PakAuto coffret
Contents
1. PR CAUTIONS Ne pas utiliser de r actifs qui sont turbides ou contamin s Prendre des pr cautions pour viter la contamination du tampon pour chantillon et du conjugu Une contamination involontaire de ces r actifs avec du s rum humain ou du plasma entra nera la neutralisation du conjugu et ainsi l chec du test Ne pas utiliser de r actifs au del de la date de p remption Les micropuits et les r actifs inclus dans ce coffret ne doivent pas tre utilis s conjointement avec aucun autre ensemble de test La substitution de composantes autres que ceux fournies dans ce coffret peut entra ner des r sultats incoh rents ou erron s Apr s chaque essai jeter l exc dent du conjugu dilu du s rum contr le positif dilu du s rum contr le n gatif dilu et du r actif PNPP reconstitu et dilu Lors de la pr paration des dilutions pipetter selon les instructions du fabricant afin d assurer des techniques de distribution et de rin age appropri es La r action entre l enzyme et le substrat se produisant lors de l incubation finale est sensible la temp rature et la lumi re et doit tre ex cut e dans un environnement contr l 22 25 l abri de la lumi re AVERTISSEMENTS Tous les s rums d origine humaine utilis s dans les contr les n gatifs et positifs ont t test s et trouv s n gatifs concernant les anticorps anti VIH 1 2 l h patite et l antig ne HBs Cependant aucune m tho2. Les fioles peuvent contenir une quantit de r actif plus grande que celle indiqu e sur l tiquette Bien mesurer le r actif avec un instrument appropri pour pr parer les dilutions 6 2 x 8 bandes de micropuits 1 x 50 ml solution de lavage concentr e 10X 1 x 14 ml tampon pour chantillon 1 x 14 ml tampon de substrat 1 x 14 ml solution d arr t 1 x 80 ul conjugu anti IgG A M humain 1 x 50 ml solution de pr servation et resuspension cellulaire 1 x 2 5 ml solution tampon 1 x 2 5 ml solution d lution 10 3 x 50 mg substrat PNPP 11 1 x 0 3 ml s rum contr le positif 12 1 x 0 7 ml s rum contr le n gatif 13 1 contr le de plaquettes positives 14 1 contr le de plaquettes normales 15 6 scellants pour plaques DL 9 0 R Mat riel N cessaire non Fourni Tubes essai pour chantillons de patients dilution des contr les et dilution des r actifs Pipettes de transfert Micropipettes ajustables pour distribuer 10 100 ul et 100 1000 ul avec des embouts jetables Chronom tre Lecteur de microplaque capable de mesurer des densit s optiques de 405 410 et 490 nm Eau d ionis e ou distill e Serviettes de papier absorbant Instrument pour laver les microplaques Centrifugeuse capable de s parer le s rum ou le plasma des chantillons de patients 10 Incubateur ou bain marie 37 C 11 Tubes pour microcentrifugeuse 12 Microcentrifugeuse pour pr parer les culots de plaquettes 13 P
3. JG Powers Carter CJ Prospective Study of the Usefulness of the Measurement of Platelet Associated IgG for the Diagnosis of Ideopathic Thrombocytopenia Purpura Blood 1982 60 No 4 1050 SR 2008 Immucor GTI Diagnostics Inc 20925 Crossroads Circle Waukesha WI 53186 USA McMillan R et al Platelet associated and Plasma Anti Glycoprotein Autoantibodies in Chronic ITP Blood 1987 70 No 4 1040 American Association of Blood Banks Blood FAQ www aabb org resources bct Pages bloodfaq aspx September 12 2013 Canadian Blood Services Clinical Guide to Transfusion 2 Blood Components www transfusion medicine ca March 2013 0 Roback John D Combs Martha Rae Grossman Brenda J Hillyer Christopher D Technical Manual AABB Sixteenth Edition Immucor Medizinische Diagnostik GmbH Adam Opel Strasse 26A Rodermark 63322 Germany US and International Contact Information Technical Support wWww immucor com waukeshatechsupport immucor com 1996 2014 Immucor GTI Diagnostics Inc 303467 IFUFR Rev F 2015 05 15 Warning Attention Danger Danger H302 Nocif en cas d ingestion H318 Provoque des l sions oculaires graves H412 Nocif pour les organismes aquatiques entra ne des effets n fastes long terme EUHO32 Au contact d un acide d gage un gaz tr s toxique P264 Se laver les mains soigneusement apr s manipulation P270 Ne pas manger bo
