du 454 au MiSeq
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1. gt gi 129594480 gb EF445235 1 Uncultured bacterium clone NED4B6 16S ribosomal RNA gene pa TACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGACGGAAGTCTGAACCAGCCAAGTAGCGTGCAGGAT Y ATAAAGTTAGCCACGTGTGGTTATTTGCATGTACCCTACGAATAAGGACCGGCTAATTCCGTGCCAGCAGCCQ ATTGGGTTTAAAGGGAGCGCAGGCCGTTTGGTAAGCGTGTTGTGAAATGTCCGGGCTCAACCTGGGCACTG GGCGGAATTCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCTTAGATATCACGAAGAACTCCAATTGCGAAGGCAGCTCGCT TCGAACAGGATTAGATACCCTGGTA 208 824 R1 ou R2 brut 137 622 contigs 66 Butyrivibrio fibrisolvens Firmicutes NED4E2 450nt gt gi 129594507 gb EF445262 1 Uncultured bacterium clone NED4E2 16S ribosomal RNA gene partial sequ TACGGGAGGCAGCAGTGGGGGATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGTGAAGAAGTA GAAGAAAGACCTCGTAAGAGGGGATGACGGTACCTGAGTAAGAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATTTACTGGGTGTAAAGGGAGCGTAGACGGTGTATCAAGTCTGAAGTGAAACCCCACGGCTCAACCGTGGGCTTGCTT1 GAGGTAAGCGGAATTCCTGGTGTAGTAGTGAAATGCGTAGATATCAGGAAGAACATCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTC GGCGTGGGGAG GATACCCTGGT 181 734 brut 122 510 contigs 67 SCIENCE amp IMPACT Nombre de sequences 150000 100000 50000 SCIENCE amp IMPACT Plasmides Prevotella bryantii 137 622 contigs 292 454 nt Butyrivibrio fibrisolvens 122 510 contigs gt 91 a 450 nt Taille des s quences Contig Plasmides les constructions compar es V4 me i se Zone de contig 200nt 230nt a nen NNN V3 V4 aa maid E mm D 2 ms2. a SCIENCE amp IMPACT Plasmides les constructions compar es Contig Insert H gt 430 463 nt Contig oft ye Insert Primer R clean Primer F _ Primer R _ 430 463 nt sans N RINR2 NN NN mas 430 nt 10N Ri brut gt 250m R2 brut mm gt 250 nt SCIENCE amp IMPACT 2 fa ons d analyser les communaut s Assignation taxonomique f ciusterisation regroupement en OTU Mothur RDP classifier Base LTP111 Mothur RDP classifier Base LTP111 Esprit Tree 1 read 1 taxon bo ra Regroupement p 85 95 st ine de caract res ot Chaque read est class dans 1 OTU puis assignation taxonomique des OTU Table d abondance 100 400 taxons connus ou unclassified sample 3_ 3155 0 5 1 5694 0 779 sample 100 0 2 4 5943 1 11421 par chai 90 000 OTU Y matrix Co o e c O Taxon n 0 12 2320 0 7928 64 76 28 16616 0 748 36 E2 0 5436 O 0 UT UJ 0 48 4 380 0 3248 I Butyrivibrio fibrisolvens SCIENCE amp IMPACT Clusterisation en OTU Esprit tree sur contig Prevotella Butyrivibrio bryantii fibrisolvens Contig 137 622 122 510 To be continued Contig clean Nb OTU attendu 1 1 RINR2 R1 Nb total OTU 1397 998 OTU 1 maj 93 6 93 6 OTU 2 0 2 0 2 gt SCIENCE amp IMPAC
3. TM ECOLE LE L NATIONALE Analyse de commu nautes bact riennes complexes du 454 au MiSeq ar Sylvie COMBES Laurent CAWQUIL Olivier ZEMB B atrice ABINAUD G raldine PASCAL Ds TARGEM Olivier BOUCHEZ Frederic ESCUDIER Sophie VALIERE 30 Sept 2013 Microbiote dominant 20 to 40 Re valuation par approches mol culaires ind pendantes de la culture aa 2 M T Light ubunit Heavy subunit iseg mode d emploi INA SCIENCE amp IMPACT CONSTRUCTION S quen age paire end 2x250nt G olocalis R1 amp R2 associ s S quence R gion