Home

Bedienungsanleitung für das CRC RAScan™ Combination Kit

Contents

1. Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit Ein SURVEYOR Scan KRAS und NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 CE IVD fur DHPLC Systeme CCE Bitte lesen Sie diese Bedienungsanleitung sorgfaltig durch bevor Sie dieses Produkt verwenden Heben Sie diese Bedienungsanleitung auf vielleicht mochten Sie spater etwas nachschlagen Transgenomic Advancing Personalized Medicine Diese Seite ist absichtlich leer Inhaltsverzeichnis MOT SUC Oi DORRRARSN BER ER AIRLORSSENEE RIESE ERS SESHERE ERSEE RER AERENGEREREESERELNERGEESEESEHRERE SEREERUSEUERERUN EEE IRRE SEEADE 3 2 CRC RAScan Combination Kit anna 3 2 1 VerWenduneszWweck arena 3 2 2 Angaben zum Gebrauch naeh 3 3 Testprinzip des CRC RAScan KRAS und NRAS Mutation Detection Assay 4 WIA SV N A ee ee OE O AS 4 3 2 Analyse von Patientenproben mit den SURVEYOR Scan Kits eessesessnsssesnnsnessnnnnnnnnnnnenn nenn 4 PASURVE VOR NUCIE Fran E T EEA 5 4 R ckverfolgbarkeit der Kit Kontrollen cccceeeeceeeesceeeesessneeeeeeeeeneeeensnseeeseeseseeoes 6 BOK OM OIG 11 1 1 a E ensue encanta vececnasin Uenueninneenesussiuuceetuceosacsvvasauiaecesa 7 5 1 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2 3 amp 4 Karton h 710107 eeennceeeessnesssessnsssenessnnnnnne nenn 7 5 2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 Karton h 710400 cceccccccessseceeeeeeseceeeeeeeeees 8 5 3 Anzahl der Proben die mit dem Kit getestet werden k nnen cc
2. Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 19 12 Schritt f r Schritt Anleitung 8 Pipettieren Sie je 5 0 uL Aliquot des SURVEYOR Nuclease Master Mix in jedes Reaktionsgef oder jede Vertiefung das bzw die 10 0 uL Aliquot des amplifizierten PCR Produkts enth lt siehe Schritt 3 oben 9 Wenn Sie mit dem Pipettieren fertig sind zentrifugieren Sie die 0 2 mL PCR Reaktionsgef e bzw die 96 Loch Mikrotiterplatte 10 Sekunden lang 10 Vortexen Sie die 0 2 mL PCR ReaktionsgefaBe bzw die 96 Loch Mikrotiterplatte vorsichtig 10 Sekunden lang 11 Zentrifugieren Sie 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit dieser Schritt ist besonders wichtig wenn der Verdau in einem Instrument ohne beheizten Deckel durchgef hrt wird 12 Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 42 C 13 F gen Sie jedem R hrchen bzw jeder Vertiefung 1 0 uL SURVEYOR Stop Solution PN 708030 hinzu leicht vortexen das SURVEYOR Nuclease Gesamtreaktionsvolumen betr gt 16 0 uL TIPP Die SURVEYOR Verdauprodukte k nnen bei lt 20 C bis zu einer Woche gelagert werden 14 Laden Sie die Probenverdaus auf das DHPLC System Anmerkung Empfohlene Gradienteneinstellungen f r die Analyse von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukte mit dem DHPLC System finden Sie auf http world transgenomic com diagnostic tools qenetic analysis kits crc rascan kits eu dhplicsystemsettings 13 Kontrollverfahren 13 1 Qualitatskontrolle f
3. enstandard ea Durchfluss G12D ergibt Ungespaltenes Fragmente von 74 190 bp Amplikon und 116 bp KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 2 G12D ergibt Probe 1 KRAS Exon 2 Fragmente von 74 Probe 2 KRAS Exon 2 und 116 bp Probe 3 KRAS Exon 2 DNA Gr enstandard Ungespaltenes 190 bp Amplikon Abbildung 4A und 4B WAVE DHPLC Analyse mit UV Abbildung 4A und Fluoreszenz Abbildung 4B Detektion von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten von KRAS Positive Control Exon 2 KRAS Control Wild Type und CRC DNA isoliert aus FFPE Schnitten Bei der Sichtpr fung der Chromatogramme sollten die verdauten Proben mit der Wild Type Control braune Linie verglichen werden Die KRAS Positive Control Exon 2 blaue Linie ist eine Mischung aus Wild Type und mutanten G12D Plasmiden die in Verdau Peaks zu 74 und 116 bp resultieren diese Kontrolle zeigt an dass der SURVEYOR Nuclease Verdauschritt funktioniert hat und weist auf dem Chromatogramm auf die Region zur Sichtpr fung hin die bestimmt ob eine Probe zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollte Beim Vergleich der Verdaumuster der Proben 1 3 mit dem Elektropherogramm des unverdauten Wild Type ist es offensichtlich dass Proben 1 amp 2 rote amp t rkisfarbene Linie m glicherweise Mutationen enthalten und sequenziert werden sollten um Anwesenheit oder Fehlen einer Mutation am entsprechenden Codon zu Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHP
4. SURVEYOR Eine neue Probe Nuclease nicht verdauen hinzugef gt Ungeschnittener Homoduplex SURVEYOR Eine neue Probe Undeutliche Peak Verdaul Nuclease Verdau verdauen Peaks wurde bei falscher Temperatur durchgef hrt meN Dt 4 5 F 7 8 9 y mn Problem 7 Unerwartete Peaks in SURVEYOR Nuclease Verdauspur DER SURVEYOR NUCLEASE VERDAU DER POSITIVE MOGLICHE L SUNG CONTROLS IST FEHLGESCHLAGEN URSACHE Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 41 Anhang B Mutation Probe befindet sich an sequenzieren igeschnittener ungew hnlicher um Mutation zu an Stelle best tigen Peak 2 Unerwartete Verdau Peaks Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 42 Anhang B Problem 8 Kontamination von Proben mit Positive Controls Verdaumuster stimmen mit Anwesenheit von gemischten gestempelten Regionen der Positive Controls und Wild Type Heteroduplices berein M GLICHE URSACHE Schlechte Pipettiertechnik Probe 1 Probe 2 Probe 3 Schlechte Pipettiertechnik Sequenzierung von NRAS Exon 2 Stempelregionen zeigt eine Kontamination der Probe Plasmidkontrolle stempel region von NRAS Exon 2 Region Codon 12 und 13 von NRAS Exon 2 Probe ist Wild Type Stempelsequenz ist vorhanden Kontaminiert Probe ist Mutant Keine Stempelsequenz G ltige Probe Al GAG CARE Probe is
5. 4B Probe 2 KRAS Exon 4B DHPLC Ungespaltenes Probe 3 KRAS Exon 4B Durchfluss 194 bp DNA Gr enstandard Amplikon A146T ergibt Fragmente von 78 und 116 bp KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 4B Probe 1 KRAS Exon 4B A146T ergibt Probe 2 KRAS Exon 4B Fragmente von 78 Probe 3 KRAS Exon 4B und 116 bp DNA Gr enstandard Abbildung 7A und 7B WAVE DHPLC Analyse mit UV Abbildung 7A und Fluoreszenz Abbildung 7B Nachweis von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten von KRAS Positive Control Exon 4B KRAS Control Wild Type und CRC DNA isoliert aus FFPE Schnitten Bei der Sichtpr fung der Chromatogramme sollten die verdauten Proben mit der Wild Type Control braune Linie verglichen werden Die KRAS Positive Control Exon 4B dunkelgr ne Linie ist eine Mischung aus Wild Type und mutanten A146T Plasmiden die in Verdau Peaks zu 78 und 116 bp resultieren diese Kontrolle weist darauf hin dass der SURVEYOR Nuclease Verdauschritt funktioniert hat und weist auf dem Chromatogramm auf die Region zur Sichtpr fung hin die bestimmt ob eine Probe zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollte Beim Vergleich der Verdaumuster der Proben 1 3 mit dem Elektropherogramm des unverdauten Wild Type ist es offensichtlich dass Probe 3 rote Linie m glicherweise eine Mutation enth lt und sequenziert werden sollte um Anwesenheit oder Fehlen einer Mutation am entsprechenden Codon zu best tigen Die Proben 2 und 3 schwarze und hellgr ne Linie ha
6. 9B WAVE DHPLC Analyse mit UV Abbildung 9A und Fluoreszenz Abbildung 9B Nachweis von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten von NRAS Positive Control Exon 3 und Wild Type Controls und CRC DNA isoliert aus FFPE Schnitten Bei der Sichtpr fung der Chromatogramme sollten die verdauten Proben mit der NRAS Control Wild Type gr ne Linie verglichen werden Die NRAS Positive Control Exon 3 blaue Linie ist eine Mischung aus Wild Type und mutanten Q61K Plasmiden die in Verdaupeaks zu 78 und 125 bp resultieren diese Kontrolle weist darauf hin dass der SURVEYOR Nuclease Verdauungsschritt funktioniert und gibt auf dem Chromatogramm die Region zur Sichtpr fung an mit der bestimmt werden sollte ob eine Probe zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollte Beim Vergleich der Verdauungsmuster der Proben 1 und 2 mit dem Wild Type das im Elektropherogramm verdaut ist ist es offensichtlich dass Probe 1 rot Linie m glicherweise eine Mutation enth lt und sequenziert werden sollten um die Anwesenheit oder das Fehlen einer Mutation am entsprechenden Codon zu best tigen Die Probe 2 schwarze Linie hat im Vergleich zur NRAS Control Wild Type ein hnliches Chromatogramm und muss nicht zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden Bitte beachten Sie dass das Sequenzierungsergebnis das endg ltige Ergebnis darstellt da es in derselben Fragmentgr e weitere nicht relevante Mutationen geben kann Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC
7. F r Master Mix 1 KRAS Exon 2 sind drei zus tzliche Reaktionen je Probenplatte erforderlich KRAS Control Wild Type KRAS Positive Control Exon 2 und die KRAS Exon 2 No Template Control NTC1 b F r Master Mix 2 KRAS Exon 3 sind drei zus tzliche Reaktionen je Probenplatte erforderlich KRAS Control Wild Type KRAS Positive Control Exon 3 und die KRAS Exon 3 No Template Control NTC2 c F r Master Mix 3 KRAS Exon 4A sind drei zus tzliche Reaktionen je Probenplatte erforderlich KRAS Control Wild Type die KRAS Positive Control Exon 4A und die KRAS Exon 4A No Template Control NTC3 d F r Master Mix 4 KRAS Exon 4B sind drei zus tzliche Reaktionen je Probenplatte erforderlich KRAS Control Wild Type die KRAS Positive Control Exon 4B und die KRAS Exon 4B No Template Control NTC4 e F r Master Mix 5 NRAS Exon 2 sind drei zus tzliche Reaktionen je Probenplatte erforderlich fur die NRAS Control Wild Type NRAS Positive Control Exon 2 und die NRAS Exon 2 No Template Control NTC5 f F r Master Mix 6 NRAS Exon 3 sind drei zus tzliche Reaktionen je Probenplatte erforderlich fur die NRAS Control Wild Type die NRAS Positive Control Exon 3 und die NRAS Exon 3 No Template Control NTC6 g Fur Master Mix 7 NRAS Exon 4 sind drei zusatzliche Reaktionen je Probenplatte erforderlich fur die NRAS Control Wild Type die NRAS Positive Control Exon 4 und die NRAS Exon 4 No Template Control NTC7 Anmerkung Berucksichtige
8. Hilfe ben tigen rufen Sie 888 233 9283 nur Nordamerika 1 402 452 5400 oder 44 0 141 892 8800 Europa an und fragen nach dem KRAS und NRAS support Alternativ k nnen Sie eine E Mail senden an SURVEYORscan Transgenomic com Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit mit den DHPLC Systemen Seite 5 4 R ckverfolgbarkeit der Kit Kontrollen 4 R ckverfolgbarkeit der Kit Kontrollen Die mit diesem Kit mitgelieferten Kontrollen sind Plasmidklone der Sequenzen KRAS und NRAS Exons 2 3 amp 4 Alle Klone wurden sequenziert um sie durch Vergleich mit der NCBI Reference Sequences auf Sequenztreue zu berpr fen NG_007524 1 KRAS und NG _007572 NRAS Die Kontrollen haben einen genetischen Stempel Siehe Anhang A 2 Kontroll DNA Stempel dabei handelt es sich um Variationen aus den KRAS oder NRAS Wild Type Sequenzen in einer Region wo keine Mutationen erwartet werden die verwendet werden k nnen um Probleme mit Probenkontamination durch Positive Controls zu erkennen Siehe Anhang B Fehlersuche Problem 8 f r ein Beispiel einer SURVEYOR Scan Spur einer solchen Kontamination Der KRAS Control Wild Type wurde durch Synthese und Klonierung von KRAS Exons 2 3 und 4 unter Verwendung von NCBI Reference Sequence NG_007524 1 konstruiert Die KRAS Positive Control Exon 2 wurde durch Synthese von KRAS Exon 2 unter Verwendung der NCBI Reference Sequence oben konstruiert enth lt aber die G12D Mutation Durc
9. Inc hat alle Anstrengungen unternommen um die Genauigkeit dieser bersetzung zu gew hrleisten Wenn Sie Fragen zu Angaben in dieser bersetzten Version des Handbuchs haben oder zu der englischen Version Instructions for Use for the CRC RAScanTM Combination Kit for DHPLC Systems 482427 EN unter http world Transgenomic com files literature 482427 EN pdf bitten wir Sie Kontakt mit Transgenomic unter support transgenomic com Aufzunehmen Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 44 Lizenzen Handelsmarken amp Copyright Lizenzen Handelsmarken amp Copyright SURVEYOR Nuclease Dieses Produkt wurde unter exklusiver Lizenz der US Patente 6 699 980 6 391 557 5 869 245 ihrer ausl ndischen Entsprechungen und weiterer anh ngiger Patente hergestellt F r die Verwendung von SURVEYOR Nuclease ist eine Lizenz von Transgenomic erforderlich Akademische Non Profit und For Profit Organisationen besitzen mit Kauf dieses Produkts eingeschr nkte Rechte die SURVEYOR Nuclease zu Forschungszwecken zu nutzen Ein Weiterverkauf bzw eine anderweitige Verwendung sind streng verboten F r weitere Informationen wenden Sie sich bitte an Transgenomic DNA Polymerase Die Verwendung dieses Produkts ist durch eine oder mehrere der folgenden US Patente sowie zugeh rige Patentanspr che au erhalb der USA gesch tzt 5 789 224 5 618 711 6 127 155 sowie Anspr che au erhalb der USA zugeh rig zu US Patent Nr 4 8