4. connus pour poss der des auto anticorps r actifs avec les glycoprot ines identifi es sur le tableau de r sultats inclus ainsi que des chantillons connus pour ne pas poss der ces m mes anticorps valuation de la Performance M thode Comparative Positif N gatif Total coffret PE PakAuto Positif 24 1 25 N gatif 23 49 72 Total 47 50 97 Concordance 75 3 Co positivit 51 1 Co n gativit 98 M thode Comparative PAIgG IgG associ s aux plaquettes Cytom trie en flux PAIgG un coefficient de pr vision d un test positif faible PakAuto coffret 8 303467 IFUFR REV F 5 1 George JN El Harake Raskob GE N Engl J Med 331 1207 1994 2 George JN El Harake MA Aster RH Thrombocytopenia due to enhanced platelet destruction by immunologic mechanisms In Williams Hematology E et al eds 5 McGraw Hill 1995 1315 3 Bussel JP Schreiber AD Immune thrombocytopenic purpura In Hematology Basic Principles and Practice R Hoffman et al eds Churchill Livingstone Inc New York 1991 p 1485 4 McMillan R Imback Immune thrombocytopenic purpura In Thrombosis and Hemorrhage J Loscalzo and Al Schafer eds Blackwell Scientific Publications Oxford 1994 p 575 5 Aster RH The immunologic thrombocytopenias In Platelet Immunology TJ Kunicki JN George eds Lipincott Philadelphia 1989 p 387 Kelton
5. langer PakAuto coffret 6 303467 IFUFR REV F 15 TAPES DE LAVAGE Aspirer ou d canter le contenu de chaque puits et presser sur de tissu ponge absorbant b Ajouter 300 de solution de lavage de travail d canter d R p ter les tapes b et c pour un total de 3 4 lavages e Apr s le dernier lavage d canter vigoureusement pour enlever toute solution de lavage r siduelle Retourner sur un tissu ponge absorbant pour viter l ass chement NOTE Il est important d enlever compl tement toute la solution de lavage apr s le dernier lavage 16 Ajouter 50 ul de conjugu dilu pr alablement pr par chaque puits SAUF aux puits d sign s VIERGES 17 Sceller les micropuits avec un scellant pour plaques et incuber 30 35 minutes 37 C au bain marie Si un incubateur sec est utilis au lieu du bain marie augmenter le temps d incubation de 10 minutes 18 Dissoudre le substrat PNPP en ajoutant 0 5 d eau d ionis e ou distill e la fiole Remettre le bouchon et bien m langer Prot ger de la lumi re jusqu utilisation 19 Diluer le PNPP 1 dans 100 dans le tampon de substrat Bandes 2 2x8 6 2x8 PN 40 ul 120 pi SB 4 0 ml 12 0 Bien m langer Prot ger de la lumi re jusqu utilisation 20 TAPES DE LAVAGE Aspirer ou d canter le contenu de chaque puits et presser sur de tissu ponge absorbant b Ajouter 300 de solution de la
6. Auto coffret 1 303467 REV F UTILISATIONS PR VUES PakAuto coffret est un essai qualitatif par la m thode LISA enzyme linked immunosorbent assay en phase solide con u pour d tecter les auto anticorps plaquettaires lu s de plaquettes de patients ou en circulation dans le s rum ou le plasma de patients SOMMAIRE ET EXPLICATION Le purpura thrombocytop nique autoimmun est une des causes les plus communes de thrombocytop nie autoimmune Environ la moiti des cas de PTAI se produisent en association avec d autres tats tels que lymphome lupus ryth mateux diss min et infection au VIH les autres cas tant consid r s comme des cas idiopathiques D apr s les vidences cliniques le PTAI se classe deux cat gories le PTAI un trouble de l enfance habituellement limit cette seule condition et le chronique se produisant chez les adultes et qui diminue rarement de fa on spontan e La plupart des anticorps associ s au PTAI reconnaissent des glycoprot ines des membranes de plaquettes tout sp cialement les prot ines GPIb IX et GPla lla Des anticorps circulants r actifs avec ces prot ines peuvent souvent tre d tect s dans le plasma ou le s rum des patients atteints de PTAI 5 est cependant pr f rable pour confirmer l autor activit de caract riser des immunoglobulines associ es aux plaquettes pr par es partir d un plasma riche en p