V3 V4 de l ADNr 165 440 460 pb R1 250pb f f V3 V4 Primer F EE amplicon mm PrimerR index Adapt P7 A R2 250pb zone hypervariable Run de 104 echantillons index de 6 nt Communaut digestive lapin n 80 Communaut digestive porc n 21 e Plasmides contenant la s quence ADNr 165 de bacterie connues n 2 M lange 4 bact ries marines n 1 SCIENCE amp IMPACT Miseq les donn es INA SCIENCE amp IMPACT Nombre de reads par echantillon Nombre de reads apr s filtrage Illumina 24 854 086 8 de reads supprim es Ea i E ut soit E p 12 427 043 R1 12 427 043 R2 E E at REPARTITION DES SEQUENCES DANS LES 104 ECHANTILLONS 50000 Probleme technique 27 chantillons ont moins de 50 000 s quences apr s filtrage Illumin
4. ACT Lactobacillus Group Turicibacter CCUS Bifidobacterium propre 10 Corynebacterium H sale h Mpa 0 40 Mogibacterium seldoalteromonas g eriu n SIIT Parabacteroides 0 025 ti 1 Leispirllum Anaerovibrio n DR ORC US Asteroleplasma i anella Acetivibrio lon Cloacibacillus n uiter la 0 12 Anaeroplasma rasnpasma i Dietga 0 0 0016 u_u Mucispirillum n ulynicimonas Sharpea MAS i 1 Yersinia COROT S 0 025 Chlamydia g anc i Succiniclasticum L bai Anaerofustis 0 M bee coc Escherichia uper RISATE eudaanbacter ropionibacterium Alligonella i i cou 0 0016 Roseburia 1 Saag Phascolarctobacterium I tee Res Gemmiger H seudohjmibio Butyricicoccus 0 Bacteroides 0 Barnesiella Koron coccus 0 Butyrivibrio ODA UM Collinsella d bpecflus Peptococcus Dialister Miles boston NG oter E abha 1 cel nerobacteium Selenomonas i Id CO Acidaminococcus C MN Succinivibrio 1 iit Sm Oscillibacter bacterium Treponema i Sarcina eglonela Mitsuokella ARE Streptococcus iu Clostridium MCE is Prevotella j aen pacius Faecalibacterium fain llus Coprococcus I BON nas I eptotrichia Dorea nvobacte Blautia 1 Apo TIS Eubacterium wana Ruminococcus 1 de 1 Seudomonas Catenibacterium Megasphaera wem sem men SCIENCE amp IMPACT SCIENCE amp IMPACT Lactobacil
5. T Comparaison 454 vs MiSeq Comparer les profondeurs L impact sur l interpr tation biologique w Sma Sa SCIENCE amp IMPACT Comparaison de communaut s digestives de porcs 454 vs Miseg 15 chantillons 3 lots propre sale t1 n 5 454 USA Miseg PLAGE 61 158 reads 1 211 554 reads Lo Classification Clusterisation RDP classifier base LTP 111 Esprit tree 2 niveaux taxonomiques Avec pr clusterisation par gt famille 85 classification RDP gt genre 95 gt SCIENCE amp IMPACT Lactobacillaceae Streptococcaceae Prevotellaceae Grou Streptococcaceae 0 80 p OG propre Clostridiaceae Lachnospiraceae Gpirochael Eubacteriaceae 0 40 06 pirochaetaceae Ruminococcaceae A H Peptococcaceae NoFamily Unified_Clostridiales Oscillospiraceae 0 025 Lactobacillaceae Acidaminococcaceae Clostridiaceae 0 12 ran orynebacteriaceae icrococcaceae Bifidobacteriaceae i 0 025 Bacteroidaceae Aerococcaceae Succinivibrionaceae 4 P Enterobacteriaceae 0 0016 lieri odd Pseudoalteromonadaceae 0 0016 Dietziaceae Flavobacteriaceae Synergistaceae Bacillaceae Anaeroplasmataceae Carnobacteriaceae 0 Propionibacteriaceae Oxalobacteraceae Chlamydiaceae 0 Pseudomonadaceae Hyphom icrobiaceae Leuconostocaceae Ruminococcaceae Lachnospiraceae NoFamily Unified Clostridiales Erysipelotrichaceae Coriobacteriaceae Eubacteriaceae Porphyromonadaceae Prevotellaceae Veillonel