10. Linie hnliche Chromatogramme wie f r die NRAS Control Wild Type zeigen und nicht zur DNA Sequenzanalyse eingeschickt werden m ssen Bitte beachten dass f r positive Ergebnisse mit dem SURVEYOR Scan das Sequenzierungsergebnis das endg ltige Ergebnis darstellt da es in derselben Fragmentgr e weitere nicht relevante Mutationen geben kann Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 29 15 Leistungsmerkmale 15 Leistungsmerkmale 15 1 Nachweisgrenze von Mutationen mit SURVEYOR Scan Kits Die Validierung der SURVEYOR Scan Kits f r DHPLC Plattformen mit Plasmidklonen aller angezeigten Mutationen hat gezeigt dass SURVEYOR Nuclease Peaks in einer Mischung von 2 5 Mutant vor einem Wild Type Hintergrund nachgewiesen werden k nnen Der automatischen Sequenzierungszuordnung der Vorw rts und auch R ckw rtsstr nge gelingt es h ufig nicht Mutationen mit Werten unter 10 in Gemischen mit Wild Type DNA zu erfassen Zusammen mit den SURVEYOR Nuclease Ergebnissen ist es m glich die 5 10 mutanten SequenzierungsChromatogramm mit mehr Sicherheit zu interpretieren Wenn eine Probenanalyse ein positives SURVEYOR Scan Ergebnis zeigt aber mit der DNA Sequenzierung keine KRAS oder NRAS Mutation detektiert wird empfehlen wir dass Keine Variante erfasst als Ergebnis angegeben wird F r weitere Einzelheiten siehe berlegungen zum Arbeitsablauf 15 2 Sequenzbest tigung F r alle positiven SURV
11. Reagenzien Folgende Komponenten bzw Ausr stungen sind f r die Verwendung des CRC RAScan Combination Kit mit DHPLC zus tzlich erforderlich DHPLC System S ulen Puffer DNA Gr enstandard siehe Anhang A 3 1 DHPLC Spezifikationen f r SURVEYOR Scan Anwendungen f r Merkmale eines geeigneten DHPLC Systems zur Verwendung mit diesem Kit Hochreines Wasser f r die Molekularbiologie 0 2 mL PCR Reaktionsgef e Streifen oder 96 Loch Mikrotiterplatte Mikropipetten Pipettenspitzen Eisbad Vortexer Mikrozentrifuge Thermocycler Agarosegele und Ausr stung fur Agarosegel Elektrophorese 10 Bleiche oder ahnliches Reinigungsmittel 7 Reagenzienvorbereitung Alle Reagenzien dieses Kits sind gebrauchsfertig Einige Komponenten m ssen vor Gebrauch aufgetaut mit dem Vortexer gemischt oder in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert werden Einzelheiten siehe weiter unten unter Testverfahren Reagenzien m ssen zur Herstellung von Master Mix und Reaktionsgemischen gemischt werden Eine genaue Anleitung finden Sie im Abschnitt Testverfahren Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit mit den DHPLC Systemen Seite 9 8 Lagerung und Haltbarkeit 8 Lagerung und Haltbarkeit Das Kit muss bis zu seinem Gebrauch zwischen 18 C und 25 C in einem Gefrierschrank mit konstanter Temperatur aufbewahrt werden Achten Sie bei jedem erhaltenen Kit auf das Verfallsdatum Das Kit nicht mehr verwenden wenn das Verfallsdatum berschritten is
12. Sie eine 96 Loch Mikrotiterplatte verwenden bzw schlie en die 0 2 mL PCR Reaktionsgef e mit dem Deckel Vergewissern Sie sich dass die Deckel fest verschlossen sind ANMERKUNG Zur guten Laborpraxis geh rt die No Template Controls NTC in Vertiefungen zu geben die nicht an Positive Controls oder Proben angrenzen ANMERKUNG Als Vorschlag wie 96 Loch Mikrotiterplatte f r die Analyse von KRAS und NRAS Exons 2 4 anzulegen ist siehe Anhang A 1 Plattenlayout f r SURVEYOR Scan Kits Vortexen Sie 1 2 Geschwindigkeit 10 Sekunden lang Zentrifugieren Sie 1 2 Minuten lang um zu garantieren dass alle L sungen auf dem Boden der Vertiefung oder der R hrchen gesammelt werden Vergewissern Sie sich dass alle L sungen auf dem Boden jeder Vertiefung bzw jeden Reaktionsgef es sind Wenn dies nicht der Fall ist wiederholen Sie die Zentrifugation Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 17 12 Schritt f r Schritt Anleitung 12 6 Thermocycler Programm f r Amplifikationsprotokoll 1 Verwenden Sie folgendes Thermocycler Protokoll f r die PCR Amplifikation und Heteroduplex Bildung Initiale Denaturierung 95 C 5 Minuten Touchdown Amplifikation 95 C 30 Sekunden 15 Zyklen 62 C 0 5 C Zyklus 30 Sekunden 72 C 25 Sekunden Amplifikation 30 Sekunden 30 Zyklen 30 Sekunden 25 Sekunden 1 Zyklus 72 C 2 Minuten Heteroduplex Bildung 95 C 2 Minuten lt 12 C Hold 12
13. demselben oder einem anderen FFPE Schnitt F hren Sie die Reaktion mit Positive Control durch um die Enzymleistung zu verifizieren Nur frisch hergestellten SURVEYOR Nuclease Master Mix verwenden Anmerkung SURVEYOR Nuclease spaltet berwiegend bei Mismatches in Heteroduplices Das Verh ltnis von Heteroduplex zu Homoduplex in der hybridisierten Probe bestimmt das Verdausignal in der SURVEYOR Nuclease Wenn die KRAS oder NRAS Mutation in der genomischen DNA Probe in sehr geringer Konzentration vorliegt kann das Signal f r ein positives Ergebnis zu niedrig sein Es ist wichtig darauf zu achten dass der Hybridisierungsschritt im Thermocycler Programm enthalten ist siehe Amplifikationsprotokoll um die Leistung der Heteroduplexbildung zu optimieren Heteroduplices werden bei Standard PCR Reaktionen mit sehr geringem Ertrag gebildet Anmerkung Der Signal Rausch Abstand ist im Allgemeinen hoch genug um Mutationen mit einem geringeren Prozentsatz der Gesamt DNA Matrize nachzuweisen Es ist m glich bis 2 mutante DNA zu detektieren Abbildung 4 10 zeigt die mit Homoduplex und Heteroduplex KRAS und NRAS Positive Control DNAs in diesem Kit enthalten und FFPE Proben generierten Verdauprodukte auf einem WAVE DHPLC 4500 System Die Spaltprodukte sind deutlich als zwei neue Peaks zu erkennen die mit der erwarteten L nge eluiert wurden die anhand des DNA L ngenstandards berechnet werden k nnen Achtung Im Handel erh ltlich
14. jsp year 2013 amp releaselD 1820728 Peeters M et al 2013 Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase Ill study of metastatic colorectal cancer Clin Cancer Res 19 1902 12 De Roock W et al 2010 Association of KRAS p G13D mutation with outcome in patients with chemotherapy refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab JAMA 304 1812 20 Peeters M et al 2013 Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab J Clin Oncol 31 759 65 Andre T et al 2013 Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wild type metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy a GERCOR efficacy tolerance and translational molecular study Ann Oncol 24 412 9 Loupakis F et a 2009 KRAS codon 61 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild type metastatic colorectal cancer Br J Cancer 101 715 21 De Roock W et al 2010 Effects of KRAS BRAF NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy refractory metastatic colorectal cancer a retrospective consortium analysis Lancet Oncol 11 753 62 Qiu P et al 2004 Mutation detection using Surveyor nuclease Biotechniques 36 702 707 Kuang Y et al 2009 Noninvasive detection of EGFR T790M in
15. und Polymorphismen nachzuweisen Insbesondere wird die SURVEYOR Nuclease verwendet um bekannte Mutationen in einer Reihe von Genen zu best tigen die mit Nieren Lungen Kopf und Halskrebs sowie Leuk mie und Endometriumkarzinom in Verbindung gebracht werden Ebenso wurde das Enzym zur Ergebnisprognose einer Strahlentherapie eingesetzt Das CRC RAScan Combination Kit wurde zur Spaltung von Mismatches in KRAS und NRAS Exons 2 3 amp 4 und der anschlie enden Analyse mit DHPLC entwickelt Anmerkung Wenn eine Probe 100 mutante DNA ist k nnen keine Heteroduplices gebildet werden und die Probe erscheint als Wild Type Proben aus Tumorbiopsien enthalten allerdings aufgrund der Tumorheterogenit t und oder kontaminierendem normalen Gewebe Wild Type Zellen bitte beachten Sie dass Proben mit 5 und 95 mutanter DNA identische Chromatogramm ergeben Anmerkung F r diesen Test ausschlie lich die mit diesem Kit mitgelieferte DNA Polymerase verwenden Anmerkung Befolgen Sie bitte die spezifischen Anleitungen im Bedienungshandbuch Ihres DHPLC Systems Um dieses Kit erfolgreich einzusetzen wird dringend angeraten diese Bedienungsanleitung sorgf ltig durchzulesen und alle darin gegebenen Anleitungen und Richtlinien genau zu befolgen Personen die diesen Test zum ersten Mal durchf hren sollten die in Abschnitt Verwendung der Kontrollplasmid DNAs beschriebenen Kontrolluntersuchungen durchf hren Falls Sie weitere Fragen haben oder
16. 10077 Diese Bedienungsanleitung ist auch als Download erh ltlich unter http world transgenomic com files literature 482427 DE pdf 2 2 Angaben zum Gebrauch Mediziner k nnen den CRC RAScan Combination Kit fur DHPLC Systeme als Hilfe bei der Entscheidung verwenden ob Patienten mit kolorektalem Karzinom auf eine Therapie mit Anti EGFR Epidermal Growth Factor Receptor bzw epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor Therapeutika wie Panitumumab ansprechen Das CRC RAScan Combination Kit darf nicht zur Diagnose von kolorektalem Karzinom oder anderen Krebsarten verwendet werden Das CRC RAScan Combination Kit ist ein Test der die Anwesenheit potenzieller somatischer Mutationen in Exons 2 3 amp 4 des KRAS und NRAS Gens nachweist aber nicht die Sequenzidentitat der Mutation bestatigt Um nachzuweisen um welche Mutation es sich genau handelt sind weitere Untersuchungen wie zum Beispiel eine DNA Sequenzierung erforderlich Wenngleich die mit diesen Kits erhaltenen Ergebnisse ein Hinweis auf den Mutationsstatus eines Patienten sind m ssen jedoch weitere klinische Faktoren ber cksichtigt werden Die Ergebnisse mit dem CRC RAScan Combination Kit d rfen nicht als die einzige Methode zur Entscheidungsfindung einer Behandlung von Patienten mit kolorektalem Karzinom herangezogen werden Es ist wichtig darauf hinzuweisen dass die DHPLC mit diesem Kit zur Identifikation von Proben mit positivem Testergebnis f r eine KRAS oder NRAS Mutation nu
17. 7 Qualit tskontrolle der PCR Produkte 1 Bevor Sie mit dem SURVEYOR Nuclease Verdau fortfahren m ssen Qualit t und Quantit t des Amplikons durch Gelelektrophorese oder quivalente Mittel gepr ft werden 2 Analysieren Sie ein Aliquot des PCR Produkts zusammen mit mehreren verschiedenen Mengen einer 100 bp DNA Basenpaarleiter 3 Verwenden Sie die Basenpaarleiter um die Konzentration amplifizierter DNA zu berechnen 4 Es sollte nur eine einzige dem Haupt PCR Produkt entsprechende Bande gr er als 20 ng uL verzeichnet werden 5 Falls mehrere Bande vorhanden sind vergewissern Sie sich dass die Qualit t der Eingangsmatrizen DNA ausreichend war siehe Anhang B Fehlersuche 6 Falls kein Produkt zu sehen ist vergewissern Sie sich dass die Qualit t der Eingangsmatrizen DNA ausreichend war siehe Anhang B Fehlersuche Wenn die Qualit t den Spezifikationen entspricht erh hen Sie das Volumen der Matrize auf 4 0 uL je 50 uL Reaktion Verh ltnis von Wasser zu Reaktion auf 31 0 uL reduzieren 7 In der No Template Control d rfen keine PCR Produkte zu sehen sein Wenn bei dieser Kontrolle DNA Produkte nachweisbar sind liegt wahrscheinlich eine Kontamination vor siehe Anhang B Fehlersuche 8 Bewerten Sie die PCR als starke PCR oder schwache PCR a Eine starke PCR muss eine Einzelbande haben die gleich oder gr er als 20 ng uL ist b Eine schwache PCR muss eine Einzelbande haben die k
18. 89 818 Der Kauf dieses Produkts schlie t ein eingeschr nktes nicht bertragbares Nutzungsrecht dieses Produkts f r eigene Forschungszweck des K ufers ein Es wird damit kein Recht unter einem anderen Patentanspruch wie die patentierten 5 Nuclease Verfahrensanspriche unter US Patent Nummern 5 210 015 und 5 487 972 kein Recht zur Durchf hrung einer patentierten Methode sowie kein Recht zur Durchf hrung jedweder kommerzieller Dienstleistungen insbesondere die bermittlung von Ergebnisse der T tigkeiten von Erwerbern gegen ein Honorar oder andere wirtschaftliche Gegenwerte weder ausdr cklich noch implizit bzw durch Rechtsverwirkung abgetreten Dieses Produkt dient ausschlie lich Forschungszwecken F r die diagnostische Verwendung unter Roche Patenten ist eine separate Lizenz von Roche erforderlich F r weitere Informationen ber den Erwerb von Lizenzen wenden Sie sich an den Director of Licensing Applied Biosystems 850 Lincoln Centre Drive Foster City California 94404 USA Transgenomic SURVEYOR und WAVE sind eingetragene Marken und Navigator CRC RAScan das Helix Logo und Advancing Personalized Medicine sind Marken von Transgenomic Inc Alle anderen Marken sind das Eigentum ihrer jeweiligen Inhaber 2013 Transgenomic Inc Alle Rechte vorbehalten Gedruckt in den USA Dokument Nr 482427 DE rev 01 Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPLC Systemen Seite 45