7. MODE D EMPLOI IMMUCOR REF PakAuto 8 C 2 C TABLE DE MATI RES UTILISATIONS PR VUES ann mana annees Annie eme ni REIN 2 SOMMAIRE ET EXP A T O aea a lee terne tale 2 PRINGIPE A ERE E E AA A E 2 COMPOSITION DU 2 PR CAUTIONS dansent nine Eri 3 AVERTISSEMENTS en en un 3 CHANTILLONS a a A 3 MODE OP RATOIRE 2 2 e ara e aee aa eaaa ae rE a aeaee PEA AE aea e ee Ted ieia Ea Ees Eea Aaea dures 4 WNE E EE E E E 4 Mat riel N cessaire FOUMI i inensis seenen eroe ee ee e a a a ar 4 Proc dure A E AEE TATTI ET 4 CONTROLE QUALIT een entre ant eaaa ians 7 INTERPR TATION DES R SULTATS 8 LIMITES LA TECHNIQUE nemand eines 8 PERFORMANCES SP CIFIQUES nine nee en 8 R F RENCES AE 9 Pak
8. atient n indique pas n cessairement la pr sence d un auto anticorps Les allo anticorps sp cifiques de plaquettes peuvent aussi tre r actifs dans ce test coffret PakAuto est con u pour d tecter les auto anticorps r actifs avec les glycoprot ines de plaquettes llb Illa Ib IX et la Ila Les auto anticorps dirig s contre d autres prot ines plaquettaires ne sont pas suppos s r agir dans ce test est possible qu un auto anticorps donne un faux r sultat n gatif cause de l obstacle st rique des auto anticorps humains cr par les anticorps monoclonaux de souris utilis s pour isoler les glycoprot ines plaquettaires Le PakAuto est con u pour tre utilis comme test de d pistage Il ne faut pas se baser que sur les mod les de r actions produits par ce test sur l chantillon analyser pour identifier un anticorps plaquettaire C est pourquoi les r sultats positifs ou n gatifs obtenus en utilisant cet essai doivent tre utilis s en conjonction avec les signes cliniques et d autres tests s rologiques PERFORMANCES SP CIFIQUES Lorsque bien entrepos et utilis selon le mode op ratoire d crit ci dessus ce produit peut d tecter les auto anticorps dirig s contre les glycoprot ines plaquettaires comme d fini dans la feuille d enregistrement Recording Sheet Afin d assurer une r activit et une sp cificit ad quates chaque lot de PakAuto est test avant la mise en vente avec des chantillons
9. de ne peut offrir une totale assurance de l absence de ces virus ou autres agents infectieux Par cons quent ces mat riaux doivent tre manipul s comme des produits potentiellement infectieux Certains r actifs fournis dans ce coffret contiennent l azide de sodium comme agent de conservation MISE EN GARDE L azide de sodium r agit avec le plomb et le cuivre de la plomberie pour former des m taux azides hautement explosifs Lorsque jet dans il est recommand de rincer avec beaucoup d eau pour viter la concentration d azide L azide de sodium est un poison toxique si ing r Jeter tous les composants de la trousse selon les r glements locaux CHANTILLONS S rum ou plasma pauvre en plaquettes Pour la d tection des auto anticorps circulants Le sang doit tre pr lev par une technique aseptique sur tube EDTA ou sur tube sec Il doit tre test alors qu il est encore frais Le s ru m ou le plasma pauvre en plaquettes qui ne peut tre test imm diatement doit tre conserv entre 2 et 8 C maximum 48 heures ou tre congel Les chantillons congel s 20 C ou moins se conservent bien pendant 2 ans PakAuto coffret 3 303467 IFUFR REV F Le s rum ou le plasma doit tre s par des globules rouges avant d tre exp di ou conserv Des particules ou des agr gats dans l chantillon peuvent causer des r sultats faux positifs ou de mauvaises valeurs de duplicatas Ces chantillons d
10. e de la pi ce 11 Aspirer ou d canter nergiquement et inverser sur du tissu ponge absorbant pour emp cher de s ass cher 12 Ajouter 50 ul de l luat appropri du contr le dilu ou du s rum plasma du patient dans les puits d une colonne comme le montre la figure 1 ao 5 8 5 a 2 2 1 2 3 4 A GP QQ 5 S rum contr le positif p OO OO luat de plaquettes positives OO OO NC S rum contr le n gatif GP Ib IX Eluat de plaquettes normales 10000 wun TOQQQ 10000 Pos Control G OG OG m OOOO Figure 1 NOTE Ne pas ajouter d chantillons ou de r actifs aux puits vierges NOTE Si plusieurs chantillons de patients diff rents sont test s en m me temps une seule s rie de contr les