6. a Probl me d amplification sur PCR1 gt pr sence d inhibiteur gt Suite de la pr sentation sur 104 27 77 SCIENCE amp IMPACT CONTIGAGE PAR FLASH 430nt 460nt 100000 R1 gt qualit OK sur 250 n 50000 PM LEE 250 300 950 400 I 450 i Taille des sequences R2 gt qualit OK sun 240 M gt overlap minimum 10 bases notre construction n cessite un overlap de min 20 et max 35 nt SCIENCE amp IMPACT CONTIGAGE PAR FLASH 430nt 460nt R1 gt qualit OK sur 250 n n d i M ix 440 445 490 4 P i pm B Ema DN NEE m D GS g 3 8 E 3 E E DN BH SS ba R2 gt qualit OK D 2 214 216 218 220 222 224 226 228 230 252 234 236 238 240 245 245 247 gt overlap minimum 10 bases notre construction n cessite un overlap de min 20 et max 35 nt gt limine une grande partie des reads contenant des N mais pas tous SCIENCE amp IMPACT CONTIGAGE PAR FLASH 3 seuils de mismatch test s 5 10 15 A5 gt 65 des couples R1 R2 sont contigu s gt 8 millions A 10 gt 75 A 15 gt 80 ITV NN N VOC AV de reads contigues Echantillons SCIENCE amp IMPACT LES PLASMIDES V rifier la qualit du contigage et du processus de s quencag diro eme Plasmides Prevotella bryantii Bacteroides NED4B6 454nt
7. acillaceae Clostridiaceae 0 12 Anaeroplasmataceae Micrococcaceae Enterococcaceae Staphylococcaceae 0 025 Aerococcaceae Planococcaceae Pseudoalteromonadaceae 0 0016 Flavobacteriaceae Pasteurellaceae Bacillaceae Carnobacteriaceae 0 Oxalobacteraceae Pseudomonadaceae Leuconostocaceae Sphingomonadaceae Syntrophomonadaceae Elusimicrobiaceae Alcaligenaceae Rhodobacteraceae Streptomycetaceae Sphingobacteriaceae Fusobacteriaceae Acholeplasmataceae Erythrobacteraceae Xanthomonadaceae Bradyrhizobiaceae Paenibacillaceae Synergistaceae Leptotrichiaceae Methylobacteriaceae Christensenellaceae Microbacteriaceae Nocardiopsaceae raxellaceae Chlamydiaceae NoFamily Unified Burkholderiales Neisseriaceae Mycoplasmataceae Comamonadaceae Legionellaceae Fibrobacteraceae Rikenellaceae Acidaminococcaceae Dietziaceae Actinomycetaceae Deferribacteraceae Sutterellaceae Helicobacteraceae Succinivibrionaceae Desulfovibrionaceae Campylobacteraceae Erysipelotrichaceae Corynebacteriaceae Bifidobacteriaceae Enterobacteriaceae Bacteroidaceae Peptococcaceae Veillonellaceae Oscillospiraceae Spirochaetaceae _ Porphyromonadaceae ES Coriobacteriaceae Hyphomicrobiaceae Comparaison des profiles taxonomiques par nMDS 454 USA Mised PLAGE Classification RDP classifier LTP111 niv famille Repr sentation robuste gt 4 individus ont un positionnement significativement diff rent SCIENCE amp IMP
8. ci sella C dI cterium ec Clusterisation Esprit Tree 0 03 Nb OTU 4 346 75 636 SCIENCE amp IMPACT Comparaison des profiles taxonomidues par nMDS Clusterisation Esprit Tree 0 03 Repr sentation robuste 4 individus ont un positionnement significativement diff rent SCIENCE amp IMPACT Conclusion Mised PLAGE Qualit des s quences satisfaisantes Contigage possible suppression des bases N Profondeur accrue Moindre co t Multiplexage plus important R sultats coh rents d un point