19. AS Primer Exon 2 Reverse 10 uM Blau 125 uL 710157R KRAS Primer Exon 3 Reverse 10 uM 710154F KRAS Primer Exon 4A Forward 10 uM Blau 90 uL 710154R KRAS Primer Exon 4A Reverse 10 uM Blau 90 uL 710156F KRAS Primer Exon 4B Forward 10 uM Blau 90 uL 710156R KRAS Primer Exon 4B Reverse 10 uM Blau 90 uL 710131 KRAS Control Wild Type Gelb 120 uL 710135 KRAS Positive Control Exon 2 Gr n 40 uL 710136 KRAS Positive Control Exon 3 Gr n 40 uL 710137 KRAS Positive Control Exon 4A Gr n 40 uL 710138 KRAS Positive Control Exon 4B Gr n 40 uL 710153F Universal Sequencing Primer 1 10 uM Orange 125 uL 710153R Universal Sequencing Primer 2 10 uM Orange 125 uL Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit mit den DHPLC Systemen Seite 7 5 Komponenten 5 2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exon 2 3 amp 4 Karton h 710400 Der Karton mit den Komponenten zur Analyse von NRAS Exon 2 3 und 4 enth lt zwei Schachteln 1 eine SURVEYOR Schachtel mit Verdau Komponenten mit 10 Reagenzgef en ohne leer L cher und 2 einer u eren Halterung f r PCR Komponenten und Kontrollr hrchen mit 14 Reagenzgef en Kit f r 100 Testreaktionen gelieferte Menge Katalog nummer Reaktionsgef Kit Komponente Deckelfarbe SURVEYOR Schachtel mit Verdau Komponenten 710160 710161 708049 708027 708030 SURVEYOR Nuclease W SURVEYOR Enhancer W2 SURVEYOR Enhancer Cofactor 0 15 M MgCl Solution SURVEYOR Stop Solution Vio
20. C Systemen Seite 6 5 Komponenten 5 Komponenten Das CRC RAScan Combination Kit wird in zwei Kartons in einer Schutzh lle geliefert a ein Karton mit Reagenzien zur Analyse von KRAS Exons 2 3 und 4 und b ein Karton mit Reagenzien zur Analyse von NRAS Exons 2 3 und 4 Zusammen sind in den Kartons ausreichend Reagenzien vorhanden um die wie in Abschnitt 5 3 aufgef hrte Anzahl Analysen durchzuf hren 5 1 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2 3 amp 4 Karton h 710107 Der Karton mit den Komponenten zur Analyse von KRAS Exons 2 3 und 4 enth lt zwei Schachteln 1 eine SURVEYOR Schachtel mit Verdau Komponenten mit 10 Reagenzgef en und 2 einer u eren Halterung f r PCR Komponenten und Kontrollr hrchen mit 20 Reagenzgef en Kit f r 130 Testreaktionen gelieferte Menge Katalog nummer l Reaktionsgef Kit Komponente Deckelfarbe SURVEYOR Schachtel mit Verdau Komponenten 710160 SURVEYOR Nuclease W Violett 3 x 105 uL 710161 SURVEYOR Enhancer W2 Schwarz 2 x 105 uL 708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor Rosa 2 x 105 uL 708027 0 15 M MgCl Solution Braun 2 x 105 uL 708030 Stop Solution Rot 250 uL PCR Box mit Komponenten und Kontrollen 703310 DNA Polymerase Durchsichtig 2 x 100 uL 703315 10x DNA Polymerase Reaction Buffer Durchsichtig 1 mL 703065 dNTPs 10 mM Durchsichtig 2 x 500 uL 710155F KRAS Primer Exon 2 Forward 10 uM Blau 125 uL 710157F KRAS Primer Exon 3 Forward 10 uM Blau 90 uL Blau 90 uL 710155R KR
21. Der NRAS Control Wild Type wurde durch Synthese und Klonierung von NRAS Exons 2 3 und 4 unter Verwendung der NCBI Reference Sequence NG_007572 konstruiert Das NRAS Positive Control Exon 2 wurde durch Synthese von NRAS Exon 2 unter Verwendung der NCBI Reference Sequence oben konstruiert enthalt aber die G12D Mutation Durch DNA Sequenzierung wurde best tigt dass die einzige Anderung in der Sequenz von Codon 12 in einer G12D GGT gt GAT Alteration vorliegt Dieser Klon wird dann mit NRAS Control Wild Type DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten Das NRAS Positive Control Exon 3 wurde durch Synthese von NRAS Exon 3 unter Verwendung der NCBI Reference Sequence oben konstruiert enth lt aber die Q61K Mutation Durch DNA Sequenzierung wurde best tigt dass die einzige Anderung in der Sequenz von Codon 61 in einer Q61K Alteration CAA gt AAA vorliegt Dieser Klon wird dann mit NRAS Control Wild Type DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten Das NRAS Positive Control Exon 4 wurde durch Synthese von NRAS Exon 4 unter Verwendung der NCBI Reference Sequence oben konstruiert enth lt aber die A146T Mutation Durch DNA Sequenzierung wurde best tigt dass die einzige Anderung in der Sequenz von Codon 146 in einer A146T Alteration GCC gt ACC vorliegt Dieser Klon wird dann mit NRAS Control Wild Type DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPL
22. Diese Aktivit t wird durch den SURVEYOR Enhancer W2 und seinen Cofactor unterdr ckt ohne ansonsten die Mismatch Spaltreaktionen negativ zu beeintr chtigen SURVEYOR Enhancer W2 und SURVEYOR Enhancer Cofactor sind in diesem Kit enthalten und sollten immer verwendet werden Wenn dieses Anschneiden weiter auftritt werden kleine Peaks auf dem DHPLC System erzeugt Der Wild Type Control Verdau zeigt dieselben kleinen Peaks Dieser Vergleich wird verwendet um Unterschiede in den Mustern der Chromatogramm zwischen Wild Type Control und der getesteten Proben aufzufinden Es wird beim Vergleich vom Muster der Probe mit der Wild Type Control angewendet Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 40 Anhang B Problem 5 Peaks des SURVEYOR Nuclease Verdaus bei Negativkontrollen MOGLICHE s VERDAU PEAKS BEI NEGATIVKONTROLLEN URSACHE LOSUNG Schwaches Signal Kontamination von Alle Kit Verdau Peaks bei Wild Type Kit Bestandteile mit Komponenten KRAS oder NRAS entsorgen und ein Amplikons oder neues Kit Plasmidkontrollen verwenden Kontrolle Kontaktieren Sie den Technischen Kundendienst von Transgenomic um potenzielle Ungeschnittener Ursachen und Homoduplex a Quellen der Kontamination zu besprechen Problem 6 Fehlgeschlagene SURVEYOR Nuclease Ergebnisse DER SURVEYOR NUCLEASE VERDAU DER M GLICHE POSITIVE CONTROLS IST FEHLGESCHLAGEN URSACHE LOSUNG
23. EE EE O EONI 36 ANNaNG B eo AE nee 37 FEMO UE ee a een ee 37 Einzelheiten zur Bestellung uussuunnnunennnnnnnnnnnnnnnnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnennnnnnnennnn 44 IR OMTAKIG ALON iscsi ARE NERBENE NER EEE NEE EURE EEE CE EREUR DEINER E BEER NENNENHERE EEE SE NERNERNESE IE OR EEIERAERNERHREEEN 44 bersetzungseinschr nkung 2uu2uu2220020000000000000nnannnnunnnnunnunnnnunnunnnnunnnnunnnnnnnunnunnnnnnnnnn 44 Lizenzen Handelsmarken amp Copyright nn2u22an0nn00n0nnnonnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nun 45 1 Hersteller 1 Hersteller Transgenomic Inc Hersteller M 12325 Emmet Street Omaha NE 68164 USA Tel 1 402 452 5400 Vertreter in der Transgenomic Limited EU 40 Watt Road Hillington Park Glasgow G52 4RY UK Tel 44 141 892 8800 2 CRC RAScan Combination Kit 2 1 Verwendungszweck Anwendung nur durch Fachpersonal Das CRC RAScan Combination Kit von Transgenomic ist ein In vitro Diagnostikum zum Nachweis von somatischen Mutationen in Exons 2 3 amp 4 des KRAS und NRAS Gens Diese Mutationen werden durch SURVEYOR Nuclease Spaltpeaks angezeigt und enthalten jene Mutationen mit bekanntem Potenzial f r klinische Signifikanz Dieses Kit ist f r den Gebrauch in einem Labor f r klinische Diagnostik durch entsprechend ausgebildetes Fachpersonal vorgesehen Getestet wird DNA die aus formalinfixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe extrahiert wird Dieses Kit hat die Katalognummer 7
24. EYOR Scan Ergebnisse mit einer Sequenzbest tigung fortfahren um die Sequenzidentit t der Mutationen KRAS oder NRAS Exons 2 3 oder 4 zu bestimmen Abbildung 11 stellt ein Beispiel f r die Bedeutung einer Sequenzbest tigung dar f r die Bestimmung der exakten Mutation Bei einem negativen Ergebnis des SURVEYOR Scan keine Sequenzbest tigung durchf hren Die Probe kann als Wild Type oder Keine Variante festgestellt No Variant Detected angegeben werden Zur Sequenzbest tigung sollten die in diesem Kit enthaltenen Universal Sequencing Primer verwendet werden Der Vorw rts Primer hat die PN 710153F Universal Sequencing Primer 1 der R ckw rts Primer die PN 710153R Universal Sequencing Primer 2 Probe 1 G13C Probe 2 G13D Abbildung 11 Sequenzanalyse von Proben mit demselben KRAS Exon 2 SURVEYOR Nuclease Verdaumuster Die Proben 1 und 2 oben zeigen nach SURVEYOR Nuclease Verdau dasselbe DHPLC Peakmuster und wurde mit DNA Sequenzierung weiter analysiert Die Sequenzierung zeigt dass sie 2 unterschiedliche Mutationen sind G13C und G13D Diese Proben zeigen a die F higkeit der SURVEYOR Nuclease potenzielle Mutationen nachzuweisen und b das Unverm gen den genauen Mutationsort oder die spezifische Alteration der Basen einer oder mehrerer Mutation en in einer Probe nachweisen Anmerkung Es ist wichtig in jedem Sequenzierungselektropherogramm auf das Fehlen der Stempel Sequenz zu pr fen um zu best tigen dass die Muta
25. LC Systeme Seite 23 14 Interpretation der Ergebnisse best tigen Die Probe 3 gr ne Linie hat im Vergleich zur Wild Type Control hnliche Chromatogramme und muss nicht zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden Bitte beachten Sie dass das Sequenzierungsergebnis das endg ltige Ergebnis darstellt da es in derselben Fragmentgr e weitere nicht relevante Mutationen geben kann KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 3 Probe 1 KRAS Exon 3 Probe 2 KRAS Exon 3 DHPLC Probe 3 KRAS Exon 3 Be Durchfluss DNA Gr enstandard Abbildung 5A Q61H ergibt Ungespaltenes Fragmente von 65 200 bp und 135 bp Amplikon DHPLC Wash off KRAS Control Wild Type Q61H ergibt Fragmente von 65 und 135 bp KRAS Control Exon 3 Probe 1 KRAS Exon 3 Probe 2 KRAS Exon 3 Probe 3 KRAS Exon 3 DNA Gr enstandard lt 4 Ungespaltenes 200 bp Amplikon Abbildung 5A und 5B WAVE DHPLC Analyse mit UV Abbildung 5A und Fluoreszenz Abbildung 5B Detektion von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten von KRAS Positive Control Exon 3 KRAS Control Wild Type und CRC DNA isoliert aus FFPE Schnitten Bei der Sichtprufung der Chromatogramme sollten die verdauten Proben mit der Wild Type Control braune Linie verglichen werden Die KRAS Positive Control Exon 3 gr ne Linie ist eine Mischung aus Wild Type und mutanten Q61H Plasmiden die in Verdau Peaks zu 65 und 135 bp resultieren diese Kontrolle weist darauf hin dass der SURVEYOR Nuclease Verd
26. OR Nuclease Reaktionen erfordert h ufigere und strengere Reinigungsprotokolle als f r die normale PCR Probenanalyse F r weitere Einzelheiten siehe die Anweisungen Ihres DHPLC Systems Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 34 Anhang A A 4 Laboreinrichtung f r PCR Tests Um zuverl ssige und kontaminationsfreie PCR Ergebnisse zu erhalten halten Sie sich bei der Einrichtung der PCR Labors an die gute Laborpraxis Denken Sie bei der Planung des Laboraufbaus an den Bedarf an r umlicher Trennung der Arbeitsbereiche Pr Amplifikation und Post Amplifikation Es ist wichtig Folgendes zu trennen i DNA Isolierung ii Pra Amplifikation und iii Post PCR Aktivitaten wie das Offnen von R hrchen mit amplifizierter Probe f r die Durchf hrung von Gelelektrophoresen oder zum Vorbereiten anderer Tests wie SURVEYOR Nuclease Verdau und DNA Sequenzierung Es ist auch wichtig dass Laborverbrauchsmaterial und Laborausr stung speziell f r diese Arbeitsbereiche gekennzeichnet sind und ausschlie lich in diesem Bereich verwendet werden Abwischen von Oberfl chen mit einer w chentlich frisch zubereiteten Bleiche 10 v v ist hilfreich bei der Elimination von DNA Fragmenten lt 500 bp als Matrizen f r PCR Dar ber hinaus kann es n tzlich sein Kunststoffprodukte und L sungen mit einem UV Crosslinker 7 10 Minuten kurzwelliger UV Strahlung auszusetzen Anmerkung Enzyme und DNA die amplifiziert wer
27. Systeme Seite 28 14 Interpretation der Ergebnisse Abbildung 10A NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 4 Probe 1 NRAS Exon 4 Probe 2 NRAS Exon 4 Ungespaltenes DNA Gr enstandard 233 bp DHPLC Amplikon Durchfluss DHPLC Wash off sp len A146T ergibt Fragmente von 68 und 165 bp NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 4 Probe 1 NRAS Exon 4 A146T ergibt Probe 2 NRAS Exon 4 600 Fragmente von 68 DNA Gr enstandard und 165 bp Ungespaltenes Da 233 bp Amplikon Abbildung 10A und 10 WAVE DHPLC Analyse mit UV Abbildung 10A und Fluoreszenz Abbildung 10B Nachweis von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten von NRAS Positive Control Exon 4 und Wild Type Controls und CRC DNA isoliert aus FFPE Schnitten Bei der Sichtpr fung der Chromatogramme sollten die verdauten Proben mit der NRAS Control Wild Type gr ne Linie verglichen werden Die NRAS Positive Control Exon 4 blaue Linie ist eine Mischung aus Wild Type und mutanten A146T Plasmiden die in Verdaupeaks zu 68 und 165 bp resultieren diese Kontrolle weist darauf hin dass der SURVEYOR Nuclease Verdauungsschritt funktioniert und gibt auf dem Chromatogramm die Region zur Sichtpr fung an mit der bestimmt werden sollte ob eine Probe zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollte Beim Vergleich der Verdauungsmuster der Proben 1 und 2 mit dem Wild Type verdauten Elektropherogramm ist es offensichtlich dass Proben 1 und 2 rot und schwarze