est n cessaire TIQUETTER CHAQUE BANDE POUR EVITER LES ERREURS 13 Sceller les micropuits avec un scellant pour plaques et incuber 30 35 minutes 37 C au bain marie Si un incubateur sec est utilis au lieu du bain marie augmenter le temps d incubation de 10 minutes 14 Diluer le conjugu 1 dans 100 dans le tampon pour chantillon Utiliser un contenant en polypropyl ne Bandes 2 2x8 6 2x8 AH 20 ll SD 2 0 ml 6 0 NOTE Le conjugu est une solution visqueuse Amorcer les embouts de pipette en pr levant distribuant 2 3 fois dans le conjugu avant de l ajouter au tampon pour chantillon rincer apr s chaque distribution Bien m
11. eloppe est mesur e au spectrophotom tre COMPOSITION DU COFFRET Nombre maximal de tests par coffret PakAuto 5 tests par coffret Tous les r actifs devraient tre entrepos s selon les instructions indiqu es sur l tiquette REF 404552 Micropuits bandes avec micropuits fond plat auxquels des glycoprot ines plaquettaires lb Illa Ib IX et la lla ont t attach es Les bandes sont incluses dans des sachets refermables Pr t utiliser TCW 403622 Solution de lavage concentr e 10X Solution tamponn e de Tris hydroxym thyl aminom thane contenant du chlorure de sodium et du Tween 20 1 d azide de sodium Diluer avec de l eau d ionis e ou distill e avant utilisation Conserver la solution de lavage de travail jusqu 48 heures la temp rature la pi ce ou jusqu 7 jours une temp rature de 2 8 C 403831 Tampon pour chantillon Solution saline tamponn e au phosphate contenant de l albumine bovine et du s rum de souris 0 1 d azide de sodium Pr t utiliser 403613 Tampon de substrat Cette solution contient du di thanolamine et du chlorure de magn sium 0 02 d azide de sodium Pr t utiliser A prot ger de la lumi re 403603 Solution d arr t Pr t utiliser 404588 Anti Human IgG A M Conjugu Anticorps de ch vre anti immunoglobuline IgG A M humaine purifi par affinit et conjugu la phosphatase alcaline 0 1 d azide de sodium Dil
12. evraient tre centrifug s avant d tre test s Les chantillons doivent tre aliquot s en petits volumes avant la cong lation pour viter des cycles de cong lation d cong lation Des chantillons contamin s par des microbes h molys s lip miques ict riques ou inactiv s par la chaleur peuvent donner des r sultats incoh rents et devraient tre vit s Plaquettes ou plasma riche en plaquettes Pour la d tection des auto anticorps lu s de la surface des plaquettes Le sang doit tre pr lev par une technique aseptique sur EDTA Conserver le sang total ou le plasma riche en plaquettes temp rature ambiante 20 25 C Ne pas mettre au frigo ni congeler les plaquettes ou le plasma riche en plaquettes Un minimum de 1 x 107 plaquettes est n cessaire de pr f rence 5 x 107 plaquettes pour la pr paration des luats plaquettaires Une quantit suffisante d chantillon peut tre obtenue en pr levant deux tubes de 7 de sang total chez les patients dont le nombre plaquettes est gt 10 000 uL NOTE L exp dition d chantillons sanguins peut causer une r duction de plaquettes Lorsque les chantillons ont besoin d tre transport s il est pr f rable de pr lever un plus grand volume pour assurer une quantit suffisante de plaquettes pour l lution Tester rapidement les luats pr par s ou les conserver 80 C pour une analyse ult rieure MODE OPERATOIRE Mat riel Fourni
13. f pour enlever tous les d bris plaquettaires Une fois les luats pr par s tester rapidement pour ne pas permettre aux anticorps de se rattacher aux d bris plaquettaires ou congeler pour une utilisation ult rieure Les luats plaquettaires peuvent tre congel s 80 C pour une utilisation ult rieure Continuer l tape 9 s il n y a que des luats qui sont test s NOTE Ne pas diluer les luats Analyse de s rum plasma pour des anticorps circulants Pr paration des chantillons et contr les 8 Diluer comme suit et bien m langer PakAuto coffret 5 303467 IFUFR REV F Volume diluant pour Volume chantillon d chantillon PC 150 ul 50 yl NC 300 il 100 ul chantillon de patient 300 li 100 9 Retirer la monture de micropuits du sachet Retirer rapidement et resceller toutes barrettes non utilis es dans le sachet protecteur NOTE Une seule monture est fournie par coffret Ne pas la jeter jusqu que toutes les bandes aient t utilis es NOTE Orienter la plaque afin que le puits A1 se situe dans le coin en haut gauche Soyez certain que toutes les barrettes soient mises de fa on appropri es et ins r es la plaque Etiqueter ou num roter chaque barrette afin d viter des erreurs Maintenir la m me orientation de plaque durant tout l essai 10 Ajouter 300 il de solution de lavage de travail chaque puits et laisser reposer 5 10 minutes la temp ratur