de vue composition communaut Mais Difficult de traitement du l augmentation du nb de reads gt Pipeline revoir diro IMPACT N e TEE a Thanks for your attention Merci pour votre attention Thanks to each of my team members geno toul bioinfo PECTOUL L aurence Fortun Lamothe 3 Val rie Lozano dm m Philippe Muriel Segura Corine Bayourthe as Annabelle Troegeler Marie Luce Schmidt Laurent Cauquil i q Carole Bannelier Olivier Zemb Christine Julien K Francis Enjalbert gt Vargas Anita cle B Co ere ve V ETERINAIRE SCIENCE amp IMPACT
9. laceae Sphingomonadaceae Syntrophomonadaceae Elusimicrobiaceae Alcaligenaceae Rhodobacteraceae Streptomycetaceae Sphingobacteriaceae Fusobacteriaceae Acholeplasmataceae Erythrobacteraceae Xanthomonadaceae Bradyrhizobiaceae Paenibacillaceae Synergistaceae Leptotrichiaceae Methylobacteriaceae Christensenellaceae Microbacteriaceae holderiales Sb ai Veillonellaceae Oscillospiraceae Spirochaetaceae Porphyromonadaceae J Coriobacteriaceae Hyphomicrobiaceae SCIENCE amp IMPACT 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 7 CES Lactobacillaceae Streptococcaceae Clostridiaceae Spirochaetaceae Peptococcaceae Oscillospiraceae 0 025 Acidaminococcaceae Desulfovibrionaceae Corynebacteriaceae Bifidobacteriaceae Bacteroidaceae Succinivibrionaceae 0 0016 Enterobacteriaceae i Dietziaceae Deferribacteraceae Synergistaceae Anaeroplasmataceae Propionibacteriaceae Chlamydiaceae 0 Hyphomicrobiaceae Ruminococcaceae Lachnospiraceae NoFamily Unified Clostridiales Erysipelotrichaceae Coriobacteriaceae Eubacteriaceae Porphyromonadaceae Prevotellaceae Veillonellaceae Corr lation abondance relative 454 vs MiSeg niveau famille nd P A MTM Erysipelotrichaceae SCIENCE amp IMPACT Anaeroplasmataceae E Prevotellaceae 0 80 Group Streptococcaceae Lachnospiraceae DIVE Eubacteriaceae 0 40 Hsale Ruminococcaceae M NoFamily Unified Clostridiales tl Lactob
10. lus Turicibacter Bifidobacterium Corynebacterium Mogibacterium Parabacteroides Anaerovibrio Asteroleplasma Acetivibrio Cloacibacillus Anaeroplasma Cellulosilyticum Dietza Mucispirillum Sharpea Yersinia Chlamydia Succiniclasticum Anaerofustis Escherichia Veillonella Allisonella Roseburia Gemmiger Butyricicoccus Bacteroides Barnesiella Butyrivibrio Collinsella Peptococcus Dialister Olsenella Desulfovibrio Slackia Selenomonas Succinivibrio Oscillibacter Treponema Sarcina E Mitsuokella Streptococcus Clostridium Prevotella Coprococcus Dorea Blautia Eubacterium Ruminococcus Catenibacterium Megasphaera Group propre M sale 0 025 t1 0 0016 Propionibacterium Phascolarctobacterium Acidaminococcus Faecalibacterium Megasphaera Eubacterium r ra mit Jr lt T ee S IET TH ET LT CS TI dos Group i propre S G romonas 0 40 a H sale nella t Ur 0 12 naerop asma nteroco A CC nasco Het Sbacterium erini utyricimonas Hane 0 005 OCOCCUS ile fl avonifractor eu nl aerobiospirillum cop asm ramibacter i 0 0016 DI o reptomyces ce r celanaerobaclerium ilu enella VORRAI pgobium aclerium 1 Cerium MEN Elsi icun Ho ongi in pe a AM dacterium aecaliba ghigcoccus erium uminococcus 82 nema ai Da
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