28. ZELNEN amplifizierten Spezies der richtigen L nge erzeugen F r die PCR muss die in diesem Kit mitgelieferte DNA Polymerase und der DNA Polymerase 10X PCR Buffer verwendet werden Amplikons aus Kontrollen m ssen mit der SURVEYOR Nuclease verdaut und analysiert werden um durch Sichtprufung der Chromatogrammprofile st rendes Hintergrundrauschen auszuschlie en siehe Beispielergebnisse Abbildung 4 10 Kontrollieren Sie vor dem Verdau jedes amplifizierte DNA Produkt durch Gelelektrophorese oder durch Analyse mit dem DHPLC System um sicherzugehen dass es eine einzelne Spezies der erwarteten L nge ist Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 38 Anhang B Problem 3 Keine Spaltprodukte bei der Analyse nach SURVEYOR Nuclease Behandlung der Heteroduplices M GLICHE KEINE SPALTPRODUKTE URSACHE Anteil an Mismatch Ziel zu gering Ineffiziente Bildung von Position der Heteroduplices fehlenden Heteroduplices EEE rt N u ey 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 Ungeschnittener Homoduplex Peak Inaktive SURVEYOR Nuclease L SUNG Test anhand der Kontrollen berpr fen F hren Sie das PCR und Hybridisierungsverfahren genau nach Anleitung durch Verwenden Sie f r den SURVEYOR Nuclease Verdau frisch hybridisierte DNA Wiederholen Sie die PCR Amplifikation mit 1 derselben Menge DNA Matrize 2 erh hen Sie die Menge Start DNA oder 3 isolieren Sie frische DNA von
29. analyse durchf hren Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 20 13 Kontrollverfahren 13 2 Verwendung von Kontrollplasmid DNAs Mit dem Kit werden neun Kontroll DNAs geliefert KRAS Control Wild Type PN 710131 KRAS Positive Control Exon 2 PN 710135 KRAS Positive Control Exon 3 PN 710136 KRAS Positive Control Exon 4A PN 710137 KRAS Positive Control Exon 4B PN 710138 NRAS Control Wild Type PN 710441 NRAS Positive Control Exon 2 PN 710442 NRAS Positive Control Exon 3 PN 710443 NRAS Positive Control Exon 4 PN 710444 Diese Kontroll DNAs sind Plasmide mit Insertionen Die Positive Controls enthalten jeweils zwei Plasmide eine Mischung aus KRAS oder NRAS Control Wild Type und einem Mutationsklon der sich vom Wild Type in einem einzigen Basenpaar unterscheidet Die Kontrollen werden in getrennten Reagenzgef en geliefert jede in einer Konzentration von 10 Kopien uL KRAS und NRAS Exons 2 3 und 4 Forward und Reverse PCR Primer die f r die PCR Amplifikation ben tigt werden werden in den Kitkartons separat geliefert Bitte befolgen Sie beim Gebrauch dieser Kontrollen die Anweisungen in Amplifikationsprotokoll SURVEYOR Nuclease Verdau und Analyse von KRAS und NRAS Exons 2 3 amp 4 mit der SURVEYOR Nuclease ES WIRD PERSONEN DIE DIESEN TEST ERSTMALS AUSF HREN DRINGEND EMPFOHLEN ZUNACHST TESTS MIT KONTROLLEN DURCHZUF HREN BEVOR SIE GENOMISCHE PROBEN BEARBEITEN 14 Interpretatio
30. auschritt funktioniert hat und weist auf dem Chromatogramm auf die Region zur Sichtpr fung hin die bestimmt ob eine Probe zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollte Beim Vergleich der Verdaumuster der Proben 1 3 mit dem Elektropherogramm des unverdauten Wild Type ist es offensichtlich dass Probe 2 schwarze Linie m glicherweise eine Mutation enth lt und sequenziert werden sollte um Anwesenheit oder Fehlen einer Mutation am entsprechenden Codon zu best tigen Die Proben 1 und 3 blaue und rote Linie haben im Vergleich zur Wild Type Control hnliche Chromatogramme und m ssen nicht zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden Bitte beachten Sie dass das Sequenzierungsergebnis das endg ltige Ergebnis darstellt da es in derselben Fragmentgr e weitere nicht relevante Mutationen geben kann Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 24 14 Interpretation der Ergebnisse Abbildung 6A KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 4A Probe 1 KRAS Exon 4A Probe 2 KRAS Exon 4A DHPLC DNA Gr enstandard Durchfluss K117N ergibt Ungespaltenes Fragmente von 80 168 bp und 88 bp Amplikon KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 4A Probe 1 KRAS Exon 4A Probe 2 KRAS Exon 4A K117N ergibt DNA Gr enstandard Fragmente von 80 und 88 bp Ungespaltenes 168 bp Amplikon Abbildung 6A und 6B WAVE DHPLC Analyse mit UV Abbildung 6A und Fluoreszenz Abbildung 6B Nachweis von SURVEYOR Nuc
31. cceeececcsseeeeeeeeeeeeetees 8 MINA SOC ZI SF INE ee een leben 9 6 Zus tzlich erforderliche Ausr stung und Reagenzien cccccecseeseseeesseeneeeeeeeeeseeees 9 7 Reagenzienv rbereltUng eussuuscanes indian E aE nahe 9 8 Lagerung und Haltbarkeit uu22000 200000000nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nn nnnnnnnunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn 10 9 Warnhinweise amp Vorsichtsma nahmen 22242220000n 0an0000nnnnnnnnnnnnnn nn nnnnnunnnnnnnnnnnnnn 10 10 Prim re Probenentnahme Handhabung und Lagerung uu z 00000000000nnnnnan nn 10 11 TESIVErTanreN cuisine eat E aan ende nennen neueren een 11 11 1 Somatischer Mutationsnachweis mit SURVEYOR Scan Kits Ein berblick 11 12 Schritt f r Schritt Anleitung 242222200000000000nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nn nn nnnnnnnnnnnnnnnnnn nun 12 12 1 DHPLC Grundeinstellung Kalibration ccccccccccessssccecceeecessssceescecseessseceeeesesssueeseeeeeeegs 12 12 2 berlegungen vor Beginn der KRAS und NRAS Probenanalyse uuanaeesasenansnennnnenenennennns 12 12 3 berlegungen zu den Matrizen ccccccsssccsssccssescssscsssccsssscssssssccsssscssesossscsssescssssenseessnsens 12 12 4 berlegungen zum Arbeitsablauf unseesseensesensennnnennnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnannnnnnnnn 12 12 5 Amplifikationsprotok6ll un 15 12 6 Thermocycler Programm f r Amplifikationsprotokoll s02222200002220000 een 18 12 7 Qualita
32. d Verschlusskappen nach dem Verschlie en der Kontroll DNA R hrchen mit einem DNA Zerst rungsmittel ab z B 10 Bleiche bevor Sie sie in einen anderen Bereich bringen e Achten Sie darauf dass es beim Pipettieren in die 96 Loch Mikrotiterplatte beispielsweise durch Verspritzen w hrend des Mischens oder durch nicht gewechselte Pipettenspitzen nicht zu einer Kontamination der Proben in den angrenzenden Vertiefungen kommt Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPLC Systemen Seite 31 Anhang A Anhang A A 1 Plattenlayout f r SURVEYOR Scan Kits Das vorgeschlagene Plattenlayout gilt f r die gleichzeitige Durchf hrung aller sieben KRAS und NRAS Exons mit der SURVEYOR Scan Analyse an 10 Proben 1 2 3 s 6 T 3 9 10 1 Fl A KRAS KRASEx2 KRASEx2 Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe EX2 WT Mut 1 2 3 4 a 6 T g 3 10 Schl ssel Ex Exon WT Wild Type Mut Mutation NTC No Template Control A 2 Kontroll DNA Stempel Im Folgenden werden die Sequenzen mit einem Stempel angegeben Schl ssel Die h ufigsten Mutationsregionen sind Mile markiert Die Sequenz in GROSSBUCHSTABEN stellen codierende Basen dar die Sequenz in Kleinbuchstaben stellen nicht codierende Basen dar Die Kontrollen haben genetische Stempel die Gelb markiert sind diese Variationen von der KRAS oder NRAS Wild Type Sequenz in einem Bereich in dem keine Mutationen erwartet werden k nnen verwendet werden um P
33. den sollen d rfen nicht mit UV Strahlung behandelt werden Zur Reduzierung von Kontamination vorschriftsm ige Schutzkleidung tragen h ufig Handschuhe wechseln und bevor man sich zum Arbeitsbereich begibt die behandschuhten H nde mit 10 v v Bleiche abwischen Die Einrichtung sollte zumindest der Zweiraumaufteilung in dem Diagramm unten entsprechen die speziell f r PCR und Analysen mit der SURVEYOR Nuclease entwickelt wurde Empfohlene Organisation eines PCR Labors SURVEYOR Scan Analyse plattform UV Cross linker PCR Arbeits PCR platz mit Arbeits nate 20 C l HEPA i i platz mit Gefrier Leichter Filter und u Leicnter HEPA schank Luft berdruck UV Licht al Luftunterdruck Filter und UV Licht 209C Gefrier Micro Merne schank 2 Unterbauk hlschr nke zentrifuge mit 4 2C Mikro zentrifuge zentrifuge f r Mikro phorese Gelelektro f r Mikro titerplatten phoresen titerplatten PCR Arbeitsplatz mit HEPA Filter und UV Licht Labor fur PCR Extra kti on gt Post PCR Labor lifikati Probendurchlauf f r PCR und und Amp INKAauonN SURVEYOR Scan Analyse Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 35 Anhang A A 5 Literaturnachweis iP 10 11 Amgen News Release 2013 New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix panitumumab in patients with metastatic colorectal cancer http wwwext amgen com media media_ pr _ detail
34. die Master Mix Zentrifugenr hrchen Mischen Sie vor Gebrauch die Zentrifugenr hrchen mit dem Master Mix mit dem Vortexer 30 Sekunden und zentrifugieren sie dann kurz an 10 Sekunden Lagern Sie diese bis zum Gebrauch auf Eis Pipettieren Sie 48 0 uL siehe Anmerkung oben in Schritt 6 Master Mix in die entsprechenden Vertiefungen Wechseln Sie bei Verwendung einer Einkanalpipette jedes Mal die Spitze Wenn Sie eine Dispenserpipette verwenden achten Sie darauf dass von Vertiefung zu Vertiefung nichts verspritzt wird Halten Sie die Platte auf Eis F gen Sie in die entsprechenden Vertiefungen 2 0 uL siehe Anmerkung oben in Schritt 6 der Probenmatrizen DNAs oder Wasser No Template Control NTC hinzu Verwenden Sie neue Pipettenspitzen f r jede Probe und vermeiden Sie die Kreuzkontamination durch Verspritzen Verschlie en Sie die Vertiefungen mit den Proben DNAs und dem NTC mit dem 8 Verschlussstreifen bei Verwendung einer 96 Loch Mikrotiterplatte bzw die 0 2 mL PCR Reaktionsgef e mit ihren Deckeln Vergewissern Sie sich dass die Deckel fest verschlossen sind ffnen Sie erst jetzt die R hrchen mit den Kontrollmatrizen DNAs PNs 710131 710135 710136 710137 710138 710441 710442 710443 amp 710444 und zwar eines nach dem anderen Pipettieren Sie diese Kontrollmatrizen zuletzt um das Risiko einer Kontamination der Proben DNA zu verringern Verschlie en Sie jede Vertiefung wieder mit den 8 Verschluss Streifen wenn
35. e PCR Puffer unterscheiden sich stark in der Zusammensetzung und h ufig ist die Zubereitung vom Hersteller nicht genau gekennzeichnet Mehrere Puffer sind aufgrund von pH oder Zusatzstoffen Tensiden oder anderen herstellereigenen Inhaltsstoffen mit Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPLC Systemen Seite 39 Anhang B der SURVEYOR Nuclease NICHT kompatibel Verwenden Sie KEINE andere als die im Kit enthaltenen Polymerase oder 10X Polymerase Puffer Problem 4 Hohes Hintergrundrauschen nach SURVEYOR Nuclease Behandlung MOGLICHE URSACHE Nicht optimaler F hren Sie folgende Hybridisierungsschritt Schritte durch HOHES HINTERGRUNDRAUSCHEN L SUNG 1 Vergewissern Sie sich dass sich die DNA Konzentration im Bereich gt 12 5 ng uL befindet Wiederholen Sie den Schritt Heteroduplex Bildung achten Sie N dabei darauf das t empfohlene Verfahren einzuhalten siehe DHPLC mit 1271 Durch verrauschter fluss Basislinie DNA Menge zu berpr fen Sie die niedrig Ergiebigkeit und Qualit t der DNA Matrize Nicht spezifische berpr fen Sie die PCR Produkte Ergiebigkeit und Qualit t der DNA Matrize SURVEYOR berpr fen Sie das Enhancer W2 Ablaufdatum des Kits und oder SURVEYOR Enhancer Cofactor wurden deaktiviert Anmerkung Die SURVEYOR Nuclease schneidet gelegentlich bei doppelstr ngigen DNAs an zuf llig ausgew hlten Gen Orten ein Dies erzeugt nach dem Verdau ein Hintergrundrauschen
36. eitsschritten Schritt 1 Mit PCR Proben DNA amplifizieren v Schritt 2 SURVEYOR Nuclease Spaltung v Schritt 3 Fragmentanalyse nach Gr e mit DHPLC Schritt 1 Vorbereiten der PCR Amplikons aus mutanter Test und normaler Referenz DNA AnschlieBend an den letzten PCR Amplifikationszyklus wird zum Schmelzen s mtlicher Doppelstrange das PCR Produkt erhitzt und dann zur optimalen Bildung von Hetero und Homoduplices langsam abgek hlt Heteroduplices kommen vor wenn ein Strang einer Wild Type Sequenz mit einem Strang einer mutanten Sequenz abk hlt Schritt 2 Behandlung des hybridisierten Heteroduplex Homoduplex Gemischs mit SURVEYOR Nuclease SURVEYOR Nuclease schneidet beide Str nge der Heteroduplex DNA und l sst DNA Fragmente entstehen Die gleich behandelte Control Wild Type DNA dient als Hintergrundkontrolle Schritt 3 Analyse der DNA Fragmente mit dem DHPLC System Die Bildung neuer Spaltprodukte aufgrund von einem bzw mehreren Mismatch wird durch zus tzliche chromatografische Peaks angezeigt Die Retentionszeit der Spaltprodukte weist auf die Gr e der Fragmente und daher den ungef hren Ort des der Mismatches hin Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit mit den DHPLC Systemen Seite 11 12 Schritt f r Schritt Anleitung 12 Schritt f r Schritt Anleitung 12 1 DHPLC Grundeinstellung Kalibration Bei der Vorbereitung der SURVEYOR Nuclease Platte zur Analyse mit DHPLC schlagen S
