Protocole
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1. OCPLO7 TSH Cisbio Bioassays F vrier 2014 Mod le 18 Trousse pour la d termination radioimmunologique de la thyrotrophine humaine hTSH Contenu de la trousse 1 flacon de traceur 125l anticorps anti hTSH monoclonal souris lt 300 kBq contenant 11 5 ml de tampon de l albumine bovine des anticorps monoclonaux de souris de l azoture de sodium et un colorant rouge 2x50 tubes rev tus anticorps anti hTSH monoclonal souris 7 flacons de calibrateurss de hTSH contenant chacun 1 mI de s rum humain de l albumine bovine et de l azoture de sodium concentration allant de 0 65 uUl mI hTSH humaine 1 flacon de s rum de contr le hTSH contenant 1 ml de s rum humain de l albumine bovine et de l azoture de sodium concentration indiqu e sur l tiquette 1 r actif de lavage 3 comprim s sous blister 1 sachet plastique 1 mode d emploi Certains r actifs contiennent de l azoture de sodium comme conservateur Eviter toute absorption des r actifs ainsi que tout contact avec la peau ou les muqueuses L azoture de sodium peut r agir avec les canalisations de plomb et de cuivre pour former des azotures de m taux fortement explosifs Les diluer abondamment lors de l vacuation des d chets 1 Introduction La thyrotrophine TSH hormone ant hypophysaire est une glycoprot ine d un poids mol culaire d environ 30 000 compos e de deux sous unit s diff rentes savoi2. sultats Un exemple de courbe d talonnage du RIA gnost hTSH est montr la figure 2 Porter sur du papier millim tr pr par cet effet d une part les coups par minute des calibrateurs CALo CAL et d autre part la concentration de TSH correspondante uUl mI Construire la courbe talon en reliant les points Marquer les valeurs du s rum de contr le et des chantillons doser puis lire sur la courbe d talonnage la concentration en TSH 4 L 7 Interf rences a pr sence de bilirubine d h moglobine et de triglyc rides des concentrations jusqu 250 mg L 5 g l et 20 g l n ont pas d effet sur les r sultats du dosage L immuno dosage est prot g contre les anticorps h t rophiles Cependant nous ne pouvons pas garantir que cette protection soit exhaustive Tab 1 Protocole de dosage du test hTSH Calibrateurs ul S rum Echantillons ul de contr le ul N des tubes CALo CAL CAL CAL CAL CALs CALs C 1 2 Etc Calibrateurs CALo 200 200 CAL 200 200 CAL 200 200 CALs 200 200 CAL 200 200 CALs 200 200 CALs 200 200 S rum de contr le 200 200 Echantillons 200 200 Etc 200 200 Traceur anti hTSH 100 pl gt Agiter pendant 2 h 300 50 tr min Tampon de lavage ro a gt D canter aspirer l
3. aver avec 1 ml Compter Fig 2 Exemple d une courbe d talonnage Groupes cpm Concentration Echelle normale Grossissement 10 fois de tubes moyens pU ml 50 000 Calibrateur 0 117 0 00 6 000 Calibrateur 1 309 0 14 12 Calibrateur 2 806 0 50 30000 Calibrateur 3 2171 1 49 amp S 20 000 Calibrateur 4 6764 4 80 2000 Calibrateur 5 18963 14 40 R Calibrateur 6 47913 46 00 Umi TSH HU hTSH Contr le 2870 2 10 OCPLO7 TSH Cisbio Bioassays F vrier 2014 Mod le 18 5 R gles de base de radioprotection Ce produit radioactif ne peut tre re u achet d tenu ou utilis que par des personnes autoris es cette fin et dans des laboratoires couverts par cette autorisation Cette solution ne peut en aucun cas tre administr e ni l homme ni aux animaux L achat la d tention l utilisation et l change de produits radioactifs sont soumis aux r glementations en vigueur dans le pays de l utilisateur L application des r gles de base de radioprotection assure une s curit ad quate Un aper u en est donn ci dessous Les produits radioactifs seront stock s dans leur conteneur d origine dans un local appropri Un cahier de r ception et de stockage de produits radioactifs sera tenu jour La manipulation de produits radioactifs se fera dans un local appropri dont l acc s doit tre r glement zone contr l e Ne pas manger ni boire ni fumer ni appliquer des
