bact rie ensemenc e dans la galerie ci dessous fermente le glucose GLU se traduisant par une r action positive en jaune mais ne fermente pas le xylitose XLT se traduisant par une r action n gative en rouge ee a 2 ar F i i l a CHLL FPELI kihi LEA LAC A TE Ft AE MT REE i e Identification D termination du profil num rique
44. ues les bacilles Gram non ent robact ries et non fastidieux etc Ces galeries permettent ainsi l identification ph notypique des bact ries en associant les diff rents caract res biochimiques Lors des TP vous avez le choix entre 4 types de galeries d identification Vous devez choisir la galerie qui vous permettra d identifier pr cis ment la bact rie galerie pour l identification des Streptocoques galerie pour l identification des Staphylocoques galerie pour l identification des Ent robact ries galerie pour l identification de B non fermentants M thode la galerie comporte des microtubes contenant des substrats d shydrat s Inoculer ces microtubes avec une suspension bact rienne en respectant scrupuleusement le mode d emploi qui vous est fourni lors des TP Incuber les galeries l tuve 37 C pendant 24 48 h selon le type de galerie R v lation de la galerie lors de la 2e s ance de TP voir plus loin 6 Identification des levures Levures agglutination des antig nes de Candida albicans esp ce la plus fr quemment isol e dans les levures d int r t m dical D poser une goutte de diluant sur une lame puis r aliser une suspension avec une fraction d une colonie pr lev e l se puis d poser le latex sensibilis avec des anticorps monoclonaux sp cifiques de l esp ce C albicans sur la suspension Appliquer un mouvement de rotation la suspension pendant deux tr
45. ux ci ne sont pas cultivables HVC ou que le liquide biologique se pr te mal la culture LCR Techniques quantitatives suivi des patients sous traitement anti viral HIV HVC CMV HVB S quen age d tection de mutations nucl otidiques associ es la r sistance aux anti viraux HIV HVB caract ristiques des g notypes des virus HVC HVB e Int r ts o Sensibilit remarquable o Automatisation possible o Gain de temps important notamment pour l identification des mycobact ries partir de la culture 58 Nb bact ries M thode 10 Microscope Antig ne Amplification Culture e Limites Risques de contamination pour les techniques de PCR Absence de preuve du caract re infectieux du virus d tect Caract risation ph notypique de la souche impossible Co t encore relativement lev La simplicit et la rapidit d ex cution de la plupart de ces techniques justifient une utilisation de plus en plus routini re dans les laboratoires de biologie e Applications au laboratoire de Microbiologie M dicale Les techniques de biologie mol culaire permettent de mettre en vidence la plupart des bact ries des virus parasites ou champignons Exemples D tection qualitative Bact ries Mycobacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis 59 Virus Enterovirus Herpes simplex Influenza A Parasites Plasmodium falciparum Tox
46. xamen microscopique permet de distinguer diff rents types morphologiques des bact ries Forme sph rique La forme sph rique caract rise les coques ou cocci Ces bact ries se subdivisent elles m mes en e diplocoques cellules dispos es par paires et pr sentant parfois un aspect effil ou r niforme plus ou moins accentu e streptocoques cellules dispos es en cha nettes e t trades groupement de 4 cellules en carr sur un m me plan e _sarcines cubes r guliers de 8 cellules ou de multiples de 8 e staphylocoques cellules r unies en amas irr guliers ou grappes Forme cylindrique en b tonnet On distingue deux types e bacilles b tonnets droits avec extr mit s arrondies carr es effil es fusiformes ou pr sentant un renflement un ou aux deux p les e vibrions b tonnets en forme de croissant ou de faucille Forme h lico dale ou spiral e Ces bact ries qui ont l aspect de filaments spiral s peuvent tre diff renci es par leur longueur le nombre et l amplitude de leurs ondulations Forme ramifi e Certaines bact ries comme les actinomyc tes peuvent pr senter des ramifications 4 1 1 Examen l tat frais Sans avoir subi de coloration particuli re une pr paration est obtenue avec le d p t d une goutte du liquide biologique entre lame et lamelle puis on observe au microscope la pr sence ventuelle de bact ries coque diplocoque coccobacille bac
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