14. ire ou fumer en manipulant ce produit P273 viter le rejet dans l environnement P280 Porter des gants de protection des v tements de protection un quipement de protection des yeux du visage P301 P312 EN CAS D INGESTION Appeler un CENTRE ANTIPOISON un m decin en cas de malaise P305 P351 P338 EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX rincer avec pr caution l eau pendant plusieurs minutes Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent tre facilement enlev es Continuer rincer P310 Appeler imm diatement un CENTRE ANTIPOISON un m decin P330 Rincer la bouche PakAuto coffret 9 303467 IFUFR REV F
15. l automatiquement 26 Enregistrer les r sultats obtenus sur le tableau de r sultats CONTROLE QUALIT Le contr le qualit de l essai PakAuto est incorpor au syst me d analyse des contr les positifs et n gatifs se trouvent dans la trousse Lors de l analyse du s rum plasma utiliser le s rum contr le positif et le s rum contr le n gatif Lors de l analyse d chantillons lu s inclure les plaquettes de contr les positives et les plaquettes de contr les normales Ces contr les doivent tre inclus dans chacun des runs d analyse pour aider d terminer si des erreurs techniques ou des checs de r actifs se sont produits pendant l essai PakAuto coffret 7 303467 IFUFR REV F Crit res pour valider le test Contr le N gatif Contr le Positif Eluat lt 0 100 rang e llb Illa gt 1 000 S rum lt 0 160 rang e gt 1 000 Les valeurs de densit optique obtenues pour les duplicatas devraient tre inf rieures 20 de la moyenne des deux valeurs Les chantillons pour lesquels les r sultats sont l ext rieur de cette limite devraient tre retest s NOTE De mauvaises valeurs de duplicatas peuvent tre caus es par d un r actif ou de l chantillon in gal des r actifs une temp rature d incubation in gale une exposition la lumi re errante lors de l incubation finale ou par une contamination entre puits L absence de r sultats de test
16. laquettes et lu es de la surface plaquettaire Plusieurs tests pour l identification des immunoglobulines associ es aux plaquettes manquent en sp cificit puisqu ils produisent souvent des r sultats faux positifs chez des patients atteints de thrombocytop nie de type non immun Les micropuits LISA en phase solide PakAuto contiennent les glycoprot ines Ilb Illa et la Ila isol es par anticorps monoclonaux Ce test est con u pour d tecter des auto anticorps sp cifiques de glycoprot ines plaquettaires dans le s rum ou le plasma des patients auto anticorps circulants ou des auto anticorps lu s de la surface de leurs plaquettes La configuration des puits se trouve sur le tableau de r sultats PRINCIPE Le s rum ou le plasma est utilis pour d tecter les auto anticorps circulants alors que l luat d riv d un s rum riche en plaquettes est utilis pour d tecter les auto anticorps pr sents la surface des plaquettes du patient L chantillon est ajout aux micropuits enrob s de glycoprot ines plaquettaires permettant l anticorps si pr sent de se lier Les anticorps non li s sont alors lav s Un r actif anti globuline humaine conjugu la phosphatase alcaline Anti IgG A M est ajout aux puits et incub Les Anti IgG A M non li s sont lav s et le substrat PNPP p nitroph nyl phosphate est ajout Apr s 30 min d incubation la r action est arr t e La densit optique de la couleur qui se d v