37. en FFPE kolorektalen Tumorproben extrahiert wurde F r eine optimale DNA Extraktion muss das Gewebe 14 24 Stunden in Formalin fixiert werden Tumorbiopsien sind eine heterogene Mischung aus Tumorzellen und Nicht Tumorzellen Au erdem ist der Tumor an sich eine heterogene Mischung aus Tumorzellen mit Mutationen und Tumorzellen ohne Mutationen Da diese somatischen Mutationen m glicherweise nicht gleichm ig im Tumor verteilt sind kann die aus verschiedenen Bereichen desselben Tumors resultierende Mutationsanalyse unterschiedlich ausfallen Um die Wahrscheinlichkeit f r einen Mutationsnachweis zu erh hen sollte die DNA aus der Tumorregion des Gewebes isoliert werden indem nur der Tumorbereich von dem Glasobjekttr ger abgeschabt wird Dazu f r jeden neuen Objekttr ger ein frisches steriles Skalpell verwenden F r eine erfolgreiche Verwendung dieses Kits sollte die entnommene DNA den Kriterien entsprechen die in den berlegungen zu den Matrizen aufgelistet sind ANMERKUNG Entnommene DNA Proben die mit diesem Kit nicht sofort analysiert werden m ssen bei 20 C bis 80 C eingefroren aufbewahrt werden Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPLC Systemen Seite 10 11 Testverfahren 11 1 Somatischer Mutationsnachweis mit SURVEYOR Scan Kits Ein berblick Nachweis und Best tigung einer Mutation mit der SURVEYOR Nuclease umfasst drei Schritte SURVEYOR Scan Vorbereitung zum Screening in drei einfachen Arb
38. gefitinib or erlotinib resistant non small cell lung cancer Clin Cancer Res 15 2630 6 Mitani N et al 2007 Surveyor nuclease based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy Ann Clin Biochem 44 557 9 Engelman JA et al 2006 Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR amplified lung cancer J Clin Invest 116 2695 2706 Siehe auch http world transgenomic com files literature 482146 pdf f r Literaturhinweise zur SURVEYOR Nuclease und ihre Anwendungen Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 36 Anhang B Anhang B Fehlersuche Die effektive Verwendung der SURVEYOR Scan Kits f r DHPLC h ngt von der erfolgreichen Ausf hrung einer Reihe von Arbeitsschritten ab Einer der entscheidendsten ist die PCR Amplifikation die zur Produktion einer ausreichenden Menge spezifischer gleichm ig langer DNA f hren muss um nach der Hybridisierung und Spaltung nachgewiesen zu werden Das wiederum h ngt von der Qualit t der Ausgangsprobe ab Die Durchf hrung dieses Tests mit DNA die nicht den Qualit t und Quantit tskriterien entspricht ist nicht empfehlenswert Anmerkung Wenn Sie zum ersten Mal mit SURVEYOR Nuclease arbeiten f hren Sie die Untersuchungen im Abschnitt Verwendung von Kontrollplasmid DNAs durch nachdem Sie den Abschnitt Schritt f r Schritt Anleitung gelesen und verinnerlicht haben Bevor Sie sich an den tech
39. gen Wild Type Control sollte sie zur Sequenzbest tigung gesandt werden Wenn die Sequenzbest tigung nicht annehmbar ist dann a Wenn noch ausreichend genomische DNA vorhanden ist die PCR wiederholen b Aus FFPE erneut DNA extrahieren dies muss die zweite Wahl sein da es normalerweise nicht w nschenswert ist einen FFPE Block nachzuschneiden Bei einer akzeptablen Best tigungsanalyse sollte eines der folgenden Resultate zutreffen a Wild Type Sequenz das hei t No Variant Detected NVD keine Variante nachgewiesen oder b Variant Detected Variante nachgewiesen Wenn die Sequenzbest tigung eine Anderung der Basensequenz anzeigt die zu einer Ver nderung einer Aminos ure f hrt bei i Codon 12 oder 13 li Codon 59 oder 61 iii Codon 117 oder iv Codon 146 ist dies als KRAS oder NRAS Mutation positiv zu bewerten Anmerkung Es ist m glich eine positive SURVEYOR Scan Zuordnung zu haben der bei der Sequenzbest tigung zudem in ein No Variant Detected keine Variante festgestellt resultiert Die Nachweisgrenze Level of Detection LoD der SURVEYOR Nuclease auf einem DHPLC System ist f r einige Mutationen so gering wie 2 Mutant in 98 Wild Type DNA wohingegen die LoD der Sequenzierung circa 10 25 Mutant in 90 75 Wild Type DNA betr gt Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 14 12 Schritt f r Schritt Anleitung Anmerkung Wenn eine Probe 100 mutante DNA ist k nne
40. h DNA Sequenzierung wurde bestatigt dass die einzige Anderung in der Sequenz von Codon 12 in einer G12D GGT gt GAT Alteration vorliegt Dieser Klon wird dann mit KRAS Control Wild Type DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten Das KRAS Positive Control Exon 3 wurde durch Synthese von KRAS Exon 3 unter Verwendung der NCBI Reference Sequence oben konstruiert enthalt aber die Q61H Mutation DNA Sequenzierung bestatigte dass die einzige Anderung in der Sequenz von Codon 61 in einer Q61H Alteration CAA gt CAC vorliegt Dieser Klon wird dann mit KRAS Control Wild Type DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten Das KRAS Positive Control Exon 4A wurde durch Synthese von KRAS Exon 4 unter Verwendung der NCBI Reference Sequence oben konstruiert enth lt aber die K117N Mutation DNA Sequenzierung bestatigte dass die einzige Anderung in der Sequenz von Codon 117 in einer K117N Alteration AAA gt AAT vorliegt Dieser Klon wird dann mit KRAS Control Wild Type DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten Das KRAS Positive Control Exon 4B wurde durch Synthese von KRAS Exon 4 unter Verwendung der NCBI Reference Sequence oben konstruiert enth lt aber die A146T Mutation DNA Sequenzierung bestatigte dass die einzige Anderung in der Sequenz von Codon 146 in einer A146T Alteration GCA gt ACA vorliegt Dieser Klon wird dann mit KRAS Control Wild Type DNA gemischt um eine heterozygote Mischung zu erhalten
41. hren Sie die PCR durch und pr fen Sie die DNA Qualitat durch Gelelektrophorese Dokumentieren Sie ob die Bande stark 220 ng oder schwach lt 20 ng ist Wenn mehrere PCR Banden vorliegen bereiten Sie aus FFPE frische genomische DNA vor 4 Bei Proben die nach der PCR Amplifizierung als starke PCR bzw schwache PCR bewertet wurden kann die Behandlung mit SURVEYOR Nuclease und Analyse mit dem DHPLC System angeschlossen werden Beachten Sie dass mit einer schwachen PCR Zuordnung unzureichende DNA fur das Erzielen aussagefahiger Ergebnisse mit DHPLC aber genug DNA fur die Sequenzierung vorhanden sein kann Siehe Anhang B Fehlersuche f r Beispiele fehlgeschlagener SURVEYOR Scan Ergebnisse Alle Proben mit dem Ergebnis SURVEYOR Scan fehlgeschlagen sollten noch einmal neu bearbeitet werden a Wenn noch ausreichend genomische DNA vorhanden ist die PCR wiederholen b Aus FFPE erneut DNA extrahieren dies muss die zweite Wahl sein da es normalerweise nicht w nschenswert ist einen FFPE Block nachzuschneiden c Wenn ein anderer Gewebeschnitt oder Block verwendet wird muss der gesamte Test wiederholt werden da es aufgrund der Tumorheterogenit t zu Abweichungen im Verdau kommen kann Wenn keine Spalt Peaks sichtbar sind f r den SURVEYOR Scan ein negatives Ergebnis angeben d h NVD No Variant Detected keine Variante nachgewiesen Wenn eine Probe SURVEYOR Nuclease Spaltprodukte anzeigt entspricht nicht der jeweili
42. ich zoomen Sie auf den Bildausschnitt und berblenden das Chromatogramm mit der Wild Type Control f r dieses Amplikon Dokumentieren Sie alle Unterschiede zwischen der Wild Type Control und der analysierten Probe Wichtig F r eine sorgf ltige Pr fung jeder Probe sollte der Pr fer kontrollieren ob nebeneinanderliegende Proben in der Analyseplatte identische positive SURVEYOR Scan Ergebnisse ausweisen Das Auftreten identischer positiver Ergebnisse kann das Resultat einer Kreuzkontamination von Probe und Kontrolle sein Die Analyse muss in dem Fall wiederholt werden Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 22 14 Interpretation der Ergebnisse 14 3 Beispielergebnisse Beispielergebnisse die mit dem CRC RAScan Combination Kit und einem DHPLC System erzielt wurden zeigen die Abbildungen 4 10 unten In diesen Beispielen wurde unter Verwendung des WAVE 4500HT HS Systems mit UV als auch Fluoreszenzdetektoren das im Abschnitt Schritt f r Schritt Anleitung dargestellte Verfahren genauestens eingehalten F r Hinweise zu empfohlenen Gradienteneinstellungen f r die Analyse von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten mit dem DHPLC System gehen Sie auf http world transgenomic com diagnostic tools genetic analysis kits crc rascan kits eu dhplicsystemsettings KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 2 Abbildung 4A Probe 1 KRAS Exon 2 Probe 2 KRAS Exon 2 Probe 3 KRAS Exon 2 DHPLC DNA Gr
43. ie bitte nach im Anhang A 3 HPLC DHPLC Systemanforderungen f r die Denaturierung 12 2 berlegungen vor Beginn der KRAS und NRAS Probenanalyse Bevor Sie Proben auf einem DHPLC System laufen lassen muss ein geeigneter DNA Gr enstandard getestet werden um zu gew hrleisten dass das System einwandfrei funktioniert Das Laborpersonal das mit dem Instrument arbeitet sollte vor Durchf hrung der Analyse die Qualit t des DNA Gr enstandards pr fen 12 3 berlegungen zu den Matrizen 1 Verwenden Sie f r die FFPE isolierte Matrizen DNA die blichen Labortechniken um die Qualit t und Quantit t der extrahierten DNA zu bewerten und um zu gew hrleisten dass f r die PCR ausreichend Matrize vorhanden ist 2 Das 260 280 Absorptionsverh ltnis muss gr er als 1 80 sein 3 Um das PCR Setup zu beschleunigen stellen Sie die Gebrauchskonzentration der Matrize auf ungef hr 12 5 ng uL ein Verd nnen Sie bei Bedarf die Matrizen DNA mit hoch reinem Wasser f r die Molekularbiologie 12 4 berlegungen zum Arbeitsablauf Das Kit ist f r die Analyse von 230 Reaktionen ausgelegt Kleinere Probenserien k nnen ausgef hrt werden aber die Kit Kontrolle und eine No Template Control m ssen bei jeder Probenserie mitgef hrt werden Im Kit ist ausreichend Kontrollmaterial f r 230 Reaktionen aller Kombinationen der zu verwendenden Probenseriengr en Im Allgemeinen sollte die Probenverarbeitung von Anfang bis Ende so ausgef hrt
44. igkeit auf den Beh lterdeckeln bleibt und legen Sie sie auf Eis Bereiten Sie auf Eis die jeweiligen Master Mix vor 6 Halten Sie sich bei der Herstellung eines Master Mix f r jede der KRAS Exon 2 KRAS Exon 3 KRAS Exon AA KRAS Exon 4B Reaktionen NRAS Exon 2 NRAS Exon 3 und NRAS Exon 4 Reaktionen als Anhaltspunkt an die nachstehende Tabelle Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPLC Systemen Seite 15 12 Schritt f r Schritt Anleitung Anzahl der Reaktionen 7 Proben 3 Kontrollen Volumenberechnung Volumen Wasser uL DNA Polymerase 10X PCR Buffer uL dNTPs uL Forward Primer uL Reverse Primer uL DNA Polymerase uL Master Mix Gesamtvolumen 48 0 Anmerkung Der Anwender sollte auf ein Minimum von 25 ng DNA je 50 uL PCR Reaktion abzielen Erh hen Sie f r extrahierte DNA Konzentrationen mit weniger als 12 5 ng uL proportional das Volumen extrahierter DNA um je Reaktion 25 ng zu erhalten Reduzieren Sie auch um dieselbe Menge den Wasseranteil in dem jeweiligen Master Mix um je Reaktion 50 uL zu erhalten Alle mit diesen Master Mix vorbereiteten Proben brauchen extrahierte DNA die auf ann hernd dasselbe niedrigste Konzentrationsniveau verd nnt wurde Es ist nicht empfehlenswert Konzentrationen extrahierter DNA mit weniger als 5 ng uL einzusetzen 7 Berechnen Sie die erforderlichen Volumina f r alle Master Mix L sungen anhand der Tabelle oben Beachten Sie dabei Folgendes a
45. iner spezifischen Basen nderung in Exons 2 3 oder 4 des KRAS bzw NRAS Gens zu bestimmen SURVEYOR Nuclease spaltet an allen Mismatches die sich aus der Heteroduplex Bildung von Wild Type und mutanten DNAs ergeben nicht nur Mutationen in Exon 2 3 oder 4 Die Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 21 14 Interpretation der Ergebnisse SURVEYOR Nuclease best tigt dass ein Mismatch vorhanden ist Die mutationsspezifische Identit t der Basen nderung ist zur Bestimmung des KRAS und NRAS Aktivierungsstatus erforderlich und muss durch eine andere Methode z B Sequenzierung best tigt werden 14 2 Datenpr fung der SURVEYOR Scan Ergebnisse berpr fen Sie die Chromatogramme und vergleichen die der Wild Type und Positive Controls mit denen der Probe Bestimmen Sie ob das Chromatogramm der Probe mit dem Wild Type Muster bereinstimmt oder differiert Wenn es sich unterscheidet dann sollte die Probe als SURVEYOR Scan positiv bewertet und zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden Siehe Beispiele in Abbildung 4 10 sowie Anhang B Fehlersuche Probleme 7 amp 8 f r Beispiele solcher Proben Jede Probe mit einem SURVEYOR Nuclease Muster das sich von dem des Wild Type unterscheidet sollte f r eine Sequenzbest tigung eingeschickt werden selbst wenn sie nicht mit der Positive Control identisch ist Siehe Anhang B Fehlersuche Problem 7 f r ein Beispiel einer solchen Probe Falls erforderl