4. aximum 42 chantillons de patients avec une seule courbe d talonnage Les anticorps monoclonaux contenus dans la trousse sont hautement sp cifiques de la TSH Une r action crois e avec hLH hFSH et hCG dans les plages de concentrations importantes sur le plan physiologique est pratiquement exclue Les chantillons d passant la plage de mesure sont dilu s avec le tampon de lavage La standardisation t r alis e par rapport au standard hTSH WHO 80 558 Remarques la sensibilit extr mement lev e du test ne peut donner toute sa mesure que si l on respecte les pr cautions suivantes a Eviter que les tubes subissent une contamination venant de l ext rieur b Eliminer int gralement la fraction de traceur non li e par d cantation ou aspiration En cas d aspiration veiller ce que les capillaires ne soient pas bouch s Apr s la d cantation liminer tout liquide restant en tapotant les tubes sur un papier absorbant c Contr ler que l appareil de mesure et les portoirs ventuellement utilis s ne soient pas contamin s Si n cessaire effectuer une d contamination d Exclure toute influence perturbante de sources externes de rayonnement 3 2 Caract ristiques sp cifiques du dosage 3 2 1 Impr cision Elle a t valu e l aide de 3 chantillons dos s 10 fois dans la m me s rie et dans 10 s ries diff rentes Intra essai Inter essai Echantillons Moyenne CV Echantillon
5. cosm tiques en zone contr l e Ne pas pipeter des solutions radioactives avec la bouche Eviter le contact direct avec tout produit radioactif en utilisant des blouses et des gants de protection Le mat riel de laboratoire et la verrerie qui ont t contamin s doivent tre limin s au fur et mesure afin d viter une contamination crois e de plusieurs isotopes Chaque cas de contamination ou perte de substance radioactive devra tre r solu selon les proc dures tablies Toute limination de d chets radioactifs se fera conform ment aux r glementations en vigueur
6. e taux s rique de TSH est par cons quent abaiss ou inversement il est lev si la concentration susmentionn e est faible Le m canisme d action d crit sert de base au test la TRH Chez les sujets dont la thyro de fonctionne normalement l administration de TRH synth tique provoque une excr tion de TSH par lhypophyse pouvant tre mesur e par voie radioimmunologique Dans l hyperthyro die la synth se de la Prot ines de transport TBG TBPA TSH cesse par suite du r tro contr le pr cit si bien que cette hormone ne peut tre lib r e En cas d hypothyro die par contre le r tro contr le entra ne sous la stimulation de la TRH un taux accru de TSH dans l hypophyse et une l vation exag r e du taux de TSH d j accru au d part 2 2 Taux normaux Dans le cadre de l tude clinique du RIA gnost hTSH la plage normale du taux s rique de hTSH chez les hommes et les femmes a t tablie Euthyro die 0 25 4 uUl ml n 1966 Hyperthyro die lt 0 25 uUl ml n 182 dans la majorit des cas lt 0 1 pUl ml Hypothyro die gt 5 uUl ml n 50 OCPLO7 TSH Cisbio Bioassays F vrier 2014 Mod le 18 CE Apr s stimulation par la TRH le taux de TSH atteint chez les sujets sains 2 30 uUl ml n 417 En cas d hyperthyroidie le taux de TSH est inf rieur 0 5 uUl ml n 59 tandis qu en cas d hypothyroidie il peut d passer 30 uUl ml
7. n 8 En cas d affections g n rales graves et prolong es le taux s rique de TSH peut subir des modifications ou tout au moins la r ponse de la TSH la stimulation par la TRH peut tre r duite Une hypocalc mie ou certains m dicaments peuvent stimuler la s cr tion de TSH par exemple les antagonistes de la dopamine les iodures ou l inhiber par exemple la L dopa les cortico des Avec l ge il peut se produire une l g re baisse du taux de TSH et une diminution de la s cr tion de TSH stimul e par la TRH 3 Principe du dosage et caract ristiques du RIA gnost hTSH 3 1 Principe du dosage Le RIA gnost hTSH permet de doser in vitro la thyrotrophine dans le s rum ou le plasma humain d apr s le principe du test sandwich 1 tape Au cours de ce test il se forme un complexe entre l anticorps anti h TSH monoclonal souris fix sur la paroi du tube la TSH contenue dans l chantillon et l anticorps anti hTSH marqu l 1251 monoclonal souris Une fois la r action effectu e la partie libre du traceur est limin e par d cantation ou aspiration et rin age La fraction de traceur sp cifiquement fix e sur les tubes rev tus d anticorps est mesur e l aide d un compteur gamma L valuation des r sultats fournis par les chantillons inconnus se fait l aide d une courbe d talonnage tablie dans des conditions identiques En cas de dosages effectu s en double on peut traiter au m