17. laquettes normales 5 x 10 pour contr le d lution HN OR D Proc dure 1 Amener tous les r actifs la temp rature ambiante entre 22 et 25 C PakAuto coffret 4 303467 IFUFR REV F Pr parer une solution de lavage en diluant la solution de lavage concentr e Ajouter 1 volume de solution de lavage concentr e 9 volumes d eau d ionis e ou distill e Bien m langer D terminer le nombre d chantillons luat ou s rum plasma tester Utiliser le tableau de r sultats pour assigner chaque chantillon un emplacement consistant en une colonne Noter l identit de chaque chantillon sur le tableau de r sultats Pr paration des chantillons plaquettaires 4 Pr parer les culots de plaquettes de patients ou de donneurs de plaquettes normaux comme suit Pr parer un plasma riche en plaquettes PRP centrifugeant les chantillons de sang sur EDTA entre 110 et 150 rcf pendant 10 15 minutes Transf rer le PRP dans un nouveau tube de polypropyl ne et centrifuger 10 600 rcf pendant 5 10 minutes pour obtenir un culot de plaquettes Pr lever le plasma sans rompre le culot en utilisant une pipette de transfert Ajouter 500 ul de solution de pr servation et resuspension cellulaire CRP au culot de plaquettes et bien m langer avec une pipette de transfert pour rompre compl tement le culot afin de le remettre en suspension Transf rer la suspension plaquettaire dans un tube p
18. our microcentrifugeuse et laver trois fois comme d crit ci dessus avec au moins 500 ul de S assurer que le culot plaquettaire est compl tement remis en suspension chacun des lavages afin de permettre de retirer tout le plasma de la surface des plaquettes Apr s le lavage final pr parer un culot de plaquettes contenant entre 1 et 5 X 107 plaquettes Cela se fait en remettant les plaquettes en suspension avec et ajustant le nombre de plaquettes entre 10 000 et 50 000 plaquettes ul Transf rer 1 ml dans un tube pour microcentrifugeuse et centrifuger pendant 5 minutes 10 600 rcf pour obtenir un culot Autrement dit 5 10 ul d un culot de plaquettes devrait contenir suffisamment de plaquettes pour r aliser l lution Comparer le culot un tube identique contenant de 5 10 ul de diluant de l chantillon Apr s avoir pipet le culot de plaquettes enlever enti rement le CRP r siduel en utilisant une pipette de transfert Ne pas rompre le culot de plaquettes Pr paration des plaquettes contr les 5 NOTE NOTE Pr parer les culots de plaquettes contr les comme suit Ajouter 500 ul de solution de pr servation et resuspension cellulaire aux plaquettes contr les positives luat de contr le positif et au besoin aux plaquettes de contr les normales luat de contr le n gatif Laisser reposer temp rature ambiante au moins 10 minutes afin de r hydrater Bien m lange
19. r avec une pipette de transfert pour rompre compl tement le culot afin de le remettre en suspension Centrifuger dans un tube pour microcentrifugeuse 5 10 minutes 10 600 rcf D canter ou aspirer le surnageant et s cher le tampon restant pour obtenir un culot de plaquettes sec Il est pr f rable d utiliser des plaquettes normales fra ches pour l luat de contr le n gatif mais des plaquettes lyophilis es ont t fournies si des plaquettes normales n taient pas disponibles L luat de contr le positif peut tre surgel pour une utilisation ult rieure Ne pas congeler et d congeler l luat de contr le pr par plus de deux fois Pr paration des chantillons et des luats contr les 6 Pr parer l chantillon et les luats contr les comme suit Avant de proc der s assurer que tous les culots de plaquettes ont bien s diment et que tout le CRP restant a t enlev Il est imp ratif de retirer le CRP r siduel fin de garantir que l luat pr par ne sera pas dilu Ajouter 180 ul de solution d lution chacun des culots de plaquettes et m langer l aide d une pipette Laisser reposer temp rature ambiante pendant 2 minutes Centrifuger 5 10 minutes 10 600 rcf dans un microtube Transf rer rapidement les surnageants les luats dans un nouveau tube pour microcentrifugeuse et ajouter 180 de solution tampon chacun des tubes Bien m langer Centrifuger 10 minutes 10 600 rc