46. lease Verdauprodukten von KRAS Positive Control Exon 4A KRAS Control Wild Type und CRC DNA isoliert aus FFPE Schnitten Bei der Sichtpr fung der Chromatogramme sollten die verdauten Proben mit der Wild Type Control gr ne Linie verglichen werden Die KRAS Positive Control Exon 4A blaue Linie ist eine Mischung aus Wild Type und mutanten K117N Plasmiden die in Verdau Peaks zu 80 und 88 bp resultieren diese Kontrolle weist darauf hin dass der SURVEYOR Nuclease Verdauschritt funktioniert hat und weist auf dem Chromatogramm auf die Region zur Sichtpr fung hin die bestimmt ob eine Probe zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollte Beim Vergleich der Verdaumuster der Proben 1 amp 2 mit dem Elektropherogramm des unverdauten Wild Type ist es offensichtlich dass Probe 1 rote Linie m glicherweise eine Mutation enth lt und sequenziert werden sollte um Anwesenheit oder Fehlen einer Mutation am entsprechenden Codon zu best tigen Die Probe 2 schwarze Linie hat im Vergleich zur Wild Type Control ein hnliches Chromatogramm und muss nicht zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden Bitte beachten Sie dass das Sequenzierungsergebnis das endg ltige Ergebnis darstellt da es in derselben Fragmentgr e weitere nicht relevante Mutationen geben kann Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 25 14 Interpretation der Ergebnisse Abbildung 7A KRAS Control Wild Type KRAS Control Exon 4B Probe 1 KRAS Exon
47. leiner als 20 ng uL ist c F hren Sie den SURVEYOR Nuclease Verdau sowohl mit starken als auch schwachen PCR Ergebnissen durch TIPP In dieser Phase k nnen PCR Produkte bei unter bzw gleich 20 C bis zu einer Woche gelagert werden Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPLC Systemen Seite 18 12 Schritt f r Schritt Anleitung 12 8 SURVEYOR Nuclease Verdau 1 Nachdem sich die Probe PCR in Qualit t und Quantit t als ausreichend erwiesen hat f hren Sie die SURVEYOR Nuclease Verdaureaktion wie nachstehend beschrieben durch F r einen optimalen Verdau durch die SURVEYOR Nuclease wird eine Probenkonzentration von 40 ng uL oder mehr ben tigt Tauen Sie die Reaktionsgef e mit 0 15 M MgCl Solution und den SURVEYOR Enhancer Cofactor auf Eis auf Geben Sie 10 0 uL von allen oben genannten PCR amplifizierten Proben in ein neues 0 2 mL PCR Reaktionsgef oder in die Vertiefung einer 96 Loch Mikrotiterplatte Stellen Sie frische eine Mischung aus 0 15 M MgCl SURVEYOR Enhancer Cofactor SURVEYOR Enhancer W2 und SURVEYOR Nuclease W SURVEYOR Nuclease Reaktionsgemisch her Bereiten Sie den SURVEYOR Nuclease Verdau Master Mix fur die Analyse mehrerer Proben anhand der folgenden Tabelle vor Das Beispiel unten zeigt die Volumina fur ein 10 Proben Master Mix Ber cksichtigen Sie dass etwas mehr Master Mix als in dieser Berechnung angezeigt ben tigt wird um Verluste w hrend des Pipettierens ausz
48. lett Schwarz Rosa Braun Rot 2 x 105 uL 105 uL 105 uL 105 uL 250 uL 710153F 710153R Universal Sequencing Primer 1 10 uM Universal Sequencing Primer 2 10 uM Orange Orange 2 x 125 uL 2 x 125 uL PCR Box mit Komponenten und Kontrollen 703310 DNA Polymerase 250 U Rot 703312 DNA Polymerase 50 U Rot 703315 DNA Polymerase 10X PCR Buffer Durchsichtig 703065 dNTPs 10 mM Durchsichtig 710452F NRAS Primer Exon 2 Forward 10 uM 710452R NRAS Primer Exon 2 Reverse 10 uM Blau 90 uL 710453F NRAS Primer Exon 3 Forward 10 uM Blau 90 uL 710453R NRAS Primer Exon 3 Reverse 10 uM Blau 90 uL 100 uL 20 uL 1mL 500 uL Blau 90 uL 710454F NRAS Primer Exon 4 Forward 10 uM Blau 90 uL 710454R NRAS Primer Exon 4 Reverse 10 uM Blau 90 uL 710441 NRAS Control Wild Type Mix Gelb 120 uL 7104422 NRAS Positive Control Exon 2 Gr n 40 uL 710443 NRAS Positive Control Exon 3 Gr n 40 uL 710444 NRAS Positive Control Exon 4 Gr n 40 uL 5 3 Anzahl der Proben die mit dem Kit getestet werden k nnen Das CRC RAScan Combination Kit ist f r 230 Reaktionen vorgesehen Die Gesamtprobenanzahl h ngt von der Gr e der jeweiligen durchschnittlichen Seriengr en der zu testenden Proben ab da mit jeder Probenserie jeweils ein Satz Kontrollreaktionen Wild Type Controls Positive Controls und No Template Controls auf jeder Mikrotiterplatte mitgef hrt werden muss In der nachstehenden Tabelle ist die Anzahl Proben aufgef h
49. n Combination Kit Arbeitsablauf zum Screening auf KRAS und NRAS Als Vorschlag wie 96 Loch Mikrotiterplatten f r die Analyse von KRAS und NRAS Exon 2 4 anzulegen sind siehe Anhang A 1 Plattenlayout f r das CRC RAScan Combination Kit Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPLC Systemen Seite 4 3 Testprinzip des CRC RAScan Scan KRAS and NRAS Mutation Detection Assay 3 3 SURVEYOR Nuclease Die SURVEYOR Nuclease von Transgenomic ist eine mismatch spezifische Pflanzen DNA Endonuclease die die Heteroduplex DNA auf bekannte und unbekannte Mutationen und Polymorphismen durchsuchen kann Das Enzym schneidet mit hoher Spezifit t einen DNA Doppelstrang an Stellen wo durch einen Basenaustausch oder andere Sequenzver nderungen Basen nicht miteinander paaren k nnen Diese DNA Nuclease spaltet beide Str nge eines DNA Heteroduplex am 3 Ende der Mismatch Stelle Insertion Deletion Mismatches und alle Basenaustausch Mismatches werden erkannt aber die Spalteffizienz variiert mit der Mismatch Sequenz Ort des Mismatches Abbildung 2 Wirkungsweise der SURVEYOR Nuclease Die ee eee Endonuclease erkennt ein Mismatch 3 und spaltet am 3 Ende der Mismatch Basen Das spaltet den 5 DNA Doppelstrang was einen einzigen 3 Basen berhang hinterl sst Entstandene Fragmente 5 3 3 5 Die SURVEYOR Nuclease wurde in einer ganzen Reihe von Projekten eingesetzt um in Genen eine Vielzahl von Mutationen
50. n Sie dass etwas mehr Master Mix als in dieser Berechnung angegeben benotigt wird um Verluste wahrend des Pipettierens auszugleichen 8 Beschriften Sie 0 2 mL PCR Reaktionsgef e oder die Vertiefungen einer 96 Loch Mikrotiterplatte mit den erforderlichen Probeninformationen 9 Beschriften Sie 2 0 mL Zentrifugenr hrchen fur den jeweiligen vorbereiteten Master Mix 10 Fugen Sie diesen 2 0 mL Zentrifugenr hrchen mit der Beschriftung Master Mix das erforderliche Volumen an hoch reinem Wasser f r die Molekularbiologie hinzu Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 16 11 12 13 14 19 16 17 18 19 20 21 22 23 24 29 26 12 Schritt f r Schritt Anleitung F gen Sie den Master Mix R hrchen die erforderliche Menge DNA Polymerase 10X PCR Buffer hinzu F gen Sie den Master Mix R hrchen das erforderliche Volumen an 10 mM dNTPs hinzu F gen Sie den jeweiligen Master Mix R hrchen das erforderliche Volumen des KRAS oder NRAS Forward Primer hinzu F gen Sie den jeweiligen Master Mix R hrchen das erforderliche Volumen des KRAS oder NRAS Reverse Primer hinzu Nehmen Sie die DNA Polymerase PN 703310 aus dem Gefrierschrank Zentrifugieren Sie die DNA Polymerase f r 10 Sekunden Mischen Sie die DNA Polymerase f r 10 Sekunden mit dem Vortexer F gen Sie den Master Mix R hrchen das erforderliche Volumen DNA Polymerase hinzu Verschlie en Sie
51. n der Ergebnisse 14 1 Analyse von KRAS und NRAS Exons 2 3 und 4 mit der SURVEYOR Nuclease F hren Sie zu Vergleichs und Kontrollzwecken bei allen Kontrollen Wild Type und Positive Controls einer No Template Control NTC sowie bei den Proben DNAs IMMER den SURVEYOR Nuclease Verdau durch und lassen diese auf derselben Probenplatte auf dem DHPLC System durchlaufen In der Phase des SURVEYOR Nuclease Verdaus berpr fen die Amplikons dieser Kontrollplasmid DNAs effektiv ob die Bedingungen der Spaltreaktion Herstellung der SURVEYOR Nuclease Mixtur und Inkubationsbedingungen zufriedenstellend waren Bei der Analyse liefert das DHPLC System die Spuren dieser verdauten Kontrollamplikons der SURVEYOR Nuclease einen Anhaltspunkt wo die DNA Fragmente aus der Spaltung auch bei geringer Konzentration an den Mismatch Stellen dieser spezifischen Mutation eluieren werden siehe Abbildung 4 10 Wenn entweder die PCR Amplikons oder die aus den Kontroll DNAs stammenden SURVEYOR Nuclease Spaltfragmente nicht den dargestellten Ergebnissen entsprechen sehen Sie im Anhang B Fehlersuche nach oder wenden Sie sich an den technischen Kundendienst von Transgenomic bevor Sie weitere Schritte der Probenanalyse durchf hren Die Beispiele unten dienen nur zu Darstellungszwecken und d rfen NICHTverwendet werden um die Identit t einer gegebenen Mutation festzulegen Die Best tigung der Identit t einer Mutation ist erforderlich um eindeutig die Pr senz e
52. n keine Heteroduplices gebildet werden und die Probe erscheint als Wild Type Proben aus Tumorbiopsien enthalten allerdings aufgrund der Tumorheterogenit t und oder kontaminierendem normalen Gewebe Wild Type Zellen Anmerkung Proben mit 5 und 95 mutanter DNA ergeben identische Chromatogramm Anmerkung Positive SURVEYOR Scan Ergebnisse k nnen sich aufgrund von Ver nderungen in der Basensequenz von denen unterscheiden die KRAS oder NRAS aktivierend sind Obwohl diese Mutationen selten sind ist eine Best tigung durch eine andere Methode z B DNA Sequenzierung erforderlich um festzustellen ob ein positives SURVEYOR Scan Ergebnis tats chlich eine KRAS oder NRAS aktivierende Mutation ist Anmerkung Das Formalinfixierungsverfahren das f r die Vorbereitung von FFPE Tumorbiopsieproben verwendet wird kann zu einer Cytosin Desaminierung f hren Diese Desaminierung wandelt Cytosin in Uracil um Die Polymerase liest dieses Uracil als ein Thymin und bindet ein Adenin in die duplizierten Str nge ein Dies scheint dann eine Mutation zu sein bei der das normale G jetzt durch ein A ersetzt wird und eine GC zu AT Mutation verursacht die eine Artefaktmutation durch den Fixierungsprozess und keine echte somatische Mutation ist Diese Vorf lle sind selten wenn sie jedoch f r im PCR Cycling dupliziert werden sehen sie wie Mutationen aus Sie reagieren nicht auf eine erneute Analyse Beispiele f r m gliche Cytosin Desaminierungsmu
53. niert hat und weist auf dem Chromatogramm auf die Region zur Sichtpr fung hin die bestimmt ob eine Probe zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden sollte Beim Vergleich der Verdauungsmuster der Proben 1 und 2 mit dem Wild Type verdauten Elektropherogramm ist es offensichtlich dass Probe 1 rot Linie m glicherweise eine Mutation enth lt und sequenziert werden sollte um Anwesenheit oder Fehlen einer Mutation am entsprechenden Codon zu best tigen Die Probe 2 schwarze Linie hat im Vergleich zur NRAS Control Wild Type ein hnliches Chromatogramm und muss nicht zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden Bitte beachten Sie dass das Sequenzierungsergebnis das endg ltige Ergebnis darstellt da es in derselben Fragmentgr e weitere nicht relevante Mutationen geben kann Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPLC Systemen Seite 27 14 Interpretation der Ergebnisse Abbildung 9A NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 3 Probe 1 NRAS Exon 3 Probe 2 NRAS Exon 3 DHPLC DNA Gr enstandard Durchfluss a DHPLC Wash off sp len Q61K ergibt Fragmente von 78 und 125 bp Ungespaltenes N 203 bp Amplikon ty 2 3 4 5 min Abbildung 9B sa Q61K ergibt Fragmente von 78 und 125 bp NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 3 Probe 1 NRAS Exon 3 600 Probe 2 NRAS Exon 3 DNA Gr enstandard 500 Ungespaltenes 203 bp Amplikon 300 200 100 Q 1 2 3 4 5 mm Abbildung 9A und