8. r d une cha ne a et d une cha ne B Seule la mol cule enti re intacte hTSH est biologiquement active Les autres hormones glycoprot iques telles hLH hFSH hCG se composent galement de deux sous unit s Les sous unit s de ce groupe d hormones sont pratiquement identiques tandis que les sous unit s B sont sp cifiques de l hormone et se distinguent les unes des autres par leur structure 2 R sultats cliniques obtenus avec le RIA gnost hTSH 2 1 Importance clinique du dosage de l hTSH Un r tro contr le s effectue entre la thyro de l hypophyse l hypothalamus et les hormones thyro diennes circulant dans le Fig 17 Axe hypoi alam sihypoph se thyr d sang savoir la triiodothyronine T3 et la thyroxine T4 Fig 1 TRH Hormone lib rant la thyrotrophine TSH Thyrotrophine Hypothalamus Une neuros cr tion l hormone lib rant la thyrotrophine TRH T4 Thyroxine ean T3 Triiodothyronine est labor e dans l hypothalamus La TRH provoque la lib ration TBG Globuline liant la thyroxine de la thyrotrophine TSH par l hypophyse et stimule galement TBPA pr albumine liant la thyroxine sa synth se De son c t la TSH entra ne une synth se et une lib ration accrue de T4 et de T3 La lib ration de la TSH est command e par la fraction circulante m taboliquement active des hormones thyro diennes En cas de concentration lev e de la fraction libre de ces hormones la p riph rie l
9. rum 4 4 Mises en garde et pr cautions d emploi Les mati res premi res d origine humaine contenues dans les r actifs de cette trousse ont t test es avec des trousses agr es et trouv es n gatives en ce qui concerne les anticorps anti HIV 1 anti HIV 2 anti HCV et l antig ne HBs Cependant aucune m thode d analyse ne permet ce jour de garantir totalement qu une mati re premi re d origine humaine soit incapable de transmettre l h patite le virus HIV ou toute autre infection virale Aussi faut il consid rer toute mati re premi re d origine humaine y compris les chantillons doser comme potentiellement infectieuse 4 4 1 1 D 4 OCPLO7 TSH Cisbio Bioassays F vrier 2014 Mod le 18 5 Protocole de dosage Num roter un nombre suffisant de tubes rev tus d anticorps comme indiqu dans le tableau 1 calibrateurs s rum de contr le chantillons doser Distribuer 200 ul de calibrateurs ou d chantillon doser au fond des tubes Utiliser un nouvel embout pour chaque chantillon Distribuer 100 ul de l anti hTSH dans chaque tube Agjiter les tubes sur un agitateur horizontal 300 50 tr min pendant 2 h une temp rature comprise entre 18 et 25 C Distribuer dans chaque tube 1 mI de tampon de lavage d canter aspirer et rincer avec 1 ml Mesurer la radioactivit des tubes pendant 1 minute l aide d un compteur gamma 6 Lecture des r
10. s Moyenne CV uUI mIl uUIl mI 1 0 30 5 7 4 1 55 5 4 2 3 95 1 5 5 3 61 4 8 3 28 7 1 2 6 9 81 2 4 3 3 Limite de d tection La limite de d tection est d finie comme tant la plus petite concentration d tectable diff rente de O avec une probabilit de 95 Elle a t valu e 0 03 uUl ml 4 Mode d emploi 4 1 Mat riel n cessaire Micropipettes avec embout plastique interchangeable de 100 ul et 200 ul prouvettes gradu es agitateur horizontal 300 50 tr min compteur gamma r gl pour la mesure de l iode 125 4 2 Pr paration des r actifs Avant utilisation porter temp rature ambiante entre 18 et 25 C les composants de la trousse conserv s entre 2 et 8 C Pour pr parer le tampon de lavage dissoudre les trois comprim s de tampon dans 300 ml d eau distill e Conserver tous les r actifs non utilis s une temp rature comprise entre 2 et 8C Les tubes rev tus d anticorps sortis de leur emballage et non utilis s doivent tre stock s dans le sachet plastique fourni dans la trousse 4 3 Pr paration des chantillons Apr s le pr l vement sanguin pr parer le s rum ou le plasma selon le proc d habituel Le s rum ou le plasma peut tre utilis imm diatement pour le test ou conserv pendant 3 jours au maximum entre 2 et 8 C Pour une conservation plus longue une temp rature de 20C est recommand e Apr s d cong lation bien agiter les chantillons de s
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