20. s en duplicata peut mener l approbation de r sultats erron s INTERPR TATION DES R SULTATS Les r sultats de tests d montrant des valeurs de densit optique gales ou plus grandes que 2X la valeur obtenue pour la moyenne des contr les n gatifs des glycoprot ines correspondantes 2 valeurs de contr les n gatifs pour chaque glycoprot ine sont consid r s comme r sultats positifs LIMITES DE LA TECHNIQUE Des r sultats erron s peuvent tre caus s par une contamination bact rienne des mat riaux du test des p riodes d incubation inad quates un mauvais lavage d cantage des puits une exposition du substrat la lumi re l omission de r actifs une exposition des temp ratures plus lev es ou plus faibles que celles prescrites un manque ou un exc s de plaquettes ou l omission d tapes pr sence de complexes immuns ou autres agr gats d immunoglobulines dans les chantillons de patients peut causer une augmentation de la liaison non sp cifique et produire de faux positifs dans cet essai Certains faibles titres d anticorps faible affinit ne peuvent tre d tect s par cet essai Les r sultats de cet essai ne devraient pas tre utilis s comme le seul fondement d un jugement clinique produit est con u sp cifiquement pour d tecter les auto anticorps lu s des plaquettes du patient Par cons quent une r action positive obtenue avec seulement le s rum ou le plasma du p
21. uer avec le tampon pour chantillon avant utilisation Jla e PakAuto coffret 2 303467 IFUFR REV F 2 v 2 5 2 v v 0 404590 Solution de pr servation et resuspension cellulaire solution saline tamponn e au phosphate contenant de lEDTA 0 1 d azide de sodium Pr t utiliser 404560 Solution pour tamponner solution de Tris contenant de l albumine bovine 0 1 d azide de sodium 404565 Solution d lution un tampon glycine faible pH 403594 Substrat PNPP p nitroph nyl phosphate Poudre crystalline Reconstituer avec de l eau d ionis e ou distill e et diluer avec le tampon de substrat avant utilisation A prot ger de la lumi re 404600 S rum contr le positif s rum humain 0 1 d azide de sodium A diluer dans le tampon pour chantillon avant utilisation 404576 S rum contr le n gatif s rum humain 0 1 d azide de sodium A diluer dans le tampon pour chantillon avant utilisation 404579 Contr le de plaquettes positives contr le d luat positif plaquettes humaines avec un anticorps s ch es au vacuum R hydrater avec la solution de pr servation et resuspension cellulaire avant d utiliser 404578 Contr le de plaquettes normales contr le d luat n gatif pool de plaquettes humaines s ch es au vacuum R hydrater avec la solution de pr servation et resuspension cellulaire avant d utiliser 503019 Scellants pour plaques
22. vage de travail c Aspirer ou d canter d R p ter les tapes b et c pour un total de 3 4 lavages e Apr s le derniere lavage d canter vigoureusement pour enlever toute solution de lavage r siduelle Inverser sur du tissu ponge absorbant pour emp cher s ass cher Poursuivre rapidement les trois prochaines tapes 21 Ajouter 100 ul de la solution de PNPP dilu e chaque puits SAUF ceux d sign s VIERGES 22 Incuber les micropuits l abri de la lumi re pendant 30 minutes la TEMP RATURE DE LA PIECE 22 25 NOTE Le temps et la temp rature d incubation suite l ajout du PNPP sont critiques NE PAS varier le temps et la temp rature d incubation tablis A des fins d uniformit d buter le chronom trage rapidement apr s du r actif au premier puits 23 Arr ter la r action par l ajout de 100 ul de solution d arr t chaque puits dans le m me ordre que celui utilis lors de du substrat Ajouter 200 de la solution d arr t aux puits vierges 24 Lire la densit optique de chaque puits 405 ou 410 nm en utilisant un filtre de r f rence de 490 nm Si les r sultats ne peuvent tre lus imm diatement laisser les puits l abri de la lumi re jusqu 30 minutes 25 Soustraire la valeur obtenue pour les puits vierges de tous les puits contenant les contr les et les chantillons Plusieurs instruments de lecture ELISA sont programm s pour faire ce calcu
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