54. nischen Kundendienst von Transgenomic wenden warten Sie bitte die Ergebnisse f r die Kontrollplasmid DNAs ab Diese Fehlersuche deckt eine Liste von Problemen ab die bei der Arbeit mit den SURVEYOR Scan Kits f r DHPLC auftreten k nnen sowie Vorschl ge wie sie zu l sen sind Die aufgezeigten Beispiele gelten f r die KRAS sowie f r die NRAS Exons Konsultieren Sie das Bedienungshandbuch des DHPLC Systems f r detaillierte Anleitungen in Bezug auf Ger tebetrieb und Wartung Das Bedienungshandbuch enth lt spezifische Verfahren zur berpr fung und Wartung der S ulenleistung und beinhaltet Einzelheiten zur Fehlersuche Problem 1 Niedrige PCR Ausbeute oder kein PCR Produkt wenn auf Agarosegel analysiert NIEDRIGE PCR MOGLICHE AUSBEUTE URSACHE Schlechte Qualit t der Wiederholen Sie die Aufreinigung der DNA DNA Matrize berpr fen Sie die verwendete Aufreinigungsmethode Wenn die FFPE Gute Schlechte extrahierte DNA zu fragmentiert ist k nnen PCR PCR alternative FFPE Blocks erforderlich sein Ausbeute Ausbeute Zu viel RNA in der Wiederholen Sie die RNase Behandlung der a Probe verursacht die DNA Probe und reinigen Sie die DNA erneut LOSUNG Uberbewertung der DNA Konzentration Thermocycler nicht Fuhren Sie die Kalibrierung des kalibriert Thermocyclers durch Nicht ausreichende Erh hen Sie die Matrizenmenge Matrize Anmerkung Es sollte hochwertige DNA aus FFPE verwendet werden Die DNA sollte eine durch Absor
55. ption bei 260 nm gemessene Konzentration von 12 5 ng uL aufweisen sowie ein Absorptionsverh ltnis von 260 280 nm von gr er 1 8 haben und gr er als 90 DNA sein d h nahezu frei von tRNA und rRNA Kontamination laut Agarosegelauswertung DNA Proben zwischen 20 C und 80 C aufbewahren Die Analyse von DNA Matrize die aus paraffineingebettetem Gewebe extrahiert wurde erfordert mehrere VorsichtsmaBnahmen Die DNA kann mit Uracil DNA Glycosylase behandelt werden um eine Amplifikation von DNA Fragmenten zu vermeiden die deaminierte C Reste enthalten Haufig wird ein hoher Prozentsatz des aus dem paraffineingebetteten Gewebe extrahierten A260 Adsorptionsmittels bei der PCR nicht gut amplifiziert Oft hilft eine gr ere Menge Start DNA um ein geeignetes Amplifikationsprodukt zu erhalten Eine weitere berlegung ware FFPE Tumorschnitte mit einem hohen Prozentanteil an Tumorzellen zu w hlen Mikrodissektion kann Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 37 ebenfalls verwendet werden ist aber zeitaufwendig und f r das normale Routinelabor nicht empfehlenswert Problem 2 Mehrere PCR Produkte wenn auf Agarosegel analysiert MEHRERE PCR PRODUKTE M GLICHE URSACHE L SUNG Anlagerungstemperatur zu berpr fen Sie die Kalibrierung Gute Mehrfach niedrig des Thermocyclers PCR banden Ausbeute PCR Anmerkung PCR sollte einen ausreichend hohen Ertrag gr er als 20 ng uL einer EIN
56. r als Richtlinie zu verwenden ist und alle Mutationen durch weitere Analyse wie zum Beispiel durch eine DNA Sequenzierung best tigt werden m ssen Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPLC Systemen Seite 3 3 Testprinzip des CRC RAScan KRAS and NRAS Mutation Detection Assay 3 Testprinzip des CRC RAScan KRAS und NRAS Mutation Detection Assay 3 1 KRAS und NRAS Auf den Epidermal Growth Factor Receptor EGFR gerichtete therapeutische Wirkstoffe haben sich bei kolorektalem Karzinom als wirksam erwiesen Die Forschung hat gezeigt dass rund 40 der kolorektalen Tumoren somatische KRAS Genmutationen tragen und klinische Studien haben bewiesen dass Mutationen in KRAS Exon 2 Codon 12 und 13 mangelndes klinisches Ansprechen auf Anti EGFR Therapien voraussagen Neueste explorative Studien haben gezeigt dass die Patientenpopulation weiter differenziert werden kann da Patienten deren mCRC Tumoren eine zus tzliche Mutation in KRAS Exon 3 und 4 oder NRAS Exon 2 3 und 4 bergen ebenfalls dazu neigen nicht auf eine Therapie mit Anti EGFR anzusprechen Dieses Kit wurde f r den Gebrauch in der diagnostischen Analyse von somatischen Mutationen in KRAS und NRAS Exons 2 3 amp 4 entwickelt Das CRC RAScan Combination Kit ist ein Test zum Nachweis aller Sequenz und kleinen Insertions Deletionsver nderungen in Exons 2 3 amp 4 des KRAS und NRAS Gens Mutationen im KRAS und NRAS Codon 12 13 59 61 117 und 146 wurden mit de
57. r mangelnden Wirksamkeit von Panitumumab in Verbindung gebracht Mit diesem Kit werden Positive Controls f r Mutationen in Codon 12 61 117 und 146 mitgeliefert Dieses Kit verwendet die patentrechtlich gesch tzte Technologie SURVEYOR Nuclease von Transgenomic und bietet in Verbindung mit dem DHPLC System einen einfachen und empfindlichen Nachweis potenzieller Mutationen Damit kann vor einem Hintergrund aus nicht mutanter DNA ein Gemisch aus 2 5 mutanter DNA nachgewiesen werden Untersuchungen zur Validierung haben eine sehr hohe bereinstimmung mit der Sequenzierung von gut charakterisierten kolorektalen Tumorproben gezeigt Durch die Verwendung des CRC RAScan Combination Kit reduziert sich f r den Anwender die Sequenzierungsarbeit und erm glicht dar ber hinaus aggressive Sequenzzuordnung wo eine automatische Sequenzierungssoftware eine Mutation oft nicht kl ren kann Aufgrund der hohen Empfindlichkeit hinsichtlich der Sanger Sequenzierung wird empfohlen die Laboreinrichtung zu optimieren um eine Kreuzkontamination von Proben oder Kontrollen zu vermeiden Ein Beispiel einer idealen Laboreinrichtung finden Sie im Anhang A 4 Laboreinrichtung f r PCR Tests 3 2 Analyse von Patientenproben mit den SURVEYOR Scan Kits Das CRC RAScan Combination Kit darf nur zusammen mit einem der unten genannten Arbeitsabl ufe verwendet werden Arbeitsablauf Patientenprobe Test KRAS und NRAS Exon2 3 amp 4 Ergebnis ausgeben Abb 1 CRC RASca
58. robleme mit der Probenkontamination durch Positive Controls zu erkennen Siehe Anhang B Fehlersuche Problem 8 f r ein Beispiel einer SURVEYOR Scan Spur einer solchen Kontamination KRAS Exon 2 Stempel Amplikongr e 190 bp F r die Herstellung des genetischen Stempels des KRAS Exon 2 Kontrollplasmids wird TAT gegen ATA ausgetauscht Codon 12 und 13 sind unten ebenfalls markiert GCT GTAGGCAAGAGTGCECTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTITGGACGAA GAT KRAS Exon 3 Stempel Amplikongr e 200 bp F r die Herstellung des genetischen Stempels des KRAS Exon 3 Kontrollplasmids wird ACC gegen TGG ausgetauscht Codon 59 und 61 sind unten ebenfalls markiert GAATGETGTCTCTTGGATATTCTCGACACHA STE ac KRAS Exon 4A Stempel Amplikongr e 168 bp F r die Herstellung des genetischen Stempels des KRAS Exon 4A Kontrollplasmids wird AGA gegen TCT ausgetauscht Codon 117 ist unten ebenfalls markiert AATMMATGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTTCTCAC Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 32 Anhang A KRAS Exon 4B Stempel Amplikongr e 194 bp F r die Herstellung des genetischen Stempels des KRAS Exon 4B Kontrollplasmids wird agt gegen tca ausgetauscht Codon 146 ist unten ebenfalls markiert TCAG AAAGACAAGACAGgtatcaaac NRAS Exon 2 Stempel Amplikongr e 236 bp F r die Herstellung des genetischen Stempels des NRAS Exon 2 Kontrollplasmids wird aca gegen tgt ausgetauscht Codon 12
59. rt die mit dem KRAS und NRAS Kit je nach durchschnittlicher Gr e der Probenserie getestet werden k nnen Die Berechnung beruht auf der Basis dass a jede Serie 21 Kontrollen 7x Control Wild Type 7x Positive Control 7x No Template Control ben tigt und b jedes Kit f r 230 Reaktionen ausgelegt ist Anmerkung Wenn mehrere Platten laufen sollen muss auf jeder einzelnen Platte ein Satz der 21 oben angegebenen Kontrollen mitgef hrt werden Daher ben tigen zwei Platten insgesamt 42 Kontrollreaktionen 3 Platten ben tigen 63 Kontrollreaktionen usw Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit mit den DHPLC Systemen Seite 8 5 Komponenten Mit Ansteigen der Gr e der Probenserie erh ht sich auch die Anzahl der Proben die insgesamt mit einem Kit getestet werden k nnen wodurch sich die Reagenzienkosten je Probe im Durchschnitt reduzieren Die Tabelle unten dient als Orientierung daf r wie viel Proben mit dem Kit getestet werden k nnen Gr e der Anz erforderl Eau Gesamtanz Anz Kontrollreaktionen anz Proben getesteter serienl ufe Proben pro Kit pro Kit Proben i Reaktionen serie Anz Probenamplikons pro Lauf 5 4 DNA Sequenzierung Sequencing Primer PNs 710153F und 710153R werden f r die DNA Sequenzierung aller getesteten Proben geliefert Die vor dem SURVEYOR Nuclease Verdau erzeugten PCR Amplikons sollten f r die Sequenzierung verwendet werden 6 Zus tzlich erforderliche Ausr stung und
60. t Das in Schritt 7 des SURVEYOR Nuclease Verdaus vorbereitete SURVEYOR Nuclease Reaktionsgemisch muss sofort verwendet werden da die Anwesenheit anderer Komponenten im SURVEYOR Nuclease Reaktionsgemisch die SURVEYOR Nuclease W mit der Zeit inaktiviert 9 Warnhinweise amp Vorsichtsma nahmen Keines der Reagenzien in diesem Kit stellt in den gelieferten Mengen eine Gesundheitsgef hrdung dar Die Dokumentnummer MSD 710077 von Transgenomic kann heruntergeladen werden unter http world transgenomic comf files literature 710077 DE pdf Dieses Kit enth lt keine Substanzen tierischen oder menschlichen Ursprungs die ein Infektionsrisiko darstellen k nnen Dieses Kit darf nur von Personen verwendet werden die in den entsprechenden Labortechniken ausgebildet wurden Beim Arbeiten mit den Kitkomponenten immer einen geeigneten Laborkittel Einmalhandschuhe und Augenschutz tragen Nach dem Gebrauch m ssen die Kitkomponenten als klinischer Abfall und gem der f r sie anwendbaren Gesetze und Verordnungen entsorgt werden Aus den Gef en pipettierte Reagenzienaliquots dieses Kits sind nur zum einmaligen Gebrauch bestimmt Es konnte validiert werden dass Kitkomponenten auch nach 25 Auftau Einfrierzyklen noch stabil sind Verwenden Sie das Kit nicht wenn diese Anzahl Zyklen berschritten wurde 10 Prim re Probenentnahme Handhabung und Lagerung Das CRC RAScan Combination Kit ben tigt DNA die aus formalinfixierten paraffineingebettet
61. t beeintr chtigen k nnen siehe Anhang B Fehlersuche weiter unten Bei diesem Kit muss besonders darauf geachtet werden bertragung und Kreuzkontamination zu vermeiden Die hohe Empfindlichkeit der Testmethode erfordert Vorsichtsma nahmen f r folgende Punkte e Achten Sie darauf dass alle Proben so gehandhabt werden dass eine Kreuzkontamination zwischen ihnen nicht vorkommt e Arbeiten Sie an einem PCR Arbeitsplatz oder in einem anderen geeigneten Raum wo der Arbeitsbereich vor dem Aufbau von PCR Amplifikationsreaktionen UV Licht ausgesetzt werden kann e Verwenden Sie einen getrennten PCR Arbeitsplatz bzw Raum um die Proben nach der PCR Amplifikation f r die Qualit tskontrolle durch Gelelektrophorese zu ffnen e Der Testaufbau f r den SURVEYOR Nuclease Verdau sollte in einem anderen Raum oder an einem anderen PCR Arbeitsplatz von dem stattfinden wo die erste PCR stattgefunden hat e Achten Sie darauf dass bei allen Testschritten die Plasmidkontrollen des Kits von den Testproben getrennt gehandhabt werden o Stellen Sie sicher dass alle L sungen No Template Controls und Proben DNA Vertiefungen verschlossen sind bevor Sie die Reaktionsgef e mit der Kontrollplasmid DNA ffnen o DIE KONTROLLEN ZULETZT BEARBEITEN F gen Sie den entsprechenden Reaktionsgef en erst dann Kontrollplasmid DNA hinzu NACHDEM ALLE Vertiefungen mit No Template Control und Proben verschlossen wurden o Wischen Sie ALLE R hrchen un
62. t Wild Type Keine Stempelsequenz vorhanden G ltige Probe Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme L SUNG Beim Pipettieren der Proben besonders darauf achten dass es nicht zur Kreuzkontamination kommt berpr fen Sie die Regionen der Kontrollstempelsequenz auf Kontamination der Positive Control Beim Pipettieren der Proben besonders darauf achten dass es nicht zur Kreuzkontamination kommt berpr fen Sie die Regionen der Kontrollstempelsequenz auf Kontamination der Positive Control Seite 43 Einzelheiten zur Bestellung Einzelheiten zur Bestellung Produkt ummer Produktname 710104 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exon 2 CE IVD 100 Reaktionen 710106 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 3 amp 4 CE IVD 100 Reaktionen 710400 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2 3 amp 4 CE IVD 100 Reaktionen 710077 CRC RAScan Combination Kit 230 Reaktionen Kontaktdaten Hauptniederlassung Europa Transgenomic Inc Transgenomic Limited 12325 Emmet Street 40 Watt Road Omaha Hillington Park Hillington Nebraska 68164 Glasgow G52 4RY United States of America United Kingdom Tel 888 233 9283 oder 1 402 452 5400 Tel 44 141 892 8800 Fax 1 402 452 5401 Fax 44 141 883 5967 E Mail support transgenomic com E Mail support transgenomic com Nur in Nordamerika www Transgenomic com Transgenomic Advancing Personalized Medicine bersetzungseinschr nkung Transgenomic
63. t im Vergleich zur Wild Type Control hnliche Chromatogramme und muss nicht zur DNA Sequenzanalyse geschickt werden Bitte beachten Sie dass das Sequenzierungsergebnis das endg ltige Ergebnis darstellt da es in derselben Fragmentgr e weitere nicht relevante Mutationen geben kann Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 26 14 Interpretation der Ergebnisse Abbildung 8A NRAS Control Exon 2 Probe 1 NRAS Exon 2 Probe 2 NRAS Exon 2 DHPLC DNA Gr enstandard a Durchfluss Ungespaltenes 236 bp Amplikon G12D ergibt Fragmente von 88 und 148 bp DHPLC Wash off sp len NRAS Control Wild Type NRAS Control Exon 2 G12D ergibt Probe 1 NRAS Exon 2 Probe 2 NRAS Exon 2 DNA Gr enstandard Fragmente von 88 und 148 bp Ungespaltenes 236 bp Amplikon Abbildung 8A und 8B WAVE DHPLC Analyse mit UV Abbildung 8A und Fluoreszenz Abbildung 8B Nachweis von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten von NRAS Positive Control Exon 3 Wild Type Controls und CRC DNA isoliert aus FFPE Schnitten Bei der Sichtpr fung der Chromatogramme sollten die verdauten Proben mit der NRAS Control Wild Type blaue Linie verglichen werden Die NRAS Positive Control Exon 2 gr ne Linie ist eine Mischung aus Wild Type und mutanten G12D Plasmiden die in Verdaupeaks zu 88 und 148 bp resultieren diese Kontrolle weist darauf hin dass der SURVEYOR Nuclease Verdauschritt funktio
64. tationen die f r eine Bestimmung der Patiententherapie herangezogen w rden sind f r KRAS Codon 12 AGT G12S und GAT G12D Codon 13 AGC G13S GAC G13D und GGT G13G eine stille Mutation Codon 146 GCA gt ACA A146T Beispiele f r m gliche Cytosin Desaminierungsmutationen die f r eine Bestimmung der Patiententherapie herangezogen w rden sind f r NRAS Codon 12 GGT gt AGT G12S oder GAT G12D Codon 13 GGT gt AGT G13S GAT G13D oder GGC G13G eine stille Mutation Codon 146 GCC gt ACC A146T Daher wird empfohlen dass alle diese Mutationen durch Doppelanalyse fur dieselbe genomische DNA bestatigt oder alle Proben ab Analysebeginn im Doppelansatz durchgefuhrt werden 12 5 Amplifikationsprotokoll 1 Die vorgemischte dNTP Losungen PNs 703065 und 705020 von Transgenomic werden in einer Gebrauchskonzentration von 10 mM Gesamtdeoxynucleotid je 2 5 mM der vier Deoxynucleotiden geliefert 2 Die KRAS und NRAS Forward und Reverse PCR Primer KRAS PNs 710155F R 710157F R 710154F R und 710156F R NRAS PNs 710452F R 710453F R und 710454F R werden als 10 uM geliefert 3 Nehmen Sie die 10 uM Primer 10 mM dNTPs und den DNA Polymerase 10X PCR Buffer PN 703315 aus dem Gefrierschrank und lassen sie auf Eis auftauen 4 Nach dem Auftauen Vortexen Sie alle Kitkomponenten 10 Sekunden um sie gut zu mischen zentrifugieren Sie diese kurz an 10 Sekunden um zu gew hrleisten dass keine Fl ss
65. tion nicht aus einer Kontamination der Probe mit einer der Kitkontrollen resultiert Anmerkung Wenn die getestete Probe an dem den relevanten Codon s Wild Type ist und die gestempelte Sequenz vorhanden ist ist die Probe kontaminiert und muss erneut analysiert werden Die Anwesenheit des Stempels weist darauf hin dass die Probe mit einer der Wild Type Controls des Kits kontaminiert sein k nnte diese Kontamination k nnte eine in der probe vorhandene geringf gige Mutation maskieren Siehe A 2 Kontroll DNA Stempel f r weitere Einzelheiten zu den Stempelsequenzen der Kontrollen Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPLC Systemen Seite 30 15 Leistungsmerkmale 15 3 Verfahrensbeschr nkungen Von der Extraktion der formalinfixierten paraffineingebetteten Proben bertragene kontaminierende Substanzen k nnen ebenfalls PCR Amplifikation und SURVEYOR Nuclease Verdauvorg nge st ren Die in Verfahren zur Qualit tskontrolle von PCR Produkten beschriebenen Vorgehensweisen zur Qualit tskontrolle gew hrleisten dass die extrahierte DNA zur Verwendung mit diesem Kit geeignet ist Dieses Kit wurde f r die Verwendung mit formalinfixierten paraffineingebetteten Biopsieproben von Kolorektaltumoren validiert Eine Validierung f r eine Verwendung mit anderen Krebsarten oder frischen bzw tiefgefrorenen Biopsieproben besteht nicht Zur Fehlersuche nicht standardm iger Ergebnisse und Einzelheiten zu Faktoren die diesen Tes
66. tskontrolle der PCR Produkte ccccccssccccceessceccssesseeceesseeeeeessueueeeeseaeeeessaaeseessaes 18 12 8 SURVEYOR Nu clesse Verdal run aaa en 19 13 Kontr llverl nren sone een 20 13 1 Qualit tskontrolle f r das CRC RAScan Combination Kit ccccccccsssseeeeeeseeceeeeeeeeeseaes 20 13 2 Verwendung von Kontrollplasmid DNAs cccccsssececccueeeecceseeeeeceecsueeeeessaueeessaneeeeseaes 21 14 Interpretation der Ergebnisse u 2 200 n22aa000000nnnnnnnnnnonnnnnnnnnnnunnnnnnnnnnunnnnnnnnnnnnnnnnn 21 14 1 Analyse von KRAS und NRAS Exons 2 3 und 4 mit der SURVEYOR Nuclease 21 14 2 Datenpr fung der SURVEYOR Scan ErgebnisSse ccccccsssssscceceeseceeecseeeeeecseenseeeeseeseeseaes 22 IE 3 BOIS ISIC E COIS ee een 23 15 L ist ungsmerkmal sissies secre cet ee ig 30 15 1 Nachweisgrenze von Mutationen mit SURVEYOR Scan Kits ccccsssececeseeeeeeeseeeeeneeees 30 15 2 SEQGUENZDESTAL GUNG ee 30 15 3 Verfahrensbeschr nkungen ccccsssssccccesssccceceeececsaeesceccsuaeseeceesseeeceessuaueesseasseeessaaeseessaes 31 Anhang AA ueber E E 32 A 1 Plattenlayout f r SURVEYOR Scan Kits ccccceseeccccsseceeccseseceeesseeeceeseeeuceeeasaeeeessaaeesessaes 32 A 2 Kontroll DNASTENPBE Lesen 32 A 3 HPLC DHPLC Systemanforderungen f r die DenaturierUng ccseeseeccececeeeseesseeeeeeeeees 33 A 4 Laboreinrichtung f r PER Tests uk ee 35 A5 TRC PACU Na CNW EIS esseri
67. ugleichen Anzahl der SURVEYOR Nuclease Verdaureaktionen Volumenberechnung 0 15 M MgCl Solution uL SURVEYOR Enhancer Cofactor uL SURVEYOR Enhancer W2 uL SURVEYOR Nuclease W uL Master Mix Gesamtvolumen F gen Sie je 5 uL SURVEYOR Nuclease Master Mix den PCR amplifizierten Proben hinzu uL Gesamtvolumen SURVEYOR Nuclease Verdaureaktion 15 0 Vor dem Gebrauch alle Reagenzien zentrifugieren b Vor dem Pipettieren jedes Reagenz leicht vortexen Zentrifugieren Sie nach jedem Vortexschritt 10 Sekunden leicht an c F gen Sie f r jeden Verdau einem 0 2 mL oder gr eren PCR Reaktionsgef folgende Komponenten hinzu 1 0 uL 0 15 M MgCl Solution PN 708027 1 0 uL SURVEYOR Enhancer Cofactor PN 708049 1 0 uL SURVEYOR Enhancer W2 PN 710161 2 0 uL SURVEYOR Nuclease W PN 710160 Oder f gen Sie 5 uL Master Mix hinzu der wie in der Tabelle oben vorbereitet wurde Vortexen Sie den SURVEYOR Nuclease Master Mix 10 Sekunden vorsichtig bei niedriger Geschwindigkeit Zentrifugieren Sie den SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix 10 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit Legen Sie den SURVEYOR Nuclease Verdau Master Mix bis zur Weiterverarbeitung auf Eis Anmerkung Der in Schritt 7 vorbereitete SURVEYOR Nuclease Verdau Master Mix muss sofort verwendet werden da SURVEYOR Nuclease W mit der Zeit inaktiv wird wenn sie mit den anderen Komponenten des SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix in Ber hrung kommt
68. ulenofen mit hoch pr ziser Temperaturregelung e Temperaturbereich 40 bis 70 C e Temperaturgenauigkeit 0 2 C e Temperaturreproduzierbarkeit 0 2 C e Linearit t ber vollst ndigen Temperaturbereich 2 0 C Alternative Nachweismethode 1 e UV VIS Detektor e Wellenlangenbereich 190 700 nm e UV Quelle Deuteriumlampe Bedienungsanleitung fur das CRC RAScan Combination Kit fur DHPLC Systeme Seite 33 Anhang A Alternative Nachweismethode 2 e Fluoreszenz Detektor e Wellenlangenbereich Anregung 200 850 nm Emission 250 900 nm e Fluoreszenzquelle 150 W Xenonlampe e Pumpe f r Fluoreszenzfarbstoff e Feste Durchflussrate bei 0 1 mL min 20 50 e Pulsationsarmer Durchfluss A 3 2 Systembetrieb Zu Installation und Betrieb des DHPLC Systems richten Sie sich nach den Empfehlungen des Herstellers zur Analyse von dsSDNA Fragmenten in der Gr enordnung von 50 bp bis 250 bp mit einer Zielaufl sung von mindestens 10 bp Dies ist der Gr enbereich f r Fragmente nach SURVEYOR Nuclease Verdau mit diesem Kit F r Hinweise zu empfohlenen Gradienteneinstellungen f r die Analyse von SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten mit dem DHPLC System gehen Sie auf http world transgenomic com diagnostic tools genetic analysis kits crc rascan kits eu dhplicsystemsettings A 3 3 Wartung der DHPLC Kartuschen Fur die Wartung der DHPLC Kartuschen befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers Anmerkung Die Analyse von SURVEY
69. und 13 sind unten ebenfalls markiert ccatgtggttcettgetggtgtgaaATGACTGAGTACAAACTGGTGGTGGTTGGAGCH GEREN STT NRAS Exon 3 Stempel Amplikongr e 203 bp F r die Herstellung des genetischen Stempels des NRAS Exon 3 Kontrollplasmids wird GAC gegen CTG ausgetauscht Codon 59 und 61 sind unten ebenfalls markiert ACAH ESGABRASAAGAGTACAGTGCCATGAGACTGCAA NRAS Exon 4 Stempel Amplikongr e 233 bp F r die Herstellung des genetischen Stempels des NRAS Exon 4 Kontrollplasmids wird CAA gegen GTT ausgetauscht Codon 117 und 146 sind unten ebenfalls markiert AACHRETGSTSATTTSCCAACAAGGACAGTTGATACAAAAGTTGCCCACGAACTGGCCAAGAGTTACGGG ATTCCATTCATTGAAACCTCA Aac A 3 HPLC DHPLC Systemanforderungen f r die Denaturierung A 3 1 DHPLC Spezifikationen f r SURVEYOR SCAN Anwendungen Die folgenden Spezifikationen stellen die Mindestanforderungen f r die DHPLC Systemspezifikationen f r die Durchf hrung der Tests mit dem SURVEYOR Scan KRAS amp NRAS Kit dar Abgabesystem f r Hochleistungsl sungsmittelgradienten e Bin re Gradientenkapazit t Hochdruck oder Niederdruck e Durchflussregulierung Mindestbereich 0 7 1 6 mL min e Durchflussgenauigkeit 2 H2O bei 20 C e L sungsmittelentgaser Auto Sampler e Temperaturregulierung zum Abk hlen der Platten einstellbar 4 bis 14 C e Injektionsvolumen 5 50 uL Trennkartusche e Entwickelt f r die Gr entrennung von dsDNA Fragmenten Fragmentgr e 50 bp bis 250 bp S
70. ur das CRC RAScan Combination Kit Zur Qualitatskontrolle bestimmter Schritte des Testverfahrens sind diesem Kit Kontrollplasmid DNAs beigef gt Fur das Amplifikationsprotokoll gew hrleisten diese Kontrollen dass der Master Mix korrekt hergestellt wurde und die Amplifikation richtig funktioniert hat No Template Controls wo anstelle der Matrizen DNA Wasser hinzugef gt wird werden ebenfalls empfohlen um eine m gliche Kontamination der Kitkomponenten mit einer DNA Matrize nachzuweisen Bei dem Schritt des SURVEYOR Nuclease Verdaus zeigen die Amplikons dieser drei Kontrollplasmid DNAs effektiv ob die Bedingungen der Spaltreaktion Herstellung des SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix und Inkubationsbedingungen zufriedenstellend waren Bei der Analyse geben die mit dem DHPLC System erstellten Chromatogramm dieser SURVEYOR Nuclease verdauten Kontrollamplikons einen Hinweis darauf wo die Peaks der Spaltprodukte die der Mutation in KRAS und NRAS Exons 2 3 und 4 entsprechen sogar bei geringer Konzentration eluieren werden siehe Abb 4 10 Peaks von Spaltprodukten die zu anderen Mutationen in KRAS bzw NRAS Exons 2 3 und 4 geh ren k nnen an leicht unterschiedlichen Positionen eluieren Wenn die PCR Amplikons nicht den Ergebnissen in Abschnitt Qualit tskontrolle der PCR Produkte entsprechen sehen Sie in Anhang B Fehlersuche nach oder setzen Sie sich mit dem Kundendienst von Transgenomic in Verbindung bevor Sie weitere Schritte der Proben
71. werden wie in dieser Bedienungsanleitung beschrieben Wenn die Verarbeitung einer Probe vor der Fertigstellung aller Schritte unterbrochen werden muss sollte die DNA bei angegebener Stelle bei 20 C gelagert werden Allerdings sollten gefrorene Proben nicht wiederholten Einfrier Auftauzyklen ausgesetzt werden und die Tiefk hllagerung 18 bis 25 C von PCR amplifizierter DNA bzw SURVEYOR Nuclease Verdauprodukten ber einen Zeitraum gt 1 Woche sollte vermieden werden Die Probenanalyse sollte dem unten aufgef hrten Arbeitsablauf folgen Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Kit mit den DHPLC Systemen Seite 12 12 Schritt f r Schritt Anleitung DNA Isolation Gelelektrophorese P amp PCR 1 aa Bewertung Starke Schwache a PCR I SURVEYOR w I Scan fehlgeschlagen SURVEYOR Nuclease amp 5 DHPLC Analyse ile N SURVEYOR Scan SURVEYOR Scan Positiv Negativ Sequenzbest tigung Sequenzqualit t fehlgeschlagen Sequenzqualit t bestanden Mutationen in KRAS oder NRAS Codon G12 G13 A59 Q61 K117 oder A146 NVD Abbildung 3 Arbeitsablauf der Analyse mit dem CRC RAScan Combination Kit Bedienungsanleitung f r das CRC RAScan Combination Kit f r DHPLC Systeme Seite 13 12 Schritt f r Schritt Anleitung Anmerkungen zu Abbildung 3 1 2 3 Isolieren Sie mit den Standardlabortechniken die DNA aus FFPE F

Download Pdf Manuals

Related Search

Related Contents

Netgear 762S Quick Start Guide  REF 158.indd  Philips Sync and charge cable DLC2404  View  288918 - seggetta rialzata con braccioli 288918  INTERCOM 6000 TM6008R01/TM6016R01/TM6032R01 Service  Emtec C500 64GB  User Manual  ECB600 datasheet  

Copyright © All rights reserved. Failed to retrieve file